UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ. Katedra biochemických věd CYTOTOXICITA A METABOLISMUS DOXORUBICINU

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biochemických věd

CYTOTOXICITA A METABOLISMUS DOXORUBICINU V BUNĚČNÉ LINII MCF-7.

Diplomová práce

Školitel: Doc. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D. Hradec Králové, 2009

Bc.Veronika Hanušová

„Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány.“

2

Na tomto místě bych chtěla poděkovat Doc. RNDr. Lence Skálové, Ph.D., Aleně Pakostové a PharmDr. Lence Vildové za jejich ochotu, cenné rady a významnou pomoc při získávání informací a dat pro tuto diplomovou práci.

3

Obsah: 1. Úvod...............................................................................................................................7 2. Teoretická část..............................................................................................................8 2.1 Karcinom prsu..........................................................................................................8 2.2 Cytostatika..............................................................................................................10 2.2.1 Obecné rozdělení...........................................................................................10 2.2.2 Doxorubicin...................................................................................................13 2.2.3 Oracin............................................................................................................19 2.3 Buněčné linie..........................................................................................................21 2.4 Enzymová výbava MCF-7 x MCF-10A.................................................................23 2.5 Buněčné kultury......................................................................................................29 3. Cíl práce ......................................................................................................................32 4. Experimentální část....................................................................................................33 4.1 Materiál a chemikálie.............................................................................................33 4.2 Pomůcky a přístroje................................................................................................33 4.3 Kultivace buněčné linie MCF-7.............................................................................34 4.3.1 Kultivační média ..........................................................................................34 4.3.2 Rozmražování buněčné linie MCF-7.............................................................35 4.3.3Pasážování buněk...........................................................................................36 4.3.4 Rutinní kultivace............................................................................................36 4.3.5 Zamražování buněk.......................................................................................37 4.4 Stanovení cytotoxicity doxorubicinu......................................................................37 4.4.1 Metodika testu cytotoxicity –Neutral red uptake test....................................37 4.5 Zpracování buněk na subcelulární frakce...............................................................40 4.5.1 Stanovení bílkovin v cytosolické frakci..........................................................41 4.6 Inkubace cytosolické frakce s doxorubicinem........................................................42 4.6.1 Inkubace cytosolu s doxorubicinem a oracinem............................................42 4.7 Příprava vzorku pro HPLC analýzu........................................................................44 4.8 HPLC analýza.........................................................................................................45 5. Výsledky.......................................................................................................................47 5.1 Testování kultivačních médií..................................................................................47 5.2 Stanovení bílkovin v cytosolické frakci..................................................................48 5.3 Optimalizace metody..............................................................................................50 5.4 Inkubace doxorubicinu v čase................................................................................51 5.5 Vliv oracinu na redukci doorubicinu......................................................................52 5.6 Inkubace cytosolu s doxorubicinu a 50 μM oracinem............................................54 5.7 Stanovení cytotoxicity doxorubicinu......................................................................57 6. Diskuze.........................................................................................................................62 7. Závěr............................................................................................................................66 Seznam zkratek.................................................................................................................67 Použitá literatura..............................................................................................................69

4

ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Titul, jméno, příjmení kandidáta: Bc. Veronika Hanušová Titul, jméno, příjmení školitele: Doc. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D. Název diplomové práce: Cytotoxicita a metabolismus doxorubicinu v buněčné linii MCF-7. Doxorubicin (DOX) patří mezi antracyklinová chemoterapeutika významně se podílející na léčbě mnoha solidních nádorů, včetně karcinomu prsu, ale také mnoha hematoonkologických onemocněních. DOX je metabolizován na 13-OH-doxorubicinol (DOX-OL) produkovaný zejména karbonyl reduktasou 1 (CBR1). DOX-OL je méně antineoplastický, ale více kardiotoxický neţ původní sloučenina. Cílem této práce bylo studium redukce DOX a testování moţného zvýšení cytotoxicity DOX inhibicí jeho reduktas. K experimentům byla zvolena buněčná linie MCF-7, odvozená z prsního adenokarcinomu. Nejprve bylo zjištěno vhodné sloţení kultivačního média a optimalizován postup při přípravě vzorku pro HPLC analýzu. Při studiu metabolismu DOX v cytosolu MCF-7 buněk působil oracin (potencionální cytostatikum) jako významný kompetitivní inhibitor reduktas DOX. V testech cytotoxicity působil DOX toxičtěji v buňkách s přídavkem séra do média, oracin byl naopak toxičtější v buňkách bez přídavku séra. Kombinace DOXu s oracinem působila toxičtěji neţ samotný DOX na nádorové buňky MCF-7.

5

ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Title, Name, Surname of candidate: Bc. Veronika Hanušová Title, Name, Surname of tutor: Doc. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D. Title of a diploma work: Doxorubicin cytotoxicity and metabolism in MCF-7 cell line.

Doxorubicin (DOX) is ranked among anthracycline chemoterapeutics, significantly participant in the treatment of solid tumors, inclusive breast carcinoma and haematologic malignancies. DOX is metabolized to 13-OH-doxorubicinol (DOX-OL) produced by carbonyl reductase 1 (CBR1). DOX-OL is lower antineoplastic, but more cardiotoxic compared to the parent drug. Aim of this work was research of reduction DOX and testing possible increasing cytotoxicity of DOX through inhibition his reductase. For experiments has been selected human breast cancer cell line MCF-7. Initially has been elicit optimal composition of cultural medium and optimalized process on sample preparation for HPLC. In the study of DOX metabolism in cytosol the MCF-7 cells act oracin (potentional chemoterapeutic) as significantly kompetition’s inhibitor of DOX reductases. In cytotoxicity tests acted DOX more toxic in cells with bovine serum in medium, oracin was again more toxic in cells without bovine serum. Combination DOX with oracin acted more toxic than single DOX to tumor cells MCF-7.

6

1. ÚVOD Chemoterapie je v dnešní době rovnocennou terapií nádorových onemocnění ve srovnání s chirurgickou léčbou či radioterapií. Jednotlivé postupy se vzájemně prolínají a doplňují. Při léčbě je důleţité především rozhodnutí jaký typ terapie zvolit. Je třeba zhodnotit typ nádoru, stupeň pokročilosti onemocnění, vaskularizaci nádorového loţiska, klonální heterogenitu maligní populace, primární či sekundární (indukovanou) chemorezistenci a hlavně celkový stav nemocného (Chumchalová, Kovařík, 2000). Toxicita chemoterapeutik má vliv nejen na buňky nádorové, ale i normální buňky, coţ způsobuje vedlejší účinky těchto léčiv. I z těchto důvodů je nutné ke kaţdému pacientovi přistupovat individuálně a snaţit se zvolit optimální řešení, které ho minimálně zatíţí a přinese očekávané výsledky (Klener, 2002). Testování citlivosti nádorů in vitro je vhodné pro výběr nejúčinnějších cytostatik. Má samozřejmě své výhody i nevýhody. Tyto metody se vyuţívají v celé řadě nádorů a pro široké spektrum chemoterapeutik (Nosková a spol., 2000). Antracyklinová cytostatika patří mezi hlavní protinádorová léčiva. Doxorubicin je při terapii karcinomu prsu významným cytostatikem, ale je účinný i u dalších solidních tumorů a maligních onemocnění. Hlavním cílem současného studia doxorubicinu je zvýšit jeho toxicitu vůči nádorovým buňkám a současně sníţit vedlejší účinky tohoto cytostatika, zejména jeho kardiotoxicitu (Olson et al, 1988; Lincová, 2007). Cílem předloţené diplomové práce bylo studium metabolismu doxorubicinu a testování moţného zvýšení jeho cytotoxicity v buněčné linii MCF-7, linii odvozené z prsního nádoru.

7

2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Karcinom prsu Rakovina prsu je nejčastěji se vyskytující malignitou u ţen. Patří k onemocněním, jejichţ pravá příčina vzniku nebyla dosud uspokojivě vysvětlena. Jelikoţ patří mezi hormonálně závislé nádory, předpokládá se, ţe karcinogenní účinek mají zejména estrogeny. Ty indukují zvýšení exprese některých růstových faktorů a patrně i onkogenů, jejichţ produkty významně ovlivňují proliferační aktivitu buněk. Za fyziologických podmínek by tyto účinky měly být v rovnováze s antiproliferačními působky, jako jsou např. TGF-β (Klener 2002; Strnad a Daneš, 2001). Na vzniku nemoci se však podílí mnoho rizikových faktorů. Jsou to jak faktory ovlivnitelné, jako např. kouření, alkohol, obezita, ţivotní prostředí nebo psychické aspekty, tak faktory neovlivnitelné, neboli dispoziční, sem patří osobní anamnéza, věk, počet porodů, kojení, hormonální léčba nebo genetická rodinná zátěţ (Strnad, 2001). Rakovina prsu u muţů je mnohem vzácnější a vyskytuje se často ve spojení s Klinefelterovým syndromem. Poměr vzniku rakoviny u muţů a ţen je přibliţně 1:135. Prsní tkáň můţe být také v relativně vzácných případech cílovým orgánem pro metastázy některých solidních tumorů (Klener, 2002). S kaţdým rokem se zvyšuje mortalita na tato nádorová onemocnění. I kdyţ v poslední době došlo ke zlepšení diagnostiky i léčebných postupů, přesto je mortalita na toto onemocnění stále vysoká. Čím dříve se stanoví diagnóza, tím lepší jsou vyhlídky na přeţití. Základem úspěšného a včasného stanovení diagnózy a tedy i včasné léčby je soubor mnoha vyšetření a konzultace mezi jednotlivými odborníky. Na začátku je vyšetření klinické, zejména posouzení rodinné a osobní anamnézy a hlavně celkové fyziologické vyšetření se zaměřením na prsní tkáň (Klener, 2002). Při zjištění odchylek se obvykle vyuţívá zobrazovacích metod. Patří sem mammografie, ultrasonografie, počítačová tomografie, magnetická resonance a mnoho dalších. Pro odlišení sloţek nenádorového původu a diagnostiku metastáz ve vnitřních mammárních uzlinách se vyuţívá pozitronové emisní tomografie vyuţívající ke značení 99Tc. Jednotlivé metody se vzájemně prolínají a doplňují (Daneš, 2001, Dundová a spol., 2005). Biochemické vyšetření můţe napomoci monitorování nemocných vzhledem k rozsevu choroby i při hodnocení efektu terapie. Obvykle dochází ke zvýšení hladin některých testů.

8

Vyšetřují se jak testy jaterní, kreatinin, urea nebo elektrolyty, tak zejména humorální nádorové markery. U karcinomu prsu se v séru v průběhu nádorového růstu zvyšuje hladina karcinoembryonálních antigenů, TPA nebo hladina katepsinu D. Senzitivita těchto markerů bývá velmi dobrá a bývají často prvním ukazatelem recidivy. Dalším často pouţívaným vyšetřením z této oblasti je stanovení hormonálních receptorů. Z těchto markerů se vyšetřuje zejména estrogenový a progesteronový receptor (Lesná, 2008). V poslední době se do popředí dostává vyšetření molekulárně–biologické. To je zaměřené hlavně na určení mutace genu BRCA-1 a BRCA-2. Zjišťuje se také exprese receptoru pro HER-2/neu (c-erb-B2-receptor), který má jak prognostický, tak prediktivní význam (Petruţelka, 2008; Foretová, 2008). Spíše doplňkovým je vyšetření rodiny EGFR, určení proteinu p53 a faktorů podílejících se na angiogenezi VEGF, bFGF (Klener, 2002). Rozhodující význam má cytologické a bioptické vyšetření. Cytologické vyšetření je součástí předoperačního vyšetření, kdy vzorek získáme punkcí tenkou jehlou. Dále pak je to stereotaktická punkční biopsie, pomocí níţ lze klasifikovat karcinom a slouţí i k vyšetření receptorů her-2/neu, event. jiných markerů imunohistochemicky. Pooperační histopatologické vyšetření pomůţe odhalit biologický charakter karcinomu, velikost a především histologický typ odebrané tkáně. Je to metoda, která můţe potvrdit, či vyvrátit kancerogenitu nálezu a definitivně rozhodne o povaze procesu (Motlík a Ţivný, 2001). Podle určení typu nádoru a stavu organismu se přistupuje k terapii. Základní metodou je chirurgická léčba. Nádory prsu anatomicky vychází ze struktur mléčné ţlázy, které tvoří ţlázové těleso prsu, fibrósní a tuková tkáň. Odebírá se tkáň podle povahy a velikosti nádoru, obvykle však abnormální tkáň s nejméně 1 centimetrovým lemem nepostiţené tkáně (Klener, 2002). Chirurgickou léčbu je nutno doplnit radioterapií, která omezuje rizika lokální recidivy. U ohraničených nádorů se jedná o radioterapii s kurativním záměrem. Dalším typem je radioterapie paliativní, kdy je cílem zmenšení nádoru a moţnost operability (Petera a Filip, 2001). Hormonální léčba se vyuţívá zejména u ţen po menopauze, kdy bývá hlavní léčebnou metodou. Vhodnost léčby u premenopauzálních ţen je v případě nálezu pozitivních hormonálních receptorů nebo jako doplňková léčba po skončení chemoterapie, neboť u těchto ţen můţe indukovat ovulaci a tím i zvýšenou fertilitu (Fínek a spol., 2005). K léčbě karcinomu prsu je moţno vyuţít širokou škálu cytostatik s různými mechanismy účinku. Je to terapie toxická, proto se musí kombinovat s ostatními metodami. Zásadním poţadavkem na volbu chemoterapeutik je, aby byly toxičtější k buňkám 9

nádorovým, neţ buňkám normálním. Neměly by mít téţ zkříţenou resistenci a pokud moţno by měly působit synergicky (Petera a Filip, 2001).

2.2 Cytostatika 2.2.1 Obecné rozdělení Zhoubné nádory se vyznačují infiltračním a destruktivním růstem a nebezpečím tvorby metastáz. Příčinou selhání regulovaného růstu je „kumulace četných genetických poruch“. Můţe jít o genetické defekty, které indukují zvýšenou proliferaci nebo defekty s nedostatečnou eliminací buněk s chybnou reduplikací DNA (Klener, 2002). Cytostatika tlumí zejména růst s vysokou proliferační rychlostí. Nádorově zvrhlá tkáň se většinou dělí obzvláště rychle, proto ji cytostatika nejvíce postihují. Společně s ní jsou však postiţeny i zdravé tkáně, které mají vysokou frekvenci buněčného dělení a vznikají tak neţadoucí účinky jako je útlum kostní dřeně, poškození sliznic trávicího traktu, pohlavních ţláz, nebo vypadávání vlasů (Lüllmann, 2004). Pomocí chemoterapie je moţné vyléčení například u některých lymfomů nebo u leukémie. U karcinomů a sarkomů potom tato léčba většinou pouze zpomalí progresi maligního procesu. Během terapie se můţe vyvinout rezistence nádoru vůči pouţitému cytostatiku (Lüllmann, 2004; Nosková a spol., 2000). Podle mechanismu účinku lze cytostatika rozdělit takto: 1) léčiva poškozující strukturu a funkci DNA – z hlediska cytotoxického účinku dojde k inhibici replikace a transkripce, méně často dochází k inhibici translace. Z hlediska poškození struktury nukleových kyselin dochází k alkylaci kovalentní vazbou na DNA (alkylující látky, např. cyklofosfamid), uvolněním reaktivní platiny k rozštěpení molekuly DNA (např. cisplatina), interkalaci (např. antibiotikum doxorubicin) a nebo inhibici topoisomeráz (inhibitory topoisomerázy II: epipodofylotoxiny, např. etoposid; inhibitory topoisomerázy I, např. topotekan). a) látky ovlivňující syntézu DNA – cytotoxický efekt je způsoben inhibicí klíčových enzymů metabolismu, coţ vede k poruše biosyntézy nukleových kyselin a tím následně k inhibici buněčného dělení. Jedná se zejména o inhibici 10

dihydrofolátreduktázy (metotrexát) a inhibici ribonukleotidreduktázy (např. hydroxykarbamid), (Klener, 2002; Lüllman, 2004). b) zabudování falešných stavebních jednotek DNA – látky působící tímto mechanismem se strukturně podobají přirozeným metabolitům, proto je nazýváme analoga, nebo téţ antimetabolity. Nejčastěji jsou analoga nejprve metabolicky pozměněny, aktivovány většinou přeměnou na nukleotid a takto pak inkorporovány do nukleové kyseliny, nebo mohou způsobit inhibici metabolických reakcí mechanismem zpětné vazby. Můţeme je rozdělit na antimetabolity purinu (např. azathioprin) a antimetabolity pyrimidinu (např. 5fluorouracil). Strukturními změnami dochází i k poruše funkce a výsledkem je omezení buněčné proliferace (Klener, 2002; Lincová, 2007).

2) látky působící interakcí s mikrotubuly resp. s mitotickým vřeténkem – poškozují strukturu a funkci mikrotubulů a působí převáţně během mitózy, proto je někdy nazýváme mitotickými jedy. a) Inhibice polymerizace tubulinu nebo jeho rozrušení zablokuje průběh mitózy v metafázi (např. vinblastin, kolchicin). b) Léčiva s rychlým účinkem na mikrotubuly, kdy se tvoří nenormální mikrotubuly a stabilizují mikrotubuly jiţ vytvořené, resp. dochází k inhibici depolymerizace (taxany: např. paklitaxel)(Klener, 2002). 3) látky působící dalšími mechanismy a) inhibicí proteosyntézy – Syntéza bílkovin je jedním z podmínek růstu normálních i nádorových buněk. Nádorové buňky se od normálních liší rozdílnou schopností biosyntézy specifických aminokyselin jako je Lglutamin, nebo L-asparagin. Deplece aminokyseliny pomocí L- asparaginasy naruší proteosyntézu a omezí tím proliferaci. b) Kombinované účinky – v tomto případě můţe léčivo působit jako antimetabolit a současně alkylační látka (DTIC). Také většina interkalačních činidel působí současně inhibici topoisomerasy II (prokarbazin).

