UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ DIPLOMOVÁ PRÁCE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMAKOGNOZIE

Lenka Maliňáková

KULTURY LÉČIVÝCH ROSTLIN IN VITRO – X DIPLOMOVÁ PRÁCE

Datum zadání:

24.11.2008

Vedoucí katedry:

Doc. RNDr. Jaroslav Dušek, CSc.

Vedoucí diplomové práce:

Doc. PharmDr. Lenka Tůmová, CSc.

Termín odevzdání: Počet stran:

62

Oponent diplomové práce:

PharmDr. Marie Kašparová, PhD.

Tento výstup vznikl v rámci projektu specifického vysokoškolského výzkumu 2010261-002.

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány.

PODĚKOVÁNÍ Děkuji Doc. PharmDr. Lence Tůmové, CSc. za odborné vedení v průběhu diplomové práce. Zároveň děkuji také ostatním pracovníkům katedry farmakognozie za pomoc a vytvoření dobrých pracovních podmínek.

Obsah 1.

ÚVOD....................................................................................................................... 6

2.

CÍL PRÁCE............................................................................................................. 7

3.

TEORETICKÁ ČÁST............................................................................................ 8 3.1 Explantátové kultury rostlin jako zdroj sekundárních metabolitů .......................... 8 3.1.1 Kategorie rostlinných explantátů ..................................................................... 9 3.1.2 Výhody a využití tkáňových kultur ................................................................. 9 3.1.3 Kultivační média pro explantátové kultury ................................................... 10 3.1.4 Další faktory ovlivňující explantátové kultury .............................................. 13 3.1.5 Mikropropagace ............................................................................................. 14 3.1.6 Kalusová a suspenzní kultura ........................................................................ 16 3.2 Fyziologie stresu ................................................................................................... 18 3.2.1 Stresové faktory a stresová reakce................................................................. 18 3.2.2 Mechanismy stresových reakcí ...................................................................... 20 3.2.3 Biotické stresy................................................................................................ 23 3.2.4 Abiotické stresy ............................................................................................. 25 3.2.5 Elicitace a elicitory ........................................................................................ 26 3.3 Chlorid ceritý (CeCl3)........................................................................................... 31 3.4 Flavonoidní glykosidy .......................................................................................... 33 3.5 Fagopyrum esculentum Moench. (Polygonaceae) ............................................... 36

4.

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST................................................................................ 38 4.1 Přístroje................................................................................................................. 38 4.2 Chemikálie ............................................................................................................ 39 4.3 Biologický materiál............................................................................................... 39 4.4 Příprava a složení živného média ......................................................................... 40 4.5. Kultivace kultur ................................................................................................... 41 4.6 Příprava roztoků elicitoru ..................................................................................... 42 4.7 Elicitace in vitro kultur ......................................................................................... 43 4.8 Stanovení obsahu flavonoidů (rutinu)................................................................... 44 4.9 Stanovení ztráty sušením ...................................................................................... 47 4.10 Statistické zpracování výsledků.......................................................................... 48

4

5.

VÝSLEDKY .......................................................................................................... 50

6.

DISKUZE .............................................................................................................. 54

7.

ZÁVĚR .................................................................................................................. 57

8.

SEZNAM LITERATURY.................................................................................... 58

9.

ABSTRAKT .......................................................................................................... 62

10. SUMMARY ........................................................................................................... 62

5

1. Úvod Rostliny jsou tradičně cenným zdrojem široké palety sekundárních metabolitů využívaných ve farmacii. I v budoucnosti budou rostliny představovat jeden z nejdůležitějších zdrojů nových účinných látek a modelových struktur sloužících pro vývoj nových léčiv. Díky rozvoji chemických analytických metod je ročně ve světě identifikováno tisíce nových substancí izolovaných z vyšších rostlin. Přes současné pokroky v chemické syntéze stále nejsme schopni produkovat složité chemické struktury přírodních látek a pokud ano, jedná se o metody málo efektivní a drahé.1 Produkce

sekundárních

metabolitů

probíhá

prostřednictvím

složitých

biochemických pochodů využívajících jako substrát primární metabolity, které vznikají fotosyntetickou aktivitou rostlin. Řadu takovýchto látek nacházíme výhradně v rostlinné říši.1 Využití rostlinných tkáňových kultur pro produkci sekundárních metabolitů patří mezi moderní biotechnologické metody. Tyto postupy umožňují zefektivnění produkce řady farmaceuticky významných látek. Rostlinné buňky jsou biosynteticky totipotentní, což znamená, že každá buňka v kultuře zachovává kompletní genetickou informaci a proto je schopná produkovat veškeré metabolity původní rostliny. Výhody tohoto technologického postupu oproti klasickému pěstování léčivých rostlin jsou tyto: - nezávislost na vlivu geografických podmínek, změn spojených se střídáním ročních období a na dalších přírodních vlivech. Tento technologický postup umožňuje produkovat dostatečné množství požadovaných látek ve stále stejné kvalitě, popř. umožňuje produkovat nové strukturní typy látek, které nenalézáme v původních rostlinách. Umožňuje účinné zpracování a dosažení vysokého výtěžku produktu v krátké době. Dále buněčné kultury umožňují stereoselektivní a regioselektivní biotransformaci prekurzorů, vedoucí k novým sloučeninám. V současné době existuje mnoho buněčných kultur produkujících větší množství sekundárních metabolitů než původní rostliny.1

6

2. Cíl práce Cílem práce bude se seznámit s metodikou kultivace rostlinných kultur in vitro. Dále zjistit vliv abiotické elicitace (ionty Ce) na produkci flavonoidů kalusovou a suspenzní kulturou Fagopyrum esculentum. Na základě stanovení obsahu flavonoidů HPLC metodou zjistit, zda ionty ceru v různých koncentracích jsou schopny ovlivnit produkci těchto obsahových látek.

7

3. Teoretická část 3.1 Explantátové kultury rostlin jako zdroj sekundárních metabolitů Rostlinné tkáňové kultury jsou alternativním zdrojem ke klasickému pěstování rostlin a představují cenný zdroj sekundárních metabolitů.2,

3

Jedná se o velice

perspektivní zdroj řady farmaceuticky významných sloučenin. Tabulka č. 1 zobrazuje přehled některých skupin sekundárních metabolitů, jejichž zástupci byli v minulosti izolováni z tkáňových kultur vyšších rostlin.1 Fenylpropanoidy Antokyany Kumariny Flavonoidy Isoflavonoidy Stilbeny Třísloviny

Alkaloidy Indolové Purinové Tropanové Isochinolinové

Terpeny Karoteny Mono- až triterpeny

Chinony Antrachinony Benzochinony Naftochinony

Steroidy Kardioaktivní glykosidy

Tabulka č. 11 Explantáty (rostlinné tkáňové kultury) jsou z organismu sterilně vyňatá a na umělé živné půdě rostoucí izolovaná pletiva s prakticky neomezenou živností. Podmínkou je pravidelné pasážování (přenášení) do nového živného prostředí, které, kromě anorganických a organických látek, musí obsahovat růstové regulátory.4 Růst kultury závisí na poměru koncentrací růstových látek v médiu. Změnou podmínek kultivace lze ovlivňovat mitotickou aktivitu buněk, diferenciační a morfogenetické pochody. Protože tkáňová kultura nediferencovaného pletiva má charakter závalového hojivého pletiva, označuje se také jako kalusová tkáňová kultura. Takové kalusové kultury odvozené z diferencovaného pletiva (kalus sám má charakter dediferencovaného pletiva embryonálního stavu) je možné převést působením růstových látek na diferencovaný stav dále spojený s organogenezí. Tento postup umožňuje totipotence rostlinné buňky (buňky vzniklé mitózou ze zygoty obsahují celou genetickou informaci).4

8

3.1.1 Kategorie rostlinných explantátů5 Podle morfologické (anatomické) charakteristiky se rozlišují: •

Kultury orgánové – orgánové systémy, orgány, resp. jejich základy, či části, pěstované v podmínkách in vitro způsobem, který umožňuje jejich diferenciaci a vcelku zachovává jejich stavbu a funkci.

•

Kultury tkáňové (resp. pletivové, kalusy) – do různého stupně soudržné, morfologicky dezorganizované mnohobuněčné komplexy tkáně (pletiva), pomnožované buď na polotuhých, či pevných nosičích, nasycených živným médiem, nebo výjiměčně v tekuté živné půdě.

•

Kultury suspenzní – volné buňky a buněčné shluky společně pomnožované, suspendované v tekuté živné půdě, promíchávané a provzdušňované.

•

Kultury buněčné (resp. kultury volných buněk) – volné jednotlivé a identifikované buňky, resp. jejich nejbližší potomstvo, pomnožované v tekuté či polotuhé půdě, nebo na nosiči nasyceném půdou.

•

Kultury protoplastů – kultury buněk zbavených buněčných stěn.

3.1.2 Výhody a využití tkáňových kultur Využití tkáňových kultur představuje zajímavý alternativní způsob produkce sekundárních metabolitů rostlin. Oproti klasickým metodám pěstování rostlin přináší řadu výhod.6 Jedná se o technologii nezávislou na geografických a meteorologických vlivech, která umožňuje získávat produkty obsažené v nesnadno kultivovaných rostlinách.5 Tkáňová kultura představuje dobře definovaný systém umožňující kontrolovanou produkci požadovaných látek. Proces probíhá ve sterilních podmínkách a tím je zabráněno virovým a mikrobiálním nákazám. Další výhodou je možnost optimalizace vyvinutých postupů pro průmyslovou produkci přírodních látek (využití bioreaktorů). Kombinace s metodami genového inženýrství umožňuje produkci rekombinantních proteinů (enzymy, cytokininy, monoklonální protilátky) a dalších terapeuticky významných makromolekulárních látek. Enzymy obsažené v buňkách tkáňových kultur mohou sloužit jako katalyzátory regioselektivních a stereoselektivních modifikací organických sloučenin. Tento proces bývá označován jako biotransformace a je využíván pro produkci farmaceuticky významných sloučenin z jejich dostupnějších prekurzorů (viz tabulka č. 2).1

9

Rostlina Papaver somniferum Digitalis purpurea Digitalis lanata Eucalyptus perriniana Podophyllum hexandrum Mucuna pruriens Catharanthus Roseus Capsicum frutescens Capsicum frutescens Capsicum frutescens

Substrát thebain digitoxin digitoxin taxol koniferyl alkohol tyrosin vindolin vinblastin ferulová kyselina vanillylamin 3,4-dihydroxybenzaldehyd digitoxin

Spirulina platensis Capsicum frutescens

kodein isoeugenol Tabulka č. 21

Produkt kodein digoxin digoxin deriváty taxolu podophyllotoxin DOPA vinkristin kapsaicin, vanilin kapsaicin, vanilin kávová kyselina digoxin purpureaglykosid A morfin vanilin, kapsaicin

3.1.3 Kultivační média pro explantátové kultury Důležitým faktorem ovlivňujícím růst a morfogenezi v explantátových kulturách je složení kultivačního média, které se používá jak pro kultivaci buněk, tak rostlinných pletiv i orgánů. Médium obvykle obsahuje tyto složky: makroelementy, mikroelementy, vitamíny, aminokyseliny (případně jiný zdroj organického dusíku), sacharidy, další nedefinované organické složky, zpevňující látku a růstové regulátory.7 Mezi nejčastěji používaná média patří ta, která popsali White (1963), Murashige a Skoog (MS 1962), Gamborg et. al (B5, 1968), Gautheret (1942), Shenk a Hildebrant (SH, 1968), Nitsch a Nitsch (1969) a Lloyd a McCown (1981).7 Kultivační média používaná pro in vitro kultivaci rostlinných buněk jsou složena z těchto základních složek8: 1. esenciální prvky nebo minerální ionty 2. organické látky dodávající vitamíny a aminokyseliny 3. zdroj vázaného uhlíku (obvykle sacharóza) 4. Růstové regulátory 5. Látky používané pro zpevnění média

Esenciální prvky8 Esenciální prvky se dále rozdělují na:

10

A. Makroelementy Mezi makroelementy patří vápník, draslík, hořčík, dusík, fosfor a síra. Pro svůj růst a vývoj je rostliny potřebují ve větším množství. V médiu se vyskytují ve formě solí, jejichž koncentrace se pohybuje řádově v milimolech. Dusík je obvykle dodáván jako směs dusičnanových iontů (z KNO3) a amonných iontů (z NH4NO3). Fosfor je obvykle dodáván jako fosforečnan amonný, sodný nebo draselný. Vysoké koncentrace fosforečnanů mohou vést k precipitaci složek média na nerozpustné fosforečnany. B. Mikroelementy Mikroelementy jsou pro růst rostlin potřebné ve stopových množstvích. Mezi mikroelementy patří mangan, jód, měď, kobalt, bór, molybden, železo a zinek. Železo je obvykle dodáváno jako síran železnatý nebo citrát železnatý. Se síranem železnatým se přidává EDTA, která tvoří komplex se železem a umožňuje jeho pomalé uvolňování do média.

