UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ. Katedra biologických a lékařských věd. Bc. Kristýna Krasulová

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biologických a lékařských věd

Bc. Kristýna Krasulová VÝZNAM CYTOCHROMU P450 2W1 U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Diplomová práce

Školitel: doc. RNDr. Vladimír Semecký, CSc. Specialista: RNDr. Jana Nekvindová Ph.D.

Hradec Králové 2013

„Prohlašuji, že tato diplomová práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji. Práce nebyla využita pro získání jiného kvalifikačního titulu.

datum

podpis 2

Děkuji Doc. RNDr. Vladimíru Semeckému, CSc. a RNDr. Janě Nekvindové, Ph.D. za odbornou pomoc a ochotu při řešení mé diplomové práce.

3

OBSAH 1. ABSTRAKT ........................................................................................................................................... 5 2. ABSTRACT ............................................................................................................................................ 6 3. ÚVOD...................................................................................................................................................... 7 4. ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE – CÍL PRÁCE ............................................................................... 9 5. TEORETICKÁ ČÁST ......................................................................................................................... 11 5.1. KOLOREKTÁLNÍ KARCINOM ............................................................................................................. 12 5.2. EPIDEMIOLOGIE – SVĚT ................................................................................................................... 13 5.3. EPIDEMIOLOGIE – ČESKÁ REPUBLIKA ....................................................................................... 13 HISTOPATOLOGIE KRK ......................................................................................................................... 14 5.4. KLINICKÉ PŘÍZNAKY ........................................................................................................................ 17 5.5. RIZIKOVÉ FAKTORY ......................................................................................................................... 18 5.6. BIOLOGIE KOLOREKTÁLNÍHO NÁDORU ............................................................................................ 19 5.6.1 Molekulární genetika hereditární formy KRK ......................................................................... 19 5.6.1.1 FAMILIÁRNÍ ADENOMATÓZNÍ POLYPÓZA- FAP .................................................................. 20 5.6.1.2 LYNCHŮV SYNDROM ................................................................................................................. 20

5.6.2 Molekulární genetika sporadické formy KRK ......................................................................... 20 5.6.2.1 Nestabilita mikrosatelitů................................................................................................................... 21 5.6.2.2 Chromosomální nestabilita ............................................................................................................... 22 5.6.2.3 CIMP (CpG island methylator phenotype) ....................................................................................... 24

5.6.3 Signální dráhy spojené s KRK ................................................................................................. 25 5.6.3.1 WNT/APC/CTNNB1signální dráha ................................................................................................. 26 5.6.3.2 TGFβ (transformující růstový faktor beta) signální dráha ................................................................ 26 5.6.3.3 Signální dráha epidermálního růstového faktoru (EGFR) ................................................................ 27

5.7. DIAGNOSTIKA .................................................................................................................................. 29 5.7.1 Screening kolorektálního karcinomu ....................................................................................... 29 5.7.2 Laboratorní diagnostika .......................................................................................................... 30 5.7.3 Genetická diagnostika ............................................................................................................. 31 5.7.4 Radiodiagnostika ..................................................................................................................... 32 5.7.5 Endoskopie .............................................................................................................................. 32 5.7.6 Endosonografie rekta .............................................................................................................. 33 5.8. LÉČBA ............................................................................................................................................. 33 5.8.1 Chirurgická léčba .................................................................................................................... 33 5.8.2 Chemoterapie .......................................................................................................................... 33 5.8.3 Radioterapie ............................................................................................................................ 34 5.8.4 Cílená terapie .......................................................................................................................... 34 5.8.4.1 Přehled nových léků ve fázi klinického vývoje ................................................................................ 37

5.9. CYTOCHROM P450 .......................................................................................................................... 39 5.9.1 Cytochrom P450 a jeho role v karcinogenezi.......................................................................... 40 5.9.2 Využití CYP v protirakovinné terapii....................................................................................... 42 5.9.3 Cytochrom P450 2W1.............................................................................................................. 43 6. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................................... 49 6.1. PARAMETRY STUDIE ........................................................................................................................ 50 6.1.1 Výběr pacientů a kontrolní skupiny ......................................................................................... 50 6.2. PŘÍPRAVA VZORKŮ .......................................................................................................................... 50 6.3. ALELICKÁ DISKRIMINACE ................................................................................................................ 51 6.3.1 Princip metody ........................................................................................................................ 51 6.3.2 Pracovní postup ....................................................................................................................... 52 6.4. VÝSLEDKY ...................................................................................................................................... 54 7. DISKUSE .............................................................................................................................................. 61 8. ZÁVĚR ................................................................................................................................................. 66 9. SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK ................................................................................................ 68 10. LITERATURA ................................................................................................................................... 70

4

1.ABSTRAKT Bc. Kristýna Krasulová Význam cytochromu P450 2W1 u kolorektálního karcinomu Diplomová práce Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Zdravotnická bioanalytika – Odborný pracovník v laboratorních metodách Cíl práce: Cytochromy P450 hrají důleţitou roli nejen v karcinogenezi aktivací prokarcinogenů, ale také v léčbě rakoviny, kde se mohou účastnit metabolismu protinádorových léčiv. V práci jsou rešeršně zpracovány současné poznatky o karcinogenezi kolorektálního karcinomu a poznatky o novém členu CYP P450 2W1 a jeho potenciálu v léčbě tohoto onemocnění. Hlavním cílem práce bylo analyzovat výskyt dvou nejvýznamnějších nesynonymních polymorfismů CYP2W1 u pacientů s kolorektálním karcinomem a u zdravých jedinců. Metody: Studovaná skupina se skládala ze 197 pacientů s kolorektálním karcinomem a 202 zdravých subjektů. Vzorky byly získány na základě spolupráce s Masarykovým onkologickým ústavem v Brně. Identifikace CYP2W1 alelických variant byla provedena metodou alelické diskriminace s pouţitím sond TaqMan® SNP Genotyping assay. Výsledky: Nesynonymní polymorfismus 541G/A (alela CYP2W1*2, rs3735684) způsobující aminokyselinovou substituci Ala181Thr a polymorfismus 1463C/T (alela CYP2W1*6, rs3808348) odpovědný za substituci Pro488Leu jsou v naší populaci oba zastoupeny. Minoritní alela 541A se ve vyšetřovaném souboru vyskytovala u 7 % (MAF: A=0,074) jedinců, bez rozdílů mezi pacienty s kolorektálním karcinomem a zdravými kontrolami. Minoritní alela druhého polymorfismu, 1463T, se vyskytovala u přibliţně 20 % (MAF: T=0,195) zkoumaných subjektů, častěji byla přítomna u zdravých jedinců, ale tento rozdíl nebyl statisticky významný. Závěry: Frekvence obou alel v naší populaci se liší od dosud publikovaných studií a jejich populací, jejich výskyt je geograficky rozdílný. Nenašli jsme významnou souvislost mezi kolorektálním karcinomem a výskytem polymorfismů. Ačkoli tato data nepodporují význam CYP2W1 jako prognostického markeru, celkově je tento nádorově specifický enzym velmi perspektivním kandidátem pro cílenou terapii.

5

2.ABSTRACT Bc. Kristýna Krasulová The importance of cytochrome P450 2W1 in colorectal cancer Diploma thesis Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Healthcare Bioanalytics - Specialist in Laboratory Methods

Backround: Cytochromes P450 play an important role in carcinogenesis by activating carcinogens as well as in cancer treatment where they can participate in metabolism of anticancer drugs. This work discuses current knowledge about colorectal cancer carcinogenesis and knowledge about the new member of CYP P450 2W1 and its potential in anticancer therapy. The main aim is to detect differences in the frequency of the two most important non-synonymous CYP2W1 polymorphisms between colorectal cancer patients and healthy subjects. Methods: The study group consisted of 197 colorectal patients and 202 healthy subjects gained on the basis of collaboration with Masaryk Memorial Cancer Institute. The identification of CYP2W1 allelic variations was performed by allelic discrimination using TaqMan® SNP Genotyping assays. Results: The non-synonymous polymorphism 542G/A (allele CYP2W1*6, rs3808348) responsible for the amino acid substitution Ala181Thr and polymorphism 1463C/T (allele CYP2W1*6, rs3808348) causing the amino acid substitution Pro488Leu were both present in the population studied. The 541A allele was present in 7 % (MAF: A=0,074) of the investigated individuals without any differences between colorectal patients and healthy controls. The 1463T allele was present in 20 % (MAF: T=0,195) of the studied group and it was also more common in healthy subjects, but without any statistical significance. Conclusions: The frequency of both alleles in our population is slightly different to what has been published. We have not found any correlation between SNP occurrence and colorectal cancer incidence. Although these data do not support the prognostic utility of CYP2W1, it is still a highly promising candidate for targeted therapy of colon cancer.

6

3. ÚVOD

7

Zhoubné novotvary zaujímají ve vyspělých zemích jednu z hlavních příčin úmrtí. Česká Republika není výjimkou a na rakovinu zde umírá kaţdý čtvrtý člověk (NOR 2009). Kolorektální karcinom zaujímá svou incidencí přední místo ve zhoubných novotvarech. Celosvětově je kaţdým rokem diagnostikováno přes 1 milion nových pacientů a my patříme dokonce na první příčku incidence v Evropě (Cunningham, Atkin et al. 2010) (Dušek 2005). Jelikoţ se jedná o časté onemocnění, je zde velká potřeba sníţit tato čísla pomocí prevence, screeningu a vývoje nových terapeutických postupů. Porozuměním genetickým změnám v nádorech se vědci snaţí odhalit podstatu karcinogeneze a zlepšit prevenci, diagnostiku a terapii rakoviny. Pro budoucnost se počítá s identifikací nových nádorových markerů a novými léčebnými postupy v oblasti chemoterapie i tzv. cílené terapie. Cytochromy P450 jsou hlavní enzymy metabolismu xenobiotik a mnoha endogenních substrátů. Významnou roli hrají i u metabolismu protinádorových léčiv. Díky jejich variabilitě můţe docházet k významným lékovým interakcím ovlivňujícím výsledek léčby (Gervasini, de Murillo et al. 2010). Mohou se také podílet přímo na procesu karcinogeneze (Nebert and Dalton 2006). Vedle této negativní role jim však jejich výskyt v nádorové tkáni a schopnost aktivovat některá xenobiotika v cytotoxicky působící látky dává potenciál pro cílenou terapii (Hanzawa, Sasaki et al. 2008). Nově objeveným členem rodiny P450 je CYP2W1. Tento enzym není za normálních okolností exprimován v dospělých lidských tkáních, jeho exprese byla téměř výlučně popsána v nádorové tkáni kolorekta, díky čemuţ je uvaţován jako potenciální cíl v protirakovinné terapii kolorektálního karcinomu (Karlgren, Gomez et al. 2006). Účastní se biotransformace několika karcinogenů a má schopnost aktivovat prodrug v cytotoxický metabolit (Wu, Sohl et al. 2006). Jeho zvýšená exprese byla popsána u pacientů s horší prognózou a jeho exprese by tak mohla být také pouţita jako prognostický marker (Edler, Stenstedt et al. 2009). V mnoha hlediscích se zdá být CYP2W1 slibnou molekulou pro léčbu kolorektálního karcinomu. Stejně jako u některých dalších CYP je pro CYP2W1 typická genetická variabilita a dosud byla identifikována řada genových polymorfismů. Existuje zde hypotéza, ţe některé z nich by mohly znamenat vyšší riziko vzniku kolorektálního karcinomu (Gervasini, de Murillo et al. 2010). Tato diplomová práce se zabývá stanovením frekvence významných nesynonymních polymorfismů v naší populaci u pacientů s kolorektálním karcinomem a zdravých kontrol. 8

.

4. ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE – CÍL PRÁCE

9

Práce se zabývá problematikou kolorektálního karcinomu se zaměřením na pokroky v léčbě se specializací na cytochrom P450 2W1. Cílem je zmapovat výskyt dvou nejvýznamnějších nesynonymních CYP2W1 polymorfismů v naší populaci a porovnat jejich rozloţení mezi pacienty s kolorektálním karcinomem a zdravými jedinci. Cíle práce lze rozdělit do několika dílčích úkolů. 

Zpracovat rešeršně současné poznatky z oblasti kolorektální karcinogeneze se zaměřením na biologii nádoru, moderní diagnostiku a léčbu.



Zpracovat dostupné vědecké poznatky o cytochromu P450 2W1 a jeho vyuţití v léčbě kolorektálního karcinomu.



Stanovit pomocí metod molekulární biologie frekvenci významných nesynonymních polymorfismů genu CYP2W1 v naší populaci. Porovnat výskyt u pacientů s kolorektálním karcinomem a zdravých kontrol.



Získaná data porovnat s výsledky dosud uveřejněných studií.

10

5. TEORETICKÁ ČÁST

11

5.1. KOLOREKTÁLNÍ KARCINOM Kolorektální karcinom je jedna z nejčastějších malignit v západních zemích. Za poslední dvě dekády stoupla incidence téměř o 200 %, můţeme jej také označit za jedno z civilizačních onemocnění, a proto je kolorektální karcinom a jeho léčba jedním z témat současného výzkumu. Hlavním cílem je zmapovat krok po kroku vznik malignity a tyto poznatky zuţitkovat ve vývoji nových diagnostických a terapeutických postupů. Kolorektální karcinom je zhoubný novotvar vznikající maligní transformací cylindrického epitelu tlustého střeva a rekta (Adam 2002).

Obr. 1. Tlusté střevo (Dušek 2013) Jedná se o úsek dlouhý 1,3 – 1,7 m s průměrem od 4 do 7,5 cm. První část se nazývá cékum (intestinum caecum) neboli slepé střevo, jehoţ součástí je i červovitý výběţek (appendix vermiformis). Po céku následuje hlavní část tlustého střeva tračník (colon). Od slepého střeva směrem vzhůru stoupá tračník vzestupný (colon ascendens). Napříč zprava doleva prochází tračník příčný (colon transversum) a od něj klesá tračník sestupný (colon descendens), který je napojen na esovitou kličku (colon sigmoideum) propojující tračník s posledním úsekem - konečníkem (rectum) vyúsťujícím řitním otvorem (anus) (Čihák 2002).

12

5.2. EPIDEMIOLOGIE – SVĚT V současné době je onkologické onemocnění hlavní příčinou úmrtí člověka ve vyspělých zemích. V rozvojových zemích se umístilo na druhém místě a čísla stále rostou ruku v ruce s převzetím ţivotního stylu západní civilizace zahrnující kouření, nedostatek pohybu a nezdravou stravu (Jemal, Bray et al. 2011). Významný podíl pak tvoří zhoubné novotvary kolorekta (Obr. 2).

Obr. 2. Incidence zhoubných novotvarů ve světě dle údajů z roku 2008 (Ferlay J 2010).

Podle údajů mezinárodní agentury pro výzkum rakoviny GLOBOCAN z roku 2008 zaujímá incidence kolorektální rakoviny (KRK) u muţů 3. místo s celkově 663 000 případy (10 % ze všech zhoubných novotvarů). Úmrtností se řadí na 4. místo hned po rakovině plic, jater a ţaludku. U ţen je incidence jen lehce niţší, s celkově 571 000 případy zaujímá 3. místo (9,4 % ze všech ZN) a 4. místo v počtu úmrtí (po karcinomu prsu, cervixu a plic) (Ferlay J 2010).

5.3. EPIDEMIOLOGIE – ČESKÁ REPUBLIKA Stejně jako ve světě, tak i v České Republice vykazuje výskyt KRK stoupající tendenci. Dle údajů Národního onkologického registru ČR z roku 2009 je incidence u muţů 93,1/100 000 a 61,1/100 000 u ţen (NOR 2009). Bohuţel nás tato data řadí na přední pozice v Evropě i po celém světě. Jedná se o druhý nejčastější zhoubný novotvar v české populaci. První místo zaujímá u muţů rakovina prostaty a u ţen karcinom prsu (Dušek 2012). Kaţdým rokem je nově diagnostikovaných okolo 8000 pacientů s KRK a zhruba poloviční počet na něj umírá (Dušek 2005). Věk většiny pacientů s touto 13

diagnózou je v rozmezí mezi 61. a 78. rokem, ale 21 % pacientů je pod 60 let (NOR 2009). Dalším problémem je nedostatečně včasná a účinná diagnostika, protoţe více neţ polovina případů je objevena aţ ve III. či vyšším stádiu choroby. To je nepříznivé pro budoucí léčbu a nepřispívá to ani k optimistické prognóze. Navzdory těmto faktům byl však zaznamenán klesající trend mortality (Obr. 3), ta je však stále druhá nejvyšší ze zhoubných novotvarů v ČR (Dušek 2012).

Obr. 3 Incidence a mortalita kolorektálního karcinomu v letech 1977 - 2010 v ČR (Dušek 2005)

HISTOPATOLOGIE KRK Kolorektální karcinom vychází z epiteliálních buněk sliznice tlustého střeva (Rubin 2011). Nejčastěji se objevuje v tračníku (lat. colon) a konečníku (lat. rektum), odtud tedy název kolorektální karcinom. Jeho lokalizace má v posledním desetiletí tendenci posunu doprava. Méně se dotýká rekta, a naopak více tlustého střeva. Adenomy představují prekancerózu, protoţe mají schopnost transformace v karcinom. Podle morfologických studií je jasné, ţe existuje souvislost mezi velikostí a typem adenomu a stupněm epitelové dysplazie a jeho malignizací. Vývoj KRK probíhá v několika morfologických stupních (Obr. 4). Z normálního epitelu vznikají aberantní kryptové fokusy s dysplazií a mění se v adenom s nízkým rizikem maligního zvratu. Riziko se postupem času zvyšuje, aţ vznikne adenokarcinom, nádor ţlázového původu, který se bez zásahu mění v metastazující adenokarcinom (Holubec 2004).

14

Takto vzniká většina (90 %) KRK, v menším mnoţství se vyskytuje v mucinózní formě (Rubin 2011). Dle mikroskopického obrazu rozlišujeme tubulární a vilózní adenom. Převáţná většina (80 %) karcinomů je zastoupena tubulární formou, čistá vilózní forma je zastoupena jen u 2,6 % a zbytek (okolo 18 %) je tvořen přechodnou tubulovilózní mikroskopickou stavbou (Becker 2005).

Obr. 4 Histologické preparáty normálního, hyperplastického a maligního střevního epitelu. Vlevo vidíme běţné uniformní střevní buňky, přesně seřazené podle bazální membrány. Uprostřed jsou buňky morfologicky normální, ale díky vyššímu počtu buněk v kryptách dochází ke shlukování a slizničnímu skládání. Vpravo vidíme typický vzhled karcinomu: vyšší poměr cytoplazma/jádro, neuniformní buňky, větší počet jader seřazených podél bazální membrány (Kinzler and Vogelstein 1996) .

Pro histologický staging (určení rozsahu nádoru) je nejrozšířenější uţití klasifikace TNM (tabulka 1), která vychází z rozsahu penetrace nádoru do sliznice střeva a okolních orgánových struktur (Obr. 5). Pouţívá se zejména k určení stádia KRK, které je pak rozhodujícím faktorem pro volbu vhodného léčebného postupu. Jednotný standard pro hodnocení vztahu histologického obrazu s biologickou povahou nádoru chybí, ale mezi nejpouţívanější patří klasifikace dle Dukese (Compton 2003; Becker 2005). Ten ve svém hodnocení upřednostňuje buněčné uspořádání a míru postiţení. K prvnímu Dukesovu stupni se řadí nádory s nejdiferenciovanějšími buňkami, tubulární, s nejmenším počtem jaderných polymorfismů. Stupeň poslední je charakteristický nejméně diferenciovanými buňkami, pouze občas je zde zřetelná ţláznatá struktura, buňky jsou neuniformní, často v mitóze (Labianca, Beretta et al. 2010). Kolorektální karcinom metastazuje buď přímým růstem do okolí, nebo se dostává pomocí lymfatických kanálků do lymfatických uzlin pod nádorem a dalších vzdálenějších orgánů. Metastáze se mohou vyskytovat prakticky všude, často se vyskytují v játrech (Rubin 2011). Prognostický význam má spíš rozsah invaze nádoru skrz střevo neţ velikost či histopatologický obraz. Obecně však platí, ţe čím 15

vyšší stádium, tím horší prognóza. Karcinom z prstenčitých buněk má vţdy horší prognózu, stejně tak mucinózní adenokarcinom. Naopak medulární forma KRK je prognosticky příznivější (Compton and Greene 2004). T- kategorie - primární nádor Primární nádor nelze posoudit TX Bez známek primárního nádoru T0 Nádor in situ (intraepiteliální nebo intramukózní) TIS Nádor prorůstá do submukózy T1 Nádor prorůstá do tunica muscularis propria T2 Nádor pokračuje v invazi přes muscularis propria do subserózy nebo se šíří do neperitonealizované perikolické nebo perirektální tkáně pT3a minimální invaze: < 1mm za hranici muscularis propria pT3b lehká invaze: 1 - 5 mm za hranici muscularis propria pT3c střední invaze: >5–15 mm za hranici muscularis propria pT3d rozsáhlá invaze: >15 mm za hranici muscularis propria T3 Nádor přímo postihuje jiné orgány či struktury (T4a) Nádor prorůstá na viscerální peritoneum (T4b) T4 N kategorie - regionální uzliny Regionální mízní uzliny nelze hodnotit NX Bez metastáz NO Metastáze v 1 aţ 3 lymfatických uzlinách N1 Metastáze ve 4 a více lymfatických uzlinách N2 M kategorie - vzdálené metastázy Přítomnost vzdálených metastází nelze posoudit MX Bez vzdálených metastáz MO Přítomnost vzdálených metastáz M1 stádium 0 Tis N0 M0 N/A stádium I

T1

N0

M0

stádium A

T2

N0

M0

stádium B1

stádium IIA

T3

N0

M0

stádium B2

stádium IIB

T4

N0

M0

stádium B3

stádium IIIA

T1, T2

N1

M0

stádium C1

stádium IIIB

T3, T4

N1

M0

stádium C2, C3

stádium IIIC stádium IV (TNM)

Jakékoliv T

N2

M0

Jakékoliv T

Jakékoliv N

M1

stádium C1, C2, C3 stádium D (Dukes)

Tabulka 1TNM klasifikace KRK (Compton and Greene 2004) (Sobin 2010)

16

Obr. 5 Staging kolorektálního karcinomu (Metrohealth 2012).