11

c) Poškození buněčné membrány – interakce cytostatik s buněčnou membránou můţe poškodit fluiditu, permeabilitu a integritu membrány (antracykliny). Některé látky inhibují vazbu růstových faktorů na receptory membrány, mění aktivitu

proteinkinás

V neposlední

řadě

a

fosfolipás

můţe

(alkyl-lyzofosfolipidy -

membránu

ovlivňovat

skupinu

edelfosin). polyaniontů

(chondroitinsulfát, dextransulfát) a polyaminy (spermidin, spermin). 4) látky ovlivňující regulační pochody organismu a) Hormony – jejich účinek je spojen s buněčnými receptory přítomnými v jádře nebo v cytoplazmě pro steroidní hormony a receptory v buněčné membráně jsou pak receptory pro regulační peptidy. Jedná se zejména o steroidní pohlavní hormony androgeny, estrogeny a gestageny. Další součástí kombinací mohou být glukokortikoidy, antiestrogeny, antiandrogeny a nebo inhibitory aromatasy. b) Regulační peptidy – mají charakter peptidických hormonů a účastní se regulace proliferace a diferenciace (tamoxifen). c) Cytokiny – tyto regulační peptidy zajišťují interakce mezi subpopulacemi leukocytů a působí tedy zejména na imunitní funkce (interleukiny, lymfokiny, monokiny). d) Hemopoetické růstové faktory – glykoproteiny stimulující růst buněčných kolonií progenitorových buněk (multi-CSF), faktory stimulující kolonie buněk imunitního systému (GM-CSF, EPO, TPO). e) monoklonální protilátky (Klener, 2002; Lüllman, 2004) Dodnes nebylo dosaţeno specifické terapie, tedy eliminace maligně zvrhlých nádorových buněk při současném zachování integrity buněk zdravých. Přesto lze opatrným výběrem, pouţitím vhodných léčiv a jejich časovou koordinací docílit v mnoha případech výrazného

přechodného

zlepšení

a

při

nádorovém

onemocnění

lymfatického

či

hemopoetického systému dokonce k vyhojení. Nejlepších výsledků lze dosáhnout vhodnou kombinací několika cytostatik (Petera a Filip, 2001).

12

2.2.2 Doxorubicin Četné látky ze skupiny léčiv s interkalačním účinkem jsou produkty streptomycet nebo aktinomycet. Interkalačním mechanismem působí aktinomycin D, antracyklinové deriváty, deriváty antrachinonu, deriváty akridinu a elipticiny (Lüllmann, 2004; Klener,2002). Jedním ze zástupců antracyklinů je doxorubicin (Adriamycin). Doxorubicin patří k antibiotikům

se

základní

strukturou

antracyklinu.

Chemicky

je

to

3-

hydroxyacetyldaunorubicin hydrochlorid, je tedy derivátem daunorubicinu, izolovaným ze Streptomyces peucetius (var.caesius). Původně to bylo antibiotikum proti gram-negativním bakteriím, nyní se pouţívá jako cytostatikum. Tyto látky mají kardiotoxické účinky, kdy mohou nastat akutní poruchy srdečního rytmu, později se můţe vyvinout srdeční nedostatečnost, která nereaguje na digitalis. Ve snaze získat méně kardiotoxické sloučeniny byly vyvinuty epirubicin, idarubicin a mitoxantron (Lüllmann, 2004; Lincová, 2007).

Obrázek 1. Strukturní vzorec doxorubicinu

13

2.2.2.1 Mechanismus účinku: Mechanismus účinku pro antracykliny souvisí s DNA v jádře buňky, která je hlavní cílovou strukturou cytostatického efektu. Antracykliny mají schopnost interkalace, tj. vmezeřování se mezi páry bazí DNA a inhibice funkce zejména topoizomerasy II (Klener, 2002). V přítomnosti antracyklinů se generují reaktivní sloučeniny kyslíku (peroxidací lipidů), které poškozují myokard a podmiňují tak kardiotoxicitu (Poprach, 2008). Interkalací rozumíme nekovalentní vazbu cytostatika na molekulu DNA vmezeřením mezi dvoušroubovici a navázání na ni vodíkovými můstky. Výsledkem je inhibice replikace a transkripce, tedy i inhibice syntézy RNA závislé na DNA (Klener, 2002).

Obrázek 2. Znázornění interkalačního účinku (Klener, 2002). Při protinádrorovém účinku se můţe téţ uplatnit inhibice funkce topoisomerasy II. Je to zásadní enzym pro replikaci. Váţe se na oba řetězce dvoušroubovice, přerušuje je a vzápětí opět spojuje v původní dvoušroubovici a umoţní tím separaci chromozomů při mitóze.

Obrázek 3a.Mechanismus účinku topoisomerasy II: A) DNA prodělává torzi podél vlastní osy. B) TOPO II se naváže na oba řetězce DNA. C) TOPO II přeruší řetězce a uvolní torzi. D) Řětězce se opět spojí (Klener, 2002).

14

Při blokádě funkce topoizomerasy II nedojde k opětnému spojení rozštěpených řetězců a tyto zlomy v DNA jsou pro buňku letální.

Obrázek 3b.Mechanismus inhibice účinku topisomerasy II. Krok A), B), C) jsou shodné jako při normální funkci TOPO II. D) Inhibitor TOPO II neumožní opětovné spojení a vznikají tak zlomy v DNA (Klener, 2002). Mezi další mechanismy cytostatik patří působení kyslíkových radikálů. Kyslíkové radikály vznikají nejméně dvěma mechanismy. Při redukci chinonového kruhu vzniká semichinon, který reakcí s kyslíkem poskytuje superoxid. Druhým mechanismem je vznik komplexu s ADP a ţelezitými ionty. Tento komplex reaguje s kyslíkem za vzniku perferylového komplexu, který se rozpadá za uvolnění peroxidu vodíku. Kyslíkové radikály pak způsobují poškození různých intracelulárních struktur, zejména mitochondrií a sarkoplazmatického retikula a poškození buněčné membrány (Klener, 2002; Poprach, 2008). Tyto radikály jsou také zodpovědné za peroxidaci lipidů. Tímto mechanismem se vysvětluje kardiotoxický účinek antracyklinů. Tkáň myokardu je chudá na antioxidační enzymy (superoxid dismutasa, glutathion reduktasa), proto se zde projeví toxický účinek nejvíce. Můţe dojít k aktivaci některých typů kalciových kanálů v sarkoplazmatickém retikulu s následným influxem Ca do buňky (Poprach, 2008; Kim 2006).

15

Obrázek 4. Schéma dvou cest vedoucích ke vzniku kyslíkových radikálů. Při redukci chinonového kruhu vzniká semichinon, který reakcí s kyslíkem poskytuje superoxid. Druhou možností je vznik komplexu s ADP a s železitými ionty. Tento komplex reaguje s kyslíkem za vzniku perferylového komplexu, jež se dále rozpadá za uvolnění peroxidu vodíku (Klener, 2002). Doxorubicin (DOX) zvyšuje hladinu prozánětlivých cytokinů (TNF-α, Il-2), které mají své receptory na kardiomyocytech. Hladiny uvolněných cytokinů se potom liší v závislosti na typu tumoru a jeho citlivosti vůči antracyklinům (Poprach a kol., 2008). Zdá se, ţe v případě DOXu se na toxických účincích podílí zejména hlavní metabolit – 13-OH-doxorubicinol (DOX-OL). Následkem jsou typické subcelulární změny struktury, tj. pomalá ztráta myofibril a vakuolizace buněk (Kassner, 2008). Studie buněčné kinetiky ukázaly, ţe DOX je účinný během celého buněčného cyklu včetně mezifáze. Rychle proliferující tkáně, například nádorová tkáň, ale i kostní dřeň, gastrointestinální sliznice, sliznice dutiny ústní a vlasové folikuly jsou proto nejcitlivější na antiproliferativní účinky DOXu (Klener, 2002).

2.2.2.2 Farmakokinetika: DOX je čirý červený roztok. Pro klinické účely se pouţívá jeho hydrochlorid, který je stabilnější. Můţeme ho aplikovat dvěma způsoby a to intravenózně, nebo intravezikálně. U intravenózního podání je vhodnější podat jako nitroţilní infuzi (izotonický roztok chloridu 16

sodného nebo 5 % roztok glukózy) předejde se tak vzniku tromboflebitidy, či periferní extravazace. Není tedy ani resorbován v gastrointestinálním traktu. Při intravezikálním postupu aplikujeme látku uvnitř do močového měchýře při léčbě superficiálních tumorů močového měchýře. Průnik léku do systémového oběhu je při tomto podání minimální (Novotná, 2008). Cytostatikum má rychlý počáteční plazmatický poločas 5-10minut, distribuce DOXu je převáţně do extravaskulárních kompartmentů a probíhá rychle a ve velké míře. Ze 75% se váţe na bílkoviny krevní plazmy, které brání rychlé biotransformaci cytostatika, na druhou stranu však můţe být příčinou sníţené dostupnosti léku pro cílové tkáně (Zhou, Chowbay, 2002). DOX je metabolizován ve značném rozsahu, hlavně játry. Prvním krokem enzymatické reakce antineoplastického léčiva DOXu je redukce na 13-OH-doxorubicinol (DOX-OL) produkovaný redukčním enzymem karbonyl reduktázou 1 (CBR1) a AKR1C3. Protoţe DOXOL je méně antineoplastický, ale více kardiotoxický neţ původní sloučenina, individuální poměr této reakce můţe ovlivnit antitumorový efekt a riziko DOXem indukované srdeční poruchy. Relativní expozice DOX-OL vůči DOXu se pohybuje od 0,4 do 0,6. DOX a DOX-OL převaţují rovněţ v moči a ve ţluči. Ostatní metabolity zastoupené v detekovatelných mnoţstvích v plazmě jsou aglykony DOXu a DOX-OL (Kassner, 2008; Novotná, 2008). Po intravenózním podání prochází plazmatické hladiny DOXu multifázovým poklesem. Terminální poločas DOX-OLu je podobný jako u DOXu. Plazmatická clearence je zaloţena především na metabolismu a na vylučování léku ţlučí. Eliminace můţe být ještě zpomalena zhoršenou funkcí jater. Odbourávání DOXu probíhá rozpadem na aktivní či neaktivní produkty. Většina, asi 40-50% přechází do ţluči a je během 7 dnů vyloučena z těla stolicí. 5-10% podané dávky je z těla eliminováno ledvinami během 5 dnů (Novotná, 2008). Primární odpověď na DOX v MCF-7 buňkách je buněčná smrt apoptózou. Na molekulární úrovni je hlavní příčinou mitochondriální dysfunkce a tedy důvodem apoptózy myocytů, několik jejich markerů. Po inkubaci DOXu s myocyty se objevují jak jaderné, tak i mitochondriální změny. Jiţ po 24 hodinách dochází k aktivaci kaspasy a kondenzaci chromatinu v jádře. Po dalších 48 hodinách dochází k vzestupu p53 a poklesu mitochondriálního membránového potenciálu. Tedy spíše neţ efekt léčiva na mitochondrie je zde zásadní jaderný vzestup p53 (Sardão et al, 2009). U zvířat byl prokázán mutagenní a teratogenní efekt DOXu. DOX prochází placentou i do mléka, kde se koncentruje. 17

2.2.2.3 Indikace: V hematologii se DOX indikuje v kombinaci k léčbě nehodgkinových lymfomů, Hodgkinovy choroby, mnohočetného myelomu, akutní lymfoblastické a myeloidní leukémie. U solidních tumorů patří mezi indikace karcinomu prsu, osteosarkomu, sarkomu měkkých tkání, malobuněčného bronchogenního karcinomu. Dále je pouţíván při karcinomu močového měchýře, ovaria, endometria, ţaludku a štítné ţlázy, jater, či léčbě pacientů s neuroblastomem a Wilmsovým nádorem. DOX je moţnou alternativou k léčbě nádorových výpotků v intrapleurální nebo intraperitoneální aplikaci (Cil, 2009; Klener, 2002, Novotná, 2008). 2.2.2.4 Nežádoucí a vedlejší účinky: Pouţívání DOXu je spojeno zejména s kardiotoxicitou, která je výsledkem interakce mezi DOXem a redukovanou formou exogenní NADH dehydrogenasy (NADH-D). Tato interakce byla nalezena v kardiální mitochondrii a má za následek produkci reaktivních směsí kyslíku (ROS) (Machado et al). Kardiotoxicitu způsobenou DOXem můţeme rozdělit na akutní, pozdní a chronickou. Akutní kardiotoxicita je přechodná, reverzibilní, eventuálně klinicky zvládnutelná antiarytmiky. Objevuje se bezprostředně po první dávce (během 24 hod.) nebo jako následek první léčebné kúry změnami na EKG a arytmiemi. Po skončení arytmie můţe léčba pokračovat (Fan, 2008; Klener, 2002). Kardiotoxicita způsobená dlouhodobějším podáváním DOXu, označovaná jako chronická, se projevuje kardiomyopatií, která můţe mít za následek srdeční selhání. s kumulativní dávkou (> nebo = 550 mg/m2). Klinicky se manifestuje náhle, většinou během prvního roku léčby, nejčastěji 1-2 měsíce po poslední dávce a rychle progreduje. Je poměrně rezistentní na léčbu a můţe tak ohrozit ţivot nemocného. Její prognóza bývá váţná (Salvatorelli, 2009). Pozdní kardiotoxicita se můţe manifestovat po více letech aţ desetiletích (4-20 let) od ukončení léčby. V elektrických vlastnostech se projevuje poruchami vodivosti a tachyarytmiemi. Poškození myocytů a dysfunkce komor mívá za následek pozdní dekompenzaci srdce. Tento typ kardiotoxicity byl popsán i u dětí (Lüllman, 2004; Klener 2002; Fan, 2008).

18

Mezi další neţádoucí účinky počítáme hlavně myelosupresi s granulocytopenií, případně trombocytopenií, které jsou obvykle závislé na dávce cytostatika. Účinky doxorubicinu se projevují také na funkci granulocytů in vitro, kde způsobují inhibici chemotaxe a fagocytózy, potlačují degranulaci a uvolnění lysozomálních enzymů (Novotná, 2008). Emetogenní účinek, který byl pozorován asi ve 30-40% případů, řadí antracykliny mezi střední aţ silné emetogeny. Nauzea a zvracení se dají podstatně zmírnit aţ odstranit antagonisty S3 receptorů (ondansetron aj.). Vliv na gastrointestiální trakt dále prezentuje anorexie, průjmy, eventuálně tenezmy a záněty střevní sliznice (Klener, 2008). Léčba DOXem je spojena s významnou alopecií v 90-100% případů. Manifestuje se přibliţně

za

3

týdny

po

první

dávce

DOXu.

V

současnosti

není

k dispozici ţádný prostředek, kterým by se dalo tomuto časnému vlivu zabránit. Paravazální podání při i.v. aplikaci vede k lokální nekróze tkání a k tromboflebitidě (Novotná, 2008). Objevuje se zvýšené riziko postradiačních lézí neboli Recall fenomen. Můţe dojít téţ k obnově dříve vyhojených lézí v exponované oblasti v případě předchozí nebo současné radiační terapie. Byl pozorován také účinek na reprodukční systém, který se projevil azoospermií u muţů a amenoreou u ţen (Petera a Filip, 2001).

2.2.3 Oracin Oracin

je

potenciálním

cytostatikem,

jedná

se

chemicky

hydroxyethyl)aminoethyl]-5,11-dioxo-5,6-dihydro-11H-indeno[1,2-c]isochinolin.

o

6-[2-(2Patří

do

skupiny derivátů antrapyrazolu. Vzniká substitucí postranních řetězců na antracenovém jádře antrachinonů. Oracin je v současnosti v II. fázi klinických zkoušek (Wsól, 2004; Klener, 2002).

19

Obrázek 5. Strukturní vzorec oracinu – hydrochloridu

2.2.3.1 Mechanismus účinku: Podle provedených studií bylo zjištěno, ţe se jedná o interkalační cytostatikum strukturně blízké mitoxantronu s prokázanou protinádorovou účinností v celé řadě experimentálních nádorů. Inhibuje replikaci a transkripci a tím i syntézu nukleových kyselin a bílkovin v kulturách nádorových buněk (Melka, 1993). Mechanismus účinku se podobá antracyklinům a antrachinonům. Na cytotoxickém účinku se tedy podílí interkalace či inhibice topoisomerasy II, u oracinu však v preklinických studiích nebyla prokázána kardiotoxicita přípravku. Moţným mechanismem je i pevná vazba na cytoskeletální protein cytokeratin 8 (Klener, 2002).

2.2.3.2 Farmakokinetika : Oracin je účinný při intravenózním i při perorálním podání.

Látka má vysoký

distribuční objem, průměrný eliminační poločas je 12,4 hod (Klener, 2002).

Hlavními

metabolity oracinu jsou 11-dihydrooracin (DHO) a 3-hydroxyoracin (3-HO). Tyto metabolity byly u laboratorního potkana nalezeny na úrovni in vitro i in vivo. V jaterních mikrosomech potkana se na metabolizaci podílí 11-hydroxysteroiddehydrogenasa typ 1 (11-HSD1). Při experimentech s lidským jaterním cytosolem probíhala metabolizace za účasti AKR1C1, 1C2 a 1C4 (Wsól et al, 2004; Szotáková et al, 2003, Novotná, 2008). Farmakokinetická studie odhalila, ţe oracin je odolný vůči metabolické inaktivaci karbonylovou redukcí. Metabolická inaktivace přispívá ke vzniku chemoterapeutické resistence.

