UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ
Katedra farmakologie a toxikologie
Riziko intoxikace barbiturátů u psů léčených na epilepsii
Diplomová práce
Školitel specialista: MVDr. Oto Huml Vedoucí diplomové práce : PharmDr. Marie Vopršalová,CSc
Milan Černohlávek
Hradec Králové 2010
1
Poděkování: Děkuji paní PharmDr. Marii Vopršalové,CSc., za odborné vedení, ochotu a pomoc při sestavování diplomové práce. Děkuji panu MVDr. Otovi Humlovi za pomoc při získávání zdrojů i pracovníkům toxikologické laboratoře ÚSL v Plzni za poskytnutí přístrojového vybavení a možnost pracovat v prostorách .
2
„Prohlašuji, že tato diplomová práce „ Riziko intoxikace barbiturátů u psů léčených na epilepsii “ je mým původním autorským dílem.Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem čerpal, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány.“
…….………………..
Podpis diplomanta
3
OBSAH
I.
Úvod a cíl práce ............................................................................................. 6
II.
Teoretická část .............................................................................................. 8 1. Pes /Canis/ charakteristika druhu .............................................................. 9 2. Srovnávání epilepsie u psů a lidí ............................................................ 10 3. Problematika diferenciální diagnostiky .................................................. 19 3.1. Jiné příčiny křečovitých stavů psů .................................................. 21 3.1.1.
Primární epilepsie ................................................................ 21
3.1.2. Sekundární epilepsie ............................................................. 23 3.2. Idiopatická epilepsie ...................................................................... 25 4. Fenobarbital ............................................................................................ 29 5. Princip imunochemické metody ............................................................. 35 5.1. Kompetitivní metody se značným antigenem a s limitovaným množstvím protilátky .......................................... 37 5.2. Kompetitivní metody-homogenní .................................................. 38 5.3.
Nekompetitivní metody s nadbytkem značené i neznačené protilátky- sendvičová technika .................................................... 39
5.4. Enzymoimunoanalýza .................................................................... 40 5.5. Fluorescenční polarizační imunoanalýza ...................................... 40 III.
Experimentální část .................................................................................... 43 1. Metodická část ........................................................................................ 44 1.1. Metoda AxSYM Phenobarbital .................................................... 44 4
1.2.Praktická část .................................................................................... 56 1.2.1. Zpracování odebrané krve ve Vedilabu ............................... 56 1.2.2. Stanovení fenobarbitalu metodou AxSYM Phenobarbital .......................................................... 57 2. Výsledky ................................................................................................. 60 IV.
Diskuze ......................................................................................................... 68
V.
Závěr ............................................................................................................ 71
VI.
Zkratky ........................................................................................................ 73
VII.
Seznam použité literatury .......................................................................... 76
VIII. Abstrakty ..................................................................................................... 83
5
I.
ÚVOD A CÍL PRÁCE
6
Epilepsie je nejčastějším neurologickým onemocněním psů. Vyskytuje se u všech psích plemen a jejich kříženců. (30) V současné době převažuje monoterapie fenobarbitalem.(22) Z mnoha pohledů se jeví jako velice účinná a nezanedbatelná je i jeho cenová dostupnost ve srovnání s jinými preparáty, které jsou v současné době používány v humánní medicíně. Vhodné je i snadné dávkování fenobarbitalu. (47) Velice důležité pro úspěšnou léčbu je docílení optimální sérové hladiny fenobarbitalu.(21) Tato práce je zaměřena na stanovení fenobarbitalu pomocí metody AxSYM Phenobarbital, imunoanalýzy využívající fluorescenční polarizaci FPIA. (48)
7
II. TEORETICKÁ ČÁST
8
1. Pes / Canis / charakteristika druhu Pes domácí Canis familiaris ,rod šelem z čeledi psovitých Canidae. Vznikl domestikací vlka před více než 11 000 lety,ve střední době kamenné, patrně nezávisle na několika místech na světě. Psi se od počátku nevyvíjeli jako jednotná, místně ohraničená skupina, která by se později rozšířila, ale v mnoha izolovaných, geneticky se postupně rozrůzňujících společenstvech. Jejich vzájemný kontakt byl po dlouhá staletí
a
tisíciletí prakticky nemožný.
Nejstarší
archeologické
nálezy
pocházejí z Turecka (9 500 let př.n.l., Cayünü) ze Skotska (7 500 let př.n.l., Star Car). O existenci psa domácího vypovídají egyptské a mezopotámské kresby (3000-2000 let př.n.l), které zobrazují psy s převislýma ušima, psy krátkonohé aj. Prapůvodní formu
psa, Canis ferrus,
nazvanou též
Canis
putjanini, nacházíme dosud
u pariů (potulní psi Orientu) u australských psů zvaných dingo a u malajských psů tangerských. Velká rozmanitost forem domácího psa se vyvinula v dlouhodobém vývoji též vlivem snadného křížení s rasami vlků Canis lupus, šakalů Canis aureus a kojotů Canis latrans, jejichž potomstvo se psy je plodné. Domestikace psů patří k nejstarším dokladům lidské civilizace. Ve
starém
Egyptě pěstovali již chrty
a lovecké psy, dogy, špiclíky, teriéry a jezevčíky. Kolumbus a Cortéz našli v Americe buldoky a jezevčíky.
V současnosti
se chová kolem 500 plemen psa domácího,
registrovaných v FCI. (19) Pes jako druh je v současnosti nejrozšířenějším domestikovaným zvířetem. Z hlediska společenského patří k člověku nejbližším, nejtěsnějším společníkům. Z od přírody širokého a pestrého základu, který navíc vynikal velkou schopností se přizpůsobit nejrůznějším podmínkám, dokázal člověk zprvu naprosto neuvědoměle, teprve mnohem později i vědomě přetvářet svého společníka do podoby, která mu v konkrétních podmínkách nejvíce vyhovovala. Pevně fixovaná a striktně odlišená plemena psů, tak jak je známe dnes,jsou ve své většině dílem našich bezprostředních předků, kynologů druhé poloviny devatenáctého a první poloviny dvacátého století,vykazují neobyčejnou variabilitu. (20)
9
2. Srovnání epilepsie u psů a lidí Epilepsie se vyskytuje u mnoha živočišných druhů např. u hlodavců, koček, psů, koní, skotu, koz, opic a primátů. Jako pokusné zvířecí modely pro její studium byly ale použity i drozofily, myši, potkani, kočky a opice. Epilepsie je nejčastější získaná chronická neurologická porucha u
lidí.
Ve světě se vyskytuje u 50-100 osob z 100 000 a její výskyt je častější v rozvojových zemích. Riziko rozvoje epilepsie v průběhu života se u lidí
pohybuje mezi 2-5%.
Epilepsie je také nejčastější chronickou neurologickou poruchou
v populaci psů
s výskytem 5-5,7% . U lidí existuje přes 40 epileptických syndromů. Ty jsou definovány takovými fenotypickými
kritérii, jako je věk při prvním výskytu, EEG
abnormality, typ záchvatu a druh stimulu vyvolávající záchvat.(21) U psů epilepsie nebývá rozdělena na syndromy. U většiny psů s opakujícími se záchvaty nebyla zjištěna jejich idiopatická.
příčina a epilepsie je tak
Nedostatky v klasifikaci epilepsie u psů
jsou
kvalifikována
jako
dány nejen obtížností
popisu a klasifikací psích záchvatů, ale také tím, že EEG není rutinně používáno veterinárními neurology. V humánní i veterinární medicíně je terminologie související s epilepsií často nesourodá a liší se podle použité literatury.(25) V humánní medicíně si proto Mezinárodní liga proti epilepsii (International League Against
Epilepsy ILAE)
dala za úkol
urychlit a sjednotit proces
a používané terminologie. Současná definice epilepsie podle ILAE zní: Epilepsie je chronická neurologická porucha
charakterizovaná
záchvaty. Mohou být děleny na
idiopatické,
opakujícími
se
epileptickými
symptomatické, kryptogenní
a reaktivní. Humánní idiopatická epilepsie má předpokládanou nebo potvrzenou genetickou příčinu. U symptomatické epilepsie mají záchvaty specifickou etiologii – např.
jizvu po traumatu nebo mozkový tumor. Kryptogenní
nazývána, o
„pravděpodobně
symptomatická“ , kdy
epilepsie
je nověji
se předpokládá, že jde
epilepsii symptomatickou, ale není možné určit její přesnou příčinu. Reaktivní
záchvaty vznikají v důsledku metabolické poruchy nebo intoxikace a nejsou proto klasifikovány jako epilepsie.(21)
10
Ve veterinární neurologii je situace mnohem méně přehledná. Termíny jsou často
přejaty z humánní medicíny, ale
jejich obsah je chápán jinak. Idiopatická
epilepsie u psů je chápána jako opakující se záchvaty, při kterých nejsou zjistitelné žádné abnormality.(21) Humánní neurologové rozdělili záchvaty do různých skupin podle jejich klinických příznaků a EEG. Podobné
rozdělení
podle
ILAE prosazují i veterinární lékaři,
nicméně ve veterinární medicíně je situace složitější, protože lékaři musí posoudit typ záchvatu často jen podle popisu majitele. Při posuzování záchvatů u psů je důležité dbát když
na podrobnou anamnézu ( lze použít i speciální dotazník ) a pomůže i to, majitel
záchvat
natočí
na
Zjednodušeně se záchvaty dělí na fokální a generalizované.
video.
(21)
Fokální záchvaty
vznikají po iniciální aktivaci pouze v jedné části jedné hemisféry nebo po aktivaci specifické oblasti předního mozku, např. hyppokampu. Generalizované záchvaty vznikají aktivací obou mozkových hemisfér současně. Fokální motorické záchvaty jsou dány jednoduchými stereotypními kontrakcemi určitých svalových skupin nebo automatismy, což jsou pohyby, které se podobají vůlí řízeným pohybům. Příklady automatismů pozorovaných při záchvatech jsou žvýkací pohyby nebo pohyby končetin imitující běh. U lidí jsou automatismy pozorovány především po ukončení záchvatu, kdy se obnovuje vědomí, ale lidé si na záchvat nepamatují.
Epilepsia partialis
continua je souvislý sled fokálních záchvatů, které mají původ v motorickém kortexu. Tento typ epilepsie zatím u psů popsán nebyl.(21) Generalizované záchvaty mají většinou jednu nebo více z těchto fází: Tonická - trvale zvýšená svalová kontrakce, zvířata většinou v této fázi padají na zem a leží. Myoklonická - náhlá, krátká, nedobrovolná, jednoduchá nebo multipní kontrakce svalu nebo svalové skupiny. Klonická - pravidelně se opakující prodloužený myoklonus stejných svalových skupin Atonická - náhlá ztráta svalového tonu, většinou trvá 1-2 sekundy. Tonicko - klonická - střídající se tonické a klonické fáze.(21) V humánní medicíně bývají běžně popisovány i „ pauzy“ (podle dřívějšího názvosloví „pepit mal“). Jde o typ generalizovaných záchvatů, kdy dochází na krátkou chvíli k nabytí vědomí bez ztráty svalového tonu a na EEG jsou typické 3Hz generalizované peaky. Tento typ záchvatu je u psů spíše vzácný, i když je možné, že se vyskytuje i u nich, ale je obtížné jej zachytit. (30) 11
Rozlišujeme 4 stadia záchvatu: prodromální stadium, aura, iktus a postiktální fáze. Tyto pojmy jsou běžně užívány i ve veterinární medicíně a je velmi užitečné snažit se je rozlišit u psů, když chceme vyloučit jinou příčinu záchvatů než epilepsii, např. synkopy nebo neuromuskulární slabost.
U lidí aura může předcházet záchvatu a popisuje
se jako manifestace záchvatu se senzorickými,
psychosenzorickými
a experimentálními symptomy. Pokud se vyskytne sama o sobě, jde o senzorický fokální záchvat. To je velmi důležité, protože ve veterinární medicíně je aura chápána pouze jako předznamenání samotného záchvatu než jako záchvat samotný. Tento názor by se měl ale změnit a i veterinární neurologové by měli auru chápat jako jednoduchý fokální (senzorický) záchvat. Lidé při auře vnímají stereotypické vjemy a aura je tak požadována za jakési varování před progresí záchvatu. Tyto aury jsou pak pacienty popisovány jako pocity déja vu nebo pocit divné chuti na jazyku. Evidentně je velmi obtížné zjistit, zda se aura vyskytuje i u psů, ale vzhledem k jemným změnám v chování před záchvatem je to pravděpodobné a existují četné studie, které to potvrzují.(21) U většiny psů s opakujícími se záchvaty je stanovena diagnóza idiopatická epilepsie. To znamená, že nebyla nalezena žádná příčina záchvatů
neurologickým,
hematologickým ani biochemických vyšetřením, nebyla zjištěna hladina sérového amoniaku, nebyly nalezeny abnormality při dynamickém testu žlučových kyselin ani při vyšetření cerebrospinálního moku a MRI byla beze změny. Většinou dochází k prvnímu záchvatu ve věku 6 měsíců až 6 let. (21) Fokální záchvaty jsou u psů spíše výjimkou a většina psů s epilepsií trpí generalizovanými tonicko-klonickými záchvaty. Nicméně je možné, že budou zjišťovány u psů častěji
fokální
díky větším diagnostickým možnostem. U mnoha
lidských i zvířecích pacientů s fokálními záchvaty byly zjištěny fokální intrakraniální změny. U lidí mohou být fokální záchvaty i idiopatické a předpokládá se u nich vliv specifických genových mutací. U psů byly prováděny četné studie vlivu plemene na četnost výskytu epilepsie a byla potvrzena plemenná predispozice tohoto onemocnění u bíglů, německých ovčáků, labradorů, zlatých retrívrů , bernských salašnických psů, belgických
ovčáků (tervueren), keeshondů a anglických špringršpanělů.
12
U keeshondů jde o autosomální recesivní dědičnost, u labradorů a zlatých retrívrů o polygenní recesivní dědičnost, u bíglů pak o autosomální recesivní pohlavně vázanou dědičnost. (21) Nedávno byla popsána mutace genu Epm2b způsobující autosomální recesivní progresivní myoklonickou epilepsii u trpasličích drsnosrstých jezevčíků. Jde o první popis genetické mutace způsobující epilepsii u psů, což může
znamenat
průlom při mapování etiologie tohoto onemocnění. Nicméně je pravděpodobné, že se typ dědičnosti epilepsii u psů liší u jednotlivých plemen, ale i u krevních linií v rámci jednoho plemene. U lidí se jako idiopatická popisuje epilepsie bez jiných neurologických abnormalit s možnou genetickou příčinou. Mezi lidskou a psí idiopatickou epilepsií existuje několik společných charakteristik, jako např. specifický věk při prvním záchvatu, normální psychomotorický vývoj apod. U lidí s idiopatickou epilepsií se předpokládá polygenní typ dědičnosti, některé genu
idiopatické kódujícího
epilepsie
elektricky
nicméně
jsou i monogenetické a jsou způsobeny mutací řízené
nebo chemicky řízené iontové kanály.
