Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra genetiky a mikrobiologie DIZERTAČNÍ PRÁCE

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra genetiky a mikrobiologie

DIZERTAČNÍ PRÁCE

Rezistence k makrolidům, linkosamidům a streptograminům u koaguláza negativních stafylokoků v ČR

Mgr. Gabriela Novotná

Praha 2007

1

Tato dizertační práce byla vypracována v Mikrobiologickém ústavu Akademie věd České republiky v Laboratoři biologie sekundárního metabolismu pod odborným vedením Ing. Jiřího Janaty, CSc. v období říjen 2000 - září 2007.

Práce vznikla za podpory Grantové agentury Univerzity Karlovy (148/2005/B-Bio/PřF), Grantové agentury ČR (GA204/04/0801), Grantové agentury Akademie věd ČR (IAA600200519) a Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ČR (1M06011)

Prohlašuji, že jsem předloženou práci vypracovala samostatně a použila jen prameny, které cituji a uvádím v seznamu použité literatury. Dále prohlašuji, že tato práce, ani její podstatná část, nebyla předložena k získání jiného titulu

V Praze, září 2007

....................................... Mgr. Gabriela Novotná

2

Především bych chtěla poděkovat svému školiteli Ing. Jiřímu Janatovi, CSc. za vedení práce, odborné diskuze, cenné rady a kritické připomínky. Dále děkuji RNDr. Petru Petrášovi za konzultace týkající se diagnostiky koaguláza negativních stafylokoků a MVDr. Otu Melterovi, Ph.D. za pomoc při genotypizování izolátů S. haemolyticus. Anně Matuškové děkuji za praktické rady při práci s rekombinantní DNA a s heterologními proteiny. Děkuji též všem ostatním členům laboratoře Biologie sekundárního metabolismu, kteří svými radami a pomocí přispěli ke vzniku této práce. Spolustolovníkům v jídelně MBÚ děkuji za příjemné chvilky. Velký dík pak patří mému Alešovi za to, že to se mnou vydržel.

3

Obsah

I. ÚVOD

6

II. LITERÁRNÍ ÚVOD

8

1. Koaguláza negativní stafylokoky - nozokomiální infekce, rezistence a terapeutické možnosti. 9 2. Makrolidy, linkosamidy a streptograminy (MLS) 2.1. Makrolidy 2.2. Linkosamidy 2.3. Streptograminy

12 12 14 15

3. Mechanismy rezistence k makrolidům, linkosamidům a streptograminům u stafylokoků 3.1. Změna zásahového místa 3.1.1. MLSB rezistence - methylace 23S rRNA v pozici A2058 3.1.2. PhLOPSA rezistence - methylace 23S rRNA v pozici A2503 3.1.3. Rezistence k MLS antibiotikům mutacemi v zásahovém místě 3.2. Inaktivace MLS antibiotik 3.2.1. Inaktivace makrolidů 3.2.2. Inaktivace linkosamidů 3.2.3. Inaktivace streptograminů A 3.2.4. Inaktivace streptograminů B 3.3. Transportní rezistence 3.3.1. ABC-transportéry 3.3.2. Rezistence k MLS antibiotikům = 2. třída ABC proteinů 3.3.3. Jedná se skutečně o transport? 3.3.4. Regulace: atenuace translace nebo terminace transkripce?

17 17 17 20 20 21 21 22 22 23 23 24 24 27 27

4. Frekvence MLS rezistencí u CoNS a klinický význam jednotlivých rezistenčních mechanismů 29 4.1. Rezistence k makrolidům a linkosamidům 29 4.2. Inducibilní rezistence 31 4.3. Rezistence ke streptograminům 31 4.4. Mobilní elementy nesoucí MLS rezistenční geny 33

III.VÝSLEDKY

34

1. Rozšíření mechanismů rezistence k makrolidům a linkosamidům u methicilin rezistentních koaguláza negativních stafylokoků v České republice a výskyt neznámého mechanismu rezistence k linkosamidům 35 2. Nová varianta proteinu streptograminové rezistence, Vga(A)LC, ze Staphylococcus haemolyticus se změnou substrátové specifity směrem k linkosamidům

36

3. In vitro účinnost telithromycinu a quinupristinu/dalfopristinu proti methicilin rezistentním koaguláza negativním stafylokokům s definovaným rezistenčním genotypem 37 4. Sekvenční analýza okolí rezistenčního genu msr(A) u S. haemolyticus (data pro připravovanou publikaci)

38

IV. DISKUZE

46

V. REFERENCE

51

4

Zkratky

Seznam zkratek: ABC protein ARE rodina CLI

(ATP-binding casette) ATP-vazebný protein (antibiotic resistance) rodina ABC proteinů klindamycin

cMLSB CoNS CSLI DDM ERY

konstitutivní MLSB rezistence koaguláza negativní stafylokoky Clinical Standard Laboratory Institute disková difúzní metoda erythromycin

iMLSB IR IS ISLE LIN

inducibilní MLSB rezistence invertovaná repetice inzerční sekvence inzerčním sekvencím podobný element linkomycin

LSA

rezistence k linkosamidům a streptograminům A

MLSB

rezistence k makrolidům linkosamidům a streptograminům B

MSB PFGE

rezistence k makrolidům a linkosamidům pulzní gelová elektroforéza rezistence k florfenikolům, linkosamidům, oxazolidinonům pleuromutilinům a streptograminům A Pristinamycin IIA quinupristin a dalfopristin streptograminy A streptograminy B Státní ústav pro kontrolu léčiv telithromycin levá terminální invertovaná repetice

PhLOPSA PIIA Q/D SgA SgB SÚKL TEL TIRL CFU RBS TIRR TM doména

(ribosom binding site) vazebné místo pro ribozóm pravá terminální invertovaná repetice transmembránová doména

5

ÚVOD

I. ÚVOD

6

ÚVOD

Na počátku dvacátého století byly infekce celosvětově hlavní příčinou úmrtí. Teprve s nástupem antibiotické éry významně klesla mortalita způsobená bakteriálními infekcemi. Všeobecně se předpokládalo, že problém infekčních chorob je objevem antibiotik definitivně vyřešen. Při slyšení v Kongresu v r. 1969 hlavní lékař zdravotnických zařízení USA William H. Stewart prohlásil: „Přišel čas uzavřít kapitolu infekčních nemocí.“ (44). Protože existující spektrum antibiotik bylo v té době pro kontrolu infekčních chorob dostatečné, obrátila se pozornost farmaceutických firem na výzkum lukrativnějších skupin léčiv zaměřených na léčbu chronických chorob. Za posledních třicet let tak byla na trh uvedena pouze dvě skutečně nová antibiotika linezolid a daptomycin (139, 191). V souvislosti s celosvětovým nárůstem používání antibiotik se však u mikroorganismů začaly objevovat a hromadit rezistence k těmto látkám. Zatím ke každé skupině antibiotik, která byla do roku 2004 uvedena na trh, se časem u patogenních mikroorganizmů objevil rezistenční mechanismus, který je důvodem řady terapeutických selhání (94). Enormní a často neuvážené používání antibiotik vedlo k selekci multirezistentních baktérií, zejména v nemocnicích kde jsou ideální podmínky pro jejich vznik a šíření. Ve Spojených státech byla zaznamenána rezistence alespoň k jednomu antibiotiku u 70% původců nosokomiálních infekcí (90). Dokonce i vankomycin používaný pouze jako antibiotikum poslední volby zejména proti problematickým methicilin rezistentním stafylokokům ztrácí svoji účinnost. V roce 1997 byly objeveny první částečně rezistentní kmeny Staphylococcus aureus (61). O dva roky později byl dokonce popsán první klinický případ plně vankomycin rezistentního kmene tohoto původce vážných postoperačních infekcích (16). Methicilin rezistentní stafylokoky jsou běžně rezistentní i k ostatním beta-laktamům, gentamicinu. 80% z nich je také rezistentní alespoň k jednomu z pěti následujících antibiotik: erythromycinu, klindamycinu, cotrimoxazolu, ciprofloxacinu a tetracyklinu. Zatímco biologie a způsob šíření methicilin rezistentních kmenů Staphylococcus aureus (MSRA) byly podrobně studovány jak ve světě tak i na území ČR (114, 115), rezistence u koaguláza negativních stafylokoků (CoNS) je prostudována jen okrajově. Přitom právě tyto blízce příbuzné mikroorganismy mohou sloužit jako zdroj nových rezistenčních determinant pro klinicky významnější patogen. Mimoto jsou CoNS důležitým infekčním agens u hospitalizovaných imunokomprimovaných pacientů a stejně tak u pacientů s intravenózními katétry. V roce 1996 byl v rámci rozsáhlé epidemiologické studie rezistence k methicilinu Národní referenční laboratoří pro stafylokoky shromážděn soubor 2234 klinických izolátů stafylokoků (1315 izolátů S. aureus a 919 izolátů CoNS). Hlavním záměrem epidemiologické studie, která byla realizována Národní referenční laboratoří pro antibiotika, bylo zmapovat klonální strukturu methicilin rezistentních izolátů Staphylococcus aureus na území ČR (113-115). My jsme využili tutéž sbírku izolátů pro studium mechanismů rezistence k makrolidům a linkosamidům u methicilin rezistentních CoNS. Protože jsme mezi izoláty zjistili neobvyklou distribuci rezistenčních mechanismů a také jsme objevili nový rezistenční fenotyp naznačující přítomnost doposud neznámé rezistenční determinanty rozhodli jsme se pokračovat v podrobnějším studiu těchto jevů. Výsledky studia jsou shrnuty ve třech přijatých a jedné připravované publikaci, které jsou prezentovány v předkládané disertační práci. Uplatněním postupů klinické mikrobiologie, molekulární biologie i bakteriální genetiky jsme se pokusili o ucelený pohled na problematiku vzniku a šíření rezistencí k antibiotikům u klinicky významných mikroorganizmů

7

II. LITERÁRNÍ ÚVOD

8

LITERÁRNÍ ÚVOD Koaguláza negativní stafylokoky

1.

Koaguláza

negativní

stafylokoky

-

nozokomiální

infekce,

rezistence a terapeutické možnosti.

Koaguláza negativní stafylokoky (CoNS) patří mezi nejčastěji izolované mikroorganismy v laboratořích klinické mikrobiologie. Vzhledem ke své všudypřítomnosti a relativně nízké virulenci byly dlouho považovány za klinicky nevýznamné kontaminanty klinických vzorků. Avšak postupem času začaly být CoNS vnímány jako důležité etologické agens nozokomiálních infekcí a nyní patří dokonce mezi nejčastější příčinu infekcí u hospitalizovaných pacientů s intravenózními katétry a u imunokomprimovaných pacientů. Podle studie National Nosocomial Infections Surveillance System byly v letech 1990-1999 CoNS nejčastějšími pozorovanými patogeny (37,7 %, v porovnání s 12,6 % pro S. aureus) izolovanými z infekcí krevního řečiště na jednotkách intenzivní péče (189). Jejich význam jako etiologické agens nozokomiálních infekcí je dán zejména výskytem na površích lidského těla ve velkých koncentracích, až 103 - 106 CFU/cm2 (82), dále pak selekcí, která je výsledkem používání širokospektrých antibiotik v nemocnicích, schopností adherovat a tvořit biofilm na površích intravaskulárních katétrů a jiných lékařských nástrojů a relativně nízkými nutričními nároky (137). Protože až 85 % izolátů CoNS je výsledkem kontaminace, zejména při odběru krve, je velmi problematické odlišení takovýchto kontaminací od skutečných původců infekcí krevního řečiště (195). Pokud je tentýž mikroorganismus alespoň dvakrát po sobě izolován z nezávislých hemokultur, může být považován za původce infekce. U katétrové infekce je nutný průkaz stejného mikroorganismu z hemokultury a kultury z povrchu katétru. Pro druh S. epidermidis je pro potvrzení nutné kromě druhové identifikace také ověření totožnosti kmene jeho typizací (81). Mezi nejčastěji izolované stafylokokové izoláty v Evropě v letech 2002-2004 patřily tyto druhy: S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. capitis, S. warnerii, S. xylosis (156). Jednotlivé druhy CoNS se liší svojí virulencí. Velké zastoupení izolátů identifikovaných jako infekční agens bylo pozorováno u S. lugundensis (91 % z celkového počtu izolátů tohoto druhu) a S. saprophyticus (88 %), naproti tomu poměr klinicky významných izolátů ke kontaminantům byl menší u S. epidermidis (52 %) a S. haemolyticus (11 %) (180). Tyto dva posledně zmíněné druhy však často tvoří většinu (až 90 %) všech CoNS izolátů. Zatímco patogenita druhu S. epidermidis je spojena zejména se schopností adheze a tvorby biofilmu na polymerních površích zdravotnického materiálu, u podstatně virulentnějších druhů S. lugdunensis a S. schleiferi, které způsobují agresivní a až život ohrožující infekce, jsou patogenní mechanismy podobné těm z S. aureus (produkce clumping faktoru a termostabilní DNásy (189)). S. saprophyticus je významným oportunním patogenem způsobujícím infekce močových cest. Specifická afinita k uroepitealním buňkám je dána řadou povrchových proteinů typických pro tento druh. Problémem nozokomiálních infekcí je vysoký výskyt kmenů mnohočetně rezistentních k antibiotikům. Stejně jako u S. aureus je hlavním problémem infekcí způsobených CoNS rezistence k oxacilinu. Zatímco u S. aureus se rezistence vyskytuje u necelých 30 %, u CoNS to je až 77 % rezistentních izolátů (Tab. 1.1.). Navíc rezistence k oxacilinu s sebou nese výrazně vyšší podíl rezistence k dalším antibiotikům. Kromě všech β-laktamů jsou oxacilin-rezistentní CoNS často rezistentní také k erythromycinu (72,7 %), ciprofloxacinu (67,5 %), levofloxacinu (62,9 %),

9


trimethoprim-sulfamethoxazolu (47,4 %) a klindamycinu (32,5 %). Naopak některá novější antibiotika vankomycin

a

teikoplanin

(glykopeptidy),

quinupristin/dalfopristin

(streptograminy),

linezolid

(oxazilidony) a daptomycin (lipopeptidy) si zachovávají dobrou účinnost, a jsou tedy považovány za antibiotika poslední volby pro léčbu nozokomiálních stafylokokových infekcí (Tab. 1.2.).

Tab.1.1. Evropský průměr četností rezistence k oxacilinu u CoNS a S. aureus. Data převzata z rozsáhlých studií SENTRY antimicrobial surveillance programme.

Izolovány v letech: 1997-1999 2002-2004 2005

CoNS Oxacilin Počet rezistentní izolátů (%) 2068 73,1 1942 77 941 71,5

S. aureus Oxacilin Počet rezistentní izolátů (%) 3477 26,9 (35) 4842 26,7 (156) 2746 29,1 (157)

Reference:

Nicméně i k těmto antibiotikům se u stafylokoků vyvíjí rezistence. Rezistence ke glykopeptidům u klinických izolátů byla poprvé pozorována již v roce 1979 a 1983 u S. epidermidis (175) a v roce 1986 u S. haemolyticus (168). Teprve v roce 1997 byly objeveny částečně rezistentní kmeny S. aureus (61) a o dva roky později byl dokonce popsán první klinický případ plně vankomycin rezistentního kmene tohoto původce vážných postoperačních infekcí (16). Mechanismus intermediární glykopeptidové rezistence u stafylokoků je způsoben strukturními změnami v buněčné stěně, konkrétně zvýšením počtu vazebných míst pro vankomycin. To má za následek jeho "vychytání" ještě před navázáním do zásahového místa, jímž je prekurzor buněčné stěny (59). Rezistence k vysokým hladinám glykopeptidů je u stafylokoků způsobena získáním enterokokového shluku genů vanA, které kódují alternativní část biosyntetické dráhy buněčné stěny (194). Také mechanismy rezistence ke streptograminům jsou poměrně dobře prostudovány. I přes dlouholeté používání streptograminových antibiotik ve veterinární praxi si kombinace streptograminů A a B quinupristin/dalfopristin zachovává dobrou účinnost. A to díky synergistickému účinku obou antibiotik, který je zachován i přes získání rezistence k jednomu ze streptograminů (25). Linezolid a daptomycin jsou prvními zástupci dvou nových skupin antibiotik oxazilidonů a cyklických lipopeptidů. Mechanismus antibakteriálního účinku oxazolidinových antibiotik spočívá v jejich vazbě na 50S podjednotku bakteriálního ribozómu v peptidyl-tRNA vazebném místě P, což zabraňuje vazbě molekuly fMet-tRNA a tvorby iniciačního komplexu (176). Rezistence k linezolidu u S. aureus je popisována ojediněle a to v souvislosti s dlouhodobou linezolidovou léčbou a přítomností cizorodých materiálů (133). Výskyt rezistence u CoNS se dle různých surveillančních programů pohybuje pod 0,1 %, avšak lokálně může být i vyšší a to díky šíření linezolid-rezistentních klonů v nemocničním prostředí (138). Daptomycin je proti CoNS, včetně oxacilin rezistentních izolátů, neúčinnějším z výše popsaných "nových" antibiotik. Jeho mechanismus účinku spočívá ve vazbě na membránu a tvorbě pórů propustných pro ionty, následná depolarizace membrány způsobuje narušení energetického metabolismu buňky a její smrt. Doposud bylo popsáno pouze pár ojedinělých případů daptomycin-rezistentních klinických izolátů S. aureus, u nichž se rezistence vyvinula během antibiotické léčby (101, 105).

10


Tab.1.2. Četnosti rezistencí k antibiotikům u klinických izolátů CoNS a S. aureus citlivých nebo rezistentních k oxacilinu v Evropě. Data z rozsáhlých studií SENTRY antimicrobial surveillance programme

Organismus Koaguláza negativní stafylokoky Oxacilin citlivé (počet izolátů) Erythromycin Ciprofloxacin Tetracyklin Levofloxacin Trimethoprim-sulfamethoxazol Klindamycin Rifampin Chloramfenikol Vankomycin Teikoplanin Quinupristin-Dalfopristin Linezolid Daptomycin Oxacilin rezistentní (počet izolátů) Erythromycin Ciprofloxacin Tetracyklin Levofloxacin Trimethoprim-sulfamethoxazol Klindamycin Rifampin Chloramfenikol Vankomycin Teikoplanin Quinupristin-Dalfopristin Linezolid Daptomycin

1997-1999a

Rezistentní (%) 2002-2004b

2005c

(556) 30,6 10,1 15,8 9,7 2,7 6,3 0 0,4 (1512) 72 50,5 22,2 47,9 15,1 24,5 0 0,5 -

(447) 28 8,7 16,2 7,8 11 3,8 0 0 0 0 0 (1495) 70,5 63,9 17,4 58,7 49,1 36,6 0 0,6 0,5 0 0

(268) 44 11,9 10,4 8,2 4,5 2,6 2,6 0 0 0 0 0 (673) 72,7 67,5 62,9 47,4 32,5 13,4 13 0 0,6 0,4 0 0

a

Diekema, DJ a kol., 2001 (35) Sader, HS a kol., 2006 (156) c Sader, HS a kol., 2007(157) b

11

LITERÁRNÍ ÚVOD Makrolidy, linkosamidy a streptograminy

2. Makrolidy, linkosamidy a streptograminy (MLS) Makrolidy, linkosamidy a streptograminy jsou chemicky velmi různorodé antibakteriální látky, které mají podobný mechanismus účinku spočívající ve vazbě antibiotika na velkou podjednotku bakteriálního ribozómu. V souvislosti s tím se vyvinuly i některé společné mechanismy rezistence bakterií k těmto antibiotikům. Producenty těchto látek jsou mikroorganismy rodu Streptomyces spp. Biologická aktivita těchto tří skupin látek je také velice podobná.

2.1. Makrolidy V letech 1999-2005 byly makrolidy třetí nejpoužívanější skupinou antibiotik v České republice a jejich spotřeba stále stoupá (SÚKL). Tyto antibiotika jsou tvořena 14-, 15-, nebo 16-členným laktonovým kruhem nesoucím jeden nebo více cukrů a několik dalších substitucí. Nejznámějším zástupcem makrolidů je erythromycin A (Obr.2.1.), který byl zaveden do klinické praxe již v roce 1952. Od té doby bylo vyvinuto několik generací makrolidů lišících se schopností indukovat rezistenci, rozšířeným spektrem účinku a lepší stabilitou v kyselém prostředí (198) (Tab. 2.1.). Tyto antibiotika jsou účinná hlavně proti grampozitivním kokům.

Tab.2.1. Přehled vlastností nejčastěji používaných makrolidových antibiotik.

Generace

Velikost laktonového kruhu

Název antibiotika erythromycin

1. generace

14 členný oleandomycin spiramycin

2. generace

16 členný

tylosin karbomycin A

Saccharopolyspora erythraea Streptomyces antibioticus Streptomyces ambofaciens Streptomyces fradiae Streptomyces thermotolerans

klarithromycin

semisyntetický

roxithromycin

semisyntetický

15 členný

azithromycin

semisyntetický

14 členný

telithromycin

semisyntetický

14 členný 3. generace

4. generace (ketolidy)

Producent

Charakteristické vlastnosti

indukce rezistence, malá stabilita v kyselém prostředí

neindukují rezistenci, malá stabilita v kyselém prostředí

indukují rezistenci, vylepšená stabilita v kyselém prostředí, širší antimikrobiální spektrum také proti mykobakteriím a chlamydiím. neindukují rezistenci, dobrá stabilita v kyselém prostředí, účinné i proti některým erythromycin rezistentním kmenům

12


Obr. 2.1. Chemické struktury některých streptograminových antibiotik (PubChem, NCBI)

makrolidových,

linkosamidových

a

Mechanismus účinku makrolidů spočívá ve vazbě antibiotika na velkou ribozomální podjednotku v blízkosti peptidyltransferasového místa, čímž inhibuje proteosyntézu (197). Avšak detailní mechanismus inhibice nebyl ještě zcela objasněn. Nedávno publikované krystalové struktury velké podjednotky ribozómu s navázanými antibiotiky potvrdily již dřívější biochemické analýzy vazby makrolidů na ribozóm (14, 51, 52, 162). Důležitým místem pro vazbu je interakce C5 mono- nebo disacharidového postranního řetězce 14-, 15- a 16-členných makrolidů s dusíkovými bázemi nukleotidů v pozicích A2058 a A2059 v doméně V molekuly 23S rRNA (E. coli číslování). Toto místo je pro vazbu antibiotik klíčové a vysvětluje, proč mutace či modifikace v tomto místě způsobují rezistenci k makrolidům. Na vazbě makrolidů se podílejí také ribozomální proteiny L4 a L22, což opět vysvětluje, proč mutace v těchto proteinech způsobují částečnou rezistenci (46). U makrolidů byly popsány čtyři různé mechanismy inhibice proteosyntézy: 1) Inhibice

13


prodlužování nascentního peptidu, 2) Stimulace disociace peptidyl-tRNA z ribozómu 3) Inhibice tvorby peptidové vazby a 4) zabránění správného složení velké ribozomální podjednotky. Všechny tyto mechanismy přispívají k celkovému účinku makrolidů. Nejdůležitější mechanismus inhibice pravděpodobně souvisí s vazbou makrolidů do tunelu, který vytváří velká podjednotka ribozómu (Obr. 2.2. a 2.3.). Dříve se předpokládalo, že tento tunel je pouze inertní struktura, kterou prochází právě syntetizovaný peptid, avšak nyní se zdá, že jde o dynamickou strukturu ovlivňující průběh proteosyntézy. Ačkoli je tento tunel relativně široký, obsahuje dvě zúžení, která jsou tvořena proteiny L4 a L22. Makrolidy vázající se do tohoto zúžení tak můžou blokovat cestu pro rostoucí peptid.