5.4. KLINICKÉ PŘÍZNAKY Klinické symptomy souvisí s lokalizací kolorektálního karcinomu, s jeho velikostí, typem nádoru a v pozdějších stádiích s mírou postiţení metastázemi. Pro kolorektální karcinom je typické dlouhotrvající asymptomatické období, které můţe dojít aţ k rozvoji akutního stavu, jako je perforace či obstrukce tlustého střeva. Jediným příznakem v asymptomatickém období bývá přítomnost okultního krvácení. Symptomatické karcinomy lokalizované na pravé straně tračníku jsou doprovázeny mikrocytární sideropenickou anémií způsobenou chronickým okultním krvácením. Dalším znakem bývá neidentifikovatelná abdominální bolest způsobená invazí tumoru. Levostranné nádory jsou doprovázeny změnami defekačního stereotypu, plynatostí, enteroragií a subileózními stavy. Pro nádory rekta jsou typické tenezmy, následované vyprázdněním neodpovídajícího mnoţství stolice s přítomností hlenu a krve (Rubin 2011).

17

5.5. RIZIKOVÉ FAKTORY Kolorektální karcinom je multifaktoriální onemocnění. Na rozvoji KRK se podílejí dvě hlavní skupiny rizikových faktorů – exogenní a hereditární. Působení exogenních faktorů má především podíl na vzniku nádorů v oblasti sestupného tračníku, esovité kličky a konečníku. Hereditární faktory odpovídají výskytu zhoubných nádorů v oblasti céka a vzestupného tračníku (Holubec 2004). Mezi osoby se zvýšeným výskytem

kolorektálního

onemocněním

střev,

karcinomu

nositelé

patří

dispozice

pacienti

s chronickým

k hereditárnímu

karcinomu

zánětlivým a

osoby

s individuálně zvýšeným rizikem pro sporadický karcinom (Becker 2005). Aţ 25 % pacientů s KRK má pozitivní rodinnou anamnézu a u 15 % se jedná přímo o příbuzné prvního stupně. V tomto případě je šance na KRK dvojnásobná (Johns and Houlston 2001). Pokud se v rodině vyskytuje více neţ jeden případ KRK u prvního stupně příbuzenství, riziko narůstá čtyřnásobně. Stejně tak rozvinutí zhoubného novotvaru kolorekta u příbuzného před 60. rokem znamená zvýšené riziko (Becker 2005). U sporadických nádorů se v procesu karcinogeneze uplatňují nejvýznamněji exogenní rizikové faktory. (Arnold, Goel et al. 2005). Byla potvrzena souvislost mezi typem výţivy západních zemí a zvýšenou incidencí KRK (Slattery, Boucher et al. 1998). Patří sem především nadbytek tuků v potravě, nízký příjem vlákniny, nevhodné tepelné zpracování potravy, nadměrná exkrece ţlučových kyselin do stolice, nízká koncentrace vápníku v potravě, nízký příjem vitamínů skupiny A, C a také E, a také vysoký příjem alkoholu a kouření (Holubec 2004). Mezi rizika také patří sedavý způsob ţivota a nadváha (Becker 2005) . Mezi hereditární faktory patří familiární adenomatózní polypóza s mutací tumor supresorového genu APC a Lynchův syndrom (hereditární nepolypózní KRK) s mutací v genech MLH1 a MSH2 (Arnold, Goel et al. 2005). Pacienti s chronickým zánětlivým onemocněním střev mají určité predispozice k rozvoji KRK. Výskyt dysplastických lézí, jako jsou různé polypy, s sebou nese nebezpečí závislé na jejich histologické stavbě a jejich velikosti. Colitic ulcerosa se často zvrhává do malignity, především pokud trvá onemocnění delší dobu a zánět postihuje celé střevo. Distální manifestace (rectum, sigmoideum) bývají nepodstatné, ale postiţení levé strany zvyšuje riziko aţ 4krát a totální postiţení aţ 23krát. Maligní zvrat

18

u Crohnovy nemoci není jednoznačně definován, ale manifestace onemocnění před 30. rokem představuje určitou hrozbu (Becker 2005) (Holubec 2004). 5.6. BIOLOGIE KOLOREKTÁLNÍHO NÁDORU Porozumění biologické aktivitě nádoru hraje důleţitou roli pro pochopení průběhu onemocnění. Hraje významnou roli pro pokroky ve vývoji nových léčebných postupů. Snahou současného výzkumu je odhalení celého procesu karcinogeneze krok po kroku se všemi zapojenými geny a jejich proteinovými produkty. Pro budoucnost se počítá, díky těmto poznatkům, s léčebnými postupy zahrnujícími korekce genetických poruch, inhibice metastazování, inhibice angiogeneze a podobně (Holubec 2004). Nádor vzniká jako výsledek několikastupňového procesu inaktivace různých tumor supresorových genů a/nebo aktivace onkogenů několika cílových skupin genů (Fearon and Vogelstein 1990). Výsledkem je přeměna normálního epitelu v maligní struktury. Pokud se KRK vyvine na základě genetické predispozice, mluvíme o hereditární formě, která je zastoupena asi ve 20 % případech. Ostatní nádory, asi 80 %, patří do skupiny sporadických zhoubných novotvarů (Livstone 2012). 5.6.1 Molekulární genetika hereditární formy KRK Kolorektální karcinom je typický existencí několika dědičných predispozic, které přispívají k jeho rozvoji (tabulka 2). Dva nejvýznamnější jsou familiární adenomatózní polypóza a Lynchův syndrom. Gen APC

Syndrom Familiární adenomatózní polypóza

APC MUTYH

Zeslabená FAP MUTYH asociovaná polypóza

MLH1, MSH2

Lynchův syndrom

STK11 SMAD 4, BMPR1A

Peutz-Jeghersův syndrom

PTEN

Cowdenův syndrom

Juvenilní polypóza

Typ dědičnosti Ţivotní riziko Autozomálně dominantní 100 % Autozomálně dominantní 69 % Autozomálně recesivní 80 % Autozomálně dominantní 80 % Autozomálně dominantní 39 % Autozomálně dominantní 39 % Autozomálně dominantní vzácné

Tabulka 2 Přehled hlavních genů a syndromů hereditární formy KRK, převzato z (Migliore, Migheli et al. 2011)

19

5.6.1.1 FAMILIÁRNÍ ADENOMATÓZNÍ POLYPÓZA- FAP U FAP dochází k rozvoji několika adenomatózních polypů po první dekádě ţivota, a pokud nedojde k léčebnému zásahu, většina se rozvine postupem času v kolorektální karcinom. Jedná se o autozomálně dominantní dědičnou chorobu vyskytující se u 1 člověka z 1000 se stejnou incidencí u muţů i ţen (Boland, Sato et al. 1995). FAP můţe být doprovázená mimostřevními manifestacemi, jako jsou osteomy, zubní abnormality, vrozené hypertrofie pigmentového epitelu sítnice a extrakolonické nádory (u 10 – 15 % pacientů, nádory mozku, slinivky, ţaludku, štítné ţlázy) (Jasperson, Tuohy et al. 2010). Za výskyt FAP je odpovědná mutace genu APC (adenomatosis polyposis coli) na 5. chromozomu (Groden, Thliveris et al. 1991). Pod pojem familiární adenomatózní polypóza můţeme také zařadit méně váţnější formy Gardnerův syndrom a tlumenou adenomatózní polypózu (Migliore, Migheli et al. 2011).

5.6.1.2 LYNCHŮV SYNDROM Lynchův syndrom neboli hereditární nepolypózní kolorektální karcinom (HNPCC) je autozomálně dominantní onemocnění. Charakteristikou tohoto onemocnění je časný nástup (přelom 3. a 4. dekády ţivota) KRK a jiných tumorů (endometria, vaječníku, ţaludku, močového traktu, slinivky, tenkého střeva a mozku) u několika členů rodiny bez výskytu kolorektálních polypů (Jasperson, Tuohy et al. 2010) (Lynch, Lynch et al. 2009). Na

počátku

90.

let

byla

zjištěna

souvislost

Lynchova

syndromu

s mikrosatelitovou nestabilitou (MSI) (Peinado, Malkhosyan et al. 1992). Ukázalo se, ţe postiţenými geny v tomto případě jsou geny patřící k DNA ,,mismatch“ opravnému systému (MMR) MSH2 a MLH1 (Lynch and de la Chapelle 2003). Tento systém pomocí několika proteinů zajišťuje opravu DNA během replikace (Peltomaki 2001). 5.6.2 Molekulární genetika sporadické formy KRK Sporadické kolorektální nádory jsou klonálního typu. Mutace se týká několika genů, obvykle 4 - 5, a ty nejsou specifické pro ţádnou chorobu. Teprve aţ jejich nahromaděním vzniká maligní transformace (Adrouny 2002).

20

Porozumění

genetickému

podkladu

familiární

adenomatózní

polypózy

a hereditární nepolypózní KRK pomohlo pochopit patologické cesty vzniku mutací u sporadických forem. Rozlišujeme tři aţ čtyři základní molekulární příčiny: nestabilita mikrosatelitů (MSI, microsatellite instability), chromozomální nestabilitu (CIN, chromosomal instability) a CIMP (CpG island methylator phenotype) (Adrouny 2002;

Arnold, Goel et al. 2005) (Migliore, Migheli et al. 2011). V některých zdrojích se uvádí čtvrtá cesta, a to globální hypometylace DNA (Pritchard and Grady 2011). Tyto cesty však ještě nejsou všechny přesně identifikovány a je moţné, ţe existuje více moţností. Arnold a kol. hledali u 209 pacientů s KRK aktivaci CIN a MIN, u 14 % KRK byla prokázána nestabilita mikrosatelitů, u 51 % chromozomálně nestabilní dráha, u necelých 4 % se projevily obě dvě, ale u 38 % ani jedna (Arnold, Goel et al. 2005). 5.6.2.1 Nestabilita mikrosatelitů Nestabilita mikrosatelitů (MSI) se vyskytuje asi u 15 aţ 20 % sporadických KRK. MSI bylo Národním institutem pro rakovinu definováno jako porucha nejméně 30 % míst z 5-10 definovaných, bez změny karyotypu (Boland, Thibodeau et al. 1998). Pouţívá se panel 5 mononukleotidových markerů (BAT 25, BAT 26, NR 21, NR 24, MONO 27) (Bacher, Flanagan et al. 2004). Ukázalo se, ţe pacienti s MSI mají lepší prognózu neţ pacienti s tumorem vzniklým na základě CIN (Walther, Houlston et al. 2008). Pod MSI patří i mechanismus při poruše MMR genů. Dochází k defektu ,,mismatch“ a vzniklé mutace jsou přenášeny do dalších generací, coţ můţe vést ke vzniku tumoru. (Lengauer, Kinzler et al. 1998). Porucha těchto genů se vyskytuje aţ u 90 % HNPCC. V současné době bylo identifikováno 5 MMR genů: MSH2, MLH1, PMS1, PMS2 a HMS46. 50 % pacientů s HNPCC má mutaci v genu MSH2, 30 % v MLH1 a mutace ostatních genů se vyskytují jen vzácně (Adrouny 2002). K rozlišení sporadické formy od Lynchova syndromu slouţí v tomto případě přítomnost mutace BRAF, která je typická pro sporadické karcinomy. Vylučuje tedy moţnost Lynchova syndromu (Wang, Cunningham et al. 2003).

21

5.6.2.2 Chromosomální nestabilita Chromosomální nestabilita (CIN) se vyskytuje asi u 85 % sporadických forem KRK. Projevuje se buď výskytem aneuploidií, polyploidií, delecemi chromozomů nebo jejich ramének, anebo ztrátou heterozygozity. Existují dva obecné mechanismy odpovědné za změny v chromozomech. Jedním z nich je chyba v segregaci, pak vznikají aneuploidie po ztrátě či zisku chromozomů. Druhým mechanismem jsou pak poruchy ve strukturálním uspořádání: nesymetrické translokace, delece atd., vyúsťující ve ztráty či zisky částí chromozomů (Lengauer, Kinzler et al. 1997). Dle několika studií je CIN spojován s horším průběhem nemoci. (Walther, Houlston et al. 2008) (Popat and Houlston 2005).

Obr. 6 Model karcinogeneze dle Fearona a Vogelsteina (Mináriková 2005)

V roce 1990 Fearon s Vogelsteinem představili model formace sporadického karcinomu (Fearon and Vogelstein 1990). Ten vychází z předpokladu, ţe tumor vzniká z adenomových polypů mutací několika genů (Obr. 6). Avšak od představení prvního modelu došlo díky pokroku v odhalení jednotlivých kroků molekulární patogeneze k několika revizím jejich návrhu (Obr. 7).

22

Dle Fearona a Vogelsteina první mutace bývá u APC genu, který je umístěn na dlouhém raménku chromozomu 5 (Adrouny 2002). Jeho funkce spočívá v udrţování struktury a adheze buňky. Při poruše dojde k formaci chromozomálně nestabilního adenomu, coţ vede k dalším genetickým ztrátám. Následkem inaktivace APC můţe například dojít k aktivaci onkogenu c-MYC nebo k interakci s adhezivním proteinem β-kateninem. Výsledkem je sníţená adheze buněk, která tvoří ideální podmínky pro náhodný buněčný růst. (Adrouny 2002). Mutace genu APC je přítomna u 70 % pacientů s KRK (Pritchard and Grady 2011). Na chromozomu 12 se vyskytuje další protoonkogen, který je zapojen do formace sporadického karcinomu kolorekta. Je jím K-ras. Jeho produkt se účastní intracelulární signalizace a jeho mutace byla detekována aţ u 60 % KRK (Capella, Cronauer-Mitra et al. 1991). Další mutovaná oblast je na 18. chromozomu v oblasti genu DDC (,,Deleted in KRK“). Posledním krokem podle tohoto modelu je deaktivace tumor supresorového genu p53, regulátoru buněčného cyklu. V případě, ţe protein p53 nalezne významněji poškozenou, neopravenou DNA, zastaví replikaci a navodí buňce apoptózu. Při jeho deaktivaci dochází tedy k proliferaci poškozených buněk. Mutace genu p53 na 17. chromozomu se vyskytuje u 75 % sporadických KRK (Adrouny 2002).

Obr. 7 Nové schéma vývoje adenomu v karcinom. V současné době jsou dvě dobře známé a popsané cesty vzniku KRK. Chromozomová nestabilita (CIN) je typická pro vývoj tubulárního adenomu. Sled mutací začíná genem APC a vede k nesprávné regulaci WNT signální dráhy. V tomto případě je častá mutace K-ras onkogenu, ztráta heterozygotnosti chromozomu 18 (18qLOH) a mutace TP53. Naopak nádory vzniklé na základě mikrosatelitové nestability (MSI) vyţadují mutaci v genu BRAF a není zde přítomna mutace 18qLOH a TP53 (Pritchard and Grady 2011).

23

Kromě modelu karcinogeneze dle Fearona a Vogelsteina existují další popsané dráhy (Obr. 7), které vedou ke vzniku fenotypu typického pro KRK. Za poslední dobu bylo zjištěno nejméně 80 genů, jejichţ mutace jsou spojené s KRK, ale jen méně neţ 15 z nich je opravdu odpovědná za vlastní karcinogenezi (Leary, Lin et al. 2008). Mimo geny zmíněné výše to jsou například geny spojené s centromerami – kódující protein kinázu Aurora A (AURKA) či serin/treonin kinázu (Plk1). Můţe se také jednat o poruchu genů regulujících apoptózu FAS a FASL, dále COX-2, PPAR a další (Migliore, Migheli et al. 2011) (Pino and Chung 2010) .

5.6.2.3 CIMP (CpG island methylator phenotype) Epigenetika se týká dědičných změn genové exprese bez změny DNA sekvence. CIMP se vyskytuje asi u 20 % KRK (tabulka 3). Mezi epigenetické mechanismy patří DNA metylace cytosinů v tzv. CpG ostrůvcích posttranslační modifikace histonů nebo mikroRNA (Sharma, Kelly et al. 2010), přičemţ u karcinogeneze KRK se nejvíce uplatňuje DNA metylace CpG ostrůvků. Stále není jasný celý proces epigenetických změn, ale jedná se o ţhavé téma současnosti. Je zde určitá asociace mutace BRAF a

CIMP KRK, která ukazuje na BRAF jako iniciátora patogeneze metylace

(Weisenberger, Siegmund et al. 2006). Hypometylace některých genů je fyziologický proces, který je zesilován stoupajícím věkem. Věk je také jedním z rizikových faktorů podporujících hypometylaci v procesu karcinogeneze (Feinberg 2004). Ukázalo se, ţe tyto změny vytvářejí prostředí pro mutace související s KRK (Worthley, Whitehall et al. 2010). CIMP někteří vědci rozdělují do dvou podskupin. Například Issa a jeho kolegové dle výsledků své studie zařadili do první skupiny CIMP nádory s mikrosatelitovou nestabilitou a mutací BRAF, do druhé uvedli nádory s mutací KRAS, BRAF nebo p53, ale bez mikrosatelitové nestability (Shen, Toyota et al. 2007). V současné době se známé epigenetické změny pouţívají jako biomarkery pro diagnostiku, určení prognózy a terapeutické léčby (Lao and Grady 2011).

24

Gene APC MLH1 MGMT RASSF1A

SLC5A8 RUNX3 SFRP1 SFRP2

Protein

Funkce

Adenomatous polyposis coli MutL homolog 1 O-6-metylguanin-DNA metyltransferáza Ras asociovaná doména rodiny1 (izoforma A) Sodium solute symporter rodiny 5 člen 8 Runt-spojený transkripční faktor 3 Secreted frizzledrelated protein 1 Secreted frizzledrelated protein 2

Inhibice signální dráhy Wnt oprava DNA mismatch

CDH1

E-Kadherin

CDH13

Kadherin 13

CRABP1 CDKN2A/p 16 HLTF

Retinol-vázající protein 1 Cyklin-dependentní kináza inhibitor 2A Helikáze podobný transkripční faktor

CDKN2A (P14, ARF)

Protein 14

ESR1

Estrogenový receptor 1

TIMP3

Tkáňový inhibitor metaloproteinázy 3

CXCL12 ID4 IRF8

Oprava alkylace DNA proapoptická aktivita, stabilizace mikrotubulů, inhibitor RAS

Účinek ztráty funkce Vzrůst Wnt/β-katenin dráhy Mikrosatelitová nestabilita Vzrůst frekvence G→A mutace Vzrůst RAS/RAF/MAP kinázy signalizace, porucha apoptózy

Přenašeč sodíku a krátkých mastných kyselin Transkripční faktor Wnt antagonista Wnt antagonista Na vápníku závislý adhesivní protein Účastní se na buněčném rozpoznávání a adhezi, antiapoptická aktivita

pokles TGF-β/BMP signalizace Vzrůst Wnt/β-catenin signalizace Vzrůst Wnt/β-catenin signalizace Ztráta buněčné adheze Vzrůst PI3K/Akt/mTOR signalizace, MAPK signalizace

přenašeč retinolu Regulace buněčného cyklu dsDNA translokáza, ubikvitin ligáza Inhibice E3 ubikvitin ligázy Ligand-aktivující transkripční faktor inhibice MMPs a ADAMs

Chemokin (C-X-C) ligand 12 Inhibitor DNA vázající 4 Interferon regulatorní faktor 8

Alfa chemokin

Zvýšená proliferace Porucha DNA reparace Pokles p53 stabilizace a aktivace Ztráta estrogenové signalizace Vzrůst EGF receptor signalizace, TNFalfa signalizace Zvýšené metastázováni

transkripční faktor transkripční faktor

Interferonová signalizace

Tabulka 3 Přehled některých běţně metylovaných a down-regulovaných genů u kolorektálního karcinomu, převzato z (Lao and Grady 2011).