V současnosti je známo minimálně 14 genů, které mají souvislost i idiopatickou epilepsií, a předpokládá se, že jich bude nalezeno mnohem více. Zajímavé je, že většina těchto genů kóduje právě vlastnosti iontových kanálů, a lze předpokládat, že některé z těchto genů budou mít vliv na vznik epilepsie i u psů.(21) EEG je záznam spontánní elektrické aktivity mozkové kůry. Frekvence EEG signálu se pohybuje mezi 0,5- 5Hz a jeho amplituda je většinou pod 100 µV. Elektrická aktivita zaznamenávaná na EEG vzniká především ze synaptických potenciálů a ze změn potenciálů na gliích. Akční potenciály vznikající podél axonů se na EEG nepodílí, protože se šíří mnoha směry, a proto se navzájem ruší. Nejdůležitějším zdrojem EEG signálu jsou pravděpodobně pyramidální buňky cerebrálního kortexu. Mnoho veterinářů EEG nepoužívá rutinně, protože získat záznam bez artefaktů je velmi obtížné. Běžným artefaktem je záznam svalových potenciálů, pohybů očí, EKG a dýchacích pohybů. Sedace nebo anestezie pacienta jsou proto někdy při tomto vyšetření nezbytné. Nicméně sedace může mít velký vliv na záznam EEG a některá sedativa mají antiepileptické účinky a zkreslují proto záznam
EEG.
EEG tedy musí být
posuzováno s ohledem na frekvenci a amplitudy jednotlivých artefaktů a přesnou charakteristiku abnormalit. V humánní
medicíně
patofyziologie a elektrických charakteristik rozpoznání
interiktální
je
EEG
záchvatů.
Dá
nástroj
ke
studiu
se použít i pro
aktivity a epileptiformní aktivity u pacientů s netypickými 13
záchvaty a má velkou roli i při plánování chirurgického řešení epilepsie.Ve veterinární medicíně se EEG používá od roku 1950 a od té doby bylo popsáno mnoho EEG abnormalit u psů. (21) Patofyziologie epilepsie je často vysvětlována jako dysbalance mezi excitací a inhibicí a zvýšená excitace nebo snížená inhibice tak může vést k epileptiformní aktivitě v mozku. Hlavním excitačním neurotransmiterem je glutamát a hlavním inhibičním neurotransmiterem v CNS je gama-amino-máselná kyselina (GABA). Blokování její funkce vede k záchvatům a její snížená nebo omezená funkce je pak klíčem ke vzniku epilepsie. Testuje se hypotéza, že psí epilepsie může souviset se změnami hladin inhibičních a excitačních neurotransmiterů. U epileptických psů byly zjištěny mnohem nižší hladiny GABA a vyšší hladiny glutamátu než u zdravých psů. Nicméně u labradorů s geneticky podmíněnou epilepsií
bylo
popsáno snížení hladin GABA i glutamátu. Další komplikací při studiu hladin neurotransmiterů je, že hladiny zjištěné v cerebrospinálním moku nemusí korelovat s koncentrací neurotransmiterů uvolňovaných na synapsích. Glutamát je navíc prekursorem GABA a je tedy velmi obtížné definovat změny jejich hladin na funkci CNS.(21) Spouštěcím momentem záchvatu bývá často
synchronní aktivace neuronů,
a přestože byl tento jev pozorován v mozku lidí s epilepsií, byla nedávno popsána naopak preiktální redukce synchronizace neuronů. Během záchvatu se ale neurony aktivují hypersynchronně díky vysoké
vodivosti
mezi buňkami. GABA většinou
funguje jako inhibitor tím, že otevře chloridové kanály, umožní přestup chloridu do neuronu, a tím způsobí jeho hyperpolarizaci. Nicméně aktivace GABA A receptoru může vést i k depolarizaci neuronu, a to v tom případě, když reverzní potenciál iontů proudících tímto kanálem má větší pozitivní náboj než je klidový potenciál neuronu. Určitou roli při komunikaci mezi neurony hraje i spojení mimo synapse, a to přímá elektrická komunikace díky gap junction. U epilepsie byla popsána i synchronní inhibiční aktivita a bylo potrvzeno, že při vzniku epilepsie je nezbytná aktivita jak
GABA, tak
glutamátu.
Starší
úvahy, že při
epilepsii
jde o pouhou
dysbalanci inhibice a excitace, jsou tedy překonané.(21) Mnoho receptorů během záchvatu prochází změnami, které mohou znamenat změny v aktivitě mozku a tím být součástí patofyziologie vzniku záchvatů.(21) Receptory, u kterých byly tyto změny popsány, jsou GABA receptory, glutamátové receptory a opioidní receptory.(21) 14
U lidí je nejčastějším typem epilepsie při parciálních záchvatech tzv. epilepsie čelního laloku. Tato forma může být familiární a může souviset s horečnatými záchvaty v dětství. Tato epilepsie často nereaguje na terapii a bývá při ní popisována skleróza hippokampu ( viditelná při MRI). U psů bylo popsáno několik stavů, které mohou odpovídat dysfunkci temporálního laloku, např. hypersialosis reagující na podávání fenobarbitalu. Předpokládá se, že i chytání vzduchu, které
bylo
imaginární mouchy
popisováno jako stereotypní
nebo kousání do
chování, může
mít původ
v patologické aktivitě temporálního laloku. Může jít ale i o halucinace vznikající v occipitálním laloku. U psů nebyla zatím popsána ani skleróza hyppokampu a neexistuje tedy jednoznačný důkaz, že se epilepsie temporálního laloku vyskytuje i u psů. Během posledních deseti let jsme zažili dramatický rozvoj zobrazovacích metod ve veterinární neurologii a MRI
se stala součástí rutinního vyšetření pacientů se
záchvaty na neurologických klinikách. U idiopatické epilepsie psů zatím nebyly popsány žádné změny na MRI, i tak ale tato zobrazovací technika zůstává nedílnou součástí neurologického vyšetření, protože díky ní můžeme vyloučit, nebo potvrdit intrakraniální příčiny záchvatů, jako např. kongenitální strukturální onemocnění mozku, zánět CNS nebo infekci a intrakraniální neoplazie. V podstatě by měla být stanovena diagnóza idiopatické epilepsie pouze v případě, že na MRI nebyly nalezeny žádné změny. Při záchvatu jsou někdy
popisovány reverzní
změny MRI v oblasti
piriformního a temporálního laloku a podobné změny byly popsány i u lidí.(21) Vzhledem k tomu, že epilepsie často souvisí se změnami mechanismů inhibice a excitace, k terapii se používají léky, které se mění excitabilitu mozku a pomáhají znovu nastolit rovnováhu mezi excitací a inhibicí. Při léčbě epilepsie se používají preparáty, které navozují funkční blok sodíkových kanálů řízených změnou napětí (phenytoin, lamotrigin, valproat, topimarat, carbamezepin), dále ty, které přímo nebo nepřímo potencují inhibiční učinek GABA (benzodiazepiny,barbituráty,tiagabin), preparáty, které potlačují excitační účinek glutamátu (topimarat) anebo léky, které modulují činnost kalciových kanálů (ethosuximid, topiramat, gabapentin). Přestože možnosti terapie epilepsie jsou relativně četné, u psů se pro léčbu hodí jen některé preparáty. Největší problém je v tom, že většina těchto léků má velmi krátký poločas rozpadu a musí se podávat velmi často, aby se docílilo potřebné hladiny účinné látky v séru. (21)
15
Pro majitele je naopak žádoucí, aby mohl psovi podávat lék jen 1- 2x denně. To je i důvod, proč se možnosti terapie psí epilepsie rozvíjí relativně pomalu. Nejčastěji podávaným lékem u psů je fenobarbital a bromid draselný.(42) Fenobarbital je účinný u 60-80 % pacientů a selhání léčby je dáno spíše nevhodným podáváním léku než farmakorezistencí. (21) Nevhodné podávání může být dáno příliš malou dávkou, nedodržením kontroly sérových hladin léku,nedodržením frekvence podání apod. (21) Doporučená počáteční dávka je 2,5mg/kg 2x denně p.o. Ve výjimečných případech může být fenobarbital podáván i 3x denně. Tento lék je kompletně vstřebán během dvou hodin a 4 – 8 hodin po p.o. podání dosahuje maximálních koncentrací v krvi. Trvá 10- 14 dní, než se hladiny stabilizují, a po této době je nutné je sérologicky zkontrolovat. Pokud pes používá pouze fenobarbital, měla by hladina v séru dosahovat 15- 45 µg/ml. Pokud užívá k fenobarbitalu i KBr, hladina by se měla pohybovat mezi 9-36mg/ml. Účinné terapeutické hladiny léku jsou velmi individuální, ale nejlepší výsledky dosahovány jsou při hladinách 30-35 µg/ml. Po každé změně dávky je nutné zkontrolovat hladinu v séru, a to 10 – 14 dní po dané změně. Pokud záchvaty stále nejsou plně pod kontrolou, lze k fenobarbitalu přidat KBr v dávce 30mg/kg 1 x denně, nebo 15mg/kg 2 x denně. Je také velmi důležité, aby byl fenobarbital podáván
pravidelně po 12 hodinách, aby jeho hladina v krvi zůstávala
stabilní.(43) Fenobarbital ovlivňuje aktivitu jaterních mikrozomálních enzymů a může se stát, že pes je po úvodní dávce stabilní, hladiny léku jsou dostačující, ale pak začnou klesat i přesto, že pacient dostává stále stejnou dávku. (44) Majitel musí být také upozorněn na možné vedlejší účinky léčby, které se většinou objeví během prvních dvou týdnů terapie a zahrnují
změny v
chování
(nejčastěji mírnou sedací, ale
někdy
i hyperaktivitu), polydipsii, polyurii a polyfagii. Bývá také zaznamenávána imunitně zprostředkovaná neutropenie a trombocytopenie a zvyšuje se se riziko výskytu superficiální
nekrotické dermatitidy. Během dlouhodobého užívání
fenobarbitalu
vzniká na lék fyzická závislost a eventuální vysazení musí probíhat velmi postupně, protože hrozí náhlý nástup silných záchvatů.(39) Problémem se mohou stát i lékové interakce. (45)
16
KBr byl prvním lékem použitým k terapii epilepsie, a to už v roce 1857. Léčila se jím tzv. hysterická epilepsie. Mechanismus antiepileptického účinku tohoto preparátu není znám, ale předpokládá se, že bromid prochází chloridovými iontovými kanály a způsobuje jejich hyperpolarizaci. Současné studie ukazují, že také potencuje GABA inhibici.(21) U lidí se KBr už téměř nepoužívá pro své nežádoucí vedlejší účinky– těžké kožní léze, gastrointestinální a nervové poruchy. (21) U psů je KBr úspěšně používán jako doplňková terapie k fenobarbitalu.(36,40,42) Biologický poločas je 15- 20 dní a trvá asi 100- 200 dní, než se jeho hladina v krvi ustálí. Požadovaná terapeutická hladina v krvi je 0,7 – 2,3 µg/ml a je ovlivněna mimo jiné stravou. Pokud je zvíře krmeno dietou bohatou
na sůl (a tím na chloridy),
zvyšuje se vylučování bromidu ledvinami a klesá tak jeho sérová koncentrace. Doporučená denní dávka KBr je 30mg/kg/den, pokud jde o doplněk k jinému léku anebo 40mg/kg/den, pokud je používán jako monoterapie. Nejčastější vedlejší účinky u psů jsou polydipsie, polyfagie, sedace, ataxie, pankreatitida a gastrointestinální poruchy. KBr má přímý dráždivý účinek na žaludeční mukózu a může tak vyvolat zvracení. Tento nežádoucí účinek lze omezit podáváním léku po jídle a v rozdělené dávce několikrát denně.(41) Obecně je však KBr
u
psů
velmi dobře snášen a může být podáván
i zvířatům s jaterními problémy, u kterých je vyloučeno použití fenobarbitalu.(37) Terapie KBr zlepšila kontrolu nad křečemi u 83% psů, která předtím nebyla upravena používáním
fenobarbitalu, 26% z
těchto 83% psů úplně
zůstalo
bez křečí.(37) Pokud pes nereaguje na terapii výše uvedenými preparáty, lze použít některé z následujících. Gabapentin byl původně vyvinut jako analog GABA, ale neváže se na GABAA ani GABAB receptory. Váže se však na podjednotky kalciových kanálů, a může tak podporovat syntézu GABA. Jeho antiepileptický účinek ale není zcela objasněn. Počáteční dávka by měla být 10mg/kg 3 x denně p.o. nebo lze začít s dávkou 10mg/kg 1 x denně a během několika týdnů zvýšit frekvenci na 3 x denně. Tento postup do jisté míry eliminuje sedaci pozorovanou při nasazení léku. U pacientů s renálním poškozením je nutné dávkování snížit. Levetiracetam je humánní antiepileptikum nové generace používané k léčbě parciálních Je vylučován převážně
ledvinami a
záchvatů nereagujících
na jinou terapii.
u psů je doporučená dávka
17
5 – 30 mg/kg
3 x denně. Felbamát a zonisamid byly u psích epileptiků také zkoušeny, ale v současné době nejsou dostupné. (21) Jiné možnosti
léčby epilepsie zahrnují
stimulaci
vagového
nervu
( u farmakorezistentních parciálních epilepsií u lidí) a okulární kompresi ( opět jde o stimulaci n. vagus) pro částečnou kontrolu záchvatů. U dětí byla s úspěchem používána i tzv. ketogenická dieta. Jde o dietu s vysokých obsahem tuku a nízkým obsahem karbohydrátů. Mechanismus účinku této diety není zcela znám, ale pravděpodobně svou roli hraje zvýšená hladina acetonu v mozku. Je ale mnohem obtížnější dosáhnout ketózy u psů než u lidí a není jisté, zda by taková dieta u psů měla význam. (21) Existuje i několik studií, že alergie, migrény a hyperaktivita dětí může mít souvislost se vznikem epilepsie. U psů hypoalergenní
diety
bylo
proto
vyzkoušeno
a prokazatelně se u nich snížila četnost
problematiku bude ale ještě potřeba prozkoumat.( 21)
18
podávání
záchvatů. Tuto
3. Problematika diferenciální diagnostiky Ve veterinární medicíně se v posledních letech zvedá zájem o epilepsii psů, především pro její relativně četný výskyt, ve psí populaci 5 -5,7%. (23,24) Také jeho sociální význam, vzhledem ke vztahu majitel - zvíře, je nezanedbatelný. V neposlední řadě je pak zájem o toto onemocnění umocňován možností jeho využití jako modelu pro zkoumání epilepsie u lidí. Nejprve je však třeba si ujasnit, co to vlastně epilepsie je a co chápeme pod tímto označením.(25) Epilepsie je pojem užívaný pro označení idiopatické (neznámého původu) epilepsie, tedy funkční poruchy buněk mozku. V momentě záchvatu dochází k abnormální elektrické aktivitě určitých buněk v mozku. Je však velmi
důležité, čím byla tato abnormální aktivita způsobena.
V zásadě se nabízí tři možnosti: 1. Abnormálně aktivní buňky mozku jsou přímo zasaženy nějakým onemocněním (nádor mozku, infekce..). 2. Buňky mozku jsou ovlivněny nedostatečnou funkcí jiných orgánů těla zvířete (při nedostatečné funkci vnitřních orgánů se v těle hromadí látky, které sou za normálních okolností zneškodněny a z těla vyloučeny. Protože se tyto látky krví
roznáší
po celém těle a mozek je nejcitlivější vůči jejich působení, mohou vyvolat záchvatovité, křečové
stavy. Samozřejmě všechny škodlivé látky- jedy přijaté do těla zvenčí,
mohou působit zcela shodně). 3. Abnormálně aktivní buňky jsou "zdravé", nejsou ani ovlivněny nedostatečnou funkcí jiných orgánů, nemůžeme tedy najít žádnou příčinu a jedná se pouze o funkční momentální nedostatek. Obecně lze tedy rozdělit příčiny záchvatů do několika skupin: 1. Záchvaty jejichž příčina je v onemocnění mozkové tkáně - primární epilepsie ( záněty, infekce - psinka, nádory, vývojové abnormality - vodnatelnost hlavy, úrazů
následky
a
přímého
poškození
mozku)
2. Záchvaty v důsledku onemocnění jiných orgánových systémů - sekundární epilepsie ( nedostatečná funkce ledvin, jater, srdce, oběhového systému, slinivky břišní, štítné
4.