2.2. Linkosamidy Tato skupina antibiotik zahrnuje linkomycin a jeho semisyntetické deriváty (Obr. 2.1.). Linkomycin byl poprvé izolován v roce 1963 z kmene Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis (106). Skládá se ze dvou stavebních jednotek, cukerné (methylthiolinkosaminid) a aminokyselinové (derivát prolinu), spojených amidovou vazbou. Jedinými používanými antibiotiky této skupiny v klinické praxi jsou linkomycin a mnohem účinnější klindamycin. Klindamycin je semisyntetický derivát připravený chlorací linkomycinu na sedmém uhlíku aminocukerné části. Derivátem klindamycinu je pirlimycin, který je používán výhradně ve veterinární medicíně. Mechanismus účinku linkosamidů je stejný jako u makrolidů a je způsoben disociací peptidyltRNA z ribozómu. Rozdíl spočívá ve vzdálenosti místa vazby antibiotika od peptidyltransferasového místa, a tedy i v délce disociovaného nascentního peptidu (Obr. 2.2.) (182). Kromě grampozitivních koků jsou linkosamidy účinné také proti anaerobním bakteriím.

14


Obr. 2.2. Struktura 50S podjednotky v komplexu s analogem peptidyl-tRNA a s různými MLS antibiotiky. Z obrázku je patrná různá vzdálenost antibiotik od peptidyltransferasového místa, konkrétně od dusíku N3 adeninu v pozici A2451(adenin ČEVENĚ, N3 - ŽLUTĚ) V tabulce je vzdálenost vyjádřená v Å. Různá vzdálenost antibiotika od peptidyltransferasového místa se projevuje v různé délce peptidu disociujícího z ribozómu účinkem antibiotika. V experimentu byly použity dvě různé mRNA: MS mRNA a erm mRNA kódující různé polypeptidy (délka disociujících peptidů hlavní frakce je zvýrazněná v tabulce tlustě). ZELENÉ - nukleotidy A2058, A2059 a A2062 23S rRNA, které jsou důležité pro vazbu makrolidových antibiotik MODŘE A ŽLUTĚ proteiny L4 a L22 tvořící zúžení tunelu. a) 50S podjednotka v komplexu s analogem tRNA b) - f) 50S podjednotka s navázanými antibiotiky. ČERVENĚ případně i FIALOVĚ, A ČERNĚ (jsou pro odlišení zvýrazněny jednotlivé struktury sloučenin). Struktura 50S podjednotky v komplexu s pristinamycinem IA (SgB) chybí, avšak shodná velikost disociovaného peptidu s erythromycinem naznačuje podobné místo vazby na ribozóm Převzato z Tenson et al, 2003 (182)

2.3. Streptograminy Streptograminy jsou přírodní látky produkované mikroorganismy rodu Streptomyces. Tuto skupinu antibiotik tvoří dva typy látek, streptograminy A (polysaturované cyklické peptidy, SgA) a streptograminy B (cyklické hexadepsipeptidy, SgB), které jsou současně produkovány jednou bakterií v přibližném poměru 7:3 (134). Jednotlivě mají SgA a SgB bakteriostatické účinky proti grampozitivním kokům, avšak při společném působení obou látek vykazují silný baktericidní efekt (67). Ačkoli byly streptograminy objeveny již v roce 1950, v klinické praxi nebyly příliš hojně využívány. Donedávna byl užíván pouze pristinamycin (kombinace pristinamycinu IA a pristinamycinu IIA), a to pouze ve Francii pro léčbu stafylokokových infekcí. Klinický význam těchto antibiotik vzrostl až s vývojem semisyntetických derivátů dalfopristinu (streptogramin A) a quinupristinu (streptogramin B), které jsou

15


podávány jako alternativní antibiotikum proti vankomycin rezistentním grampozitivním kokům. V současné době je testován nový semisyntetický derivát XRP2868, který vykazuje až čtyřikrát větší účinnost in vitro než kombinace dalfopristinu a quinupristinu (38). Streptogramin A se váže do peptidyltransferasového místa ribozómu, pouze pokud zde není navázána aminoacyl-tRNA, a blokuje tak její navázání. Navíc vazba streptograminu A způsobuje konformační změny velké ribozomální podjednotky tak, že zvyšuje aktivitu streptograminu B a to více jak 100-krát (188). Streptogramin B naopak zabraňuje podobně jako makrolidy a linkosamidy prodlužování peptidu tím, že zabrání jeho prostupu tunelem (Obr. 2.3.). na rozdíl od streptograminu A je streptogramin B schopen se k ribozómu vázat ve všech stadiích translace.

Obr. 2.3. Struktura dalfoprisitinu a quinupristinu navázaných na velkou 50S podjednotku bakteriálního ribozómu. A) Elektronová densita dalfopristinu a quinupristinu navázaných na ribozóm B) Pozice dalfopristinu, quinupristinu a peptidyl-tRNA. Na obrázku je dobře vidět zablokování zúžení tunelu quinupristinem. Převzato z Mukhtar et al., 2005 (119)

16

LITERÁRNÍ ÚVOD Mechanismy rezistence

3.

Mechanismy

rezistence

k

makrolidům,

linkosamidům

a

streptograminům u stafylokoků Tři základní mechanismy rezistence k MLS antibiotikům byly popsány u stafylokoků: Změna zásahového místa může být způsobena jednak posttranskripční modifikací 23S rRNA, jednak mutacemi v 23S rRNA nebo v ribozomálních proteinech. Jiným mechanismem je inaktivace antibiotika buď jeho modifikací navázáním jiné sloučeniny, nebo jeho degradací. Třetím mechanismem je aktivní transport antibiotika ven z buňky.

3.1. Změna zásahového místa Tento mechanismus rezistence úzce souvisí s místem vazby a mechanismem účinku antibiotik. Protože se vazebná místa MLS antibiotik z velké části překrývají, také rezistence způsobená změnou zásahového místa je společná. V některých případech se může rezistence překrývat i s dalšími skupinami antibiotik, jež se váží na ribozóm a inhibují translaci.

3.1.1. MLSB rezistence - methylace 23S rRNA v pozici A2058 Nejčastějším typem rezistence k MLS antibiotikům je posttranskripční modifikace 23S rRNA, způsobená S-adenosylmethionin-dependentní methyltransferasou. Enzym methyluje adenin v pozici A2058 (E. coli číslování), která je esenciální pro vazbu antibiotik na ribozóm (86, 196-198). Methylace probíhá pouze během krátkého časového úseku během sestavování velké podjednotky, kdy je 23S rRNA přístupná enzymu. Sestavený ribozóm již nemůže být substrátem pro methyltransferasu, neboť molekula 23S rRNA je uložená hluboko uvnitř velké podjednotky (174). Modifikace na adeninu stericky brání vazbě antibiotika do svého zásahového místa. Protože se vazebná místa pro makrolidy, linkosamidy a streptograminy B překrývají, je tento mechanismus rezistence pro tyto antibiotika společný a je označován jako MLSB rezistence. Existují dva základní typy methyltransferas. Prvním typem jsou monomethyltransferázy, jejichž příkladem jsou Lmr(B) u producenta linkomycinu Streptomyces lincolnensis (135), Crl u producenta celesticetinu Streptomyces caelestis (29) nebo Lrm u Streptomyces lividans (73). Druhým typem jsou dimethyltransferasy, např. Erm(E) u producenta erythromycinu Saccharopolyspora erythrea nebo Erm(C) u stafylokoků. Zatímco monomethylace adeninu udílí rezistenci k vysokým koncentracím (> 1000 µg/ml) linkosamidů a nižším koncentracím (50-200 µg/ml) erythromycinu, tylosinu a karbomycinu, dimethylace způsobuje rezistenci k vysokým koncentracím (> 1000 µg/ml) všech pěti antibiotik (28, 29).

3.1.1.2. Regulace MLSB rezistence Geny erm kódující methyltransferasu mohou být exprimovány konstitutivně, nebo inducibilně za přítomnosti subinhibičních koncentrací induktoru. Inducibilní MLSB rezistence (iMLSB) byla poprvé popsána u Staphylococcus sp. v roce 1956, šest let po zavedení erythromycinu do klinické praxe (66). Účinnými induktory exprese iMLSB rezistence jsou pouze 14-členné a 15-členné makrolidy.

17


Neindukující 16-členné makrolidy, ketolidy, linkosamidy a streptograminy zůstávají i nadále účinné (197). Konstitutivní MLSB rezistence (cMLSB) byla poprvé popsána až v roce 1972. V důsledku používání neindukujících 16-členných makrolidů došlo k selekci konstitutivních mutant, které jsou rezistentní ke všem makrolidům, linkosamidům a streptograminům typu B (198). Fenotypový projev iMLSB rezistence lze pozorovat diskovým indukčním testem. Vedle disku s neindukujícím antibiotikem je položen disk s induktorem (erythromycinem) ve vzdálenosti max. 20 mm. Difúze erythromycinu směrem k disku s neindukujícím antibiotikem indukuje expresi erm genů, což se projeví tvorbou

Obr. 3.1. Diskový indukční test. E - erythromycin (15 ug) DA - klindamycin (2 ug)

inhibiční zóny deformované do tvaru písmene "D" (Obr. 3.1.) (40). Mechanismem regulace genové exprese MLSB rezistence je atenuace translace (37), která je řízena regulační oblastí předcházející oblast strukturního genu. Mechanismus byl poprvé popsán pro gen erm(C) nesený na plazmidu pE194 (64). Sekvence před genem obsahuje dvě Shine-Dalgarno (SD) sekvence pro dva otevřené čtecí rámce. První, SD-1 oblast, slouží pro přepis 14-aminokyselin dlouhého kontrolního peptidu a SD-2 pro přepis genu erm(C). Díky 4 invertovaným repeticím, které tvoří vlásenky, může tato kontrolní oblast zaujímat dva konformační stavy, neaktivní konformaci I a aktivní konformaci II (Obr. 3.2.). Při nepřítomnosti vhodného induktoru se párují repetice 1 + 2 a repetice 3 + 4. Vlásenka vzniklá párováním repetic 3 a 4 brání vazbě ribozómu v oblasti SD-2 a přepisu genu erm(C). V této neaktivní konformaci je SD-1 volně přístupná pro ribozómy, což umožňuje konstitutivní přepis kontrolního peptidu kódovaného úsekem I. Jakmile je přítomen vhodný induktor, který se naváže na ribozóm přepisující kontrolní peptid, ribozóm se zastaví, což způsobí přeskupení konformace I do konformace II. Tímto přeskupením se uvolní repetice 4 a odkryje SD-2. Volná Shine-Dalgarno sekvence oblasti 2 umožní nasednutí funkčních ribozómů a přepis genu erm(C). Zároveň se prodlouží životnost mRNA, což je pravděpodobně způsobeno stojícími ribozómy, které chrání transkript před degradací RNasou (158). Jestli je antibiotikum induktorem či ne, závisí na struktuře atenuátoru (112), avšak doposud není úplně jasné, jakým mechanismem je tato specifita indukce způsobena. Pro zastavení ribozómu ve správném místě, které způsobí změnu konformace, je kritická interakce mezi makrolidem, kontrolním peptidem a ribozómem. Bylo zjištěno, že pro správnou

18


funkci kontrolního peptidu atenuátoru genu erm(C) jsou esenciální 4 aminokyseliny, IFVI (197). Podobná sekvence aminokyselin byla nalezena u E. coli ve specifických malých peptidech kódovaných tzv. minigeny na 23S rRNA (183). Tyto peptidy udílejí nízkou hladinu rezistence k různým makrolidovým antibiotikům mechanismem "bottle brush", kdy nascentní peptid interaguje v ribozomálním tunelu s antibiotikem a aktivně jej odstraňuje ze svého vazebného místa (120, 184).

Obr. 3.2. Alternativní konformace mRNA inducibilně exprimovaného genu erm(C) z plazmidu pE194. Konformace mRNA v nepřítomnosti A), nebo v přítomnosti B) erythromycinu. RBS, vazebné místo pro ribozóm; LP, kontrolní peptid; ORF, otevřený čtecí rámec; 1, 2, 3, a 4, invertované repetice. Zelená a červená čára, kódující sekvence. Převzato z Depardieu et al., 2007 (34)

Podobná interakce pravděpodobně probíhá také během syntézy kontrolního peptidu. Exprese genů erm(A) a erm(B) je regulována stejným mechanismem atenuace translace jako gen erm(C), avšak struktura regulačních oblastí těchto genů je mnohem složitější (62, 120). Ačkoli mechanismem regulace exprese iMLSB rezistence je ve většině případů výše popsaná atenuace translace, regulace exprese genu erm(K) z Bacillus licheniformis je řízena mechanismem atenuace transkripce. Regulační oblast před genem erm(K) obsahuje, podobně jako kontrolní oblast pro gen erm(C), ribozomální vazebné místo pro otevřený čtecí rámec kódující 14 aminokyselin dlouhý kontrolní peptid. Také tato oblast se může vyskytovat ve dvou konformacích. Konformace vzniklá za nepřítomnosti induktoru dává vznik dvěma ρ-nezávislým transkripčním terminačním faktorům, které předčasně ukončí transkripci mRNA genu erm(K). Za přítomnosti induktoru dojde k přeskupení kontrolní oblasti, které umožní přepsání terminačních faktorů a syntézu celé délky mRNA kódující rezistenční methyltransferasu (85). Konstitutivní exprese MLSB rezistence vyplývá z narušení sekundární struktury mRNA. V laboratorních podmínkách byly kultivací iMLSB rezistentních kmenů za přítomnosti neindukujícího antibiotika vyselektovány konstitutivní mutanty s různými delecemi (30, 87), duplikacemi (95, 129) či bodovými mutacemi (163). Konstitutivní mutanty byly získány kultivací v přítomnosti téměř všech neindukujících MLSB antibiotik, zahrnující karbomycin, tylosin, linkomycin, klindamycin, ketolidy telithromycin a ABT-773 či streptogramin B, quinupristin. Quinupristinem však bylo možné selektovat konstitutivní rezistenci pouze v nepřítomnosti dalfopristinu (163). Regulační oblasti genů erm(A) a

19


erm(C) u konstitutivně rezistentních klinických izolátů vykazují tytéž změny, které byly pozorovány během selekce konstitutivních mutant in vitro. Delece v regulační oblasti byly nalezeny u konstitutivně rezistentních klinických izolátů S. epidermidis a S. aureus (87, 164, 199). Bodové mutace byly nalezeny v atenuátoru před genem erm(A) u S. aureus (199) a tandemové duplikace v atenuátoru genu erm(C) u klinických izolátů S. aureus, S. saprophyticus a S. equorum a v atenuátoru genu erm(A) u S. aureus (57, 96, 129, 164, 200).

3.1.1.3. erm geny u stafylokoků Během posledních třiceti let bylo popsáno velké množství adenin-N6-methyltransferas jak u producentů antibiotik, kteří se takto chrání před účinky produkovaného antibiotika, tak i u širokého spektra klinicky významných mikroorganismů (147). U stafylokoků byly doposud nalezeny tyto erm geny: erm(A), erm(B), erm(C), erm(33), erm(F) a erm(Y). Zatímco první tři zmíněné geny erm(A, B, C) jsou pro stafylokoky typické, ostatní byly detekovány ojediněle spíše jako důsledek intenzivního horizontálního genového přenosu mezi mikroorganismy. Geny erm(A) (120) a erm(C) (48, 64), jejichž nukleotidové sekvence jsou ze 62 % identické, jsou nejčastějšími nositeli MLSB rezistence u klinických izolátů stafylokoků. Zatímco erm(A) převládá u S. aureus, gen erm(C) je dominantní u CoNS. Gen erm(B) (160) je typický pro zvířecí stafylokokové izoláty a v klinické praxi je detekován jen ojediněle (39). Gen erm(33) ze S. scurii je zajímavým příkladem možné rekombinace mezi erm geny (konkrétně mezi erm(C) a erm(A)), která vede k plně funkčnímu proteinu (169). Gen erm(Y) byl popsán na plazmidu pMS97 z S. aureus, který nese i další dva geny makrolidové rezistence, msr(A) a mph(C) (108). Nukleotidová sekvence tohoto genu je z 81 % identická se sekvencí genu erm(T) z Lactobacillus reuteri a ze 77 % se sekvencí stafylokokového genu erm(C).

3.1.2. PhLOPSA rezistence - methylace 23S rRNA v pozici A2503 Methyltransferasa Cfr byla popsána teprve nedávno u S. sciuri a S. simulans během surveillanční studie florfenikolové rezistence u stafylokoků ze zvířat (77, 170). Rezistence je způsobená methylací adeninu v pozici A2503 (79), která se nachází v oblasti peptidyl-tRNA vazebného místa (místo P). Modifikace v této pozici interferuje s vazbou mnohem různorodější skupiny antibiotik než je tomu u Erm methyltransferas. Bylo prokázáno, že gen cfr snižuje citlivost k florfenikolům (chloramfenikol, florfenikol), linkosamidům, oxazolidinonům (linezolid), pleuromutilinům (tiamulin, valnemulin) a ke streptograminům A (PhLOSA rezistence; (97)). Studie uvádí, že tento gen byl během rozsáhlé surveillanční studie zvířecích stafylokokových izolátů nalezen pouze u 6 kmenů. Avšak již byl také izolován klinický methicilin rezistentní S. aureus, který nese tento cfr gen udílející rezistenci k antibiotikům poslední volby pro léčbu multirezistentních grampozitivních koků (78).

3.1.3. Rezistence k MLS antibiotikům mutacemi v zásahovém místě Mutace na ribozómu zabraňující vazbě MLS antibiotik mohou vznikat jednak na ribozomálních proteinech a jednak na 23S rRNA. Mutace v proteinu L4 přímo ovlivňují vazbu antibiotika (47). Mutace v proteinu L22 působí nepřímo tak, že vlivem této mutace dojde k rozšíření ribozomálního tunelu a

20


nascentní peptid tak může "proklouznout" vedle navázaného antibiotika (43). Zatímco mutace v proteinech se vyskytují poměrně často, mutace v genu pro 23S rRNA způsobující rezistenci jsou vzácnější (178). Důvodem je nutnost nahromadění mutací v jednotlivých kopiích genu pro ribozomální RNA. Proto je tato rezistence významná pouze u mikroorganismů s nízkým počtem kopií genu pro 23S rRNA jako třeba u Helicobacter pylori nebo Mycobacterium sp., které mají pouze dvě kopie rrn operonu. Naproti tomu druhy rodu Staphylococcus můžou mít až šest kopií genu pro 23S rRNA na buňku. I přes takto velký počet byla u S. aureus popsána rezistence k MLSB antibiotikům způsobená mutacemi A2058G, A2058T, A2059G ve třech nebo čtyřech operonech z šesti. U jednoho izolátu této studie byly mutace v genu pro 23S rRNA kombinovány s mutacemi v proteinu L22. Tento izolát byl rezistentní také ke kombinaci quinupristin/dalfopristin (140). Jiné izoláty S. aureus získané během léčby streptograminovou kombinací quinupristin/dalfopristin se staly k tomuto antibiotiku rezistentní pouze díky mutacím v proteinu L22 (100).

3.2. Inaktivace MLS antibiotik Zatímco rezistence způsobená změnou zásahového místa postihuje široké spektrum antibiotických látek vázajících se do stejného místa účinku, rezistence způsobená inaktivací antibiotika je specifická pro úzkou skupinu chemicky podobných látek. U MLS antibiotik můžeme rozlišit rezistenci způsobenou inaktivací makrolidů (M-rezistence), linkosamidů (L-rezistence), streptograminů A (SgA-rezistence) nebo inaktivací streptograminů B (SgB-rezistence).

3.2.1. Inaktivace makrolidů Doposud byly popsány dva mechanismy inaktivace makrolidů, modifikace fosforylací a inaktivace hydrolytickým štěpením laktonového kruhu. Oba tyto rezistenční mechanismy jsou typické pro gramnegativní tyčinky a k makrolidové rezistenci u stafylokoků přispívají spíše okrajově. U E. coli byly popsány dva typy makrolid 2'-fosfotransferas. První, Mph(2')I, je kódovaná genem mph(A) a inaktivuje 14- a 15-členné makrolidy a ketolidy efektivněji než 16-členné makrolidy (70, 129). Druhá fosfotransferasa, Mph(2')II, kódovaná genem mph(B), nevykazuje žádnou substrátovou preferenci (83). Navzájem tyto dva enzymy vykazují 37% identitu aminokyselinových sekvencí, a pouze gen mph(B) inaktivoval makrolidy po přenosu do heterologního hostitele S. aureus (122). Gen mph(B) má podobný obsah GC párů jako je v chromozómu stafylokoků, je tedy možné, že odtud gen původně pochází. U stafylokoků byl nalezen gen mph(C), jehož proteinový produkt je podobný fosfotransferase Mph(B) (49% identita, (108)). Tento gen byl identifikován na plazmidu pMS97 společně s rezistenčními geny msr(A') a erm(Y). Analýza exprese této trojice genů odhalila, že exprese genu mph(C) na tomto plazmidu závisí na upstream lokalizovaném genu msr(A) (109). Experimenty s přenosem genu mph(C) do citlivého S. aureus RN4220 potvrdily toto pozorování, jehož příčina nebyla zatím objasněna (70). Gen mph(C) byl detekován v klinických či zvířecích izolátech různých studií buď v těsné blízkosti genu msr(A) (98, 179), nebo samostatně, udílející pouze střední hladinu rezistence k erythromycinu (MIC = 2-16 mg/l) (98, 165). Na rozdíl od fosforylace, inaktivace erythromycinu hydrolýzou laktonového kruhu postihuje pouze 14- a 15-členné makrolidy, nikoli však ketolidy a 16-členné makrolidy (15, 19). U E. coli, byly

21


nalezeny dva typy esteráz kódované geny ere(A) nebo ere(B) (12, 130). Jejich aminokyselinové sekvence vykazují velmi malou podobnost (25% identita). Také obsah G+C párů genu ere(B) (36 %) se výrazně liší od ere(A) (50 %) a také od GC obsahu v chromozómu E. coli (50 %). To naznačuje, že gen ere(B) je exogenního původu a byl získán pravděpodobně od grampozitivních koků (12). Přítomnost genu ere u stafylokoků byla prokázána pouze v jednom případě. V roce 1996 byl popsán kmen S. aureus nesoucí gen ere(B) spolu s genem msr(A) (202). Tento kmen inaktivoval 14- a 16členné nikoli však 15-členné makrolidy, čímž se fenotypově lišil od exprese ere(B) genu v E. coli.

