Univerzita Karlova v Praze. Přírodovědecká fakulta. Studijní obor: Speciální chemicko-biologické obory

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta

Studijní obor: Speciální chemicko-biologické obory Studijní program: Molekulární biologie a biochemie organismů

Tereza Pavlištová

Diferenciační potenciál polydendrocytů v patologických stavech centrálního nervového systému Differentiation potential of polydendrocytes in pathological states of central nervous system

Bakalářská práce Vedoucí závěrečné práce: Ing. Miroslava Anděrová, CSc. Praha, 2015

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.

V Praze, dne 14. 5. 2015 Podpis

Poděkování Ráda bych poděkovala vedoucí své bakalářské práce Ing. Miroslavě Anděrové, Csc. za její odborné rady a vstřícný přístup. Mé díky patří i rodičům za trpělivou pomoc při korektuře bakalářské práce a nakonec mým skvělým spolubydlícím za psychickou podporu a udržení dobré nálady.

Abstrakt NG2 buňky jinak nazývané polydendrocyty nebo prekurzory oligodendrocytů tvoří čtvrtý typ gliových buněk nacházejících se v centrální nervové soustavě (CNS). Na svém povrchu exprimují různé markery, podle kterých je lze identifikovat, mezi ně patří zejména NG2 chondroitin sulfát proteoglykan a receptory pro růstový faktor krevních destiček. Polydendrocyty vznikají jak ve dvou páteřních kanálcích, tak v mozku postupně z ventrální části předního mozku, telencefalonu a diencefalonu. Jejich populace je heterogenní, podle lokalizace v mozku se liší morfologicky, elektrofyziologickými vlastnostmi a rozdílnou diferenciací.

V in

vitro

podmínkách

jsou

polydendrocyty

schopny

diferencovat

v oligodendrocyty, protoplazmické astrocyty i neurony. V postnatálním mozku mohou NG2 glie diferencovat v astrocyty, ale většina populace zůstává v maturovaném stavu nebo se mění na oligodendrocyty. Při patologickém poškození CNS se polydendrocyty dostávají do aktivovaného, hypertrofovaného stavu a zvyšují svoji expresi NG2 proteoglykanu. Reakce těchto buněk je ovlivněna především prostředím a různými uvolněnými faktory při poranění například růstovými, morfogeny a cytokiny. V závislosti na typu poranění CNS se diferenciační potenciál NG2 glií mění; v ischemických podmínkách jsou schopny tvořit subpopulaci reaktivních astrocytů a nezralých neuronů, ale při demyelinizaci, zánětu, lézi nebo mechanickém poškození nemění svůj osud a diferencují pouze v oligodendrocyty. Odpověď polydendrocytů na patologické stavy tak zřejmě zahrnuje pouze zvýšení proliferace, spoluúčast na tvorbě gliální jizvy a v procesu remyelinizace.

Abstract NG2 cells also called polydendrocytes or oligodendrocyte progenitors comprise fourth type of glial cells in the brain. Ng2 glia express distinct markers on their cell surface, which can be used for their identification. Particularly, NG2 proteoglycan chondroitin sulphate and receptors for platelet-derived growth factor belong to the main markers. Polydendrocytes arise in two canals of spinal cord and also in the ventral part of frontal brain, telencephalon and diencephalon. Population of NG2 cells is heterogeneous because they differ morphologically, by their electrophysiological properties and distinct differentiation potential depending on localization in brain. In conditions in vitro, polydendrocytes can differentiate into oligodendrocytes, protoplasmic astrocytes or neurons. In early postnatal brain, NG2 glia give rise to astrocytes, but most of these cells remain in the mature state or change themselves to oligodendrocytes. Pathological states of the central nervous system cause an activation of polydendrocytes, they start to be hypertrophied and increase expression of NG2 proteoglycan. Reaction of these cells is influenced by environment and chemical factors, for example growth factors, morphogens and cytokines. Depending on the type of CNS disorder the differentiation potential of NG2 glia changes; under ischemic conditions they give rise to certain subpopulation of reactive astrocytes and immature neurons, while demyelinization inflammation, lesion or mechanical damage of tissue does not change their fate. Their main response to pathological stimuli comprises NG2 glia proliferation, glial scar formation and moreover, they participate in the process of remyelinization.

Seznam použitých zkratek AD

Alzheimerova choroba (z angl. alzheimer's disease)

ALS

amyotropní laterární skleróza

BDNF

neurotrofní faktor (z angl. brain derived neurotrophic factor)

bFGF

bazický fibroblastový růstový faktor

CD68

specifický mikrogliální/makrofágový marker

CNS

centrální nervová soustava

DCX

doublecortin, migrační/proliferační marker

EGF

epidermální růstový faktor (z angl. epidermal growth factor)

GFAP

gliální fibrilární acidický protein

GS

glutamin syntetáza

Iba1

specifický marker mikroglií (z angl. ionized calcium-binding adaptor molecule 1)

IL-1β

interleukin 1β

IL-6

interleukin 6

kDa

kilo Dalton, jednotka molekulové hmotnosti proteinů

Ki-67

antigenní protilátka proti MKI67 genu, značící proliferaci

MBP

myelin bazický protein

MCAo

okluze střední mozkové arterie (z angl. middle cerebral artery occlusion)

MCT1

monocarboxylátovový transportér 1

MHC II.

hlavní histokompatibilní komplex II. třídy (z angl. major histocompatibility complex II.)

MS

roztroušená skleróza (z angl. multiple sclerosis)

NeuN

neuronální marker (z angl. neuron-specific nuclear protein)

NG2

chondroitin sulfát proteoglykan, neuralní/gliální antigen 2

NGF

nervový růstový faktor (z angl. neuronal growth factor)

O4

pre-oligodendrocytický marker

OPC

oligodendrocytické prekurzory

OX-42

monoklonální protilátka proti cd11-b

PCNA

proliferační marker (z angl. proliferating cell nuclear antigen)

PDGF

růstový faktor krevních destiček (z angl. platelet-derived growth factor)

PLP

myelinový proteolipidový protein (z angl. proteolipid protein promotor)

Shh

morfogen sonic hedgehog

SVZ

subventrikulární zóna

TGF α

transformující růstový faktor α (z angl. transforming growth factor α)

TGF-β1

tranformující růstový faktor β1 (z angl. transforming growth factor β1)

Obsah 1

Úvod ................................................................................................................................... 9

2

Vlastnosti polydendrocytů ................................................................................................. 9

3

4

2.1

NG2 glie, prekurzory oligodendrocytů či polydendrocyty? ......................................... 9

2.2

Identifikace polydendrocytů ...................................................................................... 10

2.3

Původ a vývoj .............................................................................................................. 11

2.3.1

Páteřní mícha ...................................................................................................... 11

2.3.2

Mozek ..................................................................................................................12

2.4

Morfologie ..................................................................................................................13

2.5

Elektrofyziologické vlastnosti .....................................................................................14

2.6

Kontakt s neurony ...................................................................................................... 15

Diferenciace polydendrocytů ............................................................................................16 3.1

V in vitro podmínkách ................................................................................................16

3.2

V in vivo podmínkách.................................................................................................16

3.2.1

Prekurzory oligodendrocytů ................................................................................16

3.2.2

Diferenciace v astrocyty ...................................................................................... 17

3.2.3

Diferenciace v neurony....................................................................................... 18

3.2.4

Diferenciace v mikroglie......................................................................................19

Reakce polydendrocytů na patologické stavy centrální nervové soustavy....................... 20 4.1

Ischemické poškození .................................................................................................21

4.1.1

Reakce NG2+ glií.................................................................................................21

4.1.2

Iba1+/NG2+ buňky ............................................................................................ 23

4.1.3

Diferenciace v neuronální prekurzory................................................................ 23

4.1.4

Diferenciace v astrocyty ..................................................................................... 24

4.2

Excitotoxické léze ...................................................................................................... 24

4.3

Alzheimerova choroba ............................................................................................... 25

4.4

Roztroušená skleróza................................................................................................. 26

4.5

Amyotropní laterární skleróza................................................................................... 29

4.6

Gliomy ....................................................................................................................... 29

4.7

Mechanické poranění mozku .................................................................................... 30

5

Závěr ................................................................................................................................. 30

6

Seznam použité literatury .................................................................................................31

1

Úvod V centrální nervové soustavě savců se kromě astrocytů, oligodendrocytů a mikroglií

nalézají také buňky, které se nazývají polydendrocyty. Tyto poměrně nově objevené buňky jsou také nazývány NG2 buňky, protože na svém povrchu exprimují antigen NG2 proteoglykan (chondroitin sulfát). Dalším specifickým povrchovým markerem těchto buněk je alfa-receptor pro růstový faktor krevních destiček (PDGFαR) (A. Nishiyama, Lin, Giese, Heldin, & Stallcup, 1996; Stallcup & Beasley, 1987). Polydendrocyty jsou jako jedny z mála buněk schopné se dělit i v dospělém mozku (Dawson, 2003) a v in vitro podmínkách vykazují tyto buňky multipotentní potenciál, neboť jsou schopny diferencovat do dalších buněčných typů. V centrálním nervovém systému (CNS) nebyla zatím za fyziologických podmínek prokázána diferenciace polydendrocytů v jiné buněčné typy než oligodendrocyty. Současný výzkum, který je zaměřen na regeneraci nervové tkáně v patologiích CNS, ukazuje, že polydendrocyty mohou diferencovat i v neurony nebo astrocyty. Úloha těchto buněk není stále plně objasněna, nicméně při mechanickém poškození mozku a demyelinizaci (Keirstead, Levine, & Blakemore, 1998; Komitova, Serwanski, Lu, & Nishiyama, 2011), ischemii (Claus et al., 2013; Honsa, Pivonkova, Dzamba, Filipova, & Anderova, 2012), Alzheimerově chorobě (Li et al., 2013; Nielsen et al., 2013) a dalších poškozeních se dynamicky proměňuje reakce a velikost populace polydendrocytů. V této práci jsou nejprve charakterizovány obecné vlastnosti těchto buněk, jejich identifikace a vývoj, poté shrnuty možnosti jejich diferenciace v in

vitro

podmínkách

a in

vivo

ve

zdravém

mozku.

V poslední

části je

popsána úloha polydendrocytů v různých patologických stavech, možnosti jejich reakce a diferenciace, a případné přispění k regeneraci poškozené tkáně.

2 Vlastnosti polydendrocytů 2.1 NG2 glie, prekurzory oligodendrocytů či polydendrocyty? Buňky CNS se obvykle rozdělují do dvou buněčných linií – neuronální a gliové. Gliové buňky tvoří oligodendrocyty, astrocyty, mikroglie a polydendrocyty. Poslední jmenované buňky, polydendrocyty, byly objeveny přibližně před 20 lety (Stallcup & Beasley, 1987). Jejich výzkum se začal rozvíjet po nalezení buněk v nádoru mozku myši, kdy tyto buňky svými vlastnostmi neodpovídaly neuronům ani typickým gliovým buňkám. Poté byly v myším postnatálním

optickém

nervu za použití

nejprve

toxinu tetanu a později antigenu NG2

identifikovány jako buňky tvořící společný prekurzor oligodendrocytů a astrocytů 2. typu (Stallcup & Beasley, 1987). Polydendrocyty neexprimují markery typické pro astrocyty ani mikroglie, např. gliální fibrilární acidický protein (GFAP), glutamin syntetázu (GS) 9

ani monoklonální protilátku OX-42 rozeznávající cd11-b α podjednotku mikrogliálního komplementového receptoru 3. Od astrocytů i mikroglií se liší také morfologicky. To potvrzuje, že tvoří novou, prozatím ne plně objasněnou, linii buněk v CNS (J M Levine & Card, 1987; Reynolds & Hardy, 1997).

c

Obrázek 1: (a) Polydendrocyty obarvené pomocí antigenů NG2 a PDGF (Rα) v měřítku 50 μm, (b) Porovnání obarveného NG2 proteoglykanu a (c) PDGFRα v měřítku 10 μm (Rivers et al., 2008)

Označení NG2 glie je odvozeno z podobnosti jak neuronům (N) tak gliím (G) – protoplazmickým astrocytům 2. typu. V literatuře se setkáváme i s termínem prekurzory oligodendrocytů (OPC), který poukazuje na schopnost polydendrocytů diferencovat v oligodendrocyty. Název polydendrocyty byl použit z důvodu jednotnosti označení všech buněk, které na svém povrchu exprimují NG2+ proteoglykan a poukazuje na vysoký počet jejich rozvětvených výběžků (Watanabe, Toyama, & Nishiyama, 2002). Polydendrocyty jsou také

nazývány

GluR-buňky,

protože

exprimují

pouze

glutamátové

receptory

a nikoliv glutamátové transportéry jako astrocyty (Matthias et al., 2003).