20

Oracin je u potkana redukován na DHO ve všech sledovaných orgánech i bakteriemi GIT. V subcelulárních frakcích všech extrahepatálních orgánů byl přednostně tvořen (+)DHO. Oracin je více redukován bakteriemi tenkého neţ tlustého střeva a největší redukční aktivita byla nalezena u bakterií slepého střeva. Odlišnou stereospecifitu redukce vykazovala střevní mikroflóra, kdy bakterie tvořily ve větší míře (-)-DHO (Wsól et al, 2004). Vylučuje se jednak ve formě metabolitů, jednak v nezměněné formě, převáţně do stolice. Z neţádoucích účinků se předpokládá mírná hematologická toxicita, nevolnost a pyretická reakce. Vstupní dávky léčiva se pohybují mezi 125-500mg/m2 (Klener, 2002). 2.3 Buněčné linie

Obrázek 6. Buněčná linie MCF-7 (x100) Původní MCF-7 buněčná linie karcinomu prsu pochází od 69-tileté ţeny, která během pěti let podstoupila dvě mastektomie. Odstraněná tkáň z první mastektomie byla benigní, ale po druhé operaci byl nalezen maligní adenokarcinom. V průběhu tří let byla ţena léčena lokální opakovanou radioterapií a hormonální terapií. Po odstranění uzlin v hrudním koši byl objeven pleurální výpotek. Buněčná linie MCF-7 byla získána v roce 1970 pravě z tohoto pleurálního výpotku (The university of Texas MD Anderson Cancer center, 2008). MCF-7 buněčná linie je získávána z různých zdrojů , nejčastěji od NIH a ATCC. Kdyţ se porovnají karyotypy, růstové křivky, růst v agaróze, obsah estrogenového a progesteronového receptoru a růst nádoru, lze nalézt určité rozdíly v jednotlivých liniích z různých zdrojů. MCF-7 buňky mají tendenci růst v koloniích. Mohou růst na měkkém agaru. Buňky nejsou schopné penetrovat kolagenní fibroblastovou matrix. V Boydenské komoře chemoinvazivní analýzy byla zjištěna nízká aţ průměrná aktivita, coţ ukazuje, ţe in vitro má MCF-7 nízkou invazivní schopnost.

21

MCF-7 linie si zachovává pravou charakteristiku diferencované prsní epiteliální tkáně zahrnující schopnost prostupu estradiolu přes cytoplasmatické estrogenní receptory a schopnost tvořit domény (The university of Texas MD Anderson Cancer center, 2008). In vivo v myších buňky MCF-7 jsou schopné formovat nádor, který roste rychleji v přítomnosti 17 β-estradiolu. Za letální dávku pro MCF-7 se povaţuje hranice 5x106 buněk. Jedna studie uvádí, ţe buňky MCF-7 v myších neutváří metastázy, ale jiné tvrdí, ţe jsou pozorovány obě formy, spontánních i experimentálních metastáz v těchto buňkách, přičemţ experimentální metastázy byly pozorovány pouze v případech s podporou estrogenů (Zivadinovic, 2005). Zvýšeně jsou v MCF-7 exprimovány některé důleţité faktory jako E-kadheriny, receptory pro epidermální růstový faktor, progesteronový a estrogenový receptor. Naopak postrádají expresi hlavního fibroblastového růstového faktoru, některých matrixových metaloproteas a vimentinu. Obsahují Tx-4 onkogeny. Růst MCF-7 je inhibován tumornekrotickým faktorem alfa. Sekrece IGFBP můţe být modulována zpracováním s antiestrogeny (IGFBP 1,3 je sníţena, IGFBP 2,4,5 je zvýšena) (Bursch, 2008). Pro kultivaci je nejčastěji vyuţíváno kultivační médium s přídavkem hovězího séra (FBS), v mnoha případech obohaceno u různé aminokyseliny, dále pak antibiotikum a pufračního roztok. V některých studiích byl přidáván bovinní insulin. Jako modelový systém prsní tkáně je kromě linie MCF7 vyuţívána nenádorová buněčná linie MCF-10A

Obrázek 7. Buněčná linie MCF-10A (x100) Jedná se o nenádorovou epiteliální buněčnou linii. MCF-10A byla vyprodukována dlouhodobou kultivací v médiu bez séra s nízkou hladinou Ca2+. Obsah vápníku v médiu se projevuje silným efektem na morfologii buněk. Byly odvozeny z adherentních buněk běţně se vyskytujících v populaci. Buňky jsou pozitivní na epiteliální sialomuciny, cytokeratiny a globulární antigeny mléčného tuku. V kolagenu jsou schopny trojrozměrného růstu a v konfluentních kulturách tvoří domény. Buňky vykazují znaky terminální diferenciace a

22

stárnutí. Linie je citlivá k inzulinu, glukokortikoidům, cholerovému endotoxinu a epidermálnímu růstovému faktoru. Charakteristika buněk je zobrazována pomocí elektronové mikroskopie jako luminální duktální buňky. Exprimují prsní specifický antigen, coţ se vyuţívá jako detekce při pozitivní reakci s MFA prsními a MC-5 monoklonálními protilátkami. Pro kultivaci se pouţívá kultivační médium sloţené z 95% média a 5% DMSO (Lawrence Berkeley National Laboratory, 2008). 2.4 Enzymová výbava MCF-7 x MCF-10A Nádorové (MCF-7) a normální zdravé buňky (MCF-10A) se liší svým metabolismem a tedy i enzymatickou výbavou, která následně ovlivňuje metabolismus léčiva. V jednotlivých liniích je aktivita a exprese těchto enzymů odlišná. AKR je nadrodina aldo-keto reduktas. Tyto enzymy katalyzují přeměnu aldehydů a ketonů na jejich odpovídající alkoholy pouţívající NADH nebo NADPH jako kofaktory. AKR1C1

(dihydrodiol

dehydrogenase

1;

20-α

(3-α)-hydroxysteroid-dehydrogenasa)

katalyzuje reakci progesteronu na inaktivní formu 20-α-hydroxyprogesteron. AKR1C2 (dihydrodiol dehydrogenasa 2; 3-α-hydroxysteroid dehydrogenasa, typ III) váţe s vysokou afinitou ţlučové kyseliny. Ve studii Ji et al byla pouţita MCF-7 a MCF-10A pro zjištění aktivity a mnoţství AKR1C1 a 1C2 v souvislosti s metabolismem progesteronu. Prsní nádorová linie MCF-7 exprimovala sníţeně AKR1C1, naproti tomu prsní epiteliální buněčná linie MCF-10A exprimovala AKR1C1 v hladině srovnatelné s normální prsní tkání. Imunohistochemické stanovení potvrdilo sníţení exprese AKR1C1 v prsním nádoru. Potlačení AKR1C1 a AKR1C2

přidáním 20-α-dihydroprogesteronu bylo spojeno se

vzestupem progesteronu v MCF-10A buňkách. V buňkách prsního nádoru se předpokládá, ţe ztrátou AKR1C1 a AKR1C2 dojde k poklesu progesteronového katabolismu (Ji et al, 2004). Lewis et al zaznamenal expresi AKR1C1, 1C2 a 1C3 v buněčné linii MCF-7 ve sníţené míře v porovnání s MCF-10A buněčnou liní (Lewis et al, 2004). AKR1C3 (3-α-hydroxysteroid dehydrogenasa, typ II) katalyzuje redukci PGD2, PGH2 na fenantrenchinon a oxidaci 9-α, 11-β PGF2 na PGD2. To by mohlo hrát důleţitou roli v patogenezi alergických nemocí, jako je astma a mohl by tedy být důleţitý v kontrole buněčného růstu a/nebo diferenciaci. Azzarello detekoval AKR1C3 v hormon dependentních (MCF-7) i nehormon dependentních tkáních. Enzym se účastní regulace ligandových vstupů 23

do androgenového receptoru, estrogenového receptoru a peroxismálního proliferátoru receptoru gama v hormonálně cílené tkáni (Azzarello et al, 2008). Gavelová et al v MCF-7 buněčné linii zjistili, ţe aktivita cytosolické AKR1C3 a mikrosomálních reduktas vůči doxorubicinu byla niţší v porovnání s CBR1 (Gavelová et al, 2008). V duktálním karcinomu in situ byla zjištěna silná imunoreaktivita enzymu AKR1C3. V normálních epiteliálních buňkách byla imunoreaktivita slabší (Lin, 2004). Cytochrom P45019A1 (CYP19A1, aromatasa) je lokalizována v endoplasmatickém retikulu a katalyzuje poslední krok biosyntézy estrogenů, přeměnu androstendionu na estron. Při experimentech byly zjišťovány inhibitory aromatasové aktivity v MCF-7 a MCF-10A buňkách. Chen et al v experimentech pouţil extrakt z muchomůrek pro zjištění podmínek inhibice buněčné proliferace. Po přidání extraktu z muchomůrek byla potlačena testosteronem indukovaná proliferace v MCF-7, oproti MCF-10A, kde byla inhibice méně uspěšná (Chen et al, 2006). 25-hydroxyvitamin D-3-1-α-hydroxylasa (CYP27B1, 1-α-hydroxylasa,) je klíčový enzym při tvorbě kalcitriolu. Byl nalezen v prsních nádorových buňkách, kde podléhá autokrinní regulaci tvorby kalcitriolu. Fisher et al v MCF-7 zjistil za pomoci nested PCR vyšší aktivitu enzymu neţ v MCF-10A buňkách (Fisher et al, 2007). Karbonyl

reduktasa,

typ

1

(CBR1)

je

monomerní

NADPH

dependentní

oxidoreduktasa, která má širokou specifitu pro karbonylovou skupinu. Účastní se redukce chinonů, prostaglandinů a xenobiotik obsahujících karbonylovou skupinu. Tento enzym je široce rozšířen v těle (Bateman et al, 2008). Gavelová et al zjišťovali hlavní enzymy účastnící se karbonylové redukce v DOX a oracinu v MCF-7. Hlavním enzymem redukujícím karbonylovou skupinu obou těchto léčiv byla stanovena CBR1 (Gavelová et al, 2008). Steroid-5-α-reduktasa, typ 1 (SRD5A1, 5α-reduktasa, typ 1; 5α-R1) a steroid-5-αreduktasa, typ 2 (SRD5A2, 5α-reduktasa, typ 2; 5α-R2) katalyzují přeměnu testosteronu na dihydrotestosteron. Lewis et al ve své studii zjistil, ţe exprese SRD5A1 (5-αR1) a SRD5A2 (5-αR2)

je zvýšená v MCF-7 buněčné linii v porovnání s nenádorovou buněčnou linií

MCF10A (Lewis et al, 2004). Karboxylesterasa 1 (CES1, monocyt/macrofág serin esterasa, typ 1) hydrolyzuje aromatické a alifatické estery a je nezbytná pro esterifikaci buněčného cholesterolu. Můţe také hrát důleţitou roli při detoxifikaci a ochraně plic a CNS před ester nebo amidosloučeninami. Deficit karboxylesterasy bývá spojen s nehodgkinovým lymfomem nebo B-buněčnou lymfocytární leukémií. Barthel zjistil při svých experimementech v MCF-7 buňkách nízkou hladinu tohoto enzymu (Barthel, 2008). 24

Superoxid dismutasa (MnSOD) hraje důleţitou roli při nádorovém bujení. MnSOD se uplatňuje u potlačení tumorového efektu v estrogen dependentních prsních kancerogenních buňkách. Kattan et al zjistil, ţe estrogen dependentní lidské prsní nádorové buňky (MCF-7) exprimovali výrazně niţší hladinu MnSOD ve srovnání s estrogen nezávislými buňkami (Kattan et al, 2008). Kalinina et al také v experimentech s MCF7 resistentních k doxorubicinu zjistil pokles na úrovni mRNA enzymu MnSOD při současné produkci ROS ( Kalinina et al, 2006). Při dalších experimentech Weydrt et al testoval jak MCF-7, tak MCF-10A buněčné linie a zjistil, ţe MnSOD a ZnCuSOD sníţili in vitro u těchto buněčných linií růst. Působí tedy jako inhibitory růstu nádoru (Weydert et al, 2008). Exprese selenocystein-dependentní thioredoxin reduktasy (TrxR) vzrůstá v různých lidských primárních tumorech spojených s růstem agresivního tumoru a poklesem přeţití pacientů. Trx/TrxR se ukázala jako důleţitá cílová molekula pro vývoj antikancerózních léků. Engman et al pouţil MCF-7 pro experimenty zaměřeny právě na komplex Trx/TrxR (Lu et al, 2007; Engman et al, 2006). Gupta et al provedl experimenty s cílem inhibice kancerogenní a mutagenní aktivity, které byly zaměřeny na xanthin oxidasu. Tento enzym při svých reakcích vytvářel superoxid a tím xanthin oxidasa pozitivně působila na růst buněčných nádorových linií mimo jiné na MCF-7. Strategií této léčby bylo zaměření na inhibici xanthin oxidasy (Gupta et al, 2008). Při dalším z experimentů Bae et al byla zkoumána role peroxiredoxin (Prx) enzymů během buněčné odpovědi na oxidační stres. Pouţitím specifických protilátek byl zjištěn výskyt Prx isoforem Prx I a II, na úrovni proteinů a mRNA při imunoblottové analýze v buněčné linii MCF-7. Byla srovnávána normální prsní linie MCF-10A a linie karcinomu prsu MCF-7. Buňky byly vystaveny expozici peroxidem vodíku. Při zpracování MCF-10A s peroxidem vodíku skončilo úplnou smrtí buněk, zatímco MCF-7 byly rezistentní k peroxidu vodíku. Tyto objevy ukázaly, ţe Prx I a II mají důleţítou funkci jako inhibitory buněčné smrti během působení oxidačního stresu na buňku (Bae et al, 2007). Glutathion peroxidasa (GPx1), je cytosolický enzym důleţitý při ochraně proti hydrogenové a lipidové peroxidaci, je tedy důleţitým antioxidačním enzymem. V aktivním místě obsahuje selenocystein. Vibet et al zjistil při testování nádorových linií nárůst aktivity tohoto enzymu v linii MCF-7 v reakci na ROS (Vibet et al, 2008) i v přítomnosti DOXu (Kalinina et al, 2006). Glutathion-S transferasa (GST-s) patří do rodiny detoxifikačních izoenzymů chránicích buňky proti konjugaci GSH v různých toxických směsích a mohou tedy hrát roli v regulaci, buněčné proliferaci a apoptóze. Yao et al testoval buňky MCF10A s metabolitem 25

katecholového estrogenu 4 - hydroxyequilenin (4-OHEN) in vitro. Zde po přidání 4-OHEN došlo ke sníţení GST aktivity v netransformovaných lidských prsních epiteliálních buňkách MCF10A (Yao et al, 2002). Ozkan a Fiskin testovali in vitro na MCF-7 buňkách ochranný efekt antioxidačních enzymů vůči EPI (epirubicin). Western blottovou analýzou byla zjištena zvýšená exprese NADPH - dependentní cytochrom P-450 reduktasa (NADPH-CYP450 R), GST, GPx 1 a GSH v přítomnosti EPI, takţe chránili MCF-7 před působením ROS a H2O2 (Ozkan, Fiskin, 2006). Djuric et al zjistil v MCF-7 prsní nádorové linii relativně vyšší hladinu neproteinových thiolů, oxidované glutathion reduktasy (GSSG-R), katalasy a superoxid dismutasy neţ měly MCF-10A netransformované lidské prsní epiteliální buňky (Djuric et al, 1993). Ve studii provedené Ott et al byla také zjištěna GSSG-R aktivita a aktivita cyklooxygenasy-1 (COX-1) v buňkách MCF-7 (Djuric et al, 2005). Metaloproteasa-2, 9 (MMP-2 a MMP-9) jsou součástí metaloproteinasové rodiny endopeptidas a hrají důleţitou roli v degradaci extracelulární matrix v průběhu remodelace tkáně, angiogeneze a metastazování. Ve zvýšené míře byly exprimovány v nádorových buňkách. Toth et al v nenádorových buňkách MCF-10A pomocí imunoprecipitačních protilátek zjistil 2 isoformy enzymu MMP-9 (Toth et al, 1997). Katechol-O-methyl transferasa (COMT) katalyzuje přenos methylové skupiny z Sadenosylmethioninu na katecholaminy, včetně neurotransmiterů dopaminu, epinefrinu a norepinefrinu. COMT byl nalezen ve tkáni ve dvou formách, rozpustné (S-COMT) a vázané na membránu (MB-COMT). Hui et al sledoval vliv katechol estrogenů na aktivitu COMT (katechol-O-methyl transferasa) v cytosolu na MCF-7 a MCF-10A buňkách. Při experimentu byl popsán sníţený vliv COMT na buněčný růst, katechol-estrogen zprostředkované poškození DNA a buněčný cyklus u obou linií. COMT tedy hraje zásadní roli při vymezení genotoxického vlivu vyvolaného katechol-estrogeny (Hui et al, 2008). Současně při testování COMT byly zjišťovány aktivity cytosolické sulfotransferasy (SULT). Je to enzym subcelulárně lokalizovaný v cytoplasmě, katalyzuje přenos sulfátu a není indukovatelný xenobiotiky (Dostálek et al, 2006). Enzymatická analýza odhalila, ţe 5 SULT (1A1, 1A2, 1A3,1C4, 1E1) z 11 známých lidských SULT by mohlo být pouţito k testování katecholestrogenů a methoxyestrogenu jako substrátu v MCF-7 i MCF-10A linii. SULT1E1 isoforma měla zjištěnu nejsilnější sulfátovou aktivitu (Hui et al, 2008). Wakefield et al sledovali vztah mezi expresí enzymu arylamin N-acetyltransferasy typu 1 (NAT1) a ER pozitivitou (+) a biologickou roli NAT1 v progresi prsního karcinomu. 26

Jako ER+ buněčná linie byla pouţita MCF-7, kde byla zjištěna její aktivita. Transkript NAT1 by mohl být důleţitým prognostickým markerem pro ER+ prsní karcinom (Wakefield et al, 2008). Aldehyd dehydrogenasa (ALDH) je enzym ze skupiny oxidoreduktas, má širokou specifičnost. Katalyzuje oxidaci (dehydrogenaci) aldehydů. Chen a Waxman (1995) v MCF-7 buňkách zjistil zvýšení cytosolické ALDH. Nevýznamné změny nastaly i v NADPH cytP450 reduktasové aktivitě. V MCF-10A tyto enzymy nebyly popsány. Lehmann a Wagner ve své studii kvantifikovali hladinu mRNA estradiol metabolizujících isoenzymů exprimovaných v MCF-7 a hodnoty byly porovnávány s normální lidskou prsní ţlázou. CYP1A1, 1B1, SULT1A1, 1A2, membránově vázaná i rozpustná forma COMT, GSTT1, NADPH-chinon-oxidoreduktasa (QR1), a UDPglukuronosyltransferasa (UGT2B7) byly zjištěny v obou tkáních. UGT nebyly detekovány v MCF-7 v přítomnosti steroidů. MCF-7 buňky kultivované bez steroidů exprimovaly CYP1A2, UGT1A4, 1A8, a 1A9. UGT1A8 byl detekován pouze v MCF-7 linii. UGT je enzym lokalizovnaý uvnitř mikrosomů a patří mezi konjugační enzymy. Produkty glukuronidace jsou O-, N- a S-glukuronidy (Lehmann a Wagner, 2008). Leung et al se zabývaly spojitostí enzymů CYP1A1 and UGT1A1 v souvislosti s výskytem rakoviny prsu u ţen. Zjistili, ţe oba tyto enzymy byly v MCF-7 exprimovány (Leung et al, 2007). Manni et al MCF-10A infikoval retrovirálním vektorem obsahujícím cDNA kódující ornithin dekarboxylasu (ODC). V těchto buňkách byl pozorován pokles S-adenosylmethionin dekarboxylasy a naopak vzestup spermidin/spermin N1-acetyltransferasy (Manni et al, 1997). Na základě poznatků z dostupné literatury lze shrnout, ţe buňky nádorové a normální prsní tkáně mají rozdílné aktivity/expresi některých enzymů. Nalezené údaje shrnuje tabulka 1. Určité enzymy účastnící se metabolismu xenobiotik jsou v nádorových buňkách exprimovány intenzivněji, naopak exprese jiných je oproti normálním buňkám sníţena.

