UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biochemických věd
SOUČASNÉ TRENDY VE VÝVOJI NOVÝCH ANTHELMINTIK Bakalářská práce
Vedoucí bakalářské práce: Doc. Ing. Barbora Szotáková, Ph.D.
Hradec Králové 2013
Tereza Dědková
PROHLÁŠENÍ „Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.“
V Hradci Králové Podpis:
PODĚKOVÁNÍ Touto cestou bych chtěla poděkovat paní Doc. Ing. Barboře Szotákové, Ph.D. za její věcné připomínky a pomoc při sepsání bakalářské práce a také svojí rodině a přátelům za podporu a trpělivost při psaní bakalářské práce.
OBSAH ÚVOD
5
1. ZÁKLADNÍ CHARAKTERISTIKA PARAZITICKÝCH HELMINTŮ
6
1.1 Trematoda
7
1.2 Cestoda
9
1.3 Nematoda
11
2. POUŽÍVANÁ ANTHELMINTIKA
15
2.1 Antinematoda
15
2.2 Antitrematoda
19
2.3 Anticestoda
20
3. NEBEZPEČÍ VZNIKU HELMINTOREZISTENCE
22
4. NOVÁ ANTHELMINTIKA
27
4.1 Aminoacetonitrilové deriváty (AADs)
27
4.1.1 AAD 1566: monepantel
28
4.2 Derquantel
30
5. DALŠÍ MOŽNOSTI V BOJI PROTI HELMINTŮM
32
5.1 Kombinace anthelmintik
32
5.2 Vakcinace
32
5.3 Rostlinné alternativy
33
ZÁVĚR
35
POUŽITÁ LITERATURA A OSTATNÍ ZDROJE
36
ÚVOD Jako anthelmintika se označují přípravky, které se používají k léčbě chorob způsobených parazitickými červy - helminty. Tento výraz vznikl z řeckého slova helmins, helmintos a znamená červ. Pak tedy onemocnění způsobené cizopasnými parazitujícími červy nebo jejich infekčními stádii označujeme jako helmintózy (Anthelmintika- Velký lékařský slovník). Helmintózy se vyskytují jak u lidí, tak u zvířat. U lidí v rozvinutých zemích se jedná spíše o výjimečnou záležitost. Nákaza helminty je velmi častá v tropických a subtropických oblastech Asie a Afriky. I u nás se vyskytují některé druhy helmintů působících helmintózy - například: enterobiázy, askariózy, trichinelózy, teniázy, schistosomózy,… (Terapie- Multimediální trenažér plánování ošetřovatelské péče). Člověk se většinou nakazí konzumací nedostatečně tepelně upraveného masa, pitím kontaminované vody, nedostatečnou hygienou, špatně omytou zeleninou, která byla potřísněna močí nebo stolicí hostitelů parazitů, kde se vajíčka parazitů vyskytují. Helmintózy jsou aktuální u všech obratlovců, negativními projevy parazitace zvířat jsou nepřímé i přímé ztráty v jejich užitkovosti (chovatelská, produkční, reprodukční). Mnohé helmintózy jsou i zoonózami (Lamka a Ducháček 2006). U zvířat se anthelmintika podávají především preventivně a pak je - li to nutné léčebně. Anthelmintika u lidí jsou podávána pouze z léčebného hlediska. Prevence a léčba helmintóz zvířat zahrnuje kombinaci zoohygienických opatření a využívání velmi rozsáhlé skupiny značně různorodých léčiv s anthelmintickými účinky (Lamka a Ducháček 2006). Cílem mé práce je seznámit čtenáře s problematikou současně používaných anthelmintik, s riziky vzniku helmintorezistence a jak jí předcházet. Část mé práce je věnována aminoacetonitrilovým derivátům, které se ukázaly jako nová naděje v boji proti vícečetné lékové rezistenci u helmintů. Možnost, jak vzdorovat helmintorezistenci, nabízí i kombinace anthelmintik nebo využití rostlin jako nových potencionálních anthelmintik.