3.2.2. Inaktivace linkosamidů Inaktivace linkosamidů fosforylací nebo nukleotidylací hydroxylové skupiny na pozici 3 byla popsána u různých druhů rodu Streptomyces (11, 102). U klinických a zvířecích izolátů je inaktivace linkosamidů

způsobena

jejich

adenylací

linkosamid-O-nukleotidyltransferasou.

Dvě

nukleotidyltransferasy lišící se 14 aminokyselinovými zbytky byly poprvé popsány u S. haemolyticus a S. aureus a jsou kódovány geny lnu(A) nebo lnu(A') (26, 27). Dalších pět variant genů lnu bylo popsáno u grampozitivních (lnu(C), lnu(B), (1, 24) a gramnegativních mikroorganismů (lnu(F) a lnu(AN2); (58, 192). Proteiny kódované geny lnu(AN2) a lnu(C) vykazují 50-52% a 26% identitu aminokyselinových sekvencí s proteiny Lnu(A) ze stafylokoků. Naopak protein Lnu(B) je podobný pouze proteinu Lnu(F) z E. coli (34,9 % identity aminokyselinových sekvencí). Ačkoli proteinové produkty lnu genů inaktivují oba linkosamidy, udílejí významnou rezistenci pouze k linkomycinu (1, 88). To je pravděpodobně způsobeno vyšší účinností klindamycinu, jenž je schopen buňky usmrtit ještě před tím než je zcela inaktivován. Výjimkou je gen lnu(F) u E. coli, který udílí rezistenci také ke klindamycinu.

3.2.3. Inaktivace streptograminů A Streptograminy A jsou modifikovány O-acetyltransferasami, které přenáší acetyl z acetylkoenzymu A na sekundární hydroxyl antibiotika. Tento hydroxyl je v kontaktu s 23S rRNA v pozici G2505 (E. coli číslování) a jeho acetylace znemožní vazbu antibiotika na ribozóm (53). Několik acetyltransferas kódovaných geny vat (virginiamycin A acetyltransferasa) bylo doposud identifikováno u klinických a zvířecích izolátů stafylokoků a enterokoků (Tab. 3.1.). Aminokyselinové sekvence těchto enzymů jsou vysoce podobné sekvencím kódovaných na chromozómech dalších mikroorganismů což naznačuje jejich velké rozšíření (Tab. 3.1.).

22


Tab. 3.1. Porovnání aminokyselinových sekvencí virginamycin A acetyltransferas ze stafylokoků a enterokoků a příklady podobných sekvencí z genomů jiných mikroorganismů.

Mikroorganismus S. aureus S. cohnii Bacillus cereus ATCC10987 Enterococcus faecum Enterococcus faecum S. aureus Desulfitobacterium hafniense Y51 Clostridium botulinum F str. Langeland

Acetyltransferasa Vat(A) Vat(C)

Identita 100 % 70 %

Podobnost Lokalizace Reference 100 % plazmid pIP680 (8) 85 % plazmid pIP1714 (6)

AAS41570.1 Vat(D) Vat(E) Vat(B)

62 % 61 % 58 % 53 %

80 % 77 %

chromozóm plazmid

72 %

plazmid

GenBank (143) (54) (4)

BAE82934.1

54 %

71 %

chromozóm

GenBank

ABS40829.1

52 %

71 %

chromozóm

GenBank

3.2.4. Inaktivace streptograminů B Streptograminy B jsou inaktivovány intramolekulárními lyasami, které linearizují cyklický depsipeptid štěpením esterové vazby, čímž je zrušena bioaktivní konformace nutná pro vazbu antibiotika na ribozóm (118). U stafylokoků byly popsány dva geny vgb(A) (7) a vgb(B) (6) kódující lyasy, jejichž aminokyselinové sekvence jsou z 67 % identické. Navíc bylo prokázáno, že enzymy Vgb jsou součástí velké rodiny streptogramin B lyas, které jsou přítomné nejenom v rezistentních klinických izolátech, ale také v chromozómu mnoha bakterií, jež mohou sloužit jako zdroj rezistenčních genů pro klinicky významné stafylokoky (Tab. 3.2.). Konkrétně byly v nukleotidové databázi vytipovány ortologní geny z chromozómu Streptomyces coelicolor a Bordetella pertusis, jejichž aktivita štěpení streptograminů B byla prokázána expresí v heterologním hostiteli E. coli (118). Tab. 3.2. Porovnání aminokyselinových sekvencí lyasy Vgb(A) ze Staphylococcus aureus se sekvencemi dostupnými v GenBank databázi použitím BLAST(tblastn).

protein ID AAA98349.1 AF24088.1 ABR35734.1 AAU21870.1 AAU39223.1 CAB88456.1 CAM02658.1

identita Staphylococcus aureus Vgb(A) 100 % Staphylococcus cohnii Vgb(B)a 67 % Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 53 % Bacillus licheniformis ATCC 14580 51 % Bacillus licheniformis DSM 13 51 % Streptomyces coelicolor A3(2)a 41 % Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 42 % CAE30921.1 Bordetella bronchiseptica strain RB50 41 % Bordetella pertussis strain Tohama Ia CAE40592.1 39 % ABM12711.1 Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 38 % a Inaktivační aktivita těchto proteinů byla testována v E. coli (118) a

podobnost 100 % 82 % 70 % 69 % 69 % 59 % 62 % 57 % 56 % 56 %

plazmid pIP680 plazmid pIP1714 genom genom genom genom genom genom genom genom

3.3. Transportní rezistence Mikrobiální transportní mechanismy zprostředkovávající rezistenci k antibiotikům lze rozdělit do pěti rodin (142). Mezi sekundární transportéry, využívající pro export toxických látek protonový gradient, patří: MFS (major facilitator superfamily) rodina proteinů, RND (resistance-nodulationdivision) rodina proteinů, SMR (small multidrug resistance) rodina proteinů a MATE (multidrug and

23


toxic compound extrusion) rodina proteinů. Z nich u grampozitivních mikroorganismů byly detekovány pouze dvě rodiny (MFS a SMR). MFS rodina zahrnuje tyto transportéry MLS antibiotik: Mfe ze streptokoků (161), LmrP z Lactococcus lactis (141) a MdeA z S. aureus (65), Lmr(A) ze Streptomyces lincolnensis (205). Superrodina ABC-proteinů (ATP-binding casette) zahrnuje transportéry, které získávají energii pro export z hydrolýzy ATP. Tato rodina zahrnuje kromě klasických transportérů také skupinu, která se významně podílí na rezistenci k MLS antibiotikům u stafylokoků, avšak u které, jak bude zmíněno níže, nebyl transportní mechanismus zcela prokázán.

3.3.1. ABC-transportéry Obecně ABC transportéry vyžadují pro svoji funkci dvě hydrofilní cytoplazmatické domény, které váží a hydrolyzují ATP, a dvě hydrofobní transmembránové (TM) domény, které jsou většinou složeny ze šesti transmembránových α-helixů. Hydrofilní doména, označovaná také jako NBD (nukleotid binding domain), má dva typické motivy Walker A a Walker B (190), které jsou společné pro všechny ATPasy plus další konzervované motivy charakteristické pro ABC transportéry: konzervovaná sekvence společná pro všechny ABC transportéry (ABC transporter signature motif), konzervovaná oblast obsahující aromatické aminokyseliny (Tyr-loop), konzervovaná glutaminová smyčka (Gln-loop) a konzervovaná histidinová smyčka (His-loop). Walker A, nebo-li fosfát vazebná smyčka, je oblast bohatá na glycin se strukturou: GXXGXGK(S,T), kde X je libovolná aminokyselina. Kromě ABCtransportérů se tento motiv nachází také u ostatních ATP- nebo GTP-vazebných proteinů. Walker B motiv vázající hořčík je hydrofobní oblast s několika nabitými aminokyselinami s touto strukturou: hhhhD(D,E,S)(P,A) kde h je hydrofobní aminokyselina. Jednotlivé domény mohou být syntetizovány jako samostatné proteiny nebo mohou být fúzovány v multidoménové peptidy kódované jedním genem. U ABC proteinů jiné než transportní funkce TM doména chybí. Na základě fylogenetické analýzy sekvencí ABC proteinů lze rozlišit tři třídy (32). 1. třída zahrnuje většinu známých transportérů, které mají NDB doménu a TM doménu fúzovanou v jeden polypeptid. 2. třída zahrnuje rezistenční proteiny a proteiny účastnící se jiných buněčných procesů než je transport. Tato třída proteinů má fúzované dvě NBD domény a postrádá transmembránovou doménu. 3. třída obsahuje proteiny závislé na vazebném proteinu (BPD, binding protein dependent) většinou s importní funkcí.

3.3.2. Rezistence k MLS antibiotikům = 2. třída ABC proteinů ABC proteiny udílející rezistenci k MLS antibiotikům spadají do třídy 2 a patří mezi ně proteiny producentů MLS antibiotik i proteiny udílející rezistenci k těmto antibiotikům u klinicky významných mikroorganismů a zejména pak u stafylokoků. Jak bylo zmíněno výše, tato fylogenetická třída ABC proteinů má dvě fúzované NBD domény, avšak postrádá jakoukoli TM doménu. Kromě rezistenčních proteinů, které tvoří tzv. ARE podrodinu (antibiotic resistance), jsou do této skupiny řazeny i proteiny účastnící se regulace translace (elongační faktor hub EF-3 (68) nebo proteiny GCN1 a GCN20. Podílejí se na regulaci proteosyntézy skrze regulaci fosforylace eukaryotického iniciačního faktoru eIF2 (104), u mnoha dalších proteinů této skupiny zůstává funkce nejasná.

24


3.3.2.1. Msr(A) - rezistence k makrolidům a streptograminům B Přítomnost ABC proteinu Msr(A) je druhou nejčastější příčinou rezistence k makrolidům u stafylokoků. Msr(A) udílí rezistenci k 14- a 15-členným makrolidům a po indukci snižuje citlivost také ke ketolidům a streptograminům B (MSB rezistence). Mechanismus této rezistence byl poprvé popsán u S. epidermidis (150, 151) a u S. aureus (111). 488 aminokyselin dlouhý peptid obsahuje dvě ATPvazebné domény a postrádá jakoukoli transmembránovou doménu. NDB domény jsou separovány nezvykle dlouhým mezerníkem, který je bohatý na glutamin a ostatní polární aminokyseliny, což je typické pro tzv. Q-linker - flexibilní spojku mezi doménami, jež propojuje rozdílné, ale interagující domény proteinů, které se často vyskytují u prokaryotických dvousložkových regulačních a signál transdukujících systémů (203). Ačkoli gen msr(A) nekóduje žádnou transmembránovou doménu, přenos pouze tohoto genu do citlivého kmene S. aureus RN4220 byl dostatečný pro expresi rezistence k erythromycinu. Navíc buňky S. aureus RN4220 produkující Msr(A) akumulovaly méně radioaktivně značeného antibiotika než buňky bez Msr(A), což by mohlo svědčit o aktivním exportu antibiotika ven z buňky. Na základě tohoto pozorování bylo předpovězeno, že tento transportní protein pravděpodobně využívá pro svoji funkci TM doménu přítomnou v recipientním kmeni (150). Downstream od genu msr(A) byly na původním plazmidu pUL5050 z S. epidermidis nalezeny dva geny, které by mohly být součástí předpokládaného transportního systému. Gen stpA kóduje ATPvazebnou doménu a gen smpA kóduje hydrofobní transmembránovou doménu. Tyto geny byly hybridizačně potvrzeny také u všech 35 MSB rezistentních CoNS analyzovaných v této studii. Navíc velmi podobné geny, stpC a smpC byly nalezeny v chromozómu recipientního erythromycin citlivého S. aureus RN4220. Inaktivace těchto genů však neměla žádný vliv na schopnost msr(A) udílet MSB rezistenci (149). Mechanismus funkce Msr(A) zůstává i nadále nejasný. Kromě stafylokoků byl gen msr(A) identifikován v mnoha dalších rodech grampozitivních i gramnegativních mikroorganismů: Streptococcus spp., Enterococcus spp., Corynebacterium spp. a Pseudomonas spp. Tyto geny vykazovaly navzájem 99 - 100% identitu (127). V chromozómu Enterococcus faecium byl objeven gen msr(C) kódující protein, jehož aminokyselinová sekvence vykazovala 42% identitu s Msr(A). Pokud byl tento gen inaktivován u E. faecium, citlivost k MSB antibiotikům se snížila pouze nepatrně (172). Avšak pokud byl tento gen přenesen do citlivého S. aureus RN4220, udílel vysoké hladiny rezistence k MSB antibiotikům (145). Gen msr(D) byl objeven jako součást velkého chromozomálního genetického elementu v Streptococcus pneumoniae kódující také dva MDR transportéry makrolidů Mef(E) a Mef(A). Aminokyselinová sekvence Msr(D) je ze 75 % identická s Msr(A) a ze 78 % identická s Msr(C). Tento protein v S. pneumonie udílel pouze nízkou hladinu rezistence k 14-členným makrolidům a ketolidům (10) a po přenosu do S. aureus RN4220 citlivost k MSB antibiotikům výrazně nesnižoval (145).

3.3.2.2. Vga proteiny - rezistence k streptograminům A (a linkosamidům) Proteiny Vga(A), Vga(A)v a Vga(B) byly původně objeveny jako rezistenční determinanty udílející rezistenci k streptograminům A u stafylokoků. Stejně jako Msr(A) patří do rodiny ARE proteinů, pro kterou je typická přítomnost dvou NBD domén a absence transmembránové domény. Aminokyselinové sekvence proteinů Vga(A) a Vga(B) jsou si navzájem z 48.3 % identické a s

25


proteinem Msr(A) jsou identické z 35,2 % a 34,4 %. Typický Q-linker bohatý na glutamin lze nalézt u proteinu Vga(B), avšak protein Vga(A) má poměr glutaminů stejný v celé délce polypeptidu. Schopnost těchto proteinů udílet rezistenci k MLS antibiotikům byla porovnávána po přenosu do citlivých recipientů S. aureus RN4220 a S. epidermidis BM3302 (69). Proteiny Vga(A) a Vga(A)v byly schopny udílet kromě rezistence ke streptograminům A také nízkou hladinu rezistence k linkomycinu. Protein Vga(B) udílel nízkou hladinu rezistence ke streptograminu A avšak podstatně zvýšenou rezistenci ke kombinaci streptograminů A a B. Kromě toho byla pozorována různá schopnost Vga proteinů udílet rezistenci v závislosti na hostiteli: v S. epidermidis BM3302 dosahovaly minimální inhibiční koncentrace vyšších hodnot než u S. aureus RN4220. Naše práce (124) popisuje novou variantu genu, vga(A)LC, která udílí střední hladinu rezistence k oběma linkosamidům (MICLIN = 32 mg/l a MICCLI = 8 mg/l) u S. haemolyticus, avšak po přenosu do heterologního S. aureus RN4220 dosahovaly minimální inhibiční koncentrace hodnot nižších, které však zůstaly vyšší v porovnání s genem vga(A).

3.3.2.3. Ostatní rezistenční proteiny ARE rodiny Další dva proteiny příbuzné s Msr(A) a udílející přirozenou rezistenci k linkosamidům a streptograminům byly nalezeny při analýze ABC transportních systémů ze sekvenovaných genomů E. faecalis a B. subtilis. U E. faecalis, který je

na rozdíl od ostatních druhů enterokoků přirozeně

rezistentní linkosamidům a streptograminům A (LSA rezistence), byl nalezen gen lsa, jehož inaktivací došlo ke zvýšení citlivosti ke klindamycinu, dalfopristinu (streptogramin A) a ke kombinaci quinupristin/dalfopristin. Současně komplementací delece (zavedením genu lsa na plazmidu) byl rezistenční fenotyp obnoven (172, 173). Protein Lsa z E. faecalis je z 42 % podobný proteinu Msr(C) a z 41 % podobný proteinu Vga(A). U dvou izolátů E. faecalis citlivých k oběma linkosamidům a ke quinupristinu/dalfopristinu byly v genu lsa nalezeny bodové mutace vedoucí k předčasnému ukončení translace (36) Gen lsa byl přítomen ve všech LS rezistentních izolátech E. faecalis a zároveň nebyl detekován v žádném z izolátů ostatních enterokokových druhů (173). Na plazmidu pSCFS1 z S. sciuri byl objeven gen lsa(B) kódující protein, který je z 41 % identický s proteinem Lsa. Přenosem do citlivého S. aureus RN4220 bylo prokázáno, že tento protein udílí rezistenci ke klindamycinu. Potenciální rezistence k streptograminům A nebyla v tomto případě testována (77). Velká podobnost proteinu Lsa(B) s předpokládaným ABC transportérem z B. anthracis (82% identita) naznačuje, že další příbuzné proteiny, které pravděpodobně udílejí rezistenci k MLS antibiotikům, jsou obecně rozšířeny u grampozitivních baktérií. Další protein, který snižuje citlivost k linkosamidům a streptograminům A byl charakterizován v genomu Bacillus subtilis. Protein Vml(R) vykazuje 33% identitu s Vga(A). Exprese tohoto genu je inducibilní a je pravděpodobně řízena předčasnou terminací transkripce v nepřítomnosti antibiotika (126). Velkou podskupinou ARE rodiny jsou ABC proteiny vyskytující se v biosynthetických shlucích producentů MLS antibiotik (Tab. 3.3. (116)). Analýza aminokyselinových sekvencí těchto proteinů odhalila překvapivou souvislost počtu aminokyselin mezi Walker A a B motivy v druhé ABC doméně a

26


substrátovou specifitou proteinu: u všech makrolidových transportérů je vzdálenost mezi oběma konzervovanými Walker motivy konstantní (Tab. 3.3. (116)). Tab. 3.3. Přehled ABC transportérů ARE rodiny z producentů antibiotik (převzato z (116))

Antibiotikum Karbomycin Spiramycin Tylosin Oleandomycin Linkomycin Frenolicin Virginiamycin

Produkční organizmus rodu Streptomyces S. thermotolerans S. ambofaciens S. fradiae S. antibioticus S. lincolnensis S. roseofulvus S. viginiae

Protein Car(A) Srm(B) Tlr(C) Ole(B) Lmr(C) Fnr(D) Var(M)

Průkaz rezistence ano ano ano ano ano netestováno netestováno

Vzdálenost mezi Walker motivya 149/100 148/100 145/100 144/100 119/113 131/117 122/102

Reference (166) (166) (152) (128) (135) AF05832 (76)

a

Počet aminokyselin mezi konzervovaným lysinem ve Walker A motivu a kys. asparagovou v motivu Walker B u obou domén oddělené lomítkem.

3.3.3. Jedná se skutečně o transport? Rezistenční proteiny ARE rodiny ABC transportérů postrádají transmembránovou doménu, a ačkoli u Vga(A) byla potvrzena membránová lokalizace (69), nebyl doposud identifikován žádný interagující membránový protein. Nelze tedy vyloučit ani jiný mechanismus funkce, kterým tyto proteiny udílejí rezistenci k MLS antibiotikům. Za důkaz aktivního effluxu erythromycinu proteinem Msr(A) je považována snížená akumulace radioaktivně značeného antibiotika uvnitř rezistentních buněk v porovnání s buňkami citlivými. Avšak tento zdánlivý efflux lze interpretovat i jiným způsobem. Erythromycin vstupuje pasivní difúzí do buněk, kde se navázáním na ribozómy akumuluje (144). Přidáním neznačeného antibiotika k buňkám saturovaným (C14)-erythromycinem, dochází ke kompetici o vazebné místo a k uvolnění (C14)-erythromycinu, který difunduje po směru koncentračního gradientu ven z buňky (144). Podobný efekt by mohl být způsoben také zabráněním vazby antibiotik na ribozóm nebo aktivním odstraněním antibiotika z vazebného místa, což by mohly být alternativní mechanismy funkce proteinů ARE rodiny (80, 144). Tuto hypotézu potvrzuje také fylogenetická analýza ABC transportérů, podle níž tyto rezistenční proteiny spadají do stejné skupiny jako eukaryotické ABC proteiny účastnící se kontroly iniciace translace a elongace (80). Navíc je velmi zajímavá korelace specifity ARE rezistenčních proteinů s překrývajícími se vazebnými místy MLS antibiotik, konkrétně specifita proteinů Msr(A), Msr(C) a Msr(D) k makrolidům a streptograminům B a proteinů Vga, Lsa, Vml(R) k linkosamidům a streptograminům A. Zda ARE proteiny interagují s membránovým proteinem a aktivně transportují antibiotika ven z buňky, či zda zabraňují vazbě antibiotika na ribozóm (nebo jej z ribozómu odstraňují), zůstává předmětem dalších výzkumů.

3.3.4. Regulace: atenuace translace nebo terminace transkripce? U genů msr(A), msr(C), msr(D), vml(R), byla pozorována inducibilní exprese v závislosti na přítomnosti indukujícího antibiotika – erythromycinu (u genů msr) nebo linkomycinu a virginiamycinu M (u vml(R)) (10, 126, 145, 150). U některých dalších genů kódujících rezistenční ABC proteiny lze identifikovat upstream sekvence vykazující některé rysy regulačních oblastí jiných rezistenčních genů.

27


Na základě strukturní podobnosti regulační oblasti genu msr(A) s regulační oblastí genu MLSB rezistence erm(C) bylo předpovězeno, že inducibilní exprese je řízena mechanismem atenuace translace (150), avšak toto tvrzení nebylo nikdy experimentálně potvrzeno. Regulační oblast msr(A) (320 bp) obsahuje promotor, čtyři invertované repetice a dvě ribozomální vazebná místa. Jedno před samotným genem msr(A) a druhé před sekvencí kódující osmiaminokyselinový peptid. Narušení sekundární struktury regulační oblasti vede stejně jako v případě genů erm ke konstitutivní expresi (145). Podobná kontrolní oblast se nachází u genu msr(C) z E. faecium (172). Regulační oblast genu msr(D) obsahuje RBS předcházející sekvenci kódující šestiaminokyselinový peptid a sadu 4 invertovaných repetic,,avšak žádná z repetic nepřekrývá RBS. Navíc konsensus -10 a -35 sekvence promotoru překrývají místo kódující domnělý kontrolní peptid, před kterým naopak žádný promotor nalezen nebyl. Není tedy pravděpodobné, že by gen msr(D) byl regulován stejným mechanismem jako msr(A) a msr(C) (145). Důvodem může být to, že je tento gen trasnkripčně spojen s upstream lokalizovaným rezistenčním genem mef(E) (33). Struktura podobná erm(C) atenuátoru byla popsána také před genem lsa(B) ze S. sciuri. Regulační oblast obsahuje dva čtecí rámce pro krátké peptidy (26 a 7 aminokyselin), první dvojice invertovaných repetic leží v sekvenci pro 26-aminokyselinový peptid. Druhá sada IR částečně zasahuje do sekvence kódující kratší peptid a zahrnuje v sobě také RBS (77). U genu vml(R) byl prokázán odlišný mechanismus regulace inducibilní exprese, který je založený na předčasné terminaci transkripce. Bylo zjištěno, že 225 nukleotidů dlouhá 5' nepřepisovaná oblast genu vml(R) obsahuje několik invertovaných repetic, u nichž jedna tvoří ρnezávislý terminátor. Pokud není přítomno indukující antibiotikum, dochází k předčasnému ukončení transkripce právě v místě tohoto terminátoru lokalizovaného před genem. V přítomnosti induktoru dochází k částečnému pročtení tohoto terminátoru a transkripce může být ukončena až v místě druhého ρ-nezávislého terminátoru umístěného za strukturním genem. Terminátor doprovází druhá vlásenka, jejíž 3' konec je schopen se párovat s 5' koncem terminátoru a vytvářet tak alternativní sekundární strukturu. Avšak delece této vlásenky nemá žádný vliv na regulaci exprese rezistence (126). Přestože přesný mechanismus indukce rezistence není stále objasněn, na základě strukturní podobnosti s regulačními oblastmi ostatních genů je možné, že by tento mechanismus indukce mohl být pro tyto příbuzné geny společný.