27

Tabulka 1. Přehled enzymů exprimovaných v buněčných liniích MCF-7 a/nebo MCF-10A. enzymy

MCF-7

MCF-10A

AKR1C1

+ (↓)

+

AKR1C2

+ (↓)

+ (↑)

AKR1C3

+ (↓)

+ (↑)

AKR27B1

+ (↑)

+ (↓)

AKR19A1

+

+/-

SRD5A1

+ (↑)

+

SRD5A2

+ (↑)

+

CBR1

+ (↑)

nepopsáno

GSSGR

+ (↑)

+

PrxR 1,2

+

-

QR1

+

nepopsáno

TrxR

+

nepopsáno

ALDH

+ (↑)

nepopsáno

CES1

+ (↓)

nepopsáno

MnSOD

+

+

ZnCuSOD

+

+

COX-1

+

nepopsáno

GPx1

+

nepopsáno

katalasa

+ (↑)

+

Xanthin oxidasa

+

nepopsáno

MMP-2

+ (↑)

+

MMP-9

+ (↑)

+

COMT

+

+

NAT1

+

-

SULT*1

+

+

UGT *2

+

nepopsáno

1

* 1A1, 1A2, 1A3,1C4, 1E1 (SULT1E1 měla nejsilnější sulfátovou aktivitu)

*2

(1A1, 1A4, 1A8, 1A9, 2B7)

28

2.5 Buněčné kultury

Kultivace buněčných a tkáňových kultur se stala součástí rutinních i experimentálních metod. Experimentálně se kultivace buněk in vitro pouţívá zejména pro vývoj a testování nových léčiv. Jako buněčné kultury se zde vyuţívají jednotlivé součásti rostlinného, lidského, nebo i zvířecího těla. Kultivace je však nedílnou součástí i v klinické praxi, například při hodnocení kvality štěpu pro transplantaci kostní dřeně. V tomto případě se kultivují zejména krevní kmenové buňky. Slouţí také jako zdroj materiálu pro biotechnologické aplikace např. při produkci monoklonálních protilátek (Vejraţka, 2008). Ve výzkumu patří buněčné kultury mezi nejpouţívanější biologické modely. Buněčné linie mají řadu výhod, jako např. sledování úlohy určitých enzymů, receptorů pro jediný typ buněk, jsou také alternativou nádorových buněk, ale oproti nim jsou lépe definovány. Nevýhodou těchto kultur je, ţe podmínky in vitro nemůţou plně napodobit podmínky in vivo. Chybějící okolní tkáň běţně přítomná v těle, stejně jako zastoupení a aktivita enzymů, nebo nefyziologické kultivační podmínky se potom značně liší od původní tkáně. Někdy během kultivace můţe dojít k dediferenciaci nebo buňky změní svůj fenotyp. Při práci s kulturami je nutné pracovat ve speciálně vybavené laboratoři a pouţívat zvláštní spotřební materiál a chemikálie bez běţných kontaminantů (Chumchalová a Kovařík, 2000). Buněčné kultury můţeme vytvořit přípravou z vlastních buněčných linií z primokultur, nebo lze buněčné kultury nakoupit ze sbírek (Vejraţka, 2008). První způsob, tedy zaloţení buněčných linií z primokultur, se zakládá izolací určitého typu buněk ze zvířete, člověka nebo rostliny. Prvním krokem izolace buněk, ať uţ z rostlinného, tak ze ţivočišného materiálu je technika zaloţená na mechanické disociaci tkáně. Pouţívá se jemných postupů zejména rozbití tkáně těsnícím rotačním pístem, disociace pomocí ultrazvuku, pouţitím mírných detergentů, natrávením pomocí enzymů nebo sběrem odloupaných buněk z tělesných tekutin (Alberts, 2005). Buňky se kultivují nejčastěji adherované na vhodném povrchu, ať uţ plastových lahvích nebo miskách, méně často v suspenzi jako např. krevní buňky či zakotvené ve vhodné matrix. K identifikaci izolovaných buněk se zpravidla pouţívají imunocytochemické techniky nebo molekulárně biologické metody (Michalová, 2008; Vejraţka, 2008). Kultivační podmínky se snaţí napodobit vnitřní prostředí organismu. Buňky se pěstují při tělesné teplotě ve speciálních nádobách v termostatu, kde se udrţují v atmosféře se

29

zvýšeným parciálním tlakem oxidu uhličitého (5%) a rostou v kultivačním médiu (Michalová, 2008; Chumchalová a Kovařík, 2000). Důleţité jsou zejména vlastnosti povrchu kultivační nádoby Většina buněčných typů vyţaduje hydrofobní povrch, dnes nejčastěji pouţívaný speciálně ošetřený polystyren. Pouţívají se kultivační lahve o velikostech 25 a 75cm2 , nebo misky o různých velikostech (Vejraţka, 2008). Po určité době dojde k vyčerpání ţivin z média a buňky se namnoţí tak, ţe pokrývají celou plochu kultivační lahve a nemohou se jiţ dále dělit, proto je nutné provézt pasáţ. Při pasáţi dochází k naředění konfluentních buněk tak, aby měly dostatek místa pro další dělení a růst. Během pasáţe dochází k uvolnění buněk od kultivačního povrchu pomocí proteas a naředěná buněčná suspenze se nasadí do nové kultivační nádoby, nebo je pouţita na další experimenty. Nárůst buněk u většiny linií je přibliţně exponenciální aţ do okamţiku, kdy se buňky začnou těsně dotýkat. V důsledku tzv. kontaktní inhibice pak dochází ke zpomalení či zastavení růstu. Pokud jsou buňky po pasáţi správně zhomogenizovány, většina adherentních kultur roste v tzv. monovrstvě ( monolayer) (Vejraţka, 2008). Některé kultivované buňky mají omezenou ţivotnost, dokáţí se dělit pouze po určitou dobu. Po několika pasáţích stárnou, ztrácí schopnost dělení, aţ tato schopnost úplně vymizí. Jsou to především buňky odebrané z orgánů nebo tkání přímo nasazené do kultivačního média. Tyto buňky jsou tedy smrtelné. Můţeme ale také pracovat s buněčnými kulturami tvořenými spontánně, chemicky či virově transformovanými buňkami, jedná se o tzv. kontinuální linie. Mají neomezený potenciál dělení a jsou tedy „nesmrtelné“ (Červenková, 2001). Pro laboratoře tkáňových kultur je důleţité speciální vybavení a je nutné pracovat ve sterilně čistém prostředí podléhající zvlášťnímu reţimu. Mezi základní vybavení patří laminární box, inkubátor s řízenou atmosférou, který udrţuje jak zvýšený parciální tlak oxidu uhličitého (5%), tak vysokou relativní vlhkost, vyhřívanou lázeň a v neposlední řadě potřebujeme inverzní mikroskop vybavený fázovým kontrastem. Pro kultivaci, pasáţ a další experimenty se pouţívá jednorázový plastový materiál, kultivační nádoby s upraveným povrchem a chemikálie pro pouţití s buněčnými kulturami (Červenková, 2001; Vejraţka, 2008). Ţivé buňky lze dlouhodobě skladovat zmraţené kapalným dusíkem nebo v hlubokomrazícím boxu. Před poškozením mrazem chrání buňky vhodné kryokonzervační látky, nejčastěji DMSO. Kritickým momentem je zmrazování a rozmrazování suspenze

30

buněk, které musí probíhat optimální rychlostí, aby nedošlo k poškození membrán, ale abychom naopak zachovali původní struktury a funkce buněk. Pro zamrazení bývají vyuţita klasická kryoprotektiva a zmrazovací protokoly zaloţené na rovnováţném zmrazování, které umoţní uchování buněk aţ po několik let. Kryoprotektiva můţeme rozdělit na intracelulární, neboli pronikající jako je např. glycerol, nebo dimethylsulfoxid a kryoprotektiva extracelulární, neboli nepronikající, kam řadíme sacharózu, dextran, polyvinylpropylen, hydroxyetylškrob a další. V praxi často pouţíváme jejich kombinace, přičemţ účinnější jsou kryoprotektiva intracelulární (Steu, 2008; Měřička 2007). Kultivační médium musí buňkám zajistit stejné základní podmínky pro přeţití, jako mají buňky in vivo, tedy podmínky pro zachování schopnosti růstu, dělení apod. Jako kultivační média se pouţívají směsi několika desítek látek. Hlavní sloţkou je zdroj energie, nejčastěji glukóza, pak jsou to hlavní anorganické ionty, aminokyseliny, pufrující sloţky, sérum, nejčastěji hovězí, ale také vitamíny a růstové faktory. Do kultivačních médií přidáváme také antibiotikum či antimykotikum, abychom zabránili vzniku infekce, přičemţ by jejich pouţití nemělo být paušální, neboť zvyšuje riziko skryté kontaminace buněčných kultur (Vejraţka, 2008). Podle pufrující sloţky lze kultivační média rozdělit do dvou hlavních skupin: média určená pro kultivaci v atmosféře se zvýšeným parciálním tlakem oxidu uhličitého a média pro práci v běţné atmosféře. Důleţitou sloţkou kultivačního média je fetální telecí sérum (FBS), které má vysoký obsah potřebných růstových látek. Jeho obsah a mnoţství v médiu ovlivňuje růst buněk a to zejména rychlost růstu. Příprava kultivačních médií musí kromě poţadavků na čistotu a sterilitu brát ohled i na stabilitu jednotlivých sloţek a jejich směsí (Červenková, 2001).

31

3. CÍL PRÁCE Cílem předloţené diplomové práce bylo: 1) Najít v literatuře informace o rozdílech v expresi a aktivitě enzymů (zvláště biotransformačních enzymů) v nádorových a normálních buňkách prsní tkáně. 2) Zjistit vhodné sloţení kultivačního média pro rutinní kultivaci buněčné linie MCF-7. 3) Optimalizovat metodu přípravy vzorku pro HPLC analýzu doxorubicinu a jeho redukovaného metabolitu v biologickém materiálu. 4)

Studovat redukci doxorubicinu v cytosolu buněčné linie MCF-7 a zjistit vliv

potenciálního inhibitoru oracinu na aktivitu reduktas doxorubicinu. 5)

Testovat cytotoxicitu doxorubicinu a oracinu a zjistit, jaký vliv má přídavek séra

do média buněk na cytotoxický účinek testovaných látek. 6)

Porovnat cytotoxicitu samotného doxorubicinu a doxorubicinu v kombinaci s

oracinem.

32

4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

4.1 Materiál a chemikálie

Buněčná linie MCF-7 - A. M. Soto, C. Sonnenschein (Tufts University, Boston, MA ) Doxorubicin - Pharmacia (Upjohn, Itálie) Doxorubicinol – Toronto Research Chemical Inc. (North York, Ontario, Kanada) Oracin, (+)-DHO, (-)-DHO - VÚFB (Praha,ČR) DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N‘-2ethanesulfonic acid) pufr, set pro stanovení bílkovin s BCA (bicinchonic acid), NADPH, DMSO (dimethylsulfoxid) – Sigma-Aldrich (Praha, ČR) FBS (fetal bovine serum), gentamicin sulfát – Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) BSA (bovine serum albumin) – Fluka (Prague, ČR) Běţné chemikálie čistoty p.a.

4.2 Pomůcky a přístroje

Pomůcky: Sterilní kultivační lahve, sterilní pipety, elektrický pipetník, sterilní pasterky , kádinky, automatické pipety, sterilní pipetovací špičky, Petriho misky, Bűrkerova komůrka, špachtle, mikrozkumavky, nádoba na led, centrifugační kyvety, stojánek na kyvety, mikrotitrační destička, multikanálové pipety, stopky, vialky, inserty, rukavice, váţenka, navaţovací kopistka. Přístroje a zařízení: laminární box - BioAir AURA 2000 M.A.C. mikroskop - Nikon Eclipse TS 100 CO2 inkubátor – HeraCell vodní lázeň - Memmert zamraţovací kontejner - NALGENE, Sigma C1562 mrazící box (-80°C) - HeraFreeze

33

analytické váhy - Scaltec SBC 22 centrifugy stolní, chlazené - Heraeus Biofuge Stratos, Eppendorf5810R ultrazvukový homogenizátor - Sonopuls Bandelin HD 2070 ultracentrifuga – Beckman coulter čtečka absorbance - Biorad Microplate Reader 550 spektrofotometrický a spektrofluorimetrický analyzátor Tecan Infinite M200 inkubátor - Eppendorf Thermomixer Comfort třepačka - IKA MS2 Minishaker kapalinový chromatograf - HP 1100 series LC systém (Agilent Technologies, Waldbronn, Německo)

4.3 Kultivace buněčné linie MCF-7 4.3.1 Kultivační média Základem pro kultivační médium je DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) s fenolovou červení. Jedná se o modifikované BME (Basal Medium Eagle), které je obohaceno o vyšší hladiny aminokyselin, vitamínů a další doplňující sloţky. Existuje velké mnoţství variant DMEM, s různými hladinami cukrů či různými typy aminokyselin a jinými přídavnými látkami. Při kultivaci buněk byly pouţity 2 typy těchto médií. Jako první DMEM (Sigma D6046) s hladinou 1000mg glu/l, hydrogenuhličitanem sodným a pyridoxinem HCl, coţ zvyšuje stabilitu média. Jako druhé médium bylo pouţito DMEM (D 6429) s hladinou 4500mg glu/l, L-glutaminem a pyruvátem sodným. FBS bylo před pouţitím nejprve inaktivováno při 57°C po dobu 30 minut. Jako pufrující sloţka byla pouţita HEPES neboli 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1ethanesulfonilovou kyselinu, která udrţuje pH v rozmezí 6,8 - 8,2, tedy pH podobné pH fyziologického prostředí oragnismu. Jako antiinfekční agens bylo pouţito širokospektré aminoglykosidové antibiotikum gentamicin v koncentraci 10mg/ml a v druhém případě kombinace úzkospektrého penicilinu se širokospektrým aminoglykosidovým streptomycinem.

34

Tabulka 2.Přehled složení testovaných kultivačních médií

1.

DMEM

pufrační

(obsahové sloţky)

systém

1000mg

HEPES

glu/l,

hydrogen-

475ml (1M)

uhličitan

antibiotikum

sérum

Gentamicin

FBS

5ml

2,5ml

(Diagenes

(1%)

(0,5%) 14 – 801F)

25ml (5%)

sodný, pyridoxin HCl 2.

4000mg glu/l*, hydrogen-

HEPES 475ml (1M)

uhličitan

Gentamicin

FBS

5ml

2,5ml

(Diagenes

(1%)

(0,5%) 14 – 801F)

25ml (5%)

sodný, pyridoxin HCl 3.

4500mg

glu/l,

L-glutamin,

HEPES 450ml (1M)

pyruvát sodný,

5ml (1%)

Penicilin/

FBS

50ml

streptomycin 5ml

(Diagenes

(10%)

(1%)

14 – 801F)

pyridoxin HCl *tato hladina byla dosaţena přidáním 3000mg práškované glu/l sterilně přes filtr

4.3.2 Rozmražování buněčné linie MCF-7 Do připravené kultivační lahve 25 cm2 (Biotech 90025) bylo napipetováno sterilně 8 ml kultivačního média. Potom bylo opakovaně toto médium nabíráno a přidáváno sterilně do zkumavky, kde docházelo k rychlému tání a současně k ředění buněk. Takto rozpuštěná suspenze byla přenesena do kultivační lahve, dokud nebyly všechny buňky rozmraţeny. Buněčná suspenze byla zhomogenizována protřepáním a zkontrolována pod mikroskopem. Po správně provedeném rozmraţení by buňky v homogenátu měly plavat jednotlivě, ne ve shlucích, aby mohlo dojít k jejich dalšímu rovnoměrnému růstu a mnoţení. Lahev pak byla umístěna do termostatu. Druhý den po adherenci bylo vyměněno médium v lahvi a pak jiţ následovala rutinní kultivace. .