žlázy,
nadledvinek,
a
nebo
následkem
otravy).
Záchvaty bez detekovatelného příčinného onemocnění, tedy "pouze" funkční
deficit
mozku
-
idiopatická
epilepsie 19
nebo
také
pouze
epilepsie.
Při pohledu na rozmanitost možných příčin záchvatů, je velmi důležité nejprve zjistit, kde je pravá příčina onemocnění, a teprve potom zahájit léčbu. V případě ignorace této možné rozmanitosti, a zahájení léčby antiepileptiky (účinné léčby idiopatické epilepsie) můžeme totiž velmi lehce neodhalit některé z důležitých onemocnění, které může mít potom dostatek času, aby se rozvinulo natolik, že jej pak není možno ovlivnit ani po správném stanovení diagnózy a zahájení správné terapie. Nasazení antiepileptik po záchvatech bez důkladného vyšetření může vést k zanedbání případného onemocnění, které záchvaty vyvolává.Jistá kritéria, podle kterých lze již na základě průběhu a manifestace
záchvatů
usoudit ,o kterou skupinu onemocnění se jedná. Na druhé
straně je však třeba sebekriticky přiznat, že všechny skupiny se co do projevů a průběhu velmi
překrývají
a riziko zmýlení se, vzhledem k možným následkům
takovéto chyby, je příliš vysoké. Záchvaty, ať už spadají do kterékoliv ze tří výše uvedených skupin, mohou vykazovat neuvěřitelnou šíři a rozmanitost vnějších projevů. Mohou sahat od pouhých záchvěvů, či třesu jednotlivých svalových partií (víčka, pysky, uši) nebo končetin a to za plného vědomí nebo jeho zastření až ztráty. Další možností jsou stavy náhlé ztráty vědomí a bezvládné upadnutí pacienta, jež může pokračovat zvýšeným svalovým napětím krku (často zaklonění) nebo končetin (tonická křeč). Velmi klasickým typem záchvatu je tzv. Grand-mal typ, s úplnou ztrátou vědomí, upadnutím na zem, zvýšeným napětím svaloviny krku a končetin a následnými plovacími pohyby končetin (klonická křeč) a pohyby žvýkacími. Nezřídka dochází k výraznému slinění, pomočení a samovolnému kálení. Jednotlivé
typy záchvatů se
mohou různě kombinovat nebo plynule přecházet jeden v druhý. Před samotnými záchvaty můžeme někdy pozorovat určitý neklid a nejistotu a změnu chování zvířete (prodromální stádium a aura). Samotný záchvat , jak byl výše popsán může trvat od několika vteřin až po několik minut.(22) V případě
kumulace
mnoha
záchvatů
následně po sobě hovoříme o tzv. klastrech, v momentě, kdy záchvaty na sebe navazují plynule, bez zjevných pauz, hovoříme o tzv. status epilepticus. (31)
20
3.1. Jiné příčiny křečovitých stavů
3.1.1. Primární epilepsie Onemocnění ,při nichž je přímo poškozena mozková tkáň. Typickými znaky této skupiny jsou: Progresívní vývoj onemocnění, neúspěšná léčba antiepileptiky (když, tak pouze přechodná ), přetrvávající
deficity při provedení neurologického vyšetření.
V této skupině se často setkáváme s tzv. hydrocefalem , nebo-li vodnatelností mozku. Jde o vývojovou anomálii a proto jsou postižena především mladší zvířata do 1 roku. Typickými plemeny jsou jorkšír teriér a čivava, postižena mohou být však všechna plemena i kříženci. Diagnostika je možná pomocí
elektroencefalografie (EEG)
a computerové tomografie (CT), pomocí ultrazvuku pouze při otevřené fontanele (neuzavřený srůst lebky) a pouze zřídka v některých, velmi výrazných případech může určitým způsobem napomoci rtg snímek. Léčba antiepileptiky je neúspěšná. Možnosti medikamentózního ovlivnění produkce mozkomíšního moku, sledující snížení jeho produkce, jsou úspěšné ve většině případů pouze na přechodnou dobu (týdny až měsíce). Optimální, ale technicky a finančně velmi náročnou metodou je drenáž mozkových komor pomocí hadičky s jednostranným ventilem do dutiny břišní nebo hrudní. Operace spočívá v zavedení hadičky s ventilem přímo do mozku.Ventil se otvírá při určitém tlaku mozkomíšního moku uvnitř mozku a odpouští tak přebytečnou tekutinu dále do hadičky, která ji odvádí do dutiny břišní, kde se vstřebává. Tato operace se úspěšně
provádí
již
po řadu let v humánní medicíně.
Další častou příčinou záchvatů jsou infekce. Infekce postihují převážně mladší a neočkovaná zvířata a mají progresívní průběh. Snad nejznámějším infekčním onemocněním mozku je psinka. Je však třeba říci, že existuje celá řada dalších infekčních a zánětlivých onemocnění, které
zůstávají
u nás nediagnostikovány,
respektive se ztrácejí jako případy psinkové. Dále je třeba zdůraznit, že psinka, ale i ostatní zánětlivá onemocnění mohou mít pouze jediný projev a tím mohou být právě záchvaty. Diagnostika těchto onemocnění se neobejde bez odběru mozkomíšního moku, pomoci a
může také EEG vyšetření. Léčba těchto onemocnění je velmi v drtivé
většině
případů
bývá
také
složitá
neúspěšná.(22)
Zřídka pozorovaným onemocněním mozku je tzv. posttraumatická epilepsie. Vzniká, jako následek úrazů hlavy s následnou tvorbou "jizvy" v mozku, která pak 21
může s odstupem i několika roků působit elektricky abnormálně aktivní okrsek nervové tkáně a tak vyvolávat záchvaty. Diagnostika je možná pouze pomocí CT, napomoci může i EEG. Léčba spočívá v podávání antiepileptik, úspěch je nejistý. Infarkty mozkové tkáně (ucpání cévy přivádějící krev do určitého okrsku mozku) mohou mít za následek taktéž záchvatovité stavy. Dlužno však říci, že na rozdíl od
člověka jsou infarkty u psů
spíše vzácností. Diagnostika je založena
na zobrazovacích metodách mozku, tedy CT. Nádory jsou častou příčinou záchvatů hlavně u starších psů, známe však případy nádorů mozku i u štěňat. Nádory mohou růst velmi dlouho nepozorovaně a projevit se zcela náhlým výskytem záchvatů.Diagnostika je možná pomocí CT, někdy ji může výrazně ulehčit odběr mozkomíšního moku. Rtg má smysl pouze při hledání metastáz v hrudníku. Terapie je možná chirurgická (operace
tumoru
velmi
náročná a závisí
na
jeho charakteru
a
lokalizaci),
medikamentózní způsob spočívá v podávání antiepileptik a cytostatik. U štěňat čistokrevných plemen (baset, gordon setr, kokršpaněl, bígl, pointr, německý ovčák, pudl, saluki, border kolie, čivava a další) se
setkáváme
s tzv.
kumulačními
onemocněními. U takto postižených jedinců dochází k odumírání nervových buněk následkem zahlcení určitým substrátem, který vzhledem k jejímu nedokonalému vybavení a neschopnosti
zpracování
těchto
látek nemohou z buňky vyloučit.
Tato onemocnění se manifestují brzy po narození a jsou progresívní a neléčitelná. Diagnostika je ve většině případů založena na posmrtném histologickém vyšetření mozku.(22)
22
3.1.2. Sekundární epilepsie Tato
skupina
onemocnění je charakteristická taktéž přetrvávajícími deficity
nervového systému v období mezi záchvaty. V mnohých případech se pak navíc přidružují
projevy
onemocnění
jiných orgánových
systémů (průjem, zvracení,
nadměrný příjem tekutin, snížený příjem tekutin, dýchavičnost atd.). Terapie antiepileptiky je v těchto případech taktéž neefektivní a v závislosti na příčině je průběh buďto progresívní nebo regresívní.Mezi nejdůležitější onemocnění této skupiny patří hepatoencefalopatie, tedy
záchvaty
jdoucí
na vrub nedostatečné činnosti
jater.Výsledkem je pak otrava mozku amoniakem. Projevem mohou
být
generalizované záchvaty typu Grand-mal, trvající několik minut a sdružující se do skupin (klaster). Častým
příznakem
bývá výrazné slinění, bezcílné bloudění po
místnosti, dezorientace nebo až úplná ztráta vědomí (koma). Diagnostika onemocnění se neobejde bez specielních testačních odběrů jaterních funkcí, které nejsou běžně prováděny každou laboratoří a vyžadují
taktéž specielní podmínky pro odběr
a uchovávání vzorků. Nejčastějším důvodem pro jaterní funkční nedostatečnost jsou vrozené vývojové abnormality jaterních cév. Dochází k vývoji zkratu - odbočky, která odvádí krev ze zažívacího aparátu, bohatou na amoniak, místo do jater, přímo k srdci. Takto "nevyčištěná" krev je pak srdcem pumpována do celého těla a mozek, jako nejcitlivější orgán, je pak otráven, což se projeví výše uvedenými příznaky. V případě cévních anomálií je pak možno provést jejich detekci pomocí kontrastního rtg vyšetření. Léčba spočívá v chirurgické korekci anomálie. metodou
je úprava
diety, která vede ke
Méně
náročnou
zlepšení stavu, ale
z dlouhodobého hlediska (roky), není příliš úspěšnou. Samozřejmě, že nefunkčnost jaterní tkáně může být taktéž následkem infekce, nádoru nebo cirhózy jater. Tyto příčiny jsou však u psů spíše ojedinělé. Jejich potvrzení je možné pomocí ultrasonografie, biopsie a krevních testů.
Při
onemocněních
ledvin dochází
k obdobné situaci, kdy se v těle hromadí kreatinin, kys.močová , které za normálních okolností opouští organizmus vyloučením do moči. U těchto případů velmi často pozorujeme abnormality v příjmu tekutin a močení (příliš velký nebo minimální příjem a výdej). Zvířata jsou apatická a mohou upadnout až do stavu úplného bezvědomí (komatu).
Častým projevem jsou záchvaty. V pokročilejších stádiích zvířata
páchnou po moči. (22) 23
Léčba těchto stavů je velmi náročná a vyžaduje několikadenní hospitalizaci u veterináře. V případě zvládnutí akutního stavu je pak nutno pokračovat v podávání specielních diet. Jednou z dalších možných příčin záchvatů je nedostatečná funkce štítné žlázy (hypotyreóza). Toto onemocnění
může být také spojeno s jinými
deficity, jako jsou celková slabost, obrny různých nervů ( končetin a hlavy ), s poruchami polykání atd. Mnohdy jsou
však generalizované záchvaty jediným
příznakem.(29) Diagnostika spočívá v krevních testech a terapie v nahrazení hormonu štítné žlázy každodenním podáváním tabletek. Dalšími příčinami sekundární epilepsie jsou křeče způsobené nerovnováhou různých iontů v krvi (hypokalcémie, známá u kojících fen, dysbalance draslíku a sodíku při onemocnění nadledvinek). (22) Další možnou příčinou záchvatů je nedostatek
cukru v krvi
(hypoglykémie)
při některých nádorových onemocněních nebo příliš vysoká hladina krevního cukru (hyperglykémie),
při cukrovce. Všechna
tato onemocnění vyžadují k diagnostice
odběry krve, případně další doplňková vyšetření (rtg, ultrazvuk, EKG).(22)
24
3.2. Idiopatická epilepsie - Epilepsie
Obr. 1
Pravděpodobné místo vzniku epileptického záchvatu Převzato z
http://www.spicove.cz/veterina/epilepsie/epilepsie-psu-cast-4.php
Jak již bylo uvedeno, jedná se o nejčastější příčinu záchvatů u psů (podobně jako u lidí). Samotné
záchvaty jsou
pak způsobeny dočasnou abnormální elektrickou
aktivitou některých buněk mozku, která převýší určitý práh vnímavosti a způsobí tak vznik vlastních křečí. Pro toto onemocnění je typický výskyt prvních záchvatů ve věku 6 měsíců až
3 roky (26) , postižení
čistokrevných
plemen
a jinak
bezpříznakový průběh tohoto onemocnění. (22) Je popsána celá řada plemen, u nichž se epilepsie vyskytuje s vyšší četností ( pudl, kokršpaněl,irský setr, knírač, sibiřský haski, bernardýn, foxteriér, bernský salašnický pes, belgický tervueren, horákův laboratorní pes, špic a další). U většiny 25
těchto psů se uvažuje o dědičné komponentě tohoto onemocnění. Pouze u několika málo plemen se podařilo skutečně prokázat genetické zakotvení tohoto onemocnění (kolie, zlatý retrívr, labradorský retrívr, belgický tervueren (27, 28) bígl.( 46) Idiopatická epilepsie může u těchto plemen vykazovat různé odlišnosti, co se týče průběhu i typu záchvatů. (22) U psů se dá uvažovat o „práhu záchvatu „ někteří autoři předpokládají , že každé zvíře má určitou „ genetickou náchylnost k záchvatům“. (32) Záchvaty se pak vyskytují, když je tento práh překročen . (24) Práh záchvatu je zřejmě vyjímečně nízký u zvířat,která trpí idiopatickou epilepsií.( 32) Takovým faktorem mohou být i léky např. acepromazin , celková alkalóza. (33) Jsou přesvědčivé experimentální údaje, že opakované záchvaty mohou nevratně snížit práh záchvatu a způsobovat jeho roznícení. Neurony epileptika v mozku „rekrutují „ normální neurony do procesu záchvatu a tak se zvětšuje oblast mozku, která může produkovat záchvaty.(34) Nakonec „potenciovaná vzrušivost“ může způsobit,že i normální neurony, dostatečně povzbuzené, se mohou
stávat stále více schopné k tomu, aby způsobily záchvaty
nezávislé na vnější pobídce. Také je zmiňován „ohniskový fenomén zrcadla“. Každá hemisféra je zrcadlovým obrazem té druhé. Na jedné straně mozku ,kde probíhá záchvat, se objeví abnormální tvary na EEG. Ve lhůtě týdnů ,
„normální strana“
hemisféry začne ukazovat podobné EEG odchylky. Tak se „ohnisko zrcadla „ stává schopným
způsobovat
aktivitu záchvatu
samo.
Tímto způsobem
opakované
neovladatelné záchvaty snižují práh záchvatu v tom daném zvířeti. Proto je důležitá včasná intervence v kontrole nad záchvaty.(25) Existuje klasický obraz, který je typický tomuto onemocnění: První záchvaty typu grand-mal se objeví ve věku od 6 měsíců až 3 let, a poté jsou zvířata delší dobu (řádově několik měsíců až rok) bez záchvatů. Další záchvaty jsou zpravidla stejné až slabší intenzity, ale intervaly se postupně zkracují, z měsíců až na týdny. V této době už je nutné záchvaty kontrolovat. Čím více záchvatů jedinec prodělá, tím hůře se pak kontrolují. Předpokládá se , že u psů se dá uvažovat o prahu
záchvatu.