Organické látky a) Vitamíny Ve složení většiny běžných médií nejčastěji nalezneme thiamin (vitamín B1), pyridoxin (vitamín B6), nikotinovou kyselinu (vitamín B3) a myoinositol. Pro růst buněk je esenciální pouze thiamin. Nicméně přítomnost ostatních vitamínů urychluje růst buněk. b) Aminokyseliny Nejčastěji přidávanou aminokyselinou je glycin. Arginin, asparagin, kyselina asparagová, alanin, kyselina glutamová, glutamin a prolin jsou také používány. Aminokyseliny poskytují zdroj redukovaného dusíku. Pokud jsou přítomny jako amoniové ionty může jejich nadbytek způsobit acidifikaci média. Kaseinový hydrolyzát může být použit jako relativně levný zdroj směsi aminokyselin.

Zdroj uhlíku Většina explantátových kultur je heterotrofních a jako zdroj organicky vázaného

11

uhlíku jim slouží jednoduché cukry.1 Nejčastěji používaným zdrojem uhlíku je sacharóza, protože je levná a snadno dostupná, lehce asimilovatelná a relativně stabilní. Mohou být použity i další cukry (glukóza, maltóza, galaktóza, sorbitol). V některých případech mohou být vhodnější než sacharóza.

Růstové regulátory8 a) Auxiny Auxiny podněcují dělení a růst buněk. Nejdůležitější přirozeně se vyskytující auxin je indol-3-octová kyselina (IAA). Využití IAA je omezeno, protože je nestabilní a je inaktivována působením světla a tepla. Vyšší odolnost proti působení těchto faktorů vykazují syntetická analoga IAA – indol-acetyl-L-alanin, indol-acetyl-L-glycin atd. Nejčastěji používaným analogem IAA je 2,4-dichlorophenoxyoctová kyselina (2,4D) a kyselina naftyloctová (NAA). b) Cytokininy Cytokininy podporují buněčné dělení. Cytokininy jsou deriváty purinu. Z přirozeně se vyskytujících cytokininů v rostlinných tkáňových kulturách se používají zeatin a 2iP (2-isopentyladenin). Jejich nevýhodou je relativně nízká stabilita a vysoká cena.

Častěji

jsou

využívány

jejich

syntetická

analoga

kinetin

a

BAP

(benzyaminopurin). Jako cytokininy se používají i nepurinové sloučeniny jako substituovaná fenylureáza. c) Giberiliny Nejběžnější je GA3. Jejich využití v kultivačních médiích má jen okrajový význam. Používají se například k podpoře dlouživého růstu buněk výhonků. d) Kyselina abscisová Kyselina abscisová (ABA) se dodává za účelem stimulace i inhibice růstu kalusu v závislosti na rostlinném druhu, ke stimulaci proliferace prýtů a k inhibici pozdějších fází embryogeneze. e) Ethylen Ethylen je plynný přirozeně se vyskytující růstový regulátor. Ovlivňuje zrání ovoce. Je produkován některými typy kultur a ve vyšších koncentracích, může inhibovat jejich růst a vývoj. V kultivačních komorách je potom nutné zajistit obměnu

12

atmosféry a kultivační nádoba musí být uzavřena způsobem, který umožňuje výměnu plynů.

Nedefinované organické složky médií8 Zejména v minulosti byla často využívána řada organických extraktů (kaseinový hydrolyzát, kokosové mléko, kvasničné a sladové extrakty atd.), které sloužily jako zdroj aminokyselin a dalších živin.

Gelační činidla8 Nejčastějším gelačním činidlem je agar (vyráběný z mořských řas). Je ideální pro běžné použití, ale protože je to přírodní produkt, jeho složení se může lišit. Pro náročnější použití jsou používána čistější gelační činidla: purifikovaný agar nebo agaróza nebo různé gelační gumy.

3.1.4 Další faktory ovlivňující explantátové kultury Kromě složení kultivačního média (minerální výživa a přítomné organické látky) významně ovlivňuje vývoj explantátové kultury i kultivační prostředí. Růst buněk je ovlivněn zejména světlem (kvalita, intenzita, fotoperioda), teplotou (nejčastěji o

17 až 25

C), pH média (nejčastěji 5 až 6), složením plynné složky média,

protřepáváním a provzdušněním směsi. Optimální parametry kultivace se liší podle typu kultury a původu použitých explantátů.1 Vedle kultivačních podmínek závisí růst buněk rovněž na vlastním explantátu. Jeho chování ovlivňuje9: •

Orgán, ze kterého byl explantát izolován

•

Fyziologické a ontogenetické stádium

•

Období odběru explantátu

•

Velikost explantátu

•

Kvalita donorové rostliny

•

Genotyp

13

•

Orientace explantátu

•

Předchozí působení na donorovou rostlinu

•

Inokulační hustota

Za rozhodující faktor určující chování explantátové kultury je dnes považován genotyp. Nicméně právě u explantátových kultur se názorně projevuje vzájemná závislost genetických a fyziologických zákonitostí. Po umístnění explantátu do kultivačních podmínek u něj nastávají tyto reakce9: •

Reakce na poranění, ke kterému dochází při izolaci

•

Reakce na ztrátu vlivu celistvé rostliny

•

Reakce na kultivační podmínky

Vývoj explantátu se může ubírat jednou z následujících cest9: •

Odumření

•

Dlouhodobé přežívání bez zásadních změn (někdy dojde pouze ke zvětšení kultivovaných pletiv)

•

Pokračování v původním růstu a vývoji (např. vznik izolovaných kořenů)

•

Další vývoj struktur, které již byly založeny před izolací

3.1.5 Mikropropagace7 Mikropropagace představuje způsob vegetativního množení rostlin s využitím explantátových kultur. Vývoj rostlin v podmínkách in vitro můžeme rozdělit do několika stadií. Tato stádia jsou charakteristická vývojem kultury in vitro, který je ovlivněn změnou kultivačních podmínek v jednotlivých stádiích. Fáze mikropropagace 1. Stádium 0 – výběr matečné rostliny a její příprava pro odběr explantátů Matečná rostlina by měla být zdravá a pěstovaná v optimálních podmínkách. Odvození a růst explantátu je ovlivňován ročním obdobím, ve kterém je odebírán. Nejlepších výsledků je dosahováno, je-li explantát odebrán z rostliny v aktivní fázi

14

růstu. Změny teploty, délky dne, hladiny osvětlení, dostupnost vody a jiné faktory významně ovlivňují množství obsahových látek v rostlině a tím i vlastnosti explantátu. 2. Stádium I – odvození aseptické kultury Hlavním cílem tohoto stadia je odvodit sterilní kulturu s co největším procentem úspěšnosti. To je spojeno s povrchovou desinfekcí materiálu používaného jako explantát. Tento proces zahrnuje opláchnutí explantátu vodou a jeho povrchovou desinfekci pomocí jednoho nebo více desinfekčních činidel (chloramin B, chlorové vápno). Po desinfekci je nutné desinfekční roztok z explantátu odstranit opakovaným vypíráním ve sterilní destilované vodě. Poté se explantáty umístí do kultivační nádoby na povrch média, popřípadě do média. 3. Stádium II – fáze proliferace explantátové kultury Hlavním cílem je namnožení explantátu. Rostlinný materiál je opakovaně pasážován na čerstvém médiu. V závislosti na dosaženém koeficientu množení se zvyšuje počet explantátů v kultuře. Tento proces trvá do dosažení žádaného počtu explantátů. Množení může probíhat několika způsoby, např. somatickou embryogenezí, stimulací axilárního větvení, nebo tvorbou adventivních prýtů. 4. Stádium III – zakořeňování in vitro Tato fáze většinou představuje jednorázovou kultivaci prýtů odvozených z předchozího stádia po dobu 2-4 týdnů. V průběhu této kultivace prýty zakoření. V současnosti se více využívá zakořeňování in vivo. K zakořeňování je nutné použít jiné kultivační médium, které má odlišné složení a obsahuje cytokininy i auxiny. U některých druhů se používá médium s nižším obsahem makro i mikroelementů. Kořeny se také lépe tvoří při kultivaci prýtů na můstcích z filtračního papíru. Důležitý vliv hraje teplo (teploty, které obvykle stimulují růst kořenů, se pohybují v rozmezí 25 – 28 oC) i světlo. 5. Stádium IV – zakořeňování in vivo a aklimatizace Zakořeňováním in vivo se rozumí zakořeňování prýtů odvozených in vitro v nesterilních podmínkách na substrátech, jiných než jsou kultivační média. Jsou to různé umělé půdy, popřípadě porézní materiály (perlit, vermikulit, směsi obsahující písek a rašelinu, čedičová vata). Zakořeňování prýtů v nesterilních podmínkách se provádí tak, že se prýty z fáze proliferace jednotlivě izolují, ponoří se do roztoku

15

auxinu a poté se zanoří svou bází do vlhkého substrátu (ten by měl být kyselý až neutrální a měl by mít vysokou vodní kapacitu). Prýty zakořeněné in vitro se po předchozím důkladném opláchnutí zbytků živného média ulpělého na kořenech opatrně přesadí do vlhkého substrátu. Kromě zakořenění rostlin je také potřebná jejich aklimatizace na změněné podmínky zevního prostředí – sníženou vlhkost a přechod na autotrofní způsob výživy.

3.1.6 Kalusová a suspenzní kultura10 Kalusová kultura Kalus je amorfní pletivo tvořené buňkami, které se neorganizovaně dělí. Často vzniká v místě poškození pletiva, působením hmyzu, mikroorganismů nebo jako následek stresu. Kalus může být připraven in vitro umístěním části rostliny (explantátu) do živného média ve sterilních podmínkách. Působením endogenních růstových faktorů nebo růstových faktorů přidaných do média, je pozměněn metabolismus buněk, které se začnou dělit. Během tohoto procesu je potlačena diferenciace buněk a explantát dává vzniknout pletivu, které je složeno z meristematických a nespecializovaných buněk. Během dediferenciace je utlumena produkce sekundárních metabolitů. Vzniká nový meristém, který dává vzniknout nediferenciovaným parenchymatickým buňkám bez jakékoli struktury. Ačkoli kalus zůstává neorganizovaný, při pokračování růstu mohou vzniknout některé typy specializovaných buněk. Diferenciace se může vyskytnout náhodně, nebo může být spojena s centry morfogeneze, které dávají vzniknout orgánům jako jsou kořeny, lodyhy nebo embryonální pletivo. De novo vznik rostlin z neorganizovaných kultur je popisováno jako regenerace rostlin. Ačkoli k přípravě kalusu může být použita jakákoli část rostliny, jsou k jeho přípravě některé orgány vhodnější. Nejvhodnější jsou meristematická pletiva a nebo zbytky meristému ve starších částech rostliny např. v kambiu. Kalus připravený z původního explantátu je nazýván primární kalus. Sekundární kalusová kultura bývá připravovaná z buněk odebraných z primárního kalusu. Kalusová kultura může být udržovaná řadu let, ale čím déle je udržovaná, tím vyšší je riziko genetického poškození.

16

Suspenzní kultura V suspenzních kulturách jsou buňky kalusu volně dispergovány v tekutém pohybujícím se živném médiu. Tyto kultury se většinou připravují umístěním inokula do tekutého média. Důkladným protřepáním dochází k oddělování jednotlivých buněk a jejich malých shluků z původního pletiva (kalusu) do kultivačního média. Protože buněčné stěny mají přirozenou tendenci ke vzájemné adhezi, není možné připravit suspenzi jednotlivých buněk. Stupeň dispergace je možné ovlivnit například složením média. Auxiny zvyšují aktivitu enzymů, které degradují lamely spojující buněčné stěny pletiva, proto média s vysokým obsahem auxinů a nízkým obsahem cytokininů zvyšují stupeň disperze buněk v médiu. Buňky suspenze mají s živným médiem přímý kontakt, takže jsou jednotlivé složky rychle dostupné. Snadný přísun živin a dobrá výměna dýchacích plynů umožňuje velmi rychlý růst suspenze.