28

LITERÁRNÍ ÚVOD Frekvence MLS rezistencí

4. Frekvence MLS rezistencí u CoNS a klinický význam jednotlivých rezistenčních mechanismů

4.1. Rezistence k makrolidům a linkosamidům Dle různých studií se četnost rezistence k erythromycinu u CoNS pohybuje mezi 21,5 - 44 % klinických izolátů citlivých k oxacilinu a mezi 66 - 72% u oxacilin rezistentních. Také četnost rezistence ke klindamycinu je nižší u oxacilin citlivých izolátů (2,8 - 14 %) než u oxacilin rezistentních CoNS, kde se poměr klindamycin rezistentních izolátů pohybuje v rozmezí 32,5 - 52,6 % (35, 156, 157). U S. aureus je rezistence k makrolidům a linkosamidům v naprosté většině případů způsobena přítomností genů erm(A) nebo erm(C) udílející konstitutivní nebo inducibilní MLSB rezistenci. Rezistence MSB způsobená genem msr(A) nebo inaktivační rezistence geny mph(C) nebo lnu(A) jsou u S. aureus vzácné (13, 50, 92, 93). I u CoNS převládá MLSB rezistence, třebaže ostatní typy rezistence jsou přítomny častěji než u S. aureus. Jednotlivé rezistenční mechanismy a jejich kombinace lze předpovědět diskovým indukčním testem použitím ERY, LIN a CLI disku (Obr. 4.1.) (40, 123). Diskovou indukční metodou byly první MSB rezistentní izoláty (rezistence k erythromycinu avšak citlivost ke klindamycinu; Obr.4.1. - MSB) detekovány ještě před objasněním genetické podstaty této transportní rezistence. Mezi 78 ERY rezistentními CoNS bylo nalezeno 11 kmenů (14 %) s tímto fenotypem (74). Četnost genu msr(A) se v různých studiích pohybuje od 6 % u S. epidermidis, (103) až po 41 % u CoNS, (39). V naší studii (123) gen msr(A) dokonce převažuje nad erm geny (53 % vs. 43 %). Fenotypově se však MSB rezistence projevuje v daleko menší míře než je četnost genu msr(A) a to proto, že gen msr(A) bývá často přítomen spolu s geny erm, které překrývají fenotypový projev MSB rezistence svým dominantním fenotypem. Ve studii (93) byl gen msr(A) přítomen u 35 ze 150 izolátů, ale pouze u 19 z nich nebyl detekován v přítomnosti erm genů. V naší studii byl msr(A) detekován spolu s erm geny u 16 z celkového počtu 52 msr(A) pozitivních izolátů (123). MLSB rezistence u CoNS je způsobena geny erm(C) a erm(A), gen erm(A) však bývá přítomen pouze v malém procentu erythromycin rezistentních izolátů: 7,5 %, (39); 3 % (201); 4,8 %, (103). V některých studiích však byla četnost erm(A) o něco vyšší: 27.2 % izolátů CoNS ve studii (92) a 18 % izolátů ve studii (93). Gen erm(B), typický pro streptokoky a enterokoky, se u stafylokoků vyskytuje zejména u zvířecích izolátů, (39) u lidí byl detekován pouze v ojedinělých případech (92, 93, 103). Inaktivační rezistence byla u stafylokoků dlouhou dobu na okraji pozornosti, proto existuje pouze omezený počet studií dokumentující výskyt genů lnu(A) (inaktivace linkomycinu) nebo mph(C) (inaktivace makrolidů) u stafylokoků. Ačkoli je význam těchto rezistencí díky svému specifickému účinku na úzkou skupinu antibiotik spíše minoritní, jejich četnost v některých populacích CoNS není zcela zanedbatelná. Ve studii (93) byl gen lnu(A) (dříve linA) detekován pouze u 4,6 % stafylokoků rezistentních alespoň k jednomu MLS antibiotiku. Avšak v naší studii (123) byl gen lnu(A) detekován ve 24 % všech izolátů CoNS rezistentních k erythromycinu, linkomycinu nebo klindamycinu. Ve studii (98) se lnu(A) vyskytoval u 8 z 31 (29 %) erythromycin

nebo

pirlimycin

(linkosamid)

rezistentních

CoNS

z

mastitidy

krav.

29


Typ rezistence

ERY LI

CL cMLSB (MSB + LSA)

Obr. 4.1 Předpověď fenotypově dominantních rezistenčních mechanismů a jejich kombinací diskovým indukčním testem LIN, linkomycin; CLI, klindamycin; ERY, erythromycin; cMLSB, konstitutivní rezistence k makrolidům, linkosamidům a streptograminům; iMLSB, inducibilní rezistence k makrolidům, linkosamidům a streptograminům B; MSB, rezistence k makrolidům a streptograminům B; L rezistence k linkomycinu; LSA, rezistence k linkosamidům a streptograminu A.

iMLSB

MSB

L

LSA

iMLSB + L

MSB + L

Gen mph(C) byl poprvé detekován u stafylokoků na plazmidu pMS97 v těsné blízkosti upstream lokalizovaného genu msr(A) (108). Tyto geny byly nalezeny v těsném sousedství také v mnoha dalších studií u klinických izolátů ((45, 179) nebo u zvířecích izolátů (98, 165). V klinické studii z Německa byl gen mph(C) detekován u 37,9 % erythromycin rezistentních kmenů, vždy v kombinaci buď s genem msr(A) (24,5 %) či erm(C) (12 %) (45). CoNS jsou většinou hodnoceny jako homogenní skupina nehledě na druhovou skladbu, jež může být ovlivněna parametry výběru studovaného souboru: výběr rezistentních kmenů, klinická relevance izolátů, typ klinického vzorku atd. Druhové zastoupení pak může ovlivnit četnosti rezistenčních genů. Tak například MSB rezistence bývá nejčastěji detekována u druhů S. haemolyticus, S. hominis nebo u S. cohnii (39, 45, 74, 93, 123). Podrobnější studie zabývající se rezistenčními charakteristikami jednotlivých druhů však chybí.

30


4.2. Inducibilní rezistence Stafylokokové izoláty s inducibilním genem erm(A) nebo erm(C) jsou rezistentní k 14-členným (klarithromycin, dirithromycin, erythromycin a roxithromycin) a 15-členným (azithromycin) makrolidům, které jsou účinnými induktory. Naopak, neindukující ketolidy (telithromycin), 16-členné makrolidy (josamycin, midecamycin, miocamycin, rokitamycin, spiramycin a tylosin), linkosamidy (linkomycin, klindamycin, pirlimycin) a streptograminy B (pristinamycin IA a quinupristin) zůstávají aktivní. cMLSB rezistence se vyvinula z iMLSB rezistence v důsledku selekčního tlaku neindukujících antibiotik. U klinických izolátů CoNS se výskyt konstitutivní MLSB rezistence pohybuje mezi 25 a 41 % erythromycin rezistentních kmenů (41, 45, 50, 93, 167). Přestože byla několikrát prokázána selekce spontánních konstitutivních mutant in vivo během léčby klindamycinem, není úplně jasné, zda léčba inducibilní rezistence neindukujícím antibiotikem představuje skutečné riziko. Existuje pouze několik popsaných případů klinického selhání při léčbě infekcí způsobených inducibilně rezistentními kmeny neindukujícím antibiotikem. Nicméně i přes úspěšnou léčbu takovýchto infekcí neindukujícím antibiotikem je vytvářen nežádoucí tlak na selekci konstitutivních mutant. V roce 2004 byl diskový indukční test doporučen laboratoří CSLI (Clinical Standard Laboratory Institute) pro detekci iMLSB rezistence u stafylokoků. Izoláty vykazující inducibilní rezistenci ke klindamycinu jsou dle doporučení CSLI interpretovány jako rezistentní (121). Tatáž interpretace platí také pro ostatní neindukující antibiotika.

4.3. Rezistence ke streptograminům Díky synergistickému účinku streptograminu A a B, vyžaduje rezistence k jejich kombinaci u stafylokoků získání rezistence ke SgA avšak ne nezbytně získání rezistence ke SgB (3, 56). Přítomnost obou typů rezistencí v jednom izolátu však nemusí vždy znamenat rezistenci ke kombinaci (50, 93). Také in vivo selekce izolátů rezistentních ke quinupristinu-dalfopristinu (QD) v experimentálním modelu králičí endokarditidy souvisela se selekcí rezistence k jednotlivým komponentám (204). Do nedávné doby byl ze streptograminů v klinické praxi používán pouze pristinamycin (kombinace pristinamycinu IIA a pristinamycinu IA), který byl dlouhá léta používán pro kontrolu stafylokokových infekcí ve francouzských nemocnicích. Studie týkající se rozšíření Sg rezistence u stafylokoků se tedy omezovaly pouze na tuto zemi, kde se četnost rezistence k pristinamycinu v jednotlivých nemocnicích pohybuje mezi 0 - 44 % (56). Dvě studie sledovaly zastoupení genů streptograminové rezistence u většího souboru SgA rezistentních izolátů (3, 56). První studie zahrnuje 126 klinických izolátů stafylokoků izolovaných ve francouzských nemocnicích v letech 1975-1993, z nichž 36 S. aureus a 20 CoNS izolátů bylo rezistentních k pristinamycinu IIA (SgA) (3). V té době nebyly známy některé rezistenční geny, a tak informace o jejich výskytu v tomto souboru byly postupně doplněny (5, 55). U PIIA rezistentních izolátů S. aureus byla nejpočetnější trojkombinace genů vat(B), vga(B) a vga(A)v, která se vyskytovala u 20 z 36 izolátů (62,5 %). Všechny izoláty s touto kombinací tří SgA rezistenčních genů byly rezistentní k pristinamycinu nehledě na rezistenci k SgB, která nebyla přítomna u 8 izolátů citlivých také k makrolidům. Druhým nejčastějším genem byl gen vga(A), který se nacházel u 8 izolátů (25 %). U šesti z nich byl vga(A) přítomen spolu s

31


dvojkombinací SgA a SgB rezistenčních genů vat(A) a vgb(A). Tyto izoláty byly rezistentní k SgA, SgB a také k jejich kombinaci. U PIIA rezistentních CoNS byl nejpočetnějším genem vga(A), který se nacházel téměř u všech (95 %) izolátů. U čtyřech z nich byl přítomen s dvojkombinací vat(A) a vgb(A). Jediný izolát bez genu vga(A) obsahoval dvojkombinaci vat(B), vga(B) a byl rezistentní k MLSB antibiotikům a pristinamycinu. Trojkombinace genů vga(A), vat(A) a vgb(A) udílela rezistenci k pristinamycinu nezávisle na přítomnosti cMLSB rezistence. Gen vga(A) udílel vyšší hladiny rezistence k pristinamycinu (MIC = 2-8 mg/l) pouze u izolátů současně rezistentních k MLSB antibiotikům. Druhá studie zahrnuje 62 klinických PIIA rezistentních izolátů S. aureus z francouzských nemocnic izolovaných v letech 1981-2000 (56). V této druhé studii, která neobsahuje CoNS, se gen vga(A) vyskytoval pouze u jednoho izolátu, který byl rezistentní k pristinamycinu. Tento izolát byl současně konstitutivně MLSB rezistentní. Nejpočetnějším byl gen vga(A)v, který byl nalezen u 37 izolátů (59,7 %), u 15 z nich byl přítomen spolu s geny vat(A) a vga(B). Pokud byl vga(A)v přítomen sám, záleželo na přítomnosti cMLSB rezistence, zda byly tyto izoláty rezistentní také k pristinamycinu. Všechny vga(A)v pozitivní izoláty až na jeden byly rezistentní také k linkomycinu. Druhou nejpočetnější byla dvojkombinace genů vat(A) a vgb(A) přítomna u 26 izolátů (42 %) a udílející rezistenci ke streptograminové kombinaci nehledě na přítomnost cMLSB rezistence. Souhrnný přehled častých kombinací genů streptograminové rezistence a jejich schopnost udílet rezistenci k pristinamycinu v závislosti na citlivosti k MLSB antibitokům je uveden v tabulce 4.1. Tab. 4.1. Přehled častých kombinací Sg rezistenčních genů a schopnost udílet rezistenci k pristinamycinu v závisloti na citlivosti k MLSB antibiotikům a Zjištěný genotyp Na pozadí fenotypu Rezistence k V Gen nebo Druh Citace pristinamycinu Mechanismus kombinaci kombinace cMLSB LIN SgA SgB (MIC mg/l) rezistence s dalším genů genem S. + + + + (16) (3, 56) epidemidis vat(B), inaktivace SgA vga(B) a efflux SgA vga(A)v + + + + + (8-32) (3, 56) S. aureus vga(A)v + + + (2-4) (3, 56) S. aureus

vat(A), vgb(A)

inaktivace SgA a inaktivace SgB

+

+

+

+

-

+

+

+

S. aureus

(3, 56)

(56) S. aureus S. aureus, vga(A) +/+ + + (8-32) (3) CoNS + + (1-2) CoNS (3) vga(A) efflux SgA S. aureus, + + + + (4) (3) CoNS + + + + + (56) S.aureus vga(A)v efflux SgA + + (56) S.aureus a Přítomnost rezistence je značena plusem; cMLSB, konstitutivní rezistence k makrolidům linkosamidům a streptograminům B; LIN, rezistence k linkomycinu; SgA, rezistence ke streptograminu A; SgB, rezistence ke streptograminu B

Teprve až po zavedení quinupristin/dalfopristinu do klinické praxe je streptograminová rezistence sledována celosvětově. Dle různých surveillančních studií je výskyt Q/D rezistentních izolátů prozatím velmi nízký (0-5 %, viz. kap. 1 literárního úvodu). Ve studii z Kanady (75) se mezi 658

32


klinickými izoláty CoNS rezistence ke Q/D vyskytovala u 15 izolátů (2,3 %). Z toho bylo 9 izolátů identifikováno jako S. cohnii. V jiné studii byly u tohoto druhu identifikovány dva nové rezistenční geny vat(C) a vgb(B), které nebyly doposud nalezeny v izolátech jiných druhů (6). Je tedy možné že za tento nezvykle vysoký výskyt Q/D rezistentních izolátů je zodpovědná tato, pravděpodobně druhově specifická, dvojice rezistenčních genů. V Koreji byla rezistence ke quinupristinu/dalfopristinu nalezena častěji u klinických izolátů S. aureus (26 %) než u izolátů CoNS 9,1 % (92). Naopak v Řecku nebyla rezistence ke Q/D nelezena u žádného z 350 izolátů S. aureus avšak mezi 500 izoláty CoNS bylo nalezeno 10 izolátů S. hominis rezistentních k nízkým hladinám Q/D (MIC=1-3 mg/l). U všech těchto QD rezistentních izolátů byl nalezen gen vga(A) spolu s konstitutivně exprimovaným genem erm(A) (136).

4.4. Mobilní elementy nesoucí MLS rezistenční geny Gen erm(C) byl poprvé popsán na 3,7 kb velkém plazmidu pE194 (63). Častěji je však gen kódován na plazmidu o velikosti cca 2,5 kb nebo jeho kratších konstitutivních variant (185, 201). Prototypem plazmidu této velikosti je plazmid pNE131, který byl poprvé popsán u S. epidermidis. Oba tyto typy plazmidů jsou řazeny mezi malé nekonjugativní, mnohakopiové plazmidy replikující se mechanismem valivé kružnice (RC plazmidy), které mohou být přenášeny mobilizací se spolu přítomnými konjugativními plazmidy (89). Strukturně podobné plazmidy byly popsány také u stafylokoků zvířecího původu, což naznačuje jejich všeobecné rozšíření a také možný přenos rezistence mezi lidskými a zvířecími izoláty (96). Gen erm(A) je asociován s transpozonem Tn554 (6,7 kb), který současně nese rezistenci ke spektinomycinu (17, 120). Primární inzerční místo, att554, bylo lokalizováno ve specifické oblasti na chromozómu (84), byly však detekovány i kmeny se dvěma (S. aureus) a více (u CoNS) inzerty (185, 186). Transpozon Tn554 může být lokalizován také na konjugativních plazmidech (187) a je také součástí chromozomální kazety methicilinové rezistence typu II (71). Gen msr(A) byl lokalizován buď na velkých (20 - 30 kb) plazmidech (107, 110, 111, 150) u S. epidermidis a S. aureus, nebo na chromozómu u S. hominis (148). U S. haemolyticus JCSC1435 je gen msr(A) součástí plazmidu integrovaného do chromozómu (179). Gen lnu(A) je obvykle nesen na malých (2,3 - 4 kb) plazmidech replikujících se mechanismem valivé kružnice (RC plazmidy) (26, 27, 99). Devět různých, avšak příbuzných plazmidů bylo popsáno v izolátech CoNS z klinické mastitidy krav (99). Devět vysoce podobných lnu(A) genů (92,8 - 100 % identity) je obklopeno přímými repeticemi, které tvoří kazetu. Ta je pravděpodobně volně přenositelná mezi různými plazmidy rodiny pC194. To vysvětluje, proč jsou tyto velmi příbuzné geny neseny na plazmidech s rep geny, které navzájem vykazují 47,9 až 100 % identity. Stejné přímé repetice byly nalezeny i na stafylokokových plazmidech nesoucí jiné rezistenční geny (20, 21, 23).

33

III.VÝSLEDKY

34

VÝSLEDKY Makrolidová a linkosamidová rezistence v ČR

1. Rozšíření mechanismů rezistence k makrolidům a linkosamidům u methicilin rezistentních koaguláza negativních stafylokoků v České republice a výskyt neznámého mechanismu rezistence k linkosamidům

Cíle: Cílem práce bylo analyzovat rozšíření mechanismů rezistence k makrolidům a linkosamidům u klinických izolátů methicilin rezistentních koaguláza negativních stafylokoků (CoNS) izolovaných v České republice. Metody: Celkem 919 klinických izolátů CoNS bylo shromážděno během roku 1996 v sedmi českých nemocnicích a zasláno do Státního zdravotního ústavu, kde byly izoláty druhově identifikovány. Citlivost k antibiotikům byla testována diskovou difúzní metodou (DDM) a diskovým indukčním testem. Přítomnost rezistenčních genů erm(A), erm(C), msr(A), lnu(A)/lnu(A)' byla testována Southern blot hybridizací EcoRI štěpené celkové DNA se specifickými sondami značenými digoxigeninem. Izoláty S. haemolyticus pozitivní na gen msr(A) byly genotypizovány pulzní gelovou elektroforézou (PFGE) SmaI restrikčních fragmentů. Výsledky: Z celkového počtu bylo 98 izolátů (S. haemolyticus n=62, S. epidermidis n=27, S. hominis n=5, S. capitis n=3, S. warnerii n=1) současně rezistentních k oxacilinu a alespoň k jednomu z následujících antibiotik: erythromycin, linkomycin a klindamycin. Přestože rezistence k makrolidům a linkosamidům bývá často zkřížená, více jak polovina z 98 izolátů zůstala, dokonce i za indukčních podmínek, citlivá alespoň k jednomu z testovaných antibiotik. Tomu odpovídaly i výsledky genetické analýzy, jež potvrdily vysoký výskyt rezistenčních genů msr(A) (53 %) a lnu(A) 30 % udílejících rezistenci pouze k některým MLS antibiotikům. Neobvyklá byla také přítomnost více genů v jednom izolátu. Obvzláště kombinace genů msr(A) a lnu(A), která částečně fenotypově napodobuje přítomnost genů erm, byla frekventovaná. Distribuce rezistenčních genů byla druhově specifická. Vysoký výskyt genu msr(A) byl typický pro S. haemolyticus (u 43 z 62 izolátů) zatímco u izolátů S. epidermidis převládala přítomnost genů erm (u 16 z 27 izolátů). msr(A) pozitivní izoláty S. haemolyticus tvořily poměrně heterogenní skupinu co se týče místa izolace, rezistenčního genotypu a msr(A) hybridizačních profilů. Heterogenita izolátů, která byla potvrzena také PFGE genotypizací, vylučuje klonální šíření této rezistence během outbreaku. Zcela nový rezistenční fenotyp (citlivost k erythromycinu a rezistence k oběma linkosamidům), který byl pozorován u deseti klonálně příbuzných izolátů S. haemolyticus, u nichž nebyl detekován žádný z testovaných rezistenčních genů, nasvědčuje přítomnosti nového rezistenčního mechanismu.

35

VÝSLEDKY Nový rezistenční protein Vga(A)LC

2.