5.6.3Signální dráhy spojené s KRK Různé genetické změny a jejich akumulace vedou k poruše regulačních mechanismů buněčných signálních drah. Ty mají v organismu řídit proliferaci, diferenciaci, apoptózu, angiogenezi a všechny další buněčné mechanismy.

25

Nejlépe prostudovanými signálními dráhami, které se týkají kolorektálního karcinomu, jsou dráhy WNT-β kateninu, TGFβ, EGFR mitogen aktivující protein kinázy (MAPK) a fosfatidylinositol 3-kinázy (PI3K). Poznatky získané studiem těchto drah se vyuţívají k rozvoji cílené terapie. Některé léky ovlivňující zmíněné dráhy jsou jiţ klinicky pouţívané a některé jsou zatím součástí klinických studií (Pritchard and Grady 2011). 5.6.3.1 WNT/APC/CTNNB1signální dráha Tato signální dráha začíná navázáním Wnt ligandů na transmembránové receptory Frizzled a jejich kofaktory. Tímto se zahájí fosforylace a sekvestrace komplexu proteinů APC, kasein kinázy 1, glykogen syntáza-kinázy 3 a axinu. Po inhibici těchto proteinů dojde k stabilizaci β-katenin genu (CTNNB1) a kumulaci βkateninu v cytoplazmě v nefosforylované formě. Vstupuje do jádra, kde interaguje s transkripčními faktory, které ovlivňují buněčný růst a diferenciaci. Funkcí APC je tedy negativní regulace Wnt signální dráhy vázáním na β-katenin a aktivací ubikvitinem regulované degradace. Porucha APC vede k vyšší činnosti Wnt signální dráhy díky stabilizaci β-kateninu (Barker and Clevers 2006). V současné době zatím neexistuje lék cílený na tuto signální dráhu ani na APC ani na β-katenin. Nenašlo se uplatnění této dráhy v diagnostice ani jako diagnostický faktor (Pritchard and Grady 2011). 5.6.3.2 TGFβ (transformující růstový faktor beta) signální dráha TGFβ se povaţuje za tumor supresorovou signální dráhu. Mutacemi v receptorových genech TGFBR2 a TGFBR1, v post receptorových genech SMAD2 a SMAD4 a v rodině TGFβ genů dochází k inaktivaci této dráhy. Mutace těchto genů jsou celkem časté, například TGFRB2 je pozměněn u více neţ 30 % KRK pacientů a nejvíce se vyskytuje u nádorů s mikrosatelitovou nestabilitou. Prozatím se tyto geny nevyuţívají ke klinickým účelům. Nicméně SMAD4 se vyskytuje u více neţ 50 % tumorů a zdá se, ţe je spojený s výskytem metastáz v lymfatických uzlinách, a jeví se také jako prognostický marker pro léčbu 5-fluorouracilem. Nadějným prediktivním markerem se zdá i 18qLOH (ztráta heterozygozity –LOH) Tato cytogenetická alterace se objevuje u 70 % KRK a hlavní roli v jejím vzniku hrají DCC a SMAD4 geny. Bylo vypozorováno spojení s horší prognózou, v současné době na toto téma probíhají klinické studie (Pritchard and Grady 2011). 26

5.6.3.3 Signální dráha epidermálního růstového faktoru (EGFR) Receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR) je členem rodiny receptorů s tyrosinkinázovou aktivitou. Skládá se z intracelulární domény, která nese enzymovou aktivitu. Transmembránově je uloţena lipofilní část a extracelulárně leţí ligand-vázající doména. Jedním z ligandů můţe být transformující růstový faktor TGFα, aktivátor DNA syntézy a buněčného růstu v nádorové tkáni. Navázání takovéhoto ligandu na EGFR spouští sled událostí, jejichţ výsledkem je buňka chráněná před apoptózou, inhibující opravy DNA a podporující angiogenezi (Arteaga 2002). Hlavní aktivovaná dráha je Ras /Raf /MAPK. Postupně dojde aţ k fosforylaci ERK1 a ERK2. Tyto MAP kinázy mohou regulovat transkripci molekul zapojených do buněčného přeţívání a proliferace (Mendelsohn and Baselga 2003).

Obr. 8 Schéma EGFR signalizace a místa účinku protirakovinných léků (Merla and Goel 2012).

27

Jedním z nejčastějších mutovaných genů u všech rakovin je gen KRAS, je to také nejdůleţitější onkogen u kolorektálního karcinomu. KRAS protein, člen Ras rodiny, je ligandem EGFR. Kras aktivuje MAPK přes BRAF a podporuje tak buněčný růst a přeţití buňky. Mutace KRAS ve 12. nebo 13. kodonu je přítomna u 40 % KRK a mutace genu BRAF asi u 15 % pacientů s KRK. Právě mutace jednoho z těchto dvou genů přispívá ke karcinogenezi vyvolanou Ras/Raf/MAPK signální dráhou (Pritchard and Grady 2011). Význam EGFR v procesu karcinogeneze jej předurčilo jako vhodný cíl pro vývoj protirakovinných léčiv (Obr. 8). Vyuţití zde našly například protilátky proti EGFR, bohuţel ne všichni pacienti reagují na léčbu. Reakce pacienta na léčivo závisí na několika faktorech: aktivaci EGFR, nepřítomnosti KRAS mutace a dalších (Spano, Milano et al. 2008). Tato tématika bude rozebrána v kapitole o léčbě. Další dráhou, která můţe být spuštěna přes EGRF, je dráha PI3K a protein serinová treoninkináza Akt. Signály, vytvořené aktivací této cesty, ovlivňují růst buňky, její proliferaci a přeţití (Mendelsohn and Baselga 2003). PI3K- Akt dráha je inhibována tumor supresorovým proteinem PTEN, mutací jeho genu dochází k aktivaci dráhy a tumorové progresi (Merla and Goel 2012). Mutace v PI3K signální dráze jsou přítomny asi u 40 % KRK, nejčastěji v katalytickém místě p110α PI3KCA a právě v genu PTEN. PI3K dráha je ovlivňována EGFR signalizací přes KRAS aktivaci, a proto se uvaţuje o uţití těchto dvou mutací jako prediktivní markery anti- EGFR léčby (Pritchard and Grady 2011). Přes EGFR můţe být také nastartována cesta JAK/STAT nebo stresem aktivovaná protein kinázová dráha (Mendelsohn and Baselga 2003).

28

5.7. DIAGNOSTIKA Důleţitou roli hraje správné stanovení osobní a rodinné anamnézy. Na prvním místě při podezření na kolorektální karcinom je palpace břicha a vyšetření per rectum. V algoritmu vyšetření dále stojí zobrazovací metody a laboratorní diagnostika vč. stanovení okultního krvácení do stolice (Obr. 9) (Adam 2002).

Obr. 9. Diferenciální schéma diagnostiky kolorektálního karcinomu.

5.7.1 Screening kolorektálního karcinomu Screening populace se provádí s cílem detekce tumoru v časném stádiu, cílem je zajistit včasnou léčbu, která je méně radikální a sníţit tak mortalitu. V současné době probíhá v České Republice screening třech nádorových malignit. V roce 2002 se rozjel projet pro včasný záchyt rakoviny prsu, od roku 2008 probíhá screening nádorů hrdla děloţního a od roku 2009 také program pro kolorektální karcinom. Na screening má právo kaţdá asymptomatická osoba nad 50 let. Osoby s pozitivní osobní či rodinnou anamnézou se do tohoto procesu nepočítají, patří do jiných speciálních programů dle stupně jejich rizika. Kolorektální screening zahrnuje pravidelné testy okultního krvácení do stolice (TOKS) a kolonoskopii. 29

Screening probíhá ve dvou fázích. Ve věku od 50 do 54 let by měl kaţdý jedinec podstoupit jednou za rok TOKS. Lidé starší věku 54 let mohou v tomto pokračovat nebo mohou podstoupit jednou za deset let primární screeningovou kolonoskopii (Dušek 2013). Jiný screening probíhá u vysoko rizikových skupin, kam řadíme všechny pacienty s

polypózami, osoby s Lynchovým syndromem, blízké příbuzné pacientů

s KRK, pacienty se střevními záněty a pacienty s KRK po léčbě. U jednotlivých stavů se postupuje individuálně, rizikoví pacienti jsou hlídání od niţšího věku, odborníci se opírají o genetický screening, opakované kolonoskopie a TOKS (Holubec 2004). 5.7.2 Laboratorní diagnostika Laboratorní diagnostika zahrnuje klasické biochemické vyšetření krve, moči a stanovení nádorových markerů. V brzkých stádiích bývá málokdy biochemický nález pozměněn. Růst nádoru se projeví urychlenou sedimentací erytrocytů, zvýšeným CRP, zmnoţením α-globulinů, mukoproteinů, také se můţe vyvinout anémie (Holubec 2004). Stanovení nádorových markerů bývá doplňkovým terapeutickým postupem, protoţe v současné době neexistuje ideální marker a v klinické interpretaci je nutná spolupráce klinika s laboratoří. První volbou je stanovení karcinoembryonálního antigenu (CEA) a CA 19-9. CEA je sérový glykoprotein. Účastní se intercelulární adheze a umoţňuje agregaci nádorových buněk kolorektálního tumoru (Benchimol, Fuks et al. 1989). Jedná se o produkt nádorových buněk střeva, prsu a jater, bývá také zvýšený u chronických onemocnění jater. U kuřáků bývá zvýšená hladina, ale hodnoty by neměly přesahovat 5mg/l (Ilantzis, DeMarte et al. 2002). Hladina CEA před operací koreluje s velikostí primárního nádoru a stupněm postiţení uzlin. Ukázalo se, ţe CEA je dobrým prognostickým ukazatelem po chirurgické léčbě. Při úspěchu by se hladiny CEA během 4 - 6 týdnů měly vrátit do normálu (Fletcher 1986). Proto se pouţívá sledování hladin tohoto markeru ke kontrole účinnosti terapie. (Holubec 2004). Tumorový marker CA 19-9 patří do skupiny glycidových antigenů, je produkovaný adenokarcinomy pankreatu, ţaludku, močového měchýře a střeva. Pro KRK je méně citlivý neţ CEA, ale výrazně koreluje s výskytem vzdálených metastáz. Optimální je proto kombinace těchto dvou markerů (Gupta, Arciaga et al. 1985) (Holubec 2004).

30

5.7.3 Genetická diagnostika Pouţití genetické diagnostiky není zatím rutinně pouţívaná věc, ale uplatňuje se například u hereditárních forem KRK. Familiárně se vyskytuje asi 1/5 KRK a důleţitou roli pro indikaci genetického vyšetření zde hraje rodinná anamnéza. Při podezření na familiární adenomatózní polypózu se stanoví rodokmen a můţe se potvrdit sekvenační analýzou APC genu, kdy hledáme patologické mutace. K detekci přeskupení genů, delecí a jiných změn slouţí southern blott (Arnold, Goel et al. 2005). Jedním z postupů jak určit diagnózu Lynchova syndromu je splnění tzv. Amsterodamských kritérií. Jedná se o 3 podmínky, kdy při jejich splnění se pacient posílá na genetické vyšetření. Tyto kritéria zahrnují výskyt alespoň jednoho nemocného s KRK v rodině diagnostikovaného do 50 let. Musí být postiţeny nejméně dvě po sobě jdoucí generace. V rodině musí být alespoň 3 příbuzní s histologicky potvrzenou diagnózou KRK, přičemţ jeden z nich je příbuzným prvního stupně těch dvou (Holubec 2004). Molekulární diagnostika zahrnuje analýzu MMR genů MLH1, MSH2, hhMSH6 a PMS2 pomocí PCR a následně denaturační gradientové gelové elektroforézy (Holubec 2004). Toto vyšetření je však značně nákladné a proto byly navrţeny série testů zaloţených na molekulární patologii KRK. Nejdříve se vyšetří tumorová tkáň na ztrátu produktů MMR genů (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) pomocí imunohistochemie a pomocí PCR se zjistí výskyt MSI (Baudhuin, Burgart et al. 2005). Pokud se zjistí přítomnost MSI a ztráta produktu MMR genů, pokračuje se v testování na výskyt mutace BRAF V600E a hypermetylace promotoru MLH1, abychom od sebe odlišili sporadický tumor (BRAF mutace u 50 %, metylace u 99 %) od Lynchova syndromu (bez BRAF mutace, málo častá metylace) (Baudhuin, Burgart et al. 2005; Bettstetter, Dechant et al. 2007). U Lynchova syndromu je důleţité včasné odhalení tohoto onemocnění. Pacienti a jejich rodinní příslušníci jsou pak zařazeni do speciálního programu prevence (Pritchard and Grady 2011). Poslední dobou se studie o kolorektálním karcinomu zabývají prognostickým významem mutací KRAS, BRAF a PIK3CA (Richman, Seymour et al. 2009) (Ogino, Nosho et al. 2009). Pokud se u vyvinutého kolorektálního karcinomu identifikuje mutace v genech KRAS a BRAF, zjistilo se, ţe tyto nádory mají pak horší průběh a celkové přeţití je niţší (Richman, Seymour et al. 2009). Jelikoţ je známo, ţe mutace

31

KRAS se vyskytuje u mnoha nádorů, stanovuje se pro posouzení nároků léčby cetuximabem nebo panitumumabem. A do budoucna se bude do klinického vyuţití zavádět také prognostický marker mutace KRAS (Pritchard and Grady 2011). Dříve se mutace detekovala pomocí sekvenování, ale tato metoda měla nedostatečnou sensitivitu. Uplatnění v detekci KRAS mutace našla RFLP PCR s denaturační gradientovou elektroforézou a ARMS PCR (Shor and Jothy 2009). 5.7.4 Radiodiagnostika V současné

době

je

tato

metoda

vytlačena

rozvojem

endoskopie.

Radiodiagnostické metody zachycují tlusté střevo vcelku, mohou detekovat některé poruchy motility, polohy a fixace. Patří sem konvenční radiodiagnostika - irigoskopie s metodou dvojího kontrastu. Provádí se, pokud nelze pouţít kolonoskopii, například při obtíţných anatomických poměrech. Vyšetření probíhá při podání baryové suspenze a insuflaci vzduchu. Mezi další radiodiagnostické metody pouţívané k diagnostice KRK patří ultrasonografické vyšetření, počítačová tomografie a magnetická rezonance. Tyto metody slouţí hlavně k detekci metastatického procesu především v játrech a retroperitoneálních uzlinách (Holubec 2004). 5.7.5 Endoskopie Endoskopická vyšetření (rektoskopie, sigmoideoskopie, kolonoskopie) jsou rozšířenou technikou diagnostiky rakoviny kolorekta, ale i jiných onemocnění této oblasti. První volbou bývá kolonoskopie. Umoţňuje snesení polypů nebo vzorků z neidentifikovaných tkání a jejich následné histologické vyšetření. Výhodou je moţnost okamţitého odstranění polypů metodou polypektomie, coţ prokazatelně sniţuje incidenci KRK. Lze pouţít i ultrazvukovou sondu zavedenou kanálem endoskopu (Adam 2002). Jako alternativa nepříjemné kolonoskopie se zdá virtuální endoskopie tlustého střeva pomocí spirální počítačové tomografie. Touto metodou lze vytvořit rekonstrukci střeva a odhalit nádory, ale je zde riziko falešné pozitivity (hlen, výkaly) (Holubec 2004).

32

5.7.6 Endosonografie rekta Jedná se o důleţitou metodu, která pomáhá určit staging karcinomu rekta před operací. Spolu s magnetickou rezonancí patří k nejlepším metodám zobrazení rekta. Lze stanovit rozsah infiltrace ve stěně rekta a také stav regionálních uzlin (Adam 2002; Holubec 2004).

5.8. LÉČBA Léčba kolorektálního karcinomu zahrnuje několik pouţívaných postupů, mezi které patří chirurgické řešení, radioterapie, chemoterapie a v neposlední řadě také rozvíjená cílená terapie (Prakash and Porwal 2012). 5.8.1 Chirurgická léčba Chirurgická léčba bývá často pouţívaná v prvních stádiích kolorektálního karcinomu. Existuje několik chirurgických technik, které se volí podle rozsahu a umístění tumoru. Pokud se nádor týká střeva, provádí se otevřená kolektomie (hemikolektomie), kdy dochází k odstranění postiţené části střeva a blízkých lymfatických uzlin. Můţe se provádět laparoskopicky. Povrchové karcinomy a polypy se odstraňují polypektomií, nedochází tady k otevření pacienta, ale provádí se pomocí kolonoskopie. Přístup přes anální otvor se také uplatňuje při transanální resekci a transanální endoskopické mikrooperaci. U karcinomu rekta se podle místa postiţení volí různé typy resekce (Nelson, Petrelli et al. 2001). 5.8.2 Chemoterapie I přesto, ţe se podaří chirurgicky odstranit nádor u 75 % pacientů s KRK, stále dochází u poloviny z nich k vývoji generalizovaného onemocnění. Proto se pouţívá adjuvantní chemoterapie ke zničení latentní nádorové populace a zamezení vývoje metastáz. Standardní postup u kolorektálního karcinomu je podávání 5-fluorouracilu (5FU) a leukovorinu u pacientů ve III. klinickém stádiu (T2-T4, N1-N2 M0). 5-FU se pouţívá od roku 1957 k léčbě zejména nádorů trávicího traktu. V organizmu se rychle metabolizuje v játrech, poločas rozpadu je 10 aţ 25 minut. (Holubec 2004). Transformuje se na 5-fluoro-deoxyuridin monofosfát (5-FdUMP) a blokuje metylaci kyseliny deoxyuridilové na kyselinu thymidylovou. Inhibuje tak syntézu DNA 33

a způsobuje začlenění 5-FdUMP do RNA. Působí tedy v S fázi buněčného cyklu (SUKL). Ukázalo se však, ţe tato léčba je neefektní u MSI nádorů (Ribic, Sargent et al. 2003). 5-FU totiţ ke své cytotoxicitě potřebuje funkční MMR systém. Tento typ nádoru lépe odpovídá na adjuvantní irinotekanovou léčbu (Fallik, Borrini et al. 2003). Také ztráta 18q je spojována s neúčinností adjuvantní chemoterapie na bázi 5-FU (Watanabe, Wu et al. 2001). Mezi další pouţívaná léčiva patří tedy irinotekan. Jedná se o inhibitor topoizomerázy a její vysoká exprese předpovídá rezistenci nádoru na tento lék (Braun, Richman et al. 2008). K novějším lékům u kolorektálního karcinomu patří raltitrexed, oxaliplatina a capecitabin (Holubec 2004). 5.8.3 Radioterapie Radioterapie se pouţívá samostatně nebo v kombinaci s chemoterapií, předoperačně i pooperačně a slouţí k redukci počtu lokálních recidiv u pacientů ve II. a III. stádiu. Uplatňuje se aplikace 5-fluorouracilu s ozářením pánve dávkou do 50 Gy vysokoenergetickým svazkem brzdného či gama záření (Holubec 2004). 5.8.4 Cílená terapie Cílené terapie v onkologii napadá specifický molekulární cíl, který je součástí patogenetického mechanismu zodpovědného za karcinogenezi. V 80. letech byl vytvořen in vitro model tumoru ke studiu molekulární biologie nádoru a ke zkoumání nových terapeutických strategií. Cílem je pochopit patogenetický mechanismus onkogeneze, všechny aktivované signální dráhy zapojené do maligní transformace. K pochopení mechanismů také pomohlo zmapování lidského genomu a v roce 2001 se zavedl do klinické praxe první cílený lék imanitib proti myeloidní leukémii následovaný dalšími léčivy (Giaccone and Soria 2007). Cílená terapie se uplatňuje také v léčbě kolorektálního karcinomu (tabulka 4). Uplatňuje se zde nejvíce signální dráha EGFR aktivující zejména Ras/Raf/MAPK a PI3K-Akt (Merla and Goel 2012). EGFR dráha se fyziologicky účastní udrţování střevní homeostázy. Avšak její hyperaktivace byla nalezena u několika typů zhoubných nádorů. Ukázalo se ţe EGFR má vlastnosti podporující hypotézu pouţití EGFR jako cíle terapie. Vznikly tedy antiEGFR léky, které byly schváleny pro léčbu metastatické nemalobuněčné rakoviny plic,

34

kolorektálního karcinomu, nádorů hlavy a krku a rakoviny pankreatu (Vecchione, Jacobs et al. 2011). K anti-EGFR léčbě se uţívají buď inhibitory tyrosin kinázy (TKIs) anebo monoklonální protilátky. Alternativně je ve vývoji cílení na EGFR mRNA pomocí antisense nukleotidů nebo ribozomů se zamezuje translaci EGRF. Další variantou je pouţití intracelulárních protilátek, které by zabránily migraci receptorů na povrch buňky (Spano, Milano et al. 2008). Mezi TKI patří gefinitib a erlotinib. Principem jejich působení je zablokování ATP kapsy katalytické intracelulární domény receptoru. Znemoţní tak fosforylaci a přenos signálu v EGFR kaskádě.