17

3.2 Fyziologie stresu 3.2.1 Stresové faktory a stresová reakce9 Rostliny jsou během svého života vystaveny proměnlivým podmínkám vnějšího prostředí. Tyto podmínky mohou zpomalovat jejich životní funkce, poškozovat jednotlivé orgány a mohou vést až k jejich uhynutí. Nepříznivé vlivy vnějšího prostředí závažně ohrožující rostlinu označujeme jako stresové faktory – stresory. Termín stres je obvykle používán pro souhrnné označení stavu, ve kterém se rostlina nachází pod vlivem stresorů. Přehled nejdůležitějších stresových faktorů, se kterými se rostliny setkávají v přírodě: Abiotické faktory: Fyzikální: •

mechanické účinky větru

•

nadměrné záření (UV, viditelné)

•

extrémní teploty (horko, chlad, mráz)

Chemické: •

nedostatek vody (sucho)

•

nedostatek kyslíku (hypoxie, anoxie)

•

nedostatek živin v půdě

•

nadbytek iontů solí a vodíku v půdě

•

toxické kovy a organické látky v půdě

•

toxické plyny ve vzduchu

Biotické faktory: •

herbivorní živočichové (spásání, poranění)

•

patogenní mikroorganismy (viry, mikrobi, houby)

•

vzájemné ovlivňování (alelopatie, parazitismus)

Stresové faktory (fyzikálně-chemické i biotické) mohou pronikat do vnitřního prostředí rostlin různých druhů nestejně snadno, především v důsledku různě vyvinutých ochranných struktur. Tento způsob ochrany má převážně pasivní a dlouhodobý charakter (např. tlustá kutikula na listech, výrazná impregnace buněčných stěn, rezervoáry vody a snadno rozložitelných organických látek tlumící jejich

18

nedostatek). Jedná se o schopnost vyhnout se stresu, ke které přispívají také vhodně načasované životní cykly. Z fyziologického hlediska jsou zajímavější mechanismy aktivní odolnosti omezující dopad stresorů až po jejich proniknutí k plazmatické membráně buněk a do symplastu. V takovém případě dochází ke spuštění řetězce změn – stresová reakce. Zjednodušeně lze i u rostlin přijmout klasické schéma průběhu stresové reakce (známé z humánní fyziologie): •

poplachová fáze – bezprostředně po začátku působení stresového faktoru, dochází k narušení buněčných struktur a funkcí

•

restituční fáze – dochází k mobilizaci kompenzačních mechanizmů, pokud intenzita působení stresoru nepřekračuje letální úroveň

•

fáze rezistence – kompenzační mechanismy směřují ke zvýšení odolnosti rostliny vůči působícím faktorům

•

fáze vyčerpání – při dlouhodobém a intenzivním působení stresového faktoru dochází k dalšímu poklesu

obr.č. 1: Idealizovaný průběh stresové reakce (Podle Larchera 1995)9 Základní schéma stresové reakce však nevypovídá nic o rozmanitosti vlastního působení stresorů ani o koordinaci složitého komplexu reakcí, kterými je podložena odpověď rostliny na jejich působení. Průběh stresové reakce a její konečný výsledek závisí jak na intenzitě a délce působení stresového faktoru na danou rostlinu, tak i na geneticky vázaných předpokladech odpovědi, souhrnně označovaných jako adaptační schopnosti.

19

Přechodné zvýšení odolnosti získané pod vlivem stresoru nazývané jako aklimatizace, může být založeno jak na změnách rychle pomíjivých (tvorba specifických metabolitů), tak i na změnách trvalejších (změny v tvorbě nových orgánů a v jejich vnitřní struktuře). Působení stresorů (např. nízké teploty) může na druhou stranu podmiňovat průběh důležitých morfogenetických procesů, např. klíčení či tvorby květních orgánů, a tím zvýšit reprodukční schopnosti i kompetitivní úspěšnost. Studium stresu u rostlin rostoucích v přírodních podmínkách je dále komplikováno tím, že často více stresových faktorů působí současně (např. silné záření, vysoká teplota a nedostatek vody). Interakce mezi nimi mohou podstatně měnit charakter stresové reakce ve srovnání s působením každého faktoru zvlášť. Působení stresorů bývá také často omezeno pouze na část rostliny (listy či kořeny), ve které dochází k lokální stresové reakci, ale ta může druhotně způsobovat stres i v ostatních orgánech.

3.2.2 Mechanismy stresových reakcí9 Univerzální obecná stresová reakce pravděpodobně neexistuje, nepochybně ale u rostlin existují dílčí komplexy společných reakcí, které vedou ke zvýšení odolnosti vůči několika stresorům současně. Metabolické změny v buňkách při působení i velmi odlišných stresorů mají skutečně řadu společných znaků. K nejčastějším společným změnám, které vedou ke zvýšení odolnosti vůči několika stresovým faktorům současně, patří: - tvorba stresových proteinů, - tvorba a odstraňování aktivních forem kyslíku, - tvorba „stresových“ fytohormonů (kyseliny abscisové, ethylenu, kyseliny jasmonové, methyljasmonátu a polyaminů), - tvorba osmoregulačních sloučenin (cukrů, polyalkoholů, a jednoduchých dusíkatých látek). Tvorba stresových proteinů Vlivem stresového faktoru se v buňce začnou syntetizovat proteiny, které se za normálních okolností nedají v buňkách zjistit. Tyto proteiny se nazývají stresové

20

proteiny. Jen některé proteiny se pravidelně vyskytují i u jiných typů stresů, zbývající část stresových proteinů je specificky vázána na určitý stresový faktor. Většina proteinů, jejichž tvorba je indukována nespecificky, tedy různými typy stresorů, patří do některé z těchto tří funkčních skupin: molekulární chaperony, proteázy a ubikvitin. Vesměs se jedná o konstitutivní proteiny, které patří k pravidelné výbavě buněk všech genotypů, ovšem za stresu se jejich množství mnohonásobně zvyšuje. Jejich intenzivní tvorba souvisí se vzrůstem počtu poškozených proteinů v různých buněčných strukturách. Chaperony slouží k řízení změn konformace proteinů při transportech přes membrány a jsou schopny upravit jejich konformaci i při mírném poškození. Pokud ovšem dojde k velkým, nenapravitelným změnám, je takový protein „označen“ malou molekulou ubikvitinu a rozložen pomocí proteáz na aminokyseliny. Ty jsou pak využity k syntéze nových proteinů. Nejdůležitější skupiny stresových proteinů: •

proteiny indukované zvýšenou teplotou

•

proteiny indukované chladem

•

proteiny indukované dehydratací

•

proteiny indukované sníženou koncentrací kyslíku

•

proteiny indukované patogeny

Aktivní formy kyslíku Běžný molekulární kyslík v atmosféře je poměrně málo reaktivní, ovšem některými procesy v rostlinách může být přeměněn na mnohem aktivnější formy. Úloha těchto látek ve stresovaných rostlinách je velmi rozmanitá a do jisté míry rozporná. Jednak vznikají jako nebezpečné produkty při působení řady stresových faktorů a rostliny musí mít účinné systémy na jejich deaktivaci, jednak mohou mít kladnou úlohu jako signály či ochranné látky při některých typech stresů, a je tudíž žádoucí jejich koncentraci udržovat na jisté úrovni. Negativní působení aktivních forem kyslíku spočívá především v peroxidaci lipidů. Mechanismy ochrany před oxidačním poškozením: •

systémy přímé deaktivace: karotenoidy, alfa-tokoferol

•

specializované enzymy a enzymatické systémy: superoxiddismutáza

21

•

protistresová úloha aktivních forem kyslíku

Tvorba stresových fytohormonů Rostlinné hormony (fytohormony) patří k nejvýznamnějším vnitřním faktorům růstu. Působením stresových faktorů se mohou vytvářet některé fytohormony (kyselina abscisová, ethylen, kyselina jasmonová, methyljasmonát a polyaminy). Kyselina abscisová (ABA) – je přirozeným inhibitorem růstu krytosemenných rostlin. Nejvíce se tvoří v dormantních orgánech (pupenech, semenech, hlízách), ale i v mladých, rychle rostoucích pletivech (listech). Inhibuje klíčení, tvoří oddělovací vrstvy mezi řapíkem a stonkem, což vede k opadávání listů a řapíků. Urychluje stárnutí buněk a také brzdí dělení a růst buněk. Její působení ve stresových situacích je spojeno s indukcí tvorby specifických proteinů, které chrání buňku před působením stresových podmínek. Kyselina abscisová redukuje nejen negativní vliv nedostatku vláhy, ale i dalších stresů, které nedostatek vody v buňce vyvolávají, jako nízká teplota, zasolení apod. Proto je kyselina abscisová považována za důležitý faktor obrany rostlin vůči stresům, případně adaptace k nim. Ethylen – je přírodní regulátor zrání plodů, brzdí syntézu auxinu. Dále inhibuje prodlužovací růst a stimuluje růst radiální. Zvýšení tvorby ethylenu je jednou z prvních reakcí rostlin na působení stresoru. Jeho zvýšenou tvorbu vyvolává nedostatek i nadbytek vody, anaerobióza, teplotní výkyvy, zasolení, poranění, napadení patogeny i toxické látky. Kyselina jasmonová a methyljasmonát – urychlují stárnutí listových segmentů a důležitou úlohou je jejich funkce jako signál při reakci na dotyk, na patogeny a na poranění. Stoupá tím jejich obsah v buňce, který nese informaci o působení vnějšího faktoru. Polyaminy – stimulují růst v systémech in vitro, ve kterých probíhá intenzivní buněčné dělení. Také stimulují somatickou embryogenezi a iniciují kvetení. Hrají významnou úlohu v obraně proti stresům, a to díky jejich ochranným působením na membrány a na DNA (mohou ovlivnit její konformaci i expresi genů). Polyaminy jsou rovněž schopny stabilizovat buněčné pH a zvyšují vnitrobuněčnou osmolaritu.

22

3.2.3 Biotické stresy9 Alelopatie Dojde-li k přenosu účinné látky z rostliny a tím k ovlivnění sousední rostliny, jedná se o alelopatii. Každá rostlina obsahuje velké množství sekundárních metabolitů, z nichž některé mohou působit inhibičně až toxicky na jiné rostliny vyskytující se v jejich těsné blízkosti. Účinné látky musí být z jedné (zdrojové) rostliny vyloučeny a přeneseny na jinou (cílovou) rostlinu v dostatečné koncentraci. Zdrojová rostlina tedy musí být vůči účinné látce mnohem méně citlivá než rostlina cílová. Teoreticky je toto působení možné i u nadzemních orgánů přenosem těkavých látek (hlavně terpenů) či smýváním netěkavých metabolitů vyloučených na povrch listů, ale hlavní význam má v kořenové zóně. Lépe prozkoumané je nepřímé alelopatické působení zprostředkované metabolity uvolněnými mikrobiálním rozkladem z odumřelých částí rostlin. Interakce s býložravými živočichy Rostliny jsou vystavovány stálému nebezpečí poškození svých orgánů mnoha druhy živočichů. Existuje celá řada morfologických a morfogenetických adaptací k omezení herbivorie (např. ostré trny či trichomy, vysoký obsah tuhých sklerenchymatických pletiv či schopnost rychlé regenerace poškozených orgánů). Velmi časté jsou i rozmanité biochemické adaptace. Z velkého množství sekundárních metabolitů, syntetizovaných v rostlinách, mnohé působí na herbivorní živočichy odpudivě až toxicky. Z hlediska množství, v jakém se vyskytují, je lze rozdělit na metabolity kvalitativně významné a kvantitativně významné. Látky kvalitativně významné se sice vyskytují v malých koncentracích, ale zato jsou pro živočichy velmi toxické.

Patří

sem

nejrůznější

alkaloidy,

glykosidy

uvolňující

kyanovodík,

glukosinoláty a mnoho dalších. Kvantitativně významné metabolity sice nejsou tak toxické, ale ve větším množství způsobují špatnou stravitelnost, nechutnost až toxicitu. Mezi ně řadíme: lignin, taniny a fenolické látky. Reakce na patogenní organismy Rostliny ohrožují i patogenní mikroorganismy (viry, bakterie, houby). Především patogenní houby disponují celou řadou velmi účinných lytických exoenzymů.