Často lze vypozorovat souvislost mezi záchvaty
a stresovým spouštěcím mechanizmem (vzrušení, emotivní reakce, strach..). Samozřejmě existují jedinci, u nichž onemocnění propukne sadou několika těžkých záchvatů během několika minut až hodin. Z toho vyplývá, že není možno stanovovat diagnózu idiopatické epilepsie pouze na základě průběhu onemocnění, ale je nutno 26
provést celou řadu doplňkových vyšetření. U epileptických jedinců je tedy nutno nejprve vyloučit možnost primární a sekundární epilepsie ,a teprve ,až se neprokáže žádná z možných příčin záchvatů, lze uvažovat o idiopatické epilepsii a začít s její medikamentózní terapií.(22) Diagnóza idiopatické epilepsie je tedy diagnóza vylučovací! Léčba epilepsie je doživotní a s touto skutečností se musí majitelé smířit. Na rozdíl od humánní medicíny, kde existuje a účinkuje celá řada antiepileptik, je situace ve veterinární medicíně výrazně odlišná. Většina humánních preparátů je u psů a koček neúčinná a má výrazné negativní vedlejší účinky v případě dlouhodobého podávání. Dalším důležitým momentem při léčbě epilepsie je preference monoterapie, tedy použití jednoho medikamentu, před polyterapií, tedy současným podáváním kombinace více
medikamentů.
Jakékoliv výkyvy a změny typu a dávky medikamentů jsou
nežádoucí a mohou vést k těžkým a obtížně kontrolovatelným záchvatům. Při léčbě epilepsie je důležité udržovat stálou hladinu medikamentu v krvi jedince. Toho lze dosáhnout pouze pravidelným opakovaným podáváním. Jedno vynechání dávky tak může mít nepříjemné následky. Taktéž samovolné snižování dávky nebo záměna medikamentu obvykle vede ke komplikacím. Obecně platné pravidlo hovoří o možnosti postupného vysazení medikamentů u pacientů, kteří netrpí záchvaty po dobu delší jednoho roku. I toto vysazování musí pak být postupné a odehrává se po dobu několika týdnů až měsíců. Za úspěch léčby je nutno považovat zeslabení intenzity záchvatů a snížení jejich četnosti na 4 až 5 záchvatových dnů v roce. Pouze asi 20% pacientů je doživotně bez záchvatů. Asi dalších 25% pacientů se nedaří kontrolovat pomocí jednoho medikamentu a je nutno u nich začít s kombinační terapií. Asi 5 - 8% z celkového počtu pacientů se nedaří kontrolovat vůbec. Na tomto místě je třeba uvést další obecné pravidlo, které hovoří o zvládnutelnosti epilepsie vzhledem k velikosti psa. U malých a středních plemen je tato úspěšnost mnohem vyšší než u plemen velkých,
kde je
epilepsie
velmi
těžkým problémem. V případě vypozorování
stresového faktoru se samozřejmě stává součástí terapie
vyvolávajícího
o eliminaci všech těchto negativních vnějších vlivů. momentem jsou momentech
veškeré
dochází
poruchy v zažívacím
snaha
Dalším velmi důležitým
aparátu
jedince. V takovýchto
k nedostatečnému vstřebávání medikamentu a následným
záchvatům. Tomu lze předejít podáním medikamentu jinou cestou (injekce, čípky..). Velmi častou komplikací u epileptiků
jsou
pak různé chirurgické a diagnostické
zákroky vyžadující zklidnění nebo celkovou narkózu. Existují skupiny medikamentů, 27
které mozek přímo provokují k epileptickým záchvatům. Při jejich použití pak často dochází ke komplikacím během narkózy nebo během probouzení. Proto je nutné, aby všichni epileptici měli patřičný záznam ve svém očkovacím průkazu
a
majitel
veterináře na tuto skutečnost vždy upozornil.(22) Několik zásad v případech, kdy zvíře prodělává záchvat. U mnoha psů může majitel pozorovat určité změny v chování, ještě před nástupem vlastního záchvatu (prodromální stadium, aura). V těchto případech se doporučuje kontaktovat takového jedince a snažit se jej zklidnit. V mnohých případech lze tímto způsobem přicházející záchvat zažehnat. Během vlastního záchvatu je třeba dávat pozor, aby se pes neporanil. Většina jednotlivých záchvatů probíhá tak rychle, že podávání medikamentů formou tabletek je nedostačující, neboť jejich vstřebání ze zažívadel je příliš pomalé (hodiny) a tudíž touto cestou záchvat zastavit nelze. Podání tabletek po záchvatu (mimo běžné pořadí) může mít svůj smysl v prevenci možných následných záchvatů. V případě po sobě se rychle opakujících záchvatů (klastra, status epilepticus) je nutné tyto velmi rychle zastavit. Předcházíme tak přetížení ostatních orgánových systémů (dýchání, srdce, svaly, játra), ale i vlastního mozku. Efektivní, tedy rychlé zastavení záchvatů je možné pouze podáním medikamentů přímo do žíly, tedy injekční formou. Injekce do svalu je z tohoto pohledu
nevyhovující, neboť
vstřebávání ze svalů je také příliš pomalé. Možnou eventualitou pro chovatele je použití tzv. rektálních tub, pomocí kterých se medikament (dizepam) aplikuje do konečníku. Takto deponovaný medikament se vstřebává velmi rychle a jeho efekt je patrný během několika minut. Jistě lze na tomto místě doporučit, že v případě opakovaných, skupinových záchvatů je nutno přivolat veterinárního lékaře, který záchvaty zastaví. V případě dobrého nastavení medikamentů a kontroly záchvatů (cca 4 záchvatové dny do roka), jsou psi schopni normálního výcviku a běžných aktivit bez jakéhokoliv omezení. Jistá část epileptiků může po zahájení terapie tíhnout k obezitě. V těchto případech je pak třeba hmotnost jedince kontrolovat, nejlépe podáváním light krmiv.(22)
28
4 .Fenobarbital
Obr. 2 Chemický vzorec fenobarbitalu Převzato z C ComIP (cz) ,2003
Systematic (IUPAC) name
5-ethyl-5-phenylpyrimidine2,4,6(1H,3H,5H)-trione
Obr.3 Struktura fenobarbitalu
Převzato z http://en.wikipedia.org/wiki/File:Phenobarbital3d_updated.png 29
Fenobarbital je nejstarším lékem k terapii epilepsie- začal se používat v letech 19111912.(3)
Je
účinný u tonicko-klonických a některých částečných
záchvatů,
neovlivňuje absence. Podobně jako ostatní barbituráty prodlužuje po vazbě na své specifické receptory, jež jsou součástí struktury chloridového kanálu stejně jako např. GABAA - receptory, otevření s následnou
tohoto kanálu pro vstup Cl- iontů do neuronu
hyperpolarizací
membrány. Od
ostatních
barbiturátů odlišuje
fenobarbital jako výrazné entiepileptické působení zřejmě proto, že se varianta jeho specifických receptorů vyskytuje
právě v oblastech CNS zodpovědných za rozvoj
epileptické aktivity neuronů. (38) Jeden z důvodů, pro které bylo jeho
užívání víceméně nahrazeno
dalšími
z antiepileptik, je jeho výrazné celkově sedativní působení. Má však dlouhý poločas eliminace, který je výhodný pro chronické dávkování, relativně velkou terapeutickou šíři a relativně méně jiných nežádoucích účinků než ostatní
látky. Bývá volen
u pacientů alergických na ostatní antiepileptika nebo také u dětí. Stejně jako ostatní barbituráty je kontraindikován u
porfyrie
a
je induktorem hepatického
P450
enzymatického systému, což přispívá k rozvoji tolerance a zvyšuje interakci s řadou jiných léčiv metabolizovaných stejnou cestou.(49) fyzikálně
phenobarbitalum:
chemické vlastnosti
bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly; fenobarbital je velmi těžce rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v ethanolu, dobře rozpustný v etheru; s alkalickými hydroxidy, uhličitany a s amoniakem tvoří ve vodě rozpustné sloučeniny phenobarbitalum natricum: bílý krystalický, hygroskopický prášek, snadno rozpustný ve vodě prosté oxidu uhličitého, dobře rozpustný v ethanolu, prakticky nerozpustný v dichlormethanu a v etheru
30
molekulová
phenobarbitalum:
hmotnost 232,24 phenobarbitalum natricum: 254,22 přibližně 10,95 mg sodné soli fenobarbitalu odpovídá 10 mg volné kyseliny fenobarbitalu množství
v nezměněné formě 19-29%
vyloučené močí
(stoupá při alkalizaci moče)
biologická dostupnost (p.o.)
80-90%
vazba na plazmatické bílkoviny
40-60 %
(50) Příznaky intoxikace: Předávkování Známky předávkování mohou nastat při koncentracích od 30 µg/ml. U jednotlivců je vysoká variabilita koncentrací v plazmě, která produkuje toxické účinky. Příznaky předávkování fenobarbitalem mohou zahrnovat následující: závrať, stupor, kardiovaskulární deprese s hypotonií, selhání ledvin, hypotermie, nystagmus v krajních polohách a při přímém pohledu, snížená pozornost, oslabení šlachových reflexů, minimální ataxie, ataxie s pohotovostí k pádům, somnolence, spánek, semikoma, koma, deprese dýchání, šok s dilatací pupil.(51)
31
Terapie intoxikace: Při otravě barbiturátem je zapotřebí
respirační a oběhová podpora. K odstranění
fenobarbitalu z gastrointestinálního traktu a systémově absorbovaného fenobarbitalu se doporučují opakované perorální dávky aktivního medicínského uhlí.(51) Další (přídavné) možnosti: alkalizovaná forsírovaná diuréza, hemodialýza, Pozor: adrenalin (může zhoršit hypotonii).(51)
hemoperfúze.
Antikonvulzivní účinky: Dávky, které u myší zabrání výskytu elektricky nebo chemicky vyvolaných konvulzí, se u fenobarbitalu pohybují v dolní polovině dávky působící sedativním účinkem. Zabránění tonické křečové fáze Elektrošok
Penetrazolový šok
(20 mA, 50 Hz,1 sec.)
(50 mg/kg i.v.)
DE50 mg/kg p.o.
DE50 mg/kg p.o.
13,7 (12,1-15,5)
11,8 (9,5-15,3)
fenobarbital (51) Sedativní účinek:
účinek lze u zvířat experimentálně sledovat potlačením nepřátelského
Sedativní
chování u kočky a myši. DE50 pro fenobarbital činí u myši 38,0 mg/kg, podané p.o., kdežto u koček 25,6 mg/kg p.o. Také tyto dávky se pohybují ještě v dolní polovině všeobecně sedativně působící dávky.(51) Farmakokinetické vlastnosti Fenobarbital dobře prostupuje hematoencefalickou bariérou, rovněž tak placentou a dosahuje
prostupuje
přechází do mateřského mléka. Jeho koncentrace v mateřském mléce
cca
10%
až
45%
plazmatické
32
koncentrace
u
matky.(51)
Vazba na plazmatické bílkoviny je 40-60%. Fenobarbital je odstranitelný hemodialýzou a hemoperfuzí, snížení plazmatické koncentrace na polovinu výchozí hodnoty se při dialýze dosáhne za cca 2 hodiny.(51) Metabolismus Fenobarbital je metabolizován cytochromem P 450, primárně CYP2C9, a v menším rozsahu i CYP2C19 a CYP2E1.(51)
Předklinické údaje vztahující se k bezpečnosti Toxikologické vlastnosti Vyšetřované druhy vykazovaly při krátkodobé a dlouhodobé perorální léčbě fenobarbitalem hepatotoxicitu a neurotoxicitu. Z dostupných údajů se usuzuje, že fenobarbital nemá při
klinickém použití žádný genotoxický potenciál. U potkanů a
myší se po léčbě fenobarbitalem v rámci dlouhodobých studií zkoumajících potenciál vyvinuly hepatické neoplazie s maligními jaterními tumory. Krátkodobé studie u potkanů a dlouhodobé studie u myší zjistily nádorotvorné vlastnosti fenobarbitalu. Diskutuje se o tom, že příčinou je indukce jaterního enzymatického systému. Při léčbě březích myší, potkanů a králíků fenobarbitalem byly pozorovány teratogenní a/nebo embryotoxické účinky. U potkanů a myší byl narušen perinatální a postnatální vývoj. U potkanů nebo křečků prenatálně či neonatálně vystavených fenobarbitalu se vyskytují nevratné sexuální dysfunkce jak u samců tak u samic.(51)
33
Toxikologické vlastnosti: Údaje k akutní toxicitě: zvířecí druh
způsob aplikace
LD50 [mg/kg]
p.o.
325
i.p.
235
p.o.
660
i.p.
190
králík
i.v.
185
kočka
p.o.
175
myš
potkan
(51)SPC Phenaemal
34
5. Princip imunochemické metody
Základem je reakce mezi antigenem (Agn) a specifickou protilátkou (PI) za vzniku imunokomplexu (AgnPI).(52)
(Agn) + (PI)
( AgnPI)
Antigeny jsou látky schopné vyvolat v živém organismu, pro který jsou cizorodé, tvorbu
specifických protilátek.
Antigeny mají na
povrchu
různý počet
determinantních skupin. Organismus reaguje tvorbou protilátek pouze na pro něj cizí determinantní skupiny. Obvykle
jsou to
vysokomolekulární
látky-
bilkoviny, glykoproteiny,
nukleotidy,lipoproteiny, mikroorganismy, viry, živočišné buňky. Imunitní odpověď může vyvolat pouze kompletní antigen.(52) Hapteny jsou nekompletní antigeny. Vyvolávají tvorbu protilátek pouze,
jsou-li
navázány na bílkovinný nosič (hovězí nebo sérový albumin). Jsou to nízkomolekulární peptidy, léčiva, hormony, steroidy, izolované determinantní skupiny antigenu.(52) Protilátky jsou bílkoviny vykazující specifickou vazebnou aktivitu vůči antigenu, na jehož podnět podnět
se vytvořily. Tzv. imunoglobuliny
( dle α,β1,γ globuliny).
Obvykle jsou komerčně vyráběny jako tzv. antisérum ( získané imunizací zvířete).(52) Izotopové a neizotopové
imunochemické metody jsou podstatně citlivější než
klasické imunochemické metody. Stanovení vysokomolekulárních látek, např. bílkovin a jiných antigenů a haptenů ( hormony, léčiva) obsažených v biologickém materiálu ve stopovém množství (pod 10mg/l)
Klasické imunochemické metody: 2 reaktanty
Agn
+ PI
(stanovení látek nad
AgnPI
10mg/ l ) 35
Izotopové a neizotopové imunochemické metody: 3 reaktanty Agn, PI a antigen nebo protilátka značená radioizotopem ( u izotopových metod) nebo jiným značkovacím indikátorem ( u neizotopových metod) symbol M
(52)
Techniky kompetitivní (soutěživé) Agn
stanovovaný
Agn M
PI
stejný antigen
specif.protilátka proti stanovovanému
antigen
značený M
antigenu v limitním množství
Techniky nekompetivní (nesoutěživé)
Agn
stanovovaný antigen
PI ¬
PIM
specif.protilátka v nadbytku navázaná na pevnou fázi
36
značená specifická protilátka v nadbytku (sekund.protilátka)
Tabulka 1
Přehled imunochemických metod ,rozlišení dle charakteru značky M
značka
druh metody
detekce
radioizotop
radioimunoanalýza ( RIA - Radioimmunoassay)
měření radioaktivity
enzym
enzymoimunoanalýza EIA - Enzyme Immonoassay
měření absorbance krevního produktu enzymová reakce se substrátem
fluoroimunoanalýza FIA - Fluoro Immunoassay
měření fluorescence
luminoimunoanalýza LIA - Lumino Immunoassay
měření světelných kvant při chemoluminiscenční reakci
technika volných radikálů FRAT - Free Radical Assay Technique
měření pomocí elektron. spinové rezonance
fluorescenční látka
luminofor
stabilní volné radikály
5.1. Kompetitivní metody se značeným antigenem a s limitovaným množstvím protilátky Stanovovaný antigen a stejný antigen značený vhodnou značkou soutěží ve vazbě na limitované množství specifické protilátky s vysokou asociační konstantou. Je nutná delší inkubace pro ustavení termodynamické rovnováhy. Princip:Ke stanovovanému Agn ve vzorku se přidá známé množství stejného AgnM, oba antigeny soutěží o vazbu na specifickou protilátku PI a váží se na ni ve stejném poměru, ve kterém byly zastoupeny ve směsi na počátku reakce ( vzniknou imunokomplexy).