35

4.3.3 Pasážování buněk Buněčná linie MCF-7 se dělí neomezeně a je tedy moţné ji přechovávat libovolně dlouho. Po vyndání z termostatu bylo nejprve slito médium a buňky byly dvakrát opláchnuty 3ml, resp. 7ml sterilního pufru PBS. Oplach buněk se provádí, abychom se zbavili vápníku a usnadnili tak působení enzymu T-E (trypsin-EDTA). Urychlí se tím uvolnění buněk z kultivační lahve a umoţní se snadnější pasáţ. K takto opláchnutým buňkám bylo pasterovou pipetou sterilně přidáno 1ml, resp. 2 ml T-E (0,25%, 37°C) a

kývavým pohybem byl T-E rozprostřen v lahvi, aby došlo

k rovnoměrnému působení na buňky a tím k jejich uvolnění. T-E se nechal působit asi 30s a poté bylo odsáto asi 2/3 tekutiny z lahve. Stav buněk byl zkontrolován pod mikroskopem. Ve chvíli, kdy měly všechny buňky jiţ kulovitý tvar, byly setřepány do spodní části lahve prudkým trhnutím. Zabrání se tak vzniku shluků. Aby byla reakce enzymu na buňky zastavena a nedošlo k jejich poškození, bylo v co nejkratším čase za hrdlo lahve napipetováno 2ml, resp. 4ml média předehřátého na 37°C. Zabrání se tak vzniku shluků. Médium bylo několikrát opakovaně nasáto a vypuštěno po stěně lahve a tím se suspenze opět zhomogenizovala. Buněčnou suspenzi lze vyuţít pro experimenty, nebo naředit tak, aby dále rostla v lahvi. Pro další kultivaci byl zpět do lahve přenesen poţadovaný díl suspenze a bylo přidáno kultivační médium tak, aby výsledný objem byl 5ml, resp. 13ml. Kývavým pohybem se buňky rozmístíli po celé lahvi a ta byla umístěna zpět do termostatu. 4.3.4 Rutinní kultivace Při rutinní kultivaci bylo nejprve z kultivační lahve slito médium a opatrně za hrdlo napipetováno 5 ml, resp. 13ml nového média. Lahev byla pak znovu uzavřena a uloţena do termostatu (37°C, 5% CO2). Výměna média se provádí po 48 hodinách, aby byl zajištěn dostatek ţivin.

36

4.3.5 Zamražování buněk Pro zamraţení buněčné linie MCF 7 bylo pouţito DMSO a buňky byly podrobeny gradientovému zmraţování (-1°C/min). Po pasáţi byla získaná suspenze naředěna tak, aby v médiu byl počet odpovídající cca 80-90% konfluenci na celkové ploše. Do zamraţovacích ampulí o objemu 1,5ml bylo napipetováno po 1,2 ml suspenze. Následně byla obohacena o 150 μl FBS (inaktivovaného při 57°C, 30min) a nakonec bylo sterilně přidáno DMSO a zamraţovací ampule byla uzavřena. Ampule byla nakonec ještě několikrát promíchána, aby se dosáhlo 10% roztoku DMSO v celém objemu zkumavky. Ampule byla co nejrychleji umístěna do zamraţovacího kontejneru (Nalgene, Sigma C1562), naplněného isopropanolem. Kontejner byl umístěn do mrazícího boxu (-80°C), kde došlo ke gradientovému zamraţování. Druhý den byly ampule z kontejneru přeneseny do tekutého dusíku pro dlouhodobé uchování. 4.4 Stanovení cytotoxicity doxorubicinu 4.4.1 Metodika testu cytotoxicity – Neutral Red uptake test Neutral red uptake test (NRU) je test ţivotnosti buněk. Základem je inkorporace a navázání neutrální červeně do ţivých buněk. Toto supravitální barvivo penetruje buněčnou membránu neionizovanou difuzí a akumuluje se převáţně v lysosomech. Lysosomy udrţují pH niţší neţ je pH okolní plasmy. Udrţování protonového gradientu na membráně lysosomu je energeticky náročné. Ztráta gradientu pH při poškození buňky nebo buněčné smrti způsobí zvýšení propustnosti membrány a uvolnění zadrţené neutrální červeně. Dojde k poklesu adsorbance, která se změří spektrofotometricky a tak lze rozlišit buňky ţivé, poškozené nebo mrtvé. Cytotoxicita je vyjádřená jako koncentrace závislá na poklesu adsorbance po chemické expozici neutrální červení (Riddell et al, 1986). Kdyţ buňky dosáhly 80% konfluence, byly zpasáţovány a buněčná suspenze byla odpipetována do sterilní kádinky. Pomocí Bürkerovy komůrky bylo zjištěno mnoţství buněk ve 100 μl a podle potřeby byla suspenze naředěna na koncentraci 20.000 bk/ 100 μl.

100 μl homogenátu bylo

pipetováno na 96-ti jamkové destičky do vnitřních jamek a kolem bylo dopipetováno sterilní H2O. 37

Destičky byly vloţeny do termostatu a nechaly se 24 hodin kultivovat. Buňky by za tuto dobu měly dosáhnout 100% konfluence. a) Počítání buněk v Bürkerově komůrce Pipetou bylo odebráno malé mnoţství suspenze a naplnily se jím obě poloviny Bűrkerovy komůrky (do kaţdé poloviny pipetujeme vţdy nový náběr). Při počítání se berou v úvahu jen 2 strany středního čtverce. Počítájí se všechny buňky, které leţí nebo se dotýkají pravého a dolního okraje, buď zevnitř nebo vně čtverce. Nepočítají se buňky dotýkající se protilehlých stran, tedy buňky leţící v horním a levém rozhraní. Pod mikroskopem se pak zjišťuje mnoţství buněk počítáním vţdy úhlopříčně v 10 čtvercích komůrky jednotlivých čtverců.

Obrázek 8. Počítání buněk v Bürkerově komůrce Výpočet koncentrace buněk v neředěné suspenzi: c = x * 4* 104 * 10 c...............počet buněk ve 4ml neředěné suspenze x...............průměrný počet buněk v 1 čtverci (tj. v 0,1 µl) 4*104.......přepočet na 4 ml 10.............ředění Např. v 10 čtvercích je 29 buněk 29 ‚ 10 = 2,9 2,9 × 16 = 46,4 × 104 buněk/ ml → 46 400/100µl, proto je nutné ji ještě doředit 2,32x, abychom získali koncentraci 20,000 bk/ 100µl. 38

b) Expozice buněk MCF-7 100 μl expozičního média se vzrůstající koncentrací bylo napipetováno do jednotlivých jamek. Na desce je tedy 9 koncentrací + 1 negativní kontrola, kde místo expozičního média bylo pouţito médium kultivační, nebo pokud je léčivo rozpuštěno v DMSO, je přidáno 0,1 – 0,5% DMSO. Kaţdá koncentrace se pipetuje minimálně v triplikátech. Směs v destičkách se promíchá prudkým pohybem a nechá se inkubovat 48 hodin v termostatu. Při testech cytotoxicity bez séra, bylo nejprve odsáto z destiček 100 μl média do sucha a připipetováno 100 μl čistého média DMEM. c) Odečítání cytotoxicity Pro zjištění cytotoxicity se pouţívá jiţ dříve zmíněné barvení neutrální červení. Nejprve bylo odsáto 100 µl média z jamek a přidáno 100 µl roztoku neutrální červeně rozpuštěné v médiu do výsledné koncentrace 40 µg/ml. Potom byly opět destičky umístěny do termostatu, kde byly 3 hodiny inkubovány. Po 3-hodinové inkubaci bylo odsáto veškeré médium a připipetován k buňkám fixační roztok (1g /100ml CaCl2 v 0,5% roztoku formaldehydu). Destičky se nechají v klidu při pokojové teplotě 15 min. Fixační roztok byl slit rychlým překlopením destičky a připipetováno 200 µl lyzačního roztoku (1% CH3COOH v 50% EtOH ) a destička se nechala 30 minut třepat v termomixeru (550 rpm, 25°C). Lyzováním se buňky rozruší a dochází k vylití neutrální červeně a tím i obarvení suspenze v jednotlivých jamkách podle mnoţství zlyzovaných buněk. Adsorbance se odečítá při 540nm. Pro vyhodnocení se pouţívá hodnota adsorbance mínus hodnotu blanku (jamka s médiem bez buněk), kde hodnoty jsou vyjádřeny jako procenta kontroly v závislosti na koncentraci pouţitého expozičního média.

39

4.5 Zpracování buněk na subcelulární frakce Pro in vitro testování aktivit reduktas doxorubicinu byl z buněčné linie MCF-7 izolován cytosol. Cytosol je intracelulární tekutina vyizolovaná z cytoplazmy po odstranění organel a jiných nerozpustných cytoplazmatických sloţek. Tato subcelulární frakce byla získána rozrušením buněk sonikací a následnou dvojnásobnou centrifugací homogenátu, čímţ byly od cytosolu odděleny ostatní frakce. Buněčnou linie byla nejprve 4 dny před plánovanou izolací cytosolu zpasáţována a nasazena do Petriho misek (Ø 15cm). Přibliţně 5. den dosáhly buňky 100% konfluence. Médium bylo nejprve slito a zbytek média odsán Pasterovou pipetou. Miska s buňkami byla umístěna na ledítko a bylo do ní přidáno 3,1 ml 0,1M fosfátového pufru o pH=7,4. Buňky byly v co nejkratší době, stále na ledu, seškrabovány škrabkou ke kraji misky. Takto vzniklá suspenze byla odsána a napipetována do připravených zkumavek vloţených do ledové lázně. Takto jsme postupovali u všech misek. Zkumavky se nechaly lehce zcentrifugovat (50G, 5 min, 5°C), abychom získali hustší suspenzi, ale přitom nedošlo k poškození buněk. Potom bylo z vrchní části všech zkumavek odsáno 3,3 ml pufru. Zkumavky stále ponořené v ledu byly v chladící místnosti sonikovány 2x30s, aby se buňky nepřehřály a nedošlo tak ke ztrátě enzymové aktivity. Takto vzniklý homogenát byl opatrně přelit do předchlazených zkumavek pro centrifugu Biofuge, která byla rovněţ předchlazena včetně rotoru. Zkumavky byly rovnoměrně umístěny proti sobě, v centrifuze byl nastaven program 5 (20 100xG; 60min; 4°C). Zcentrifugovaný homogenát byl přenesen zpět do chladícího boxu a odpipetován supernatant do zkumavek pro centrifugu Beckman Coulter. Zkumavky byly vloţeny do předem vychlazeného rotoru a byly centrifugovány (105 000xG; 67min; 4°C). Takto došlo k oddělení cytosolu a mikrosomů. Rotor byl vyndán z centrifugy, kyvety přeneseny do chladícího boxu a cytosol (supernatant) byl odpipetován po 330 µl do 0,5 ml eppendorfky. Mikrosomy (sediment) byly v kaţdé zkumavce resuspendovány sonikací v 0,5 ml 0,1M fosfátového pufru pH 7,4 s 20% glycerolu. Do kaţdé eppendorfky byla přenesen směs po 200 µl. Nakonec bylo odebráno 10 µl cytosolu na stanovení bílkovin. Takto připravené mikrosomy a cytosol byly zamraţeny v popsané krabičce na -80°C.

40

4.5.1 Stanovení bílkovin v cytosolické frakci Proteiny reagují s Cu2+ ionty v alkalickém prostředí, přičemţ měď přechází na Cu1+, která redukuje BCA (bicinchonovou kyselinu) za vzniku modrého zabarvení. Intenzita zabarvení je přímo úměrná mnoţství bílkoviny. Pro stanovení koncentrace bílkoviny byla vytvořena kalibrační řada, naředěním hovězího sérového albuminu (BSA). Tabulka 3. Přehled koncentrací roztoků BSA pro sestavení kalibrační křivky. Koncentrace

Roztok 1% BSA

Destilovaná voda

1

0 μg/ml

0 μl

500 μl

2

200 μg/ml

10 μl

490 μl

3

400 μg/ml

20 μl

480 μl

4

600 μg/ml

30 μl

470 μl

5

800 μg/ml

40 μl

460 μl

6

1000 μg/ml

50 μl

450 μl

Cytosol byl naředěn 4x a 6x destilovanou vodou, byla připravena vţdy dvě ředění a z kaţdého ředění 4 vzorky. Na mikrotitrační destičku bylo napipetováno 10 μl vzorku bílkoviny pro kalibrační řadu (100 – 1000 μg) a 10 μl vzorků cytosolu. Do slepého vzorku byla místo 10 μl bílkoviny napipetována redestilovaná voda. Do kaţdé jamky včetně slepého vzorku bylo přidáno 200 μl pracovního roztoku C. Směs byla dobře promíchána a inkubována při 22°C po dobu 30 min. Na čtečce byla poté odečítána adsorbance při 562 nm proti destilované vodě a od jednotlivých vzorků byl odečten slepý vzorek. Kalibrační křivka byla znázorněna jako závislost adsorbance na koncentraci bílkoviny (BCA). Pracovní roztok C byl získán smícháním roztoku A s roztokem B. Roztok A: NaHCO3, Na2CO3, BCA v 0,1 M NaOH Roztok B: 4% CuSO4 . 6H2O

41

4.6 Inkubace cytosolické frakce s doxorubicinem Doxorubicin je v cytosolu přeměňován redukčními enzymy, zejména CBR1, na DOXOL.

Reakční směs obsahovala cytosol, substrát doxorubicin a koenzym NADPH. Při

testování vlivu oracinu na redukci DOXu byl inhibitor oracin přidáván do reakční směsi. Ze zásobního roztoku doxorubicinu byl proředěním získán DOX o koncentraci 3mM. V čas potřeby byl také připraven 6mM roztok NADPH. Pro slepé vzorky byl namísto cytosolu pouţit 0,1M Na-fosfátový pufr o pH 7,4, který byl připraven z vodných 0,1M roztoků Na2HPO4 a NaH2PO4. Inkubační směs u všech 3 metod měla objem 150 μl. Tabulka 4. Přehled složení reakční směsi Složení reakční směsi: cytosol (příp. 0,1 M Na-fosfátový pufr pH 7,4*)

75 μl

6mM NADPH

10 μl

substrát (3 mM doxorubicin)

50 μl

redestilovaná H2O (neinhibovaná reakce), nebo

15 μl

500 μM oracin (inhibovaná reakce) *pufr byl pouţit pro přípravu slepých vzorků

Nejprve bylo do 1,5ml eppendorfky napipetováno 10 μl NADPH. Pro kaţdou metodu byly pouţity 3 eppendorfky. Poté bylo přidáno 50 μl 3mM roztoku DOXu. Namísto inhibitoru bylo připipetováno 15 μl redestilované H2O. Tato směs byla preinkubována při 37°C, cca 5 minut a 300rpm. Enzymová reakce byla odstartována přidáním 75 μl cytosolu (u slepých vzorků bylo pouţito 75 μl 0,1M Na-fosfátového pufru) a promícháním asi 30s ve vortexu. Jednotlivé zkumavky byly ukládány do termobloku vyhřívaného na 37°C, kde následovala 60-ti minutová inkubace.

4.6.1 Inkubace cytosolu s doxorubicinem a oracinem Hlavním cílem bylo porovnat enzymovou aktivitu reakcí s přidaným inhibitorem (oracin) a bez přítomnosti inhibitoru. Dále pak porovnání mnoţství vzniklého DOX-OLu při

42

reakci startované cytosolem a při reakci startované DOXem. Z výsledků byl pak zjišťován typ inhibice a hodnoty Km a Vmax. Nejprve byla zjišťována vhodná koncentrace inhibitoru (oracinu), aby došlo ke sníţení toxicity DOXu, ale přitom nebyl úplně potlačen jeho účinek. K vhodnému zvolení nám přispěly testy cytotoxicity, ale také inkubace s cytosolem. Bylo zde pouţito 0,01; 0,1; 1; 10; 100; 500 a 1000 μM koncentrace oracinu při 500 μM koncentraci DOXu. Dále byla provedena inkubace s oracinem o koncentracích 0,03; 0,3 a 3mM. V tomto pokusu byla pouţita 3mM koncentrace DOXu. Tyto koncentrace byly naředěny ze zásobního roztoku 5mM oracinu. Při tomto pokusu byla

zvolena 3mM

koncentrace DOXu. Kaţdá koncentrace byla pipetována do eppendorfek v triplikátech. Byl vytvořen graf závislosti specifické enzymové aktivity [ng doxol/min/mg proteinu] na koncentraci oracinu [mM]. Postup inkubace je jiţ popsán výše. Tabulka 5. Přehled složení reakční směsi Složení reakční směsi: 6mM NADPH

25 μl

substrát (3mM DOX)

21,7 μl

(biologický slepý vzorek - náhrada redestilovanou H2O)

inhibitor (0,03-3mM oracin)

25 μl

(kontrola – náhrada pufrem) 75 μl

cytosol (chemický slepý vzorek – náhrada pufrem)

0,1M Na-fosfátový pufr pH 7,4

3,3 μl

Z grafů a výpočtů byla zvolena vhodná koncentrace oracinu pro následující inkubace.

a) Start reakce cytosolem Nejprve byla ze 3,448 mM zásobního vodného roztoku DOXu postupným prořeďováním získána koncentrační řada 3; 1,5; 0,75; 0,3; 0,15; 0,075 a 0,03mM vodného roztoku DOXu. Postupným ředěním byla také získána odpovídající 500 μM koncentrace vodného roztoku oracinu. V čas potřeby byl připraven 6mM vodný roztok NADPH. Postup přípravy inkubační směsi je shodný s postupem popsaným výše.