23

Na počátku obranných reakcí je podnět k jejich spuštění, obvykle jím bývá specifický metabolit – elicitor, uvolňovaný při počáteční interakci buňky s patogenem a identifikovaný vhodným receptorem hostitelské rostliny. Jako elicitory mohou sloužit: • některé metabolity vylučované patogeny – exogenní elicitory, např. některé polysacharidy, specifické enzymy a peptidy • sloučeniny, které jsou uvolňovány z narušovaných buněčných stěn obou organismů – endogenní elicitory, např. oligomery chitinu, oligoglukany a glykoproteiny uvolňované hydrolýzou buněčné stěny patogenních hub či oligogalakturonany uvolňované z buněčné stěny napadené buňky. Většina obranných reakcí rostliny je závislá na aktivaci vhodných genů. Elicitory obvykle neovlivňují genovou aktivitu přímo, ale zprostředkovaně pomocí přenašečů signálu (druzí poslové). Vlastní obranné reakce zahrnují tvorbu specifických stresových proteinů, syntézu a hromadění chemicky jednodušších sloučenin s výrazným antibiotickým účinkem. Tyto sekundární metabolity s ochrannou funkcí jsou u některých druhů rostlin přítomny trvale, i když v menším množství než při infekci. Patří k nim nejrůznější flavonoidy, terpenoidy, fenolické látky a alkaloidy, které bývají souhrnně označovány jako fyntocidy či inhibitiny. K obranným reakcím na patogeny můžeme zařadit tvorbu nízkomolekulárních obranných látek – fytoalexinů. Další obrannou reakcí je hypersenzitivní reakce, při níž dochází k rozpadu membránového systému hlavně náhlým zvýšením koncentrace vysoce reaktivních volných radikálů a peroxidu vodíku. Dochází k rychlé zkáze jak vlastní buňky, tak i houbové hyfy. Postupně dojde i k odumření buněk v blízkém okolí místa infekce. Jiným typem obranných reakcí rostlin je rychlé zvýšení tvorby polysacharidu kalózy, který pak vyplňuje buňky v okolí infikovaného místa a je velmi odolný vůči houbovým hydrolázám. Navzdory těmto mechanismům existují silně virulentní kmeny hub, které překonají ochranná opatření a to díky mimořádně rychlému růstu hyf a tvorbě specifických látek tzv. supresorů, které potlačují vznik hypersenzitivní reakce, tvorbu stresových proteinů a ostatních ochranných metabolitů.

24

3.2.4 Abiotické stresy9 Mezi chemicky působící abiotické stresové faktory lze zařadit: •

Reakce na přehřátí

•

Stresové účinky nízkých teplot

•

Vodní stres

•

Nedostatek kyslíku v půdě

•

Zasolené a kyselé půdy

•

Toxické látky v prostředí

Toxické látky v prostředí Plynné, kapalné i pevné složky prostředí, ve kterém v přírodě rostliny rostou, jsou velmi pestrou směsí desítek chemických sloučenin, z nichž některé mohou mít výrazně inhibiční až toxické účinky. Z plynů je nejvíce nebezpečný oxid siřičitý a ozon, v půdě pak ionty těžkých kovů a aromatické organické látky. Oxid siřičitý vstupuje do listů hlavně otevřenými průduchy a difúzí v intercelulárách se snadno šíří ke všem buňkám listového mezofylu. Po proniknutí buněčnou stěnou se rychle rozpouští a mění na siřičitanové anionty, jejichž naprostá většina vstupuje do chloroplastů. Tam se v menších koncentracích neprojevují škodlivě. Ve vyšší koncentraci však siřičitanové ionty blokují činnost karboxylačního enzymu RuBisCO, a tím je inhibován i průběh sekundárních procesů fotosyntézy. Aklimační reakce na působení oxidu siřičitého zahrnují zvýšení aktivity enzymů metabolismu síry a také zvýšení pufrovací kapacity buněk. Ozon vstupuje do listů výhradně průduchy a již v intercelulárách v kontaktu s vlhkými buněčnými stěnami se velmi rychle rozkládá. Při rozkladu ozonu vzniká nejen molekulární kyslík, ale jako meziprodukty i vysoce reaktivní superoxid a hydroxylový radikál, ty jsou částečně zneškodněny již v buněčné stěně přeměnou na peroxid vodíku a pak na vodu. Ozon indukuje tvorbu ethylenu, polyaminů a flavonoidů, které jsou také součástí obranných mechanismů. Probíhá také tvorba stresových proteinů, které jsou téměř shodné s proteiny tvořenými při napadení rostliny patogenními organismy. Při vyšších koncentracích ozonu a při jeho delším působení nejsou ochranné antioxidační systémy dostatečné a dochází k poškození buněčných součástí. Nejvíce bývá postižena peroxidací lipidů plazmalema, částěčně však i vnitřní

25

membránový systém buněk a organely, včetně chloroplastů. Na poškozených listech se nejprve objevují drobné světlé skvrny, později celé listy žloutnou a odumírají. Toxické kovy: Těžké kovy jsou definovány jako kovy s hustotou vyšší než 5 g.cm-3. Někteří zástupci této skupiny patří mezi mikroelementy důležité pro metabolismus rostlin (Fe, Mo, Mn, Zn, Ni, Cu, V, Co, W, Cr). Jiní zástupci jsou považováni za vysoce toxické (As, Hg, Ag, Sb, Cd, Pb, U). Nejčastějším zdrojem znečištění těžkými kovy je prach z průmyslových procesů a výfukové plyny. Těžké kovy jsou z kontaminované půdy absorbovány rostlinami a tím se dostávají do potravního řetězce. Po vstupu do buněk tvoří těžké kovy komplexy s proteiny, inaktivují některé enzymy a redoxní systémy. Inhibice dělení a dlouživého růstu buněk se projevuje zpomalením růstu primárního kořene. V kořenech také dochází k největšímu hromadění těžkých kovů. Část toxických iontů je transportována do nadzemních částí rostlin, kde ovlivňuje fyziologické procesy v listech, zejména fotosyntézu. K vnitrobuněčným detoxikačním mechanizmům patří tvorba stresových proteinů zahrnujících odolnější izoenzymy, ale také proteázy a ubikvitin pro urychlení rozkladu poškozených bílkovin.9, 11

3.2.5 Elicitace a elicitory Elicitace je proces založený na signálem (elicitorem) indukované obranné reakci rostliny. Ta se projevuje zvýšenou expresí genů, což vede následně ke zvýšení syntézy sekundárních metabolitů v rostlinách i v kulturách in vitro.12 Elicitory obvykle neovlivňují genovou aktivitu přímo, ale zprostředkovaně pomocí přenašečů signálu (second messengers, např. cAMP). Přenos od aktivovaných receptorů elicitorů k DNA v jádře je možný více systémy. K takovým patří především fosfoinositidový systém, při kterém jsou hydrolýzou lipidů plazmatické membrány generovány dvě signální sloučeniny (inositol-1,4,5-trifosfát a diacylglycerol), které za účasti iontů vápníku aktivují proteinkinázy a posléze i expresi genu. Zvýšení koncentrace vápníku v cytosolu vede k aktivaci proteinkináz a fosforylaci enzymů, které posléze produkují stresové metabolity. Zvýšení koncentrace vápníku v cytosolu může být docíleno například i zvýšenou propustností iontových kanálů. Rychlým způsobem přenosu signálu je tvorba superoxidu a dalších aktivních forem kyslíku.

26

Kromě možného přímého účinku peroxidu vodíku na expresi genu existuje ještě nepřímá cesta, při které vzniká peroxidací membránových lipidů kyselina jasmonová a methyljasmonát, které ovlivňují transkripci.9 Fytoalexiny Fytolaxiny jsou lipofilní látky, produkty sekundárního metabolismu rostlin, které se kumulují v místě infikovaného pletiva, jako odpověď na stres vyvolaný patogenními organismy (viry, bakterie, houby). Za normálních okolností se v buňkách nevyskytují, ale začnou se vytvářet po napadení patogenem. Většina z těchto sloučenin je lipofilní povahy, což jim usnadňuje pronikání přes plazmatickou membránu patogenů. Poškození membránových funkcí patří také k nejčastějším mechanismům toxického působení fytoalexinů. Fytoalexiny mají toxické účinky hlavně na patogenní houby, méně pak na bakterie.9, 13 Fytochelatiny (PC) Fytochelatiny (PC) jsou skupinou peptidů, které jsou produkovány rostlinami a některými mikroorganismy (např. Schizosaccharomyces pombe). Jsou syntetizovány z glutathionu fytochelatinsyntetázou (γ-Glu-Cys dipeptidyltranspeptidáza) jejíž aktivita je indukována přítomností těžkých kovů.14 PC slouží jako ochranný mechnismus před intoxikací rostlinné buňky těžkými kovy. Po vstupu iontu kovu do cytosolu buňky s ním PC vytvoří komplex a předchází tak jeho interakci se strukturními proteiny buňky.15 Komplexně vázané toxické ionty jsou transportovány do vakuoly, kde jsou, po uvolnění z PC, inaktivovány vysokou koncentrací organických kyselin.9 Studie provedená na explantátových kulturách rostliny Rauwolfia serpentina prokázal, že syntéza PC, může být indukována přímností následujících těžkých kovů: Cd2+ >Pb2+ >Zn2+ >Sb3+ >Ag+ >Hg2+ >As5+ >Cu+>Sn2+ >Au3+ >Bi3+. Jednotlivé kovy jsou uvedeny v pořadí dle klesající intenzity indukce syntézy PC.15 PC mají základní strukturu (γ-Glu-Cys)n-Gly-COO-, kde se dipeptidická repetice glutamové kyseliny a cysteinu může opakovat 2-11 krát. Terminální glycin může být nahrazen jinou aminokyselinou. V takovém případě hovoříme o isofytochelatinech. Rostliny řádu Fabales produkují PC, v jejichž struktuře je terminální glycin nahrazen β-alaninem. Tyto látky obsahují 2-7 krát opakující se sekvenci (γ-GluCys) a jsou souhrnně označovány jako homo-fytochelatiny. Z rostlin čeledi Poaceae byly izolovány tzv. hydroxymethyl-PC, v jejichž struktuře je terminální glycin

27

nahrazen serinem. Z kukuřice (Zea Mays) byla izolována série PC obsahujících namísto glycinu glutamovou kyselinu. Z kukuřice byla rovněž izolována série PC, které neobsahovaly terminální aminokyseliny. Ty jsou označovány jako desGly-PC.15 SH

O +

H3N

COO

-

COO

NH

NH O

-

n

n = 2 - 11

Obrázek č. 2: Struktura fytochelatinu15

Elicitory Původně byl termín elicitor používán k označení sloučenin vyvolávajících produkci fytoalexinů, ale v současné době je používán pro všechny typy látek vyvolávající u rostlin obranné reakce. Elicitory mohou být abiotického nebo biotického původu. Zdrojem biotických elicitorů mohou být patogeny (exogenní elicitory), nebo jsou produkovány samotnými rostlinami v reakci na poškození pletiv způsobených např. infekcí (endogenní elicitory). Elicitory obvykle spouštějí řadu typů obranných reakcí zahrnující produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) a fytoalexinů. Zejména nárůst produkce fytoalexinů je významný z podhledu využití elicitace v biotechnologii, kde je tento jev využíván ke zefektivnění produkce sekundárních metabolitů. Elicitory jsou rovněž využívány při studiu složitých biosyntetických cest a signálních mechanismů vedoucích k produkci sekundárních metabolitů v rostlinách. Tabulka č. 3 znázorňuje rozdělení elicitorů podle jejich původu a struktury.15 Elicitory Fyzikální Chemické

Abiotické Biotické

Poškození pletiva Kationty kovů (La, Eu, Ca, Ag, Cd), oxalát Nedefinované Buněčné stěny kvasinek, buněčné stěny mycelií, spory směsi hub Definované Sacharidy Polysacharidy Alginát sloučeniny Pektin Chitosan Guar Oligosacharidy Mannuronát Guluronát Mannany Galaktouronidy Bílkoviny Peptidy Glutathion Proteiny Celluláza, Elicitin, Oligandrin Tuky Lipopolysacharidy Glykoproteiny Těkavé látky C6-C10