5
1. ZÁKLADNÍ CHARAKTERISTIKA PARAZITICKÝCH HELMINTŮ Organismy v přírodě nikdy nežijí osamoceně, ale společně s dalšími (Volf et al. 2007). Organismy mezi sebou udržují určité vztahy, které v případě dvou rozdílných populací nesou určité výhody a nevýhody. Jedním z typů tohoto soužití je parazitismus. Kořínková
(2006)
definuje
parazitismus
jako
koexistenční
vztah
dvou
heterospecifických organismů, z nichž jeden získává výhody na úkor druhého nebo ho nějakým způsobem poškozuje. Snahou parazita je najít vhodného hostitele, který mu zajistí výživu a možnost rozmnožovat se a dál se šířit. S tím je spojena adaptace parazita na hostitelské prostředí - umět vniknout do hostitele a uchytit se v něm, přizpůsobit se fyzikálněchemickým podmínkám hostitele a umět vzdorovat jeho obranným systémům. Parazitologie je interdisciplinární obor zabývající se studiem parazita a jeho vztahů s hostitelem a vnějším prostředím. Pod parazitologii spadá i helmintologie. Helminti tvoří velice různorodou a ontogeneticky velice variabilní skupinu živočichů. V parazitologických učebnicích se někdy pod pojmem helmint rozumí jen organismus parazitující v určité fázi ontogenetického vývoje v obratlovci (Volf et al. 2007). Byla snaha pro helminty vytvořit vlastní taxon, ale to se nezadařilo. Souhrnně se proto jako helminti označuje sloučení skupin nepříbuzných organismů, které charakterizuje bilaterálně souměrné tělo. Toto označení bylo zavedeno pro praktické účely některých vědních disciplín (Volf et al. 2007). Mezi helminty se řadí organismy z neodermátního kmene Plathelminthes (třída Trematoda, Cestoda, Monogenea), kmen Nemathelmithes (třída Nematoda) a kmen Acanthocephala (třída Acanthocephala). V této části své práce se budu věnovat obecné charakteristice tříd Trematoda, Cestoda a Nematoda. Jedná se totiž o nejrozšířenější helminty, jak u zvířat, tak u lidí. Bez znalosti biologie parazitů totiž nelze pochopit patogenezu nemoci ani principy protiepidemických, preventivních a léčebných opatření (Jíra 1998). Znalost životního cyklu parazita je důležitá pro výběr vhodné léčby. Životní cyklus zahrnuje všechny jevy, které probíhají v komplexu parazit - hostitel - prostředí od vzniku vajíčka v mateřském jedinci do smrti z tohoto vajíčka vzniklého potomstva, včetně všech vývojových stádií dceřiných jedinců morfologicky nestejnorodých s jedincem mateřským (Kořínková 2006).
6
Helminti zpravidla prožívají několik fází vývoje, jejich životní formy se šíří v populacích prostřednictvím hostitelů (Jíra 1998). U helmintů rozlišujeme dva typy cyklů. Jedná se o typ přímý (monoxenní), kdy se helmint spokojí jen s jedním hostitelem a další mezihostitele nevyužívá. Vývoj některých jeho stádií probíhá ve vnějším prostředí - nejčastěji v půdě (Jíra 1998). Helminti s tímto vývojovým cyklem se označují jako geohelminti. Helmint, který ke svému vývoji potřebuje více než jednoho hostitele, se označuje jako biohelmint. Jeho vývoj je nepřímý (heteroxenní), larvální formy parazita se vyvíjejí v mezihostitelích (Jíra 1998). Pravděpodobnost realizace těchto cyklů zajišťuje neobyčejně vysoká fertilita helmintů, protože jen nepatrná část vyloučených vajíček nebo embryí má naději na přežití (Jíra 1998). Helminti tvoří nesporně součást našich životů a proto je důležité o nich vědět, co nejvíce.