Dráha

EGF/MAPK

PI3K

Specifický cíl

Lék

EGFR (mAb)

Cetuximab, Panitumumab

EGFR (TKI)

Erlotinib, Gefitinib

KRAS

Tipifarnib, Lonafarnib

BRAF

Sorafenib, PLX4032, XL281

MEK

Selumetinib

PI3K

BKM120, BGT226, XL147, GDC-0941

mTOR

Everolimus, XL765

AKT

Perifosine

WNT TGFβ

Resveratrol TGFβ2

AP 12009

VEGF

HGF

HGF mAb

Bevacizumab Vatalanib, AMG706, Pazopanib, Cediranib AMG102

IGF

IGF-1 mAb

AMG479, IMC-A12

VEGF

VEGFR

Tabulka 4 Přehled léku v klinickém uţití nebo v klinických testech a dráhy, které ovlivňují.

Mezi monoklonální protilátky anti- EGFR patří cetuximab (Erbitux®, chimerický IgG1) a panitumumab (ABX-EGF nebo Abgenix®, plně lidský IgG2). Jsou cílené proti extracelulární doméně receptoru, navázáním na receptor zabrání dimerizaci, fosforylaci a následnému přenosu signálu (Vecchione, Jacobs et al. 2011). Cetuximab nebo panitumumab je indikován pacientům ve IV. stádiu KRK v kombinaci s irinotekanem, s jiným chemoterapeutikem (5-FU, FOLFOX4 -fluorouracil, leucovorin a oxaliplatin, FOLFIRI - fluorouracil, leucovorin a irinotekan) anebo sám (Shor and 35

Jothy 2009). Nejlépe na léčbu odpovídají pacienti s wild-type alelou genů KRAS, BRAF a PI3K a s expresí fosfatázy a PTEN proteinu. Bohuţel se totiţ ukázalo, ţe pacienti s mutací v genu KRAS jsou rezistentní k léčbě cetuximabem (Lievre, Bachet et al. 2008). Mutací dochází k aktivaci dráhy Ras/Raf/MAPK a inhibice receptoru je zde neefektivní. Také mutace BRAF a PTEN vedou k rezistenci pacienta na cetuximab a panitumumab (Di Nicolantonio, Martini et al. 2008) (Frattini, Saletti et al. 2007).

Frekvence mutace

Vztah k léku

KRAS kodon 12/13 mutatace

40 %

Předpovídá rezistenci k anti-EGFR terapii

KRAS kodon 61/117/146 mutace

1%

BRAF V600E mutace

10 %

PIK3CAmutace

20 %

ztráta PTEN

30 %

MSI

15 %

18qLOH/ztráta SMAD4

50 %

Nízká Topo I.

50 %

Biomarker

Pravděpodobně předpovídá rezistenci k anti-EGFR terapii Pravděpodobně předpovídá rezistenci k anti-EGFR terapii Můţe předpovídat rezistenci k anti-EGFR terapii Můţe předpovídat rezistenci k anti-EGFR terapii Můţe předpovídat nepříznivý výsledek léčby 5-FU a lepší výsledek irinotekanu Můţe předpovídat rezistenci k 5-FU Můţe předvídat rezistenci k irinotekanu

Důkaz silný střední střední

Status validovaný, pouţívá se v klinice pouţívá se v klinice, není plně validovaný pouţívá se v klinice, není plně validovaný

omezený

nepouţívá se

omezený

nepouţívá se

střední

zatím se nepouţívá

střední

nepouţívá se

omezený

nepouţívá se

Tabulka 5 Přehled moţných biomarkerů a prediktorů léčby u kolorektálního karcinomu, převzato z (Pritchard and Grady 2011).

Tři na sobě nezávislé studie potvrdily neúčinnost cílené anti-EGFR terapie u pacientů s mutací genu KRAS. Studie OPUS (oxaliplatin a cetuximab) (Bokemeyer, Bondarenko et al. 2009), CRYSTAL (Cetuximab v kombinaci s irinotekanem) (Van Cutsem, Kohne et al. 2009) a PRIME (panitumumab v kombinaci s chemoterapií pro metastatický KRK) (Douillard, Siena et al. 2010) potvrdily účinnost cetuximabu a panitumumabu pouze u wild-type KRAS. Tyto poznatky vedly ke zkoumání dalších

36

mutací v EGFR cestě a jejich souvislostí s resistencí na léčbu monoklonálními protilátkami. Bylo zjištěno, ţe mutace BRAF a p110 katalytické podjednotky PI3K působí stejně jako mutace KRAS rezistenci nádoru proti této léčbě. Jelikoţ se tyto mutace vyskytují v nádorech společně, je těţké přesně definovat jejich roli v tomto procesu (Vecchione, Jacobs et al. 2011). Další moţné biomarkery najdeme v tabulce 5.

5.8.4.1 Přehled nových léků ve fázi klinického vývoje Jelikoţ dosavadní léky mají pouze omezené pole působnosti a jsou neefektivní v několika příkladech (mutace KRAS apod.), pracuje se neustále na hledání nových léčiv, která by zaplnila chybějící místa ve farmakologické terapii kolorektálního karcinomu. a) INHIBITORY EGFR/ LÉKY PŮSOBÍCÍ NA EXTRACELULÁRNÍ DOMÉNU Jedním z těchto kandidátů je BIBW 2992/Afatinib, selektivní inhibitor EGFR a HE2. Patří mezi druhou generaci TKI a ukázal dobré výsledky při léčbě nemalobuněčného karcinomu plic. V současné době probíhá klinická studie na pacientech

s metastatickým

KRK.

Lidský

IgG1

proti

EGFR

zvaný

necitumumab/IMC-11F8 je další zkoumaný lék ve 3. fázi klinické studie v kombinaci s FOLFOX-6. b) LÉKY V 1. FÁZI VÝZKUMU UČINKUJÍCÍ NA EGFR Zalutumumab je monoklonální protilátka proti EGFR, která zatím prokazuje dobré výsledky v testech u pacientů s karcinomem hlavy a krku. Probíhá také testování zalutumumabu v kombinaci s irinotekanem u pacientů s metastazujícím KRK. Dalším zkoušeným lékem je inhibitor EGFR-TKI a HER2. Mimo pokusy s léčbou KRK se také hodnotí jeho účinnost u rakoviny prsu. Nimotuzumab je lidská monoklonální protilátka testovaná v Číně v kombinaci s irinotekanem u metastazujícího KRK bez mutace v genu KRAS. c) INHIBITORY RAS/RAF/MAPK DRÁHY V klinickém pokusu je několik látek cílených na inhibici některé z komponent Ras/Raf/MAPK signální dráhy. Jsou důleţité převáţně díky časté

37

mutaci v genech BRAF a RAS, které podmiňují resistenci vůči cetuximabu. Jeden takový inhibitor RAF je látka zvaná BMS-908662. U pacientů s KRAS mutací se testuje další látka, MSC 193639B. Jedná se o MEK inhibitor a zkouší se jeho účinnost v kombinaci s FOLFORI. Inhibitor MEK1/MEK2 selumetinib se testuje u KRK, melanomu a hepatocelulárního karcinomu. Látka PLX 4032/vemurafenib je inhibitor V600E mutace BRAF kinázy. Několik studií ukázalo slibné účinky u maligního melanomu a zkouší se také u pacientů s KRK, kteří mají také tuto BRAF mutaci. Dalším inhibitorem této Ras/Raf/MAPK dráhy je Sorafenib, v současnosti pouţívaný při léčbě rakoviny ledvin a ve výzkumu mnoha tumorů, mezi nimi i KRK. d) INHIBITORY PI3K – AKT Mezi inhibitory této cesty patří MK-2206, coţ je současně inhibitor Akt i RAS/MAPK dráhy. Everolimus je léčivo uţívané při terapii karcinomu ledvin a testuje se i pro léčbu metastatického KRK, kterým selhala léčba cetuximabem a panitumumabem (Merla and Goel 2012).

38

5.9. CYTOCHROM P450 Výskyt kolorektálního karcinomu je ovlivněn i exogenními faktory. Významnou roli hrají cytochromy P450 (CYP), enzymy, které mohou aktivovat prokarcinogeny spojené s KRK (Gervasini, de Murillo et al. 2010). Cytochromy P450 se účastní metabolismu dvou třetin klinicky uţívaných léků. Jedná se o monooxygenázy a mimo léčiva oxidují i další endogenní sloučeniny, mastné kyseliny, vitamíny, steroidy, ale také environmentální polutanty a karcinogeny (Hanzawa, Sasaki et al. 2008) (Li, Tang et al. 2009). Polymorfismus těchto enzymů často ovlivňuje reakci organismu na léčivo. CYP mohou být léčivy inhibovány nebo naopak indukovány. Dochází k významným interakcím vedoucím k neţádoucím účinkům nebo k selhání léčby. Doposud je známo u člověka 57 CYP enzymů. Mezi hlavní patří CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9 a CYP 2C19. Funkce některých CYP enzymů je prozatím nejasná, jsou nazývány tzv. ,,orphan“ cytochromy (Stark and Guengerich 2007). CYP

rodina

patří

k

hemovým

enzymům

a

vyskytuje

se

zejména

v endoplazmatickém retikulu jater. Byl ovšem zaznamenán i jejich výskyt mimo játra a to v respiračním a trávicím traktu. Mimojaterní výskyt a další pozitivní vlastnosti, jako je jejich schopnost aktivace i inaktivace protirakovinných léčiv, je nominoval na potenciální cíl terapie (Hanzawa, Sasaki et al. 2008). Jednou z moţností je pouţití při gene-directed enzyme prodrug therapy (GDEPT), kdy je cílem vpravit gen enzymu do nádorové tkáně. Produkovaný enzym je zde pak schopen selektivně přeměnit neškodnou látku v cytotoxickou (Yakkundi, McErlane et al. 2006). Například vloţení CYP2B6 do buněk 9L gliosarkomu, který následně mění prodrug cyklofosfamid v cytotoxický metabolit, který ničí zejména nádorovou tkáň v játrech. Několik CYP se totiţ exprimuje ve vyšší míře u některých karcinomů, např. CYP4Z1 je zvýšen u rakoviny prsu (Rieger, Ebner et al. 2004). Tento efekt byl také nalezen u KRK. Lze zde najít vyšší hladiny CYP2W1, CYP1B1, CYP2S1, CYP2U1, CYP3A5 a CYP51 (Kumarakulasingham, Rooney et al. 2005).

39

Obr. 10 Schéma metabolismu xenobiotik za účasti enzymů metabolizujících xenobiotika (XME). Celý proces se většinou skládá ze dvou fází. V I. fázi, dochází k funkcionalizaci pomocí oxidace ze 70 – 80 % zprostředkovanou CYP enzymy ze skupiny 1,2,3 a 4. Můţe docházet jak k deaktivaci, tak k další aktivaci xenobiotika. Ve II. fázi dochází ke konjugaci s látkami, jako je například glukoronid, acetát, metyl, sulfát, glycin a další. Cílem je získat hydrofilní produkt, který by byl snáz vyloučen a proces detoxikace by tak byl zakončen. Xenobiotika reagují s receptory XME a regulují tak expresi XME genů. Obr. převzat z (Nebert and Dalton 2006)

5.9.1 Cytochrom P450 a jeho role v karcinogenezi Cytochromy P450 mohou být do procesu karcinogeneze zapojeny několika způsoby. Například díky jejich hlavnímu úkolu detoxikaci. Při přeměně xenobiotika na konjugovaný hydrofilní produkt můţe vznikat řada reaktivních intermediátů. Tyto se pak mohou vázat na nukleové kyseliny a jiné molekuly a způsobit tak poškození DNA, bílkovin i lipidů (Obr. 10). Poškozená DNA dál způsobuje dysregulaci řídících signálů a ústí aţ v hypermutabilitu, nestabilitu genomu a iniciaci tvorby tumoru. Exprese genů kódujících CYP můţe ovlivnit metabolismus kyseliny arachidonové a zasahovat do signálních drah jejích produktů. Můţe tak vyvolat zánět, který se můţe stát iniciálním krokem tumorgeneze. Zapojení různých členů rodiny P450 do procesu karcinogeneze závisí do jisté míry na variantách genů pro tyto enzymy i genů zapojených do určitých signálních drah (Nebert and Dalton 2006). Vědci se snaţí pochopit princip zapojení CYP do procesu karcinogeneze a zjistit asociaci mezi jejich aktivitou a mírou rizika vzniku rakoviny jiţ od 70. let minulého století (Kouri, McKinney et al. 1982). Ţivotní styl, kouření, sloţení stravy, alkohol, to vše jsou faktory, které mohou reagovat s genetickými faktory. Kaţdý jedinec nese jiné 40

riziko na jiné onemocnění. Díky pokrokům v molekulární biologii se ví, ţe metabolismus xenobiotik je ovlivňován některými variabilitami v genech genů kódujících xenobiotika metabolizující enzymy. Mnoho studií se zabývá právě mírou asociace rizika rakoviny a přítomností polymorfismů (Kiyohara 2000). Prvotní informace byly odhaleny při pozorování závislosti mezi zvýšenou aktivitou benz(a)pyren hydroxylázy (CYP1A1) u kuřáků a vyšším výskytem rakoviny plic (Kouri, McKinney et al. 1982). U stejného typu rakoviny, tedy u karcinomu plic, se také dokázala souvislost mezi fenotypem CYP2D6 a zvýšeným rizikem rakoviny. Tento enzym má dosud přes 80 známých alel, které ústí do 4 fenotypů. Kaţdá tato varianta je zodpovědná za rozdílný metabolismus léků. Fenotyp nazvaný pomalý metabolizátor (poor metabolizer, PM), vykazuje sníţený metabolismus léků, a proto vyţaduje niţší dávky léčiva, aby se předešlo intoxikaci organismu (Teh and Bertilsson 2012). Genetický polymorfismus genu CYP1A1 je spojen s vyšším rizikem rakoviny prostaty (Ding, Xu et al. 2013), rakoviny plic (Ji, Wang et al. 2012), rakoviny kolorekta (Jin, Hu et al. 2011) i hlavy a krku (Liu, Wu et al. 2013). Variantní alely spojeny s vyšší náchylností k rakovině mají i další geny jako například CYP1B1, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4, CYP2A6 a CYP2B6. Díky epidemiologickým studiím je známá asociace mezi rozdílnými fenotypy-genotypy CYP1, CYP2, CYP3, CYP4 a určitým typem rakoviny vyvinutým na základě vystavení environmentálních faktorů. Avšak přesné karcinogenní látky a mechanismy nejsou dosud známy (Nebert and Dalton 2006). Většina prokarcinogenních xenobiotik patří k velmi hydrofobním látkám (arylaminy, alkyl-aminy, heterocyklické aminy, polyhalogenované aromatické uhlovodíky, polycyklické aromatické uhlovodíky). Jsou pak vylučovány za účasti enzymů patřících do skupiny CYP1, zejména CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 (Nebert, Dalton et al. 2004). Polyhalogenované aromatické uhlovodíky mohou ovlivňovat CYP1 geny. Mají vysokou afinitu k arylovaným uhlovodíkovým receptorům. Pomocí nich dochází pak ke zvýšené expresi CYP1 genů, mohou dále reagovat i s jinými transkripčními faktory a ovlivňovat tak geny zapojené do buněčného cyklu a apoptózy (Nebert and Dalton 2006). Genetický polymorfismus CYP genů můţe být také zapojen do odlišností v léčbě. Příkladem můţeme uvést karcinom prsu a jeho léčbu tamoxifenem. Tento lék je v těle metabolizován CYP2D6 na účinnou látku endoxifen. Ukázalo se však, ţe polymorfismus CYP2D6 ovlivňuje farmakokinetiku tamoxifenu (jeho aktivaci na účinný endoxifen) a u 5 aţ 7 % populace způsobuje niţší účinek tohoto léku a horší 41

výsledek u léčby pacientek. Proto se v současné době zavádí CYP2D6 genotypizace k zajištění účinnosti léčby (Vianna-Jorge, Festa-Vasconcellos et al. 2012) (Walko and McLeod 2012).

5.9.2 Vyuţití CYP v protirakovinné terapii Tkáňově specifická exprese některých enzymů z CYP rodiny dává předpoklad pro jejich vyuţití v cílené terapii. Například CYP 17 a CYP 19 se vyskytují ve varlatech, vaječníkách a nadledvinách (Bruno and Njar 2007). A stejně tak i další členové z rodin CYP1, CYP2 a CYP3 byly prokázány mimo játra. Zejména pak CYP1B1 a CYP2W1 se vyznačují tumor specifickou expresí (Murray, Taylor et al. 1997; Karlgren, Gomez et al. 2006). Snaha vědců je vyuţít této vlastnosti a pouţít tyto enzymy jako cíle v terapii a prevenci, kdy je zde moţnost působit na ně malými přírodními či syntetickými molekulami. Pro vývoj těchto léků - molekul je však nutnost znát dobře enzymové substráty, struktury i mechanismus účinku daného enzymu. Strategií vyuţití CYP pro léčbu je několik. Mohou se vyvinout molekuly, které by inhibovaly tyto enzymy a poškozovaly buňky odebráním jejich přirozené funkce. Anebo mohou být pouţity jako aktivátory prodrug, případně mohou být cílem imunitní odpovědi. (McFadyen, Melvin et al. 2004). Za velmi výhodné se zdá pouţití inhibice CYP v léčbě hormon-dependentních nádorů. Tak například rozvoj karcinomu prostaty souvisí s produkcí testosteronu a jeho inhibice se pouţívá jako standardní léčba. Potlačením CYP17 lze docílit blokace tvorby testosteronu. K tomuto účelu byla testována antifungální látka ketokonazol, inhibitor několika CYP. Bohuţel díky ovlivnění více CYP docházelo k toxicitě, a proto se hledají další látky (Trachtenberg, Halpern et al. 1983). Na stejném principu, inhibice CYP19, potenciálně funguje i blokace estrogenu u hormon-dependentního karcinomu prsu (Bruno and Njar 2007). K pouţití v cílené terapii se zdá být vhodný člen CYP1 skupiny a to CYP1B1. Účastní se aktivace několika karcinogenů, byla zjištěna souvislost mezi jeho polymorfismy a vyšším či niţším výskytem některých nádorů (Shimada, Hayes et al. 1996) (Bruno and Njar 2007). Hraje roli při metabolismu estradiolu a zdá se, ţe i u estrogen – spojené tumorgeneze. Metabolit estradiolu vzniklý reakcí s CYP1B1 má

42

schopnost vázat se na DNA a působit mutagenně. Z tohoto důvodu by mohla vzniknout chemoprevence inhibicí CYP1B1. Tento enzym se také účastní přeměny resveratolu na protirakovinně působící látku piceatannol, ale jeho působení je pouze omezené a proto se hledají další látky s podobným, ale silnějším účinkem (Chun and Kim 2003). Dalším nadějným CYP je nedávno objevený CYP2W1, který se vyskytuje v kolorektální a nadledvinové tumorové tkáni. Zatím bohuţel máme omezené informace o jeho vlastnostech. 5.9.3 Cytochrom P450 2W1 CYP 2W1 patří k nově objeveným členům rodiny CYP450. CYP 2W1 je jedním z mála CYP, které nejsou exprimovány v játrech (Girault, Rougier et al. 2005). Ve vyšší míře je tento protein exprimován v lidské fetální tkáni a také v nádorové tkáni (Karlgren, Gomez et al. 2006). Lidská CYP2W1 mRNA byla nalezena v malém mnoţství v nádorové tkáni vzorků z karcinomů močového měchýře, prsu, jater, pankreatu, ţaludku a štítné ţlázy. Nejvíce se však vyskytuje u kolorektálního karcinomu, jeho exprese byla přítomna u 78 % KRK (Karlgren, Gomez et al. 2006). CYP2W1 byl nalezen v myších embryích, ale u dospělých jedinců přítomen nebyl. Tento fakt naznačuje roli tohoto enzymu u fetálního střeva a poté je jeho exprese inhibována a aktivní je opět aţ v tumorové tkáni (Choudhary, Jansson et al. 2005). Část sekvence genu CYP2W1 byla zaznamenána uţ v roce 2000 v cDNA knihovně lidské hepatocelulární buněčné linie HepG2. (Karlgren, Miura et al. 2005). Exprese genu CYP2W1 je řízena epigenetickým mechanismem metylací CpG ostrůvku na přechodu exon 1 - intron 1. Obecně je známo, ţe hypometylace je spojována s genovou nestabilitou a můţe vyústit v karcinogenezi (Gomez, Karlgren et al. 2007). Tento mechanismus se projevil také ve spojení s enzymy skupiny cytochromů P450. Například hypometylace CYP1B1 je spojována s jeho nadměrnou expresí u karcinomu prostaty (Tokizane, Shiina et al. 2005). Podobný princip se objevil také u KRK. Našla se souvislost mezi hypometylací genu a zesílenou expresí CYP2W1 v kolorektální tkáni (Gomez, Karlgren et al. 2007). Edler a kol. ukázali na 162 pacientech spojitost mezi zvýšenou expresí CYP2W1 a horším průběhem onemocnění. Tyto poznatky naznačovaly pouţití CYP2W1 k nezávislému hodnocení prognózy pacientů s KRK (Edler, Stenstedt et al. 2009). Nedávno svoji hypotézu potvrdili na rozsáhlejší skupině pacientů s KRK. Navíc prokázali, ţe CYP2W1 je ve tkáni