28

Účinek popsán u P Pc Pc, F Pc, F, B Pc, F Pc Pc F F F Pc Pc Pc Pc Pc Pc

Tabulka č. 3: Rozdělení elicitorů podle jejich původu a struktury P – rostliny, Pc – explantátové kultury, B – bakteriální kultury, F – kultury hub15 Proteiny a glykoproteiny Jako příklad proteinu, který je využíván pro elicitaci je celluláza. Tato bílkovina vyvolává kumulaci fytoalexinů v explantátových kulturách získaných z N. tabacum a zvyšuje v nich produkci terpenů kapsidiolu16 a debneoylou17. Další skupina bílkovinných elicitorů - elicitiny jsou produkovány patogenní houbou Phytophtora drechleri. Tyto látky vyvolávají nekrotické změny v pletivu listů tabáku a byly využity pro studium úlohy iontových kanálů v membránách rostlinných buněk během přenosu signálu informujícím o působení vnějších podnětů. Do skupiny elicitinů náleží i peptid oligandrin, který u rostlin rajčete jedlého (Lycopersicon esculentum Mill.), vyvolává resistenci vůči plísňovým chorobám. Další skupinou látek, které jsou využívány jako elicitory, jsou glykoproteiny. Komplex glykoproteinů izolovaný z kvasnic je využíván jako elicitor podporující produkci alkaloidů v explantátových kulturách izolovaných z Eschscholzia californica Cham. (Sluncovka kalifornská).18 Polysacharidy Jako příklad polysacharidu, u kterého byl sledován vliv jeho přítomnosti na míru produkce fytoalexinů může posloužit chitosan. Jedná se o parciálně N-acetylovaný poly-β-1,4-D-glukosamin, který je strukturním polysacharidem buněčných stěn některých patogenních hub (např. Fusarium sp). Efekt chitosanu na permeabilitu membrán a produkci sekundárních metabolitů byl sledován u rostlin Nicotiana tabacum a Eschscholzia californica Cham. Přítomnost chitosanu neovlivnila permeabilitu membrán rostlinných buněk, ale výrazným způsobem zvyšovala produkci fytoalexinů. Oligosacharidy odvozené od chitosanu rovněž výrazným způsobem zvyšovaly produkci taxolu v explantátových kulturách připravených z tisu kanadského (Taxus canadensis, M.).15 Rostlinné hormony Kyselina salicylová (SA) a kyselina jasmonová (JA) jsou považovány za klíčové sloučeniny podílející se na aktivaci genů účastnících se na obranných reakcích rostlin. SA a JA jsou využívány jako exogenní elicitory, které u rostlin indukují vznik resistence vůči řadě patogenů.15

29

Abiotické elicitory Jako abiotických elicitorů, schopných vyvolat produkci fytoalexinů, je využíváno i některých těžkých kovů. Např. přítomnost AgNO3 a CdCl2 zvyšuje produkci tropanových alkaloidů skopolaminu a hyoscyaminu explantátových kultur v kořenových kulturách durmanu bělostného (Brugmansia candida, Persoon). Wu et al. studoval vliv lanthanu na produkci taxolu v explantátových kulturách tisů a pozoroval výrazný nárůst v produkci tohoto sekundárního metabolitu.15

30

3.3 Chlorid ceritý (CeCl3) Ve své diplomové práci jsem pro elicitaci kalusových kultur Pohanky obecné (Fagopyrum esculentum Moench.) použila abiotický elicitor – CeCl3. Pozorovala jsem závislost produkce rutinu na různých koncetracích CeCl3 v kultivačním médiu. Chlorid ceritý (M = 246,48 g/mol) je krystalická bílá látka. Jedná se o vysoce hygroskopickou sloučeninu, která se často vyskytuje ve formě heptahydrátu (CeCl3.7 H2O, M = 372.58 g/mol). Je velmi dobře rozpustný ve vodě, jeho bezvodá forma je rozpustná i v etanolu a acetonu. Spektrum využití abiotických elicitorů je velmi široké a všechny oblasti jejich účinků dosud nebyly uspokojivě zaznamenány. Pro ilustraci zde uvádím přehled několika studií, jejichž společným jmenovatelem je právě použití stejného abiotického elicitoru jako v mé práci – chlorid ceritý. Cer patří mezi lanthanoidy, které spolu se skandiem a např. yttriem tvoří skupinu prvků vzácných zemin. Jedná se o chemicky uniformní skupinu prvků. Někteří zástupci této skupiny byli v minulosti využiti pro elicitaci explantátových kultur.19 Např. byl prokázán pozitivní efekt La na produkci taxolu v explantátových kulturách Taxus spp.20 Kovy této skupiny jsou v nízkých koncentracích schopny urychlovat růst a vývoj rostlin a zvyšovat výnosy.19 Z kukuřice byl v minulosti izolován specifický protein schopný vázat prvky této skupiny. Narozdíl od fytochelatinů, se jedná o protein o Mw asi 180 000. Skládá se ze dvou podjednotek a kromě aminokyselin obsahuje i kovalentně vázané sacharidy.19 V jedné ze studií byl sledován efekt ceru na průběh fotosyntézy u sojových sazenic vystavených UV-B záření. Působení tohoto záření vedlo k poklesu fotosyntézy, který se projevil poklesem její rychlosti, potlačením Hillovy reakce – to vedlo ke snížení kvantového výtěžku. Naopak přítomnost ceru výrazně zvýšila rychlost fotosyntézy, což se projevilo zvýšenou fotofosforylací a zvýšením efektivity karboxylace. Společné působení ceru a UV-B záření, vedlo k poklesu intenzity fotosyntézy ve srovnání s kontrolou, ale k mírnému nárůstu rychlosti fotosyntézy ve srovnání s působením UV-B zářením samotným. Výsledky naznačují, že přítomnost ceru zmírňuje negativní dopad působení UV-B (280-320 nm) záření na rychlost fotosyntézy.21, 22

31

Obdobných výsledků bylo dosaženo i ve studii, která byla zaměřena na sledování vlivu UV-B záření v přítomnosti ceritých kationtů na růst sazenic řepy (Brassica juncea L.). V rámci pokusu byly využity dvě různé úrovně intezity UV záření (0.15 W/m2 a 0.35 W/m2). Působení UV záření se projevilo v poklesu obsahu chlorofylu v buňkách sazenic, zpomalením fotosyntézy, vzrůstem permeability membrán a zvýšením aktivity enzymů s antioxidační aktivitou superoxiddismutáza (SOD), kataláza (CAT) and peroxidázy (POD)). Nejcitlivěji reagoval na působení UV záření enzym superoxid dismutáza, naopak nejmenší zněmy v aktivitě vykazovaly peroxidázy). Přítomnost ceritých kationtů obecně zmírňovala negativní působení ultrafialového záření na sazenice, a to zejména při nižší hladině záření.23, 24 Další studie byla zaměřena na studium vlivu přítomnosti ceru a lanthanu na rostliny Přeslice rolní (Hydrilla verticillata L.). V koncentracích vyšších než 10 µM způsobovaly tyto vzácné kovy oxidativní stres, který se projevoval zvýšenou přítomností H2O2 a poklesem obsahu chlorofylu v buňkách rostlin. S rostoucí koncentrací obou prvků rostla aktivita enzymu peroxidázy, zatímco aktivita superoxiddismutáz a kataláz klesala. Rovněž byl pozorován nárůst produkce malondialdehydu. Výsledky této studie dokládají, že přítomnost lanthanu a ceru způsobuje peroxidaci lipidů, což vede ke změnám v permeabilitě membrán buněk. Přítomnost těchto vzácných kovů rovněž snižuje obsah chlorofylu a bílkovin v rostlinných buňkách.25 Působení ceru rovněž zmírňuje následky nedostatku hořčíku během růstu rostliny. Hořčík je důležitým makroelementem a je součástí aktivních center řady enzymů. Jeho nedostatek způsobuje pokles produkce chlorofylu a enzymů, které se podílejí na asimilaci CO2 během temnostní fáze fotosyntézy (RuBisCO, ribulosa-1,5bisfosfát-karboxyláza). Yuguan et al. prokázali ve studii sledující vliv nedostatku hořčíku na růst rostlin špenátu (Spinacia), že přítomnost ceru může částečně eliminovat následky deplece tohoto důležitého prvku. 26 Ionty ceru jsou schopny nahradit kationty hořčíku ve struktuře chlorofylu, čímž mohou přispět k urychlení fotosyntetických pochodů.27

32

3.4 Flavonoidní glykosidy Flavonoidní glykosidy neboli flavonoidy jsou rozsáhlou skupinou rostlinných fenolů. Syntéza fenolických látek vychází z fenylalaninu, který je za katalýzy enzymem fenylalaninamoniaklyázou (PAL) přeměněn na kyselinu skořicovou, do jejíž molekuly jsou pak zaváděny hydroxylové a methoxylové skupiny. Tyto látky mohou být polymerizovány na lignin, ale mohou z nich vznikat i kumariny, flavonoidy apod.9 Pro všestranné působení na organismus se často nazývají bioflavonoidy. Flavonoidy jsou deriváty fenylchromanu (kyslíkatá heterocyklická sloučenina). Základem je chroman arylovaný v poloze 2 - flavany, v poloze 3 - isoflavany nebo v poloze 4 - neoflavany.28

O

flavan

O

O

isoflavan

neoflavan

Obrázek č.3.: Strukturní vzorec flavanu, isoflavanu a neoflavanu28 V přírodě jsou hojně rozšířeny flavany, jsou obsaženy v cévnatých rostlinách a dle stupně oxidace pyranového kruhu se jejich deriváty dělí do několika skupin – flavany, flaveny, flavanony, flavanoly, flavandioly, flavony a flavonoly. Významné jsou flavonoidy – deriváty 4-oxoflavanu – flavony, flavonoly a flavanony. Jednotlivé flavonoidy se navzájem liší počtem a polohou hydroxylových skupin na obou aromatických kruzích a napojením cukrů nebo organických kyselin.28 V rostlinách se flavonoidy vyskytují většinou glykosidicky vázané, rozpuštěné v buněčné šťávě vakuoly. Methoxylované deriváty jsou lipofilní a vyskytují se v silicích. V rostlinném organismu se účastní oxidačně-redukčních pochodů.28 Flavonoidy napomáhají rostlinám vyrovnat se s působením abiotických stresorů (UV záření) a podílí se na mechanismech ochraňujících fotosyntetický aparát rostlin.29 Terapeutické využití flavonoidů je založeno na jejich schopnosti normalizovat permeabilitu kapilár, odstraňovat jejich lomivost, působit antihemorhagicky a antiedematózně. Jsou inhibitory hyaluronidázy, brání šíření mikrobiálních toxinů

33

tkáněmi – jsou podpůrnými prostředky při léčení infekčních onemocnění. Některé působí diureticky, rozšiřují cévy, snižují krevní tlak. S vápenatými ionty tvoří komplexní soli a brání tak srážení krve a zadržují vápník v těle. Potencují účinek vitamínu C. Mají také vlastnosti choleretické, cholagogní a spasmolytické.28 Účinné jsou glykosidy i aglykony. Nejčastěji se používají jako drogy nebo jejich extrakty, ale používají se i v čistém stavu – rutin, hesperidin.28 Rutin V rostlinách je hojně rozšířen terapeuticky významný flavonolový glykosid rutin

(kvercetin-3-rhamnoglukosid,

3-rhamnoglukosid

5,7,3´,4´-

28

tetrahydroxyflavonolu). Biologicky aktivní složkou rutinu je jeho aglykon kvercetin.30 Cukerná část nemá významné biologické účinky, ale podílí se na zvýšení rozpustnosti tohoto flavonoidu ve vodě. V rostlinách působí rutin jako ochranný faktor proti UV záření. 31 OH HO

OH O OH O

O

HO

O O OH HO

OH

OH

OH

Obrázek č. 4: Strukturní vzorec rutinu28 Název pochází od routy – Ruta graveolens L., z níž byl poprvé izolován. Získává se hlavně z pohanky – Fagopyrum vulgare T. Ness (1%) a F. tataricum Geartn. (2%). Vysoký obsah rutinu má Flos sophorae, pupeny stromu Gophora japonica L. (Fabaceae), domácího ve východní Asii, pěstovaného v Evropě jako okrasná rostlina. Významným zdrojem rutinu jsou listy druhu Eucalyptus macrorhyncha (Myrtaceae) sbírané v Austrálii. Rovněž oplodí pomeranče, černý rybíz a další rostliny obsahující rutin.28 V různých částech rostlin nacházíme různé koncentrace rutinu. Nejvíce rutinu bývá nakumulováno v květenství, lodyhách a v listech horních částí rostlin. Rovněž v pohance nalézáme největší množství rutinu v květech a listech rostliny.29