Nová

varianta

proteinu

streptograminové

rezistence,

Vga(A)LC,

ze

Staphylococcus haemolyticus se změnou substrátové specifity směrem k linkosamidům

Cíle: Otestovat potenciální mechanismy nové rezistence k linkosamidům u klinických izolátů S. haemolyticus rezistentních k oběma linkosamidům avšak citlivých k erythromycinu, u kterých nebyl nalezen žádný odpovídající rezistenční gen, a určit genetickou podstatu této rezistence. Metody: Přítomnost mutací ve vazebném místě linkosamidů byla testována PCR amplifikací a sekvenací relevantních úseků na 23S rRNA. Inaktivace linkomycinu byla testována použitím citlivého mikroorganismu. Proteiny příbuzné ABC rezistenčním proteinům byly vyhledávány použitím degenerovaných PCR primerů navržených podle konzervovaných úseků této rodiny proteinů. Souvislost nalezených sekvencí s rezistenčním fenotypem byla prokázána hybridizací s DNA rezistentních a citlivých izolátů. Konstrukty kódující Vga proteiny a jejich hybridní varianty byly transformovány do citlivého S. aureus RN4220, kde byla porovnávána schopnost udílet rezistenci k linkosamidům a streptograminům. Minimální inhibiční koncentrace antibiotik byly stanoveny agarovou diluční metodou. Radioaktivně značený linkomycin byl připraven enzymaticky s využitím proteinu LmbJ katalyzujícím methylaci N-demethyllinkomycinu v závěrečném kroku biosyntézy linkomycinu. Akumulace [3H]-linkomycinu v buňkách byla měřena scintilačně. Výsledky: Experimentálně byla vyloučena chromozomální a inaktivační rezistence. Degenerovanými PCR primery byl nalezen a osekvenován kandidátní gen vga(A)LC kódující ABC protein, jenž se od proteinu Vga(A), udílející rezistenci ke streptograminům A, liší pouze sedmi aminokyselinovými záměnami. Tento gen byl přítomen pouze v izolátech rezistentních k oběma linkosamidům a streptograminu A. Porovnáním obou proteinů v hostiteli citlivém k antibiotikům byl prokázán rozdíl ve schopnosti udílet rezistenci k linkosamidům. Vliv aminokyselinových záměn na substrátovou specifitu proteinů Vga(A) a Vga(A)LC byl dále testován. Mutační analýzou byl identifikován shluk čtyř aminokyselin v centrální části proteinu zodpovědný za rozdílný fenotypový projev. Měřením akumulace [3H]-linkomycinu bylo prokázáno, že mechanismus linkosamidové rezistence u S. haemolyticus je identický s mechanismem popsaným u rezistenčního proteinu Msr(A), udílející rezistenci vůči makrolidům a streptograminům............................................................................

36

VÝSLEDKY Účinnost telithromycinu a quinupristinu/dalfopristinu

3. In vitro účinnost telithromycinu a quinupristinu/dalfopristinu proti methicilin rezistentním koaguláza negativním stafylokokům s definovaným rezistenčním genotypem

Cíle: Otestovat účinnost nově zavedených antibiotik telithromycinu (TEL, ketolid) a quinupristinu/dalfopristinu (Q/D, streptograminy) proti dříve charakterizovaným klinickým izolátům methicilin rezistentních koaguláza negativních stafylokoků se zřetelem na specifický výskyt jinde spíše minoritních rezistenčních mechanismů, jejich kombinací a obzvláště pak se zřetelem na přítomnost nového rezistenčního genu vga(A)LC udílejícího rezistenci k linkosamidům a streptograminu A u S. haemolyticus (124). Metody: V této studii bylo zahrnuto 88 klinických izolátů koaguláza negativních stafylokoků pocházejících ze sbírky fenotypově a geneticky charakterizovaných izolátů rezistentních k makrolidům a/nebo linkosamidům (123). Citlivost k TEL a QD byla testována diskovou difúzní metodou (DDM) a indukčním diskovým testem s použitím erythromycinu jako induktoru. Rezistence k TEL za indukčních podmínek byla testována DDM v přítomnosti subinhibičních koncentrací erythromycinu v médiu. Minimální inhibiční koncentrace (MIC) pro Q/D byly stanoveny E testem a MIC pro PIIA agarovou diluční metodou. Citlivosti k antibiotikům byly vyhodnocovány dle kritérií CSLI (31). Přítomnost rezistenčních genů mph(C) a vga(A)/vga(A)LC byla detekována PCR amplifikací ze specifických primerů. Totožnost vga(A) varianty byla ověřena osekvenováním PCR produktu. Výsledky: Citlivost k telithromycinu u testovaného souboru byla ovlivněna stejnými rezistenčními mechanismy jako rezistence k erythromycinu. TEL byl plně aktivní pouze proti všem 15 erythromycin senzitivním izolátům a naopak všech 73 erythromycin rezistentních izolátů bylo buď konstitutivně rezistentních k TEL (13 izolátů s konstitutivním genem erm), nebo u nich byla detekována deformovaná inhibiční zóna znamenající indukci rezistence (u 25 izolátů s inducibilním genem erm a u 35 izolátů s genem msr(A)). Nicméně, úroveň rezistence k TEL udílená genem msr(A) byla i za indukčních podmínek hraniční. Inaktivační gen mph(C) byl nalezen u všech 21 testovaných izolátů (16 S. haemolyticus a 5 S. epidermidis) v sousedství genu msr(A). Pokud byla pro testování citlivosti ke Q/D použita DDM, nebyl detekován žádný rezistentní izolát. Avšak pokud byl pro testování použit E test, 18 izolátů bylo intermediárně rezistentních (MIC = 1-3 mg/l) ke Q/D a dva byly dokonce rezistentní (MIC = 8 mg/l). Všechny tyto izoláty byly současně rezistentní ke streptograminu A a obsahovaly geny vga(A) (1 izolát) nebo gen vga(A)LC (19 izolátů). MIC pro Q/D byla vyšší (3-8 mg/l) u izolátů rezistentních současně ke streptograminu B než u izolátů k tomuto antibiotiku citlivých (MIC = 0,5-2 mg/l). Kromě S. haemolyticus byl gen vga(A)LC nalezen u S. epidermidis a S. warnerii, což naznačuje jeho rozšíření. Q/D byl účinnější než TEL díky synergistickému účinku Q/D, který byl zachován i přes získání rezistence k jedné složce streptograminu, a také díky nízkému výskytu rezistence ke streptograminu A. Nesprávná identifikace izolátů rezistentních k nízkým koncentracím Q/D může přispět k šíření rezistence ke streptograminu A.

37

VÝSLEDKY Analýza okolí genu msr(A)

4. Sekvenční analýza okolí rezistenčního genu msr(A) u S. haemolyticus (data pro připravovanou publikaci)

V publikaci (123) jsme charakterizovali zastoupení mechanismů rezistence k makrolidům a linkosamidům u klinických izolátů methicilin rezistentních CoNS izolovaných v českých nemocnicích během roku 1996. Soubor studovaných izolátů byl vybrán na základě zkřížené rezistence alespoň k jednomu z následujících antibiotik: erythromycin, linkomycin a klindamycin. V souboru byla nalezena velmi neobvyklá převaha jinde spíše minoritních genů msr(A) a lnu(A). Neobvyklá byla také častá přítomnost více genů v jednom izolátu. Jedním z faktorů ovlivňujícím toto v porovnání s jinými studiemi netypické rozložení rezistenčních genů může být převaha izolátů S. haemolyticus (63 % všech izolátů). S. haemolyticus je velmi často mnohočetně rezistentní k antibiotikům a má vyšší podíl methicilin rezistentních izolátů v porovnání s obvykle dominantním S. epidermidis. Mimoto byla u tohoto druhu pozorována vyšší četnost MSB rezistence udílené genem msr(A) (45, 74, 93, 123). Selekce methicilin rezistentních izolátů, současně rezistentních alespoň k jednomu z testovaných MLS antibiotik, je tedy nejspíš důvodem převahy S. haemolyticus a současně také genu msr(A) v našem souboru. Nicméně i mezi izoláty ostatních druhů byla četnost msr(A) vyšší než bývá uváděno v literatuře. Gen msr(A) byl přítomen u 43 z 62 izolátů S. haemolyticus (69 %) tvořících velmi heterogenní skupinu co se týče velikostí EcoRI fragmentů hybridizujících se sondou specifickou pro msr(A) a počtu různých genotypů pozorovaných PFGE analýzou SmaI restrikčních fragmentů (123). Tato pozorování vylučují klonální rozšíření izolátů s genem msr(A) během outbreaku a jsou nejspíš důsledkem horizontálního šíření genu msr(A) mezi izoláty S. haemolyticus. Cílem této práce bylo lokalizovat a identifikovat mobilní element(y) nesoucí gen msr(A) a objasnit tak příčinu neobvykle velkého rozšíření tohoto genu u S. haemolyticus v České republice a také příčinu diverzity msr(A) hybridizačních profilů.

Gen msr(A) je většinou kódován chromozomálně Hybridizací neštěpené celkové DNA a plazmidové DNA se sondou specifickou pro gen msr(A) jsme zjistili, že rezistenční gen je s výjimkou dvou izolátů kódován chromozomálně. Southern blot analýza SmaI štěpené genomické DNA dělené pulzní gelovou elektroforézou ukázala, že gen je ve všech případech lokalizován na stejném fragmentu o velikosti přibližně 35 kb (Obr. 5.1.). Pouze u dvou izolátů byl gen msr(A) nalezen na velkém plazmidu.

Okolí chromozomálně lokalizovaného genu msr(A) u KM45 Pro sekvenční analýzu okolí chromozomálně kódovaného genu msr(A) jsme vybrali kmen KM45, který zastupuje nejpočetnější hybridizační profil, kdy msr(A) sonda hybridizuje s EcoRI fragmentem o velikosti 5 kb. Kraje ClaI restrikčního fragmentu obsahujícího gen msr(A) byly po vložení do vektoru pBluescript II SK+ sekvenovány z univerzálních vektorových primerů. Sekvence obou konců byly identické s chromozomální sekvencí kmene S. haemolyticus JCSC1435 (mezi nukleotidy 2333473-2338226) jehož genom byl nedávno osekvenován (přístupové č. AP006716). Tento úsek je součástí plazmidu πSh1 integrovaného v chromozómu JCSC1435 (lokusy SH2296 -

38


SH2326) (179). Identické uspořádání genů v celé oblasti odpovídající plazmidu πSh1 a také jeho umístění v genomu bylo pro kmen KM45 potvrzeno PCR mapováním (Obr. 5.2.B). V této oblasti (22 kb) se nachází 30 otevřených čtecích rámců (ORF), mezi nimiž lze identifikovat 10 genů se známou nebo hypotetickou funkcí (Obr. 5.2.A.): Geny smp a stp kódující předpokládanou hydrofobní transmembránovou doménu a ATP vazebný protein jsou lokalizovány těsně před genem msr(A). Umístění těchto genů v sousedství msr(A) bylo popsáno na plazmidech z S. aureus a S. epidermidis nebo na chromozómu u S. hominis (110, 148). Původně se předpokládalo, že produkty těchto genů, jejichž homology (85 % a 65 % identity) byly nalezeny i u citlivého S. aureus RN4220, interagují s Msr(A) a tvoří tak funkční transportní systém. Inaktivace těchto genů v S. aureus RN4220 však neměla vliv na schopnost msr(A) udílet rezistenci v tomto hostiteli (149).

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

48.5 kb 23.1 kb

Obr. 5.1. PFGE SmaI restrikčních profilů a hybridizace se sondou specifickou pro gen msr(A). Dráhy 1a 16 Low range PFG marker, dráhy 2, 9 a 15 CCM7296 negativní kontrola, dráha 14 izolát bez msr(A), dráhy 3-8 a 10,11 a13 izoláty s msr(A) na chromozómu, dráha 12 izolát s msr(A) na plazmidu

Těsně za genem msr(A) je lokalizován rezistenční gen mph(C) kódující enzym inaktivující makrolidy. Tato fosfotransferasa MPH(2')II je totožná s Mph(C) kódovanou na plazmidu pSR1 (AF167161), kde se nachází stejně jako u JCSC1435 v těsném sousedství genu msr(A), a je téměř identická (jedna aminokyselinová záměna) s fosfotransferasou ze Stenotrophomonas maltophilia (9). Kromě plazmidu pSR1, kde jsou geny msr(A) a mph(C) odděleny 97bp dlouhou nekódující oblastí, se tato dvojice sousedících genů nachází také na plazmidu pMS97 z S. aureus. V tomto případě oba dva geny odděluje nekódující oblast o velikosti 341bp (108). Proteinové produkty genů msr(A) a mph(C) se od proteinů z S. haemolyticus JCSC1435 liší 7 a 4 aminokyselinami (98% identita). Geny binR a sin lokalizované downstream od dvojice msr(A)-mph(C) kódují stafylokokovou resolvasu a rekombinasu, obě z velké rodiny serinových rekombinas, jež jsou důležité pro horizontální přenos u grampozitivních baktérií. Geny binR a sin jsou mezi stafylokoky hojně rozšířeny a často jsou asociovány s transpozonem Tn552 nesoucí geny pro ß-laktamasu a s geny rezistence ke kvartérním amoniovým sloučeninám (131, 132, 154, 171).

39


Na 3´konci plazmidu πSh1 se nacházejí gen kadmiové rezistence cadD, jeho regulátor cadX a inzerční sekvence IS431 (nebo IS257) kódující transposasu. Na 5´konci integrovaného plazmidu je gen (lokus SH2296) pro replikační protein RC rodiny (rolling circle) plazmidů, které bývají často integrovány ve velkých konjugativních plazmidech (18). První polovina rep genu je zkrácena 147bp dlouhou sekvencí, jež je vysoce homologní s ISLE39 (insertion sequence like element) z S. aureus SH39 (95% identita) (2) a z S. epidermidis RP62A (94% identita). Tento element má, podobně jako inzerční sekvence (IS), na obou koncích invertované repetice (IR) avšak na rozdíl od IS nekódují žádnou transposasu. Nepřesná převrácená kopie ISLE39 se nalézá na témže integrovaném plazmidu mezi lokusy SH2321 a SH2322. Oba elementy mají 21bp dlouhé IR jejichž část (16bp) je totožná s IR inzerční sekvence IS431. ISLE elementy, jež byly nalezeny v různých stafylokokových izolátech by mohly být pozůstatky inzerčních sekvencí avšak není také vyloučeno, že se tyto elementy můžou účastnit mobilizace sekvencí, jež obklopují (22).

Okolí genu msr(A) u izolátů s jiným msr(A) hybridizačním profilem Přestože bylo prokázáno, že gen msr(A) je u všech izolátů nesen na chromozómu ve stejném místě, msr(A) specifická sonda hybridizovala s různými velikostmi EcoRI fragmentů DNA 43 msr(A)pozitivních izolátů (123). Abychom zjistili, co je důvodem této diverzity, vybrali jsme 14 izolátů lišících se svým EcoRI hybridizačním a PFGE profilem (Tab. 5.1.). Tyto izoláty byly podobně jako KM45 podrobeny PCR mapování. Produkty amplifikace, které se svou velikostí lišily od velikosti předpovězené ze sekvence S. haemolyticus JCSC1435, byly sekvenovány. Mezi izoláty bylo nalezeno několik rozdílů v uspořádání oblasti, která je jinak vysoce homologní s plazmidem πSh1 (Obr. 5.2.C). Tab. 5.1. Výběr izolátů pro PCR mapování okolí genu msr(A) a PCR produkty lišící se od JCSC1435

Izolát

Původní označení a izolátu

KM45

1032UL

KM71 KM49 KM33 KM30

SmaI restrikční profil

Detekované rezistenční geny

Velikost EcoRI fragmentu hybridizujícího s msr(A) b sondou

PCR produkty lišící se od JCSC1435 (kb)

B2

msr(A), lnu(A)

5 kb

33OL

A2

msr(A), erm(C)

7,7 kb

mph(C)-sin (1,4)

1065UL

A3

msr(A), erm(C), lnu(A)

4,7 kb

mph(C)-sin (3,8)

78BB

A5

msr(A), lnu(A), vga(A)LC

5 kb

argS-isle39 (2,8)

65OL

A5

erm(C), msr(A), vga(A)LC

5 kb

argS-isle39 (2,8)

KM57

141KV

B5

msr(A), lnu(A)

5 kb

KM36

111KR

C

msr(A)

11 kb

KM89

155OL

D

msr(A)

7,2 kb

binR-EcoRI (3,8)

KM78

88OL

F

msr(A)

3,5 kb

plazmid

KM35

103OL

I

msr(A)

7,2 kb

binR-EcoRI (3,8)

KM2

131UL

L1

msr(A), erm(C)

7,2 kb

binR-EcoRI (3,8)

KM37

15OL

L2

msr(A), lnu(A)

7,2 kb

binR-EcoRI (3,8)

KM27

32UL

nd

msr(A), lnu(A), vga(A)LC

5 kb

argS-isle39 (2,8)

KM38

33KR

T2

msr(A)

7,2 kb

binR-EcoRI (3,8)

KM50

1079UL

U

msr(A)

7,2 kb

binR-EcoRI (3,8)

KM88

14KR

X

msr(A)

3,5 kb

plazmid

KM68

233OL

Y

msr(A)

5 kb

c

c

mph(C)-sin (3,8)

a

Zkratka označuje město, v němž byl klinický izolát získán: BB - Brno, KR - Praha, KV - Praha, OL - Olomouc, UL - Ústí nad Labem b Velikosti fragmentů byly stanoveny pomocí programu AIDA (Advanced Image Data Analyzer, v.3.28) c Tyto PCR produkty se od JCSC1435 nelišily svojí velikostí, ale nukleotidovou sekvencí

40


41


Amplifikace s použitím primerů 13F a 14R (Obr. 5.2.) velmi dobře odrážela pozorované hybridizační typy. Zatímco u kmenů s msr(A) hybridizujícím EcoRI fragmentem o velikosti 5 kb byl amplifikován produkt o velikosti 1,4 kb, což odpovídá sekvenci S. haemolyticus JCSC1435, u kmenů s msr(A) hybridizujícím EcoRI fragmentem o velikosti 7,2 kb byl amplifikován PCR produkt o velikosti 3,8 kb (Tab. 5.1.). Sekvenací produktů izolátů KM2 a KM50 jsme zjistili inzerci levé poloviny transpozonu Tn552 (binL-tnpA-tnpB-TIRL), který se vložil downstream od genu sin namísto genu binR (Obr. 5.2.C). Tímto vložením došlo k rekonstrukci plazmidu Tn5404. Použitím stejné dvojice primerů však nedošlo k žádné amplifikaci u izolátů KM49 (4,7kb EcoRI fragment), KM71 (7,7kb EcoRI fragment) a KM36 (15kb EcoRI fragment). Odpovídající DNA úseky jsme u těchto izolátů s úspěchem amplifikovali použitím dvojice primerů 9F a 15R, specifických pro geny mph(C) a sin (Obr. 5.2.). Velikost PCR produktů pro izoláty KM49, KM36 byla stejná (3,8 kb) jako pro JCSC1435. Sekvenací obou produktů jsme zjistili stejné uspořádání genů mph(C), binR a sin jako u JCSC1435, avšak oba PCR produkty se lišily v nukleotidových sekvencích genů binR a sin, včetně jejich okolí (Obr. 5.3.). Velikost PCR produktu z kmene KM71 byla pouze 1,6kb a sekvence ukázala absenci pravé části transpozonu Tn5404 a genu binR. Touto delecí se formuje uspořádání genů msr(A)-mph(C)-sin, jež je identické s uspořádáním těchto genů na plazmidu pSR1 (AF167161). Nicméně sekvence genu sin u KM71 je totožná se sekvencí z JCSC1435. Další odlišnosti v uspořádání msr(A) oblasti na chromozómu byly nalezeny u izolátů KM27, KM30 a KM33. PCR amplifikací z primerů 1F a 2R došlo k amplifikaci 2,8kb velkého PCR produktu namísto předpokládaných 1,3 kb, což bylo způsobeno vložením inzerční sekvence ISSha1 do lokusu SH2295. Inzerční sekvence je ohraničená osminukleotidovými přímými repeticemi, jež jsou výsledkem duplikace cílového místa během integrace této inzerční sekvence z ISL3 rodiny (193).

Plazmid nesoucí gen msr(A) Pro analýzu okolí genu msr(A) neseného na plazmidu jsme vybrali kmen KM88, který obsahoval pouze jediný plazmid. Konce BsaBI/HindIII fragmentu, obsahujícího gen msr(A), byly po vložení do vektoru sekvenovány z univerzálních vektorových primerů. Sekvence obou konců fragmentu byly totožné s úsekem plazmidu pSR1 z S. aureus (3417-8591bp). Shodné uspořádání genů tnpIS431, msr(A), mph(C) a sin bylo v tomto fragmentu potvrzeno sekvenováním z primerů navržených uvnitř fragmentu. Nukleotidové sekvence genů msr(A) a mph(C) jsou téměř totožné s geny z JCSC1435, v genu msr(A) byla nalezena pouze jediná nukleotidová záměna, která se projevuje také na úrovni proteinu. Geny pro rekombinasu Sin jsou si podobné méně: 87% identita na úrovni DNA a 95% identita na proteinové úrovni. Kromě fragmentu s genem msr(A) jsme do vektoru vložili i některé další BsaBI/HindIII nebo HindIII fragmenty plazmidu p88 a jejich konce jsme opět sekvenovali z univerzálních primerů. Ačkoli nebyl osekvenován celý plazmid, z částí sekvencí (Tab. 5.2.), které odpovídají několika různým stafylokokovým plazmidům, vyplývá, že p88 je složeným plazmidem, který vznikl kointegrací celých nebo částí plazmidů zprostředkovanou IS431 (označována také IS257). Tyto IS jsou lokalizovány na krajích integrovaných plazmidů (18, 91).

42


Tab. 5.2. Výsledky BLAST analýzy sekvenovaných částí plazmidu p88 Vložený úsek (kb)

Sekvenováno z primeru (bp)

Úsek sek. fragmentu

M13F (1009)

263-591

žádná významná podobnost

591-1009

pSR1 1-419 (100 %)

1-263

HindIII/HindIII (2,8)

Nejlepší výsledek BLAST analýzy (% identity)

Pořadí genů v celém vloženém fragmentua (5'-3')

GenBank přístupové číslo

Reference, poznámky

pSR1 3420-3682 (100 %)

1-582

pSR1 1274-1855 (100 %)

tnp431, orf1, ofr2, tnp431 AF167161

S. aureus

CP000028

S. epidermidis RP62A genom

repC, tet, pre

CP000045

Staphylococcus aureus subsp. aureus COL (pT181 bývá součástí mozaikových plazmidů, a také SCCmec kazety typu III)

úsek nic nekóduje

SAU73027

sekvence Tn5405 mezi aphA-3 and IS1182right

tnp

AY028780

M13R (876) BsaBI/HindIII (5)


BsaBI/HindIII (2)



583-876

pSR1 2894-3187 (100 %)

M13R (950)

1-950

pSR1 3417-4366(100 %)

M13F (936)

1-636

pSR1 7656-8591 (100 %)

1-301

pSERP 16804-17104 (99 %)

295-907

pSERP 17180-17792 (100 %)

M13F (915)

1-915

pSERP 19546-20461 (100 %)

M13F (945)

1-945

pSERP 23181-24125 (98 %)

M13R (958)

1-958

pSERP 24166-25123 (99 %)

M13R (860)

1-860

pT181 818-1677 (100 %)

M13F (872)

1-872

pT181 2039-3177 (99 %)

M13F (982)

1-982

Tn5405 402-1383 (99 %)

1-680

Tn5405 1802-2480 (99 %)

tnp431, msr(A), mph(C), sin

M13R (907) tnp431, rep, spm, rlx, mob, tnp431

M13R (974) 681-974

pST6 (200-494) 100 %

tnp431 100 % i s dalšími plazmidy

a

Pokud délka úseku mezi osekvenovanými konci vložených fragmentů plazmidu p88 odpovídala vzdálenostem v sekvenci z databáze, byl vložený fragment považován za celistvý.