43

exprimován rovnoměrně, coţ by bylo další pozitivum pro pouţití CYP2W1 v cílené terapii (Stenstedt, Hallstrom et al. 2012). Protoţe je CYP2W1 poměrně nově objevenou molekulou, nejsou dosud známy všechny vlastnosti a fyziologické funkce, proto se stále povaţuje za ,,orphan“ enzym. Ví se, ţe CYP2W1 je zapojen do metabolismu různých exogenních i endogenních substrátů v mikrozomech a na bakteriální membráně. Jako enzym se účastní například biotransformace arachidonové kyseliny, benzfetaminu a indolu. Můţe také katalyzovat aktivaci několika karcinogenů, včetně polycyklických uhlovodíkových diolů (Wu, Sohl et al. 2006) (Gervasini, de Murillo et al. 2010). Ke zkoumání enzymových substrátů byla pouţita zkrácená forma CYP2W1 exprimovaná v Escherichii coli. Moţnými substráty se ukázaly indoly a aflatoxin 1, nicméně reakce byla velmi slabá (Wu, Sohl et al. 2006). Dle nedávného výzkumu substrátové specifity tohoto enzymu byly objeveny další moţné substráty náleţící do skupiny lysofosfolipidů. CYP2W1 byl inkubován s extrakty z tkáně

KRK a ukázalo

lysofosfatidyletanolaminem,

se, ţe reaguje s lysofosfatidylcholinem,

lysofosfatidylinositolem,

lysofosfatidylserinem,

lysofosfatidylglycerolem a lysofosfatidovou kyselinou (Xiao and Guengerich 2012). CYP2W1 je jedním z dalších CYP, který má schopnost účastnit se metabolismu banoxantronu (AQ4N) (Gomez 2008). Látka AQ4N je neaktivní prodrug, která se metabolizuje přes AQ4M

na konečný produkt AQ4. Působí pouze v hypoxických

buňkách, kde inhibuje topoizomerázy a spouští sled reakcí vedoucích aţ k buněčné smrti (Atkinson, Loadman et al. 2007). Analýzou normální i nádorové kolorektální tkáně se prokázala hypotéza N-glykosylace CYP2W1 v místě Asn177. Zatím je to jediná známá ukázka glykosylace u lidského P450, protoţe jsou většinou orientovány směrem k cytoplazmě, coţ jim neumoţní styk s glykosyltransferázami umístěnými v endoplazmatickém retikulu. Dle dalšího výzkumu byla dokázána přítomnost CYP2W1 také na plazmatické membráně (asi 8 %) a to v glykosylované i neglykosylované formě (Gomez, Nekvindova et al. 2010). Enzym CYP2W1 se zdá být vhodný pro vývoj cílené terapie. Má totiţ schopnost aktivovat prodrug v cytotoxický metabolit. A jelikoţ se jeho výskyt omezuje skoro jen na tumorovou tkáň, bude snad v budoucnu moct být pouţit k protirakovinné terapii jako cytostatický prodrug nebo snad i jako specifická protilátka (Gomez, Nekvindova et al. 2010).

44

Gen CYP2W1 o délce 5,5kb leţí na chromozomu 7p22.3 a obsahuje 9 exonů (Obr. 11 a 12). Nejvyšší podobnost na proteinové úrovni vykazuje s CYP2D6 (42 %) a s CYP2S1 (40 %). Byl také nalezen u jiných ţivočišných druhů. S krysím genem vykazuje 78 % totoţnost a s myším 66 % (Karlgren, Gomez et al. 2006).

Obr. 11 Schematický obrázek chromozomu 7 a umístění genu CYP2W1 (dbSNP 2013).

Obr. 12 Grafické znázornění genu CYP2W1 a jeho 9 exonů (dbSNP 2013).

Pro některé CYP je typická velká interindividuální rozmanitost. Mezi tyto patří i CYP2W1. Doposud bylo nalezeno několik nukleotidových polymorfismů (SNP) jak v intronové, tak v exonové oblasti. Genetická variabilita tohoto genu můţe ovlivnit jeho biotransformační schopnosti a to se můţe odrazit na náchylnosti pacienta k rakovině. SNP mohou být zodpovědné za změnu funkce proteinu, jeho skládání, sestřih mRNA, její stabilitu a další (Gervasini, de Murillo et al. 2010) (Gomez 2008). Některé variantní alely ukázaly spojitost s vyšším rizikem kolorektální rakoviny. Ačkoliv bylo zveřejněno mnoho SNPů, pouze některé mají schopnost změnit strukturu proteinu a případně jeho aktivitu. Tyto SNP nazýváme nesynonymní (tabulka 6 a 8). V současné době je známo dle NCBI dnSNB databáze 252 polymorfismů CYP2W1 (dbSNP 2013).

45

Alela

Protein

změna nukleotidu, cDNA

změna nukleotidu, gen

efekt

CYP2W1*1A CYP2W1*1B CYP2W1*2 CYP2W1*3 CYP2W1*4

CYP2W1.1 CYP2W1.1 CYP2W1.2 CYP2W1.3 CYP2W1.4

beze změny 166C>T 166C>T; 541G>A 166C>T; 173A>C 1294G>A

beze změny 166C>T 166C>T; 2008G>A 166C>T; 173A>C 5432G>A

žádný žádný A181T E58A V432I

CYP2W1*5

CYP2W1.5

1294G>A; 1446G>C

5432G>A; 5584G>C

CYP2W1*6

CYP2W1.6

1463C>T

5601C>T

V432I; Q482H P488L

Tabulka 6 Nomenklatura alel genu CYP2W1. Jako první bývá označována alela referenční (,,normální“). Další varianty mohou někdy působit rozdíly v metabolismu, zvýšenou či naopak sníţenou aktivitu enzymu. Vlastnosti alel CYP2W1 jsou ve zkoumání (Hanzawa, Sasaki et al. 2008) (Gervasini, de Murillo et al. 2010).

RS označení

Změna nukleotidu

MAF

změna AK

RS označení

změna nukleotidu

MAF

změna AK

rs202178680

A/G

G=0.001/1

Ile243Val

rs149976257

C/T

T=0.003/7

Pro464Leu

rs201772103

C/G

G=0.001/3

Ile202Met

rs149240463

A/G

A=0.001/3

Arg328His

rs201717553

A/G

A=0.001/1

Asp395Asn rs148638638

A/T

neznámé

Phe115Ile

rs201684384

G/T

neznámé

Leu451Arg rs146802034

C/G

neznámé

Met206Ile

rs201612311

A/G

A=0.001/2

Gly376Ser rs145537266

C/G

G=0.001/1

His254Gln

rs200766362

A/G

A=0.001/3

Gly461Asp rs145255379

A/G

A=0.005/10 Asp468Asn

rs200715910

C/T

neznámé

Arg437Cys rs143729233

A/G

neznámé

Val233Ile

rs200641657

A/G

neznámé

Arg366His rs143596553

C/G

neznámé

Gly200Ala

rs200427519

A/G

neznámé

Ala103Thr rs142970046

A/G

neznámé

Asn406Asp

rs200386977

C/T

neznámé

Arg420Trp rs141228662

C/T

T=0.001/1

Pro142Leu

rs200372185

C/T

T=0.001/1

Arg337Trp rs140129057

A/G

neznámé

Ala428Thr

rs199737246

C/T

T=0.001/1

Pro167Leu rs139268609

C/G

rs199680587

G/T

G=0.001/1

Leu351Arg rs138410337

C/T

neznámé

Thr298Met

rs199628199

A/G

G=0.001/1

rs117826462

C/G

G=0.003/6

Leu183Val

rs188617371

C/T

T=0.001/2

Arg241Cys rs113803206

A/C

neznámé

Pro332Thr

rs186092597

C/T

T=0.001/2

Pro316Leu

rs79364415

C/T

T=0.001/2

Ala282Val

rs151057365

A/G

neznámé

Arg241His

rs78873069

A/G

A=0.014/31

Val432Ile

rs150742176

A/T

neznámé

Val143Glu

rs78447922

C/T

T=0.001/2

Arg251Trp

rs3808348

A/G

T=0.22/479 Pro488Leu

rs61746347

A/G

A=0.023/50

Arg186His

rs3735684

C/T

A=0.06/138

Tyr63Cys

C=0.016/34 Val462Leu

Ala181Thr

Tabulka 8 Přehled SNPů genu CYP2W1 a příslušných záměn aminokyselin v proteinu CYP2W1. Databáze NCBI dbSNP uvádí 252 dosud známých polymorfismů, které se vyskytují v exonové i intronové oblasti (dbSNP 2013). Tato tabulka obsahuje pouze nesynonymní polymorfismy, které způsobují substituci aminokyseliny. Šedě jsou označeny námi měřené SNP.

46

Dosud se studiem výskytu alel genu CYP2W1 věnovaly dvě studie. Na území Japonska byly určeny frekvence pro všechny do té doby popsané alely (Obr. 13) (Hanzawa, Sasaki et al. 2008). Později provedla španělská skupina studii 3 alel v jejich populaci (tabulka 7). Ukázalo se, ţe frekvence alel se u obou populací liší. Například alela CYP2W1*6 měla v Japonské studii frekvenci 37 %, ale ve druhé studii byla přítomna jen u 14 % (Hanzawa, Sasaki et al. 2008) (Gervasini, de Murillo et al. 2010). Na základě studie Gervasiniho a kol. se předpokládá spojitost alely CYP2W1*2 s vyšším rizikem kolorektálního karcinomu. Frekvence alely CYP2W1*6 byla také zkoumána v rámci vědecké skupiny Karolinska institutu ve Švédsku (Obr. 14) (Gomez 2008).

Obr. 13 Frekvence alelických variant v Japonské populaci. Schéma ukazuje wild-type alelu genu CYP2W1 a 6 jejích variant (Hanzawa, Sasaki et al. 2008). Měřená skupina jedinců zahrnovala 200 Japonců. Nejvíce byla zastoupena CYP2W1*1A (26 %), CYP2W1*1B (32%) a alela CYP2W1*6 (37 %). Ostatní alely se vyskytovaly jen v malém mnoţství, jmenovitě: CYP2W1*2 (0,5 %), CYP2W1*3 (0,5 %), CYP2W1*4 (0,8 %) a CYP2W1*5 (0,3 %).

47

RS číslo bez RS čísla rs3735684 rs3808348

alela

KRK (%, 95)

Kontroly (%, 95)

173A

201 (67,0; 61,7-72,3)

352 (66,9; 62,9-70,9)

173C

99 (33,0; 27,7-38,3)

174 (33,1; 29,1-37,1)

541G

287 (95,7; 93,4-98,0)

478 (90,9; 88,4-93,3)

541A

13 (4,3; 2,0-6,6)

48 (9,1; 6,7-11,6)

1463C

257 (85,7; 81,7-89,0)

462 (87,8; 85,0-90,6)

1463T

43 (14,3; 10,4-18,3)

64 (12,2; 9,4-15,0)

OR (%, 95)

p

q

1,00 (0,74-1,36

0,981

0,654

2,22 (1,2-4,12)

0,011

0,022

0,83 (0,55-1,25)

0,373

0,373

Tabulka 7 Frekvence alel CYP2W1 ze studie Gervasiniho a kol. Studie se účastnilo 403 jedinců (z toho150 pacientů s KRK). Jejich DNA byla zkoumána na přítomnost 5 nesynonymních SNP, ale dva v populaci nebyly nalezeny (CYP2W1*4 a CYP2W1*5). Polymorfismus 173C se vyskytoval u 33 %, CYP2W1*6 u 13%. Alela CYP2W1*2 měla rozdílný výskyt u pacientů s KRK a u kontrol. Na základě toho byla zjištěna souvislost alely 541A/G s vyšším rizikem KRK (Gervasini, de Murillo et al. 2010). KRK: kolorektální karcinom; OR: poměr šancí (odds ratio); p-hodnota, q-hodnota

Obr. 14 Alelická a genotypická frekvence CYP2W1*6 Švédů, Španělů, Tanzánců a Číňanů. Data byla získána v rámci vědecké skupiny Karolinska institutu ve Švédsku. (Gomez 2008).

48

6. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

49

6.1. PARAMETRY STUDIE 6.1.1 Výběr pacientů a kontrolní skupiny Studovaná skupina byla sloţena z pacientů Masarykova onkologického ústavu v Brně s nově diagnostikovaným sporadickým kolorektálním karcinomem v časovém rozmezí od ledna 2008 do prosince 2010. Diagnóza byla potvrzena pomocí histologie. Pacientská skupina se skládala ze 197 jedinců s průměrným věkem 63 ± 9 let (105 muţů, 92 ţen). Kontrolní skupina byla sloţena z 202 dobrovolných dárců krve s podobnou věkovou charakteristikou, 65 ± 14 let (93 muţů, 109 ţen). Všichni byli bez předešlé historie jakéhokoliv typu rakoviny a bez přítomnosti rakovinných symptomů, bez anémie. V tomto případě nebyl kolorektální karcinom vyloučen pomocí kolonoskopie, protoţe se jedná o invazivní metodu. Všichni členové studie byli z bělošské populace. Studie byla povolena nemocniční etickou komisí a všichni pacienti i kontrolní subjekty podepsali informovaný souhlas.

6.2.PŘÍPRAVA VZORKŮ Krevní vzorky všech pacientů byly uchovávány při teplotě -80˚C. Izolace DNA byla provedena pomocí kitu QIAamp® DNA mini Kit (QIAGEN). Vzorky byly vytemperovány na laboratorní teplotu. Do 1,5 ml zkumavky bylo napipetováno 200 µl nesráţlivé krve (EDTA). Ke vzorku bylo přidáno 20 µl QIAGEN Proteázy a 200 µl AL pufru. Následně byla celá směs zvortexována po dobu 15s a inkubována po 10 minut při 56˚C. Rychlým stočením byly odstraněny kapky z víčka. Ke vzorku bylo přidáno 200 µl 96-100% etanolu a opět zvortexováno a stočeno. Poté se vzorek opatrně přelil do kolonky se sběrnou tubou a byl centrifugován 1 minutu při 8 000 ot/min. QIAamp kolonka byla přemístěna do nové čisté 2ml sběrné tuby. Do kolonky bylo přidáno 500 µl AW 1 pufru a centrifugováno 1 min při 8 000 ot/min. Kolonka byla opět přemístěna do nové, čisté 2ml sběrné tuby. Následně bylo do kolonky přidáno 500 µl AW2 pufru a kolonka byla centrifugována 3 minuty při 14 000 ot/min. Poté byla kolonka přemístěna do čisté 1,5 ml zkumavky a DNA byla eluována 150 µl AE pufru. Směs byla inkubována po dobu 1 minuty při laboratorní teplotě a poté 1 minutu centrifugována při 8 000 ot/min. Nakonec byl eluát důkladně zvortexován. Orientačně, průměrná koncentrace vzorků byla 138 ng/µl a čistota 1,9 (A260/280). Vzorky byly skladovány aţ do analýzy při -20˚C. 50

6.3. ALELICKÁ DISKRIMINACE 6.3.1 Princip metody Alelická diskriminace slouţí k detekci specifických mutací a nukleotidových polymorfismů bez pouţití genového sekvenování. Metoda zahrnuje real-time PCR adaptovanou pro analýzu polymorfismů. Jedná se o systém pouţívající dvoubarevnou assay. Pro kaţdý polymorfismus je navrţen pár amplifikačních primerů a pár fluorescenčních značek (sond), jedna sonda pro wild-type alelu a druhá odpovídající nukleotidové sekvenci se SNP. Kaţdá sonda nese na 5´ konci jinou fluorescenční značku (zde konkrétně FAM/VIC) a na 3´ konci zhášeč. Pokud je sonda vcelku, fluorescence barviva je tlumena navázaným zhášečem. Během PCR nasednou primery a sondy na odpovídající sekvence DNA. Při amplifikaci je sonda rozštěpena polymerázou a tím dojde k oddělení zhášeče od fluorescenční značky a nárůstu fluorescence (Obr. 15). Aby se zabránilo amplifikaci od místa sondy je 3´ konec sondy blokován. Tento proces se opakuje kaţdý cyklus a zároveň je měřen nárůst fluorescence obou barviv (McGuigan and Ralston 2002). U homozygotů bude nárůst fluorescence patrný na jednom kanálu (barvě), u heterozygotů na obou kanálech.

Obr. 15 Schéma navázání sondy na DNA a následný nárůst fluorescence.

51

6.3.2 Pracovní postup Identifikace alelických variant CYP2W1 byla provedena metodou alelické diskriminace na přístroji Rotor-Gene 6000 (Corbett Research) a data byla vyhodnocena pomocí Rotor-Gene 6000 software. V metodě byly pouţity sondy TaqMan® SNP Genotyping Assays pro alely CYP2W1*2 a CYP2W1*6. Vzorky DNA byly rozmraţeny při laboratorní teplotě, zvortexovány a stočeny. Analýza byla připravena v předchlazených zkumavkách v 15 µl reakčním objemu.

alela

sekvence [VIC/FAM]

MAF

CYP2W1*2 CTCCCTCCAATATCACCTTC[A/G]CGCTCCTCTTCGGCCGCCGATTTGA A=0,063/138

assay č. 4656349_1

CYP2W1*6 CCAGGCCCTGTGTGCGGTGC[C/T]CAGGCCCTAGGAGCTCCCCCAGCC T=0,219/479 186550924_1

Tabulka 9 Charakteristika TaqMan® SNP Genotyping assay

Kaţdá reakce obsahovala 1X TaqMan® Genotyping Master mix (7,5 μl), 1X TaqMan® SNP Genotyping assay 40X (0,375 μl) a přibliţně 100 ng DNA. Vzorky DNA byly rozmraţeny, zvortexovány a stočeny. V kaţdém běhu byla zařazena negativní kontrola (NTC no template control), obsahující pouze vodu místo DNA. Připravené mikrozkumavky byly zavíčkovány, umístěny do 72místného rotoru a vloţeny do přístroje RotorGene 6000 (Corbett Research). Teplotní profil byl 2 min při 50 ˚C, 10 min. při 95˚C, 50 cyklů při 92 ˚C po 15 s a 60˚C po 90 s. Analýza byla zakončena 10 min při 25˚C. Real-time detekce fluorescenčního záření byla provedena v průběhu 60˚C kroku. Genotypy jednotlivých vzorků DNA byly přiřazeny automaticky softwarem Rotor-gene 6000. Genotypy byly rozlišeny na základě intenzit fluorescenčních barviv FAM a VIC v 50 cyklech. Přičemţ VIC barvivo náleţí homozygotům s alelou 1, FAM barvivo homozygotům s alelou 2 a signál obou barviv značí heterozygota.

Obr. 16 Teplotní profil alelické diskriminace genu CYP2W1

52

Obr. 17 Rotor-gene 6000 software. Obr. ukazuje výstup z analýzy alelické diskriminace. Kaţdému vzorku náleţí dvě křivky – pro mutovanou alelu křivka s krouţky a pro normální alelu bez krouţků. Významné jsou signály přesahující pozadí (threshold). Na obrázku můţeme například vidět 2 nejvýše postavené křivky s krouţky naznačující přítomnost dvou mutovaných alel ve vzorku (příslušné signály druhého kanálu jsou v pozadí).

53

6.4. VÝSLEDKY Všechny DNA pacientů i zdravých kontrol byly analyzovány metodou alelické diskriminace na přítomnost dvou nesynonymních polymorfismů genu CYP2W1. Tabulka 10 popisuje získaná data: polymorfismus CYP2W1*2, alela 541A byla nalezena ve stejném zastoupení u pacientů s kolorektálním karcinomem i u zdravých kontrolních subjektů (graf 2), její frekvence byla 0,074 (7%). Polymorfismus CYP2W1*6 (graf 3), alela 1463T byla nalezena ve vyšším počtu u zdravých kontrol (21 %), u pacientů s kolorektálním karcinomem se vyskytovala u 18 %. Její výsledná frekvence byla 0,195 (20 %). K určení asociace mezi výskytem jednotlivých alel a onemocnění jsme pouţili chí-kvadrát test (tabulka 12, 13), výpočet pro poměr pravděpodobnosti (relativní risk, RR) a výpočet pro poměr šancí (OR). Na základě provedení těchto testů jsme nezjistili ţádnou statisticky významnou spojitost mezi CYP2W1*2, CYP2W1*6 a rizikem kolorektálního karcinomu.

Graf 1 Celkový výskyt alel v testovaných vzorcích DNA. Graf zobrazuje genotypové rozdělení v celé zkoumané skupině.