43

b) Start reakce DOXem Při tomto postupu byly roztoky DOXu i oracinu naředěny stejným způsobem jako v předchozím případě, postup přípravy inkubační směsi byl však odlišný. Do označených eppendorfek bylo napipetováno 10 μl 6 mM NADPH (výsledná koncentrace v reakční směsi byla 1 mM). Dále bylo přidáno 15 μl 500 μM roztoku oracinu v případě inhibované reakce, nebo 15 μl redestilované H2O, v případě neinhibované reakce. Následně bylo přidáno 75 μl cytosolu a směs byla 5 minut při 37°C a 300rpm preinkubována. Enzymová reakce byla odstartována přidáním 50 μl DOXu o daných koncentracích, směs byla promíchána 30s ve vortexu a 60 minut inkubována v termobloku při 37°C. 4.7 Příprava vzorku pro HPLC analýzu - optimalizace metody Metodu přípravy vzorku před HPLC analýzou bylo nutné optimalizovat. Původně se vycházelo z metody zaloţené na vytřepávání produktu do chloroform/1-heptanolu a kys. ofosforečné, tento postup byl srovnáván s extrakcí octanem ethylnatým a s metodou sráţení proteinů ledovým ethanolem.

a) extrakce do chloroform/1- heptanolu a kys. o-fosforečné V této metodě byla inkubace ukončena přidáním 150 μl Na2HPO4 o pH = 8,4 a následným ochlazením na 0°C na ledové lázni. Dále bylo ke směsi přidáno 1,2ml chloroform/1-heptanolu v poměru 1:9 a zkumavky byly 15 minut protřepávány na třepačce, aby byl produkt extrahován do organické vrstvy. Pro důkladné oddělení vodné a organické fáze byla směs zcentrifugována při 5000ot./min. po dobu 5 minut. Spodní organická vrstva (cca 1200 μl) byla přenesena do označených eppendorfek. Následně bylo přidáno 150 μl ofosforečné kyseliny a směs byla 1 minutu intenzivně míchána na třepačce. Nakonec byla horní fáze (cca 100 μl) přenesena do vialek s inzertem. Analýza byla provedena nejpozději druhý den po extrakci na HPLC a vzorky byly uchovány v chladu a temnu.

44

b) extrakce octanem ethylnatým Ukončení inkubace u této metody spočívalo v přidání 15 μl koncentrovaného amoniaku a 700 μl octanu etylnatého. Potom byla směs rychle zchlazena na ledové lázni. Následně byla směs 5 minut protřepána na třepačce a poté zcentrifugována při 5000 ot./min. po dobu 3 minut. Nakonec byla horní vrstva (cca 600 μl ) odebrána do vialek a odpařena na koncentrátoru. Tyto vzorky lze uchovávat delší dobu neţ vzorky z metody předchozí. Měříme opět na HPLC po rozředění mobilní fází. c) směs s ledovým ethanolem Enzymová reakce byla ukončena přidáním 75 μl ethanolu předem vychlazeného na 0°C na ledové lázni. Směs byla protřepána 5 minut na třepačce a následně zcentrifugována při 12 000 ot./min. po dobu 15 minut. Poté se odpipetovala horní fáze (cca 150 μl) do vialek s inzertem. Analýza byla provedena na HPLC jako předchozí metody (Václavíková a kol., 2008). 4.8 HPLC analýza Mobilní fáze byla vytvořena z 50mM Na-fosfátového pufru o pH 4,0 a acetonitrilu v poměru 3:1 v/v. Pro tuto analýzu byl pouţit přístroj Agilent 1100 a kolona Supelco Discovery C18 (150 x 4mm). Jako předkolona byla pouţita Supelco Discovery C18 (20 x 4mm). Nástřik na kolonu byl 25 μl vzorku. Průtok mobilní fáze kolonou byl 1,5ml/min. Analýza probíhala za tlaku 10,5 MPa při teplotě 25°C. K detekci byl pouţit fluorescenční detektor (Ex = 480nm, Em = 560nm). K vyhodnocení některých inkubací byla zvolena kolona Macherey – Nagel EC Nuckosil 100-5 C18 (125 x 4mm), která lépe vyhovovala pro vyhodnocení pokusů metodou s ledovým etanolem. Průtok byl zvolen 1ml/min a tlak 12,5 MPa. Mobilní fáze byla tvořena 50mM amonium Formate pufrem o pH 4,0 a acetonitrilem v poměru 3:1 v/v. K měření byl pouţit stejný přístroj Agilent 1100. Nástřik na kolonu byl 25 μl. Analýza probíhala při teplotě 25°C a pro detekci byl pouţit fluorescenční detektor (Ex = 233nm, Em = 550nm).

45

Výstupem HPLC analýzy při stanovení DOXOLu bylo mnoţství produktu v ng. Z něj bylo vypočteno látkové mnoţství (nmol) v celkovém mnoţství vzorku ve vialce. Z mnoţství DOXOLu vytvořeného za 1 minutu (po odečtení hodnot slepých vzorlů) byla stanovena enzymová aktivita, která byla vyjádřena v [pmol/min] a specifická enzymová aktivita v [pmol/min/mg bílkoviny]. Pro výpočet specifické enzymové aktivity bylo nutné stanovit mnoţství bílkoviny v pouţitém cytosolu.

46

5. VÝSLEDKY 5.1 Testování kultivačních médií Zprvu se DMEM (Sigma D6046) s hladinou 1000mg glu/l zdálo jako nedostačující pro růst a dělení buněk, proto bylo k tomuto médium sterilně přidána glukóza na výslednou hladinu 4000 mg glu/l. Zvýšení hladiny glukózy v médiu nemělo zásadní vliv na intenzitu růstu buněk, nýbrţ došlo k uloţení glukózy v podobě glykogenu v cytoplazmě. Pouţitím média DMEM (D 6429) s hladinou 4500mg glu/l, L-glutaminem a pyruvátem sodným se růst či dělení buněk také nijak zásadně nezměnilo a přebytečná glukóza se opět uloţila v cytoplazmě v podobě glykogenu. Jako nejoptimálnější mnoţství FBS se ukázalo pouţití 10% FBS v celkovém mnoţství kultivačního média. Růst buněk se zrychlil a přeţití buněk po pasáţi bylo vyšší. Antibiotika gentamicin i kombinace penicilin – streptomycin se ukázala jako účinná vůči infekci. Nebyl pozorován ţádný nárůst bakterií či mykóz. Pro kultivaci buněk stačilo pouţití 5% antibiotika v celkovém objemu kultivačního média. Buňky byly kultivovány po dobu 3 týdnů v těchto třech médiích za stejných kultivačních podmínek (kapitola 3.1.4). Růst buněk byl průběţně kontrolován mikroskopicky. Ve všech médiích docházelo k dělení i růstu buněčné linie MCF-7 přibliţně stejně, rozdíly byly pozorovány pouze ve tvaru, velikosti buněk a přítomnosti glykogenu v cytoplazmě (viz obrazová příloha).

Obrázek 9a,9b. MCF-7, kultivace za použití média č.1 (DMEM 1000mg glu/l, 5%FBS, 0,5% GMC, 1%HEPES). Buňky mají četné pseudopodie(x400 - 9a, x100 - 9b), postupně vytváří monovrstvu, kdy se svými pseudopodiemi těsně dotýkají.

47

Obrázek 10a.,10b.MCF-7 kultivace za použití média č.2(DMEM 4000mg glu/l, 5%FBS, 0,5%GMC, 1%HEPES). V cytoplazmě se objevují tmavá granula s glykogenem, buňky mají více nepravidelné tvary (x400 -10a, x100 -10b)

Obrázek 11a.,11b. MCF-7 kultivace zapoužití média č.3(DMEM 4500mg glu/l, 10%FBS, 1%PEN/STREP, 1%HEPES). V cytoplazmě se objevují tmavá granula s glykogenem. Tvar buněk je podobný buňkám s médiem č.1, jen jsou více plastické (x400 -11a,x100 -11b) Pro přípravu kultivačního média bylo nakonec pouţito médium DMEM (Sigma D6046) s hladinou 1000mg glu/l, 10% FBS, 0,5% gentamicinu a 1% HEPES. 5.2 Stanovení bílkovin v cytosolické frakci V cytosolické frakci bylo stanoveno mnoţství bílkovin podle výše uvedeného postupu (podkapitola 3.3.1) Nejprve byla sestrojena kalibrační křivka, která je závislostí adsorbance na koncentraci bílkoviny.

48

Tabulka 6. Průměrné hodnoty adsorbance A ± S.D. kalibračních roztoků Koncentrace BSA [µg/ml]

A ± S.D.

1.

0

0 ± 0,020

2.

200

0,07 ± 0,008

3.

400

0,14 ± 0,021

4.

600

0,21 ± 0,050

5.

800

0,25 ± 0,020

6.

1000

0,31 ± 0,021

0,35

y = 0,0003x + 0,009 R 2 = 0,9951

abs orbanc e

0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0

200

400

600

800

1000

1200

konc e ntra c e [μg /m l]

Obrázek 12. Kalibrační přímka BCA pro stanovení koncentrace bílkovin v použitém cytosolu Rovnice kalibrační přímky byla y = 0,0003x + 0,009 s hladinou spolehlivosti R2 = 0,9951. Z parametrů rovnice přímky a z průměrných hodnot naředěného cytosolu vypočtena koncentrace bílkoviny 1,55 mg/ml.

49

byla

5.3 Optimalizace metody Pro stanovení jednotlivých parametrů bylo nutno optimalizovat podmínky inkubace. Základem byla optimalizace metody. Byly porovnávány 3 metody, reakce s octanem etylnatým, extrakce do chloroform /1-heptanolu a reakce s ledovým etanolem. Všechny postupy jsou uvedeny výše v experimentální části (kapitola 3.5). Tabulka 7. Výsledky optimalizace metody porovnáním specifické enzymové aktivity při inkubaci cytosolu s 3mM DOX. Specifická enzymová aktivita [pmol DOXOL/min/mg proteinu] 1. metoda – octan etylnatý

181,0 ± 3,58

2. metoda – chloroform/ 1-heptanol

111,7 ± 0,07

3. metoda - ledový etanol

246,8 ± 4,81

Metoda 1 – octan etylnatý Metoda 2 – chloroform/1-heptanol Metoda 3 – ledový etanol

Obrázek 14. Porovnání 3 metod při optimalizaci podmínek. Část chromatogramu ukazuje velikost píků u jednotlivých metod při inkubaci cytosolu s 3mM DOXem.

50

Metoda s ledovým etanolem se ukázala jako nejvhodnější. Při HPLC analýze byla zjištěna nejvyšší specifická enzymová aktivita a sama metoda byla nejsnáze proveditelná. 5.4 Inkubace DOXu v čase Při inkubaci reakční směsi byl proveden pokus v neinhibované i inhibované reakci s různou dobou inkubace (0-60min). Výsledky byly porovnávány jako % kontroly v jednotlivých časech. Tabulka 8. Výsledky inkubace cytosolu v neinhibované a inhibované reakci v závislosti na čase vyjádřené jako % kontroly Čas [min]

Specifická enzymová aktivita

% kontroly

[pmol DOXOL/min/mg proteinu] Neinhibovaná

0

0±0

0

reakce

10

2,57 ± 0,97

20,2

20

5,87 ± 0,97

46,2

30

6,67 ± 0,61

52,5

40

10,3 ± 0,37

81,0

50

12,7 ± 0,17

99,7

60

12,7 ± 1,11

100

0

0±0

0

reakce – 50 μM 10

0,56 ± 0,97

4,41

20

2,01 ± 0,28

15,8

30

1,69 ± 0,42

13,3

40

3,62 ± 0,24

28,5

50

4,70 ± 0,85

37,01

60

5,71 ± 0,85

45

Inhibovaná

oracin

51

120

% kontroly

100 80

Neinhibovaná rce

60

50 µM oracin

40 20 0 0

10

20

30

40

50

60

70

čas [min]

Obrázek 13. Lineární křivka redukceDOXu v inhibované (50 μM oracin) a neinhibované reakci, vyjádřená jako % kontroly v závislosti na čase (0-60 min). Při inkubaci trvající 60 minut byla v neinhibované reakci zjištěna nejvyšší enzymová aktivita 12,7 ± 1,11 [pmol DOXOL/min/mg proteinu]. Tato hodnota představovala 100 % kontrolu. V inhibované reakci v 60. minutě byla zjištěna hodnota 5,71 ± 0,85 [pmol DOXOL/min/mg proteinu], coţ znamenalo 45% z dané hodnoty v neinhibované reakci.

5.5 Vliv oracinu na redukci DOXu Hlavním cílem práce bylo porovnat enzymovou aktivitu reakcí s přidaným inhibitorem (oracin) a bez přítomnosti inhibitoru. Proto bylo nejprve nutno zjistit vhodnou koncentraci inhibitoru (oracinu). Při těchto pokusech byla pouţita 0,03; 0,3 a 3mM koncentrace oracinu při 3mM koncentraci DOXu. Dále byla provedena inkubace s oracinem o koncentracích 0,01; 0,1; 1; 10; 100; 500 a 1000 μM při 500 μM koncentraci DOXu.

52

Tabulka 9. Výsledky vlivu inhibitoru oracinu na redukci DOXu. Byla použita 3mM a 0,5mM koncentrace DOXu. Koncentrace DOXu Koncentrace

Specifická enzymová aktivita

[mM]

oracinu [mM]

[pmol DOXOL/min/mg proteinu]

0

37,34 ± 1,73

0,03

36,73 ± 1,49

0,3

30,7 ± 1,23

3

16,48 ± 0,2

0

40,1 ± 6,01

0,01

31,6 ± 0,61

0,1

38,2 ± 2,17

1

40,0 ± 2,15

10

37,9 ± 0,93

100

26,4 ± 4,17

500

9,69 ± 2,72

1000

0,02 ± 0,66

3mM

0,5mM

45 40

specifická aktivita [ng doxol/min/mg proteinu]

35 30 25 20 15 10 5 0 0

0,03

0,3 oracin [m M]

53

3

50 specifická aktivita [ng doxol/min/mg proteinu]

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0

0,01

0,1

1

10

100

500

1000

oracin [µM]

Obrázek 14a, 14b. Vliv inhibitoru (oracinu) na redukci DOXu vyjádřena jako závislost specifické enzymové aktivity na koncentraci oracinu. Koncentrace DOXu ve směsi byla 3mM (14a) a 0,5mM (14b). Z obou pokusů byla zjišťována vhodná koncentrace oracinu pouţitelná pro další experimenty, v nichţ byl zjišťován typ inhibice. V prvním pokusu byl znatelný pokles specifické enzymové aktivity při koncentraci oracinu 300μM. V druhém pokusu byly porovnávány

koncentrace podrobněji. Zde byl

sledován pokles při hodnotě 100 μM a aktivita dále klesala. Z těchto závěrů byla pro kinetické experimenty zvolena 50 μM koncentrace oracinu. 5.6 Inkubace cytosolu s DOXem a 50 μM oracinem Byly porovnávány reakce neinhibované s reakcí inhibovanou 50μM oracinem. Inkubace

byla startována dvěma způsoby.

Nejprve přidáním

cytosolu, v dalších

experimentech přidáním DOXu do reakční směsi. Při experimentech byl vytvořen graf závislosti specifické enzymové aktivity reduktas DOXu na koncentraci DOXu, z nichţ byl zjišťován typ inhibice. Podle rovnice Michalise-Mentenové byla vypočtena hodnota Km a Vmax.

54

Tabulka 10. Výsledky inkubace cytosolu s DOXem v neinhibované a inhibované (50μM oracin) reakci a rekci startované cytosolem. Koncentrace DOX [μM]

Specifická enzymová aktivita [pmol DOXOL/min/mg proteinu]

neinhibovaná reakce – 10

2,36 ± 0,25

25

6,12 ± 0,51

50

10,1 ± 0,99

100

18,7 ± 1,49

250

25,7 ± 0,82

500

34,1 ± 3,18

1000

46,7 ± 2,29

start reakce cytosolem

50 μM oracin – start 10

1,12 ± 0,12

25

2,21 ± 0,12

50

4,00 ± 0,39

100

10,4 ± 0,66

250

17,8 ± 1,67

500

26,0 ± 2,54

1000

38,7 ± 4,13

reakce cytosolem

2,4 ± 0,25

Neinhibovaná reakce 10 – start reakce DOXem

25

6,12 ± 0,51

50

10,1± 0,99

100

18,7 ± 1,49

250

26,0 ± 0,82

500

34,1 ± 3,18

1000

46,7 ± 2,29

50 μM oracin – start 10

1,79 ± 0,16

25

1,02 ± 0,06

50

0,93 ± 0,33

100

8,11 ± 1,15

250

13,9 ± 0,35

500

24,3 ± 0,06

1000

35,0 ± 4,50

reakce DOXem

55

Spec. enzym. aktivita [pmol doxol/min/mg proteinu]

60

neinhibovaná reakce 50 µM oracin

40

20

0 0

200

400

600

800

1000

Spec. enzym. aktivita [pmol doxol/min/mg proteinu]

Dox [µM ]

60

neinhibovaná reakce 50 µM oracin

40

20

0 0

200

400

600

800

1000

Dox [µM ]

Obrázek 15a.,b. Závislost specifické enzymové aktivity reduktas DOXu na koncentraci DOXu v neinhibované reakci a inhibované 50μM oracinem, reakce startovaná cytosolem(15a), reakce startovaná DOXem (15b). Grafy byly sestaveny podle rovnice Michalise-Mentenové.

56

Tabulka 11. Hodnoty Vmax a Km získané z inkubace cytosolu s DOXem v neinhibované reakci a reakci inhibované 50μM oracinem a v reakci startované cytosolem a DOXem. Vmax ± S.D.