2.2 Identifikace polydendrocytů K první identifikaci in vitro se používala A2B5 monoklonální protilátka, kterou váží všechny NG2 pozitivní buňky, a která označuje gangliosidy u nezralých oligodendrocytů (Stallcup & Beasley, 1987). A2B5 není ovšem exprimována pouze na polydendrocytech, nýbrž i na jiných buněčných typech, a pro použití in vivo tedy není tak spolehlivá (Chang, Nishiyama, Peterson, Prineas, & Trapp, 2000). Proto bylo nutné nalézt jiné markery, které budou specifické pouze pro polydendrocyty. Přibližně polovina NG2 glií také exprimuje antigen 04, který se vyskytuje především u O-2A prekurzorů oligodendrocytů (Reynolds & Hardy, 1997). Jeho lokalizace je snadno zaznamenatelná v šedé hmotě mozkové, ale selhává v bílé hmotě, protože se překrývá s identifikací oligodendrocytů (Dawson, 2003). NG2 glie na svém povrchu exprimují receptory PDGFRα, na které se váže PDGF, který lze využít jako marker (Hart, Richardson, Heldin, Westermark, & Raff, 1989). Tento protein může tvořit 3 izoformy - homodimery AA/BB nebo heterodimer AB. V CNS převažuje 10

homodimer PDGF-AA, který má na NG2+ glie mitogenní účinek a přímo stimuluje jejich proliferaci a diferenciaci (Pringle & Richardson, 1993; Pringle et al., 1989). Hlavním markerem, pomocí kterého se nyní identifikují polydendrocyty, je NG2 chondroitin sulfát (A. Nishiyama, Dahlin, Prince, Johnstone, & Stallcup, 1991). Povrchový NG2 proteoglykan se řadí do rodiny chondroitin sulfát proteoglykanů (CSPGs), je tvořen 300 kDa jádrem glykoproteinu a dvěma nebo třemi chondroitin sulfátovými řetězci. Obsahuje velkou extracelulární

doménu a krátký

cytoplazmatický

konec.

Celková

molekulová

hmotnost celého proteinu činí asi 600 kDa (A. Nishiyama et al., 1991). Jádro tohoto proteinu má na buňky jak pozitivní, tak i negativní vliv. Je schopno vázat PDGF-AA a bazický fibroblastový

růstový

faktor

(bFGF),

který

ovlivňuje

extracelulární

doménovou lokalizaci a diferenciaci polydendrocytů. Navíc tyto látky působí inhibičně na růst neuronů, včetně axonů, nepodporují adhezi, a ani jejich případnou regeneraci in vitro (Dou & Levine, 1994) ani in vivo v patologiích CNS (Tan, Colletti, Rorai, Skene, & Levine, 2006). Avšak podle Yanga (Yang et al., 2006) toto negativní ovlivnění způsobuje právě samostatné jádro NG2 proteoglykanu, na který se později mohou navázat další látky způsobující blokaci růstu neuronů.

Naopak

NG2+

buňky

vyskytující

se

v blízkosti neuronů

mohou způsobit prodlužování a plasticitu axonů (Yang et al., 2006). Polydendrocyty nejsou jedinými buňkami, které jsou schopné exprimovat NG2 chondroitin sulfát. Lze ho nalézt také u buněk hladké svaloviny, chondroblastů a pericytů (Goretzki, Burg, Grako, & Stallcup, 1999). Exprese NG2, PDGFαR a A2B5 je po vývoji mozku a diferenciaci postupně utlumena, přibližně od 30. postnatálního dne (A. Nishiyama et al., 1996), což ztěžuje možnost určení osudu terminální diferenciace NG2 glií (Zhu, Bergles, & Nishiyama, 2008).

2.3 Původ a vývoj 2.3.1

Páteřní mícha Polydendrocyty vznikají ve ventrální zóně páteřní míchy ve dvou páteřních kanálcích.

V 10. – 12. dni embryogeneze se jako první rozlišitelné markery objevují transkripční regulátory Olig1 a Olig2, které jsou indukované pomocí morfogenu Sonic hedgehog (Shh), který

kontroluje

diferenciaci neuronů

a oligodendrocytů

v páteřní

míše.

S těmito

transkripčními faktory je spojen také Sox10, který aktivuje geny sloužící k myelinizaci (Zhou, Wang, & Anderson, 2000). Přibližně v 16. dni embryonálního vývoje lze identifikovat PDGFαR+/NG2- buňky. V průběhu následujících dvou dní polydendrocyty migrují z přední ventrální oblasti z tzv. pMN a p3 domény a rovnoměrně se rozšiřují do ventrální i dorzální části páteřní míchy (A. Nishiyama et al., 1996; Pringle & Richardson, 1993). Zároveň 11

s vývojem v přední ventrikulární zóně se menší počet buněk vyvíjí i v zadní části ventrikulární zóny. Tato oblast tvoří další zdroj budoucích oligodendrocytů, které do celkové populace přispívají cca 10 – 15% (Kessaris et al., 2006). Exprese NG2 proteoglykanu se objevuje na konci embryonálního vývoje u PDGFαR-pozitivních buněk, kdy je tedy již možná současná identifikace pomocí PDGFαR a NG2+ (A. Nishiyama et al., 1996). Maximální exprese těchto buněčných

markerů

nastává

v prvním

týdnu postnatálního

vývoje.

Proliferace

polydendrocytů pokračuje i po dvou týdnech a v tomto období také začíná pozvolna klesat exprese PDGFαR i NG2+ (A. Nishiyama et al., 1996).

Obrázek 2: Průřez neurální trubicí, který zobrazuje domény, ze kterých se tvoří neuronální a gliové progenitory. Z ventrální p0, p1, p2 a p3 domény vznikají interneurony, z pMn domény motorneurony a oligodendrocyty (Rowitch & Kriegstein, 2010).

2.3.2

Mozek Primárním zdrojem prekurzorů oligodendrocytů v mozku jsou mediální ganglionické

eminence a ventrální část předního mozku (Kessaris et al., 2006). Tam lze poprvé detekovat PDGFαR, a to již v 11. – 12. dni embryonálního vývoje (Pringle & Richardson, 1993). Později se polydendrocyty vyvíjejí také v oblasti laterárních ganglionických eminencí a telencefalonu (Kessaris et al., 2006; Pringle & Richardson, 1993). Expresi Olig1 a Olig2 pod kontrolou morfogenního signálu Shh lze zaznamenat ve ventrikulární zóně středního a zadního mozku (Nery, Wichterle, & Fishell, 2001; Zhou et al., 2000). Stejně jako v páteřní míše existuje další centrum vývoje i v dorzální části, ovšem polydendrocyty zde vznikají pouze přechodně a v 15. dni embryogeneze již není možné je detekovat (Kessaris et al., 2006; Zhou et al., 2000). Zároveň je v 15. dni vývoje v předním mozku detekováno společně s PDGFαR také NG2 (A. Nishiyama et al., 1996). Polydendrocyty tedy nejspíše vznikají primárně ve ventrální zóně telencefalonu a diencefalonu, a později migrují. V prvních dnech postnatálního 12

života pak vykazují vysoký proliferační potenciál a velmi rychle se rozšiřují po celém mozku. (Menn et al., 2006; A. Nishiyama et al., 1996; Pringle & Richardson, 1993; Zhou et al., 2000).

Obrázek 3: Vývoj polydendrocytů v mozku. Červeně označena první vlna vzniku ve

ventrální

části mozku,

modře

druhá

vlna v dorzální

části a telencefalonu, poslední zeleně označená lokace vzniku z ventrálního předního mozku (Kessaris et al., 2006).

Vzhledem k jejich mitogennímu potenciálu existují místa, kde se tyto buňky v dospělosti preferenčně

tvoří

v subventrikulární

(SVZ)

zóně

–

například

postranních

v gyrus komor.

dentatus, Tato

hipokampu nebo

místa pak

slouží

jako

zásobárna při poškození mozkové tkáně (Menn et al., 2006; J. Sypecka, Sarnowska, & Domanska-Janik, 2009). Míra proliferace se určuje pomocí začlenění bromodeoxyuridinu, jehož zvýšená hladina byla potvrzena právě u buněk osidlujících SVZ. Z výsledků studií lze usoudit,

že

polydendrocyty

i v průběhu života v závislosti na jejich

jsou cyklující

buňky

lokalizaci a stáří

mozku.

schopné

proliferovat

Maximální

proliferace

a diferenciace trvá pouze několik týdnů od narození a poté se postupně snižuje (Dawson, 2003; Kang, Fukaya, Yang, Rothstein, & Bergles, 2010).

2.4 Morfologie Polydendrocyty

mají

tělo

pravidelného

kruhového

nebo

oválného

tvaru o

průměru asi 5 – 10 μm, ze kterého vyrůstají výběžky. Primární výběžky vystupující z těla buněk jsou nejsilnější a nejdelší, a dále se pak bohatě rozvětvují v menší a užší sekundární a terciární výběžky. Pod elektronovým mikroskopem lze snadno rozeznat jádra polydendrocytů

tvořená

hustým

heterochromatinem,

které

obklopuje

tenká

vrstva cytoplazmy s malým počtem organel. Antigenní NG2 barvení je nejvíce znatelné v cytosolu a buněčné

membráně,

což

ukazuje

lokalizaci NG2

proteoglykanu v polydendrocytech (Ong & Levine, 1999). Obvykle se vyskytují spíše jako jednotlivé buňky, pouze výjimečně tvoří páry a lze je identifikovat v páteřní míše i rovnoměrně rozložené v obou mozkových hmotách ve všech vrstvách neokortexu, hipokampu i mozečku (Ong & Levine, 1999). Vzhled buněk se liší podle jejich lokalizace v mozku. V bílé hmotě, kde osidlují především corpus callosum 13

a molekulární vrstvy mozečku, mají hladké, oválnější a delší tělo a výběžky jsou prodloužené směrem k axonům. V šedé hmotě, zejména v mozkové kůře, polydendrocyty nepatrně mění svoji morfologii a začínají svým vzhledem připomínat spíše astrocyty. Zvětšují tělo, které má nepravidelný tvar a svoje výběžky prodlužují a rozvětvují do všech směrů (Dawson, 2003; A. Nishiyama et al., 1996).

Obrázek 4: Vlevo: typická morfologie polydendrocytů v šedé kůře mozkové, polydendrocyty mají hvězdicovitý tvar. Vpravo: zobrazeno prodloužené tělo polydendrocytů s méně výběžky v bílé hmotě (corpus callosum) (Dawson, 2003)

V případě

patologického

poškození

mozku je

typickou odpovědí

aktivovaný

a hypertrofovaný stav polydendrocytů. Projevuje se změnou morfologie, kdy buňky zvětšují tělo a zesilují výběžky. Zahrnuje také zvýšenou proliferaci a expresi NG2 a jeho přesun na buněčný povrch (Ong & Levine, 1999).