CYP2W1*2 CYP2W1*6

Alela

KRK, n (%)

541G

356 (93)

Kontroly, n (%) 268 (93)

541A

30 (7)

22 (7)

1463C

313 (82)

266 (78)

1463T

67 (18)

72 (21)

RR (95%)

0,90 (0,681-1,200) 1,03 (0,58-1,81) 1,04 (0,996-1,086) 0,79 (0,55-1,16)

Tabulka 10 Alelické frekvence CYP2W1 u pacientů a kontrol. n: počet alel, RR: relativní risk, OR: poměr šancí (odds ratio)

54

OR (95%)

alela

kontroly, n (%)

KRK, n (%)

Ulc. Kol., n (%)

Crohn, n (%)

WT (GG)

127 (87)

164 (85)

6 (100)

5 (100)

CYP2W1*2 HET (GA)

14 (10)

28 (15)

0

0

MUT (AA)

4 (3)

1 (0,5)

0

0

WT (CC)

107 (63)

127 (67)

3 (60)

2 (40)

HET (CT)

52 (31)

59 (31)

2 (40)

3 (60)

MUT (TT)

10 (6)

4 (2)

0

0

CYP2W1*6

genotyp

Tabulka 11 Genotypové frekvence CYP2W1 u pacientů a kontrol. n:počet; WT: wild-type homozygot; HET: heterozygot; MUT: homozygot s mutantní alelou

alela

počet výskytu znaku

relat. četnost výskytu

G kontrola

254

87,6%

G KRK

328

85,0%

G kontrola

14

4,8%

A kontrola

14

3,6%

G KRK

28

9,7%

A KRK A kontrola A KRK

28 8 2

7,3% 2,8% 0,5%

hladina významnosti 0,331 0,438 0,262 0,017 *

Tabulka 12 Výsledek chí-kvadrát testu CYP2W1*2 pro jednotlivé alely.

alela

počet výskytu znaku

relat. četnost výskytu

C kontrola

214

63,3%

C KRK

254

66,8%

C kontrola

52

15,4%

T kontrola

52

13,7%

C KRK

59

17,5%

T KRK

59

15,5%

T kontrola

20

5,9%

T KRK

8

2,1%

hladina významnosti 0,322 0,518 0,486 0,008 **

Tabulka 13 Výsledek testu chí-kvadrát CYP2W1*6 pro jednotlivé alely.

Polymorfismus CYP2W1*2 byl přítomný v homozygotní formě (AA) u 3 % kontrolní skupiny a u 0,5 % pacientů s kolorektálním karcinomem. Heterozygoti (AG) byli zastoupeni 10 % kontrol a 15 % pacientů s KRK. Homozygoti (GG) s wild-type alelou byli v 87% u kontrol a v 85% u pacientů (tabulka 11, graf 2).

55

Dříve publikovaná studie uvádí asociaci alely 541A/G s vyšším rizikem kolorektální rakoviny (Gervasini, de Murillo et al. 2010). V naší populační skupině jsme nenašli ţádnou statisticky významnou asociaci alely 541A/G a kolorektální rakovinou.

Graf 2 Genotypová a alelická frekvence CYP2W1*2.

Polymorfismus CYP2W1*6 byl zastoupen v homozygotní formě (TT) 6 % u kontrolní skupiny a 2 % u pacientů s KRK. Heterozygotní forma (CT) se vyskytovala ve 31 % případů u obou dvou skupin. Wild-type alela (CC) byla přítomna u 63 % zdravých jedinců a u 67% pacientů (graf 3). U alely 1463T byl zjištěn malý rozdíl ve výskytu mezi kontrolní skupinou (vyšší frekvence) a pacientskou skupinou, coţ odpovídá hypotéze, ţe CYP2W1 se účastní kancerogeneze a je tedy ve vyšší míře přítomen ve wild-type (funkční) formě. Data ale nejsou statisticky významná.

Graf 3 Genotypová a alelická frekvence CYP2W1*6.

56

č.vzorku

Diagnóza

c (ng/µl)

A260/280

A260/230

genotyp

č.vzorku

Diagnóza

c (ng/µl)

A260/280

A260/230

genotyp

č.vzorku

Diagnóza

c (ng/µl)

A260/280

genotyp

č.vzorku

Diagnóza

c (ng/µl)

A260/280

A260/230

genotyp

č.vzorku

Diagnóza

c (ng/µl)

A260/280

A260/230

genotyp

Tabulka 14 Souhrnná tabulka výsledků alelické diskriminace pro alelu CYP2W1*2.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 33 34 35 36 37 38

C C C C C KRK KRK C KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK C C C KRK KRK KRK C C KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK

124,8 127,2 133,0 137,8 134,7 143,6 152,3 126,3 131,7 123,0 161,6 143,1 79,3 124,4 55,8 143,0 111,2 147,1 130,6 132,5 131,4 160,4 137,7 149,4 119,8 121,9 104,9 87,7 102,5 80,8 84,5 120,6 109,3 114,8 119,6 159,7

1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 2,0 1,9 2,0 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9

1,8 WT 1,9 WT 1,8 WT 1,8 WT 1,8 WT 1,9 WT 1,9 WT 1,8 HET 1,7 WT 1,8 WT 1,9 MUT 1,8 WT 1,5 WT 1,7 WT 2,0 WT 1,8 WT 1,8 WT 2,1 WT 1,9 WT 1,8 WT 1,9 WT 2,0 WT 2,0 WT 1,9 WT 1,9 WT 1,9 WT 2,2 WT 1,6 MUT 1,5 WT 1,9 WT 2,0 HET 2,1 WT 2,2 WT 2,0 WT 1,9 HET 2,0 WT

74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110

KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK UC KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK C KRK KRK KRK KRK C KRK KRK KRK

63,6 138,9 107,8 87,0 142,3 131,0 134,9 131,8 112,0 78,8 149,8 148,7 152,8 128,1 103,4 80,8 83,7 94,4 136,5 111,7 137,4 57,6 131,1 121,9 144,6 115,7 107,1 131,3 138,9 84,4 131,5 140,7 81,0 107,0 123,9 91,3

1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9

1,3 1,9 1,9 1,3 2,0 1,4 1,7 1,4 1,6 2,2 1,7 1,9 1,8 1,7 2,1 1,5 1,4 1,5 1,6 1,8 1,6 2,2 1,8 1,6 1,7 1,6 1,7 1,8 1,8 1,7 1,6 1,7 2,2 1,9 1,7 1,7

WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT HET WT WT HET HET MUT WT WT WT WT WT WT

147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183

C C C C C C C C C KRK C KRK KRK C KRK KRK KRK KRK KRK KRK C KRK KRK C KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK C

149,3 145,0 129,1 145,9 123,8 76,9 113,2 122,9 128,7 152,3 116,9 58,3 129,9 145,9 130,8 125,6 123,1 131,3 129,6 99,5 97,1 96,4 119,9 55,5 119,8 85,3 123,3 151,5 112,6 137,3 114,4 127,8 142,4 107,4 104,8 110,9

1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 2,0 2,0 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,1 2,0 2,0 1,9 2,0 1,8 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9

WT WT WT WT WT WT WT WT WT HET WT WT WT WT WT HET WT HET WT WT WT WT WT HET WT WT WT WT HET WT WT WT HET WT WT WT

221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 241 242 243 244 245 246 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK C KRK KRK KRK C C KRK KRK CD KRK CD KRK C KRK UC CD UC UC KRK KRK KRK C C C C C C C C

139,9 114,8 127,7 132,6 146,1 89,8 160,6 149,8 159,3 115,7 108,5 154,4 130,8 148,1 103,8 117,9 111,1 115,1 74,3 75,9 56,8 128,1 122,9 79,8 120,3 131,7 143,8 153,4 115,8 147,0 104,3 136,1 98,0 112,0 117,8 130,8

1,8 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,8 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,8

1,5 1,6 1,6 1,6 1,8 1,8 1,7 1,7 1,9 1,5 1,4 1,7 1,6 1,7 1,4 1,5 1,7 1,5 1,3 1,9 1,6 1,5 1,6 1,7 1,4 1,8 1,6 1,7 1,6 1,7 1,6 1,8 1,5 1,6 1,6 1,7

WT WT WT WT WT HET WT HET WT WT HET WT WT HET WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT

294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 459 460 461 462 463 464 465 466 467 468

UC KRK KRK C KRK KRK C C C C C C C C C C C KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK C C C C C C C C C C

134,5 105,8 117,7 127,3 109,2 94,0 151,1 135,1 128,4 118,7 151,0 135,8 124,9 131,3 153,8 122,9 102,2 116,8 105,0 98,3 132,3 55,8 123,1 128,5 126,9 121,7 84,0 135,0 145,0 139,0 109,0 87,0 126,0 110,0 121,0 109,0

1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,8 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9

1,8 1,2 1,6 1,7 1,4 1,3 1,6 1,7 1,6 1,7 1,8 1,7 1,7 1,7 1,8 1,6 1,4 1,5 1,4 1,2 1,6 1,3 1,7 1,7 1,7 1,6 2,0 1,8 1,8 2,0 1,8 1,6 1,7 1,7 1,9

WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT HET WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT HET WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT

1,8

1,3 2,7 1,9

KRK KRK KRK KRK KRK KRK C KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK UC KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK

114,6 78,3 111,7 132,5 156,3 121,6 128,2 97,2 64,7 133,4 75,8 114,0 63,0 83,6 84,6 96,3 106,1 116,7 107,2 86,8 106,8 80,8 138,7 127,8 124,6 92,8 169,6 164,3 139,2 126,5 125,6

1,9 2,1 2,0 2,0 2,0 1,9 2,0 2,0 2,0 1,9 2,0 2,0 2,1 2,1 2,1 2,0 2,0 2,0 1,9 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,1 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8

2,2 1,9 1,9 2,3 2,0 1,8 2,4 2,0 1,6 2,1 1,9 2,1 1,9 2,2 2,1 2,3 2,3 2,2 1,9 1,8 2,5 3,0 2,2 2,3 2,1 2,1 1,7 1,7 1,4 1,3 1,6

WT WT WT HET WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT HET HET WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT HET WT

259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293

C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C KRK C C C KRK KRK

117,4 110,5 61,2 124,1 135,7 114,8 132,7 100,5 136,9 136,5 129,5 132,0 85,5 103,5 119,1 138,5 103,5 146,9 121,0 79,1 108,8 129,6 127,0 136,9 132,1 119,5 146,0 101,8 122,2 114,1 66,7 165,4 108,3 126,9 100,3

1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,8 1,9 1,8 1,8 1,9 1,8 1,8 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,9

1,7 1,6 1,7 1,8 1,7 1,7 1,6 1,6 1,8 1,8 1,6 1,6 1,9 1,6 1,7 1,6 1,7 1,7 1,7 1,7 1,9 1,9 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,6 1,6 1,8 1,9 1,8 1,7 1,3 1,8

WT HET WT WT WT WT HET HET WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT HET HET WT WT WT WT WT HET WT WT WT WT WT WT WT

469 470 471 472 473 474 21TO 22TO 23TO 24TO 25TO 26TO 27TO 28TO 29TO 30TO 51TO 52TO 53TO 54TO 55TO 56TO 57TO 58TO 59TO 60TO 61TO 62TO 63TO 64TO 65TO

58

C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C

genotyp

1,9 2,0 1,9

A260/230

78,3 86,7 124,4

A260/280

KRK C KRK

c (ng/µl)

č.vzorku

184 185 186 187 188 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 218 219 220

Diagnóza

genotyp

genotyp WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT HET WT WT WT WT WT WT WT WT HET HET WT WT WT HET HET WT WT WT WT WT WT

A260/230

A260/230 1,9 2,0 2,3 2,1 1,9 1,6 1,6 2,0 1,6 2,1 2,0 1,7 1,7 1,7 1,8 2,0 2,1 1,6 1,6 1,6 1,9 2,0 2,1 1,6 2,0 1,9 1,9 2,0 2,0 2,2 2,4 2,1 2,1 2,0 1?9

A260/280

A260/280 1,9 1,9 2,0 2,0 2,0 1,9 2,0 2,0 2,0 1,9 1,9 2,0 1,9 2,0 2,0 1,9 2,0 1,9 2,0 1,9 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 1,9 1,9 1,9 2,0 2,0 1,9 1,9 1,9

c (ng/µl)

c (ng/µl)

1,7 1,7 1,4 1,8 1,7 1,6 1,0 1,6 1,5

145,3 111,9 35,8 59,2 144,1 88,9 87,8 109,5 81,7 128,4 129,1 93,6 116,8 98,1 90,6 125,7 120,8 135,3 101,4 123,4 114,5 135,0 173,3 83,4 124,0 109,0 124,5 141,7 126,7 149,8 65,5 152,2 124,3 132,4 110,7

Diagnóza

Diagnóza

1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9

KRK KRK KRK KRK C KRK KRK KRK KRK C C KRK KRK KRK KRK C KRK KRK KRK KRK KRK KRK C KRK C C C KRK C C C C CD KRK C

č.vzorku

č.vzorku

132,9 104,3 105,7 158,5 112,3 93,1 62,7 128,6 126,0

111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146

genotyp

genotyp

C C KRK CD KRK KRK KRK KRK KRK

HET WT MUT WT WT WT HET WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT HET WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT

A260/230

A260/230 1,7 1,5 1,3 1,2 2,1 1,9 1,3 1,6 1,8 1,8 1,8 1,6 1,6 1,7 1,8 1,4 1,6 1,5 1,6 1,6 1,8 1,5 2,0 1,8 1,6

A260/280

A260/280 2,0 1,9 1,9 1,9 2,0 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9

c (ng/µl)

c (ng/µl) 104,7 139,0 122,5 56,2 73,8 126,7 87,9 100,1 135,1 147,4 155,6 137,8 121,9 118,0 132,6 98,1 106,9 130,4 109,5 155,0 126,4 112,3 136,5 109,5 97,6

Diagnóza

Diagnóza KRK KRK KRK KRK C C KRK KRK C KRK KRK KRK KRK KRK C KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK

č.vzorku

č.vzorku 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

137,0 129,0 19,0 128,0 134,0 136,0 23,6 19,3 19,9 11,9 17,6 18,2 17,0 41,3 28,5 30,6 29,1 30,7 29,1 24,6 27,8 33,2 26,1 29,6 24,4 16,9 27,7 19,1 23,0 28,5 30,6

1,9 1,9 2,1 1,9 1,9 1,9 1,8 1,8 1,7 1,8 1,6 1,8 1,8 1,8 1,9 1,8 1,9 1,9 2,0 1,9 2,0 2,0 2,0 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 2,0 1,8

1,9 1,9 1,8 1,9 2,0 2,0 1,5 1,5 1,5 1,3 1,2 1,6 1,4 1,9 1,7 1,6 1,1 1,0 1,7 1,5 1,1 1,8 1,8 1,0 1,5 0,8 1,5 1,8 0,8 1,3 1,3

HET WT WT WT WT HET WT WT HET WT WT WT WT WT WT WT MUT WT HET HET HET WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT

genotyp

č.vzorku

Diagnóza

c (ng/µl)

A260/280

A260/230

genotyp

č.vzorku

Diagnóza

c (ng/µl)

A260/280

A260/230

genotyp

č.vzorku

Diagnóza

c (ng/µl)

A260/280

A260/230

genotyp

č.vzorku

1,9 1,8 1,8 1,8 1,9 1,9 1,8 1,7 1,8 1,9 1,7 1,8 1,5 1,7 2,0 1,8 1,8 2,1 1,8 1,9 2,0 2,0 1,9 1,9 2,2 1,6 1,5 1,9 2,0 2,1 2,2 2,0 1,9 2,0 1,7 1,5 1,3

WT WT HET MUT WT WT WT HET WT HET HET HET HET MUT WT WT HET WT WT WT WT HET HET WT WT WT HET HET WT HET HET HET WT WT WT HET WT

86 87 88 90 91 92 93 94 95 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124

KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK C KRK KRK KRK KRK C KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK C KRK KRK KRK KRK C C KRK KRK KRK

152,8 128,1 103,4 80,8 83,7 94,4 136,5 111,7 137,4 131,1 121,9 144,6 115,7 107,1 131,3 138,9 84,4 131,5 140,7 81,0 107,0 123,9 91,3 145,3 111,9 35,8 59,2 144,1 88,9 87,8 109,5 81,7 128,4 129,1 93,6 116,8 98,1

1,9 1,9 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 2,0 2,0 2,0 1,9 2,0 2,0 2,0 1,9 1,9 2,0 1,9 2,0

1,8 1,7 2,1 1,5 1,4 1,5 1,6 1,8 1,6 1,8 1,6 1,7 1,6 1,7 1,8 1,8 1,7 1,6 1,7 2,2 1,9 1,7 1,7 1,9 2,0 2,3 2,1 1,9 1,6 1,6 2,0 1,6 2,1 2,0 1,7 1,7 1,7

HET WT WT WT WT HET HET WT WT WT WT WT WT MUT HET WT WT WT WT WT WT WT WT WT HET HET HET HET HET HET WT HET WT WT HET WT HET

166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203

KRK C KRK KRK C KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK C KRK C KRK

99,5 97,1 96,4 119,9 55,5 119,8 122,3 85,3 123,3 151,5 112,6 137,3 114,4 127,8 142,4 107,4 104,8 110,9 78,3 86,7 124,4

2,0 2,0 2,0 2,0 2,1 2,0 2,0 2,0 1,9 2,0 1,8 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 2,0 1,9

1,9 2,0 2,5 1,7 2,5 1,9 1,8 1,6 1,7 2,0 1,4 1,5 1,8 1,6 1,6 1,8 2,2 1,6 1,3 2,7 1,9

WT HET WT WT HET WT HET WT WT HET WT WT HET WT WT WT WT WT WT WT WT WT HET HET WT WT HET HET MUT WT WT WT WT WT WT WT WT

243 244 245 245 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 264 265 266 267 268 269 270 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281

UC CD UC UC KRK KRK KRK KRK C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C

128,1 122,9 79,8 120,3 150,2 131,7 143,8 153,4 115,8 147,0 104,3 136,1 98,0 112,0 117,8 130,8 117,4 110,5 61,2 124,1 114,8 132,7 100,5 136,9 136,5 129,5 132,0 103,5 119,1 138,5 103,5 146,9 121,0 79,1 108,8 129,6 127,0

1,9 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,9 1,8 1,8 1,9 1,8 1,8 1,9 1,8 1,9

1,5 1,6 1,7 1,4 1,7 1,8 1,6 1,7 1,6 1,7 1,6 1,8 1,5 1,6 1,6 1,7 1,7 1,6 1,7 1,8 1,7 1,6 1,6 1,8 1,8 1,6 1,6 1,6 1,7 1,6 1,7 1,7 1,7 1,7 1,9 1,9 1,7

WT WT WT HET WT WT WT HET HET WT WT HET WT WT HET WT HET WT WT HET HET HET WT WT HET WT WT WT WT HET WT WT WT HET WT WT HET

461 462 463 464 465 466 467 468 469 470 471 472 473 474 1TO 2TO 3TO 5TO 6TO 8TO 9TO 10TO 11TO 13TO 14TO 16TO 17TO 18TO 21TO 22TO 23TO 24TO 25TO 26TO 27TO 28TO 29TO

KRK KRK KRK KRK KRK KRK C KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK

114,6 78,3 111,7 132,5 156,3 121,6 128,2 97,2 64,7 133,4 75,8 114,0 63,0 83,6 84,6

1,9 2,1 2,0 2,0 2,0 1,9 2,0 2,0 2,0 1,9 2,0 2,0 2,1 2,1 2,1

2,2 1,9 1,9 2,3 2,0 1,8 2,4 2,0 1,6 2,1 1,9 2,1 1,9 2,2 2,1

59

C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C

genotyp

A260/230

1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9

A260/230

A260/280

127,2 133,0 137,8 134,7 143,6 152,3 126,3 131,7 123,0 161,6 120,7 143,1 79,3 124,4 55,8 143,0 111,2 147,1 132,5 131,4 160,4 137,7 149,4 119,8 104,9 87,7 102,5 80,8 84,5 120,6 109,3 114,8 119,6 159,7 104,7 139,0 122,5

A260/280

c (ng/µl)

C C C C KRK KRK C KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK C C C KRK KRK KRK C KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK

c (ng/µl)

c (ng/µl)

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 21 22 23 24 25 26 28 29 30 31 33 34 35 36 37 38 39 40 41

Diagnóza

Diagnóza

Tabulka 15 Souhrnná tabulka výsledků alelické diskriminace pro alelu CYP2W1*6.