Hlavním zdrojem variability msr(A) oblasti je aktivita resolvasy a transposasy Mezi 15 izoláty jsme PCR mapováním a sekvenováním nalezli 6 různých typů uspořádání okolí genu msr(A). U pěti z nich byla variabilita soustředěna do oblasti genů binR a sin (Obr. 5.2. a 5.3). Jak již bylo zmíněno, resolvasa Bin a rekombinasa Sin patří do velké rodiny serinových rekombinas. Regulace rekombinace je spojená s vysokým stupněm topologické selektivity. Tyto rekombinasy působí v rekombinačních místech (res site), jež jsou uspořádána jako přímé repetice v rámci jednoho plazmidu. Selektivita je pravděpodobně dána formováním katalyticky aktivní synapse tvořené rekombinasami a dalšími regulačními proteiny navázanými v oblasti res místa (153). Rekombinační místo pro bin (resbin) má tři vazebná místa, místo křížení molekuly (resbin site I), které je tvořeno nepřesnou invertovanou repeticí a další dvě místa pro navázání dalších dimerů resolvás (resbin siteII a III) (159). Rekombinační místo pro sin (ressin) má pouze dvě vazebná místa (ressin site I a II) a stejně jako u resbin je místo štěpení DNA uprostřed nepřesných invertovaných repetic v místě ressin site I (155).

43


Obr. 5.3. Porovnání sekvencí rekombinačních míst genů bin a sin a jejich okolí u JCSC1435 a izolátů s odlišným uspořádáním v tomto úseku msr(A) oblasti. První řádek: sekvence u JCSC1435; nukleotidová sekvence genů a terminálních invertovanýh repetic je vynechána. Sekvence, jež tvoří rekombinační místa ressin a resbin, jsou zvýrazněny tlustě. Neúplné palindromy uvnitř rekombinačních míst jsou podtrženy a místo rekombinace je vyznačeno lomítkem. U ostatních sekvencí jsou zobrazeny pouze nukleotidové záměny v nekódujících oblastech a identita nukleotidových sekvencí genů (%). U sekvence izolátu KM50 jsou zeleně vyznačeny jediné dvě nukleotidové záměny uvnitř TIRRa a přerušovanou čárou je vyznačena vložená sekvence odpovídající levé části Tn552. Sekvence mezi TIRRa a TIRLa odpovídá transpozonu Tn5404. Sekvence izolátu KM71 a plazmidu pSR1 mezi rekombinačními místy ressin site I chybí. Červeně s černě zvýrazněnými záměnami uvnitř je vyznačená zdvojená sekvence pravého ramena ressin site I.

Z porovnání sekvencí úseků lišících se u jednotlivých izolátů (Obr. 5.3.) jsou patrná místa, kde pravděpodobně došlo k rekombinacím, jež mají za následek většinu rozdílů nalezených v msr(A) oblasti. Všechny sekvence na obrázku 5.3. jsou identické až do místa rekombinace v ressin site I. U izolátu KM71 a plazmidu pSR1 (a pravděpodobně také u p88), které nemají resolvásu binR pokračuje sekvence pravým ramenem ressin site I a dále pak sekvencí odpovídající ressin site II a genem sin. U sekvence JCSC1435 a izolátů KM36 a KM49 je v tomto místě vložen úsek pravého ramena ressin siteI, avšak na něj nenavazuje ressin site II, ale terminální invertovaná repetice TIRRa a otevřené čtecí rámce orfB a orfA, jež jsou součástí transpozonu Tn5404. Dále pak sekvence pokračuje rekombinačním místem pro resolvásu resbin. V místě resbin site I došlo pravděpodobně k resolvasou řízené rekombinaci, jež má za následek odlišné sekvence genů binR a pravděpodobně také sin u izolátů KM36 a KM49. Za genem binR následuje úsek, jenž je v obrázku 5.3. označen jako ∆ressin site I, u kterého levé rameno palindromu chybí podobně jako u plazmidu pI9789, u kterého byla nefunkčnost tohoto ressin místa s chybějícím levým ramenem prokázána (155). U izolátu KM50, který se od JCSC1435 liší vložením levé poloviny transpozonu Tn552, začínají rozdíly teprve až v genu binL (Obr. 5.3.), který je z 94 % identický s binR. V genomu JCSC1435 se vyskytují dvě binL resolvasy, které jsou s binL z izolátu KM50 identické. První, v pozici JCSC1435 1826963-1826434, je

44


součástí kompletního transpozonu Tn552 a s rekombinačním místem resbinR je identická až k místu rekombinace (resbinR site I). Druhá, v pozici JCSC1435 261884-2618311, je součástí sekvence transpozonu Tn5404. Kompletní transpozon Tn5404 je na vnějších okrajích ohraničen 7 bp dlouhou přímou repeticí (AGTAACT), jež vznikla zdvojením místa inzerce transpozonu (Obr. 5.3.), stejné inzerční místo pro Tn552 bylo pozorováno v chromozómu Entereococcus faecalis CH116 (146, 155).

Shrnutí výsledků: •

Gen msr(A) byl u 41 izolátů lokalizován na chromozómu ve společném místě, pouze u dvou izolátů byl gen lokalizován na plazmidu.

•

Oblast chromozomálně kódovaného genu msr(A) je u všech patnácti podrobněji studovaných izolátů (Tab. 5.1.) vysoce homologní s plazmidem πSh1, integrovaným v genomu S. haemolyticus JCSC1435 izolovaného v Japonsku (179).

•

Uspořádání genů na tomto plazmidu je konzervovaným souborem jednotlivých genových motivů, jehož menší fragmenty byly odděleně popsány v několika dřívějších studiích.

•

Rozdíly v msr(A) hybridizačních profilech jsou dány výhradně variabilitou v úseku kódujícím resolvasu Bin a rekombinasu Sin.

•

Nalezli jsme pět různých typů uspořádání msr(A) oblastí, které se liší od JCSC1435 tímto: i) vložením části transpozonu Tn552 (typ KM50; 7,2kb msr(A) hybridizující fragment) ii) delecí části transpozonu Tn5404 (typ KM71; 7,7kb msr(A) hybridizující fragment) Oba tyto blízce příbuzné transpozony náleží do rodiny Tn21. Preferenčními místy vkládání těchto transpozonů jsou rekombinační místa ressin a resbin, jsou proto označovány jako "ressite hunters" (117). iii) sekvencí genů binR a sin, včetně jejich okolí (typ KM36; 11kb msr(A) hybridizující fragment a typ KM49, 4,6kb msr(A) hybridizující fragment), jenž je pravděpodobně důsledkem rekombinace v místě resbin. iv) vložením ISSha1 do stejného místa, jež leží za 5' koncem plazmidu πSh1 (typ KM27; 5kb msr(A) hybridizující fragment). Všechny izoláty s touto IS (KM27, KM30 a KM33) náleží stejnému hybridizačnímu typu jako JCSC1435

•

Okolí genu msr(A) na plazmidu p88 je identické s plazmidem pSR1 izolovaným z S. aureus a uspořádání genů msr(A)-mph(C)-sin je totožné s msr(A) okolím u izolátu KM71.

45

IV. DISKUZE

46

DISKUZE

Ve třech přijatých a jedné připravované publikaci jsou shrnuty výsledky studia mechanismů rezistence k makrolidům, linkosamidům a streptograminům u methicilin rezistentních koaguláza negativních stafylokoků. Pilotní práce (123) definovala soubor rezistentních klinických izolátů z ČR, u něhož byl stanoven rezistenční profil na fenotypové i genové úrovni. Velmi neobvyklá distribuce rezistenčních genů a pozorování nového rezistenčního fenotypu, jenž implikuje přítomnost doposud neznámé rezistenční determinanty, byly důvodem v pokračování výzkumu tohoto tématu. Výsledkem bylo objevení nové varianty rezistenčního ABC proteinu Vga(A)LC s rozšířeným substrátovým spektrem, u kterého jsme určili aminokyseliny zodpovědné za tuto změnu v substrátové specificitě (124). Dále jsme charakterizovali mobilní elementy nesoucí dominantní rezistenční gen msr(A) kódující protein ze stejné rodiny ABC proteinů jako Vga(A)LC (Novotná, v přípravě). Poslední publikace (125) využívá tento z hlediska MLS rezistencí detailně prostudovaný souboru izolátů CoNS k otestování účinnosti nových antibiotik telithromycinu a quinupristinu/dalfopristinu na pozadí rezistenčního profilu charakteristického pro ČR. Z klinického hlediska je převaha rezistenčních mechanismů udílející rezistenci pouze k některým MLS antibiotikům velmi zajímavá, dochází totiž k dělení původně společné MLSB rezistenční skupiny: v testovaném souboru bylo dokonce i za indukčních podmínek pouze 44 % izolátů rezistentních ke všem třem testovaným antibiotikům. To znamená, že alespoň některé z MLS antibiotik zůstává účinné proti více jak polovině izolátů CoNS. Otázkou je, zda je toto v jiných zemí zcela neobvyklé rozložení rezistenčních mechanismů mezi methicilin-rezistentními CoNS typické pro Českou republiku (či region střední či východní Evropy), nebo zda došlo k lokálnímu šíření (outbreaku) klonů s těmito typy rezistence. Prvotní MSB rezistentní izoláty CoNS (S. hominis, S. cohnii) s genem msr(A) byly izolovány v Československu v roce 1976 (39) a první S. aureus s tímto genem byl izolován v Maďarsku v roce 1977 (72). Také inaktivace linkosamidů byla poprvé pozorována u izolátů S. aureus a S. intermedius zvířecího původu z Československa (49, 88). Je tedy možné, že se tyto rezistenční mechanismy vyvinuly právě v tomto regionu. Důvodem však také může být intenzivní výzkum stafylokoků Prof. Václavem Hájkem, působícím na Palackého univerzitě v Olomouci, který mnohé z těchto raných rezistentních stafylokoků izoloval. Klonálnímu šíření rezistence nasvědčuje fakt, že většina msr(A) pozitivních izolátů (43 z 52) a více jak polovina lnu(A) pozitivních izolátů (19 z 29) byla identifikována jako S. haemolyticus. Zároveň S. haemolyticus jasně převažoval (63 %) ve výběru methicilin-rezistentních izolátů se zkříženou rezistencí k MLS antibiotikům, přestože v původním souboru 919 izolátů byl nejčastějším druhem S. epidermidis. Genotypizace izolátů S. haemolyticus však tuto hypotézu potvrdila pouze velmi omezeně: Mezi 46 erythromycin rezistentními izoláty bylo pozorováno 34 rozdílných genotypů, z nichž pouze některé se dle klasifikace Tenover et al. (181) zdají být klonálně příbuzné (nepublikovaná data). Díky své schopnosti akumulovat rezistence, bývá S. haemolyticus často rezistentní k mnoha antibiotikům, a dokonce i první methicilin a glykopeptid rezistentní izoláty náležely tomuto druhu (42, 60). Sekvenace genomu S. haemolyticus JCSC1435 odhalila přítomnost velkého množství funkčních inzerčních sekvencí (IS), jež jsou důvodem extrémní plasticity genomu zlepšující jeho adaptabilitu na prostředí hostitelského organizmu včetně získávání odolnosti k mnoha antibakteriálním látkám (179).

47

DISKUZE

Gen msr(A) byl u naprosté většiny našich izolátů lokalizován na chromozómu v rámci integrovaného plazmidu, stejně jako u sekvenovaného kmene JCSC1435 (179). Tento plazmid postrádá geny kódující mobilizační proteiny a nelze u něj nalézt ani žádné struktury charakteristické pro transpozon nebo chromozomální kazetu, které by naznačovaly možný mechanismus horizontálního přenosu msr(A)-mph(C) lokusu. Otázkou tedy je, zda se msr(A) šíří horizontálním přenosem, anebo pouze klonálně. Jednou z možností horizontálního šíření je mobilizace pomocí v genomu hojně se vyskytujících IS, jejichž přítomnost v okolí msr(A)-mph(C) lokusu by mohla způsobit přenesení genů do konjugativního plazmidu. Tomu nasvědčuje přítomnost msr(A)-mph(C) na mozaikovém plazmidu u dvou izolátů v naší sbírce a také přítomnost inzerčních sekvencí IS431 upstream od genů cadD a cadX a ISha1 u kmenů KM27, 30 a 33. V tomto předpokládaném procesu mobilizace by se mohla uplatňovat také nalezená dvojice ISLE39 elementů. Alternativně, podobnou funkci může mít i rekombinasa sin, která se jako jediná vyskytuje v sousedství msr(A)-mph(C) i na obou plazmidech. Není však vyloučeno, že k takovýmto událostem dochází pouze výjimečně a že je tato oblast relativně stabilní součástí jinak velmi tvárného genomu. Tomu nasvědčuje fakt, že JCSC1435, který byl izolován v Japonsku v roce 2000 má identickou msr(A) oblast s některými izoláty získanými v České republice v roce 1996 a naopak, že v rámci epidemiologicky příbuzných izolátů existují rozdíly. Jednotlivé genové motivy byly nalezeny v mnoha stafylokokových izolátech v různých studiích: kombinace genů smp-stp-msr(A) byla nalezena na plazmidu S. epidermidis a v chromozómu S. hominis (148), tatáž kombinace genů navíc se sekvencí upstream od msr(A), byla nalezena u izolátů S. aureus (110). Kombinace genů msr(A)-mph(C)-sin se vyskytuje na plazmidu pSR1 (AF167161) a dvojice genů msr(A)-mph(C) na plazmidu pMS97 z S. aureus (108) a také v mnoha dalších izolátech (45, 179). Téměř identická kombinace genů mph(C)-sin byla dokonce nalezena u gramnegativní Stenotrophomonas maltophilia (9). Až do sekvenace genomu JCSC1435 nebyla publikována jediná sekvence kódující všechny tyto geny. Analýza širšího okolí genu msr(A) v těchto izolátech by byla zapotřebí, aby bylo možné shrnout, zda je uspořádání genů smp-stp-msr(A)-mph(A)sin opakující se součástí mobilních elementů nesoucích gen msr(A). Eventuálně jestli se do ostatních stafylokokových druhů a i do jiných rodů šíří pouze jednotlivé části této oblasti náhodně. Identita sekvence části plazmidu p88 obsahující IS431-msr(A)-mph(C)-sin s úsekem na plazmidu pSR1 z S. aureus a to včetně rekombinasy, která je hlavním zdrojem variability v msr(A) oblasti izolátů v souboru, je dokladem přímé spojitosti přenosu msr(A) a mph(C) rezistenčních genů mezi těmito druhy. Multirezistentní S. haemolyticus tak může sloužit jako zdroj rezistencí pro virulentnější S. aureus, což by mohlo mít vliv i na vyšší podíl genu msr(A) u izolátů tohoto druhu. Avšak mezi stovkou methicilin rezistentních S. aureus izolovaných v českých nemocnicích v letech 2000-2002 byly nalezeny pouze dva msr(A) pozitivní izoláty (113). Teprve vyšetření aktuálního souboru klinických izolátů CoNS může potvrdit, zda je výskyt "alternativních" mechanismů udílejících rezistenci pouze k některým MLS antibiotikům v České republice stále významný. Se stoupající spotřebou makrolidů a linkosamidů (Obr. 6.1.) lze obecně očekávat nárůst rezistence k těmto antibiotikům, otázkou však je, jaké rezistenční mechanismy se u CoNS uplatňují. V případě, že by byl výskyt alternativních rezistencí u CoNS stále aktuální, má velký význam v klinické praxi rutině testovat citlivost k MLS antibiotikům diskovým indukčním testem (Obr.

48

DISKUZE

4.1.). Použití disků s oběma linkosamidy, linkomycinem a klindamycinem, umožní identifikovat inaktivaci linkomycinu, která by v případě použití pouze doporučené kombinace disků s erythromycinem a klindamycinem (40, 121) zůstala skrytá. Díky tomu, že výběr studované sbírky CoNS nebyl omezen pouze na erythromycin rezistentní izoláty, jako u většiny podobných studií, podařilo se zachytit i 10 izolátů S. haemolyticus rezistentních k oběma linkosamidům, avšak citlivých k erythromycinu, u kterých jsme později charakterizovali novou rezistenční determinantu vga(A)LC udílející rezistenci k linkosamidům a streptograminům A (124). Později se ukázalo, že tento gen je kromě těchto deseti izolátů přítomen také u dalších 9 erythromycin rezistentních izolátů S. haemolyticus, S. epidermidis a S. warnerii, u nichž byla LSA rezistence částečně maskována přítomností jiných rezistenčních determinant.

Obr. 6.1 Porovnání spotřeby MLS antibiotik v letech 1989 - 2005a

3,5

2005

DDD/1000/db

3

2003 2001 2002

1999

2,5 1995

1996

1997

1998

2004

2000

2 1994 1,5 1993 1 0,5

1989 1990 1991 1992

0 a b

údaje z let 1989-1998 převzaty z (177), údaje z let 1999-2005 poskytnuty SÚKL spotřeba je uváděna v počtu doporučených denních dávek na 1000 obyvatel za jeden den

Spolu s genem vga(A) nalezeným u jednoho izolátu S. epidermidis je to celkem 20 izolátů rezistentních ke streptograminu A. Ačkoli z tohoto počtu byly pouze dva izoláty rezistentní ke kombinaci streptograminů quinupristin/dalfopristin, je toto číslo alarmující, zejména proto, že izoláty pocházejí z doby, kdy v humánní medicíně streptograminy nebyly v České republice používány. Důvodem relativně vysokého počtu může být selekční tlak linkosamidů na gen vga(A)LC s pozměněnou substrátovou specifitou a nebo používání virginiamycinu jako přídavku do krmných směsí. Intravenózní quinupristin/dalfopristin je vzhledem ke své dobré účinnosti i proti erythromycin rezistentním izolátům vynikající alternativou proti rezistentním stafylokokům, navíc je v současné době testován nový orální derivát, který in vitro vykazuje až čtyřnásobně vyšší účinnost dokonce i proti izolátům s rezistenčními geny (38). Lze tedy očekávat nárůst spotřeby těchto antibiotik, který se projeví zvýšeným selekčním tlakem na streptograminovou rezistenci. Do budoucna bude proto nezbytné zahrnout mezi sledované MLS rezistence také ty, které jsou specifické pro streptograminy.

49

DISKUZE

Vzhledem k možnému selhání testování citlivosti ke kombinaci quinupristin/dalfopristin diskovým difúzním testem (125, 136) by bylo užitečné v klinické praxi testovat citlivost také k jednotlivým komponentám. Nově nalezený rezistenční protein Vga(A)LC se od proteinu Vga(A) udílejícího rezistenci ke streptograminu A liší pouhými sedmi aminokyselinami. Porovnáním rezistenčního profilu obou variant proteinů v citlivém hostiteli jsme prokázali, že protein Vga(A)LC udílí vyšší hladiny rezistence k oběma linkosamidům. Avšak hodnoty MIC nedosahovali hodnot naměřených v původním hostiteli, což by mohlo naznačovat potřebnost další komponenty systému. Nelze však vyloučit ani další rezistenční determinanty. Přestože chybí přímý důkaz, spočívající v inaktivaci genu vga(A)LC a s tím spojenou ztrátou LSA fenotypu, domníváme se, že je tento rezistenční gen plně zodpovědný za linkosamidovou rezistenci u těchto izolátů. Tomu nasvědčuje úplná korelace LSA rezistenčního fenotypu s přítomností genu vga(A)LC a stejné průběhy akumulace radioaktivně značeného linkomycinu v buňkách LSA rezistentního S. haemolyticus s genem vga(A)LC a erythromycinu v buňkách s genem msr(A) (110), který kóduje protein ze stejné rodiny ARE ABC transportérů. Navíc posun v substrátové specifitě směrem k linkosamidům není překvapivý vzhledem k existenci několika dalších proteinů s překrývající se specifitou k linkosamidům a streptograminu A, která pravděpodobně souvisí s překryvem ribozomálním vazebným místem těchto antibiotik (80) a kap.3.3.3. Porovnáváním hybridních proteinů odvozených od Vga(A)LC a Vga(A) jsme zjistili, že pouze čtyři ze sedmi aminokyselinových zbytků, kterými se oba proteiny liší, jsou zodpovědné za změnu substrátové specifity (124). Tyto čtyři aminokyseliny jsou nahloučené v krátkém úseku 15 aminokyselin situovaných v oblasti spojující obě ATP vazebné domény. To naznačuje, že tato část by mohla být zodpovědná za rozpoznání a vazbu substrátu. V současné době je připravovaná nová sada mutantních proteinů Vga(A) a Vga(A)LC s bodovými mutacemi kombinujícími výše zmíněnou čtveřici aminokyselin, což by mělo dále upřesnit jejich konkrétní význam v určení substrátové specifity. Dvojice téměř identických proteinů Vga(A) a Vga(A)LC s odlišnou substrátovou specifitou je ideálním modelem pro studium mechanismu funkce ARE rodiny rezistenčních proteinů, jež se díky sekvenačním genomovým projektům rychle rozrůstá.

50

V. REFERENCE

51

REFERENCE

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11. 12. 13.

14. 15.

16. 17. 18.

19. 20.

21.