1.1 Trematoda Trematoda neboli motolice jsou zástupci parazitických platyhelmintů. Tato skupina čítá kolem 8000 známých druhů. Většinou se jedná o endoparazity obratlovců, ale našly by se i výjimky. Charakteristický pro ně je složitý vývojový cyklus, který je většinou vázán na měkkýše. Lokalizace v hostiteli může být značně rozmanitá (Horák a Scholz 1998), cílovým je pro ně trávicí systém, dýchací cesty, krevní řečiště, nervová soustava, urogenitální trakt a tělní dutiny (Volf et al. 2007). Zástupci dorůstají různé velikosti - od milimetrů po centimetry. Motolice mají dobře vyvinutou trávicí soustavu a přísavné orgány (Horák a Scholz 1998). Do třídy Trematoda spadají dvě podtřídy Aspidogastrea a Digenea. Podtřída Aspidogastrea nemá z medicínského nebo veterinárního pohledu význam. Jedná se o endoparazity hlavně u měkkýšů, ale našli bychom je i u paryb, kostnatých ryb a želv (Horák a Scholz 1998). Významnější podtřídu tvoří diginetické motolice. Mají bilaterálně symetrické, většinou dorzoventrálně zploštělé tělo bez vnitřní i vnější segmentace (Horák a Scholz 1998). Jíra (1998) udává jako charakteristický znak digenetických motolic přísavky, podle kterých dostaly motolice - Trematoda své jméno (tréma= otvor). Přísavky na jejich těle najdeme většinou dvě. Ústní (orální) přísavka se nachází na přídi těla. Druhábřišní přísavka označovaná také jako acetabulum je na ventrální straně uprostřed těla motolice. Součástí ústní přísavky mohou být ústa anebo se ústní otvor nachází těsně pod
7
ní. Hlavní funkcí přísavek je přichycení na hostitele. U zástupců některých skupin mohou přísavky chybět nebo být nahrazeny jinými strukturami (Volf et al. 2007). Povrch těla (neodermis, tegument) je tvořen bezjaderným soubuním, které vzniklo během přeměny první larvy na následující parazitické stádium. Často z něj vystupují různě veliké ostny, výstupky a výběžky. Typické jsou takzvané tegumentální trny. Neodermis je metabolicky velice aktivní tkáň, která zajišťuje trávení, přenos živin, ale i ochranu parazita před vnějším prostředím (Volf et al. 2007). Tato 15-25 µm silná vrstva bývá pokrytá různě silným glykokalyxem, který zajišťuje ochranu před natrávením v těle hostitele. Vnitřní orgány motolic jsou uloženy v parenchymu, který se také účastní metabolismu a transportu látek (Horák a Scholz 1998). Parenchym funguje i jako vnitřní opora těla. Svalová soustava motolic se skládá z 3 vrstev. Tvoří ji vnější vrstva okružní svaloviny, pod ní se nachází podélná vrstva svaloviny a šikmá vrstva svaloviny, která je uložena nejblíže středu těla. Součást svalového systému tvoří i svalovina příchytných orgánů, hltanu a vývodu pohlavních žláz. Trávicí soustava je jeden z charakteristických znaků motolic a je proto velmi dobře vyvinuta. Začíná ústním otvorem, jehož součástí může být i ústní přísavka a pokračuje předhltanem, svalnatým hltanem, jícnem a končí střevem. Ústní otvor je zároveň i otvorem vyvrhovacím, protože motolicím chybí řitní otvor. Střevo motolic může být různě členěno. Buď vypadá jako jednoduchý vak nebo se různě větví a spojuje. Část živin se vstřebává i prostřednictvím tegumentu. Vylučovací soustava a osmoregulační systém je protonefridiálního typu s plaménkovými buňkami a sběrnými kanálky, které ústí do exkrečního měchýře (Horák a Scholz 1998). Plaménkové buňky filtrují tělní tekutinu z parenchymových prostor a filtrát je odváděn soustavou kanálků, které se spojují a jsou zakončeny exkrečním měchýřem. Ten ústí na povrch těla exkrečním pórem (Volf et al. 2007). Nervová soustava sestává z cerebrálních ganglií umístěných po obou stranách hltanu (Jíra 1998). Z nich pak vybíhají do přední části těla provazce krátké a do zadní části provazce delší, které jsou propojené komisurami (Mertová 2011). Významná je inervace především příchytných orgánů a hltanu, specializovaná ganglia jsou u genitálií.