2.5 Elektrofyziologické vlastnosti Klidový membránový potenciál polydendrocytů dosahuje hodnot zhruba -77.2 ± 1.9 mV. In situ vykazují membránový odpor 120 MΩ, a membránovou kapacitanci 9.5 ± 0.8 pF (Honsa et al., 2012). Elektrofyziologické studie NG2 glií pomocí metody terčíkového zámku v konfiguraci celé buňky odhalily, že na svém povrchu exprimují několik typů K+ napěťově závislých iontových kanálů tzv. komplexní profil. Obsahují napěťově řízené Na+ kanály, přechodný K+ a opožděný K+ a Ca2+ řízené K+ kanály (Barres, Koroshetz, Chun, & Corey, 1990; Bergles, Roberts, Somogyi, & Jahr, 2000; De Biase, Nishiyama, & Bergles, 2010; Schools, Zhou, & Kimelberg, 2003). Expresí Na+ kanálu připomínají neurony, ale liší se proudovou hustotou Na+ a K+ a jejich aktivační hranicí. Některé výzkumy také naznačují, že exprese K+ kanálů může ovlivňovat diferenciaci a proliferaci polydendrocytů (Barres et al., 1990; Pivonkova, Benesova, Butenko, Chvatal, & Anderova, 2010; Xie et al., 2007). Většina polydendrocytů

také

exprimuje

receptory

glutamátové

typu;

AMPA a kainátové i NMDA a GABA receptory zejména v corpus callosum, tyto buňky jsou v kontaktu se synapsemi nemyelinizovaných neuronů. Receptory jsou schopné přijímat 14

glutamatergní a GABAergní signály a mohou sloužit k depolarizaci (Bergles et al., 2000; De Biase

et

al.,

2010).

Právě

v corpus

callosum

se

při akčním

potenciálu uvolní

z presynaptického zakončení měchýřky s glutamátem, který aktivuje receptory a může ovlivnit proliferaci, migraci i diferenciaci polydendrocytů (De Biase et al., 2010; Gallo et al., 1996; Chittajallu, Aguirre, & Gallo, 2004; Ziskin, Nishiyama, Rubio, Fukaya, & Bergles, 2007). NG2 glie se liší v elektrofyziologických vlastnostech v závislosti na oblasti mozku – v bílé hmotě jsou pasivní proudy u NG2 glií minimální a mají vyšší vstupní odpor, membránový

potenciál

dosahuje

hodnot

~-70mV.

Buňky

v šedé

hmotě

jsou hyperpolarizované – jejich membránový potenciál dosahuje -85mV (Chittajallu et al., 2004). Tyto vlastnosti naznačují na možné subtypy polydendrocytů.

2.6 Kontakt s neurony NG2 imunoreaktivitu lze detekovat v těsné blízkosti neuronů. Signál je pozitivní mezi pre- a postsynaptickými strukturami v šedé hmotě, kam zasahují rozšiřující se výběžky NG2 glií (Komitova, Zhu, Serwanski, & Nishiyama, 2009; Ong & Levine, 1999). V bílé hmotě jsou téměř

všechny

polydendrocyty

v kontaktu se

synapsemi axonů

a axolemmální

membránou v Ranvierových zářezech (Bergles et al., 2000; Ong & Levine, 1999). Podle elektrofyziologických vlastností lze NG2 glie zařadit do dvou odlišných skupin, které se liší expresí napěťově řízených závislých Na+ kanálů. Morfologicky se od sebe tyto dvě skupiny nijak neliší, ale buňky, které vykazují depolarizací aktivované a na tetrodoxin citlivé Na+

proudy

začínají

postnatálně

po

týdnu od

vývoje

ztrácet

markery

určující

oligodendrocytickou linii – Olig2- a O4- (Káradóttir, Hamilton, Bakiri, & Attwell, 2008). Dalším rozdílem je jejich schopnost generovat akční potenciál a zároveň i přijmout inhibiční/excitační signál vedený neuronem. Většina z polydendrocytů s Na+ kanály je schopna excitace přes napěťově řízené kanály a 20% z těchto buněk je schopno vytvořit akční potenciál (AP) (Ge, Zhou, Luo, Jan, & Jan, 2009). Tato vlastnost přetrvává pouze v neonatálním vývoji, protože tyto buňky mají vyšší membránovou rezistenci a nižší K+ vodivost (De Biase et al., 2010). Navíc během vývoje rychle ztrácí AMPA i NMDA receptory, a proto přestávají být schopné tvořit AP. Později jsou schopné už jen přijímat signály od neuronů a to až do doby terminální diferenciace (De Biase et al., 2010; Ge et al., 2009; Chittajallu et al., 2004; Káradóttir et al., 2008). Ze spojení neuron-NG2 glie lze usuzovat, že polydendrocyty hrají určitou roli v synaptickém přenosu, podporují růst axonů a vedení a reagují na změny způsobené poškozením.

15

3 Diferenciace polydendrocytů 3.1 V in vitro podmínkách V konkrétních in vitro podmínkách, v závislosti na složení média, je možné přeměnit polydendrocyty

v oligodendrocyty

nebo

astrocyty

2.

typu.

Růst

v definovaném

médiu bez séra s přidáním růstových faktorů PDGF a bFGF způsobí diferenciaci NG2 glií v oligodendrocyty společně s expresí GC a myelin bazického proteinu (MBP) (Kondo & Raff, 2000; J. M. Levine & Stallcup, 1987). Při použití média, které obsahuje sérum, jsou NG2 glie schopné přeměnit se na GFAP+

protoplazmické

astrocyty

(Stallcup

&

Beasley,

1987).

Nicméně

v tomto médiu s obsahem růstových faktorů PDGF a bFGF, se při správném poměru a době kultivace mohou z polydendrocytů stát multipotentní buňky. Polydendrocyty se v takovém případě diferencují v neurony nebo astrocyty a exprimují příslušné povrchové detekční markery. Jejich osud přeměny v oligodendrocyty tedy není nevratně daný a v in vitro podmínkách ho lze změnit (Belachew et al., 2003; Kondo & Raff, 2000). Tato teorie je vyvracena jinými výzkumy, protože při použití média pro neurální kmenové buňky nebyly detekovány žádné znaky, které by určovaly diferenciaci polydendrocytů v neurony (Zhu et al., 2008).

3.2 V in vivo podmínkách 3.2.1 Prekurzory oligodendrocytů V dospělém mozku lze nalézt stabilní populace nezralých oligodendrocytů, tzn. polydendrocytů, z nichž necelá polovina dál proliferuje a tvoří dospělé oligodendrocyty (Rivers et al., 2008). Protože v průběhu diferenciace dochází k utlumení exprese NG2, A2B5 a PDGFRα (A. Nishiyama et al., 1996), pro ověření hypotézy, že NG2 glie vykazují multipotentní potenciál in vivo, se nejčastěji používají značení přes různé linie transgenních myší.

Ty

poté

exprimují

různé

fluorescenční

detekční

látky,

které

jsou pod

kontrolou odlišných promotorů. Pomocí této metody je tedy potvrzeno, že z polydendrocytů mohou vzniknout diferenciace

je

myelinizující

oligodendrocyty

podmíněna přítomností

Olig2

v obou mozkových a Sox10

(Dimou,

Takebayashi, & Götz, 2008; Kang et al., 2010; Zhu et al., 2008).

16

hmotách Simon,

a tato

Kirchhoff,

Obrázek 5: Schéma diferenciace progenitorových buněk v oligodendrocyty (Schumacher et al., 2012)

Diferenciace polydendrocytů v oligodendrocyty neprobíhá synchronně a má několik různých stupňů, které se odlišují podle toho, které markery jsou exprimovány. Více jak třetina NG2+ buněk diferencuje v první stupeň, kdy současně exprimuje NG2+ a preoligodendrocytický marker O4+. Poté se ztrácí exprese NG2 a buňky pozitivní na O4 začnou exprimovat GC a nakonec dozrávají v dospělé oligodendrocyty (Dawson, 2003; Kang et al., 2013; A. Nishiyama et al., 1996; Reynolds & Hardy, 1997). Navíc je také možné detekovat buňky s expresí NG2+/O4+/GC-, které zůstávají ve stádiu oligodendrocytických progenitorů, a dál nematurují (Reynolds & Hardy, 1997). Zbylé NG2 glie zůstávají v nediferencovaném

stavu a později zřejmě

mohou hrát

roli v patologii CNS

a regeneraci poškozené tkáně (Kang et al., 2013; Zhu et al., 2008). Rozsah diferenciace NG2 glií závisí na několika dalších faktorech, a to na okolním prostředí,

uvolněných

látkách

a signálech

určujících,

zda se

budou polydendrocyty

diferencovat v oligodendrocyty nebo jiné buněčné typy (Levison, Young, & Goldman, 1999). Záleží také na lokalizaci polydendrocytů, podle několika prací ovlivňuje míru diferenciace odlišné environmentální prostředí bílé a šedé hmoty (Dimou et al., 2008; Kang et al., 2010). Procento

buněk

přeměněných

v oligodendrocyty

v šedé

hmotě

je

v porovnání

s bílou hmotou nižší a více buněk zůstává v nediferenciovaném stavu. Míra a rychlost diferenciace je ovlivněna rovněž věkem, kdy detekce ve starším mozku ukazuje na menší počet buněk diferencujících v oligodendrocyty (Dimou et al., 2008; Zhu et al., 2008). 3.2.2 Diferenciace v astrocyty Diferenciace polydendrocytů v protoplazmické astrocyty byla poprvé potvrzena v in vitro podmínkách (Hill & Nishiyama, 2014)*. K ověření diferenciace se opět používají transgenní myši pod kontrolou různých promotorů, přičemž výsledky studií provedené na toto téma nejsou zcela shodné. Při použití Cre rekombinázy se potvrzuje možnost 17 * sekundární citace, převzato z Raff MC, Miller RH, Noble M, 1983, Nature

vzniku protoplazmických astrocytů in vivo (Dimou et al., 2008; Zhu et al., 2008), kde NG2 glie diferencují v astrocyty, ovšem pouze v šedé hmotě ve ventrální části předního mozku – především v hypotalamu a talamu. Tyto detekované NG2+/GFAP+ buňky vznikají prenatálně během vývoje, zatímco postnatálně nebyla potvrzena žádná přeměna v protoplazmické astrocyty. Při použití myelinového proteolipidového proteinu (PLP), který kontroluje MBP, se objevuje malá skupina pozitivních NG2 glií. Ty diferencující i postnatálně v postmitotické astrocyty a nacházejí se opět pouze v šedé hmotě (Dimou et al., 2008; Guo, Ma, McCauley, Bannerman, & Pleasure, 2009; Rivers et al., 2008; Zhu et al., 2011). Možná diferenciace v astrocyty

je

pravděpodobně

způsobena spontánním

utlumením

transkripčního

faktoru Olig2, který do té doby určuje osud NG2 glií jako budoucích oligodendrocytů. Z tohoto důvodu je možné ve ventrální části mozku pozorovat zároveň se vyskytující oligodendrocyty i astrocyty odvozené od NG2 glií. Taktéž opět platí závislost míry diferenciace na lokalizaci buněk v mozku a věku jedince (Zhu et al., 2011). V kontrastu s těmito výsledky jsou studie provedené výzkumnými skupinami (Huang et al., 2014; Kang et al., 2010; Rivers et al., 2008), které nenašly v bílé ani šedé hmotě žádné NG2+ buňky diferencující v astrocyty. Detekce GFAP neukázala žádné pozitivní barvení společně s NG2 antigeny. Dalším pokusem o identifikaci astrocytů odvozených od polydendrocytů bylo použití jiného astrocytického markeru, S100β podjednotky, která byla u malého

počtu buněk

detekována v corpus

callosum

a kůře.