AgnPI
a
AgnM PI
37
Do reakce
se vkládá limitované množství protilátky, v reakci zůstanou vždy též
nezreagované
Agn
a
AgnM
Detekce značeného imunokomplexu
AgnM PI
- naměřená hodnota je nepřímo
úměrná koncentraci stanovovaného Agn .(52) Detekce volného
AgnM
-
naměřená hodnota je přímo úměrná koncentraci
stanovovaného Agn . 3 Agn
1 Agn –PI
+
2 Agn
2 AgnM- PI
+
4 AgnM
(vzorek) +
+ 3 PI
6 Agn M
měření signálu AgnM- PI naměřená hodnota nepřímo úměrná konc. stanovovaného Agn
3 Agn :
6 Agn M
=
měření signálu Agn M naměřená hodnota přímo úměrná konc. stanovovaného Agn
1 Agn- PI :
2 AgnM- PI (52)
5.2. Kompetitivní metody- homogenní –není třeba oddělovat AgnM od AgnM-PI , Značky M → Protože vazbou na protilátku dojde ke změně fyzikálně chemických vlastností v „mikrookolí“ AgnM-PI je inaktivní (nedává signál) a měříme pouze signál AgnM . - heterogenní (signál dávají obě složky AgnM-PI i AgnM ) , složky se nejdříve izolují, např. vysrážením a centrifugací a promytím, pak se měří signál AgnM nebo AgnM-PI
(52)
38
5.3. Nekompetitivní metody s nadbytkem značené i neznačené protilátky – sendvičová technika Výhodou je krátká inkubační doba a vysoká citlivost.Je nejužívanější technikou pro stanovení antigenu
s minimálně
dvěmi vazebnými místy s
použitím dvou
specifických protilátek proti stanovovanému antigenu. Princip: Stanovovaný antigen
Agn se váže na
specifickou protilátku, která je
v přebytku vázána na pevné fázi ( PI ¬ ) – nosič, plastová stěna zkumavky: 1)
Agn
+
PI¬
Agn-PI¬
Každá molekula Agn reaguje s PI¬
. Po vypláchnutí se přidá v nadbytku značená
protilátka proti stanovovanému antigenu PIM, která se váže na druhé vazebné místo antigenu. 2) ¬PI- Agn
¬PI-Agn- PIM
PIM
+
Úbytek volné značené protilátky PIM se odstraní promýváním,měří se signál imunokomplexu
¬PI
¬PI – Agn - PIM
Agn
¬PI + ¬PI
----Agn
¬PI
¬PI
PIM
¬PI
¬PI-Agn +
PIM ------
¬PI-Agn-PIM
¬PI
PIM
¬PI
¬PI-Agn
PIM
¬PI- Agn-PIM
PIM
+ PIM
(vzorek) inkubace
inkubace
měří se signál
odstraní se
imunokomplexu
promytím
(52)
39
5.4. Enzymoimunoanalýza (EIA –Enzyme Immunoassay) Používá se k průkazu a stanovení antigenů,haptenů a protilátek. Označkován je enzym E , který dává barevnou reakci se svým substrátem ,po ukončení enzymové reakce se měří absorbance barevného
produktu. Enzymem
je nejčastěji křenová
peroxidáza,ALP, glukosoxidáza, β-galaktoxidáza -metody -kompetitivní - homogenní : EMIT - heterogenní: ELISA -nekompetitivní(sendvičová): ELISA Homogenní enzymoimunoanalýza - EMIT ( Enzyme Multiplied Immunoassay Technique ) Ke stanovení haptenů a antigenů s relativní molekulovou hmotností po 20 000 daltonů. Všechny reaktanty- stanovovaný hapten H , přidaný značený hapten HE a protilátka v limitovaném množství PI jsou v haptenovém stavu.Po ukončení imunoreakce v reakční směsi H-PI, HE-PI, H a HE.Po přidání substrátu S a inkubaci se měří intenzita barevného produktu, který dává se substrátem HE HE-PI inaktivní , reakce se substrátem se neúčastní. Tudíž není nutno oddělovat HE a HE-PI. Intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci stanovovaného haptenu ve vzorku. Výhodou je rychlost analýzy (několik minut), jednoduchost provedení (jednostupňová metoda bez promývání v jedné zkumavce), vhodnost pro automatizaci.(52)
5.5. Fluorescenční polarizační imunoanalýza – (FPIA ) (Fluorescence Polarization Immunoassay) Značena je fluorescenční značka navázaná na antigen nebo protilátku Kompetitivní homogenní metoda Měření se provádí v polarizovaném světle, využívá se různé rychlosti rotace velkých
a malých
molekul, což vede ke změně polarizace, měří se intenzita
polarizovaného světla. Princip: Z polychromatického světla wolframové halogenové lampy je interferenčním filtrem vybráno
modré světlo ( 481-489 nm), které je
40
polarizované tekutým
polarizačním krystalem. Polarizované
modré světlo
excituje fluoreskující látku,
fluorofor, který při návratu do ustáleného stavu vyzařuje zelené světlo (525-550nm). Fluorofor
ve vazbě
na velkou
nemůže volně rotovat, polarizace
molekulu
vyzařovaného světla zůstává zachována. Fluorofor ve vazbě na malou molekulu může volně rotovat, polarizace vyzařovaného světla se mění. Měří
se intenzita
emitovaného polarizovaného světla, která je
nepřímo úměrná koncentraci stanovovaného antigenu. Do reakční kyvety se vzorkem ( stanovovaný
Agn) se přidá AgnF
značeno
fluoresceinem) a PI v malém limitovaném množství, oba antigeny soutěží ve vazbě na specifickou protilátku a vážou se na ni v poměru, v jakém byly zastoupeny ve vzorku – po ukončení reakce bodou ve směsi Agn-PI, AgnF-PI, Agn , AgnF . (52)
+ 6 AgnF
3 Agn
Agn-PI
+ 2 Agn
2 AgnF-PI
+ 4 AgnF
+ 3 PI
(vzorek) 1
:
2
nerotuje /neovlivňuje intenzitu polarizov.světla /
rotuje /zeslabuje intenzitu polarizov.světla /
Výhodou je rychlost, citlivost, reaktanty není nutno oddělovat, možnost automatizace. Pozn. •Způsob vazby haptenu na protein za účelem vytvoření imunogenního konjugátu ovlivňuje specifitu výsledné metody ⇒ různé výsledky téhož vzorku u různých výrobců. • Změna pH, iontové síly, rozdíly mezi koncentrací proteinů mezi standardy a vzorky způsobují velké rozdíly výsledků → nelze použít sety na moč pro vyšetření séra. • Imunochemické metody snadno použitelné k rychlému testování psychoaktivních látek (drog a léčiv ) při klinickém monitorování a profesním testování drogové abstinence.
41
Problémy a potíže: • Negativní výsledek v moči nemusí být negativní toxikologický případ.(Noxa nemusí být vylučována močí – např.dextromoramid, -- Smrt nastala tak rychle, že se noxa nedostala do moče). •Vlivem posmrtně vytvořené kyseliny mléčné chyby u EMIT při stanovení alkoholu (falešně pozitivní) a průkazu drog (falešně negativní) vlivem
měření absorbance
NADH • V úzce vymezené skupině látek slušná úspěšnost metody,při variabilitě látek ve skupině (benzodiazepinů, barbiturátů) je úspěšnost nižší. • Možnost vyšetření krve a homogenních orgánů: Toseland: 0,5 ml krve + 0,5 ml methanolu, protřepat, nechat stát 20 min. při 4oC, po centrifugaci použít suprnalant Umožňují průkaz a stanovení látek v biologickém materiálu (moč, krev) bez předchozí úpravy vzorku, umožňují pouze skupinovou detekci. Různé látky příbuzného složení mohou jevit rozdílnou afinitu k protilátce, proto je kvantifikace jen orientační,mohou reagovat i neúčinné molekuly. K dispozici jsou papírové testy i specifické destičky umožňující během 10-15 min. odečíst pozitivní reakci okem – Jsou založeny na inhibici záchytu mikročástic. Adulterace- zředění moče ⇒ stanovení hustoty moče ( 1,003 – 1,033 ) koncentrace kreatininu (c 200mg/l). Přidání kyselin nebo zásad – měření pH, přidání dusitanů, glutaraldehydu, chlornanu, chromanu, oxidačních činidel
(52)
42
III. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
43
1. Metodika 1.1. Metoda AxSYM Phenobarbital je
imunoanalýza
ke
kvantitativnímu
stanovení
fenobarbitalu
v séru
nebo
v plazmě.Naměřené hodnoty se používají při stanovení diagnózy a léčbě předávkování fenobarbitalem a k zjišťování hladin fenobarbitalu pro zajištění správné terapie.(48)
Shrnutí a vysvětlení principu testu Imunoanalýza využívá fluorescenční polarizaci FPIA.(1,2) Fenobarbital se váže na proteiny v plazmě i v tkáních.(4) Prokázalo se, že monitorování koncentrací fenobarbitalu v séru zvyšuje účinnost terapie, lékaři umožňuje nastavit vhodné dávkování léku.(5) Vzhledem k úzkému terapeutickému rozmezí a značné interindividuální variabilitě v rychlosti metabolismu a vylučování fenobarbitalu je stanovení hladin fenobarbitalu v krvi pacientů, které podstupují terapii, nezbytné.(6)
Biologické principy vyšetřovacího postupu Vzorek a reagencie AxSYM Phenobarbital se pipetují v následujícím pořadí: Centrum pro zpracování vzorků(SAMPLING CENTER) Vzorek a všechny reagencie AxSYM Phenobarbital požadované k provedení jednoho testu se pipetují vzorkovou jehlou
(Sampling Probe) do různých jamek reakční
nádobky (RV-Reaction Vessel). Do jedné jamky RV se napipetuje vzorek a roztok 4 (Line Diluent). Do kyvety RV se přenese alikvótní podíl předředěné směsi, přípravný roztok a roztok 4 (Line Diluent). Reagenční nádobka se okamžitě přenese do procesního centra. V procesním centru se další pipetování provádí procesní jehlou (Processing Probe).
44
Procesní centrum (Processing Center) Do kyvety se přenese druhý alikvótní podíl předředěné směsi spolu s protilátkami proti fenobarbitalu.(Phenobarbital Antiserum) a indikátorem značeným fluoresceinem (Phenobarbital Fluorescein Tracer). Fenobarbital přítomný ve vzorku a indikátor značený fluoresceinem soutěží o vazebná místa na molekulách protilátek. Intenzita polarizovaného fluorescenčního záření se měří optickým systémem FPIA.
Reagencie Reagenční souprava, 100 testů AxSYM Phenobarbital Reagent Pack (7A70- 20) 1 lahvička (14,5 ml) ovčí polyklonální protilátky proti fenobarbitalu (Phenobarbital Antiserum) (< 25 %) v normálním fyziologickém roztoku s bílkovinnými stabilizátory. Konzervační činidlo: azid sodný .(Reagent Botlle 1) 1 lahvička (8,6 ml) –přípravný roztok (Pretreatment Solution). Povrchově aktivní látka v TRIS pufru. Konzervační činidlo: azid sodný (Reagent Bottle 2) 1 lahvička (15,5 ml)- indikátor značený fluoresceinem (Phenobarbital Fluorescein Tracer) (< 0,01%) v TRIS pufru s povrchově aktivní látkou. Konzervační činidlo: azid sodný . (Reagent Bottle 3) Sada 7A70-20 obsahuje reagenční soupravu AxSYM Phenobarbital na 100 testů a 100 ks reakčních nádobek.
Kalibrátory AxSYM Phenobarbital Standard Calibration (7A70-01) 1 lahvička (6 ml) –standardní kalibrátor A AxSYM Phenobarbital
obsahující lidské
sérum, které je nereaktivní na HbsAg, HIV- 1Ag, anti-HCV a anti-HIV-1/HIV-2. 5 lahviček (po 4ml )- standardní kalibrátory B-F AxSYM Phenobarbital obsahující přesně odměřená množství fenobarbitalu připraveného v lidském séru, které je nereaktivní na HbsAg, HIV-1 Ag, anti-HCV a anti-HIV-1/HIV-2.
45
Tabulka 2
Kalibrátory A-F vykazují následující koncentrace
koncentrace fenobarbitalu Označení lahvičky
(µg/ml)& (mg/l)
Standard cal A
0,0
0 ,00
Standard cal B
5,0
21,55
Standard cal C
10,0
43,10
Standard cal D
20,0
86,20
Standard cal E
40,0
172,40
Standard cal F
80,0
344,80
(µmol/l)
Konzervační činidlo: azid sodný Firma Abbott vyrábí vnitřní referenční standardy pro metodu AxSYM Phenobarbital za použití Referenčního standardu pro fenobarbital (čistota USP). Kalibrátory byly vyrobeny gravimetricky a byly testovány vzhledem k těmto vnitřním referenčním standardům. Kontroly AxSYM Phenobarbital Controls (7A70-10) 3 lahvičky (po 8 ml) –kontroly AxSYM Phenobarbital obsahující fenobarbital připravený v lidském séru, které je nereaktivní na HbsAg, HIV-1 Ag, anti-HCV a antiHIV-1/HIV-2. Hodnoty kontrol se nacházejí v následujících rozmezích koncentrací:
46
Tabulka 3 Kontroly AxSYM Phenobarbital Fenobarbital Koncentrace Označení (µg/ml) (µg/ml) lahvičky (mg/l) (µmol/l) (mg/l) Control L 15,0 64,65 13,20 - 16,80 Control M 30,0 129,30 26,40 - 33,60 Control H 50,0 215,50 44,00 – 56,00 Konzervační činidlo: azid sodný
Rozmezí (µmol/l) 56,89 - 72,41 113,78 - 144,82 189,64 - 241,36
Se všemi vzorky a reagenciemi se doporučuje pracovat jako s potencionálně infekčními a dodržovat pravidla ochrany zdraví a bezpečnosti práce
ve vztahu k patogenům
krevního původu (OSHA Standard of Bloodborne Pathogens).(7) Při podezření na infekční agens je třeba uplatňovat bezpečnostní předpisy Biosafety Level 2(8) nebo jiná bezpečnostní opatření.(9,10) Jednotky vydávaných výsledků pro metodu AxSYM Phenobarbital byly nastaveny výrobcem na µg/ml. Pomocí parametru č. 45 se mohou zadat alternativní jednotky vydávaných výsledků µmol/l nebo mg/l.