8
Synapse motolic (aminergní, cholinergní, peptidergní a NO- ergní) jsou častým místem zásahu anthelmintik. Oběhová soustava u motolic není vytvořena. Příjem kyslíku je zajištěn tegumentem. Pohlavní soustava u hermafroditických motolic zahrnuje samčí i samičí pohlavní orgány v jednom jedinci. Diginetické motolice se řadí mezi biohelminty s nepřímým vývojem- ke svému rozmnožení potřebují mezihostitele. Prvním mezihostitelem bývá obvykle měkkýš, ve kterém dochází k asexuálnímu rozmnožení. K pohlavnímu rozmnožování dochází až v definitivním hostiteli, obvykle v obratlovci (Horák a Scholz 1998). Schéma vývoje motolic začíná vajíčkem a pak následuje miracidium, sporocysta, redie, cerkarie, metacerkárie a končí dospělcem. Vajíčka většiny motolic jsou oválná, silnostěnná, světle až tmavě hnědé barvy a jsou opatřena víčkem (operculum), které umožňuje miracidiu opuštění skořápky vajíčka (Horák a Scholz 1998). Miracidium je pohyblivá mikroskopická larva, která je ve vodě schopná aktivně vyhledávat mezihostitele (Volf et al. 2007). Využívá své receptory k vyhledání svého prvního mezihostitele- měkkýše. Při penetraci do měkkýše odvrhuje ciliární buňky, které jí sloužily k pohybu a stává se z ní mateřská sporocysta. V ní se vyvíjí další generace motolic. Záleží na tom, o jaký druh motolice se jedná, protože podle toho se vyvinou buď dceřiné sporocysty anebo rédie. Dceřiné a mateřské sporocysty jsou si podobné, zatímco rédie mají vyvinutou trávicí soustavu (Mertová 2011). Vývojový cyklus se opět schází v podobě cerkárií, které vznikly z dceřiných sporocyst nebo rédií. Výsledkem asexuálního rozmnožování uvnitř mezihostitele je ohromné množství cerkárií, které zajistí rozšíření parazita do vnějšího prostředí a infekci dalšího mezihostitele. Jedna cerkarie = jedna dospělá motolice (Volf et al. 2007). Dalším krokem vývoje je přeměna cerkárie na metacerkárii. To se děje různými způsoby v závislosti na počtu hostitelů. V tom nejjednodušším případě vytvoří cerkárie ve vnějším prostředí kolem sebe cystu, která ji chrání, stane se z ní metacerkárie a tu pozře definitivní hostitel. Z metacerkárie se pak stane dospělá pohlavně aktivní motolice a vývojový cyklus se uzavírá.