34

Používá se k léčení hemorhagií, alergií, hypertenze a jako adjuvans při infekčních onemocněních.28 Snižuje permeabilitu cévních stěn a tím působí antiedematózně, snižuje riziko vzniku arteriosklerózy a působí jako antioxidant.31

35

3.5 Fagopyrum esculentum Moench. (Polygonaceae) Popis Pohanka obecná (Fagopyrum esculentum Moench.) je dvouděložná rostlina náležející do čeledi rdesnovité (Polygonacea). Jednoletá je 50 až 140 cm vysoká bylina. Lodyha je přímá, často červeně zbarvená, v horní třetině silně větvená. Pohanka se vyznačuje heterofilií (různolistost). Spodní listy jsou dlouze řapíkaté a srdčité. Horní listy jsou přisedlé s trojúhelníkovitou čepelí, která je na bázi srdčitá až střelovitá. Botka je malá, jen asi 5 mm dlouhá. Květy jsou drobné, bílé či narůžovělé. Jsou seskupeny do květenství po 7-9 kvítcích tvořících hrozny nebo vrcholové chocholíky. Jednotlivé květy jsou oboupohlavné, 5-ti četné, bílé nebo růžové , tyčinek je 8, pestík 1, čnělky 3. Květy jsou dimorfní, různočlenné (heterostylie) – jeden typ květů má dlouhé pylové tyčinky a krátké blizny a druhý typ krátké pylové tyčinky a dlouhé blizny. Pohanka vytváří na jedné rostlině velké množství květů. Jejich počet se pohybuje v širokém rozmezí. Jedná se o cizosprašnou rostlinu, převážně hmyzosnubnou. Hlavním opylovačem je včela medonosná. Plodem je tmavě hnědá, 3hranná nažka. Kvete v červnu až červenci.32, 33 Kořenový systém pohanky je vysoce výkonný a umožňuje její růst i v méně vhodných podmínkách. Kořeny pohanky vylučují řadu organických kyselin, s jejichž pomocí jsou lépe uvolňovány živiny z těžko dostupných forem. Z živin je pohanka nejnáročnější na draslík. Dostatek draslíku zvyšuje výnos i jakost nažek. Pohanka nesnáší chlór, reaguje na něj skvrnitostí listů, snadnou lámavostí a zakrnělým růstem. Má ale značné nároky na bór, jeho nedostatek se projevuje stejně jako přítomnost chlóru. Během vegetace nevyžaduje porost zvláštní ošetření. K farmaceutickým účelům se pohanka sklízí začátkem kvetení.33

Výskyt Pohanka pochází z jižní Sibiře a severní Číny, u nás je místy pěstována a přechodně někdy i zplaňuje. Na našem území byla známa už ve 12. století. Pěstuje se (a může i zplaňovat) i v jiných částech Evropy, Asie a Severní Ameriky.34 Pohanka může růst v širokém areálu půdních podmínek. Roste i v chudých půdách v chladném

36

klimatu, na horách i v severských oblastech. Nesnáší však těžké, chladné a slévavé půdy se zásaditou půdní reakcí a vysokým obsahem volného vápníku. Nejlépe jí vyhovují půdy lehčí, hlinitopísčité, dobře zásobené živinami a vláhou. Pohanka snáší i půdy kyselé.33

Droga V Českém lékopisu (ČL) 2009 je jako droga uvedena Fagopyri herba (Pohanková nať). Je to celá nebo řezaná nať druhu Fagopyrum esculentum Moench., sbíraná v časné fázi kvetení před vytvořením plodů a ihned sušená. Droga obsahuje nejméně 4,0 % rutinu, počítáno na vysušenou drogu.35

Použití Ve fytoterapii se využívá kvetoucí nať, někdy i slupky semen. Droga obsahuje flavonoidní glykosidy rutin, 2-epikatechin, hyperosid a quercetin. Nejvyšší koncentrace rutinu byla zjištěna v listech a květech ve fázi butonizace a počátku kvetení.33 Dalšími významnými obsahovými látkami jsou vitamíny skupiny B, vitamín E, cholin, bílkoviny a značné množství stopových prvků (draslík, fosfor, hořčík, vápník a trochu železa, mědi, manganu a zinku).34, 36 Fagopyrin, polyfenolická sloučenina nesoucí ve své struktuře naftodianthronový skelet, může způsobovat fotoalergické reakce.34 Semena pohanky obsahují vysoký podíl proteinů (10-14 %), škrobu (55-70 %) a lipofilních látek včetně rostlinných sterolů (sitosterol, kompesterol).34 Pro vysokou výživnou hodnotu jsou semena pohanky používána v potravinářství jako vhodná náhrada obilovin. Rovněž je využívána jako náhrada obilovin během bezlepkové diety.29 Ačkoli je vhodná pro pacienty trpící celiakií, obsahuje pohanka, které mohou způsobit hypersenzitivní reakci – alergii.37 Pohanka se užívá zejména pro schopnost zvyšovat pevnost a pružnost cévních stěn (což zajišťuje vysoký obsah rutinu) např. při křečových žilách, hemoroidech, bércových vředech, při nedostatečném prokrvení končetin nebo jako podpůrný prostředek proti praskání cév (proti náhlým mozkovým příhodám apod.).36

37

4. Experimentální část 4.1 Přístroje •

Laboratorní analytické váhy Sartorius PRLT A 1

•

Autokláv P S 20 A, Chirana

•

Horkovzdušný sterilizátor, Chirana SVS 9/1

•

Box s laminárním prouděním, Fatran LF

•

Autosampler Jasco AS-2055 Plus

•

Diodový detektor Jasco MD-2015

•

Kolona Li Chrospher RP-18 125-4, sorbent Li Chrospher 5µm

•

Mikrofiltry (0,45 µm), Tessek

•

Předkolona Li ChroCART 4-4, sorbent Li Chrospher 5µm

•

Pumpa Jasco PU-2089 Plus

•

Sušárna HS 61A Chirana

•

Termostat kolony Jetstream 2 Plus

•

Těsnění na vialky, LABICOM s.r.o. Olomouc

•

Třepačka Unimax 2010, Heidolph Instruments

•

Vialky, LABICOM s.r.o. Olomouc

•

Vodní lázeň, typ 1042, GFL

•

Ultrazvuk Bandelin Sonorex RK100H

38

4.2 Chemikálie •

Methanol R 80%

•

Destilovaná voda R

•

Chlorid ceritý p.a.

•

Acetonitril R

•

Kyselina fosforečná R

•

Rutin R

•

Ajatin

•

Ethanol 96%

•

Živné médium dle Murashigeho a Skooga 38

4.3 Biologický materiál K vypracování své diplomové práce jsem použila tkáňovou kulturu odvozenou z kořenové části klíční rostliny Fagopyrum esculentum Moench. ve 22. – 31. pasáži.

39

4.4 Příprava a složení živného média Ke kultivaci bylo použito živné médium připravené dle Murashigeho a Skooga ve složení 38: mg/l

mg/l

CaCl2 .2H2O

440,00

KNO3

1900,00

MgSO4.7H2O

370,00

NH4NO3

1650,00

KH2PO4.H2O

170,00

FeSO4

27,84

Na2EDTA

37,31

MnSO4.4H2O

22,30

ZnSO4.7H2O

11,50

H3BO3

6,20

KI

0,830

CuSO4.5H2O

0,025

Na2MoO4.5H2O

0,025

CoCl2.6H2O

0,025

Inositol

100,00

Hydrolyzát kaseinu

1000,00

Glycin

2,00

Kyselina nikotinová

0,50

Pyridoxin

0,50

Thiamin

0,10

Sacharóza

30000,00

Množství výše uvedených substancí je vyjádřeno v miligramech na litr živné půdy. Substance byly odváženy na analytických vahách, látky používané v malých množstvích se pipetovaly z koncentrovaných zásobních roztoků. Vše bylo rozpuštěno v destilované vodě v odměrné baňce na 1000,0 ml a doplněno destilovanou vodou po rysku.

Jako

stimulátor

růstu

byl

použit

roztok

2,4-D

dichlorfenoxyoctové) v koncentraci 10 mg na litr živného média.

40

(roztok

kyseliny

4.5. Kultivace kultur Kalusové kultury byly kultivovány ve 100 ml Erlenmayerových baňkách předem umytých horkou vodou se saponátem, vypláchnutých pitnou a destilovanou vodou a vysušených v horkovzdušném sterilizátoru při 200 oC. Do každé vysterilizované baňky byl umístěn můstek z filtračního papíru a nalito 30 ml živného média s růstovým regulátorem. Baňky byly uzavřeny hliníkovou folií a poté se nechaly sterilizovat v autoklávu 15 minut při 121 oC a 100 kPa. Takto připravené půdy byly použity pro pasážování tkáňových kultur. Pasážování bylo prováděno 25. den kultivace kultury v boxu s laminárním prouděním vzduchu, který byl předem vymyt roztokem ajatinu (1:10) a vysvícen germicidní UV lampou. Před pasáží byl roztokem ajatinu omyt také hliníkový kryt baňek. K pasážování byly použity sterilní pinzety. Kultivace kalusové kultury probíhala 4 – 5 týdnů za teploty 25 oC a osvětlení s 16-ti hodinovou světelnou periodou. Suspenzní kultura získaná mechanickým rozmělněním kalusu byla kultivována 2 týdny na třepačce (120 otáček za minutu) za stejné teploty a intenzity osvětlení jako kultura kalusová.

41

4.6 Příprava roztoků elicitoru Jako elicitor jsem použila chlorid ceritý (CeCl3) ve třech koncentracích a to: 100,0 mg/100 ml; 10,0 mg/100 ml; 1,0 mg/100ml. Navážka čisté substance chloridu ceritého (50,0 mg) byla kvantitativně přenesena do odměrné baňky na 50 ml a doplněna sterilní destilovanou vodou po rysku. Roztok chloridu ceritého byl vysterilizován v autoklávu (při 121, OC 15 min.). Takto byla připravena koncentrace c1 = 1000 mg/l (4,057.10-3 mol/l). Odpipetováním 5 ml roztoku c1 do odměrné baňky 50 ml a doplněním sterilní destilované vody po rysku, byl připraven roztok o koncentraci c2 = 100 mg/l (4,057.10-4 mol/l). Odpipetováním 5 ml roztoku c2 do odměrné baňky 50 ml a doplněním sterilní destilované vody po rysku byl připraven roztok o koncentraci c3 = 10 mg/l (4,057.10-5 mol/l). Všechna ředění roztoků elicitoru na příslušné koncentrace byla prováděna za podmínek aseptické práce v boxu s laminárním prouděním vzduchu předem vysvíceném germicidní UV lampou. K přípravě roztoků bylo vždy používáno sterilní sklo a nástroje.

42

4.7 Elicitace in vitro kultur Elicitace kalusových kultur byla prováděna po 4 – 5 týdnech kultivace kultury a elicitace suspenzních kultur po 2 týdnech od poslední pasáže. Ke vnášení roztoku elicitoru byly použity sterilní pipety (zabalené do hliníkové folie a sterilizované v autoklávu 15 minut při 121 oC ), práce probíhala za aseptických podmínek. K elicitaci bylo vždy použito 35 baněk pro každou koncentraci elicitoru (c1, c2, c3). Do 30 baněk byl přidán 1 ml roztoku elicitoru dané koncentrace a 5 baněk bylo použito jako kontrola bez přidaného elicitoru. Baňky byly rozděleny do šesti skupin dle doby odběru. Kalusy byly odebírány v časových intervalech po 6, 12, 24, 48, 72 a 168 hodinách působení elicitoru. Kontrolní kalusy se odebíraly po 168 hodinách bez působení elicitoru. V rámci každého časového intervalu působení elicitoru bylo k odběru použito 5 baněk. Stejný postup byl použit za identických podmínek i u suspenzních kultur. Kalusy se po vyjmutí z baněk sušily na filtračním papíru za laboratorní teploty. Suspenzní kultury byly přefiltrovány přes filtrační papír a zachycené shluky byly sušeny při laboratorní teplotě. Takto se postupovalo u všech koncentrací elicitoru. Usušené kalusy a buněčné shluky byly nakonec upráškovány v třence s těrkou a použity ke stanovení obsahu rutinu podle ČL 2005.