Způsob práce s přístrojem Instalace parametrů metody Před zahájením vyšetření musí být do systému AxSYM nainstalovány parametry metody AxSYM Phenobarbital nainstalovány parametry metody z jedné z následujících disket:
8A86-01 nebo vyšší (stabilita reagencií vložených v přístroji: 112 hodin) 3D53-01 nebo vyšší (stabilita reagencií vložených v přístroji: 336 hodin)
Odběr vzorků a jejich příprava k vyšetření Pro vyšetření metodou AxSYM Phenobarbital lze použít sérum nebo plazmu (odebranou do odběrových zkumavek s heparinem, citrátem, EDTA nebo šťavelanem). Dodržovat pokyny výrobce odběrových zkumavek na sérum nebo plazmu.
47
Systém AxSYM neověřuje typ použitého vzorku. Za použití správného typu vzorku je zodpovědná
obsluha.Zajistit,
aby
vzorky
před
odstředěním
byly
zcela
koagulovány.Koagulace některých vzorků může trvat delší dobu, zejména pokud se jedná o vzorky od pacientů, jimž byly podávány antikoagulant, nebo od pacientů, kteří podstoupili trombolytickou léčbu. Je-li centrifugován neúplně koagulovaný vzorek, přítomnost fibrinu může způsobit chybné výsledky.Vzorky obsahující pevné částice nebo erytrocyty mohou poskytovat nekonzistentní výsledky a musí se před vyšetřením odstředit (doporučená RCF (relativní odstředivá síla): 8 000 – 10 000 x g po dobu 10 minut). Vzorky lze před vyšetřením skladovat při teplotě 2 –8 oC max. 24 hodin. Všechny vzorky ( vzorky od vložení do systému
pacientů, kontroly
a kalibrátory) vyšetřit do 3 hodin od
AxSYM, aby se minimalizoval vliv odpařování. Zkontrolovat
všechny vzorky, zda neobsahují bubliny. Před vyšetřením případné bubliny odstranit. Během přepravy musí být vzorky zabaleny a označeny v souladu s příslušnými předpisy pro přepravu klinických vzorků a etiologických agens. Objem vzorku Objem vzorku potřebný k provedení jednoho testu neředěného vzorku závisí na typu použité nádobky. Při použití vzorkové nádobky (Sample Cup) je pro rutinní test požadováno 150 µl a pro statimový test 94 µl. Pro každý další rutinní nebo statimový test AxSYM Phenobarbital prováděný z téže nádobky je třeba dalších 44 µl vzorku. Systém AxSYM vypočítává minimální objem vzorku ve vzorkové nádobce pro oba režimy testování (statimový i rutinní) ředěných i neředěných vzorků. Požadovaný objem se objeví na obrazovce Objednávka (Order) při objednávání testů. Pokud je metoda nastavena na automatické opakování testu,/ automatické ředění (Auto Retest/ Auto Dilution),přídavný objem vzorku pro opakovaný test se na obrazovce Objednávka (Order) při objednávání testů neobjeví.Z tohoto důvodu by měl celkový objem vzorku zahrnovat i přídavný objem 44 µl vzorku. Informace o požadovaných objemech vzorků v primárních nebo alikvótních zkumavkách
a
požadovaných
objemech kalibrátorů / kontrol pro více šarší reagencií jsou uvedeny v Uživatelské příručce systému AxSYM. Pro získání požadovaného objemu kalibrátorů a kontrol AxSYM Phenobarbital držet lahvičky ve svislé poloze a do příslušných nádobek nadávkovat po 4 kapkách jednotlivých kalibrátorů nebo kontrol. 48
Provedení metody AxSYM Phenobarbital Dodávaný materiál 7A70-20 Sada reagencií AxSYM Phenobarbital obsahující: AxSYM Phenobarbital Reagent Pack 100 Reaction Vessels Požadovaný materiál, který není součástí sady 7A70- 01
Standardní kalibrátory AxSYM Phenobarbital
7A70- 10
Kontroly AxSYM Phenobarbital
8A46
Solution 4Line Diluent
9A35 – 10
AxSYM Probe Cleaning Solution
8A76 – 01
Sample Cups
Automatická pipeta a pipetovací špičky.
Postupy řízení kvality Kalibrace Metoda AxSYM Phenobarbital se kalibruje pomocí šestibodové standardní kalibrace. Standardní kalibrace Při standardní kalibraci metody se změří v duplikátu standardní kalibrátory A,B,C,D E a F. Pro vyhodnocení kalibrace metody musí být jedenkrát zanalyzovány všechny hladiny kontrol AxSYM. Jakmile je kalibrace metody akceptována a uložena do paměti, mohou být všechny následující vzorky vyšetřovány bez další kalibraci až do okamžiku ,kdy: Je použita reagenční souprava nové výrobní šarše. Hodnoty kontrol se nacházejí mimo stanovená rozmezí. Systém AxSYM prověřuje, zda výsledky kalibrace metody vyhovují
podmínkám
stanoveným
v parametrech
pro
platnost
kalibrace.Pokud kalibrace tyto podmínky nesplňuje, zobrazí se chybové hlášení. Nápravná opatření pro
jednotlivá
chybová hlášení jsou uvedena v Uživatelské
příručce.
49
Ověření kalibrace obsluhou Přijatelná kalibrační křivka AxSYM Phenobarbital musí splňovat následující kriteria: a)
Odchylka polarizace (PEER –Polarization Error) pro všechny kalibrátory je v rozmezí –3,00 až +3,00.
b)
Střední kvadratická odchylka (RMSE – Root Mean Squared Error) je nižší nebo rovna 2,00.
c)
Hodnoty nízké, střední a vysoké kontroly se nacházejí
v přijatelných
rozmezích.
Kontrola kvality Doporučený požadavek na kontrolu metody AxSYM Phenobarbital je provést jedenkrát test minimálně dvou různých hladin kontrol AxSYM Phenobarbital, které vymezují rozsah pro lékařské hodnocení, v průběhu 24 hodin každého dne provozu. Kontroly lze umístit na libovolnou pozici vzorkového karuselu. Jestliže systém kontroly kvality v laboratoři vyžaduje k ověření výsledků vyšetření častější používání kontrol, postupuje se v souladu s tímto požadavkem. Pro dosažení maximální stability reagencií vložených v přístroji se doporučuje častější používání kontrol k monitorování funkčnosti reagenčních souprav téže šarše.
Známky nestability nebo zhoršení kvality reagencií Jestliže se hodnoty kontrol nacházejí mimo stanovená rozmezí, může to být známkou zhoršení kvality reagencií nebo chyb technického rázu.Výsledky přidružených testů jsou neplatné a testy se musí opakovat. V případě potřeby metodu rekalibrovat. Další informace o odstranění chybových hlášení jsou v Uživatelské příručce. Systém AxSYM umožňuje pro každou provedenou kontrolu kvality metody sestrojit Levey-Jenningsův diagram. Na data získaná při kontrole kvality lze dle uvážení aplikovat pravidla pro kontrolu kvality platná pro konkrétní laboratoř. Výsledky Metoda AxSYM Phenobarbital používá k sestrojení kalibrační křivky metodu prokládání čtyřparametrové logistické křivky (4PLC- 4 –Parameter Logistic Curve Fit, y-vážené) Kalibrační křivka je uložena do paměti a koncentrace léku v kontrolách 50
a neznámých vzorcích se z ní odečítají s použitím naměřených hodnot polarizované fluorescence. Příznaky Některé výsledky mohou obsahovat informace v poli příznaků (Flags). Vzorky označené příznakem LL (parametr č.75, Low Extreme Value) musí být před vydáním výsledků zkontrolovány.Výsledky, které se rovnají nebo blíží senzitivitě metody, se musí před vydáním koncentrace léku ověřit.
Omezení metody Hodnoty fenobarbitalu (jako každého s informacemi získanými
analytu)
musí
být užívány v souladu
klinickým hodnocením a ostatními diagnostickými
postupy. Postup při ředění vzorků Automatické ředění Vzorky od pacientů s koncentracemi fenobarbitalu vyššími než 80,00µg/ml lze automaticky ředit. Systém AxSYM automaticky vypočte koncentraci zředěného vzorku a vydá výsledek. Další informace o objednávání ředění vzorků jsou uvedeny v Uživatelské příručce.
Manuální ředění Vzorky od pacientů, jejichž koncentrace fenobarbitalu jsou při použití automatického ředění vyšší než 320,00µg/ml, lze nebo rovna 2,00. manuálně zředit 10x: přidejte 1 objemový díl vzorku od pacienta do 9 objemových dílů kalibrátorů A AxSYM Phenobarbital. Zopakujte test za použití takto manuálně zředěného vzorku. Pro získání výsledné koncentrace vzorku musíte koncentraci naměřenou systémem AxSYM vynásobit faktorem manuálního ředění.
51
výsledná c = naředěná c
x
faktor manuálního zředění
c = koncentrace V= objem
Očekávané hodnoty Byly zjištěny významné korelace mezi hladinou fenobarbitalu v séru a léčebnými účinky nebo toxicitou.(11) Klinické studie naznačují, že toxické účinky fenobarbitalu jsou zvýšené u pacientů s onemocněním ledvin.(12) Toxicita fenobarbitalu primárně ovlivňuje CNS. Toxické hladiny mohou způsobit nystagmus, závratě a ataxii. U nízkého počtu pacientů dochází k přecitlivělosti na fenobarbital.(13) U některých dlouhodobě léčených pacientů se může vyskytnout makrocytóza a megaloblastická anémie nebo osteomalacie. (14-16) U většiny pacientů budou záchvaty pod maximální kontrolou, budou-li hladiny fenobarbitalu v séru v rozmezí 15 –40 µg/ml.(17) Informace o správném dávkování fenobarbitalu a o době odběru krve vhodné pro jeho monitorování naleznete v příbalovém letáku podávaného léku nebo v publikaci Physicians´ Desk Reference (PDR).
52
Specifické charakteristiky metody Přesnost Přesnost byla stanovena na základě protokolu EP5-T2 NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) za použití lidského séra obohaceného fenobarbitalem o koncentracích 15,0 30,0 a 50,0 µg/ml. Výsledky těchto studií obvykle vykazovaly variační koeficient (CV) nižší než 5 % . Tabulka 4 Reprezentativní údaje pro přesnost metody AxSYM Phenobarbital za použití lidského séra obohaceného fenobarbitalem požadovaná hodnota koncentrace (µg/ml) (n = 80) 15,0 30,0 50 ,0 průměrná hodnota 15,61 30,52 49,36 SD v rámci jedné série vyšetření 0,35 0,70 1,82 % CV v rámci jedné série vyšetření 2,2 2,3 3,7 SD mezi dny 0,14 0,00 0,95 % CV mezi dny 0,9 0,0 1,9 SD celkem 0,45 1,02 2,15 % CV celkem 2,9 3,4 4,4 SD (Standard Deviation) – směrodatná odchylka % CV (Coefficient of Variation)- variační koeficient vyjádřený v % Správnost metody získaná na základě výtěžku Výtěžek byl stanoven obohacením lidského séra a pufru fenobarbitalem o koncentracích 8,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 40,0 50,0 60,0 a 72,0 µg/ml. Koncentrace fenobarbitalu byla stanovena pomocí metody AxSYM Phenobarbital a k výpočtu výsledného výtěžku (v % ) byl použit následující vzorec.
53
Tabulka 5 Reprezentativní údaje pro správnost metody získané na základě výtěžku Přidaná
koncentrace
koncentrace
koncentrace
v séru
v pufru
výtěžek
(µg/ml)
(µg/ml)
(µg/ml)
(%)
8,00
8,24
8,52
96,7
10,00
10,54
10,55
99,9
15,00
15,79
16,46
95,9
20,00
21,10
21,03
100,3
25,00
26,92
27,00
99,7
30,00
31,52
30,54
103,2
40,00
39,89
41,63
95,8
50,00
50,88
52,11
97,6
60,00
62,36
61,06
102,1
72,00
77,84
76,92
101,2
Průměrný výtěžek : 99,2 ± 2,6 % Senzitivita Bylo vypočteno,že senzitivita metody AxSYM Phenobarbital je 1,10µg/ml. Tato senzitivita je definovaná jako nejnižší měřitelná koncentrace,kterou je metoda schopna rozeznat s 95% spolehlivostí jako nenulovou.
Specifita Byla testována zkřížená reaktivita p-hydroxyfenobarbitalu, hlavního metabolitu fenobarbitalu. Zkřížená reaktivita byla definována jako rozdíl koncentrací vzorků, které obsahovaly fenobarbital i p-hydrofenobarbital, a vzorků, které obsahovaly pouze fenobarbital. Při koncentraci p-hydroxy-fenobarbitalu 22 µg/ml a koncentracích fenobarbitalu 15 resp. 40µg/ml dosáhla zkřížená reaktivita (neboli změna v naměřené koncentraci fenobarbitalu)
20 % (3,0 µg/ml)
resp.
strukturálně podobné fenobarbitalu ( amobarbital,
12 % (4,8 µg/ml). Látky
butabarbital,
pentobarbital
a sekobarbital) vykazují při extrémně vysokých hladinách těchto zkříženě reagujících látek změny v koncentraci fenobarbitalu nižší než senzitivita metody.
54
Interference Metoda AxSYM Phenobarbital vykázala při detekci léku ve vzorcích lidského séra, které byly obohaceny následujícími látkami, chybu nižší než 10 %.
chemická látka
testovaná koncentrace
bilirubin
výsledky
15 mg/dl
chyba< 10 %
hemoglobin
1 000 mg/dl
chyba< 10 %
triacylglyceridy
2 500 mg/dl
chyba< 10 %
celkové proteiny
3,0-10,0
g/dl
chyba< 10 %
Správnost metody získaná na základě korelace Metoda AxSYM Phenobarbital firmy Abbott byla porovnána s další imunoanalýzou využívající fluorescenční polarizaci (FPIA). Výsledky testování vzorků jsou uvedeny níže. Tabulka 5 Srovnání metody AxSYM Phenobarbal f.Abbott s metodou TDx/TDxFLx f. Abbott
Výrobce
počet měření
korelační posun
směrnice
koeficient
Metoda AxSYM Phenobarbital fi. Abbott
100
-0,69
1,02
0,995
v porovnání s metodou TDx/TDxFLx Phenobarbital fi Abbott Rozmezí hodnot vzorků (AxSYM): 1,87 – 61,60 µg/ml.
Uživatelská příručka AxSYM Phenobarbital (48)
55
1.2.Praktická část
Prováděná
ve
VEDILAB
spol.
s
r.o.
,Pod
vrchem
51
,
Plzeň
www.vedilab.cz/index.php
1.2.1. Zpracování odebrané krve ve Vedilabu V laboratoři Vedilabu jsou shromažďovány vzorky krví psů léčených fenobarbitalem. Odebírají se vzorky nejdříve
po 14 dnech po zahájení léčby, kdy je ustálená
plazmatická hladina fenobarbitalu. Venózní krev se odebírá před podáním léku, aby se zachytila nejnižší možná plazmatická hladina. K dalším odběrům přistupuje veterinář, pokud je léčba epileptických záchvatů neuspokojivá, nebo po objevení nežádoucích účinků a je třeba úprava dávky fenobarbitalu. Pro analýzu je požadováno minimálně 1 ml- 1,5 ml krve. Krev je bez antikoagulačních přísad (např. heparin). Krve jsou po odebrání uchovávány v ledničce (-2 - 8 oC) a doba převozu je do 1 hod., max.
do
2hod .