I přes

pozitivní

koexpresi ovšem nelze podle S100β podjednotky stanovit astrocytický fenotyp, protože může být exprimována na více buněčných typech. Navíc tyto NG2+/S100β pozitivní buňky zároveň exprimují i Sox10, který značí zařazení do linie oligodendrocytů (Honsa et al., 2012; Rivers et al., 2008). 3.2.3 Diferenciace v neurony V průběhu let

se

objevuje

mnoho

různých

názorů

na možnou diferenciaci polydendrocytů v neurony in vivo. Po důkazech in vitro se mnoho vědců snaží potvrdit či vyvrátit tuto domněnku a určit multipotentní potenciál NG2 glií. Nastává stejná situace jako u vzniku astrocytů a předkládané studie ukazují protikladné výsledky v závislosti na použité metodě výzkumu.

18

Při detekci pod kontrolním promotorem PLP jsou NG2 glie schopné dát vznik pyramidálním neuronům, především v oblasti piriformu, v menší míře v kortexu a dokonce interneuronům v hipokampu. Tato možnost diferenciace trvá zhruba do 3. týdne od narození a klesá s věkem (Guo et al., 2010; Rivers et al., 2008; Tamura et al., 2007). Podobné výsledky ukázal

i Belachew

a spoluautoři (Belachew

et

al.,

2003),

který

identifikoval

populaci glutamatergních neuronů v oblasti hipokampu a gyrus dentatus, které byly dokonce schopny vést akční potenciál. Tyto buňky exprimují NG2+ a NeuN+ marker a v polovině případů

i marker

nezralých

neuronů

doublecortin

(DCX).

Vysvětlením

tohoto

vzniku neuronů by mohla být možná fúze oligodendrocytů a neuronů, případně i migrace ze SVZ, kterou by potvrzovala exprese DCX migračního markeru (Guo et al., 2009).

Obrázek 6: Vlevo: Na obrázku je zobrazena společná lokalizace NeuN (zeleně) a NG2 (červeně) markeru. Vpravo: Společná lokalizace NeuN (zeleně) a DCX (červeně) v neokortexu. Šipky označují NG2+ glie v blízkosti NeuN a DCX. Obrázky jsou v měřítku 20 μm (Tamura et al., 2007)

Naopak při použití transgenní myši pod Cre promotorem nebyla za normálních fyziologických podmínek zjištěna žádná koexprese neuronálních markerů a NG2, a tedy ani vznik neuronů z polydendrocytů (Dimou et al., 2008; Honsa et al., 2012; Komitova et al., 2009; Zhu et al., 2011, 2008). Příčinou tohoto heterogenního diferenciačního chování polydendrocytů by mohlo být několik podskupin NG2 glií. Ty jsou rozlišitelné podle toho, zda například exprimují PLP promotor, mají různý proliferační potenciál či vlastnosti a reagují jinak na extracelulární prostředí (Guo et al., 2009; Káradóttir et al., 2008; Rivers et al., 2008; Tamura et al., 2007). 3.2.4 Diferenciace v mikroglie Identifikace mikrogliálních markerů, především OX-42 nebo Iba1+ zároveň s NG2 gliemi je negativní. Předpokládá se tudíž, že za normálních podmínek polydendrocyty v mozku v mikroglie nediferencují (Gao et al., 2010; Tamura et al., 2007). 19

4 Reakce

polydendrocytů

na patologické

stavy

centrální

nervové soustavy Mnoho studií potvrdilo diferenciaci polydendrocytů v oligodendrocyty, astrocyty i neurony in vitro. Přestože in vivo byla většina těchto možností, kromě oligodendrocytů, poměrně

spolehlivě

polydendrocytů

vyvrácena,

stále

zde

v důsledku patologických

zůstává

možnost

podmínek.

změněné V poškozené

diferenciace tkáni se

v závislosti na lokalizaci v mozku dynamicky mění mikroenvironmentální prostředí, které se skládá z aktivních látek, které ovlivňují všechny přítomné buňky. Při poranění se uvolňují látky jako cytokiny, mitogeny, trofické a jiné růstové faktory a tyto endogenní signály mohou na polydendrocyty působit přímo či nepřímo a ovlivnit tak jejich diferenciaci. Dále také podporují nebo inhibují vývoj, obnovení nebo schopnost proliferace buněk (J. Sypecka et al., 2009). Jedním z klíčových faktorů by mohl být neurotrofní faktor BDNF, který indukuje proliferaci a maturaci. NG2+ buňky začnou být na jeho hladinu citlivé jak v mechanickém (demyelinizačním), tak zánětlivém poškození. Při zvýšené hladině BDNF v gliogenním modelu páteřní míchy polydendrocyty ukazují zpomalený vývoj vedoucí k terminální diferenciaci v myelinizující oligodendrocyty. V hipokampu představujícím neurogenní model jsou hladiny BDNF dvojnásobné, což vede ke stejnému efektu. Naopak v poškozené mozkové tkáni hipokampu je hladina aktivních látek, včetně BDNF, výrazně snížena, čímž se zvýší proliferace polydendrocytů, oligodendrocytů, produkce MBP, a sníží se apoptóza buněk (Joanna Sypecka, Sarnowska, Gadomska-Szabłowska, Lukomska, & Domanska-Janik, 2013; VonDran, Singh, Honeywell, & Dreyfus, 2012). Osud buněk v patologicky poškozené tkáni určuje také transkripční faktor Olig2. Při akutním zranění i při zánětu se v poškozené tkáni přesune Olig2 z jádra do cytoplazmy, což způsobí diferenciaci polydendrocytů na astrocyty (NG2+/GFAP+), které jsou schopné dále proliferovat. Tento stav nastane zhruba u poloviny buněk, a to těch, které jsou schopné se za normálního stavu přeměnit na oligodendrocyty. Astrocytů odvozených od NG2 glií je asi 20% a přežijí zhruba týden, proto lze odvodit, že diferenciace je pouze přechodná (Zhao, Raha-Chowdhury, Fawcett, & Watts, 2009). Mechanické poškození nebo zánět způsobí aktivaci imunitní odpovědi v mozku, do prostředí se začnou vylučovat cytokiny, interleukiny, chemokiny a další látky produkované imunitními buňkami. V reakci na ně se aktivují mikroglie, které exprimují MHC II. a produkují další interleukiny. V některých případech poškození mozku může dojít k narušení hematoencefalické bariéry v mozku, čímž se poruší homeostáza, která je klíčová pro správnou funkci všech buněk. Počet polydendrocytů zůstává konstantní, ovšem buňky se dostanou do hypertrofovaného stavu, který je charakteristický zvýšenou expresí NG2 20

proteoglykanu. Reakce polydendrocytů nastává dříve než aktivace makrofágů a odpovídá na látky

produkované

pouze

krvinkami,

na sérum

ani při použití

imunoglobulinů

polydendrocyty nereagují. Hladina testovaných pro a proti-zánětlivých látek (IL-6, IL-8, IL1β, TNF-α a TGF-β1 ) se zvyšuje při neurozánětlivém poškození a má na polydendrocyty různý účinek. Působení IL-6 a IL-1β zastavuje proliferaci a diferenciaci NG2 glií. TGF-α ani EGF (epidermální růstový faktor) nezvyšují produkci NG2 proteoglykanu a nezpůsobují aktivaci NG2 glií a naopak TGF-β1 zvyšuje expresi NG2 proteoglykanu. Dále byly také testovány diferenciační faktory PDGF-AB a bFGF, přičemž pouze PDGF je schopen způsobit aktivaci polydendrocytů (Bu, Akhtar, & Nishiyama, 2001; Rhodes, Raivich, & Fawcett, 2006; Wennstrom, Janelidze, Bay-richter, Minthon, & Brundin, 2014; Xiang, Zhu, Jiang, & He, 2015).

4.1 Ischemické poškození U cévní mozkové

příhody

dochází

k ucpání

nebo

poškození

cévy

v mozku krevní

sraženinou a následné postižení se týká bílé i šedé mozkové hmoty a bazálních ganglií. V bílé hmotě

nastává

nedostatkem

apoptóza či nekróza oligodendrocytů,

kyslíku,

glukózy

astrocytů

i neuronů

způsobená

a následnou glutamátovou excitotoxicitou

(uvolnění

glutamátu do extracelulárního prostoru). Na gliových buňkách v centru poškození lze po 30 minutách od ischemie pozorovat narůstající buněčný otok a tvorbu vakuol. Později nastává nekróza u nervových vláken. Cytotoxický edém se po 6 hodinách začne pomalu snižovat a tento proces pokračuje až 24 hodin (Pantoni, Garcia, & Gutierrez, 1996). Během 3 až 7 dní se vytvoří ischemická léze a vzniká astroglióza (Honsa et al., 2012). Na okrajích ischemické léze se hromadí GFAP pozitivní buňky se zvýšenou reaktivitou, cytotoxické lymfocyty a makrofágy (Claus et al., 2013) a dojde k aktivaci mikrogliálních buněk identifikovatelných pomocí Iba1+, které postupně překonají ohraničení ischemické léze a dostanou se přímo do jejího centra (Aya-ay et al., 2005; Claus et al., 2013).

Obrázek 7: Buněčné rozložení v ischemickém mozku po 7 dnech. Zeleně obarvené buňky značí CD68+ mikroglie, hnědě jsou zbarveny NG2 glie v periinfarktní oblasti tvořící demarkační zónu. Modré astrocyty tvoří gliální jizvu (Claus et al., 2013)

21

4.1.1 Reakce NG2+ glií V rozmezí 24 hodin až 3 dní mizí NG2+ buňky, oligodendrocyty a jejich prekurzory z centra léze (McIver et al., 2010; K Tanaka et al., 2001) a naopak v těsné blízkosti se objevuje více polydendrocytů (Claus et al., 2013; Honsa et al., 2012). Tyto buňky s největším diferenciačním potenciálem tvoří 2/3 všech buněk v periferní oblasti obklopující centrum ischemické léze (Honsa et al., 2012; K Tanaka et al., 2001). Do 7 dní je nekrotická tkáň oddělena astrocyty a neurony společně s NG2+ buňkami, které uvolní proteoglykan a zvýší jeho expresi. Tyto změny zabraňují, aby se funkční buňky dostaly do poškozené tkáně, izolují ji a mohou také případně pomoci při tvorbě gliální jizvy, protože NG2+ chondroitin sulfát blokuje růst axonů. Nejprve je tedy umožněna obnova ostatních buněčných typů a teprve později růst axonů (Claus et al., 2013; Fawcett & Asher, 1999; K Tanaka et al., 2001). Bariéra tvořená NG2+ buňkami vymizí, jakmile je kompletně dokončena astroglióza kolem ischemické léze (Claus et al., 2013). Změna nastává i v morfologii polydendrocytů, ač po 24 hodinách vykazují buňky pouze malé zvětšení. Od 3. dne po ischemii začnou zvětšovat svůj objem a snižovat počet výběžků (Honsa et al., 2012). Původně hvězdicovitý tvar s bohatým rozvětvením se mění na hypertrofovanou buňku se zesílenými a zkrácenými výběžky (K Tanaka et al., 2001). Pomocí detekce buněčných proliferačních markerů Ki-67 a PCNA se potvrzuje, že NG2+ nejvíce proliferují v časovém úseku do 2 týdnů od MCAo, a to především v corpus callosum (Honsa et al., 2012; Kassis et al., 2014). Předpokládá se, že tato zvýšená proliferace a následná diferenciace by mohla vést k opravě a remyelinizaci poškozené tkáně, která je ovšem závislá na mnoha dalších faktorech a nemusí být vždy úspěšná (Kortaro Tanaka et al., 2003).