43

4.8 Stanovení obsahu flavonoidů (rutinu) Princip stanovení: Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je separační metoda umožňující současně jak kvalitativní, tak i kvantitativní analýzu. K separaci dochází na základě interakcí dělených látek se stacionární i mobilní fází. Kvalitativní charakteristikou je retenční (eluční) čas (čas od nástřiku na kolonu po maximum chromatografického píku). Je nutné porovnání se standardem (CRL). Kvantitativní charakteristikou je plocha chromatografického píku (výška), která je přímo úměrná koncentraci stanovované látky39. Postup stanovení: Ke stanovení obsahu rutinu byla použita metoda uvedená v ČL 2005. Usušené vzorky kalusů a suspenzních kultur byly, po rozdrobnění v třecí misce, smíchány s 10 ml methanolu R 80% a zahřívány 30 minut ve vodní lázni při 60 oC. Poté se provedla filtrace přes vatu a vata byla extrahována s 5 ml methanolu R 80% 15 minut v ultrazvukové lázni. Opět bylo zfiltrováno přes vatu a jednotlivé filtráty byly přeneseny do odměrné baňky na 20,0 ml a doplněny methanolem R 80% po rysku. Poté byly vzorky filtrovány přes mikrofiltr (0,45 µm), asi 1,7 ml roztoku bylo převedeno do vialky a vzorky byly analyzovány metodou HPLC. Parametry analýzy40: HPLC analýza byla prováděna na chromatografické sestavě Jasco (čerpadlo PU2089, detektor MD-2015, Autosampler AS-2055), vybavené předkolonovým filtrem a kolonou Li Chrospher RP-18 125x4 (5 µm) s ochrannou předkolonou. Porovnávací roztoky: •

porovnávací roztok (a) – 25,0 mg rutinu R se rozpustilo v roztoku methanolu R 80% a zředilo se jím na 50,0 ml

•

porovnávací roztok (b) – 25,0 ml roztoku (a) se doplnilo methanolem R 80% na 50,0 ml

44

•

porovnávací roztok (c) – 25,0 ml roztoku (b) se doplnilo methanolem R 80% na 50,0 ml

•

porovnávací roztok (d) – 25,0 ml roztoku (c) se doplnilo methanolem R 80% na 50,0 ml

Byla sestavena kalibrační křivka, ze které se následně vypočítal obsah rutinu v procentech (viz Graf č.1).

Graf č.1: Kalibrační křivka pro stanovení obsahu rutinu Kolona: •

rozměry: délka 0,125, vnitřní průměr 4 mm

•

stacionární fáze: silikagel pro chromatografii oktadecylsilylovaný R (5 µm)

•

teplota: 30 °C

•

Mobilní fáze:

- mobilní fáze A: směs objemových dílů acetonitrilu R a vody R (50 + 950), jejíž pH se upravilo kyselinou fosforečnou R na hodnotu 2; - mobilní fáze B: směs objemových dílů vody R, jejíž pH se upravilo kyselinou fosforečnou R na hodnotu 2,0 a acetonitrilu R (95 + 905).

45

Čas (min) 0–6 6 – 16,5 16,5 – 22 22 – 25 25 – 27

Mobilní fáze A % (V/V) 94 94 → 85 85 → 76 76 → 59 59 → 94

Průtoková rychlost: 1,0 ml/min Detekce: Spektrofotometrický detektor, 350 nm Objem nástřiku: 20 µl Standard: Rutin

46

Mobilní fáze B % (V/V) 6 6 → 15 15 →24 24 → 41 41 → 6

4.9 Stanovení ztráty sušením Do tří předem vysušených váženek se na analytických vahách odvážilo přesně 1,000 g vzorku a sušilo se 2 hodiny v sušárně při 100 až 105 °C. Vysušené vzorky na váženkách byly uchovány v exsikátoru do vychladnutí a poté byly zváženy na analytických vahách. Hmotnost sušiny byla vztažena na hmotnost vzorku a vyjádřena v procentech40. Byl vypočítán aritmetický průměr těchto tří měření.

47

4.10 Statistické zpracování výsledků41 Směrodatná odchylka je veličina, která vyjadřuje, jak se hodnoty liší od průměrné (střední) hodnoty. Funkce odchylky je definovaná vztahem: s=

∑ ( x − x)

2

(n − 1)

s – směrodatná odchylka x – hodnota sledované veličiny _ x – průměrná hodnota sledované veličiny n – počet členů souboru Ke zjištění statistické významnosti vlivu elicitoru na obsah rutinu byl použit t-test rozdílů dvou průměrů. Pro testovací kritérium platí následující vztah: t=

x1 − x2 n1s12 + n2 s 22

∗

n1n2 (n1 + n2 − 2 ) n1 + n2

t – testovací kriterium x1 – aritmetický průměr kontrolního souboru x2 – aritmetický průměr pokusného souboru s1 – směrodatná odchylka kontrolního souboru s2 – směrodatná odchylka pokusného souboru n1 – počet členů kontrolního souboru n2 – počet členů pokusného souboru Testovacímu kritériu přísluší t-rozdělení se stupněm volnosti vypočteném podle vzorce:

v = n1 + n2 − 2 Vypočítaná hodnota testovacího kritéria se porovná s příslušnou kritickou hodnotou t(v)p pro vypočtený stupeň volnosti v a zvolenou hladinu významnosti p.

48

Je-li hodnota t větší než hodnota t(v)p, je rozdíl statisticky významný na hladině významnosti p. Pro zjištění obsahu rutinu byla provedena vždy tři paralelní stanovení, z čehož vyplývá, že počet členů souboru n1 = n2 = 3 a počet stupňů volnosti v = 4. Pro zvolenou hladinu významnosti p = 0,05 a pro čtyři stupně volnosti je kritická hodnota testovacího kritéria t(v)p = 2,78. Výsledky jsou statisticky významné, je-li hodnota testovacího kritéria vyšší než kritická hodnota. Pro výpočet testovacího kritéria pro odběry po 6, 12, 24, 48, 72 a 168 hodinách byla jako kontrolní hodnota použita hodnota odběru v čase 0 hod.

49

5. Výsledky Tabulka č.4: Obsah rutinu (%) v závislosti na čase v kalusové kultuře Fagopyrum esculentum Moench. po elicitaci CeCl3 v různých koncentracích. Koncentrace elicitoru (mg/ml)

c1

c2

c3

Hodina odběru

Obsah rutinu (%)

Směrodatná odchylka

0k 6 12 24 48 72 168 0k 6 12 24 48 72 168 0k 6 12 24 48 72 168

0 0,06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0,01 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Pozn.: k = kontrola

50

Hodnota testovacího kritéria 8,48 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Koncentrace roztoku elicitoru (mg/ml)

0

0,01

0,02

0,03

0,04

C1

C2

C3

0k 6 12 24 48 72 168 0,05

0,06

0,07

Obsah rutinu (%)

Graf č.2: Obsah rutinu (%) v závislosti na koncentraci roztoku elicitoru (CeCl3) v kalusové kultuře Fagopyrum esculentum Moench..

51

Doba odběru (h)

0

0,01

0,02

0,03

0k

6

12

24

48

72

168

C1 C2 C3 0,04

0,05

0,06

0,07

Obsah rutinu (%)

Graf č.3: Obsah rutinu (%) v závislosti na době odběru v kalusové kultuře Fagopyrum esculentum Moench.

52

Tabulka č.5: Obsah rutinu (%) v závislosti na čase v suspenzní kultuře Fagopyrum esculentum Moench. po elicitaci CeCl3 v různých koncentracích. Koncentrace elicitoru (mg/ml)

c1

c2

c3

Hodina odběru

Obsah rutinu (%)

Směrodatná odchylka

0k 6 12 24 48 72 168 0k 6 12 24 48 72 168 0k 6 12 24 48 72 168

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Hodnota testovacího kritéria 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Pozn.: k = kontrola Vzhledem k nulovým hodnotám stanovovaného rutinu nejsou výsledky sledování obsahu rutinu v závislosti na čase a koncentraci elicitoru v suspenzní kultuře Fagopyrum esculentum Moench. po elicitaci CeCl3 zpracovány ve formě grafů.

53

6. Diskuze Využití rostlinných tkáňových kultur pro produkci sekundárních metabolitů patří mezi moderní biotechnologické metody. Tyto postupy umožňují zefektivnění produkce řady farmaceuticky významných látek. Jednou z metod využívaných pro zvýšení produkce sekundárních metabolitů buňkami explantátových tkáňových kultur rostlin je elicitace. Jedná se o proces založený na signálem (elicitorem) indukované obranné reakci rostliny. Ta se projevuje zvýšenou expresí genů, což vede následně ke zvýšení syntézy sekundárních metabolitů v rostlinách i v kulturách in vitro.12 Cílem mé práce bylo se seznámit s metodikou kultivace rostlinných kultur in vitro. Dále bylo úkolem zjistit vliv abiotické elicitace (ionty Ce) na produkci flavonoidů v kalusové a suspenzní kultuře Fagopyrum esculentum Moench. Na základě stanovení obsahu rutinu HPLC metodou byl sledován efekt iontů ceru, přítomných v různých koncentracích, na produkci tohoto flavonoidu. Buněčné kultury byly kultivovány na médiu podle Murashigeho a Skooga38 s přídavkem růstového regulátoru 2,4-D (roztok kyseliny dichlorfenoxyoctové) v koncentraci 10 mg na litr živného média. Kalusové kultury byly kultivovány na papírových můstcích sycených živným médiem. Suspenzní kultury byly získány mechanickým rozmělněním kalusu a dále byly kultivovány v Erlenmayerových baňkách na třepačce. Elicitor byl ke kultivovaným kulturám přidáván ve třech různých koncentracích: c1 = 100,0 mg/100 ml (4,057.10-3 mol/l) c2 = 10,0 mg/100 ml (4,057.10-4 mol/l) c3 = 1,0 mg/100 ml (4,057.10-5 mol/l) Účinek elicitoru na produkci rutinu byl sledován v šesti časových intervalech: 6, 12, 24, 48, 72, 168 hodin. Pro stanovení obsahu rutinu v kalusové a suspenzní kultuře byla zvolena metoda HPLC podle ČL 2005.

54

Kalusová kultura Ke staticky významnému zvýšení produkce rutinu došlo po aplikaci elicitoru v koncentraci c1 po 6 hodinách (viz Tabulka č.4, Graf č.2). V žádných dalších vzorcích nebyla přítomnost rutinu prokázána. Pro pokus byly vybrány buňky kalusové kultury v 22. – 26. pasáži. Suspenzní kultura Suspenzní kultura v 27. – 31. pasáži rutin neprodukovala, a to ani po přídavku elicitoru. Ke staticky významnému zvýšení produkce rutinu došlo pouze u buněk kalusové kultury ovlivněné nejvyšší koncentrací elicitoru (100 mg CeCl3 na 100 ml média) a to pouze v prvním odběru (6 hodin). Jedním z důvodů velmi nízké produkce rutinu buňkami kultury Fagopyrum esculentum Moench. může být jejich stáří. Pro moji práci byly využity kalusové a suspenzní kultury ve 22. - 31 .pasáži. Kunzová L.42 ve své studii prokázala, že buňky stejné kultury neprodukují, bez působení elicitoru, rutin již 11. – 20. pasáži. Naopak Píchová M. určila, že průměrná produkce rutinu buňkami kultury Fagopyrum esculentum Moench. v 3. – 10. pasáži je 0,023 %.43 Dalším důvodem může být nevhodně zvolený elicitor. Úspěšné využití elicitace pro zvýšení produkce sekundárních metabolitů je podmíněno použitím vhodného elicitoru, jeho koncentrace a doby působení.44 Cer patří mezi lanthanoidy, které spolu se skandiem a např. yttriem tvoří skupinu prvků vzácných zemin. Někteří zástupci této skupiny byli v minulosti využiti pro elicitaci explantátových kultur.19 Např. byl prokázán pozitivní efekt La na produkci taxolu v explantátových kulturách Taxus spp.20 Kovy této skupiny jsou v nízkých koncentracích schopny urychlovat růst a vývoj rostlin a zvyšovat výnosy.19 Z kukuřice byl v minulosti izolován specifický protein schopný vázat prvky této skupiny. Narozdíl od fytochelatinů, se jedná o protein o Mw asi 180 000. Skládá se ze dvou podjednotek a kromě aminokyselin obsahuje i kovalentně vázané sacharidy.19 V další studii byl sledován vliv přítomnosti ceru a lanthanu na rostliny Přeslice rolní (Hydrilla verticillata L.). V koncentracích vyšších než 10 µM způsobovaly tyto vzácné kovy oxidativní stres, který se projevoval zvýšenou přítomností H2O2 a

55

poklesem obsahu chlorofylu v buňkách rostlin. Rovněž byl pozorován nárůst produkce malondialdehydu. Působení ceru rovněž zmírňuje následky nedostatku hořčíku během růstu rostliny. Hořčík je důležitým makroelementem a je součástí aktivních center řady enzymů. Jeho nedostatek způsobuje pokles produkce chlorofylu a enzymů, které se podílejí na asimilaci CO2 během temnostní fáze fotosyntézy (RuBisCO, ribulosa-1,5bisfosfát-karboxyláza). Yuguan et al. prokázali ve studii sledující vliv nedostatku hořčíku na růst rostlin špenátu (Spinacia), že přítomnost ceru může částečně eliminovat následky deplece tohoto důležitého prvku.26 Ionty ceru jsou schopny nahradit kationty hořčíku ve struktuře chlorofylu, čímž mohou přispět k urychlení fotosyntetických pochodů.27

56

7. Závěr Výsledky práce lze shrnout následovně: •

Bez působení elicitoru buňky kalusové a suspenzní kultury v 22. – 31. pasáži rutin neprodukovaly.