Km [μM]

[pmol DOXOL/min/mg proteinu] neinhibovaná reakce – start 55,2 ± 4,345

246,5

reakce cytosolem 50 μM oracin – start reakce 61,8 ± 5,178

624,3

cytosolem Z grafu je patrné, ţe 50μM oracin působí jako kompetitivní inhibitor reduktas DOXu. Při reakci startované cytosolem byla zjištěna srovnatelná hodnota Vmax (55,2; 61,8 [pmol DOXOL/min/mg proteinu]) a naopak hodnota Km se v inhibované reakci zvyšovala (246,5; 624,3 [μM]). V reakci startované DOXem v inhibované reakci naznačovala křivka sigmoidní tvar a tak hodnotu Vmax nebylo moţno stanovit. Z grafu je však patrné, ţe se jedná o kompetitivní typ inhibice. 5.7 Stanovení cytotoxicity doxorubicinu V testech cytotoxicity byl zjišťován vliv DOXu a inhibitoru oracinu na ţivotnost buněk MCF-7 po 48-hodinové inkubaci v termostatu. Testy byly vyhodnoceny NRU testem. Byla porovnávána ţivotnost po přidání různých koncentrací DOXu a oracinu, ale také ţivotnost buněk po přidání cytostatik naředěných médiem s přídavkem a bez přidání séra, coţ mělo odlišný vliv zejména na růst buněk a jejich dělení. Naměřené hodnoty byly zaznamenány v grafu jako závislost ţivotnosti [%] na koncentraci DOXu. Dále byly vypočteny hodnoty IC25, tedy koncentrace cytostatika smrtící 25% buněk, jelikoţ v experimentech nedošlo k poklesu ţivotnosti pod 50%, abychom mohly určit hodnotu IC50.

57

120

dox se sérem

110

dox bez séra

životnost [%]

100 90 80 70 60 50 40 0

0,5

1

1,5 M

2

2,5

]

dox [μ

Obrázek 16. Porovnání vlivu různých koncentrací DOXu naředěného médiem se sérem a DOXu bez přidání séra na životnost buněk MCF-7 po 48-hodinové inkubaci . Vyhodnocení NRU testem.

120 110 oracin bez séra

100

oracin se sérem

životnost [%]

90 80 70 60 50 40 30 20 0

2

4

6

8

10 M

12

14

16

]

orc [μ

Obrázek 17. Porovnání vlivu koncentrace oracinu naředěného médiem se sérem a bez přidání séra na životnost buněk MCF-7.

58

120 dox

životnost[%]

110

dox+500nM orc

100

dox+1000nM orc

90

dox+2500nM orc

80 70 60 50 40 0

0,2 0,4 0,6 0,8

1

1,2 1,4 1,6 1,8

2

2,2 2,4 2,6 2,8

dox [μM ]

Obrázek 18. Porovnání vlivu různých koncentrací DOXu, DOXu s 500, 1000 a 2500nM oracinem na životnost buněk MCF-7 po 48-hodinové inkubaci. 120 110 dox+500nM orc se sérem

100

životnost [%]

dox+500nM orc bez séra

90 80 70 60 50 40 0

0,5

1

1,5

2

2,5

dox [μM]

Obrázek 19. Porovnání vlivu DOXu s 500nM oracinem naředěným médiem se sérem a bez přidání séra na životnost buněk MCF-7 po 48-hodinové inkubaci.

59

životnost [%]

120 110

dox se sérem

100

dox+500nM orc se sérem

90 80 70 60 50 40 0

0,5

1

1,5

2

2,5

dox [μM]

Obrázek 20. Porovnání vlivu DOXu a DOXu s 500nM oracinem naředěným médiem s přídavkem séra na životnost buněk MCF-7 po 48-hodinové inkubaci.

120 110

dox bez séra dox+500nM orc bez séra

životnost [%]

100 90 80 70 60 50 40 0

0,5

1

1,5

2

2,5

dox [μM]

Obrázek 21. Porovnání vlivu DOXu a DOXu s 500nM oracinem naředěným médiem bez přídavku séra na životnost buněk MCF-7 po 48-hodinové inkubaci.

60

Tabulka 12. Hodnoty IC25 získané z testů cytotoxicity podle vlivu jednotlivých cytostatik na životnost buněk MCF-7. IC25 [μM] DOX se sérem

0,82

DOX bez séra

1,54

ORC se sérem

8,7

ORC bez séra

4,81

DOX + 500nM ORC se sérem

0,78

DOX + 500nM ORC bez séra

1,25

DOX + 1000nM ORC se sérem

0,6

DOX + 2500nM ORC se sérem

0,49

U pouţité linie MCF-7 byla zjištěna vyšší toxicita DOXu přidáním inhibitoru oracinu. Při pokusech s přidaným sérem došlo k častějšímu buněčnému dělení a DOX tak působil toxičtěji neţ v případech bez přidání séra do reakční směsi. Výjimkou byl experiment se samotným oracinem se sérem a bez přídavku séra, kdy byl toxičtější oracin bez séra.

61

6. DISKUSE: Doxorubicin patří mezi antracyklinová chemoterapeutika významně se podílející na léčbě mnoha solidních nádorů, včetně karcinomu prsu, ale také mnoha hematoonkologických onemocněních. Hlavním cílem moţné modifikace léčby je zvýšení toxicity proti nádorově zvrhlým buňkám a naopak sníţení vedlejších účinků velmi často provázejících chemoterapeutickou léčbu. Chemoterapeutika by téţ neměla vykazovat zkříţenou resistenci a měla by naopak působit synergicky (Petera, Filip, 2001). Největším problémem při léčbě doxorubicinem je jeho kardiotoxicita a často také navozená

resistence

nádorových

buněk.

Pouţívání

DOXu

je

spojeno

zejména

s kardiotoxicitou, která je výsledkem interakce mezi DOXem a redukovanou formou exogenní NADH dehydrogenasy (NADH-D). Tato interakce byla nalezena v kardiální mitochondrii a má za následek produkci reaktivních směsí kyslíku (ROS) (Machado et al, 2008; Poprach, 2008). DOX je metabolizován ve značném rozsahu, hlavně játry. Prvním krokem enzymatické reakce antineoplastického léčiva DOXu je redukce na 13-OHdoxorubicinol (DOX-OL) produkovaný zejména CBR1 a AKR1C3. Protoţe DOX-OL je méně antineoplastický, ale více kardiotoxický neţ původní sloučenina, individuální poměr této reakce můţe ovlivnit antitumorový efekt a riziko DOXem indukované srdeční poruchy (Kassner, 2008; Novotná, 2008). Cílem předloţené diplomové práce bylo studium redukce DOX a testování moţného zvýšení cytotoxicity DOX inhibicí jeho reduktas. K experimentům byla zvolena buněčná linie MCF-7, linie odvozené z prsního nádoru. Prvním nezbytným krokem bylo vybrat vhodné kultivační médium pro tuto buněčnou linii. Buňky byly kultivovány po dobu 3 týdnů ve třech médiích za stejných kultivačních podmínek (37°C, 5% CO2). První médium obsahovalo DMEM s hladinou 1000mg glu/l, hydrogenuhličitanem sodným a pyridoxinem HCl, 5% FBS, 0,5% gentamicinu. Jako druhé médium bylo pouţito DMEM (Sigma D6046) s hladinou 4000mg glu/l, 5% FBS a 0,5% gentamicinu. Třetí médium obsahovalo DMEM s hladinou 4500mg glu/l (Sigma D6429) Lglutaminem a pyruvátem sodným, 10% FBS a 1% penicilin/streptomycin. Ve všech třech médiích byla pouţita jako pufrující sloţka 1% HEPES. Ve všech médiích docházelo k dělení i růstu buněčné linie MCF-7 přibliţně stejně, jen v médiu č.3. s vyšší hladinou FBS bylo patrné častější dělení a vyšší ţivotnost po pasáţi. Odchylky byly zejména ve tvaru buněk. V médiu č.1 měly buňky četné pseudopódie. V médiu č.2 měly buňky nepravidelný a protáhlejší tvar

62

v porovnání s médiem č.3, kde byl tvar buněk spíše plastický. U média č.2. i 3. se v cytoplazmě buněk ukládala nadbytečná glukóza v podobně glykogenových partikulí. Při pouţití antibiotik gentamicinu a penicilin/streptomycinu nebyly pozorovány ţádné rozdíly. Pro přípravu kultivačního média bylo nakonec pouţito médium DMEM (Sigma D6046) s hladinou 1000mg glu/l, 10% FBS, 0,5% gentamicinu a 1% HEPES. Dalším úkolem bylo optimalizovat přípravu vzorků pro HPLC analýzu DOX a jeho metabolitu DOX-OLu. Byly vyzkoušeny tři různé postupy, které se buď v laboratoři KBV osvědčily u podobných chemických látek nebo byly uvedeny v literatuře (Kondrová et al. 2008). Extrakce do octanu etylnatého byla poměrně dobře proveditelná a vzorek bylo moţno skladovat před samotným měřením delší dobu, neţ u vzorků s dalších metod. Při HPLC analýze však byl velký rozptyl mezi hodnotami v jedné sérii a na chromatogramu se kromě DOX-OLu objevovali vedlejší produkty, u kterých byla výška i plocha píku vyšší, neţ u testovaného DOX-OLu. Druhá metoda byla zaloţena na extrakci do chloroform/1-heptanolu a následně do kys. o-fosforečné. Postup přípravy vzorku byl náročnější neţ v předchozí metodě a při pipetování mohlo dojít ke kontaminaci vzorku neţádoucí chemikálií. Příprava byla tedy zatíţena větší chybou a při HPLC analýze se opět na chromatogramu projevili neţádoucí píky. Provedení metody s ledovým etanolem se ukázalo jako nejsnazší při přípravě reakční směsi. Metody byly porovnávány na základě rozdílu specifické enzymové aktivity. Nejvyšší enzymová aktivita (246,8 ± 4,81 [pmol DOXOL/min/mg proteinu]) byla zjištěna u metody s ledovým etanolem. Nevýhodou této metody je nestálost vzorku, který je nutno změřit na HPLC do 2 hodin od přípravy. Při zjišťování vlivu oracinu na metabolismus DOXu byla nejprve stanovena vhodná koncentrace oracinu, která by sniţovala biotransformaci DOXu na DOX-OL. Značný pokles aktivity reduktas DOXu byl sledován při hodnotě 100 μM oracinu (koncentrace DOX byla 500 μM). Pro testování rychlosti redukce DOX v závislosti na koncentraci DOX (stanovení enzymové kinetiky) byla zvolena koncentrace inhibitoru oracinu pouze 50 μM, protoţe většina vybraných koncentrací DOX byla niţší neţ 500 μM a tudíţ byl očekáván výrazný inhibiční efekt i niţší koncentrace oracinu. V kinetických studiích byly porovnávány hodnoty Km a Vmax v reakci neinhibované a reakci inhibované 50 μM oracinem.. Při reakci startované cytosolem byla naměřena srovnatelná hodnota Vmax (55,2; 61,8 [pmol DOXOL/min/mg proteinu]) a naopak hodnota Km se v inhibované reakci zvyšovala (246,5;

624,3 [μM]). V reakci startované DOXem

v inhibované reakci naznačovala křivka sigmoidní tvar a tak hodnotu Vmax nebylo moţno stanovit. Z grafu je však patrné, ţe se jedná o kompetitivní typ inhibice (Obr. 15b). Z těchto 63

výsledků tedy vyplývá, ţe 50μM oracin působí jako významný kompetitivní inhibitor reduktas DOX. Ze studie Gavelové a spol. (2008) vyplynulo, ţe hlavním enzymem redukujícím DOX i oracin v cytosolu MCF7 buněk je CBR1. CBR1 má pravděpodobně vyšší afinitu k oracinu neţ k DOX (Gavelová et al, 2008), proto v přítomnosti obou látek je upřednostněna redukce oracinu a tím dochází ke kompetitivní inhibici redukce DOX. Omezení redukce DOX by bylo významné nejen z hlediska moţného zpomalení deaktivace účinné látky v nádorových buňkách ale téţ jako moţnost omezení tvorby DOX-OL, který je více kardiotoxický neţ jeho parentní látka (Kassner, 2008). Právě kardiotoxicita je jedním z faktorů, které limitují zvýšení dávky při terapii DOXem (Sereno et al, 2008). Výhodnou vlastností oracinu jako potenciálního inhibitoru reduktas DOX je skutečnost, ţe u oracinu v preklinických studiích kardiotoxicita zjištěna nebyla (Klener, 2002). V testech cytotoxicity byl hodnocen efekt DOX, oracinu a obou látek v kombinaci při 48-hodinové expozici. Ukázalo se, ţe výsledek těchto testů byl významně ovlivněn přítomností séra v médiu. Například buňky v médiu s přidaným sérem byly významně citlivější na DOX neţ buňky v médiu bez séra. Přídavek séra do média účinně podporuje proliferaci buněk. DOX významně zastavuje buněčné dělení, proto působil toxičtěji v intenzivněji proliferujících buňkách. Opačné výsledky byly získány při stanovení cytotoxicity oracinu v médiu s přidaným sérem (IC25 = 8,7 μM) a bez přídavku séra (IC25 = 4,81 μM). Více toxicky působil oracin na buňky v médiu bez séra neţ na buňky v médiu se sérem. Pouze v nejvyšší koncentraci (15 μM) byla vyšší toxicita zjištěna v buňkách v médiu se sérem. Zdá se tedy, ţe oracin má jiný mechanismus cytotoxického působení neţ DOX a rychleji proliferující buňky jsou proti jeho účinku lépe chráněny neţ buňky pomaleji se dělící. Hlavním úkolem testování cytotoxicity DOX bylo zjistit, zda oracin zvýší cytotoxické působení DOX na buňky MCF7. Při testování cytotoxicity DOX s postupně vzrůstající koncentrací oracinu (500, 1000, 2500 nM) bylo zjištěno, ţe oracin koncentračně-závisle zvyšuje cytotoxické působení DOX. Tedy v případě testu DOX s 500nM oracinem byla toxicita nejniţší (IC25 = 1,25 μM), u DOX s 2500nM oracinem byla toxicita nejvyšší (IC25 = 0,49 μM). Při srovnání cytotoxicity různých koncentrací DOXu samotného a DOXu s 500nM oracinem v buňkách v médiu se sérem působil toxičtěji DOX s 500nM oracinem, u kterého byla zjištěna IC25 = 0,78 μM oproti samotnému DOX se sérem s IC25 = 0,82 μM. Stejně tak při experimentech DOXu a DOXu s 500nM oracinem v buňkách v médiu bez přídavku séra působila při niţších koncentracích toxičtěji kombinace DOX s 500nM oracinem (IC25 = 1,25 μM) oproti samotnému DOX (IC25 = 1,54 μM). Pouze v nejvyšší koncentraci (2 μM) byl znatelnější pokles ţivotnosti buněk ovlivněných pouze DOXem. 64

Celkově výsledky experimentů prokázaly, ţe kombinací DOXu s oracinem dojde k signifikantnímu zvýšení toxicity vůči nádorovým buňkám MCF-7.

65

7. ZÁVĚR: Dosaţené výsledky lze shrnout do následujících bodů:  Na základě literární rešerše byla vypracovaná přehledná tabulka demonstrující rozdíly v expresi a aktivitě enzymů (zvláště biotransformačních enzymů) v nádorových buňkách MCF-7 a nenádorových buňkách MCF-10A.  Pro kultivaci buněčné linie MCF-7 je vhodné médium s nízkým obsahem glukósy a vyšším mnoţstvím séra.  Optimální metodou přípravy vzorků pro HPLC analýzu doxorubicinu a jeho metabolitů je smíchání inkubátu s ledovým etanolem a následná centrifugace.  Oracin působí jako kompetitivní inhibitor přeměny doxorubicinu na cytostaticky neaktivní a kardiotoxický 13-hydroxy-doxorubicinol  Doxorubicin působí cytotoxičtěji na buňky v médiu s přídavkem séra, oracin naopak na buňky v médiu bez séra  V testech cytotoxicity kombinace doxorubicinu s oracinem působila toxičtěji neţ samotný doxorubicin.