Obrázek 8: Řez mozkem po ischemii s obarvenými polydendrocyty. Vlevo rozmístění po 24 hodinách, vpravo konkrétní lokalizace léze a zvětšená populace po 14 dnech (Kortaro Tanaka et al., 2003)

22

4.1.2 Iba1+/NG2+ buňky Jak již bylo zmíněno výše, do 24 hodin nastává apoptóza všech buněk v ischemickém centru – tedy i mikroglií a polydendrocytů. Ovšem již po 3 dnech lze detekovat koexpresi Iba1+ a NG2+ v centru léze a do 7 dní se tyto buňky objevují i na okrajích (Claus et al., 2013; Matsumoto et al., 2008; McIver et al., 2010). Rozložení Iba1+ buněk odpovídá nejprve lokalizaci NG2+ chondroitin sulfátu, později nastává převaha především Iba1+ buněk a makrofágů, zatímco imunoreaktivita NG2+ buněk obklopujících nekrotickou část tkáně klesá (Claus et al., 2013). Uvnitř ischemického centra se nacházejí 2 různé typy buněk, které jsou Iba1 pozitivní (Matsumoto et al., 2008). Třetinu z nich tvoří Iba1+, které nevykazují žádnou NG2 imunoreaktivitu. Druhé 2/3 tvoří Iba1+/NG2+ buňky, které jsou zároveň pozitivní

na mikrogliální

marker

OX-42

a především

na Ki-67

značící

proliferaci.

Většina z nich také obsahuje velké množství fagozomů a slouží tedy pravděpodobně jako makrofágy. Funkce buněk bez fagozomů není jasná, zřejmě se bude týkat regenerace poškozené tkáně (Matsumoto et al., 2008). Především není jasné, odkud pocházejí buňky v centru léze,

která

je

izolovaná

astrogliózou a navíc

původní

buňky

spáchaly

apoptózu (Matsumoto et al., 2008). Objevení těchto nových buněk při ischemickém poranění by se dalo vysvětlit několika způsoby. Mimo ischemické centrum se dělí již osidlující polydendrocyty (Honsa et al., 2012; Ohta et al., 2003) a možná dále migrují z oblastí, ze kterých primárně pocházejí, tedy SVZ a gyrus dentatus. Schopnost progenitorových buněk – NG2+ glií migrovat je ovšem značně omezená a v těchto místech primárního osídlení nebyly nalezeny žádné markery potvrzující migraci a aktivaci buněk (Kortaro Tanaka et al., 2003). To tak nejspíše vylučuje možnost, že by polydendrocyty mohly při poškození migrovat (Claus et al., 2013; Honsa et al., 2012). Druhou a pravděpodobnější alternativou by mohla být přechodná exprese NG2+ u jiných buněk, například u makrofágů/monocytů Iba1+ (Anderova et al., 2011). Iba1+/NG2+ buňky mají pravděpodobně jinou doménu proteoglykanu, protože protein se chová jako transmembránový místo extracelulární (Matsumoto et al., 2008), což potvrzuje, že tyto buňky nejsou klasické NG2 glie. 4.1.3 Diferenciace v neuronální prekurzory Nalezení neuronálního markeru DCX nebo NeuN společně s NG2 by mohlo vést k potvrzení rozmanitého diferenciačního potenciálu polydendrocytů. V žádném z výše jmenovaných výzkumů nedošlo k překrytí a koexpresi těchto markerů, pouze v jednom z případů se objevily buňky DCX+/NG2+. DCX slouží jako marker nově vytvořených buněk a přetrvává asi 14 dní od jejich vzniku, nemusí však nutně znamenat pouze tvorbu neuronů, v tomto případě zřejmě dojde k diferenciaci i v reaktivní astrocyty. Jejich počet nepřevyšuje 5%,

a přežijí

pouze

měsíc

od

ischemie.

Tvorba těchto

nových

by

mohla být

indukována pomocí změn v mikroenvironmentálním prostředí, protože při ischemickém 23

poškození

se

uvolňují

různé

faktory

včetně

růstových,

které

poté

ovlivňují

diferenciaci polydendrocytů (Honsa et al., 2012). 4.1.4 Diferenciace v astrocyty Vzhledem k mnoha předchozím výzkumům, při kterých se ukázalo, že NG2 glie mohou diferencovat v astrocyty in vitro, se objevila snaha o potvrzení této hypotézy také in vivo při ischemickém poškození a pokus o společnou identifikaci GFAP a NG2+ buněk (Honsa et al., 2012; Sizonenko, Camm, Dayer, & Kiss, 2008). V řádu dní se nepotvrdilo společné pozitivní barvení těchto dvou markerů. Po týdnu od ischemie bylo asi 17% buněk NG2+/GFAP+ a nacházely se jak na okrajích, tak v centru léze (Honsa et al., 2012). V případě, že v centru došlo po delší době k poklesu Iba1+/NG2+, narostl počet buněk vykazujících pouze GFAP+ (Matsumoto et al., 2008). Z toho lze usuzovat, že se tyto 2 typy buněk nějakým způsobem ovlivňují v proliferaci, možná tvoří prekurzory pro GFAP+, neboť nekrotické jádro je v té době již ohraničeno astrogliózou a tudíž není jasné, odkud by jinak tyto buňky pocházely (Honsa et al., 2012; Matsumoto et al., 2008). Diferenciační

potenciál

polydendrocytů

je

také

závislý

na stáří

použitého

modelu (myši). V postnatální nebo mladé myši mají polydendrocyty multipotentní potenciál (Honsa et al., 2012). Výzkum srovnávající mozek mladé a staré myši po ischemii navíc prokázal vyšší schopnost aktivace polydendrocytů a regeneraci u mladších myší (Ohta et al., 2003). Je

jisté,

že

polydendrocyty

hrají

podstatnou roli v reparaci poškozené

tkáně

ischemickou poruchou. Do budoucna je nutné vyjasnit, jak přesně fungují, co spouští jejich proliferaci, jaké buněčné typy z nich mohou vznikat a jaké signalizační dráhy jejich diferenciaci ovlivňují (K Tanaka et al., 2001).

4.2 Excitotoxické léze Dalším modelem poranění mozkové tkáně je použití kainátové kyseliny, která se aplikuje do hippokampu a funguje jako excitotoxin. Kainátová kyselina vytvoří v mozku léze a způsobí excitotoxické poškození, degeneraci a smrt pyramidových neuronů v CA1/CA3 oblasti a smrt oligodendrocytů. Různá vývojová stádia oligodendrocytů jsou rozdílně citlivá na koncentraci kainátové kyseliny, nejméně citlivé jsou právě NG2+ pozitivní buňky, které jsou prekurzory oligodendrocytů. Ovšem nízká koncentrace excitotoxické látky by mohla způsobit jejich aktivaci (Bu et al., 2001; McDonald, Levine, & Qu, 1998; Ong & Levine, 1999). Po 2 dnech od aplikace kainátu vykazují NG2 silnější zbarvení. Začnou typicky měnit svou morfologii a zvětšují svůj objem. Vytvářejí více nových výběžků, která jsou kratší a tlustší. Vnitřní stavba buňky se také proměňuje – buňky mají více cytoplazmy 24

a nepravidelné mitochondrie. Svým vzhledem se polydendrocyty liší od astrocytů s tlustšími výběžky i od mikroglií s tenkými a pokroucenými výběžky (Ong & Levine, 1999). V místech nekrózy neuronů je do týdne od aplikace patrné také zvýšení počtu gliových buněk, především NG2+ glií, které vykazují i vyšší imunoreaktivitu. Tento nárůst trvá 14 dní a lze ho pozorovat jen v oblasti ztráty neuronů především v bílé hmotě okolo axonů degenerujících neuronů. Po té poklesne imunoreaktivita ve stratum pyramidale na téměř stejnou úroveň jako před poškozením mozku (Bu et al., 2001; Ong & Levine, 1999). Naopak současná detekce GFAP+ a NG2 neodhalila na buňkách jejich koexpresi. Ve stratum pyramidale se nejprve objevují aktivované astrocyty, které jsou obklopeny imunoreaktivními NG2+ strukturami. Po přibližně 14 dnech od vytvoření léze se astrocyty a polydendrocyty oddělují a tvoří samostatné populace. Lze předpokládat, že v tomto případě z NG2+ buněk nevznikají astrocyty, neboť na svém povrchu neexprimují NG2 proteoglykan (Bu et al., 2001). Zda mohou NG2+ buňky diferencovat do mikroglií zůstává stále nevyřešeno, neboť za normálních podmínek zatím nebyla potvrzena koexprese markerů typických pro NG2 glie a mikroglie. V pokusu za současné detekce NG2 a OX42, který slouží jako mikrogliální marker, se ukázalo, že po 1. dni byl nejprve počet všech značených buněk redukován. Po 14 dnech se objevují 2 odlišné typy buněk, 1. typ exprimuje OX42, ale je NG2 negativní, druhý buněčný typ mění svou morfologii na podobnou makrofágům, má velké, kruhové tělo a krátké výběžky. Uvnitř buněčného těla zároveň exprimuje oba markery OX42+ a NG2+, které ovšem do 90 dní zmizí. Nelze tak potvrdit diferenciaci polydendrocytů v mikroglie ani při patologických poškozeních (Bu et al., 2001).

4.3 Alzheimerova choroba Alzheimerova choroba

(AD)

je

neurodegenerativní

onemocnění

způsobující

progresivní demenci. Poškození mozku je charakterizováno hromaděním a ukládáním amyloid-β-peptidu 1-42

do

plaků

a tvorbou nerozpustných

neurofibrilárních

shluků

z hyperfosforylovaného tau proteinu. AD postupem času způsobuje především snížení kognitivních funkcí, což zahrnuje zhoršující se ztrátu paměti, artikulaci, vnímání prostoru a motorické

funkce,

deprese,

nespavost

a dokonce

i halucinace

(Mckhann,

Drachman, & Folstein, 1984). Poškození se netýká pouze šedé hmoty mozkové, ale i bílé hmoty mozkové, kde nastává především ztráta myelinu a axonů. Tvorba Aβ plaků ovlivňuje všechny buňky v mozku, neboť indukuje oxidativní stres a tvoří volné radikály. Ty jsou toxické pro neurony i endoteliální buňky (Desai et al., 2010; Nielsen, Ek, Orbjörn, Minthon, & Wennström, 2012; Xu et al., 2001) Cytotoxický efekt Aβ plaků také způsobuje apoptózu a nekrózu dospělých oligodendrocytů (Xu et al., 2001). 25

Ačkoliv při jiných neurodegenerativních onemocněních NG2 imunoreaktivita vždy stoupala, při AD lze prvotně zaznamenat výrazný pokles. Nelze však jednoznačně říci, zda je ztráta NG2 způsobena pouze nízkou expresí nebo smrtí polydendrocytů (Li et al., 2013; Nielsen

et

al.,

2013).

V průběhu choroby

jsou polydendrocyty

z počátku rozloženy

rovnoměrně a netvoří shluky (Nielsen et al., 2013), později se začínají seskupovat v hipokampální oblasti a v pyramidálních a granulárních vrstvách v okolí Aβ plaků společně s aktivovanými mikrogliemi a astrocyty, a jejich imunoreaktivita se opět zvyšuje (Schefft, 2013). Tvorba plaků navíc způsobí aktivaci a přeměnu polydendrocytů, které jsou následně schopné odstraňovat Aβ plaky mikropinocytózou a degradovat je (Li et al., 2013). U pacientů s Alzheimerovou chorobou je možné nalézt aktivované NG2 glie, které mají menší počet výběžků, které jsou kratší a méně větvené. Zároveň vykazují jasný otok buněčného těla, což značí jejich aktivaci a navíc lze detekovat odlišný typ glií Iba1-/GFAP+, který obsahuje granulární sraženiny NG2 proteoglykanu (Nielsen et al., 2013). Žádné jiné buňky obsahující NG2+ neexprimují zároveň GFAP+, teoreticky by se tudíž mohly polydendrocyty později přeměnit v astrocyty, nebo se jedná o fagocytózu či přechodnou expresi NG2 proteinu (Li et al., 2013; Nielsen et al., 2013; Schefft, 2013). Tyto dva rozdílné fenotypy NG2 glií by také mohly potvrzovat heterogenitu polydendrocytů.