145,0 139,0 109,0 87,0 126,0 110,0 121,0 109,0 137,0 129,0 19,0 128,0 134,0 136,0 7/9,2 1146 733 740 892 1030 483 754 566 582 667 421 1019 486 318 190 304 180 248 78,6 137 128 164

1,9 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 2,1 1,9 1,9 1,9 1,8 1,8 1,6 1,6 1,7 1,6 1,6 1,7 1,8 1,9 1,6 1,8 1,7 1,8 2 1,8 1,8 1,8 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9

1,8 2,0 1,8 1,6 1,7 1,7 1,9 1,8 1,9 1,9 1,8 1,9 2,0 2,0 2,43 0,9 1,4 0,8 1 1,1 0,9 1 0,9 1,7 0,8 0,9 0,8 1 1,9 2,4 2,6 2,5 2,7 2,4 2,7 2,6 2,8

WT WT WT MUT MUT HET HET MUT HET HET HET WT HET HET WT WT WT WT HET HET WT HET WT HET WT WT WT WT HET WT WT HET WT WT WT HET HET

genotyp

č.vzorku

Diagnóza

c (ng/µl)

A260/280

A260/230

genotyp

č.vzorku

Diagnóza

c (ng/µl)

A260/280

A260/230

genotyp

č.vzorku

Diagnóza

c (ng/µl)

A260/280

A260/230

genotyp

č.vzorku

C C KRK CD KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK

132,9 104,3 105,7 158,5 93,1 62,7 128,6 63,6 138,9 107,8 142,3 131,0 134,9 131,8 112,0 149,8

1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9

1,7 1,7 1,4 1,8 1,6 1,0 1,6 1,3 1,9 1,9 2,0 1,4 1,7 1,4 1,6 1,7

HET WT WT WT WT WT WT WT WT WT WT HET WT HET WT WT HET HET HET HET HET HET WT HET HET HET WT WT HET WT WT HET WT WT WT WT HET WT

125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164

KRK C KRK KRK KRK KRK KRK KRK C KRK KRK C C C KRK C C C CD KRK C C C C C C C C C KRK C KRK KRK C KRK KRK KRK KRK

90,6 125,7 120,8 135,3 101,4 123,4 114,5 135,0 173,3 96,0 83,4 124,0 109,0 124,5 141,7 149,8 65,5 152,2 124,3 132,4 110,7 149,3 145,0 129,1 145,9 76,9 113,2 122,9 128,7 152,3 116,9 58,3 129,9 145,9 130,8 125,6 123,1 131,3

2,0 1,9 2,0 1,9 2,0 1,9 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 1,9 1,9 2,0 2,0 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 2,0 2,0 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 2,0

2,0 1,9 2,0 1,9 2,0 1,9 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 1,9 1,9 2,0 2,0 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 2,0 2,0 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 2,0

WT WT WT WT WT WT WT WT HET HET WT WT WT HET HET WT WT WT WT WT WT WT WT HET WT WT HET WT WT WT WT WT WT MUT WT HET WT WT

204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 240 241 242

KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK UC KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK C KRK KRK KRK C C KRK KRK CD KRK CD KRK C KRK

96,3 106,1 116,7 107,2 86,8 106,8 80,8 138,7 127,8 124,6 92,8 169,6 164,3 160,9 139,2 126,5 125,6 139,9 114,8 127,7 132,6 146,1 89,8 160,6 149,8 159,3 115,7 108,5 154,4 130,8 148,1 103,8 117,9 111,1 115,1 74,3 75,9 56,8

2,0 2,0 2,0 1,9 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,1 1,8 1,8 1,9 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,8 1,8 1,9 1,9

2,3 2,3 2,2 1,9 1,8 2,5 3,0 2,2 2,3 2,1 2,1 1,7 1,7 1,5 1,4 1,3 1,6 1,5 1,6 1,6 1,6 1,8 1,8 1,7 1,7 1,9 1,5 1,4 1,7 1,6 1,7 1,4 1,5 1,7 1,5 1,3 1,9 1,6

WT WT WT WT WT WT WT WT WT HET WT WT WT MUT WT WT WT HET HET WT WT WT WT WT WT HET WT WT WT HET WT HET HET WT HET HET HET HET

282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 460

C C C C C C KRK C C C KRK KRK UC KRK KRK C KRK KRK C C C C C C C C C C KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK C

136,9 132,1 119,5 146,0 101,8 122,2 114,1 66,7 165,4 108,3 126,9 100,3 134,5 105,8 117,7 127,3 109,2 94,0 151,1 135,1 128,4 118,7 151,0 135,8 124,9 131,3 122,9 102,2 116,8 105,0 98,3 132,3 55,8 123,1 128,5 126,9 121,7 135,0

1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,8 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9

1,7 1,7 1,7 1,7 1,6 1,6 1,8 1,9 1,8 1,7 1,3 1,8 1,8 1,2 1,6 1,7 1,4 1,3 1,6 1,7 1,6 1,7 1,8 1,7 1,7 1,7 1,6 1,4 1,5 1,4 1,2 1,6 1,3 1,7 1,7 1,7 1,6 1,8

MUT HET WT WT WT WT WT WT WT HET WT WT HET WT HET HET WT WT WT WT WT WT WT MUT HET HET HET WT HET HET HET MUT WT WT WT WT HET MUT

31TO 33TO 35TO 36TO 37TO 38TO 39TO 40TO 42TO 43TO 44TO 45TO 46TO 47TO 49TO 50TO 52TO 54TO 55TO 56TO 57TO 58TO 59TO 60TO 61TO 62TO 63TO 64TO 65TO 66TO 67TO 68TO 69TO 70TO

60

C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C

genotyp

A260/230 1,2 2,1 1,9 1,3 1,6 1,8 1,8 1,8 1,6 1,6 1,7 1,8 1,4 1,6 1,5 1,6 1,6 1,8 1,5 2,0 1,8

A260/280

A260/280 1,9 2,0 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9

A260/230

c (ng/µl) 56,2 73,8 126,7 87,9 100,1 135,1 147,4 155,6 137,8 121,9 118,0 132,6 98,1 106,9 130,4 109,5 155,0 126,4 112,3 136,5 109,5

c (ng/µl)

Diagnóza KRK C C KRK KRK C KRK KRK KRK KRK KRK C KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK KRK

Diagnóza

č.vzorku 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 64 65 66 67 68 70 71 72 74 75 76 78 79 80 81 82 84

116 12 18 15 33,4 19,5 7,9 14,9 45,6 38,6 26,8 116 175 122 72 174 51,3 210 66,9 85,8 81,8 137 73,3 63,5 105 54,4 83,6 153 73,3 121 93,5 44,1 94,8 38,8

2,7 2,1 0,6 1,5 5,1 3,9 0,8 0,3 1,5 0,2 0,9 0 1,4 1,4 1,5 1,3 1,9 1 1,7 1,5 1,1 2,2 2.3 2 1,7 1,9 0,4 2 1,9 1,8 2 1,8 1,7 1,4

1,9 1,8 1,5 1,8 1,8 1,8 1,6 1,7 1,7 1,9 1,7 2,7 1,8 1,8 1,9 1,8 1,9 1,9 1,8 1,8 1,8 1,8 1,9 1,8 1,9 1,8 1,9 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,9

WT WT WT HET WT WT WT WT WT WT HET HET WT WT WT MUT WT WT HET WT HET WT WT WT HET HET WT WT WT WT WT WT WT WT

7. DISKUSE

Rakovina je dnes jednou z hlavních příčin úmrtí. V České Republice umírá na nějaký typ malignity kaţdý čtvrtý člověk (NOR 2009). Jedna z nejčastějších diagnóz je kolorektální karcinom. Cílem současné vědy je zlepšit prevenci, screening, diagnostiku, léčbu a sníţit tak vysokou incidenci a mortalitu. Stále se hledají nové postupy léčby, zahrnující korekci genetických poruch, vývoj nových nádorových markerů a cílené terapie. Významnou roli v procesu karcinogeneze, ale i v léčbě rakoviny hrají cytochromy P450 (Nebert and Dalton 2006). Cytochromy P450 jsou velice variabilní skupinou a většina genů zejména z prvních třech rodin vykazuje velký polymorfismus. Polymorfismy genů včetně bodových (SNP) mohou způsobit změněnou, sníţenou či zvýšenou enzymovou aktivitu výsledného proteinu díky změněné aminokyselinové sekvenci. Dříve se ke studiu souvislosti tohoto efektu a rizika výskytu rakoviny pouţívaly fenotypové studie. Byly zaloţeny na podávání pro CYP specifických substrátů a následné kvantifikaci metabolitů v moči a plazmě. Podle rychlosti metabolismu se subjekty rozdělovaly do skupin. Dnes se běţněji pouţívá genotypizace, tedy stanovení varianty přímo na úrovni DNA, a intenzivně se studuje vliv různých polymorfismů na riziko vzniku mnoha onemocnění včetně nádorových. Existují metody pro cílenou i celogenomovou genotypizaci, od původních alelicky specifických PCR, PCR-RFLP a variant kvantitativní PCR, přes Sangerovo sekvenování aţ k celogenomovým SNP mikroarrayím a sekvenování nové generace (Johnson, Yucesoy et al. 2004) (Gervasini, de Murillo et al. 2010). Z poznatků získaných zejména za poslední desetiletí je jasné, ţe existuje souvislost mezi rizikem rakoviny a polymorfismy mnoha genů včetně CYP. Není to však jediný předpoklad pro rozvoj rakovinného bujení. Je třeba dalších faktorů a významných somatických mutací (Agundez 2004), produkty polymorfních genů mohou však dotvářet vhodné prostředí a podporovat svojí aktivitou konkrétní buněčné procesy. Většinou se jedná o velmi komplexní interakce, proto se současné poznatky omezují spíše na asociační studie a sledování výskytu znaků, avšak i toto je cesta k lepší molekulární charakterizaci genetické výbavy pacienta a jeho nádoru. CYP2W1 je nově objevený člen rodiny 2. Byl nalezen v buněčných liniích HEPG2 a Caco2TC7. Je to velmi unikátní CYP, nejen z důvodu netypické lokalizace na membránách endoplazmatického retikula a posttranslační modifikace glykosylací, velmi zajímavá je jeho tkáňová exprese. Jedná se totiţ o tumor specifický enzym nalezený v signifikantním mnoţství pouze v kolorektálním karcinomu a karcinomu nadledvinek (Karlgren, Gomez et al. 2006). 62

Při studiu jeho fyziologie byl objeven ve střevě krysího embrya, ale v dospělé tkáni jiţ přítomný není. Tyto skutečnosti naznačují jeho moţnou roli ve vývoji plodu (Choudhary, Jansson et al. 2005). Ačkoliv nebyl dosud objeven jeho hlavní substrát, je známo, ţe CYP2W1 je schopen například aktivovat banoxantron či aflatoxin a můţe tak působit (cyto)toxicky na nádorové buňky (Atkinson, Loadman et al. 2007) (Gomez 2008). Jeho vlastnosti z něj dělají vhodného kandidáta pro protinádorovou léčbu. (Karlgren and IngelmanSundberg 2007). Navíc byla dokázána přítomnost CYP2W1 na povrchu buněk, a to v glykosylované i neglykosylované formě, mohl by se tedy vyuţít jako cíl léčby za pomocí cílených specifických protilátek (Gomez, Nekvindova et al. 2010). Existuje i teoretická moţnost vyuţít CYP2W1 u jiných malignit v léčebné strategii zvané gene-directed enzyme prodrug therapy. Jedná se o transfekci CYP enzymů do tumorové tkáně pomocí virové infekce. CYP pak v nádoru aktivují prodrug v cytotoxické léčivo eliminující nádorové buňky. Většina CYPů je však obvykle exprimována nejen v tumoru, ale i v dalších tkáních organismu (Yakkundi, McErlane et al. 2006), CYP2W1 by byl v tomto případě výhodnější, neboť se téměř nevyskytuje ve zdravé tkáni (Gomez 2008). V současné době se mnoho studií zabývá schopností málo penetrovaných genů způsobit zvýšenou náchylnost k rakovině. Mohlo by se jednat o významnou pomůcku při hodnocení individuálního rizika rakoviny u jedinců s dědičnými genovými změnami. To je také důvod, proč zkoumat rozšířenost polymorfismů CYP2W1 v populaci a jejich efekt na míru rizika kolorektálního karcinomu (Agundez 2004). V databázi NCBI dbSNP a HapMap byla zveřejněna řada genetických polymorfismů genu CYP2W1, a řada z nich je nesynonymních (tabulka 8, kapitola 5.9.3). Poprvé byla změřena frekvence výskytu šesti SNP CYP2W1 u Japonské populace v roce 2008 (Hanzawa, Sasaki et al. 2008). O dva roky později byla zveřejněna i studie zabývající se výskytem 5 SNP v bělošské populaci a to konkrétně u Španělů (Gervasini, de Murillo et al. 2010). V naší studii byly zkoumány dva nejvýznamnější polymorfismy a jejich frekvence výskytu v naší populaci. První z nich je polymorfismus s označením rs3735684 (alela CYP2W1*2), nachází se v exonu 4 a je odpovědný za aminokyselinovou substituci Ala181Thr. Druhým z nich je polymorfismus rs3808348 (alela CYP2W1*6) leţící v exonu 9 a způsobující záměnu prolinu 488 za leucin (Pro488Leu). Tato změna v C-terminální části peptidu narušuje sekundární konformaci peptidového řetězce a vede k defektnímu proteinu (nevykazujícímu typické P450 spektrum). 63

Dle našich výsledků se alela CYP2W1*2 s označením rs3735684 vyskytuje u 7 % (A=0,074) pacientů s KRK i u zdravých subjektů. NCBI dbSNP databáze uvádí frekvenci minoritní alely (MAF) A= 0,063 (dbSNP 2013). Polymorfismus je tedy u nás o něco častější neţ uvádí NCBI dbSNP databáze. Frekvence u Španělů byla necelých 7 % (Gervasini, de Murillo et al. 2010), v japonské studii se minoritní alela vyskytovala pouze u 0,5 % studovaných jedinců (Hanzawa, Sasaki et al. 2008). Výskyt polymorfismů je tedy geograficky rozdílný. Studie kolektivu kolem Guillerma Gervasiniho poukázala na spojitost CYP2W1 G541A (CYP2W1*2) se zvýšeným rizikem kolorektálního karcinomu (Gervasini, de Murillo et al. 2010). V našich výsledcích se ale tato hypotéza nepotvrdila. Obě studované skupiny, pacienti s kolorektálním karcinomem a zdraví jedinci, měli zastoupení obou alel přibliţně stejné. Při porovnání četnosti výskytu testem chí-kvadrát se nenašla ţádná statistická korelace (tabulka 12, kapitola 6.4.). Druhá studovaná alela CYP2W1*6 (1463T) se v naší populaci vyskytuje dle našich výsledků s 20% četností (T=0,195). NCBI dbSNP databáze uvádí frekvenci minoritní alely T=0,219. Nejvyšší četnost byla dosud zjištěna u Japonské a Čínské populace, 37 % (Obr. 13 a 14). Frekvence polymorfismů ještě nejsou zmapovány celosvětově, prozatím jsou dostupné informace jen z některých evropských států a Japonska. V porovnání pacientů a zdravých jedinců jsme nalezli malé rozdíly (*6 přítomna u 18 % pacientů a 21 % zdravých kontrol) naznačující protektivní účinek alely 1463T, ale tato hypotéza se statisticky nepotvrdila. Byl zjištěn malý, statisticky významný rozdíl mezi výskytem homozygotně mutovaného genotypu u pacientů s KRK a zdravou kontrolní skupinou (chí-kvadrát, tabulka 13, kapitola 6.4). Tato asociace se však po hodnocení pomocí poměru pravděpodobností a poměru šancí (tabulka 10, kapitola 6.4) jeví nevýznamnou. Vycházeli jsme z předpokladu, ţe kolorektální karcinom je podporován přítomností funkčního CYP2W1 s wild-type alelou, protoţe jako enzym se můţe například účastnit karcinogeneze aktivací prokarcinogenů (Wu, Sohl et al. 2006) (Gomez 2008) a předchozí pozorování ukazovala niţší frekvenci výskytu mutované alely *6 u pacientů s nádorem. V tomto případě by měla být frekvence mutované alely vyšší u zdravých kontrol a wild-type u pacientů s kolorektálním karcinomem. V praxi tyto výsledky odpovídají u CYP2W1*6, ale nejedná se o statisticky významný rozdíl. U druhé alely nebyl zjištěn ţádný rozdíl mezi zdravými kontrolami a pacienty s kolorektálním karcinomem, ač jiţ byla publikována práce, 64

která tvrdí opak, tedy ţe polymorfismus CYP2W1*2 je spojen s vyšším rizikem kolorektálního karcinomu (Gervasini, de Murillo et al. 2010). V naší studii bylo zjištěno, ţe zkoumané alely CYP2W1*2 a CYP2W1*6 jsou poměrně časté v naší populaci, ani jeden polymorfismus dle těchto výsledků nesouvisí se zvýšeným či sníţeným rizikem kolorektální rakoviny. Tyto výsledky se liší od studie provedené Gervasinim a kol., proto by bylo přínosné udělat rozsáhlejší studii, která by potvrdila či vyvrátila fakt, ţe alela 541G/A souvisí s vyšším rizikem kolorektálního karcinomu. Přestoţe existuje ještě mnoho neobjasněného ohledně fyziologické funkce CYP2W1 a nejsou známy dostatečně specifické substráty tohoto enzymu, jedná se nepochybně o velice zajímavou a slibnou molekulu. CYP2W1 má velký potenciál stát se jak prognostickým markerem u pacientů s kolorektálním karcinomem, tak terapeutickým cílem pro protinádorovou terapii.

65

8. ZÁVĚR

66

Cílem této práce bylo zmapování frekvencí dvou nejvýznamnějších polymorfismů genu CYP2W1 v naší populaci. Poprvé v České Republice i střední Evropě byly určeny alelické a genotypové frekvence dvou nejvýznamnějších alel CYP2W1 (*2 a *6) u pacientů s kolorektálním karcinomem a zdravých jedinců. Lokální alelické frekvence jsou blízké dosud publikovaným frekvencím z několika dalších Evropských zemí, nejvýznamněji se liší frekvence výskytu těchto alel v asijské populaci. Ačkoliv není zmapovaný celý svět, je zřejmé, ţe frekvence jsou v různých geografických oblastech odlišné. Minoritní alela 541A (CYP2W1*2), způsobující aminokyselinovou substituci Ala181Thr, se vyskytovala u 7 % (MAF: A=0,074) zkoumaných subjektů bez rozdílů mezi pacienty s kolorektálním karcinomem a zdravými kontrolami. Tento výsledek se liší od publikované studie, která tvrdí, ţe alela 541A je spojená s vyšším rizikem kolorektálního karcinomu. Druhá zkoumaná alela, 1463T, která charakterizuje CYP2W1*6 a je odpovědná za ztrátu funkce enzymu díky substituci Pro488Leu, se vyskytovala u 20 % (MAF: T=0,195). Tato alela byla o něco častější u zdravých jedinců, ale rozdíl nebyl statisticky významný. CYP2W1 je unikátní a velice perspektivní molekula. Můţe nalézt vyuţití v hodnocení prognózy a také v cílené terapii kolorektálního karcinomu, kdy můţe být targetem protilátky, prodrug nebo vlastního inhibitoru. Léčba by tak ideálně zasahovala pouze buňky exprimující tento enzym, tj. buňky kolorektálního karcinomu, a vůči ostatním tkáním by byla šetrná. Neţ bude moţné specifická léčiva navrhnout, bude ještě nutné především popsat metabolickou aktivitu a nalézt skutečně specifický(é) substrát(y) tohoto enzymu, ale i pochopit význam reaktivace tohoto genu v kolorektální karcinogenezi, charakterizovat významné genetické varianty co do změn aktivity a frekvence výskytu v cílových populacích.