( Uchovává se v chladicím boxu z polystyrénu, v termosce,
v izotermické folii ) . Krve jsou opatřeny průvodkou s datem odběru, charakteristiky druhu zvířete ( kočka, pes, - rasa, kříženec, event. pohlaví, stáří , další specifikace atd.) Jménem majitele, a veterináře, př. názvem zařízení, kliniky, která rozbor žádá. Může se dostavit i sám majitel psa a objednat si zde rozbor. Krve jsou v odběrových zkumavkách pro venózní krev.V laboratoři Vedilabu se přijme nový vzorek, zdokumentuje se příjem, každý vzorek je opatřen pořadovým číslem. Průměrný počet je
8-10 vzorků za týden. Krev musí být dokonale koagulována. Zbytky
fibrinu by způsobily nepřesné výsledky. Shromážděné vzorky s obsahem fenobarbitalu jsou centrifugovány v kyvetách
20 min. při
20 000 otáčkách , vysokoobrátková
chlazená centrifuga zn. Fischer . Provede se odstředění pevných krevních částic. Mikropipetou se opatrně odebere 0,5 ml séra. (Pro vyšetření je důležité, aby oddělení bylo dokonalé. Pevné krevní částice mohou způsobit ucpání mikropipet systému AxSYM Analyzer. (To představuje velmi závažnou komplikaci.) Odebrané sérum je následně zamrazeno při -15oC až -20o C. Po dohodě o termínu analýzy s toxikologickou laboratoří ÚSL Plzeň je převezeno a ponecháno při pokojové teplotě k rozmrazení .
56
1.2.2. Stanovení fenobarbitalu metodou AxSYM Phenobarbital Prováděné v Toxikologické laboratoři Ústavu soudního lékařství v Plzni.
Obr. 4
AxSym Chemistry Analyzer od firmy Abbott Diagnostics Převzato z http://www.kghospital.com/kghDiagLab.html
Používaný v toxikologické laboratoři, umožnuje rychlé a spolehlivé stanovení fenobarbitalu v séru imunoanalýzou využívající fluorescenční polarizaci FPIA.Celý proces je plně automatizovaný a
reprodukovatelný, propojený s počítačovým
programem. 57
Přístroj
je vybaven Software Version 6.00 AxSym Abott systém.V počítači je
naistalován aktualizovaný program AxSym Phenobarbital. Nejprve se provede kalibrace. Do přístroje se vloží kalibrátory A-F viz. Metodická část Vygeneruje se kalibrační křivka, kterou si počítač uloží automaticky do paměti , pak dle ní porovnává a vyhodnocuje. Samotná křivka se nezobrazuje, pouze její parametry lze zobrazit na monitoru počítače.(Pro každou novou šarši je nutno vytvořit novou kalibrační křivku. ) Proces trvá cca 15 min.
Obr. 5 Příklad vyhodnocení kalibrační křivky AxSYM Phenobarbital
Pro jedno stanovení je potřeba 0,100 ml séra. Pipetování se provádí vzorkovou jehlou(Sampling Probe) ručně a toto množství se přenese do
nádobky (Sampling
cup). Obdobně je postupuje u ostatních vzorků séra . Všechny nádobky se do vloží do karuselu přístroje .Ostatní úkony jsou prováděny dle programu automaticky. K tomuto 58
účelu se používá označení reagencií,pipetorů čárovým kódem. Ke vzorku séra je přidáno příslušné množství přípravného roztoku(povrchově aktivní látka v TRIS pufru). Reagenční nádobka se přenese do procesního centra. Zde je další pipetování prováděno procesní jehlou (Processing Probe) Do kyvety se přenese alikvotní podíl ovčí polyklonální protilátky proti fenobarbitalu, přípravný roztok a indikátor značený fluoresceinem. K označeným
vzorkům z Vedilabu se přikládá označený
kontrolní
vzorek dodávaný výrobcem AxSYM. Obvykle se přidává jeden ze tří možností. Probíhá vlastní proces. Fenobarbital přítomný ve vzorku a indikátor značený fluoresceinem soutěží
o vazebná místa na molekulách protilátek. Intenzita polarizovaného
fluorescenčního záření se měří optickým systémem FPIA. Výsledky stanovovaných koncentrací
jsou
zobrazovány na monitoru připojeného počítače a tištěny s
přesností dvě desetinná místa. Pro potřeby zadavatele jsem v tomto případě výsledky zaokrouhlil na 0,5 mg/l. Tento proces trvá dalších cca 15 min.
59
2. Výsledky
Výsledné
hodnoty
zjištěných
koncentrací
fenobarbitalu
jsou zapsány do
příslušných průvodek a stejný zápis se provede v počítači v patologické laboratoři Vedilabu. Jednotlivé výsledky jsou s případným veterinářům.
Celkové vyhodnocení
Tabulky, grafy.
60
komentářem zasílány e-mailem
Tabulka 6 Naměřené hodnoty koncentrací fenobarbitalu,četnosti jejich výskytu v období říjen 2008-duben2010 Koncentrace 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 11,5 12 12,5 13 13,5 14 14,5 15 15,5 16 16,5 17 17,5 18 18,5 19 19,5 20 20,5 21 21,5 22 22,5 23 23,5 24 24,5 25 25,5 26
Počet psů 2 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 2 3 3 1 2 3 2 4 3 3 6 9 8 12 15 14 17 21 23 24 27 28 26 28 26 22 17 16 17 14 16 14 13 12 11
Koncentrace Počet psů 27 8 27,5 8 28 3 28,5 4 29 5 29,5 2 30 2 30,5 3 31 3 31,5 1 32 2 32,5 0 33 1 33,5 0 34 0 34,5 1 1 35 35,5 0 36 0 0 36,5 37 0 37,5 0 38 0 38,5 0 39 1 39,5 0 40 0 0 40,5 41 0 41,5 0 42 0 42,5 0 43 0 43,5 0 44 0 44,5 0 45 0 45,5 0 46 0 46,5 0 47 0 47,5 0 48 0 48,5 0 49 0 49,5 0 50 0 mg.L-1 Celkem 523
61
Obr. 5 Graf č. 1 Sloupcový graf – znázorňuje Tabulku 6
Obr. 6 Graf č. 2 Gaussova křivka vygenerovaná počítačem viz. Tabulka 6
62
Tabulka 7 Rozdělení naměřených hodnot do 3 skupin Nedostatečná hladina Optimální hladina Vysoká hladina
X<15 15<X<30 X>30
9,18% 87,95% 2,87%
x= koncentrace fenobarbitalu v séru
Četnost výskytu [%]
c fenobarbitalu [ mg/l] Obr.5 Graf č.3 Četnost výskytu skupin v závislosti na c fenobarbitalu
63
Tabulka 8 Přehled četnosti plemen , u kterých byla provedena kontrola plazmatických hladin fenobarbitalu
Plemena afghánský chrt akita inu aljašský malamut americký kokršpaněl americký staffordširský terier americký kokršpaněl anglický setr anglický špringršpaněl argentinská doga australský honácký pes barzoj baset bavorský barvář beagle bearded ( vousatá ) kolie belgický ovčák ( tervueren ) belgický ovčák ( mallinois ) bernský salašnický pes border kolie briard borderterier bostonterier brabantík brazilská fila buldog bullmastif bullterier cane corso český fousek čínský chocholatý pes čivava dalmatin dobrman elderterier 64
Počet léčených psů 1 2 2 1 3 4 2 3 2 1 2 1 2 14 2 4 1 12 2 7 1 1 1 5 3 4 7 1 3 2 14 7 8 1
flat coated retriever foxterier francouzský buldoček golden retriever gordonsetr griffon havanský psík hovawart irský setr irský terier irský vlkodav italský chrtík jagdterier jezevčík kavalír king Charles spaniel kernterier kokršpaněl kolie kříženec labrador retriever landseer leonberger lhasa apso maďarský ohař malý hladkosrstý pinč malý knírač mops neapolský mastin německá doga německý ohař německý křepelák německý ovčák německý špic novofoundlandský pes Parson Jack Russel terier peruánský naháč pinč pittbulterier pointer
5 3 8 20 1 2 1 4 3 2 5 1 2 18 8 1 7 4 34 46 1 2 7 2 4 5 5 1 7 6 2 25 5 4 8 1 7 2 1 65
pražský krysařík pudl pudlpointer pyrenejský horský pes sibiřský husky skotský terier staffordširský bulterier staffordširský teriér střední knírač středoasijský pastevecký pes Svatobernardský pes šarpej šeltie ši-tzu šiba inu thajský ridgeback tibetská doga velký knírač velškorgi velššpringeršpaniel velšterier výmarský ohař west highland white terier
3 15 2 1 3 1 12 8 10 2 2 13 1 9 2 1 3 16 7 3 2 5 6
Celkem
523
66
Patologická laboratoř Vedilab K biochemické analýze jaterních testů jsou použity odstředivka : Hettich Rotofix 32 biochemický analyzátor : Mindray BS 200 Tabulka 9 Referenční hodnoty u analytů významných pro diagnostiku jaterních funkcí pes : Sledované analyty ALT AST GMT ALP žluč.kyseliny na lačno žluč.kyseliny po příjmu potravy albumin globuliny celk. bílkoviny
minim. 0,17 0 0 0,54 0 0 27 25 57
maxim. jednotky 1,24 µkat/l 0,54 µkat/l 0,12 µkat/l 3,51 µkat/l 30 µmol/l 50 µmol/l 38 g/l 45 g/l 77 g/l
Při předávkování barbituráty nejčastěji dochází ke zvýšení aktivity ALT a AST, méně často ALP a GMT. Ostatní ukazatele nejsou obvykle ovlivněny. Jaterní enzymy jsou nejčastěji používanými ukazateli jaterní poruchy. Hepatocelulární poškození
je
(alaninaminotransferáza) a jsou
zjišťováno
vyšetření
hladin
sérových
ALT
AST (aspartátaminotransferáza). Jejich velká množství
především v játrech. ALT je cytosolový enzym.AST je cytosolový enzym,
hlavně mitochondriální. Z toho plyne : - lehká jaterní poškození (hlavně permeability membrán) vyšší ALT než AST („zánětlivý“ typ poškození) -těžká jaterní poškození (i organel hepatocytu) vyšší AST než ALT („nekrotizující „ typ poškození) ALT se zvyšuje snáze než AST – screeningový test je ALT Zvýšení hladin transamináz je velice citlivé i na malé změny .Poškození 1g jaterních buněk již vede ke zvýšení hladin sérových transamináz. (54) ALP (alkalická fosfatáza) a GMT ( gamaglutamytranspeptidáza) k jejich zvýšení dochází při cholestáze.(54) 67
IV. DISKUZE
68
Fenobarbital je nejčastěji indikovaným lékem v monoterapii epileptických záchvatů u psů. (21) Vhodné je jeho dávkování 2 x denně, při důsledném compliance je navozena stabilní plazmatická hladina fenobarbitalu. (43) Většina antiepileptik
používaných v současné době v humánní medicíně
není využitelná pro terapii psů. Při léčbě jsou buď neúčinná, nebo mají nevhodný interval dávkování, vysokou cenu.(47) Léčba epilepsie vyžaduje dlouhodobé chronické užívání léků. To u psů představuje zhruba od stanovení diagnózy do konce života období 10 až 15 let. Z tohoto hlediska je důležité monitorování hladin fenobarbitalu rychlou a dostatečně přesnou metodou z důvodu zdílnosti
dosažených
plazmatických
hladin
v závislosti na dávce/kg
hmotnosti psa nejen u jednotlivých plemen , které se u psů vyznačují neobyčejnou variabilitou, ale i rozdílností
individuální. Tato studie potvrdila zvýšený výskyt
epilepsie u těch plemen, které uvádí literatura.(21) Tento fakt je třeba akceptovat a přihlížet k němu při diagnostice a léčbě epilepsie.Nejzávažnějším toxickým příznakem dlouhodobého užívání fenobarbitalu je hepatotoxicita .(51) Příznaky jako únavnost, malátnost, nevýkonnost mohou být připisovány neurotoxickým příznakům fenobarbitalu. Poškození jaterních funkcí způsobuje hromadění dusíkatých látek v mozku. Ty samy o sobě mohou způsobovat křeče a zvyšovat tendenci k vyvolání epileptického záchvatu. Prognóza úspěšnosti léčby se zhoršuje. Doporučuje se 2 x ročně provést kontrolu jaterních testů,aby se předešlo toxickým účinkům fenobarbitalu.(53)
Ty se začínají
projevovat při překročení
plazmatické hladiny nad 30 mg/l – 35mg/l. (53) Tyto příznaky jsou v počátečních fázích nepozorovatelné, a proto je z dlouhodobého hlediska léčby vhodné doporučit pravidelné sledování jaterních testů. Některé studie uvádějí účinnou plazmatickou hladinu v hodnotách blížícím se 45 mg/l.(43) Většinou se nedocílí úplného stavu bezzáchvatovosti, sníží se ale intenzita a četnost záchvatů. U psů je třeba vždy volit kompromis mezi dostatečnou kontrolou epileptických záchvatů hepatotoxicitou.(21) Současná terapie epileptických záchvatů u psů představuje vysokou účinnost konzervativní léčby fenobarbitalem a KBr v součinnosti s moderními a důslednými metodami
monitorování
plazmatických
a biochemických jaterních testů.
69
hladin
koncentrací
fenobarbitalu
Je nutno mít na zřeteli, že je výhodné nasadit počáteční dávku,tak aby se výsledné hodnoty plazmatických koncentrací, jak ukazuje Graf č.1 pohybovaly v optimálním rozmezí a počítat s možným zvýšením dávky v důsledku intolerance fenobarbitalu vzniklou na podkladě jaterní enzymové indukce cytochromu P450. Za pomoci výše uvedeného postupu jsme schopni dále rozhodnout o způsobu pokračování léčby, maximalizovat léčebné účinky, minimalizovat rizika a zkvalitnit život jednotlivce postiženého epilepsií.
70
V. ZÁVĚR
71
1.
Metodou AxSYM
Phenobarbital , imunoanalýzou využívající
FPIA
jsme
zjistili v období říjen 2008 – duben 2010 u souboru psů různých plemen s výskytem epileptických záchvatů hladiny fenobarbitalu v séru. 2.
Pro vyhodnocení četnosti dosažených hladin jsem použil grafy : Graf č.1, Graf č. 2
3.
Na základě vyhodnocení výsledků jsem dále rozdělil hodnoty koncentrací
4.