4.4 Roztroušená skleróza Roztroušená

skleróza (MS)

je

neurodegenerativní

onemocnění

způsobené

demyelinizací a zánětem. Autoimunitní odpověď namířenou proti CNS spouští kombinace environmentálních a genetických faktorů, přesná příčina není známa. V průběhu této nemoci se tvoří léze, ve kterých dochází k patologickým změnám tkáně a poškození všech typů buněk nacházejících se v mozku. Konečným stádiem této poruchy jsou vytvořené sklerotické plaky. Po poškození sice dochází k remyelinizaci, ale ta často selhává z několika důvodů, buď dojde k takovému porušení axonů, že již nejsou schopné obnovy, nebo k takovému nedostatku oligodendrocytů, které již případně nejsou schopny tvorby myelinu. Pro úspěšnou remyelinizaci jsou potřebné růstové faktory PDGF a bFGF, které indukují dělení progenitorů oligodendrocytů. S postupující poruchou však klesá jejich produkce, a tím možnost remyelinizace (Roth, Ramírez, Alarcón, & Von Bernhardi, 2005; VonDran et al., 2012). NG2+ buňky jsou přítomny ve všech tvořených typech lézí, jak v bílé, tak i v šedé hmotě. Obecně lze říci, že když se zvýší počet buněk v centru poškozené tkáně, dojde k účinnější remyelinizaci. Velikosti populace polydendrocytů se ovšem v různých studiích liší a liší se i podle typu vytvořené léze.

26

V akutních nalézají

demyelinizovaných

imunitní

zánětlivé

lézích

buňky,

se

zejména B-

lymfocyty a makrofágy. V bílé hmotě NG2 glie nejsou téměř detekovatelné, a pokud ano, pak pouze na okrajích

léze.

Naopak

velikost

populace

polydendrocytů v lézi šedé hmoty se neliší od jejich počtu v normálním

mozku.

Prostředí,

environmentální faktory, lokalizace a další stimuly a signály ovlivňují reakci polydendrocytů a mohou je aktivovat zejména v bílé hmotě (Chang et al., 2000). Naopak v šedé hmotě v důsledku nedostatku signálů a stimulů od zánětlivých buněk neproběhne aktivace polydendrocytů a jejich diferenciace v prekurzory Obrázek 9: Hustota polydendrocytů uvnitř oligodendrocytů

(Chang

et

al.,

2000;

Akiko a vně 3 různých testovaných lézí (Chang et al., 2000)

Nishiyama, Yu, Drazba, & Tuohy, 1997).

Reaktivní astrocyty se objevují jen několik málo dní po aktivaci mikroglií a polydendrocytů (Bello, Dawson, Levine, & Reynolds, 1999). Rozprostírají se na okrajích lézí a tvoří izolující gliální jizvu, buď na ochranu zdravých buněk, nebo aby se zabránilo migraci a regeneraci (Tripathi,

Rivers,

Young,

Jamen,

&

Richardson,

2010).

V mnoha případech je remyelinizace podmíněna dostatečným počtem oligodendrocytů a jejich prekurzorů, které budou schopné produkovat myelin. Poté remyelinizace probíhá poměrně rychle. Ve více jak polovině lézí jsou nalezeny nepravidelné NG2 glie společně s premyelinizačními oligodendrocyty,

které

se

vyskytují

v subventrikulární

oblasti, morfologicky připomínají oligodendrocyty a mají podobně zesílené výběžky (Chang, Tourtellotte,

Rudick,

&

Trapp,

2002).

Schopnost

proliferace

polydendrocytů

v mozku poškozeném MS ovlivňuje mnoho růstových faktorů, například PDGF, BDNF nebo NGF. Snížení BDNF v oblasti vytvořené léze negativně ovlivňuje produkci myelinu. Hladina BDNF je důležitou součástí remyelinizační odpovědi, neboť způsobuje i snížení počtu NG2 progenitorů a proteinů kódujících myelin, a tím zabraňuje regeneraci tkáně (VonDran et al., 2012). Snížení NGF působí podobně jako snížení BDNF, má tedy za následek pokles populace polydendrocytů a omezení jejich diferenciace (Triaca & Tirassa, 2003). Celkově se polydendrocyty v demyelinizované oblasti vyznačují aktivovaným stavem, který zahrnuje zvětšené tělo a zesílené a zkrácené výběžky (Wilson, Scolding, & Raine, 2006). Pomocí elektronového mikroskopu lze rozlišit 2 typy polydendrocytů. První z nich se nachází v subependymální vrstvě MS léze a má nepravidelný hvězdicovitý tvar. Druhá skupina se vyznačuje prodlouženým tělem, jejich výběžky jsou navíc propojeny a zasahují k axonům. 27

Osidlují především okraje lézí a okolí cév (Chang et al., 2002). Jejich propojení s axony v bílé hmotě značí možnost regenerace a remyelinizace axonů (Wilson et al., 2006). V páteřní míše kolem centrálního kanálu část populace NG2 glií diferencuje v oligodendrocyty a zajišťuje podstatný podíl buněk sloužících k remyelinizaci axonů (Tripathi et al., 2010; Wilson et al., 2006). Remyelinizace závisí pochopitelně na přítomnosti buněk v poškozené oblasti, přičemž zvýšení počtu buněk proběhne spíše na okrajích lézí (Bello et al., 1999).

Obrázek 10: Rozmístění polydendrocytů (označené hlavičkou šipky) uvnitř MS léze v bílé mozkové hmotě, šipka ukazuje na cévy, v měřítku 400 μm (Chang et al., 2000)

V chronické lézi nebyl zaznamenán nárůst polydendrocytů (Chang et al., 2002; Wilson et al., 2006). Jak již bylo popsáno u předchozích patologií, i v případě MS se počet buněk obvykle zvyšuje a následně poklesne na původní hodnotu. Remyelinizace v chronické MS lézi probíhá velmi slabě, což může být způsobeno utlumením diferenciačních signálů pro oligodendrocyty a jejich nedostatek, případně přítomnost inhibitorů (Bello et al., 1999). Aktivace buněk proběhne pouze tehdy, pokud je demyelinizace doprovázena zánětem, v této chronické fázi již nejsou přítomny zánětlivé buňky, které by mohly prekurzory dále stimulovat (Chang et al., 2002). Vzhledem k velké podobnosti s dalšími gliovými buňkami, především mikrogliemi, se mnohokrát testovala společná exprese určujících markerů, ale v žádném z případů nebyla detekována koexprese NG2 a OX-42 ani CD68 a ani GFAP a neuronálních markerů (Chang et al., 2002; Tripathi et al., 2010; Wilson et al., 2006). Polydendrocyty tedy tvoří odlišnou populaci od populace mikroglií, astrocytů i neuronů a s těmito buňkami pouze spolupracují a aktivují progenitory (Bello et al., 1999).

28

Reakce NG2 glií je velmi dynamická a velikost populace se liší v každé lézi. Snížení počtu NG2

glií

vede

k nedostatku oligodendrocytických

prekurzorů

a omezené

remyelinizaci (Arnett et al., 2001). S určitostí nelze ani potvrdit, zda buňky migrují ze zdravého mozku a následně osidlují poškozené oblasti za účelem remyelinizace, nebo zda malá část buněk přežije v lézi a následně proliferuje a diferencuje. Vzhledem k rychlé remyelinizaci a tvorbě izolované oblasti pomocí gliální jizvy přichází v úvahu spíše možnost přežití buněk v centru poškozené tkáně (Chang et al., 2000).

4.5 Amyotropní laterární skleróza Progresivní

neurodegenerativní

onemocnění

projevující

se

paralýzou a svalovou ochablostí způsobuje poškození motorických neuronů a dalších gliových buněk v páteřní míše. Buňky se dostávají do aktivovaného stavu a zvyšují svoji proliferaci. Odpověď polydendrocytů je totožná jako při patologických stavech výše zmiňovaných neurodegenerativních onemocnění, ovšem proliferace je tentokrát mnohem silnější a převažuje nad ostatními gliovými buňkami. Jejich aktivace a proliferace je reakcí na poškození oligodendrocytů a není započata degenerací axonů. První oblastí aktivace je ventrální šedá hmota, kde polydendrocyty maturují v oligodendrocyty. Jejich diferenciace ovšem není úspěšně dokončena z důvodu neznámého defektu a buňky brzy umírají. Současně je

také

redukována tvorba MBP,

a tak

nejsou nové

oligodendrocyty

schopny

ani remyelinizace (Kang et al., 2013; Philips et al., 2013). Defekt je pravděpodobně způsoben mutací v superoxid dismutáze 1 ovlivňující expresi monocarboxylátovového transportéru 1 (MCT1). Tento protein slouží jako metabolická podpora a zajišťuje přesun laktátu nebo pyruvátu skrz oligodendrocyty a jeho nedostatek pak vede k úbytku energie důležité pro neurony. Právě nové oligodendrocyty nemají MCT1 což vede k dalšímu poškozování okolních buněk a porušení proteinu s postupem nemoci přispívá k poškození axonů i oligodendrocytů a k jejich nefunkčnosti (Lee et al., 2012). V případě ALS tedy NG2 glie zřejmě diferencují pouze v oligodendrocyty, je nutné dále detailněji prozkoumat chování polydendrocytů a najít způsob jak umožnit úspěšnou tvorbu funkčních oligodendrocytů.

4.6 Gliomy Gliomy jsou nejběžnější maligní nádory postihující mozek. Tumory vznikají především z astrocytů a oligodendrocytů, ale zřejmě také z polydendrocytů. Vzhledem k funkcím NG2 glií ve zdravém mozku by mohly hrát roli v rakovinotvorném dělení. Bylo zjištěno, že gliomy obsahují jednotlivé polydendrocytické markery NG2, Olig2 a PDGFRα. Koexprese se nepřekrývá vždy, pouze 5% NG2+ buněk exprimuje zároveň Olig2 a asi 50% buněk také zároveň PDGFRα. NG2 glie v tumorech mají jinou morfologii, tvoří kulaté buňky bez hvězdicovitých výběžků a jejich velikost se liší v různých vzorcích poškozené tkáně. Proti ostatním buněčným typům jsou aktivnější v proliferaci, avšak v in vitro podmínkách nezávisí 29

rychlost

proliferace

na typu použitého

média. Ve shodě s tímto jejich chováním in

vitro

jsou i výsledky

in

Hlavními procesy

vivo.

v gliomech

jsou především proliferace, pohyblivost a invazivita.

Zvýšená

exprese

proteoglykanu naznačuje

NG2

zapojení

polydendrocytů do proliferace. Výzkumy však byly provedené zejména in vitro a konkrétní

role

v nádorovém

bujení

upřesněna (Al-Mayhani

polydendrocytů Obrázek 11: Exprese NG2 glií v glioblastomu, vlevo nahoře není zeleně obarvené NG2 buňky, vlevo dole jádra tumorových

ještě et

al.,

2011;

Chekenya et al., 1999).

buněk. Obrázek vpravo ukazuje překrytí (Al-Mayhani et al., 2011)

4.7 Mechanické poranění mozku Traumatické nebo mechanické poranění mozku aktivuje polydendrocyty, které snižují svůj počet v místě poškození a naopak v okolí naopak zvyšují svoji proliferaci (Keirstead et al.,

1998).

Dochází

ke

ztrátě

NG2

proteoglykanu na výběžcích

a translokaci Olig2

transkripčního faktoru. Po 5 dnech od poškození začínají Oli2+ buňky exprimovat GFAP+. Tyto reaktivní astrocyty jsou dokonce schopné proliferace, ale vyskytují se pouze několik dní po poškození a tvoří pouze 10% populace (Komitova et al., 2011; Zhao et al., 2009). Vzhledem k tomuto nízkému procentu detekovaných buněk odvozených od polydendrocytů nelze potvrdit, že opravdu tvoří budoucí astrocyty. Kontrolu nad diferenciací má také signální dráha Wnt/β-catenin,

která

diferenciaci v germinálních

kontroluje centrech

progenitorové

mozku –

buňky

a jejich

v SVZ a hipokampu.

proliferaci i

Při traumatickém

poškození mozku se β-catenin zvyšuje a zřejmě inhibuje jejich diferenciaci v oligodendrocyty (White, Nathe, & Maris, 2010).