66

Seznam zkratek

AKR – aldo-keto reduktasa ATCC – Americká sbírka tkáňových kultur. BCA – (BiCinchonic Acid) – kyselina bicinchonová bFGF – (Basic Fibroblast Growth Factor) – základní fibroblastový růstový faktor BME – Basal Medium Eagle – komerční kultivační médium BRCA 1, 2 – tumorsupresorové geny („breast cancer“) BSA – Bovinní Sérový Albumin CBR1 – karbonyl reduktasa 1 c-erb-B2 – receptor epidermálního růstového faktoru DMEM – Dulbecco's Modified Eagle's Medium – komerční kultivační médium DMSO – DiMethylSulfOxid DNA – deoxyribonukleová kyselina DOX – doxorubicin DOXOL – doxorubicinol DTIC – Defense Technical Information Center EGFR – (Epidermal Growth Factor Receptor) – receptor pro epidermální růstový faktor EPO – erytropoetin FBS – fetální bovinní sérum GIT – GastroIntestinální Trakt GMC – Gentamicin GM-CSF – (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) – faktor stimulující granulocyty a monocyty HEPES – fosfátový pufr HER-2/neu – onkoprotein, kóduje transmembránový receptor růstového faktoru HPLC – (High Performance Liquid Chromatography) - vysokoúčinná kapalinová chromatografie IGFBP - (Insuline-like Growth Factor Binding Protein) - vazebný protein pro IGF Il-2 – interleukin 2 MFA, MC-5 – monoklonální protilátky MTT – tetrazoliový test chemoresistence

67

multi-CSF – (multipotent Colony Stimulating Factor) faktor stimulující multipotentní hemopoetické buňky NADH, NAD+ - redukovaná, oxidovaná forma Nikotinamid Adenin Dinukleotid NADPH, NADP+ – redukovaná, oxidovaná forma Nikotinamid Adenin Dinukleotid Fosfát NIH - National Institutes of Health NRU – Neutral Red Uptake test – test s neutrální červení p53 – protein 53 PEN/STREP – kombinace Penicilin/Streptomycin RNA – ribonukleová kyselina ROS – reaktivní sloučeniny kyslíku 99

Tc – radionuklid 99Technecium

T-E – Trypsin-EDTA (EthyleneDiamineTetraacetic Acid) TGF-β – (Transforming Growth Factor-beta) – redukční faktor β TNF-α – (Tumor Necrosis Factor-alfa) – tumor nekrotický faktor-alfa TPA – tkáňový polypeptidový antigen TPO – trombopoetin VEGF – (Vascular Endothelial Growth Factor) – vaskulární endotelový růstový faktor

68

Použitá literatura Monografie: Alberts et al: Základy buněčné biologie, Espero Publishing, 2.vyd., 2005, 740 S Daneš J., Strnad P.: Nemoci prsu pro gynekology, Grada, Praha, 2001, 324 S Dostálek M. a kol.: Farmakokinetika, Grada, Praha 2006, 219 S Klener, P.:Klinická onkologie, Galen a Karolinum, Praha, 2002, 686 S Lincová, D., Farghali, H. a spol.: Základní a aplikovaná farmakologie, 2. doplněné a přepracované vydání, Galen, Praha, 2007, 672 S Lüllmann, H.: Farmakologie a toxikologie, 15. přepracované vydání, Grada, Praha, 2004, 725 S Motlík K., Ţivný J.: Patologie v ţenském lékařství, Grada, Praha, 2001, 550 S Petera J., Filip S. : Nechirurgická léčba časných stádií karcinomu prsu, Galén a Karolínum, Praha, 2001, 87 S

Časopisy: Adams JB, Phillips NS, Pewnim T: Expression of hydroxysteroid sulphotransferase is related (spojený) to estrogen receptor status in human mammary cancer., J Steroid Biochem 33(4A), 637-42, 1989 Barthel BL et al: Identification of human intestinal carboxylesterase as the primary enzyme for activation of a doxazolidine carbamate prodrug., J Med Chem 51(2), 298-304, 2008 Bateman RL et al: Human carbonyl reductase 1 is an S-nitrosoglutathione reductase., J Biol Chem. 283(51), 35756-62, 2008 Bursch W. et al: Cell death and autophagy: cytokines, drugs, and nutritional factors., Toxicology 254(3), 147-57, 2008) Bièche I, Narjoz C et al: Reverse transcriptase-PCR quantification of mRNA levels from cytochrome (CYP)1, CYP2 and CYP3 families in 22 different human tissues., Pharmacogenet Genomics 17(9), 731-42, 2007 Brian L. Yaspan, Joan P. Breyer et al: Haplotype Analysis of CYP11A1 Identifies Promoter Variants Associated with Breast Cancer Risk, Cancer Research 67(12), 5673-5682, 2007

69

Burchiel SW, Thompson TA, Lauer FT, Oprea TI.: Activation of dioxin response element (DRE)-associated genes by benzo(a)pyrene 3,6-quinone and benzo(a)pyrene 1,6-quinone in MCF-10A human mammary epithelial cells, Toxicol Appl Pharmacol. 221(2), 203-14, 2007 Cil T. et al: Use of N-terminal pro-brain natriuretic peptide to assess left ventricular function after adjuvant doxorubicin therapy in early breast cancer patients: a prospective series., Clin Drug Investig. 29(2), 131-7, 2009 Červenková a kol.: Cell suspensions, cell cultures and tissue slices – important metabolic in vitro systems, Biomedical papers 145(2), 57-60, 2001 Debnath J.et al.: Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures., Methods 30(3), 256-68, 2003 Deng T. et al: Preferential killing of breast tumor initiating cells by N,N-diethyl-2-[4(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine/tesmilifene., Clin Cancer Res. 15(1), 2009-03-15 Di X. et al: Apoptosis, autophagy, accelerated senescence and reactive oxygen in the response of human breast tumor cells to Adriamycin., Biochem Pharmacol. 6, 2009 Djuric Z, Everett CK, Luongo DA.: Toxicity, single-strand breaks, and 5-hydroxymethyl-2'deoxyuridine formation in human breast epithelial cells treated with hydrogen peroxide., Free Radic Biol Med 14(5), 541-7, 1993 Dundová I. a spol.: Pokročilý karcinom prsu, Medicína pro praxi 3, 120-124, 2005 Engman L et al: Thioredoxin reductase and cancer cell growth inhibition by organogold(III) compounds., Anticancer Drugs 17(5), 539-44, 2006 Fairman D. A., Collins C., and Chapple S.: Progress Curve Analysis of CYP1A2 Inhibition: A More Informative Approach to the Assessment of Mechanism-Based Inactivation?, Drug metabolism and disposition 35(12), 2159-2165, 2007 Fan GC et al: Heat shock protein 20 interacting with phosphorylated Akt reduces doxorubicin-triggered oxidative stress and cardiotoxicity., Circ Res. 103(11), 1270-9, 2008 Fischer D et al: 25-Hydroxyvitamin D3 1alpha-hydroxylase splice variants in breast cell lines MCF-7 and MCF-10., Cancer Genomics Proteomics 4(4), 295-300, 2007 Fínek J. a spol: Hormonální léčba časného karcinomu prsu, Klinická farmakologie 19, 216220, 2005 Foretová L.: Genetika nádorů prsu, Onkologie 2(1), 44-48, 2008 Gavelová M et al: Reduction of doxorubicin and oracin and induction of carbonyl reductase in human breast carcinoma MCF-7 cells., Chem Biol Interact.176(1), 9-18, 2008 Gonzalez FJ et al: CYP3A4 and pregnane X receptor humanized mice., J Biochem Mol Toxicol 21(4), 158-62, 2007

70

Grover GS, Brayman TG et al: Development of in vitro methods to predict induction of CYP1A2 and CYP3A4 in humans, Assay Drug Dev Technol. 5(6), 793-804, 2007 Gulen Ulusoy, Emel Arinç, Orhan Adali: Genotype and allele frequencies of polymorphic CYP2E1in the Turkish population, Arch Toxicol 81, 711-718, 2007 Gupta S et al: Synthesis of N-aryl-5-amino-4-cyanopyrazole derivatives as potent xanthine oxidase inhibitors., Eur J Med Chem 43(4), 771-80, 2008 Chen G, Waxman DJ.: Identification of glutathione S-transferase as a determinant of 4hydroperoxycyclophosphamide resistance in human breast cancer cells., Biochem Pharmacol. 49(11), 1691-701, 1995 Chen S et al: Anti-aromatase activity of phytochemicals in white button mushrooms (Agaricus bisporus)., Cancer Res. 66(24), 12026-34, 2006 Chumchalová J., Kovařík J.: Metodiky testování chemosenzitivity/chemoresistence nádorů in vitro (Methods for the evaluation of human tumor drug resistance in vitro), Klinická onkologie 2, 18-21, 2000 Kapucuoglua N., Cobanb T. et al: Expression of CYP3A4 in human breast tumour and non-tumour tissues, Cance Letters 202, 17-23, 2003 Kassner N. et al: Carbonyl reductase 1 is a predominant doxorubicin reductase in the human liver., Drug Metab Dispos. 36(10), 2008 Kim SY et al.: Doxorubicin-induced reactive oxygen species generation and intracellular Ca2+ increase are reciprocally modulated in rat cardiomyocytes., Exp Mol Med. 38(5), 53545, 2006 Kitamura S et al: Antiandrogenic activity and metabolism of the organophosphorus pesticide fenthion and related compounds., Environ Health Perspect.111(4), 503-8, 2003 Kurt M. Bohrena, June M. Brownlee et al: The structure of Apo R268A human aldose reductase: Hinges and latches that control the kinetic mechanism, Biochimica et Biophysica Acta 1748, 201-212, 2005 Labbozzetta M. et al: Curcumin as a possible lead compound against hormone-independent, multidrug-resistant breast cancer., Ann N Y Acad Sci., 278-83, 2009 Lee SU, Rhee M, Min YK, Kim SH.: Involvement of peroxiredoxin IV in the 16alphahydroxyestrone-induced proliferation of human MCF-7 breast cancer cells., Cell Biol Int.32(4), 401-5, 2008 Lehmann L, Wagner J.: Gene expression of 17beta-estradiol-metabolizing isozymes: comparison of normal human mammary gland to normal human liver and to cultured human breast adenocarcinoma cells., Adv Exp Med Biol. 617, 617-24, 2008 Leung HY, Wang Y, Leung LK.: Differential effect of over-expressing UGT1A1 and CYP1A1 on xenobiotic assault in MCF-7 cells., Toxicology 242(1-3), 153-9, 2007

71

Lesná M.: Prediktivní markery u karcinomu prsu, Histopathology 52, 82-90, 2008 Lu J, Chew EH, Holmgren A.: Targeting thioredoxin reductase is a basis for cancer therapy by arsenic trioxide., Proc Natl Acad Sci U S A. 104(30), 12288-93, 2007 Machado V. et al: Carvedilol as a protector against the cardiotoxicity induced by anthracyclines (doxorubicin)., Rev Port Cardiol. 27(10), 2008 Manni A et al: Ornithine decarboxylase over-expression stimulates mitogen-activated protein kinase and anchorage-independent growth of human breast epithelial cells., Int J Cancer. 70(2), 175-82, 1997 Melka, M.: Oracin. Preclinical Summary Report of RIPB (Researche Inst. for Pharmacy and Biochemistry), Prague, 1993 Michalová E. a kol.: Predikce citlivosti nádorových buněk k chemoterapeutikům ex vivo – úskalí a limitace vlastní metody (Chemosensitivity prediction in tumor cells ex vivo – difficulties and limitations of the metod), Klinická onkologie 21, 93-97, 2008 Ministerstvo zdravotnictví ČR: Český lékopis 2002, monografie Doxorubicin hydrochloridum Miko M. et al: Cytotoxicity and mode of action of the potential cytostatic drug oracin., Neoplasma 49(3), 167-71, 2002 Mimnaugh EG, Dusre L, Atwell J, Myers CE: Differential oxygen radical susceptibility of adriamycin-sensitive and -resistant MCF-7 human breast tumor cells., Cancer Res. 49(1), 815, 1989 Nová moţnost hormonální léčby karcinomu prsu: letrozol, seminář 28.6.1999, Medicína 6/VI, 15,18 S, 1999 Nosková, V., Hajdúch, M., Michál, V., Cwiertka, K.: Mechanismy mnohočetné lékové rezistence a jejich význam pro klinickou praxi II. Atypická MDR. (Mechanisms of multidrug resistance and their clinical implications II. Atypical MDR), Klin. Onkologie 2, 10-17, 2000 Nosková, V., Hajdúch, M., Michál, V., Cwiertka, K.: Mechanismy mnohočetné lékové rezistence a jejich význam pro klinickou praxi I. Typická MDR. (Mechanisms of multidrug resistance and their clinical implications I. Typical MDR), Klin. Onkologie 2, 4-9, 2000 Novotná, R. a spol.: Inactivation of the anticancer drugs doxorubicin and oracin by aldo–keto reductase (AKR) 1C3, Toxicology Letters 181(1), 1-6, 2008 Olson, R. D., Mushlin, P. S., Brenner, D. E., Fleischer, S., Chang, B. K., Cusack, B. J., Broucek, Jr. R. J.: Doxorubicin cardiotoxicity may be due to its metabolite doxorubicinol, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85, 3585-9, 1988 Onganer PU et al: An acetylcholinesterase-derived peptide inhibits endocytic membrane activity in a human metastatic breast cancer cell line., Biochym Biophys Acta 1760(3), 41520, 2006

72

Ott I et al: Antitumor-active cobalt-alkyne complexes derived from acetylsalicylic acid: studies on the mode of drug action., J Med Chem. 48(2), 622-9, 2005 Ozkan A, Fiskin K: Protective effect of antioxidant enzymes against drug cytotoxicity in MCF-7 cells., 28(1), 86-8, 2006 Poprach A. a kol.: Kardiotoxicita léků pouţívaných v onkologii, Klinická onkologie 21(5), 288-293, 2008 Salvatorelli E. et al: Doxorubicinolone formation and efflux : A salvage pathway against epirubicin accumulation in human heart., J Pharmacol Exp Ther.14, 2009 Sardão VA et al: Doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction is secondary to nuclear p53 activation in H9c2 cardiomyoblasts., Cancer Chemother Pharmacol., 2009 Sereno M et al. Clinical and Translational Oncology 10: 35-46 (2008) Setiawan V.W., Cheng I. et al: A Systematic Assessment of Common Genetic Variation in CYP11A and Risk of Breast Cancer, Cancer Research 66(24), 12019-12025, 2006 Shadan Ali, Basil F. El-Rayes, Lance K. Heilbrun: Cytochrome P450 and Glutathione Transferase Expression in Squamous Cell Cancer, Clinical Cancer Research 10, 4412-4416, 2004 Steu S. a kol.: A procedure for tissue freezing and processing applicable to both intraoperative frozen section diagnosis and tissue banking in surgical pathology., Virchows Arch. 452(3), 305-12, 2008 Stuart S Martin, Philip Leder: Human MCF10A Mammary Epithelial Cells Undergo Apoptosis following Actin Depolymerization That Is Independent of Attachment and Rescued by Bcl-2, Molecular and Cellular Biology 21(19), 6529-6536, 2001 Szotáková B. et al: Stereospecific reduction of the original anticancer drug oracin in rat extrahepatic tissues, Journal of Pharmacy and Pharmacology 55(7), 1003-1011, 2003 TOTH M.: Phorbol ester-induced cell surface association of matrix metalloproteinase-9 in human MCF10A breast epithelial cells, Cancer Res. 57(15), 3159-67, 1997 Tsuruda L, Hou Yt , Penning TM: Stable expression of rat dihydrodiol dehydrogenase (AKR1C9) in human breast MCF-7 cells results in the formation of PAH-o-quinones and enzyme mediated cell death., Chem Res Toxicol 14(7), 856-62, 2001 Vibet S, Goupille C et al: Sensitization by docosahexaenoic acid (DHA) of breast cancer cells to anthracyclines through loss of glutathione peroxidase (GPx1) response., Free Radic Biol Med 44(7), 1483-91, 2008 Václavíková, R., Kondrová, E., Ehrlichová, M., Boumendjel, A., Kovář, J., Stopka, P., Souček, P., Gut, I.: The effect of flavonoid derivatives on doxorubicin transport and metabolism, Bioorg. Med. Chem. (2008), doi:10.1016/J.BMC.2007.10.093

73

Venkata NG, Aung CS et al: PPARalpha and PPARbeta are differentially affected by ethanol and the ethanol metabolite acetaldehyde in the MCF-7 breast cancer cell line., Toxicol Sci 102(1), 120-8, 2008 Wakefield L et al: Arylamine N-acetyltransferase 1 expression in breast cancer cell lines: a potential marker in estrogen receptor-positive tumors., Genes Chromosomes Cancer 47(2), 118-26, 2008 Wei Zheng et al: Population based Case- Control Study of CYP11A, Gene Polymorphism and Breast Cancer Risk, Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 13(5), 709-714, 2004 Basil F. El-Rayes, Shadan Ali, Lance K. Heilbrun et al: Cytochrome P450 and Glutathione Transferase Expression in Human Breast Cancer, Clinical Cancer research 9, 1705-1709, 2003 Weydert CJ et al: Increased oxidative stress created by adenoviral MnSOD or CuZnSOD plus BCNU (1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea) inhibits breast cancer cell growth., Free Radic Biol Med 44(5), 856-67, 2008 Wiebe John ; Lewis Michael: Activity and expression of progesterone metabolizing 5αreductase, 20α-hydroxysteroid oxidoreductase and 3α(β)-hydroxysteroid oxidoreductases in tumorigenic (MCF-7, MDA-MB-231, T-47D) and nontumorigenic (MCF-10A) human breast cancer cells, Toxicology and Applied Pharmacology 190 (3), 241-250, 2003 Wsól V. a kol.: The novel anticancer drug oracin: different stereospecificity and cooperativity for carbonyl reduction by purified human liver 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1, Toxicology 197(3), 253-261, 2004 Yao J, Chang M et al: Inhibition of cellular enzymes by equine catechol estrogens in human breast cancer cells: specificity for glutathione S-transferase P1-1, Chem Res Toxicol 15(7), 935-42, 2002 Ying Hui et al: On the Sulfation and Methylation of Catecholestrogens in Human Mammary Epithelial Cells and Breast Cancer Cells, Biol Pharm Bull, 769-73, 2008 Zhou, Q. and B. Chowbay: Determination of doxorubicin and its metabolites in rat serum and bile by LC: application to preclinical pharmacokinetic studies, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30(4): 1063-1074, 2002 Zivadinovic D. a spol.: Membrane estrogen receptor-α levels in MCF-7 breast cancer cells predict cAMP and proliferation responses, Breast Cancer Research 7(1), 101-112, 2005 Internetové zdroje: Adriablastina (Pharmacia Farmitalia) doxorubicini hydrochloridum 2mg v 1 ml (příbalový leták), 25.11.2008 [cit. 15.12.2008] http://www.anamneza.cz/moduly/lek.php3?id=3271 Breast cancer cell line database – The university of Texas MD Anderson Cancer center 26.9.2008 [cit. 25.11.2008] http://www.mdanderson.org/departments/cancerbiology/display.cfm?id=F3DC4354-B0FB-

74

11D4-80FB00508B603A14&method=displayFull&pn=31062032-B0EB-11D480FB00508B603A14 Breast cancer cell collection – Cell line: MCF10A; Lawrence Berkeley National Laboratory, 26.9.2008 [cit. 25.11.2008] http://icbp.lbl.gov/breastcancer/viewline.php?id=37 Novotná H., Klener P. et kolektiv (2008): AISLP-kompendium http://www.linkos.cz/onkologie/aislp.php?Typ=NAZ&KEY=doxorubicin&enter=Odeslat Petruţelka L. a spol.: C-erbB2 Overexpression and Treatment Outcome in a Randomized Trial Comparing Adjuvant CMF and AC in Equitoxic Regimen in Breast Cancer2000 ASCO Annual Meeting, Abstract no 534, 5.1.2009,[cit.25.2.2009] http://pediatricca.asco.org/portal/site/ASCO/menuitem.34d60f5624ba07fd506fe310ee37a01d/ ?vgnextoid=76f8201eb61a7010VgnVCM100000ed730ad1RCRD&vmview=abst_detail_view &confID=2&index=y&abstractID=201070 Vejraţka M.: Buněčné kultury, http://bioprojekty.lf1.cuni.cz/3381/sylaby-prednasek/textovaverze-prednasek/bunecne-kultury-vejrazka.pdf , 16.10.2008, [cit. 22.10.2008]

75