(dále jen c ) do 3 skupin: Graf č.3
A)
c <15 mg/l
uvedená c odpovídá nedostatečné kontrole plazmatické hladiny
fenobarbitalu
B)
15< c <30 mg/l vhodná, většinou dostačující plazmatická hladina fenobarbitalu
ke kontrole epileptických záchvatů
C) c > 30 mg/l z dlouhodobého hlediska je hladina fenobarbitalu nevyhovující. Je doporučeno jí snížit. Ve skupině C)
lze doporučit postupné snížení dávek
fenobarbitalu a nasazení IPLP s obsahem KBr – kapslí nebo roztoku.KBr není hepatotoxický a zlepšuje výsledky antiepileptické léčby. Podobně se doporučuje postupovat i ve skupině B), pokud se objeví zvýšené hladiny jaterních testů. V případě vysokých hodnot
jaterních testů zvážit možnost
převést psa na monoterapii KBr. 4. Tato studie potrdila zvýšený výskyt epilepsie u těch plemen, které uvádí literatura.(21)
72
VI. ZKRATKY
73
¬
pevná fáze pro navázání protilátky
Agn
antigen
Agn PI
imunokomplex
AISLP
automatizovaný informační systém léčivých přípravků
ALP
alkalická fosfatáza
ALT
alaninaminotransferáza
AST
aspartátaminotransferáza
c
koncentrace
C1
chloridový anion
CNS
centrální nervová soustava
ComIP
Kompendium InfoPharm
Control |L|
control low –kontrola s nízkou hodnotou
Control |M|
control medium- kontrola se střední hodnotou
Control |H|
control hight
CT
počítačová tomografie
CV
variační koeficient
- kontrola s vysokou hodnotou
CYP2C9,CYP2C19, CYP2E1
jaterní cytochromy, enzymy
DE50
efektivní dávka, která u 50% jedinců vyvolá požadovaný účinek
E
enzym
EDTA
etylendiamintetraoctová kyselina
EEG
elekroencefalogram
EIA
enzymoimunoanalýza
ELISA
enzymoimunoanalýza
EKG
elektrokardiograf
EMIT
homogenní enzymoimunoanalýza
f
faktor
F
fluorofor
FIA
fluoroimunoanalýza
FCI
Federation Cynologique Internacionale (mezinárodní kynologická federace)
FPIA
Fluororescenční polarizační imunoanalýza
FRAT
technika volných radikálů
GABA
gamma-aminomáselná kyselina 74
GMT
glutamyltransferáza
H
hapten
HbsAg
povrchový antigen viru hepatitidy B
HIV-Agl/HIV-Ag2
antigen viru HIV 1, HIV 2 lidské imunodeficience
Hz
hertz, jednotka kmitočtu
ILAE
International League Against Epilesy (mezinárodní liga proti epilepsii)
IUPAC
International Union of Pure and Applied Chemistry Nomeclature -Mezinárodní unie pro čistou a užitou chemii názvosloví
i.p.
intraperitoneální
i.v.
intravenózní
KBr
bromid draselný
LIA
luminoimunoanalýza
LD50
letální dávka, která u 50% jedinců způsobí smrt
mA
miliampér
M
značkovací invektor
MRI
Magnetická rezonance
NADH
nikotinamidadenindinukleotid -koenzym
OSHA
standardy krevních patogenů
P450
hepatický enzymový systém cytochromu P450
PEER
odchylka polarizace
pH
záporný dekadický logaritmus koncentrace vodíkových iontů
PI
protilátka
p.o.
perorální
RIA
radioimunoanalýza
RMSE
střední kvadratická odchylka
RTG
rentgen
SD
směrodatná odchylka
sec.
sekunda
SPC
souhrn údajů o přípravku
USL
Ústav soudního lékařství
USP
United States Pharmacopea – Lékopis USA
V
objem 75
VII. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
76
1. Jolley ME. Fluorescence polarization immunoassay for determination of therapeutic drug levels in human plasma J Anal Tox 1981; 5:236-40.
2. Jolley ME, Stroupe SD,Schwenzer KS,et al. Fluorescence polarization immunoassay III. An automated systém for terapeutic drug
determination. Clin Chem 1981; 27:
1575-9.
3. Buchthal
F,
Lennox-Buchthal
MA.
Phenobarbital:Relation
of
serum
concentration to control seizures. In: Woodbury DM, Penny JK, Schmidt RP, eds. Antiepileptic drugs. New York,NY: Raven Press,1972; 335-43
4. Glazko AJ.Antiepileptic drugs; Biotransformation, metabolism,and serum half-life. Epilepsia 1975; 16:367-91.
5. Kutt H, Penny K. Usefulness of blood levels of antiepileptic drugs, Arch Neurol 1974;31:283-8.
6. Waddell WJ, Butler TC. The distribution and excretion of
phenobarbital..J Clin
Invest 1957; 36:1217-26.
7. US Department of Labor, Occupation Safety and Health Administration,29 CFR Part 1910.1030,Occupational Exposure to Bloodborne Pathogens; Final Rule. Federal Register 1991; 56(235):64175-82.
8.
US Department of Health and Human Services, Biosafety in Biochemical Laboratoriets,Fourth Edition.
Microbiological and
Washington,DC: US Government
Printing Office ,May 1999.
9.
World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual. Geneva: World Health Organization,1993.
77
10. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Protection of Laboratory Workers from Occupationally
Acquired infections; Approved Guideline-Second
Edition. NCCLS Document M29-A2, Wayne,PA; NCCLS,2001.
11. Buchthal F,Svensmark O. Aspects of the pharmacology of phenytoin (Dilantin) and phenobarbital relevant to their dosage in the treatment of epilepsy. Epilepsia 1960; 1:373-84.
12. Butler
TC,
Mahaffee
C,
Waddell
WJ.Phenobarbital:
Studies
of
elimination,accumulation,tolerance, and dosage schedules.J PharmacolExp Ther 1954 ;111:425-35.
13. Svensmark O, Buchthal F. Accumulation of phenobarbital in man. Epilepsia 1963; 4:199-206.
14. McGeachy TE, Bloomer WE. The phenobarbital sensitivity syndrome. Am Med 1953 ; 14:600-4.
15. Dent CE, Richens A, Rowe DJF, Stamp TCB Osteomalacia with long Term anticonvulsant therapy in epilepsy. Br Med J 1970; 4:69-72.
16. Hawkins CF, Meynell MJ. Macrocytosis and megaloblastic anemia in Epileptics ond anticonvulsant drugs. O.J Med 1956; 25:567-8.
17. Buchthal F, Svensmark O. Serum concentration of diphenylhydantoin (Phenytoin) and phenobarbital and their relation to therapeutic and
toxic effects.
Psychiatr Neurol Neurochir 1971; 74:117-36
18. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Evalutionof clinical chemistry devices-Second Edition; Tentative Guideline. NCCLS document EP5-T2 (ISBN 1-56238-145-8). NCCLS, 771 East Lancaster Avenue, Villanova,Pennsylvania 19082, 1993.
78
19. Kolektiv autorů , Příruční slovník naučný, Academia, nakladatelství Československé akademie věd, 1966:str .564-565 20. Smrčková Lea, Smrček Martin, Kapesní atlas psů, Art artea, 1997, str.7 21. Chandler, K. Canine epilepsy. What can we learn from human seizure disorders? The Veterinary Journal 2006: 172:207-217 22. Šrenk Pavel , Epilepsie psů , Dipl. ECVN Klinika Jaggy, Brno 1998, uveřejněno se souhlasem MVDr.Čápa ,www. veterina-info.cz (staženo 11/2008)
23. Koestner, Adalbert DVM Ph.D.: Neuropathology of Canine Epilepsy. Problems in Veterinary Medicine 1989, 1:4, 516-534
24. Cunningham, James G. DVM Ph.D. and George C. Farnbach VMD Ph.D.: Inheritance and Idiopathic Canine Epilepsy. Journal of the American Animal Hospital Association, February 1987, pp. 421-424.
25. Shell, Linda G., DVM Dipl. ACVIM: Understanding the Fundamentals of Seizures. in Symposium on Seizure Disorders, Veterinary Medicine, July 1993, pp. 622-628.
26. Oliver John E. Jr., Michael D. Lorenz: Chapter 14, Seizures and Narcolepsy. Handbook of Veterinary Neurology, 2nd edition, W.B. Saunders, Philadelphia, PA, 1993.
27. Mahaffey, Mary DVM: Epilepsy in the Tervueren. In Tervueren News Tales, newsletter of the American Belgian Tervueren Club. Fall 1980, pp. 9-10.
79
28. Oliver, John E. Jr., Kevin McElfresh, Mary Mahaffey: Epilepsy in the Tervueren: Progress Report. In Tervueren News Tales, newsletter of the American Belgian Tervueren Club, April, 1983, p. 2.
29. Dodds, W. Jean DVM: Letter to the Editor, Pointer Points, Spring 1992
30. Kay, William J. DVM: What is Epilepsy? Problems in Veterinary Medicine 1989 1:4, 495-500
31. Dyer, Karen R. DVM Ph.D. and Linda G. Shell DVM Dipl. ACVIM. Managing Patients with Status Epilepticus. Veterinary Medicine, July 1993, pp. 654-659.
32. de Lahunta, Alexander DVM Ph.D: Special Report - Seizures: How They Happen and What You Can Do. (Handout).
33. Shell, Linda, G., DVM Dipl. ACVIM: The Differential Diagnosis of Seizures. In Symposium on Seizure Disorders, Veterinary Medicine, July 1993, pp. 629-640.
34. Fenner, William R. DVM and Julie A. Haas DVM: Mechanisms of Seizure Disorders. Problems in Veterinary Medicine, 1:4, 1989, pp. 501- 516,
35. Epilepsia Copyright 2004 International League Against Epilepsy Copyright 2004 ,Vol. 45, 9 Pages: 1141-1149
36. Pearce, Laurie, DVM: Potassium Bromide as an Adjunct to Phenobarbitol for the Management of Uncontrolled Seizures in the Dog. Progress in Veterinary Neurology 1990, 1:1, 95-101
80
37. Podell, M., and Fenner, W.R. Bromide Therapy in Refractory Canine Epilepsy. Journal of Veterinary Internal Medicine, 7: 1993 ,318- 327
38. Macdonald RL, Rogers CJ, Twyman RE. Barbiturate regulation of kinetic properties of the GABAA receptor channel of mouse spinal neurones in culture. J Physiol 1989;417: 483–500.
39. Frey, H.H. DMV: Anticonvulsant Drugs Used in the Treatment of Epilepsy. Problems in Veterinary Medicine 1989, 1:4, 558-577
40. Pearce, Laurie, DVM: Potassium Bromide as an Adjunct to Phenobarbitol for the Management of Uncontrolled Seizures in the Dog. Progress in Veterinary Neurology 1990, 1:1, 95-101
41. Yohn, Susan E. DVM MS, Wallace B. Morrison DVM MS, and Patrick E. Sharp DVM: Bromide Toxicosis (bromism) in a dog treated with potassium bromide for refractory seizures. JAVMA 1992, 201:3, pp.468- 470
42. Sisson, Allen, DVM MS and Richard A. LeCouteur BVSc Ph.D. Letter to the Editor re: Potassium Bromide as an Adjunct to Phenobarbitol for the Management of Uncontrolled Seizures in the Dog by Progress in Veterinary Neurology 1990, 1:2, 114-116
43. Farnbach, George C. VMD Ph.D.: Seizures in the Dog. Part I. Basis, Classification, and Predilection. The Compendium of Continuing Education, Cont. Ed. Article #6,1984, 6:6, 569-574
44. Farnbach, George C. VMD Ph.D.: Seizures in the Dog. Part II. Control. The Compendium of Continuing Education, Cont. Ed. Article #5,1985, 7:6, 505-510
81
45. LeCouteur, Richard A. BVSc Ph.D., and Georgina Child, BVSc: Clinical Management of Epilepsy of Dogs and Cats. Problems in Veterinary Medicine 1989, 1:4, 578-595
46. LeCouteur, Richard A. BVSc Ph.D., and Georgina Child, BVSc: Clinical Management of Epilepsy of Dogs and Cats. Problems in Veterinary Medicine 1989, 1:4, 578-595
47. Mikro-verze AISLP-CR 2010.2, stav k 1.4.2010, http://www.aislp.cz
48. Abbott Axsym ®System Phenobarbital, Abbott Laboratories Diagnostics Division, Phenobarbital REF 7A70-20 ,May 2003, Mart ,2006, pp. 1-7
49. Dagmar Lincová, Hassan Farghali et al. - Základní a aplikovaná farmakologie, Galén, Univerzita Karlova v Praze, Nakladatelství Karolinum, dotisk prvního vydání - 2005, str. 150-151
50. Kompendium InfoPharm, Phenobarbital , verze 2.42, 2003
51. SPC Phenaemal,datum revize textu,7.10.2009 (č.j.159345-46/2009)1996/03/12,2009/03/25/X,2009/10/07/M 52. Huml Oto, Sylaby /6 Vedilab-Imunochemické metody , Vedilab, 6/ 2008, str . 4 -12
53. http//well-vet.cz/clanky/clanek .php?=2006-02-26% 2014:55:18, Veterinární klinika Well-Vet (staženo 01/2010),str. 3 54. Brodanová M., Mareček Z., Jaterní onemocnění, Od podezření k diagnóze, RhonePoulenc Rorer 2007, str.29-31
82
VIII. ABSTRAKTY
83
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Kandidát: Milan Černohlávek Školitel : MVDr. Oto Huml Název diplomové práce: Riziko intoxikace barbiturátů u psů léčených na epilepsii
Epilepsie je nejčastějším chronickým neurologickým onemocněním u psí populace. Její výskyt je přibližně 5-5,7%. Pro úspěšnou léčbu je důležitá správná a včasná diagnostika. V tomto případě je obzvlášť důležitá komunikace s chovatelem psa a jeho spolupráce. Po vyloučení všech možných dalších příčin křečí biochemickými a zobrazovacími metodami je nasazena antiepileptická léčba. Z mnoha hledisek je nejúčinnějším způsobem léčby monoterapie fenobarbitalem. K dosažení úspěšnosti léčby je nutné dosáhnout optimální plazmatické koncentrace fenobarbitalu. Zde dochází k rozdílnostem co se týče plemen i každého jednotlivého psa, a proto se po určitém časovém intervalu přistupuje k ověření plazmatických hladin. Jako velice výhodnou metodou se jeví FPIA Phenobarbital. Tato práce je zaměřena na vyhodnocení sledovaných koncentrací fenobarbitalu z hlediska
AxSYM
plazmatických
antiepileptické účinnosti a toxicity. Z důvodu
dlouhodobého užívání je nutné se zaměřit na hepatotoxicitu a sledování hladin příslušných jaterních enzymů biochemickými metodami v doporučených časových intervalech. Při řešení problémů vyplývajících z antiepileptické léčby se veterináři inspirují novými poznatky při léčbě lidské epilepsie. A přestože je zde celá řada odlišností, lze najít i styčné body, např. četnost výskytu epilepsie u lidské populace se pohybuje přibližně kolem 2-5%.
84
Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Candidate: Milan Černohlávek Supervisor: MVDr. Oto Huml Title of diploma thesis: The Intoxication Risk in Dogs Treated for Epilepsy
Epilepsy is the most common chronic neurological disease in the dog population. Its incidence is approximately 5-5,7%. For successful treatment is important the correct and early diagnosis. In this case, it is especially important to communicate with the dog breeder and his co-operation. After exclusion of all other possible causes of seizures and biochemical imaging approach is to start a anti-epileptic therapy. In many aspects the most effective way is phenobarbital monotherapy. To achieve successful treatment is necessary to have optimal plasma concentrations of phenobarbital. Here there are disparities in terms of breed and each dog, and therefore, after a time interval to check the plasma concentration of fenobarbital . As a very convenient method seems FPIA AxSYM Phenobarbital. This work focuses on analysis of observed plasma concentrations of phenobarbital in terms of anti-epileptic efficacy and toxicity. Due to prolonged use is necessary to focus on hepatotoxicity and monitoring the levels of liver enzymes via biochemical methods at the recommended intervals. Address problems arising from antiepileptic treatment with vets inspire new developments in the treatment of human epilepsy. And although there are many differences, you can also find points of contact, such as the incidence of epilepsy in the human population is moving around 2-5%.
85