•

Po aplikaci elicitoru v koncentraci c1 (100,0 mg/100 ml; 4,057.10-3 mol/l) byl u buněk kalusové kultury, v čase 6 hodin od přídavku elicitoru, zaznamenán staticky významný nárůst produkce rutinu (0,06 %).

•

Buňky suspenzní kultury rutin neprodukovaly, a to ani po přídavku elicitoru.

57

8. Seznam literatury 1. S. Ramachandra Rao and G. A. Ravishankar, Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites, Biotechnology Advances (2002), 20 (2), 101-153. 2. U. Stahl, U. Donalies, E. Nevoigt and I. Smetanska, Production of Secondary Metabolites Using Plant Cell Cultures, (2008) 1. vydání, 187-228. 3. J. Stöckigt, P. Obitz, H. Falkenhagen, R. Lutterbach and S. Endreß, Natural products and enzymes from plant cell cultures, Plant Cell, Tissue and Organ Culture (1995), 43 (2), 97-109. 4. L. Jahodář, Vybrané kapitoly z fyziologie rostlin, Karolinum, Praha (2000) 2. vydání, 35-40. 5. B. Sikyta and J. Dušek, Biotechnologie pro farmaceuty, Praha (1994) 1. vydání, 8486. 6. A. W. Alfermann and M. Petersen, Natural product formation by plant cell biotechnology, Plant Cell, Tissue and Organ Culture (1995), 43 (2), 199-205. 7. J. Kováč, Explantátové kultury rostlin, Vydavatelství University Palackého, Olomouc (1995) 1. vydání, 1-50. 8. R. D. Hall, Methods in Molecular Biology: Plant Cell Culture Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey (1999) 1. vydání, 13-16. 9. S. Procházka, I. Macháčková, J. Krekule and J. Šebánek, Fyziologie rostlin, Academia, Praha (1998) 1. vydání, 240-285, 322-346, 412-431. 10. E. F. George, M. A. Hall and G.-J. De Klerk, Plant propagation by tissue culture. Volume 1. The background. , Springer Berlin (2008) 3. vydání, 13-16. 11. H. Hirt and K. Shinozaki, Topics in current genetics: Plant responses to abiotic stress, Springer, Berlin (2004) 1. vydání, 6. 12. Z. Angelova, S. Georgiev and W. Roos, Elicitation of plants, Biotechnol. & Biotechnol. Eq. (2006), 20 (2), 72-83. 13. J. Kuc and J. S. Rush, Phytoalexins, Arch Biochem Biophys (1985), 236 (2), 45572. 14. S.-B. Ha, A. P. Smith, R. Howden, W. M. Dietrich, S. Bugg, M. J. O'Connell, P. B. Goldsbrough and C. S. Cobbett, Phytochelatin Synthase Genes from Arabidopsis and the Yeast Schizosaccharomyces pombe, Plant Cell (1999), 11 (6), 1153-1164.

58

15. M. H. Zenk, Heavy metal detoxification in higher plants - a review, Gene (1996), 179 (1), 21-30. 16. L. Maldonado-Bonilla, M. Betancourt-Jiménez and E. Lozoya-Gloria, Local and systemic gene expression of sesquiterpene phytoalexin biosynthetic enzymes in plant leaves, European Journal of Plant Pathology (2008), 121 (4), 439-449. 17. L. H. Nugroho and R. Verpoorte, Secondary metabolism in tobacco, Plant Cell, Tissue and Organ Culture (2002), 68 (2), 105-125. 18. S. U. Park and P. J. Facchini, High-efficiency somatic embryogenesis and plant regeneration in California poppy, Eschscholzia californica Cham., Plant Cell Reports (2000), 19 (4), 421-426. 19. P. Babula, V. Adam, R. Opatrilova, J. Zehnalek, L. Havel and R. Kizek, Uncommon heavy metals, metalloids and their plant toxicity: a review, Environmental Chemistry Letters (2008), 6 (4), 189-213. 20. J. Wu, C. Wang and X. Mei, Stimulation of taxol production and excretion in Taxus spp cell cultures by rare earth chemical lanthanum, Journal of Biotechnology (2001), 85 (1), 67-73. 21. C.-j. Liang, X.-h. Huang and Q. Zhou, Effect of cerium on photosynthetic characteristics of soybean seedling exposed to supplementary ultraviolet-B radiation, Journal of Environmental Sciences (2006), 18 (6), 1147-1151. 22. J.-J. Li, J.-M. Li and Q. Zhou, Effect of Ce(III) on photochemical reaction activity in soybean seedlings under supplementary UV-B radiation stress, Huanjing Kexue/Environmental Science (2007), 28 (6), 1388-1391. 23. C. J. Liang, X. H. Huang, W. Y. Tao and Q. Zhou, Effects of cerium on growth and physiological mechanism in plants under enhanced ultraviolet-B radiation, Journal of Environmental Sciences (2006), 18 (1), 125-129. 24. C. Liang, X. Huang, W. Tao and Q. Zhou, Effect of Rare Earths on Plants under Supplementary Ultraviolet-B Radiation: II. Effect of Cerium on Antioxidant Defense System in Rape Seedlings under Supplementary Ultraviolet-B Radiation, Journal of Rare Earths (2006), 24 (3), 364-368. 25. X. Wang, G. X. Shi, Q. S. Xu, B. J. Xu and J. Zhao, Lanthanum- and ceriuminduced oxidative stress in submerged Hydrilla verticillata plants, Russian Journal of Plant Physiology (2007), 54 (5), 693-697.

59

26. Z. Yuguan, Z. Min, L. Luyang, J. Zhe, L. Chao, Y. Sitao, D. Yanmei, L. Na and H. Fashui, Effects of Cerium on Key Enzymes of Carbon Assimilation of Spinach Under Magnesium Deficiency, Biological Trace Element Research (2009), 131 (2), 154-164. 27. F. Hong, L. Wang, X. Meng, Z. Wei and G. Zhao, The effect of cerium (III) on the chlorophyll formation in spinach, Biological Trace Element Research (2002), 89 (3), 263-276. 28. J. Hubík, J. Dušek, J. Spilková and J. Šícha, Obecná farmakognosie II, Sekundární látky, SPN, Praha (1989) 3. vydání, 31-33. 29. J. Kalinova, J. Triska and N. Vrchotova, Distribution of Vitamin E, squalene, epicatechin, and rutin in common buckwheat plants (Fagopyrum esculentum Moench.), Journal of agricultural and food chemistry (2006), 54 (15), 5330-5. 30. P. Jiang, F. Burczynski, C. Campbell, G. Pierce, J. A. Austria and C. J. Briggs, Rutin and flavonoid contents in three buckwheat species Fagopyrum esculentum, F. tataricum, and F. homotropicum and their protective effects against lipid peroxidation, Food Research International (2007), 40 (3), 356-364. 31. I. Kreft, N. Fabjan and K. Yasumoto, Rutin content in buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) food materials and products, Food Chemistry (2006), 98 (3), 508-512. 32. J. Janča and J. A. Zentrich, Herbář léčivých rostlin, Eminent, Praha (1996) 28-30. 33. J. Pech, H. Součková, J. Moudrý, J. Kalinová and K. Havlíčková, Databáze využití nepotravinářské zemědělské produkce - Pohanka setá http://www2.zf.jcu.cz/~moudry/databaze/ (11.7.2010), 34. L. Tůmová, M. Píchová and J. Dušek, Fagopyrum esculentum in vitro, Česká a slovenská Farmacie (2007), 56 125–128. 35. Kolektiv autorů, Český lékopis 2009, 2. díl, Grada, Praha (2009) 2069-2070. 36. C. Quettier-Deleu, B. Gressier, J. Vasseur, T. Dine, C. Brunet, M. Luyckx, M. Cazin, J.-C. Cazin, F. Bailleul and F. Trotin, Phenolic compounds and antioxidant activities of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) hulls and flour, Journal of Ethnopharmacology (2000), 72 (1-2), 35-42. 37. N. Morita, T. Maeda, R. Sai, K. Miyake, H. Yoshioka, A. Urisu and T. Adachi, Studies on distribution of protein and allergen in graded flours prepared from whole buckwheat grains, Food Research International (2006), 39 (7), 782-790.

60

38. T. Murashige and F. Skoog, A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant. (1962), 15, 473-97. 39. J. Klimeš, Kontrola léčiv I. , Karolinum, Praha (2002) 22-40. 40. Kolektiv autorů, Český lékopis 2005, 1. a 3. díl, Grada, Praha (2005) 41. P. Klemera and V. Klemerová, Základy aplikované statistiky pro studující farmacie, Karolinum, Praha (1997) 23-27. 42. L. Kunzová, Kultury léčivých roslin in vitro - IV., Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická falkulta v Hradci Králové, Hradec Králové (2008). 43. M. Píchová, Růstové a produkční charakteristiky kultury Fagopyrum esculentum in vitro, Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická falkulta v Hradci Králové, Hradec Králové (2006). 44. M. Kašparová, T. Siatka and J. Dušek, Vliv abiotické elicitace a vápenatých iontů na produkci explantátové kultury Rheum palmatum L., Česká a Slovenská Farmacie (2003), 52 (5), 248-51.

61

9. Abstrakt Kultury léčivých rostlin in vitro - X Cílem této práce bylo sledovat vliv abiotické elicitace na produkci flavonoidů v kalusové a suspenzní kultuře Fagopyrum esculentum Moench. Na základě stanovení obsahu rutinu metodou HPLC byl sledován efekt iontů ceru, přítomných v kultivačním médiu ve třech různých koncentracích, na produkci tohoto flavonoidu. Buněčné kultury byly kultivovány na médiu podle Murashigeho a Skooga s přídavkem růstového regulátoru 2,4-D v koncentraci 10 mg/l živného média. Účinek elicitoru na produkci rutinu byl sledován v šesti časových intervalech: 6, 12, 24, 48, 72, 168 hodin. Bez působení elicitoru buňky kalusové a suspenzní kultury v 22. – 31. pasáži rutin neprodukovaly. Po aplikaci elicitoru v koncentraci c1 (4,057.10-3 mol/l) byl u buněk kalusové kultury, v čase 6 hodin od přídavku elicitoru, zaznamenám staticky významný nárůst produkce rutinu (0,06 %). Buňky suspenzní kultury rutin neprodukovaly, a to ani po přídavku elicitoru.

10. Summary In vitro cultures of medicinal plants - X Aim of this study was to study the effect of abiotic elicitation on production of rutin in callus and suspension culture of Fagopyrum esculentum Moench. Cerium chloride (CeCl3) was used as elicitor at three different levels of concentration. The content of rutin in cell cultures was determined by HPLC. Cell cultures were cultivated on Murashige - Skoog medium with the addition of 10 mg/ml of 2,4-D as a growth regulator. No rutin was produced in both types of culture without the presence of elicitor. The maximal content of rutin in callus culture was determined after 6 hours of treatment with elicitor solution with concentration c1 (4,057.10-3 mol/l.). No production of rutin was observed in suspension culture.

62