1.2 Cestoda Tasemnice jsou další zástupci z neodermátního kmene platyhelmintů. V přírodě bychom našli kolem 5000 známých druhů tasemnic. Jedná se výhradně o endoparazity trávicí soustavy obratlovců, nejvyšší počet řádů parazitických tasemnic se ale nachází u 9
paryb a ryb (Volf et al. 2007). Tasemnice mají složité vývojové cykly, z hlediska patogenity je významné nejen stádium dospělce, ale především stádium larev, které napadá obratlovce. Podle Horáka a Scholze (1998) většina systémů rozděluje tasemnice v širším slova smyslu na skupiny Cestodaria s řády Gyrocotylida a Amphilinida (někdy řazené na úroveň tříd) a Eutocestoda, které zahrnují většinu parazitických tasemnic. Podtřída Eutocestoda se dále dělí na další řády, z nichž nejvýznamnější tvoří řád Cyclophyllidea se svými čeleděmi. Jedná se o nejpočetnější řád tasemnic parazitujících u obojživelníků, plazů, ptáků a savců včetně člověka (Volf et al. 2007). Tělo tasemnic je protáhlé, většinou segmentované (polyzoické), složené z více článků. Je členěno na hlavičku (scolex), krček (cervix) a tělo (strobilum), které se skládá z jednotlivých článků (proglotid) (Kořínková 2006). Hlavička je vybavená přichycovacími orgány, které jsou pro mnohé tasemnice typické. Můžou to být například přísavky (acetabula), přísavné rýhy (botrie) nebo zasunovatelný chobotek (rostellum), který bývá vybaven rostellárními háčky. Hlavička přechází buď přímo v tělo, nebo následuje krček jako nejužší část tasemnice. Krček je místem vzniku zárodečných buněk, které tvoří základy článků (proglotid) těla tasemnice (Jíra 1998). Strobila u většiny tasemnic je rozdělena na postupně dozrávající segmenty. Nejstarší články jsou na konci těla, nejmladší jsou v blízkosti krčku, kde se vyvíjejí (Horák a Scholz 1998). Uvolňování zralých článků s vajíčky probíhá zaškrcováním nebo jsou vajíčka rovnou uvolňována z neoddělených segmentů do vnějšího prostředí. Tělní pokryv tasemnice zajišťuje stejně jako u motolic tegument. U tasemnic, ale má o to větší význam, protože nemají vyvinutou trávicí soustavu- chybí jim střevo. Proto vstřebávání živin a přijímání potravy zajišťuje tegument. Zvětšení vstřebávací plochy a také lepší fixaci parazita zajišťují vláskovité výrůstky (mikrotrichy). Ty jsou kryté ochranným glykokalyxem. Pod tegumentem a vrstvou svaloviny (podélné, příčné a okružní, šikmá chybí) je parenchym vyplňující vnitřní prostory mezi orgány (Horák a Scholz 1998). V parenchymové tkáni tasemnic jsou obsaženy hutné struktury- vápenitá tělíska, jejichž funkce není zcela objasněna (Jíra 1998).
10
Vylučovací a osmoregulační soustava je stejná jako u motolic. Zajišťuje ji protonefridiový systém, který se skládá z terminálních plaménkových buněk. Vyústění exkrečních kanálků se nachází buď v jednotlivých článcích anebo na konci strobily (Jíra 1998). Centrum nervové soustavy se nachází ve scolexu a je tvořeno párovým hlavovým gangliem, z něhož vybíhají nervové svazky, které inervují celé tělo. Tasemnice patří mezi hermafrodity. Proglotida obsahuje jednu nebo více sad samčích a samičích pohlavních orgánů, které mají samostatné vývody. Oplozená vajíčka mohou vznikat spářením mezi dvěma tasemnicemi nebo dojde k oplození v rámci jedné strobily mezi články. V každém článku se tvoří větší počet vajíček (Jíra 1998). Vajíčka opouštějí tělo definitivního hostitele se stolicí. V každém vajíčku se ještě v mateřském prostředí nebo ve vnější prostředí vyvíjí první larva označovaná jako lykofora nebo onkosféra. Rozdíl mezi těmito larvami je v počtu embryonálních háčků. Onkosféra opatřená ciliemi pro pohyb ve vodě se nazývá koracidium. Vývojový cyklus tasemnice pokračuje pozřením onkosféry mezihostitelem, z onkosféry se stává larva druhého eventuálně třetího typu (metacestoda). Tyto larvální formy mohou mít různou morfologii a podle toho se také označují (plerocerkoid, cysticerkoid, cysticerkus, coenurus,…). Larvy tasemnic mohou významným způsobem ovlivňovat chování mezihostitelů, jejich metabolismus a hormonální regulaci (Volf et al. 2007). Lokalizace dospělých tasemnic je ve střevě obratlovců. Vývoj tasemnic je složitý a prochází rodozměnou (metagenezí) se směnou hostitelů vázanou na potravní řetězce (Jíra 1998). Výjimkou nejsou ani tříhostitelské cykly, kdy zvíře nebo i člověk figuruje jako mezihostitel larválního stádia nebo definitivní hostitel dospělé tasemnice.