Achard, A., C. Villers, V. Pichereau, and R. Leclercq. 2005. New lnu(C) gene conferring resistance to lincomycin by nucleotidylation in Streptococcus agalactiae UCN36. Antimicrob Agents Chemother 49:2716-9. Alam, M. M., N. Kobayashi, N. Uehara, and N. Watanabe. 2003. Analysis on distribution and genomic diversity of high-level antiseptic resistance genes qacA and qacB in human clinical isolates of Staphylococcus aureus. Microb Drug Resist 9:109-21. Allignet, J., S. Aubert, A. Morvan, and N. el Solh. 1996. Distribution of genes encoding resistance to streptogramin A and related compounds among staphylococci resistant to these antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 40:2523-8. Allignet, J., and N. el Solh. 1995. Diversity among the gram-positive acetyltransferases inactivating streptogramin A and structurally related compounds and characterization of a new staphylococcal determinant, vatB. Antimicrob Agents Chemother 39:2027-36. Allignet, J., and N. El Solh. 1997. Characterization of a new staphylococcal gene, vgaB, encoding a putative ABC transporter conferring resistance to streptogramin A and related compounds. Gene 202:133-8. Allignet, J., N. Liassine, and N. el Solh. 1998. Characterization of a staphylococcal plasmid related to pUB110 and carrying two novel genes, vatC and vgbB, encoding resistance to streptogramins A and B and similar antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 42:1794-8. Allignet, J., V. Loncle, P. Mazodier, and N. el Solh. 1988. Nucleotide sequence of a staphylococcal plasmid gene, vgb, encoding a hydrolase inactivating the B components of virginiamycin-like antibiotics. Plasmid 20:271-5. Allignet, J., V. Loncle, C. Simenel, M. Delepierre, and N. el Solh. 1993. Sequence of a staphylococcal gene, vat, encoding an acetyltransferase inactivating the A-type compounds of virginiamycin-like antibiotics. Gene 130:91-8. Alonso, A., P. Sanchez, and J. L. Martinez. 2000. Stenotrophomonas maltophilia D457R contains a cluster of genes from gram-positive bacteria involved in antibiotic and heavy metal resistance. Antimicrob Agents Chemother 44:1778-82. Ambrose, K. D., R. Nisbet, and D. S. Stephens. 2005. Macrolide efflux in Streptococcus pneumoniae is mediated by a dual efflux pump (mel and mef) and is erythromycin inducible. Antimicrob Agents Chemother 49:4203-9. Argoudelis, A. D., J. H. Coats, and S. A. Mizsak. 1977. Microbial transformation of antibiotics. Clindamycin ribonucleotides. J Antibiot (Tokyo) 30:474-87. Arthur, M., D. Autissier, and P. Courvalin. 1986. Analysis of the nucleotide sequence of the ereB gene encoding the erythromycin esterase type II. Nucleic Acids Res 14:4987-99. Azap, O. K., H. Arslan, F. Timurkaynak, G. Yapar, E. Oruc, and U. Gagir. 2005. Incidence of inducible clindamycin resistance in staphylococci: first results from Turkey. Clin Microbiol Infect 11:582-4. Ban, N., P. Nissen, J. Hansen, P. B. Moore, and T. A. Steitz. 2000. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289:905-20. Barthelemy, P., D. Autissier, G. Gerbaud, and P. Courvalin. 1984. Enzymic hydrolysis of erythromycin by a strain of Escherichia coli. A new mechanism of resistance. J Antibiot (Tokyo) 37:1692-6. Bartley, J. 2002. First case of VRSA identified in Michigan. Infect Control Hosp Epidemiol 23:480. Bastos, M. C., and E. Murphy. 1988. Transposon Tn554 encodes three products required for transposition. Embo J 7:2935-41. Berg, T., N. Firth, S. Apisiridej, A. Hettiaratchi, A. Leelaporn, and R. A. Skurray. 1998. Complete nucleotide sequence of pSK41: evolution of staphylococcal conjugative multiresistance plasmids. J Bacteriol 180:4350-9. Biskri, L., and D. Mazel. 2003. Erythromycin esterase gene ere(A) is located in a functional gene cassette in an unusual class 2 integron. Antimicrob Agents Chemother 47:3326-31. Bjorland, J., M. S. Bratlie, and T. Steinum. 2007. The smr gene resides on a novel plasmid pSP187 identified in a Staphylococcus pasteuri isolate recovered from unpasteurized milk. Plasmid 57:145-55. Bjorland, J., T. Steinum, M. Sunde, S. Waage, and E. Heir. 2003. Novel plasmid-borne gene qacJ mediates resistance to quaternary ammonium compounds in equine Staphylococcus aureus, Staphylococcus simulans, and Staphylococcus intermedius. Antimicrob Agents Chemother 47:3046-52.

52

REFERENCE

22.

23.

24.

25.

26. 27.

28.

29.

30.

31.

32. 33.

34. 35.

36.

37. 38.

39.

40.

41.

Bjorland, J., T. Steinum, M. Sunde, S. Waage, S. Sviland, H. Oppegaard, and E. Heir. 2006. Deletion of pT181-like sequence in an smr-encoding mosaic plasmid harboured by a persistent bovine Staphylococcus warneri strain. J Antimicrob Chemother 57:46-51. Bjorland, J., M. Sunde, and S. Waage. 2001. Plasmid-borne smr gene causes resistance to quaternary ammonium compounds in bovine Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 39:3999-4004. Bozdogan, B., L. Berrezouga, M. S. Kuo, D. A. Yurek, K. A. Farley, B. J. Stockman, and R. Leclercq. 1999. A new resistance gene, linB, conferring resistance to lincosamides by nucleotidylation in Enterococcus faecium HM1025. Antimicrob Agents Chemother 43:925-9. Bozdogan, B., and R. Leclercq. 1999. Effects of genes encoding resistance to streptogramins A and B on the activity of quinupristin-dalfopristin against Enterococcus faecium. Antimicrob Agents Chemother 43:2720-5. Brisson-Noel, A., and P. Courvalin. 1986. Nucleotide sequence of gene linA encoding resistance to lincosamides in Staphylococcus haemolyticus. Gene 43:247-53. Brisson-Noel, A., P. Delrieu, D. Samain, and P. Courvalin. 1988. Inactivation of lincosaminide antibiotics in Staphylococcus. Identification of lincosaminide Onucleotidyltransferases and comparison of the corresponding resistance genes. J Biol Chem 263:15880-7. Buriankova, K., F. Doucet-Populaire, O. Dorson, A. Gondran, J. C. Ghnassia, J. Weiser, and J. L. Pernodet. 2004. Molecular basis of intrinsic macrolide resistance in the Mycobacterium tuberculosis complex. Antimicrob Agents Chemother 48:143-50. Calcutt, M. J., and E. Cundliffe. 1990. Cloning of a lincosamide resistance determinant from Streptomyces caelestis, the producer of celesticetin, and characterization of the resistance mechanism. J Bacteriol 172:4710-4. Catchpole, I., and K. G. Dyke. 1990. A Staphylococcus aureus plasmid that specifies constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance contains a novel deletion in the ermC attenuator. FEMS Microbiol Lett 57:43-7. CLSI. 2007. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Seventeenth informational supplement M100-S17. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898. Dassa, E., and P. Bouige. 2001. The ABC of ABCS: a phylogenetic and functional classification of ABC systems in living organisms. Res Microbiol 152:211-29. Del Grosso, M., R. Camilli, F. Iannelli, G. Pozzi, and A. Pantosti. 2006. The mef(E)carrying genetic element (mega) of Streptococcus pneumoniae: insertion sites and association with other genetic elements. Antimicrob Agents Chemother 50:3361-6. Depardieu, F., I. Podglajen, R. Leclercq, E. Collatz, and P. Courvalin. 2007. Modes and modulations of antibiotic resistance gene expression. Clin Microbiol Rev 20:79-114. Diekema, D. J., M. A. Pfaller, F. J. Schmitz, J. Smayevsky, J. Bell, R. N. Jones, and M. Beach. 2001. Survey of infections due to Staphylococcus species: frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility of isolates collected in the United States, Canada, Latin America, Europe, and the Western Pacific region for the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 1997-1999. Clin Infect Dis 32 Suppl 2:S114-32. Dina, J., B. Malbruny, and R. Leclercq. 2003. Nonsense mutations in the lsa-like gene in Enterococcus faecalis isolates susceptible to lincosamides and Streptogramins A. Antimicrob Agents Chemother 47:2307-9. Dubnau, D. 1984. Translational attenuation: the regulation of bacterial resistance to the macrolide-lincosamide-streptogramin B antibiotics. CRC Crit Rev Biochem 16:103-32. Dupuis, M., and R. Leclercq. 2006. Activity of a new oral streptogramin, XRP2868, against gram-positive cocci harboring various mechanisms of resistance to streptogramins. Antimicrob Agents Chemother 50:237-42. Eady, E. A., J. I. Ross, J. L. Tipper, C. E. Walters, J. H. Cove, and W. C. Noble. 1993. Distribution of genes encoding erythromycin ribosomal methylases and an erythromycin efflux pump in epidemiologically distinct groups of staphylococci. J Antimicrob Chemother 31:211-7. Fiebelkorn, K. R., S. A. Crawford, M. L. McElmeel, and J. H. Jorgensen. 2003. Practical disk diffusion method for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. J Clin Microbiol 41:4740-4. Fokas, S., S. Fokas, M. Tsironi, M. Kalkani, and M. Dionysopouloy. 2005. Prevalence of inducible clindamycin resistance in macrolide-resistant Staphylococcus spp. Clin Microbiol Infect 11:337-40.

53

REFERENCE

42.

43.

44. 45.

46. 47.

48.

49. 50.

51.

52.

53.

54.

55.

56.

57.

58.

59. 60. 61.

62.

Froggatt, J. W., J. L. Johnston, D. W. Galetto, and G. L. Archer. 1989. Antimicrobial resistance in nosocomial isolates of Staphylococcus haemolyticus. Antimicrob Agents Chemother 33:460-6. Gabashvili, I. S., S. T. Gregory, M. Valle, R. Grassucci, M. Worbs, M. C. Wahl, A. E. Dahlberg, and J. Frank. 2001. The polypeptide tunnel system in the ribosome and its gating in erythromycin resistance mutants of L4 and L22. Mol Cell 8:181-8. Garrett, L. 1995. The coming plaque: Newly emerging diseases in a world out of balance. Penguin. Gatermann, S. G., T. Koschinski, and S. Friedrich. 2007. Distribution and expression of macrolide resistance genes in coagulase-negative staphylococci. Clin Microbiol Infect 13:77781. Gaynor, M., and A. S. Mankin. 2005. Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance. Frontiers in Medicinal Chemistry 2:21-35. Gregory, S. T., and A. E. Dahlberg. 1999. Erythromycin resistance mutations in ribosomal proteins L22 and L4 perturb the higher order structure of 23 S ribosomal RNA. J Mol Biol 289:827-34. Gryczan, T. J., G. Grandi, J. Hahn, R. Grandi, and D. Dubnau. 1980. Conformational alteration of mRNA structure and the posttranscriptional regulation of erythromycin-induced drug resistance. Nucleic Acids Res 8:6081-97. Hajek, V. 1976. Staphylococcus intermedius, a new species isolated from animals. Int. J. Syst. Bacteriol. 26:401-408. Hamilton-Miller, J. M., and S. Shah. 2000. Patterns of phenotypic resistance to the macrolide-lincosamide-ketolide-streptogramin group of antibiotics in staphylococci. J Antimicrob Chemother 46:941-9. Hansen, J. L., J. A. Ippolito, N. Ban, P. Nissen, P. B. Moore, and T. A. Steitz. 2002. The structures of four macrolide antibiotics bound to the large ribosomal subunit. Mol Cell 10:11728. Harms, J., F. Schluenzen, R. Zarivach, A. Bashan, S. Gat, I. Agmon, H. Bartels, F. Franceschi, and A. Yonath. 2001. High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107:679-88. Harms, J. M., F. Schlunzen, P. Fucini, H. Bartels, and A. Yonath. 2004. Alterations at the peptidyl transferase centre of the ribosome induced by the synergistic action of the streptogramins dalfopristin and quinupristin. BMC Biol 2:4. Haroche, J., J. Allignet, S. Aubert, A. E. Van Den Bogaard, and N. El Solh. 2000. satG, conferring resistance to streptogramin A, is widely distributed in Enterococcus faecium strains but not in staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 44:190-1. Haroche, J., J. Allignet, C. Buchrieser, and N. El Solh. 2000. Characterization of a variant of vga(A) conferring resistance to streptogramin A and related compounds. Antimicrob Agents Chemother 44:2271-5. Haroche, J., A. Morvan, M. Davi, J. Allignet, F. Bimet, and N. El Solh. 2003. Clonal diversity among streptogramin A-resistant Staphylococcus aureus isolates collected in French hospitals. J Clin Microbiol 41:586-91. Hauschild, T., P. Luthje, and S. Schwarz. 2006. Characterization of a novel type of MLSB resistance plasmid from Staphylococcus saprophyticus carrying a constitutively expressed erm(C) gene. Vet Microbiol 115:258-63. Heir, E., B. A. Lindstedt, T. M. Leegaard, E. Gjernes, and G. Kapperud. 2004. Prevalence and characterization of integrons in blood culture Enterobacteriaceae and gastrointestinal Escherichia coli in Norway and reporting of a novel class 1 integron-located lincosamide resistance gene. Ann Clin Microbiol Antimicrob 3:12. Hiramatsu, K. 2001. Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus: a new model of antibiotic resistance. Lancet Infect Dis 1:147-55. Hiramatsu, K. 1998. Vancomycin resistance in staphylococci. Drug Resist Updat 1:135-50. Hiramatsu, K., H. Hanaki, T. Ino, K. Yabuta, T. Oguri, and F. C. Tenover. 1997. Methicillinresistant Staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility. J Antimicrob Chemother 40:135-6. Horinouchi, S., W. H. Byeon, and B. Weisblum. 1983. A complex attenuator regulates inducible resistance to macrolides, lincosamides, and streptogramin type B antibiotics in Streptococcus sanguis. J Bacteriol 154:1252-62.

54

REFERENCE

63.

64.

65.

66. 67. 68. 69.

70. 71.

72. 73. 74.

75.

76.

77.

78.

79.

80. 81.

82. 83.

84.

Horinouchi, S., and B. Weisblum. 1982. Nucleotide sequence and functional map of pE194, a plasmid that specifies inducible resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin type B antibodies. J Bacteriol 150:804-14. Horinouchi, S., and B. Weisblum. 1980. Posttranscriptional modification of mRNA conformation: mechanism that regulates erythromycin-induced resistance. Proc Natl Acad Sci U S A 77:7079-83. Huang, J., P. W. O'Toole, W. Shen, H. Amrine-Madsen, X. Jiang, N. Lobo, L. M. Palmer, L. Voelker, F. Fan, M. N. Gwynn, and D. McDevitt. 2004. Novel chromosomally encoded multidrug efflux transporter MdeA in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 48:909-17. Chabbert, Y. 1956. Antagonisme in vitro entre l'erythromycine et la spiramycine. Ann Inst Pasteur (Paris) 90:787-90. Chabbert, Y. A., and P. Courvalin. 1971. [Synergism of antibiotic components of the streptogramin group]. Pathol Biol (Paris) 19:613-9. Chakraburtty, K. 2001. Translational regulation by ABC systems. Res Microbiol 152:391-9. Chesneau, O., H. Ligeret, N. Hosan-Aghaie, A. Morvan, and E. Dassa. 2005. Molecular analysis of resistance to streptogramin A compounds conferred by the Vga proteins of staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 49:973-80. Chesneau, O., K. Tsvetkova, and P. Courvalin. 2007. Resistance phenotypes conferred by macrolide phosphotransferases. FEMS Microbiol Lett 269:317-22. Ito, T., Y. Katayama, K. Asada, N. Mori, K. Tsutsumimoto, C. Tiensasitorn, and K. Hiramatsu. 2001. Structural comparison of three types of staphylococcal cassette chromosome mec integrated in the chromosome in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 45:1323-36. Janosi, L., and E. Ban. 1982. Presented at the 12th International Congress of Chemotherapy, Florence, Italy, 1981. Jenkins, G., M. Zalacain, and E. Cundliffe. 1989. Inducible ribosomal RNA methylation in Streptomyces lividans, conferring resistance to lincomycin. J Gen Microbiol 135:3281-8. Jenssen, W. D., S. Thakker-Varia, D. T. Dubin, and M. P. Weinstein. 1987. Prevalence of macrolides-lincosamides-streptogramin B resistance and erm gene classes among clinical strains of staphylococci and streptococci. Antimicrob Agents Chemother 31:883-8. John, M. A., C. Pletch, and Z. Hussain. 2002. In vitro activity of quinupristin/dalfopristin, linezolid, telithromycin and comparator antimicrobial agents against 13 species of coagulasenegative staphylococci. J Antimicrob Chemother 50:933-8. Kawachi, R., T. Akashi, Y. Kamitani, A. Sy, U. Wangchaisoonthorn, T. Nihira, and Y. Yamada. 2000. Identification of an AfsA homologue (BarX) from Streptomyces virginiae as a pleiotropic regulator controlling autoregulator biosynthesis, virginiamycin biosynthesis and virginiamycin M1 resistance. Mol Microbiol 36:302-13. Kehrenberg, C., K. K. Ojo, and S. Schwarz. 2004. Nucleotide sequence and organization of the multiresistance plasmid pSCFS1 from Staphylococcus sciuri. J Antimicrob Chemother 54:936-9. Kehrenberg, C., and S. Schwarz. 2006. Distribution of florfenicol resistance genes fexA and cfr among chloramphenicol-resistant Staphylococcus isolates. Antimicrob Agents Chemother 50:1156-63. Kehrenberg, C., S. Schwarz, L. Jacobsen, L. H. Hansen, and B. Vester. 2005. A new mechanism for chloramphenicol, florfenicol and clindamycin resistance: methylation of 23S ribosomal RNA at A2503. Mol Microbiol 57:1064-73. Kerr, I. D., E. D. Reynolds, and J. H. Cove. 2005. ABC proteins and antibiotic drug resistance: is it all about transport? Biochem Soc Trans 33:1000-2. Kim, S. D., L. C. McDonald, W. R. Jarvis, S. K. McAllister, R. Jerris, L. A. Carson, and J. M. Miller. 2000. Determining the significance of coagulase-negative staphylococci isolated from blood cultures at a community hospital: a role for species and strain identification. Infect Control Hosp Epidemiol 21:213-7. Kloos, W. E., and T. L. Bannerman. 1994. Update on clinical significance of coagulasenegative staphylococci. Clin Microbiol Rev 7:117-40. Kono, M., K. O'Hara, and T. Ebisu. 1992. Purification and characterization of macrolide 2'phosphotransferase type II from a strain of Escherichia coli highly resistant to macrolide antibiotics. FEMS Microbiol Lett 76:89-94. Krolewski, J. J., E. Murphy, R. P. Novick, and M. G. Rush. 1981. Site-specificity of the chromosomal insertion of Staphylococcus aureus transposon Tn554. J Mol Biol 152:19-33.

55

REFERENCE

85.

86. 87.

88.

89. 90. 91.

92.

93.

94. 95.

96.

97.

98.

99.

100.

101. 102.

103.

104.

105.

Kwak, J. H., E. C. Choi, and B. Weisblum. 1991. Transcriptional attenuation control of ermK, a macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinant from Bacillus licheniformis. J Bacteriol 173:4725-35. Lai, C. J., and B. Weisblum. 1971. Altered methylation of ribosomal RNA in an erythromycinresistant strain of Staphylococcus aureus. Proc Natl Acad Sci U S A 68:856-60. Lampson, B. C., and J. T. Parisi. 1986. Nucleotide sequence of the constitutive macrolidelincosamide-streptogramin B resistance plasmid pNE131 from Staphylococcus epidermidis and homologies with Staphylococcus aureus plasmids pE194 and pSN2. J Bacteriol 167:88892. Leclercq, R., C. Carlier, J. Duval, and P. Courvalin. 1985. Plasmid-mediated resistance to lincomycin by inactivation in Staphylococcus haemolyticus. Antimicrob Agents Chemother 28:421-4. Leclercq, R., and P. Courvalin. 1991. Bacterial resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin antibiotics by target modification. Antimicrob Agents Chemother 35:1267-72. Leeb, M. 2004. Antibiotics: a shot in the arm. Nature 431:892-3. Leelaporn, A., N. Firth, I. T. Paulsen, and R. A. Skurray. 1996. IS257-mediated cointegration in the evolution of a family of staphylococcal trimethoprim resistance plasmids. J Bacteriol 178:6070-3. Lim, J. A., A. R. Kwon, S. K. Kim, Y. Chong, K. Lee, and E. C. Choi. 2002. Prevalence of resistance to macrolide, lincosamide and streptogramin antibiotics in Gram-positive cocci isolated in a Korean hospital. J Antimicrob Chemother 49:489-95. Lina, G., A. Quaglia, M. E. Reverdy, R. Leclercq, F. Vandenesch, and J. Etienne. 1999. Distribution of genes encoding resistance to macrolides, lincosamides, and streptogramins among staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 43:1062-6. Livermore, D. 2004. Can better prescribing turn the tide of resistance? Nat Rev Microbiol 2:73-8. Lodder, G., S. Schwarz, P. Gregory, and K. Dyke. 1996. Tandem duplication in ermC translational attenuator of the macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance plasmid pSES6 from Staphylococcus equorum. Antimicrob Agents Chemother 40:215-7. Lodder, G., C. Werckenthin, S. Schwarz, and K. Dyke. 1997. Molecular analysis of naturally occuring ermC-encoding plasmids in staphylococci isolated from animals with and without previous contact with macrolide/lincosamide antibiotics. FEMS Immunol Med Microbiol 18:715. Long, K. S., J. Poehlsgaard, C. Kehrenberg, S. Schwarz, and B. Vester. 2006. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 50:2500-5. Luthje, P., and S. Schwarz. 2006. Antimicrobial resistance of coagulase-negative staphylococci from bovine subclinical mastitis with particular reference to macrolidelincosamide resistance phenotypes and genotypes. J Antimicrob Chemother 57:966-9. Luthje, P., M. von Kockritz-Blickwede, and S. Schwarz. 2007. Identification and characterization of nine novel types of small staphylococcal plasmids carrying the lincosamide nucleotidyltransferase gene lnu(A). J Antimicrob Chemother 59:600-6. Malbruny, B., A. Canu, B. Bozdogan, B. Fantin, V. Zarrouk, S. Dutka-Malen, C. Feger, and R. Leclercq. 2002. Resistance to quinupristin-dalfopristin due to mutation of L22 ribosomal protein in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 46:2200-7. Mangili, A., I. Bica, D. R. Snydman, and D. H. Hamer. 2005. Daptomycin-resistant, methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia. Clin Infect Dis 40:1058-60. Marshall, V. P., W. F. Liggett, and J. I. Cialdella. 1989. Enzymic inactivation of lincosaminide and macrolide antibiotics: divalent metal cation and coenzyme specificities. J Antibiot (Tokyo) 42:826-30. Martineau, F., F. J. Picard, N. Lansac, M. i. q. m. C, P. H. Roy, M. Ouellette, and M. G. Bergeron. 2000. Correlation between the resistance genotype determined by multiplex PCR assays and the antibiotic susceptibility patterns of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrob Agents Chemother 44:231-8. Marton, M. J., C. R. Vazquez de Aldana, H. Qiu, K. Chakraburtty, and A. G. Hinnebusch. 1997. Evidence that GCN1 and GCN20, translational regulators of GCN4, function on elongating ribosomes in activation of eIF2alpha kinase GCN2. Mol Cell Biol 17:4474-89. Marty, F. M., W. W. Yeh, C. B. Wennersten, L. Venkataraman, E. Albano, E. P. Alyea, H. S. Gold, L. R. Baden, and S. K. Pillai. 2006. Emergence of a clinical daptomycin-resistant

56

REFERENCE

106. 107.

108.

109.

110.

111.

112.

113.

114.

115.

116. 117.

118.

119. 120. 121. 122.

123.

124.

125.