67

9. SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK

68

KRK ZN NOR APC FAP HNPCC MSI MMR CIN CIMP KRAS MYC BRAF DDC WNT 18qLOH TP53 AURKA Plk1 COX-2 PPAR TGFβ EGFR MAPK PI3K CTNNB1 5-FU Raf Akt PTEN TOKS CRP CEA CA 19-9 PIK3CA RFLP ARMS 5-FdUMP TKIs VEGF HGF IGF Topo I. CYP GDEPT XMR SNP MAF AK AQ4N RR OR

kolorektální karcinom zhoubný novotvar národní onkologický registr Adenomatosis polyposis coli familiární adenomatózní polypóza hereditární nepolypózní kolorektální karcinom (Lynchův syndrom) mikrosatelitová nestabilita DNA ,,mismatch“ opravný systém chromozomální nestabilita CpG island methylator phenotype V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog Myc protoonkogen protein v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 deleted in KRK Wingless/Int-1 ztráta heterozygotnosti chromozomu 18 tumorový protein p53 protein kináza Aurora A serin/treonin kináza cyklooxygenáza 2 receptory aktivované peroxisomovým proliferátorem transformující růstový faktor beta receptor epidermálního růstového faktoru mitogen aktivovaná protein kináza fosfatidylinositol 3-kináza gen β-kateninu 5-fluorouracil serin/treonin specifická protein kináza protein kináza B homolog fosfatázy a tensinu test okultního krvácení do stolice C reaktivní protein karcinoembryonální antigen sacharidový antigen 19-9 fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát 3-kináza, katalytická podjednotka alfa restrikční analýza (restriction fragment length polymorphism) amplification refractory mutation system 5-fluoro-deoxyuridin monofosfát inhibitory tyrosin kinázy vaskulární endotelový růstový faktor hepatocytární růstový faktor inzulinový růstový faktor topoizomeráza I. cytochromy P450 gene-directed enzyme prodrug therapy enzymy metabolizující xenobiotika nukleotidový polymorfismus frekvence minoritní alely aminokyselina banoxantron relativní risk (poměr pravděpodobností) poměr šancí (odds ratio)

69

10.LITERATURA

70

Adam, Z. (2002). Diagnostické a léčebné postupy u maligních chorob. Praha, Grada Publishing Adrouny, R. (2002). Understanding Colon Cancer. Jackson, Univ. Press of Mississippi. Agundez, J. A. (2004). "Cytochrome P450 gene polymorphism and cancer." Curr Drug Metab 5(3): 211-224. Arnold, C. N., A. Goel, et al. (2005). "Molecular pathogenesis of colorectal cancer: implications for molecular diagnosis." Cancer 104(10): 2035-2047. Arteaga, C. L. (2002). "Overview of epidermal growth factor receptor biology and its role as a therapeutic target in human neoplasia." Semin Oncol 29(5 Suppl 14): 3-9. Atkinson, S. J., P. M. Loadman, et al. (2007). "Examination of the distribution of the bioreductive drug AQ4N and its active metabolite AQ4 in solid tumours by imaging matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry." Rapid Commun Mass Spectrom 21(7): 1271-1276. Bacher, J. W., L. A. Flanagan, et al. (2004). "Development of a fluorescent multiplex assay for detection of MSI-High tumors." Dis Markers 20(4-5): 237-250. Barker, N. and H. Clevers (2006). "Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics." Nat Rev Drug Discov 5(12): 997-1014. Baudhuin, L. M., L. J. Burgart, et al. (2005). "Use of microsatellite instability and immunohistochemistry testing for the identification of individuals at risk for Lynch syndrome." Fam Cancer 4(3): 255-265. Becker, H. D. (2005). Chirurgická onkologie. Praha, Grada Publishing. Benchimol, S., A. Fuks, et al. (1989). "Carcinoembryonic antigen, a human tumor marker, functions as an intercellular adhesion molecule." Cell 57(2): 327-334. Bettstetter, M., S. Dechant, et al. (2007). "Distinction of hereditary nonpolyposis colorectal cancer and sporadic microsatellite-unstable colorectal cancer through quantification of MLH1 methylation by real-time PCR." Clin Cancer Res 13(11): 3221-3228. Bokemeyer, C., I. Bondarenko, et al. (2009). "Fluorouracil, leucovorin, and oxaliplatin with and without cetuximab in the first-line treatment of metastatic colorectal cancer." J Clin Oncol 27(5): 663-671. Boland, C. R., J. Sato, et al. (1995). "Microallelotyping defines the sequence and tempo of allelic losses at tumour suppressor gene loci during colorectal cancer progression." Nat Med 1(9): 902-909. Boland, C. R., S. N. Thibodeau, et al. (1998). "A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer." Cancer Res 58(22): 5248-5257. Braun, M. S., S. D. Richman, et al. (2008). "Predictive biomarkers of chemotherapy efficacy in colorectal cancer: results from the UK MRC FOCUS trial." J Clin Oncol 26(16): 2690-2698. Bruno, R. D. and V. C. Njar (2007). "Targeting cytochrome P450 enzymes: a new approach in anti-cancer drug development." Bioorg Med Chem 15(15): 5047-5060. Capella, G., S. Cronauer-Mitra, et al. (1991). "Frequency and spectrum of mutations at codons 12 and 13 of the c-K-ras gene in human tumors." Environ Health Perspect 93: 125131. Compton, C. C. (2003). "Colorectal carcinoma: diagnostic, prognostic, and molecular features." Mod Pathol 16(4): 376-388. Compton, C. C. and F. L. Greene (2004). "The staging of colorectal cancer: 2004 and beyond." CA Cancer J Clin 54(6): 295-308. Cunningham, D., W. Atkin, et al. (2010). "Colorectal cancer." Lancet 375(9719): 1030-1047. Čihák, R. (2002). Anatomie II., druhé, upravené a doplněné vydání. Praha, Grada publishing. 71

dbSNP (2013). Database of Single Nucleotide Polymorphisms (dbSNP). National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine. Di Nicolantonio, F., M. Martini, et al. (2008). "Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer." J Clin Oncol 26(35): 5705-5712. Ding, G., W. Xu, et al. (2013). "CYP1A1 MspI polymorphism is associated with prostate cancer susceptibility: evidence from a meta-analysis." Mol Biol Rep 40(5): 34833491. Douillard, J. Y., S. Siena, et al. (2010). "Randomized, phase III trial of panitumumab with infusional fluorouracil, leucovorin, and oxaliplatin (FOLFOX4) versus FOLFOX4 alone as first-line treatment in patients with previously untreated metastatic colorectal cancer: the PRIME study." J Clin Oncol 28(31): 4697-4705. Dušek, L. (2005). "Epidemiologie zhoubných nádorů v České Republice [online]." Retrieved 2013-1-22, 2013. Dušek, L. (2012). Epidemiologie, prevence a léčba kolorektálního karcinomu dle dostupných českých a mezinárodních dat. . Praha, FN v Motole. Dušek, L., Zavoral, M., Májek, O., Suchánek, Š., Muţík, J., Pavlík, T., Šnajdrová, L., Gregor, J. (2013). "Kolorektum.cz – Program kolorektálního screeningu v České republice ", from http://www.kolorektum.cz. Edler, D., K. Stenstedt, et al. (2009). "The expression of the novel CYP2W1 enzyme is an independent prognostic factor in colorectal cancer - a pilot study." Eur J Cancer 45(4): 705-712. Fallik, D., F. Borrini, et al. (2003). "Microsatellite instability is a predictive factor of the tumor response to irinotecan in patients with advanced colorectal cancer." Cancer Res 63(18): 5738-5744. Fearon, E. R. and B. Vogelstein (1990). "A genetic model for colorectal tumorigenesis." Cell 61(5): 759-767. Feinberg, A. P. (2004). "The epigenetics of cancer etiology." Semin Cancer Biol 14(6): 427432. Ferlay J, S. H., Bray F, Forman D, Mathers C and Parkin DM. (2010). GLOBOCAN 2008, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 10. Fletcher, R. H. (1986). "Carcinoembryonic antigen." Ann Intern Med 104(1): 66-73. Frattini, M., P. Saletti, et al. (2007). "PTEN loss of expression predicts cetuximab efficacy in metastatic colorectal cancer patients." Br J Cancer 97(8): 1139-1145. Gervasini, G., S. G. de Murillo, et al. (2010). "CYP2W1 variant alleles in Caucasians and association of the CYP2W1 G541A (Ala181Thr) polymorphism with increased colorectal cancer risk." Pharmacogenomics 11(7): 919-925. Giaccone, G. and J. C. Soria (2007). Targeted therapies in oncology. New York, Informa Healthcare. Girault, I., N. Rougier, et al. (2005). "Simultaneous measurement of 23 isoforms from the human cytochrome P450 families 1 to 3 by quantitative reverse transcriptasepolymerase chain reaction." Drug Metab Dispos 33(12): 1803-1810. Gomez, A. (2008). Epigenetic regulation and posttranslational modofication of human cytochrome P450s: focus on CYP2W1, CYP1A2 and CYP2C18. Stockhom: 66. Gomez, A., M. Karlgren, et al. (2007). "Expression of CYP2W1 in colon tumors: regulation by gene methylation." Pharmacogenomics 8(10): 1315-1325. Gomez, A., J. Nekvindova, et al. (2010). "Colorectal cancer-specific cytochrome P450 2W1: intracellular localization, glycosylation, and catalytic activity." Mol Pharmacol 78(6): 1004-1011.

72

Groden, J., A. Thliveris, et al. (1991). "Identification and characterization of the familial adenomatous polyposis coli gene." Cell 66(3): 589-600. Gupta, M. K., R. Arciaga, et al. (1985). "Measurement of a monoclonal-antibody-defined antigen (CA19-9) in the sera of patients with malignant and nonmalignant diseases. Comparison with carcinoembryonic antigen." Cancer 56(2): 277-283. Hanzawa, Y., T. Sasaki, et al. (2008). "Genetic polymorphisms and haplotype structures of the human CYP2W1 gene in a Japanese population." Drug Metab Dispos 36(2): 349352. Holubec, L. (2004). Kolorektální karcinom: současné moţnosti diagnostiky a léčby. Praha, Grada Publishing. Choudhary, D., I. Jansson, et al. (2005). "Expression patterns of mouse and human CYP orthologs (families 1-4) during development and in different adult tissues." Arch Biochem Biophys 436(1): 50-61. Chun, Y. J. and S. Kim (2003). "Discovery of cytochrome P450 1B1 inhibitors as new promising anti-cancer agents." Med Res Rev 23(6): 657-668. Ilantzis, C., L. DeMarte, et al. (2002). "Deregulated expression of the human tumor marker CEA and CEA family member CEACAM6 disrupts tissue architecture and blocks colonocyte differentiation." Neoplasia 4(2): 151-163. Jasperson, K. W., T. M. Tuohy, et al. (2010). "Hereditary and familial colon cancer." Gastroenterology 138(6): 2044-2058. Jemal, A., F. Bray, et al. (2011). "Global cancer statistics." CA Cancer J Clin 61(2): 69-90. Ji, Y. N., Q. Wang, et al. (2012). "CYP1A1 Ile462Val polymorphism contributes to lung cancer susceptibility among lung squamous carcinoma and smokers: a meta-analysis." PLoS One 7(8): e43397. Jin, J. Q., Y. Y. Hu, et al. (2011). "CYP1A1 Ile462Val polymorphism contributes to colorectal cancer risk: a meta-analysis." World J Gastroenterol 17(2): 260-266. Johns, L. E. and R. S. Houlston (2001). "A systematic review and meta-analysis of familial colorectal cancer risk." Am J Gastroenterol 96(10): 2992-3003. Johnson, V. J., B. Yucesoy, et al. (2004). "Genotyping of single nucleotide polymorphisms in cytokine genes using real-time PCR allelic discrimination technology." Cytokine 27(6): 135-141. Karlgren, M., A. Gomez, et al. (2006). "Tumor-specific expression of the novel cytochrome P450 enzyme, CYP2W1." Biochem Biophys Res Commun 341(2): 451-458. Karlgren, M. and M. Ingelman-Sundberg (2007). "Tumour-specific expression of CYP2W1: its potential as a drug target in cancer therapy." Expert Opin Ther Targets 11(1): 6167. Karlgren, M., S. Miura, et al. (2005). "Novel extrahepatic cytochrome P450s." Toxicol Appl Pharmacol 207(2 Suppl): 57-61. Kinzler, K. W. and B. Vogelstein (1996). "Lessons from hereditary colorectal cancer." Cell 87(2): 159-170. Kiyohara, C. (2000). "Genetic polymorphism of enzymes involved in xenobiotic metabolism and the risk of colorectal cancer." J Epidemiol 10(5): 349-360. Kouri, R. E., C. E. McKinney, et al. (1982). "Positive correlation between high aryl hydrocarbon hydroxylase activity and primary lung cancer as analyzed in cryopreserved lymphocytes." Cancer Res 42(12): 5030-5037. Kumarakulasingham, M., P. H. Rooney, et al. (2005). "Cytochrome p450 profile of colorectal cancer: identification of markers of prognosis." Clin Cancer Res 11(10): 3758-3765. Labianca, R., G. D. Beretta, et al. (2010). "Colon cancer." Crit Rev Oncol Hematol 74(2): 106-133.

73

Lao, V. V. and W. M. Grady (2011). "Epigenetics and colorectal cancer." Nat Rev Gastroenterol Hepatol 8(12): 686-700. Leary, R. J., J. C. Lin, et al. (2008). "Integrated analysis of homozygous deletions, focal amplifications, and sequence alterations in breast and colorectal cancers." Proc Natl Acad Sci U S A 105(42): 16224-16229. Lengauer, C., K. W. Kinzler, et al. (1997). "Genetic instability in colorectal cancers." Nature 386(6625): 623-627. Lengauer, C., K. W. Kinzler, et al. (1998). "Genetic instabilities in human cancers." Nature 396(6712): 643-649. Li, W., Y. Tang, et al. (2009). "Molecular modeling of human cytochrome P450 2W1 and its interactions with substrates." J Mol Graph Model 28(2): 170-176. Lievre, A., J. B. Bachet, et al. (2008). "KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab." J Clin Oncol 26(3): 374-379. Liu, L., G. Wu, et al. (2013). "Functional CYP1A1 genetic variants, alone and in combination with smoking, contribute to development of head and neck cancers." Eur J Cancer. Livstone, E. M. (2012). "The Merck Manuals ", from http://www.merckmanuals.com/professional/gastrointestinal_disorders/tumors_of_the _gi_tract/colorectal_cancer.html. Lynch, H. T. and A. de la Chapelle (2003). "Hereditary colorectal cancer." N Engl J Med 348(10): 919-932. Lynch, H. T., P. M. Lynch, et al. (2009). "Review of the Lynch syndrome: history, molecular genetics, screening, differential diagnosis, and medicolegal ramifications." Clin Genet 76(1): 1-18. McFadyen, M. C., W. T. Melvin, et al. (2004). "Cytochrome P450 enzymes: novel options for cancer therapeutics." Mol Cancer Ther 3(3): 363-371. McGuigan, F. E. and S. H. Ralston (2002). "Single nucleotide polymorphism detection: allelic discrimination using TaqMan." Psychiatr Genet 12(3): 133-136. Mendelsohn, J. and J. Baselga (2003). "Status of epidermal growth factor receptor antagonists in the biology and treatment of cancer." J Clin Oncol 21(14): 2787-2799. Merla, A. and S. Goel (2012). "Novel drugs targeting the epidermal growth factor receptor and its downstream pathways in the treatment of colorectal cancer: a systematic review." Chemother Res Pract 2012: 387172. Metrohealth. (2012). "Metrohealth." from http://www.metrohealth.org/. Migliore, L., F. Migheli, et al. (2011). "Genetics, cytogenetics, and epigenetics of colorectal cancer." J Biomed Biotechnol 2011: 792362. Murray, G. I., M. C. Taylor, et al. (1997). "Tumor-specific expression of cytochrome P450 CYP1B1." Cancer Res 57(14): 3026-3031. Nebert, D. W. and T. P. Dalton (2006). "The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis." Nat Rev Cancer 6(12): 947-960. Nebert, D. W., T. P. Dalton, et al. (2004). "Role of aryl hydrocarbon receptor-mediated induction of the CYP1 enzymes in environmental toxicity and cancer." J Biol Chem 279(23): 23847-23850. Nelson, H., N. Petrelli, et al. (2001). "Guidelines 2000 for colon and rectal cancer surgery." J Natl Cancer Inst 93(8): 583-596. NOR. (2009). "Ústav zdravotnických informací a statistiky ČR: Národní onkologický registr (NOR)." from http://www.uzis.cz/katalog/zdravotnicka-statistika/novotvary. Ogino, S., K. Nosho, et al. (2009). "PIK3CA mutation is associated with poor prognosis among patients with curatively resected colon cancer." J Clin Oncol 27(9): 1477-1484. 74

Peinado, M. A., S. Malkhosyan, et al. (1992). "Isolation and characterization of allelic losses and gains in colorectal tumors by arbitrarily primed polymerase chain reaction." Proc Natl Acad Sci U S A 89(21): 10065-10069. Peltomaki, P. (2001). "DNA mismatch repair and cancer." Mutat Res 488(1): 77-85. Pino, M. S. and D. C. Chung (2010). "The chromosomal instability pathway in colon cancer." Gastroenterology 138(6): 2059-2072. Popat, S. and R. S. Houlston (2005). "A systematic review and meta-analysis of the relationship between chromosome 18q genotype, DCC status and colorectal cancer prognosis." Eur J Cancer 41(14): 2060-2070. Prakash, P. and M. Porwal (2012). "Colon Cancer: General Diagnostic and Treatment." Journal of Pharmacy Research 5(1): 355-359. Pritchard, C. C. and W. M. Grady (2011). "Colorectal cancer molecular biology moves into clinical practice." Gut 60(1): 116-129. Ribic, C. M., D. J. Sargent, et al. (2003). "Tumor microsatellite-instability status as a predictor of benefit from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer." N Engl J Med 349(3): 247-257. Rieger, M. A., R. Ebner, et al. (2004). "Identification of a novel mammary-restricted cytochrome P450, CYP4Z1, with overexpression in breast carcinoma." Cancer Res 64(7): 2357-2364. Richman, S. D., M. T. Seymour, et al. (2009). "KRAS and BRAF mutations in advanced colorectal cancer are associated with poor prognosis but do not preclude benefit from oxaliplatin or irinotecan: results from the MRC FOCUS trial." J Clin Oncol 27(35): 5931-5937. Rubin, R. (2011). Rubin's Pathology: Clinicopathologic Foundations of Medicine. Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins. Sharma, S., T. K. Kelly, et al. (2010). "Epigenetics in cancer." Carcinogenesis 31(1): 27-36. Shen, L., M. Toyota, et al. (2007). "Integrated genetic and epigenetic analysis identifies three different subclasses of colon cancer." Proc Natl Acad Sci U S A 104(47): 1865418659. Shimada, T., C. L. Hayes, et al. (1996). "Activation of chemically diverse procarcinogens by human cytochrome P-450 1B1." Cancer Res 56(13): 2979-2984. Shor, D. and S. Jothy (2009). "Molecular Pathology of Colorectal Cancer:Identifying the Status of the KRAS Gene for EGFR-Targeted Therapy." Canadian Journal of Pathology: 44-50. Slattery, M. L., K. M. Boucher, et al. (1998). "Eating patterns and risk of colon cancer." Am J Epidemiol 148(1): 4-16. Sobin, L. H. (2010). "TNM classification of malignant tumors, seventh edition." I.U.A. Cancer. Spano, J. P., G. Milano, et al. (2008). "Potential predictive markers of response to EGFRtargeted therapies in colorectal cancer." Crit Rev Oncol Hematol 66(1): 21-30. Stark, K. and F. P. Guengerich (2007). "Characterization of orphan human cytochromes P450." Drug Metab Rev 39(2-3): 627-637. Stenstedt, K., M. Hallstrom, et al. (2012). "The expression of CYP2W1: a prognostic marker in colon cancer." Anticancer Res 32(9): 3869-3874. SUKL. "Státní ůstav pro kontrolu léčiv." Retrieved 02-25-2013, from http://www.sukl.cz/. Teh, L. K. and L. Bertilsson (2012). "Pharmacogenomics of CYP2D6: molecular genetics, interethnic differences and clinical importance." Drug Metab Pharmacokinet 27(1): 55-67. Tokizane, T., H. Shiina, et al. (2005). "Cytochrome P450 1B1 is overexpressed and regulated by hypomethylation in prostate cancer." Clin Cancer Res 11(16): 5793-5801. 75

Trachtenberg, J., N. Halpern, et al. (1983). "Ketoconazole: a novel and rapid treatment for advanced prostatic cancer." J Urol 130(1): 152-153. Van Cutsem, E., C. H. Kohne, et al. (2009). "Cetuximab and chemotherapy as initial treatment for metastatic colorectal cancer." N Engl J Med 360(14): 1408-1417. Vecchione, L., B. Jacobs, et al. (2011). "EGFR-targeted therapy." Exp Cell Res 317(19): 2765-2771. Vianna-Jorge, R., J. S. Festa-Vasconcellos, et al. (2012). "Functional polymorphisms in xenobiotic metabolizing enzymes and their impact on the therapy of breast cancer." Front Genet 3: 329. Walko, C. M. and H. McLeod (2012). "Use of CYP2D6 genotyping in practice: tamoxifen dose adjustment." Pharmacogenomics 13(6): 691-697. Walther, A., R. Houlston, et al. (2008). "Association between chromosomal instability and prognosis in colorectal cancer: a meta-analysis." Gut 57(7): 941-950. Wang, L., J. M. Cunningham, et al. (2003). "BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair." Cancer Res 63(17): 5209-5212. Watanabe, T., T. T. Wu, et al. (2001). "Molecular predictors of survival after adjuvant chemotherapy for colon cancer." N Engl J Med 344(16): 1196-1206. Weisenberger, D. J., K. D. Siegmund, et al. (2006). "CpG island methylator phenotype underlies sporadic microsatellite instability and is tightly associated with BRAF mutation in colorectal cancer." Nat Genet 38(7): 787-793. Worthley, D. L., V. L. Whitehall, et al. (2010). "DNA methylation within the normal colorectal mucosa is associated with pathway-specific predisposition to cancer." Oncogene 29(11): 1653-1662. Wu, Z. L., C. D. Sohl, et al. (2006). "Recombinant enzymes overexpressed in bacteria show broad catalytic specificity of human cytochrome P450 2W1 and limited activity of human cytochrome P450 2S1." Mol Pharmacol 69(6): 2007-2014. Xiao, Y. and F. P. Guengerich (2012). "Metabolomic analysis and identification of a role for the orphan human cytochrome P450 2W1 in selective oxidation of lysophospholipids." J Lipid Res 53(8): 1610-1617. Yakkundi, A., V. McErlane, et al. (2006). "Tumor-selective drug activation: a GDEPT approach utilizing cytochrome P450 1A1 and AQ4N." Cancer Gene Ther 13(6): 598605.

76