5 Závěr Objev polydendrocytů jako nového typu buněk v mozku spustil rozsáhlý výzkum probíhající již několik desítek let. Současně s objevováním jejich vlastností pokračuje stále snaha prozkoumat diferenciační potenciál, jak ve zdravém mozku, tak v případě jeho patologického poškození. Schopnost dělit se v dospělé CNS a diferencovat in vitro ve vhodném médiu naznačují, že by polydendrocyty mohly mít multipotentní potenciál. Prozatím byla potvrzena jejich role jako oligodendrocytických prekurzorů, ačkoliv zřejmě ne 30

všechny NG2 glie mají tuto úlohu a některé zůstávají plně vyvinutými dospělými polydendrocyty. Diferenciace v astrocyty nebo neurony ve zdravém mozku zůstává stále nepotvrzena, přestože v některých případech lze nalézt společné markery těchto buněčných typů společně s NG2. Domnívám se, že jedním z hlavních důvodů rozdílných výsledků studií je použití různých kontrolních promotorů, detekčních látek či podmínek provedení, které se liší v jednotlivých výzkumných skupinách. V případě

patologických

poškození

mozku dochází

obvykle

k prvotnímu poklesu a následnému zvýšení populace polydendrocytů. Dosud není jisté, zda se jedná o nárůst proliferace nebo pouze o vyšší expresi NG2 na povrchu buněk, ale výsledky se přiklánějí spíše k druhé možnosti. Shodnou reakcí NG2 glií na poranění je jejich aktivovaný

stav,

který

se

vyznačuje

zvětšeným

buněčným

tělem

a hypertrofovanými tlustšími výběžky. Pokud dojde k zánětlivému onemocnění nebo se poškodí hematoencefalická bariéra, změní se environmentální prostředí mozku a uvolní se různé signalizační, růstové či inhibiční faktory. Ty mají na buňky velký vliv a způsobí jejich aktivaci nebo diferenciaci v oligodendrocyty. Může také dojít k translokaci Olig2, což má zřejmě podíl na jejich přechodné diferenciaci v astrocyty. Když se vytvoří léze, například při ischemickém poškození nebo roztroušené skleróze, polydendrocyty vytvoří bariéru, která izoluje poškozenou tkáň od zdravých buněk, zatímco probíhá astroglióza a tvorba gliální jizvy. Pouze některé studie potvrzují schopnost polydendrocytů trvale diferencovat v jiné buněčné typy než oligodendrocyty, především při patologickém poškození nervové soustavy. Proto tedy mají polydendrocyty zcela jistý potenciál při regeneraci poškozené tkáně, a to například v možnosti remyelinizace. Mnoho studií popisuje různé heterogenní podskupiny polydendrocytů, které se liší v elektrofyziologických vlastnostech, lokalizací v mozku, morfologií a schopností diferencovat v oligodendrocyty, případně i s potenciálem tvořit astrocyty zejména v prenatálním a neonatálním vývoji. I přes velkou snahu charakterizovat tyto buňky, mnoho mechanismů jejich fungování zůstává stále nevyřešeno, a to jak v normálních, tak patologických podmínkách.

6 Seznam použité literatury Al-Mayhani, M. T. F., Grenfell, R., Narita, M., Piccirillo, S., Kenney-Herbert, E., Fawcett, J. W., … Watts, C. (2011). NG2 expression in glioblastoma identifies an actively proliferating population with an aggressive molecular signature. Neuro-Oncology, 13(8)

31

Anderova, M., Vorisek, I., Pivonkova, H., Benesova, J., Vargova, L., Cicanic, M., … Sykova, E. (2011). Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism  : Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 31(3) Arnett, H., Mason, J., Marino, M., Suzuki, K., Matsushima, G. K., & Ting, J. P. (2001). TNF alpha promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience, 4(11) Aya-ay, J., Mayer, J., Eakin, A. K., Muffly, B. G., Anello, M., Sandy, J. D., & Gottschall, P. E. (2005). The effect of hypoxic-ischemic brain injury in perinatal rats on the abundance and proteolysis of brevican and NG2. Experimental Neurology, 193 Barres, B. A., Koroshetz, J., Chun, L. Y., & Corey, P. (1990). Ion Channel Expression by White Matter The O-2A Clial Progenitor Cell Glia  : Neuron, 4 Belachew, S., Chittajallu, R., Aguirre, A. a., Yuan, X., Kirby, M., Anderson, S., & Gallo, V. (2003). Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. Journal of Cell Biology, 161(1) Bello, I. C. Di, Dawson, M. R., Levine, J. M., & Reynolds, R. (1999). Generation of oligodendroglial progenitors in acute inflammatory demyelinating lesions of the rat brain stem is associated with demyelination rather than inflammation. Journal of Neurocytology, 28(May) Bergles, D. E., Roberts, J. D., Somogyi, P., & Jahr, C. E. (2000). Glutamatergic synapses on oligodendrocyte precursor cells in the hippocampus. Nature, 405(6783) Bu, J., Akhtar, N., & Nishiyama, A. (2001). Transient expression of the NG2 proteoglycan by a subpopulation of activated macrophages in an excitotoxic hippocampal lesion. Glia, 34(July 2000) Claus, H. L., Walberer, M., Simard, M. L., Emig, B., Muesken, S. M., Rueger, M. A., … Schroeter, M. (2013). NG2 and NG2-positive cells delineate focal cerebral infarct demarcation in rats. Neuropathology  : Official Journal of the Japanese Society of Neuropathology, 33(1)

32

Dawson, M. (2003). NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Molecular and Cellular Neuroscience, 24(2) De Biase, L. M., Nishiyama, A., & Bergles, D. E. (2010). Excitability and synaptic communication within the oligodendrocyte lineage. The Journal of Neuroscience  : The Official Journal of the Society for Neuroscience, 30(10) Desai, M. K., Mastrangelo, M. a, Ryan, D. a, Sudol, K. L., Narrow, W. C., & Bowers, W. J. (2010). Early oligodendrocyte/myelin pathology in Alzheimer’s disease mice constitutes a novel therapeutic target. The American Journal of Pathology, 177(3) Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., & Götz, M. (2008). Progeny of Olig2expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex. The Journal of Neuroscience  : The Official Journal of the Society for Neuroscience, 28(41) Dou, C. L., & Levine, J. M. (1994). Inhibition of neurite growth by the NG2 chondroitin sulfate proteoglycan. The Journal of Neuroscience  : The Official Journal of the Society for Neuroscience, 14(12) Fawcett, J. W., & Asher, R. a. (1999). The glial scar and central nervous system repair. Brain Research Bulletin, 49(6) Gallo, V., Zhou, J. M., McBain, C. J., Wright, P., Knutson, P. L., & Armstrong, R. C. (1996). Oligodendrocyte progenitor cell proliferation and lineage progression are regulated by glutamate receptor-mediated K+ channel block. The Journal of Neuroscience  : The Official Journal of the Society for Neuroscience, 16(8) Gao, Q., Lu, J., Huo, Y., Baby, N., Ling, E. a., & Dheen, S. T. (2010). NG2, a member of chondroitin sulfate proteoglycans family mediates the inflammatory response of activated microglia. Neuroscience, 165(2) Ge, W.-P., Zhou, W., Luo, Q., Jan, L. Y., & Jan, Y. N. (2009). Dividing glial cells maintain differentiated properties including complex morphology and functional synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106(1)

33

Goretzki, L., Burg, M. a, Grako, K. a, & Stallcup, W. B. (1999). High-affinity binding of basic fibroblast growth factor and platelet-derived growth factor-AA to the core protein of the NG2 proteoglycan. The Journal of Biological Chemistry, 274(24) Guo, F., Ma, J., McCauley, E., Bannerman, P., & Pleasure, D. (2009). Early postnatal proteolipid promoter-expressing progenitors produce multilineage cells in vivo. The Journal of Neuroscience  : The Official Journal of the Society for Neuroscience, 29(22) Guo, F., Maeda, Y., Ma, J., Xu, J., Horiuchi, M., Miers, L., … Pleasure, D. (2010). Pyramidal neurons are generated from oligodendroglial progenitor cells in adult piriform cortex. The Journal of Neuroscience  : The Official Journal of the Society for Neuroscience, 30(36) Hart, I. K., Richardson, W. D., Heldin, C. H., Westermark, B., & Raff, M. C. (1989). PDGF receptors on cells of the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) cell lineage. Development (Cambridge, England), 105(3) Hill, R. a, & Nishiyama, A. (2014). NG2 cells (polydendrocytes): listeners to the neural network with diverse properties. Glia, 62(8) Honsa, P., Pivonkova, H., Dzamba, D., Filipova, M., & Anderova, M. (2012). Polydendrocytes display large lineage plasticity following focal cerebral ischemia. PLoS ONE, 7(5) Huang, W., Zhao, N., Bai, X., Karram, K., Trotter, J., Goebbels, S., … Kirchhoff, F. (2014). Novel NG2-CreERT2 knock-in mice demonstrate heterogeneous differentiation potential of NG2 glia during development. Glia, 62(6) Chang, A., Nishiyama, A., Peterson, J., Prineas, J., & Trapp, B. D. (2000). NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells in adult human brain and multiple sclerosis lesions. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience Chang, A., Tourtellotte, W. W., Rudick, R., & Trapp, B. D. (2002). Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis. The New England Journal of Medicine, 346(3) Chekenya, M., Rooprai, H. K., Davies, D., Levine, J. M., Butt, a M., & Pilkington, G. J. (1999). The NG2 chondroitin sulfate proteoglycan: role in malignant progression of human brain tumours. International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience, 17(5-6) 34

Chittajallu, R., Aguirre, a, & Gallo, V. (2004). NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. The Journal of Physiology, 561(Pt 1) Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., & Bergles, D. E. (2010). NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron, 68(4) Kang, S. H., Li, Y., Fukaya, M., Lorenzini, I., Cleveland, D. W., Ostrow, L. W., … Bergles, D. E. (2013). Degeneration and impaired regeneration of gray matter oligodendrocytes in amyotrophic lateral sclerosis. Nature Neuroscience Káradóttir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., & Attwell, D. (2008). Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter. Nature Neuroscience, 11(4) Kassis, H., Chopp, M., Liu, X. S., Shehadah, A., Roberts, C., & Zhang, Z. G. (2014). Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International, 77 Keirstead, H. S., Levine, J. M., & Blakemore, W. F. (1998). Response of the oligodendrocyte progenitor cell population (Defined by NG2 labelling) to demyelination of the adult spinal cord. Glia, 22(2) Kessaris, N., Fogarty, M., Iannarelli, P., Grist, M., Wegner, M., & Richardson, W. D. (2006). Competing waves of oligodendrocytes in the forebrain and postnatal elimination of an embryonic lineage. Nature Neuroscience, 9(2) Komitova, M., Serwanski, D. R., Lu, Q. R., & Nishiyama, A. (2011). NG2 cells are not a major source of reactive astrocytes after neocortical stab wound injury. Glia, 59(5) Komitova, M., Zhu, X., Serwanski, D. R., & Nishiyama, A. (2009). NG2 cells are distinct from neurogenic cells in the postnatal mouse subventricular zone. The Journal of Comparative Neurology, 512(5) Kondo, T., & Raff, M. (2000). Oligodendrocyte precursor cells reprogrammed to become multipotential CNS stem cells. Science (New York, N.Y.), 289(5485) Lee, Y., Morrison, B. M., Li, Y., Lengacher, S., Farah, M. H., Hoffman, P. N., … Rothstein, J. D.

(2012).