1.3 Nematoda Hlístice
tvoří
samostatnou
jednotku
parazitických
helmintů
z kmene
Nemathelminthes. Zástupci této třídy jsou velice heterogenní a tvoří nejpočetnější a nejrozšířenější skupinu živočichů. Není proto překvapením, že už je popsáno 20 000 druhů, které parazitují na obratlovcích, ale jsou známé i druhy, které parazitují na bezobratlých a rostlinách. Cílová lokalizace dospělých hlístic v těle hostitele je nejčastěji trávicí trakt, ale našli bychom je i v krevních a lymfatických cestách, nervové soustavě, urogenitálním traktu, dýchací soustavě, tělních dutinách, kůži- prakticky v celém těle (Volf et al. 2007). Hlístice dosahují různé velikosti od těch nejmenších 11
milimetrových až po největší, které můžou být dlouhé až 1 metr. Jejich velikost je spjata s tkáňovou lokalizací. Horák a Scholz (1998) uvádějí jedno z možných členění hlístic na dvě třídyAdenophorea a Secernentea. Rozdíl mezi nimi je v přítomnosti nebo chybění fazmidů (kaudální senzorické orgány). Další členění v rámci těchto tříd se používá dle Andersona, který zástupce rozdělil do jednotlivých řádů a nadčeledí. Toto rozdělení je ovšem umělé a používá se pro praktické účely osvětlení biologie vybraných skupin parazitických hlístic (Volf et al. 2007). Parazitické hlístice mají protáhlé až niťovité tělo válcovitého průřezu, nesegmentované, pokryté odolnou kutikulou (Horák a Scholz 1998). U zástupců této skupiny je častý i pohlavní dimorfismus, kdy samice dorůstá větších rozměrů než samec (Volf et al. 2007). Jíra (1998) rozlišuje na těle hlístic tři základní části. Hlavovou část, kde se nacházejí orgány uzpůsobené k příjmu potravy a orgány smyslové. Střední část, ve které dochází k trávení ve střevě, jsou tu přítomné gonády s vývody a vylučovací a osmoregulační soustava. Kaudální část tvoří vyústění střeva a samčích pohlavních orgánů. Kutikula tvořící povrch těla je několikavrstevná a svůj původ má odvozený od hypodermis (epidermis). Její stavba se mezi jednotlivými skupinami hlístic může lišit. Její funkce je ale pro všechny zástupce těchto skupin stejná. Tvoří vnější kostru parazita, umožňuje mu aktivně se pohybovat, ale je také ochranou bariérou. Prostřednictvím kutikuly může hlístice vyměňovat látky s prostředím a účastnit se interakcí s hostitelem. Kutikula může být rozdělena rýhami nebo může být utvářena v podobě různých výběžků, výdutí, trnů, hřebenů. V některých místech může tvořit rozšířeniny v podobě šíjových, bočních a ocasních křídel (Volf et al. 2007). Tyto struktury nám můžou pomoci odlišit jednotlivé druhy mezi sebou. Tělní stěna neboli kožně- svalový vak je tvořen kutikulou, subkutikulou a svalovými vlákny, která ohraničují primární tělní dutinu (Jíra 1998). Primární tělní dutina (pseudocél) se nachází mezi tělní stěnou a vnitřními orgány. Obsahuje tekutinu, která se podílí na tělním turgoru, rozvodu a skladování živin. Složkou této tekutiny jsou i coelomocyty, fixované buňky, které mají fagocytární a sekreční aktivitu (Volf et al. 2007).