Staphylococcus aureus isolate during treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia and osteomyelitis. J Clin Microbiol 44:595-7. Mason, D. J., and C. Lewis. 1964. Biological Activity of the Lincomycin-Related Antibiotics. Antimicrobial Agents Chemother (Bethesda) 10:7-12. Matsuoka, M., K. Endou, H. Kobayashi, M. Inoue, and Y. Nakajima. 1997. A dyadic plasmid that shows MLS and PMS resistance in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 148:91-6. Matsuoka, M., K. Endou, H. Kobayashi, M. Inoue, and Y. Nakajima. 1998. A plasmid that encodes three genes for resistance to macrolide antibiotics in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 167:221-7. Matsuoka, M., M. Inoue, Y. Endo, and Y. Nakajima. 2003. Characteristic expression of three genes, msr(A), mph(C) and erm(Y), that confer resistance to macrolide antibiotics on Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 220:287-93. Matsuoka, M., L. Janosi, K. Endou, and Y. Nakajima. 1999. Cloning and sequences of inducible and constitutive macrolide resistance genes in Staphylococcus aureus that correspond to an ABC transporter. FEMS Microbiol Lett 181:91-100. Matsuoka, M., L. Janosi, K. Endou, S. Saitoh, H. Hashimoto, and Y. Nakajima. 1993. An increase of 63 kDa-protein present in the cell membranes of Staphylococcus aureus that bears a plasmid mediating inducible resistance to partial macrolide and streptogramin B antibiotics. Biol Pharm Bull 16:1288-90. Mayford, M., and B. Weisblum. 1990. The ermC leader peptide: amino acid alterations leading to differential efficiency of induction by macrolide-lincosamide-streptogramin B antibiotics. J Bacteriol 172:3772-9. Melter, O. 2003. Průkaz molekulární charakterizace kmenů meticilin rezistentních Staphylococcus aureus a Bartonella henselae v České republice. Univerzita Karlova, 3.LF, Praha. Melter, O., M. Aires de Sousa, P. Urbaskova, V. Jakubu, H. Zemlickova, and H. de Lencastre. 2003. Update on the major clonal types of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the Czech Republic. J Clin Microbiol 41:4998-5005. Melter, O., I. Santos Sanches, J. Schindler, M. Aires de Sousa, R. Mato, V. Kovarova, H. Zemlickova, and H. de Lencastre. 1999. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clonal types in the Czech Republic. J Clin Microbiol 37:2798-803. Mendez, C., and J. A. Salas. 2001. The role of ABC transporters in antibiotic-producing organisms: drug secretion and resistance mechanisms. Res Microbiol 152:341-50. Minakhina, S., G. Kholodii, S. Mindlin, O. Yurieva, and V. Nikiforov. 1999. Tn5053 family transposons are res site hunters sensing plasmidal res sites occupied by cognate resolvases. Mol Microbiol 33:1059-68. Mukhtar, T. A., K. P. Koteva, D. W. Hughes, and G. D. Wright. 2001. Vgb from Staphylococcus aureus inactivates streptogramin B antibiotics by an elimination mechanism not hydrolysis. Biochemistry 40:8877-86. Mukhtar, T. A., and G. D. Wright. 2005. Streptogramins, oxazolidinones, and other inhibitors of bacterial protein synthesis. Chem Rev 105:529-42. Murphy, E. 1985. Nucleotide sequence of ermA, a macrolide-lincosamide-streptogramin B determinant in Staphylococcus aureus. J Bacteriol 162:633-40. NCCLS. 2004. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 14th informational supplement. M100-S14. NCCLS, Wayne, PA. Noguchi, N., Y. Tamura, J. Katayama, and K. Narui. 1998. Expression of the mphB gene for macrolide 2'-phosphotransferase II from Escherichia coli in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 159:337-42. Novotna, G., V. Adamkova, J. Janata, O. Melter, and J. Spizek. 2005. Prevalence of resistance mechanisms against macrolides and lincosamides in methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci in the Czech Republic and occurrence of an undefined mechanism of resistance to lincosamides. Antimicrob Agents Chemother 49:3586-9. Novotna, G., and J. Janata. 2006. A new evolutionary variant of the streptogramin A resistance protein, Vga(A)LC, from Staphylococcus haemolyticus with shifted substrate specificity towards lincosamides. Antimicrob Agents Chemother 50:4070-6. Novotna, G., J. Spizek, and J. Janata. 2007. In Vitro Activity of Telithromycin and Quinupristin/dalfopristin against Methicillin-Resistant Coagulase-Negative Staphylococci with Defined Resistance Genotypes. Folia Microbiol (Praha) Accepted.

57

REFERENCE

126.

127.

128.

129.

130. 131. 132.

133. 134. 135.

136.

137. 138.

139. 140.

141.

142. 143.

144. 145. 146.

147.

Ohki, R., K. Tateno, T. Takizawa, T. Aiso, and M. Murata. 2005. Transcriptional termination control of a novel ABC transporter gene involved in antibiotic resistance in Bacillus subtilis. J Bacteriol 187:5946-54. Ojo, K. K., M. J. Striplin, C. C. Ulep, N. S. Close, J. Zittle, H. Luis, M. Bernardo, J. Leitao, and M. C. Roberts. 2006. Staphylococcus efflux msr(A) gene characterized in Streptococcus, Enterococcus, Corynebacterium, and Pseudomonas isolates. Antimicrob Agents Chemother 50:1089-91. Olano, C., A. M. Rodriguez, C. Mendez, and J. A. Salas. 1995. A second ABC transporter is involved in oleandomycin resistance and its secretion by Streptomyces antibioticus. Mol Microbiol 16:333-43. Oliveira, S. S., E. Murphy, M. R. Gamon, and M. C. Bastos. 1993. pRJ5: a naturally occurring Staphylococcus aureus plasmid expressing constitutive macrolide-lincosamidestreptogramin B resistance contains a tandem duplication in the leader region of the ermC gene. J Gen Microbiol 139:1461-7. Ounissi, H., and P. Courvalin. 1985. Nucleotide sequence of the gene ereA encoding the erythromycin esterase in Escherichia coli. Gene 35:271-8. Paulsen, I. T., M. H. Brown, and R. A. Skurray. 1998. Characterization of the earliest known Staphylococcus aureus plasmid encoding a multidrug efflux system. J Bacteriol 180:3477-9. Paulsen, I. T., M. T. Gillespie, T. G. Littlejohn, O. Hanvivatvong, S. J. Rowland, K. G. Dyke, and R. A. Skurray. 1994. Characterisation of sin, a potential recombinase-encoding gene from Staphylococcus aureus. Gene 141:109-14. Peeters, M. J., and J. C. Sarria. 2005. Clinical characteristics of linezolid-resistant Staphylococcus aureus infections. Am J Med Sci 330:102-4. Pechere, J. C. 1996. Streptogramins. A unique class of antibiotics. Drugs 51 Suppl 1:13-9. Peschke, U., H. Schmidt, H. Z. Zhang, and W. Piepersberg. 1995. Molecular characterization of the lincomycin-production gene cluster of Streptomyces lincolnensis 78-11. Mol Microbiol 16:1137-56. Petinaki, E., I. Spiliopoulou, M. Maniati, and A. N. Maniatis. 2005. Emergence of Staphylococcus hominis strains expressing low-level resistance to quinupristin/dalfopristin in Greece. J Antimicrob Chemother 55:811-2. Pfaller, M. A., and L. A. Herwaldt. 1988. Laboratory, clinical, and epidemiological aspects of coagulase-negative staphylococci. Clin Microbiol Rev 1:281-99. Potoski, B. A., J. Adams, L. Clarke, K. Shutt, P. K. Linden, C. Baxter, A. W. Pasculle, B. Capitano, A. Y. Peleg, D. Szabo, and D. L. Paterson. 2006. Epidemiological profile of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci. Clin Infect Dis 43:165-71. Projan, S. J. 2003. Why is big Pharma getting out of antibacterial drug discovery? Curr Opin Microbiol 6:427-30. Prunier, A. L., B. Malbruny, D. Tande, B. Picard, and R. Leclercq. 2002. Clinical isolates of Staphylococcus aureus with ribosomal mutations conferring resistance to macrolides. Antimicrob Agents Chemother 46:3054-6. Putman, M., H. W. van Veen, J. E. Degener, and W. N. Konings. 2001. The lactococcal secondary multidrug transporter LmrP confers resistance to lincosamides, macrolides, streptogramins and tetracyclines. Microbiology 147:2873-80. Putman, M., H. W. van Veen, and W. N. Konings. 2000. Molecular properties of bacterial multidrug transporters. Microbiol Mol Biol Rev 64:672-93. Rende-Fournier, R., R. Leclercq, M. Galimand, J. Duval, and P. Courvalin. 1993. Identification of the satA gene encoding a streptogramin A acetyltransferase in Enterococcus faecium BM4145. Antimicrob Agents Chemother 37:2119-25. Reynolds, E., J. I. Ross, and J. H. Cove. 2003. Msr(A) and related macrolide/streptogramin resistance determinants: incomplete transporters? Int J Antimicrob Agents 22:228-36. Reynolds, E. D., and J. H. Cove. 2005. Resistance to telithromycin is conferred by msr(A), msrC and msr(D) in Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother 56:1179-80. Rice, L. B., L. L. Carias, S. H. Marshall, and M. E. Bonafede. 1996. Sequences found on staphylococcal beta-lactamase plasmids integrated into the chromosome of Enterococcus faecalis CH116. Plasmid 35:81-90. Roberts, M. C., J. Sutcliffe, P. Courvalin, L. B. Jensen, J. Rood, and H. Seppala. 1999. Nomenclature for macrolide and macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinants. Antimicrob Agents Chemother 43:2823-30.

58

REFERENCE

148.

149.

150.

151.

152.

153. 154. 155.

156.

157.

158.

159. 160.

161.

162.

163.

164.

165.

166.

167.

Ross, J. I., E. A. Eady, J. H. Cove, and S. Baumberg. 1995. Identification of a chromosomally encoded ABC-transport system with which the staphylococcal erythromycin exporter MsrA may interact. Gene 153:93-8. Ross, J. I., E. A. Eady, J. H. Cove, and S. Baumberg. 1996. Minimal functional system required for expression of erythromycin resistance by msrA in Staphylococcus aureus RN4220. Gene 183:143-8. Ross, J. I., E. A. Eady, J. H. Cove, W. J. Cunliffe, S. Baumberg, and J. C. Wootton. 1990. Inducible erythromycin resistance in staphylococci is encoded by a member of the ATPbinding transport super-gene family. Mol Microbiol 4:1207-14. Ross, J. I., A. M. Farrell, E. A. Eady, J. H. Cove, and W. J. Cunliffe. 1989. Characterisation and molecular cloning of the novel macrolide-streptogramin B resistance determinant from Staphylococcus epidermidis. J Antimicrob Chemother 24:851-62. Rosteck, P. R., Jr., P. A. Reynolds, and C. L. Hershberger. 1991. Homology between proteins controlling Streptomyces fradiae tylosin resistance and ATP-binding transport. Gene 102:27-32. Rowland, S. J., M. R. Boocock, and W. M. Stark. 2005. Regulation of Sin recombinase by accessory proteins. Mol Microbiol 56:371-82. Rowland, S. J., and K. G. Dyke. 1989. Characterization of the staphylococcal beta-lactamase transposon Tn552. Embo J 8:2761-73. Rowland, S. J., W. M. Stark, and M. R. Boocock. 2002. Sin recombinase from Staphylococcus aureus: synaptic complex architecture and transposon targeting. Mol Microbiol 44:607-19. Sader, H. S., J. M. Streit, T. R. Fritsche, and R. N. Jones. 2006. Antimicrobial susceptibility of gram-positive bacteria isolated from European medical centres: results of the Daptomycin Surveillance Programme (2002-2004). Clin Microbiol Infect 12:844-52. Sader, H. S., A. A. Watters, T. R. Fritsche, and R. N. Jones. 2007. Daptomycin antimicrobial activity tested against methicillin-resistant staphylococci and vancomycinresistant enterococci isolated in European medical centers (2005). BMC Infect Dis 7:29. Sandler, P., and B. Weisblum. 1989. Erythromycin-induced ribosome stall in the ermA leader: a barricade to 5'-to-3' nucleolytic cleavage of the ermA transcript. J Bacteriol 171:6680-8. Sarkis, G. J., L. L. Murley, A. E. Leschziner, M. R. Boocock, W. M. Stark, and N. D. Grindley. 2001. A model for the gamma delta resolvase synaptic complex. Mol Cell 8:623-31. Shaw, J. H., and D. B. Clewell. 1985. Complete nucleotide sequence of macrolidelincosamide-streptogramin B-resistance transposon Tn917 in Streptococcus faecalis. J Bacteriol 164:782-96. Shortridge, V. D., R. K. Flamm, N. Ramer, J. Beyer, and S. K. Tanaka. 1996. Novel mechanism of macrolide resistance in Streptococcus pneumoniae. Diagn Microbiol Infect Dis 26:73-8. Schlunzen, F., R. Zarivach, J. Harms, A. Bashan, A. Tocilj, R. Albrecht, A. Yonath, and F. Franceschi. 2001. Structural basis for the interaction of antibiotics with the peptidyl transferase centre in eubacteria. Nature 413:814-21. Schmitz, F. J., J. Petridou, N. Astfalk, K. Kohrer, S. Scheuring, and S. Schwarz. 2002. Molecular analysis of constitutively expressed erm(C) genes selected in vitro by incubation in the presence of the noninducers quinupristin, telithromycin, or ABT-773. Microb Drug Resist 8:171-7. Schmitz, F. J., J. Petridou, N. Astfalk, S. Scheuring, K. Kohrer, J. Verhoef, A. C. Fluit, and S. Schwarz. 2001. Structural alterations in the translational attenuator of constitutively expressed erm(A) genes in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 45:1603-4. Schnellmann, C., V. Gerber, A. Rossano, V. Jaquier, Y. Panchaud, M. G. Doherr, A. Thomann, R. Straub, and V. Perreten. 2006. Presence of new mecA and mph(C) variants conferring antibiotic resistance in Staphylococcus spp. isolated from the skin of horses before and after clinic admission. J Clin Microbiol 44:4444-54. Schoner, B., M. Geistlich, P. Rosteck, Jr., R. N. Rao, E. Seno, P. Reynolds, K. Cox, S. Burgett, and C. Hershberger. 1992. Sequence similarity between macrolide-resistance determinants and ATP-binding transport proteins. Gene 115:93-6. Schreckenberger, P. C., E. Ilendo, and K. L. Ristow. 2004. Incidence of constitutive and inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci in a community and a tertiary care hospital. J Clin Microbiol 42:2777-9.

59

REFERENCE

168.

169.

170.

171.

172.

173.

174.

175. 176.

177. 178.

179.

180. 181.

182.

183. 184. 185.

186.

187.

Schulin, T., and A. Voss. 2001. Coagulase-negative staphylococci as a cause of infections related to intravascular prosthetic devices: limitations of present therapy. Clin Microbiol Infect 7 Suppl 4:1-7. Schwarz, S., C. Kehrenberg, and K. K. Ojo. 2002. Staphylococcus sciuri gene erm(33), encoding inducible resistance to macrolides, lincosamides, and streptogramin B antibiotics, is a product of recombination between erm(C) and erm(A). Antimicrob Agents Chemother 46:3621-3. Schwarz, S., C. Werckenthin, and C. Kehrenberg. 2000. Identification of a plasmid-borne chloramphenicol-florfenicol resistance gene in Staphylococcus sciuri. Antimicrob Agents Chemother 44:2530-3. Sidhu, M. S., E. Heir, T. Leegaard, K. Wiger, and A. Holck. 2002. Frequency of disinfectant resistance genes and genetic linkage with beta-lactamase transposon Tn552 among clinical staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 46:2797-803. Singh, K. V., K. Malathum, and B. E. Murray. 2001. Disruption of an Enterococcus faecium species-specific gene, a homologue of acquired macrolide resistance genes of staphylococci, is associated with an increase in macrolide susceptibility. Antimicrob Agents Chemother 45:263-6. Singh, K. V., G. M. Weinstock, and B. E. Murray. 2002. An Enterococcus faecalis ABC homologue (Lsa) is required for the resistance of this species to clindamycin and quinupristindalfopristin. Antimicrob Agents Chemother 46:1845-50. Skinner, R., E. Cundliffe, and F. J. Schmidt. 1983. Site of action of a ribosomal RNA methylase responsible for resistance to erythromycin and other antibiotics. J Biol Chem 258:12702-6. Srinivasan, A., J. D. Dick, and T. M. Perl. 2002. Vancomycin resistance in staphylococci. Clin Microbiol Rev 15:430-8. Swaney, S. M., H. Aoki, M. C. Ganoza, and D. L. Shinabarger. 1998. The oxazolidinone linezolid inhibits initiation of protein synthesis in bacteria. Antimicrob Agents Chemother 42:3251-5. Štika, L. 2001. Spotřeba antimikrobiálních léčiv a její vliv na rezistenci mikroorganismů. Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 3:66-71. Tait-Kamradt, A., T. Davies, M. Cronan, M. R. Jacobs, P. C. Appelbaum, and J. Sutcliffe. 2000. Mutations in 23S rRNA and ribosomal protein L4 account for resistance in pneumococcal strains selected in vitro by macrolide passage. Antimicrob Agents Chemother 44:2118-25. Takeuchi, F., S. Watanabe, T. Baba, H. Yuzawa, T. Ito, Y. Morimoto, M. Kuroda, L. Cui, M. Takahashi, A. Ankai, S. Baba, S. Fukui, J. C. Lee, and K. Hiramatsu. 2005. Whole-genome sequencing of staphylococcus haemolyticus uncovers the extreme plasticity of its genome and the evolution of human-colonizing staphylococcal species. J Bacteriol 187:7292-308. Tan, T. Y., S. Y. Ng, and W. X. Ng. 2006. Clinical significance of coagulase-negative staphylococci recovered from nonsterile sites. J Clin Microbiol 44:3413-4. Tenover, F. C., R. D. Arbeit, R. V. Goering, P. A. Mickelsen, B. E. Murray, D. H. Persing, and B. Swaminathan. 1995. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 33:2233-9. Tenson, T., M. Lovmar, and M. Ehrenberg. 2003. The mechanism of action of macrolides, lincosamides and streptogramin B reveals the nascent peptide exit path in the ribosome. J Mol Biol 330:1005-14. Tenson, T., and A. S. Mankin. 2001. Short peptides conferring resistance to macrolide antibiotics. Peptides 22:1661-8. Tenson, T., L. Xiong, P. Kloss, and A. S. Mankin. 1997. Erythromycin resistance peptides selected from random peptide libraries. J Biol Chem 272:17425-30. Thakker-Varia, S., W. D. Jenssen, L. Moon-McDermott, M. P. Weinstein, and D. T. Dubin. 1987. Molecular epidemiology of macrolides-lincosamides-streptogramin B resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 31:735-43. Tillotson, L. E., W. D. Jenssen, L. Moon-McDermott, and D. T. Dubin. 1989. Characterization of a novel insertion of the macrolides-lincosamides-streptogramin B resistance transposon Tn554 in methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrob Agents Chemother 33:541-50. Townsend, D. E., S. Bolton, N. Ashdown, D. I. Annear, and W. B. Grubb. 1986. Conjugative, staphylococcal plasmids carrying hitch-hiking transposons similar to Tn554: intra-

60

REFERENCE

188. 189. 190.

191. 192.

193.

194.

195.

196. 197. 198. 199.

200. 201.

202.

203. 204.

205.

and interspecies dissemination of erythromycin resistance. Aust J Exp Biol Med Sci 64 ( Pt 4):367-79. Vannuffel, P., and C. Cocito. 1996. Mechanism of action of streptogramins and macrolides. Drugs 51 Suppl 1:20-30. von Eiff, C., G. Peters, and C. Heilmann. 2002. Pathogenesis of infections due to coagulase-negative staphylococci. Lancet Infect Dis 2:677-85. Walker, J. E., M. Saraste, M. J. Runswick, and N. J. Gay. 1982. Distantly related sequences in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold. Embo J 1:945-51. Walsh, C. 2003. Where will new antibiotics come from? Nat Rev Microbiol 1:65-70. Wang, J., N. B. Shoemaker, G. R. Wang, and A. A. Salyers. 2000. Characterization of a Bacteroides mobilizable transposon, NBU2, which carries a functional lincomycin resistance gene. J Bacteriol 182:3559-71. Watanabe, S., T. Ito, Y. Morimoto, F. Takeuchi, and K. Hiramatsu. 2007. Precise excision and self-integration of a composite transposon as a model for spontaneous large-scale chromosome inversion/deletion of the Staphylococcus haemolyticus clinical strain JCSC1435. J Bacteriol 189:2921-5. Weigel, L. M., D. B. Clewell, S. R. Gill, N. C. Clark, L. K. McDougal, S. E. Flannagan, J. F. Kolonay, J. Shetty, G. E. Killgore, and F. C. Tenover. 2003. Genetic analysis of a high-level vancomycin-resistant isolate of Staphylococcus aureus. Science 302:1569-71. Weinstein, M. P., M. L. Towns, S. M. Quartey, S. Mirrett, L. G. Reimer, G. Parmigiani, and L. B. Reller. 1997. The clinical significance of positive blood cultures in the 1990s: a prospective comprehensive evaluation of the microbiology, epidemiology, and outcome of bacteremia and fungemia in adults. Clin Infect Dis 24:584-602. Weisblum, B. 1995. Erythromycin resistance by ribosome modification. Antimicrob Agents Chemother 39:577-85. Weisblum, B. 1995. Insights into erythromycin action from studies of its activity as inducer of resistance. Antimicrob Agents Chemother 39:797-805. Weisblum, B. 1998. Macrolide resistance. Drug Resist Updat 1:29-41. Werckenthin, C., M. Cardoso, J. L. Martel, and S. Schwarz. 2001. Antimicrobial resistance in staphylococci from animals with particular reference to bovine Staphylococcus aureus, porcine Staphylococcus hyicus, and canine Staphylococcus intermedius. Vet Res 32:341-62. Werckenthin, C., S. Schwarz, and H. Westh. 1999. Structural alterations in the translational attenuator of constitutively expressed ermC genes. Antimicrob Agents Chemother 43:1681-5. Westh, H., D. M. Hougaard, J. Vuust, and V. T. Rosdahl. 1995. Prevalence of erm gene classes in erythromycin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated between 1959 and 1988. Antimicrob Agents Chemother 39:369-73. Wondrack, L., M. Massa, B. V. Yang, and J. Sutcliffe. 1996. Clinical strain of Staphylococcus aureus inactivates and causes efflux of macrolides. Antimicrob Agents Chemother 40:992-8. Wootton, J. C., and M. H. Drummond. 1989. The Q-linker: a class of interdomain sequences found in bacterial multidomain regulatory proteins. Protein Eng 2:535-43. Zarrouk, V., B. Bozdogan, R. Leclercq, L. Garry, C. Carbon, and B. Fantin. 2000. Influence of resistance to streptogramin A type antibiotics on the activity of quinupristindalfopristin in vitro and in experimental endocarditis due to Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 44:1168-73. Zhang, H. Z., H. Schmidt, and W. Piepersberg. 1992. Molecular cloning and characterization of two lincomycin-resistance genes, lmrA and lmrB, from Streptomyces lincolnensis 78-11. Mol Microbiol 6:2147-57.

61

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra genetiky a mikrobiologie DIZERTAČNÍ PRÁCE

Recommend Documents