Oligodendroglia

metabolically

neurodegeneration. Nature, 487(7408) 35

support

axons

and

contribute

to

Levine, J. M., & Card, J. P. (1987). Light and electron microscopic localization of a cell surface antigen (NG2) in the rat cerebellum: association with smooth protoplasmic astrocytes. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience, 7(9) Levine, J. M., & Stallcup, W. B. (1987). Plasticity of Developing Cerebellar Cells in v & o Studied Antibodies Against the NG2 Antigen with Tetanus toxin, 7(September) Levison, S. W., Young, G. M., & Goldman, J. E. (1999). Cycling cells in the adult rat neocortex preferentially generate oligodendroglia. Journal of Neuroscience Research, 57(April) Li, W., Tang, Y., Fan, Z., Meng, Y., Yang, G., Luo, J., & Ke, Z.-J. (2013). Autophagy is involved in oligodendroglial precursor-mediated clearance of amyloid peptide. Molecular Neurodegeneration, 8(1) Matsumoto, H., Kumon, Y., Watanabe, H., Ohnishi, T., Shudou, M., Chuai, M., … Tanaka, J. (2008). Accumulation of macrophage-like cells expressing NG2 proteoglycan and Iba1 in ischemic core of rat brain after transient middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 28 Matthias, K., Kirchhoff, F., Seifert, G., Hüttmann, K., Matyash, M., Kettenmann, H., & Steinhäuser, C. (2003). Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate

transporters

defines

distinct

astrocyte

populations

in

the

mouse

hippocampus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience McDonald, J. W., Levine, J. M., & Qu, Y. (1998). Multiple classes of the oligodendrocyte lineage are highly vulnerable to excitotoxicity. Neuroreport, 9(12) McIver, S. R., Muccigrosso, M., Gonzales, E. R., Lee, J. M., Roberts, M. S., Sands, M. S., & Goldberg, M. P. (2010). Oligodendrocyte degeneration and recovery after focal cerebral ischemia. Neuroscience, 169(3) Mckhann, G., Drachman, D., & Folstein, M. (1984). Views & reviews Clinical diagnosis of Alzheimer ’ s disease, (July) Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., & AlvarezBuylla, A. (2006). Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult 36

brain. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience, 26(30) Nery, S., Wichterle, H., & Fishell, G. (2001). Sonic hedgehog contributes to oligodendrocyte specification in the mammalian forebrain. Development (Cambridge, England), 128(4) Nielsen, H., Ek, D., Avdic, U., Orbjörn, C., Hansson, O., Veerhuis, R., … Wennström, M. (2013). NG2 cells, a new trail for Alzheimer’s disease mechanisms?

Acta

Neuropathologica Communications Nielsen, H., Ek, D., Orbjörn, C., Minthon, L., & Wennström, M. (2012). Oligodendrocyte progenitor fate in response to beta-amyloid exposure. Alzheimer’s & Dementia, 8(4) Nishiyama, A., Dahlin, K. J., Prince, J., Johnstone, S., & Stallcup, W. B. (1991). The primary structure of NG2, a novel membrane-spanning proteoglycan. The Journal of Cell Biology, 114(2) Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., & Stallcup, W. B. (1996). Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain. Journal of Neuroscience Research, 43 Nishiyama, A., Yu, M., Drazba, J. A., & Tuohy, V. K. (1997). Normal and reactive NG2+ glial cells are distinct from resting and activated microglia. Journal of Neuroscience Research, 48(January) Ohta, K., Iwai, M., Sato, K., Omori, N., Nagano, I., Shoji, M., & Abe, K. (2003). Dissociative increase of oligodendrocyte progenitor cells between young and aged rats after transient cerebral ischemia. Neuroscience Letters, 335 Ong, W. Y., & Levine, J. M. (1999). A light and electron microscopic study of NG2 chondroitin sulfate proteoglycan-positive oligodendrocyte precursor cells in the normal and kainate-lesioned rat hippocampus. Neuroscience, 92(1) Pantoni, L., Garcia, J. H., & Gutierrez, J. A. (1996). Cerebral White Matter Is Highly Vulnerable to Ischemia. Stroke , 27 (9 ) Philips, T., Bento-Abreu, A., Nonneman, A., Haeck, W., Staats, K., Geelen, V., … Robberecht, W. (2013). Oligodendrocyte dysfunction in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Brain, 136(2) 37

Pivonkova, H., Benesova, J., Butenko, O., Chvatal, A., & Anderova, M. (2010). Impact of global cerebral ischemia on K + channel expression and membrane properties of glial cells in the rat hippocampus. Neurochemistry International, 57(7) Pringle, N. P., Collarini, E. J., Mosley, M. J., Heldin, C. H., Westermark, B., & Richardson, W. D. (1989). PDGF A chain homodimers drive proliferation of bipotential (O-2A) glial progenitor cells in the developing rat optic nerve. The EMBO Journal, 8(4) Pringle, N. P., & Richardson, W. D. (1993). A singularity of PDGF alpha-receptor expression in the dorsoventral axis of the neural tube may define the origin of the oligodendrocyte lineage. Development (Cambridge, England), 117(2) Reynolds, R., & Hardy, R. (1997). Oligodendroglial progenitors labeled with the O4 antibody persist in the adult rat cerebral cortex in vivo. Journal of Neuroscience Research, 47(5) Rhodes, K. E., Raivich, G., & Fawcett, J. W. (2006). The injury response of oligodendrocyte precursor cells is induced by platelets, macrophages and inflammation-associated cytokines. Neuroscience, 140(1) Rivers, L. E., Young, K. M., Rizzi, M., Jamen, F., Psachoulia, K., Wade, A., … Richardson, W. D. (2008). PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice. Nature Neuroscience, 11(12) Roth, A. D., Ramírez, G., Alarcón, R., & Von Bernhardi, R. (2005). Oligodendrocytes damage in Alzheimer’s disease: Beta amyloid toxicity and inflammation. Biological Research, 38(4) Rowitch, D. H., & Kriegstein, A. R. (2010). Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature, 468(7321) Schefft, C. (2013). Spatial arrangement of NG2 cells and their activation in a mouse model of Alzheimer’s diseases. Glia, 61 Schools, G. P., Zhou, M., & Kimelberg, H. K. (2003). Electrophysiologically “complex” glial cells freshly isolated from the hippocampus are immunopositive for the chondroitin sulfate proteoglycan NG2. Journal of Neuroscience Research, 73(6) Schumacher, M., Hussain, R., Gago, N., Oudinet, J. P., Mattern, C., & Ghoumari, A. M. (2012). Progesterone synthesis in the nervous system: Implications for myelination and myelin repair. Frontiers in Neuroscience, 6(FEB) 38

Sizonenko, S. V., Camm, E. J., Dayer, A., & Kiss, J. Z. (2008). Glial responses to neonatal hypoxic-ischemic injury in the rat cerebral cortex. International Journal of Developmental Neuroscience, 26 Stallcup, W. B., & Beasley, L. (1987). Bipotential Glial Precursor Cells of the Optic Nerve Express the NG2 Proteoglycan. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience, 7(September 1987) Sypecka, J., Sarnowska, a., & Domanska-Janik, K. (2009). Crucial role of the local microenvironment in fate decision of neonatal rat NG2 progenitors. Cell Proliferation, 42(5) Sypecka, J., Sarnowska, A., Gadomska-Szabłowska, I., Lukomska, B., & Domanska-Janik, K. (2013). Differentiation of glia-committed NG2 cells: The role of factors released from hippocampus and spinal cord. Acta Neurobiologiae Experimentalis, 73 Tamura, Y., Kataoka, Y., Cui, Y., Takamori, Y., Watanabe, Y., & Yamada, H. (2007). Multidirectional differentiation of doublecortin- and NG2-immunopositive progenitor cells in the adult rat neocortex in vivo. European Journal of Neuroscience, 25(12) Tan, A. M., Colletti, M., Rorai, A. T., Skene, J. H. P., & Levine, J. M. (2006). Antibodies against the NG2 proteoglycan promote the regeneration of sensory axons within the dorsal columns of the spinal cord. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience, 26(18) Tanaka, K., Nogawa, S., Ito, D., Suzuki, S., Dembo, T., Kosakai, a, & Fukuuchi, Y. (2001). Activation of NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells during post-ischemic reperfusion in the rat brain. Neuroreport, 12(10) Tanaka, K., Nogawa, S., Ito, D., Suzuki, S., Dembo, T., & Kosakai, A. (2003). Activation and proliferation of oligodendrocyte progenitor cells after brain ischemia in the rat. International Congress Series, 1252, 435–444 Triaca, V., & Tirassa, P. (2003). Circulating NGF antibody alters the distribution of NG2 and CD56 positive cells in the brain of an animal model of inflammatory disorder. Archives Italiennes de Biologie Tripathi, R. B., Rivers, L. E., Young, K. M., Jamen, F., & Richardson, W. D. (2010). NG2 glia generate new oligodendrocytes but few astrocytes in a murine experimental

39

autoimmune encephalomyelitis model of demyelinating disease. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience, 30(48) VonDran, M. W., Singh, H., Honeywell, J. Z., & Dreyfus, C. F. (2012). Levels of BDNF impact oligodenrocyte lineage cells following a cuprizone lesion. Journal of Neuroscience Research, 29(6) Watanabe, M., Toyama, Y., & Nishiyama, A. (2002). Differentiation of proliferated NG2positive glial progenitor cells in a remyelinating lesion. Journal of Neuroscience Research Wennstrom, M., Janelidze, S., Bay-richter, C., Minthon, L., & Brundin, L. (2014). ProInflammatory Cytokines Reduce the Proliferation of NG2 Cells and Increase Shedding of NG2 In Vivo and In Vitro. PLoS ONE, 9(10) White, B., Nathe, R., & Maris, D. O. (2010). B-catenin signaling increases in proliferating NG2+ progenitors and astrocytes during post-traumatic gliogenesis in the adult brain. Stem Cells, 28(2) Wilson, H. C., Scolding, N. J., & Raine, C. S. (2006). Co-expression of PDGFa receptor and NG2 by oligodendrocyte precursors in human CNS and multiple sclerosis lesions. Journal of Neuroimmunology, 176 Xiang, P., Zhu, L., Jiang, H., & He, B. P. (2015). The activation of NG2 expressing cells is downstream to microglial reaction and mediated by the transforming growth factor beta 1. Journal of Neuroimmunology, 279 Xie, M., Lynch, D. T., Schools, G. P., Feustel, P. J., Kimelberg, H. K., & Zhou, M. (2007). Sodium channel currents in rat hippocampal NG2 glia: Characterization and contribution to resting membrane potential. Neuroscience, 150(4) Xu, J., Chen, S., Ahmed, S. H., Chen, H., Ku, G., Goldberg, M. P., & Hsu, C. Y. (2001). Amyloid-beta peptides are cytotoxic to oligodendrocytes. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience, 21(1) Yang, Z., Suzuki, R., Daniels, S. B., Brunquell, C. B., Sala, C. J., & Nishiyama, A. (2006). NG2 glial cells provide a favorable substrate for growing axons. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience, 26(14)

40

Zhao, J. W., Raha-Chowdhury, R., Fawcett, J. W., & Watts, C. (2009). Astrocytes and oligodendrocytes can be generated from NG2+ progenitors after acute brain injury: Intracellular localization of oligodendrocyte transcription factor 2 is associated with their fate choice. European Journal of Neuroscience, 29(9) Zhou, Q., Wang, S., & Anderson, D. J. (2000). Identification of a Novel Family of Oligodendrocyte Lineage-Specific Basic Helix–Loop–Helix Transcription Factors. Neuron, 25(2) Zhu, X., Bergles, D. E., & Nishiyama, A. (2008). NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development (Cambridge, England), 135(1) Zhu, X., Hill, R. a, Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., & Nishiyama, A. (2011). Agedependent fate and lineage restriction of single NG2 cells. Development (Cambridge, England), 138(4) Ziskin, J., Nishiyama, A., Rubio, M., Fukaya, M., & Bergles, D. E. (2007). Vesicular release of glutamate from unmyelinated ayons in white matter. Nature Neuroscience, 10(3)

41