12
Svalová soustava je u hlístic složená ze svalů somatických a svalů specializovaných. Svaly somatické (podpovrchové) jsou podélné a uložené pod hypodermis. Díky těmto svalům se může hlístice pohybovat. Svaly specializované umožňují stahy orgánů spjatých s trávicí a pohlavní soustavou. Trávicí soustava se skládá z ústního otvoru, který může být opatřen pohyblivými pysky (labii) se zoubky, ústní dutiny, za ní následuje hltan, který pumpováním zajišťuje příjem potravy a končí střevem a análním otvorem (Volf et al. 2007). Hltan může být rozdělen na část svalnatou a žláznatou. Jeho tvar nám může pomoci určit, o jaký druh hlístice se jedná. Střevo hlístic má tvar jednoduché trubice, někdy bývá přítomen postranní výběžek (slepé střevo). Exkreční systém plní vylučovací a osmoregulační funkci. Jeho stavba ale není pro hlístice jednotná. Jíra (1998) popisuje u některých druhů vylučovací soustavu jako jednoduchou jednobuněčnou žlázu nebo komplex žláz a kanálků, u některých zástupců může i úplně chybět. Jsou i případy, kdy hlístice má oba systémy- primitivnější glandulární a složitější tubulární. Základ nervové soustavy nematod tvoří dva páry nervových vláken, která jsou spojená příčnými spojkami a hltanový nervový prstenec složený z přilehlých nervových ganglií (Horák a Scholz 1998). V některých částech těla najdeme i periferní ganglia (Volf et al. 2007). Hlístice mají i četná nervová zakončení v podobě senzorických papil v hlavové části (amfidy, deiridy) a v kaudální postanální části (fazmidy). Fazmidy u skupiny Adenophorea chybí. U těchto parazitů bychom nenašli cévní systém, výměnu plynů s vnějším okolím zajišťuje povrch těla. Hlístice mají většinou oddělená pohlaví, jsou to gonochoristé. Je u nich výrazný pohlavní dimorfismus. Pohlavní orgány mají jednoduchou trubicovitou stavbu. Embryonální vývoj hlístic probíhá od vajíčka přes čtyři larvální formy. Nedochází u nich k metamorfóze, jako tomu bylo u tasemnic a motolic, ale k postupnému růstu larvy s přeměnou vnitřních orgánů (Jíra 1998). Vývoj jednotlivých larválních forem je oddělen svlékáním staré a tvorbou nové kutikuly (Volf et al. 2007). Podle stupně vývoje vajíčka při odchodu z dělohy samice nebo ze střeva hostitele rozlišujeme typ oviparní, ovoviviparní a viviparní. 13
Mezi hlísticemi bychom našli zástupce geohelmintů i biohelmintů. Přímý vývoj probíhá většinou po nákaze perorální cestou pozřením infekční larvy nebo perkutánním přenosem, kdy larva proniká kůží hostitele a poté migruje do místa cílové lokalizace (Volf et al. 2007). Vývoj nepřímý se uskutečňuje prostřednictvím mezihostitele, ve kterém se larva vyvíjí do infekčního stádia. Mezihostitel je pozřen definitivním hostitelem nebo dojde k přenosu infekčních stádií do definitivního hostitele prostřednictvím vektora (například při sání krve). Boj s hlísticemi je obtížný, protože jsou dokonale přizpůsobené pro přežití. Volf et al. (2007) popisuje fenomén „dauer larvy“, kdy v druhém vývojovém stádiu larvy nedojde ke svléknutí kutikuly, ale zastaví se vývoj a larva je schopna přečkat nepříznivé podmínky. Zachovává si ale schopnost reagovat na stimuly z vnějšího prostředí a díky hmyzu, ke kterému adheruje, se může rozšířit dál po okolí. Když nepříznivé podmínky přejdou, pokračuje dál ve vývoji. Na podobném principu je založena schopnost hypobiózy. Využití paratenických hostitelů je další ze strategií hlístic k efektivnímu přenosu jednotlivých vývojových stádií na další hostitele (Volf et al. 2007).
14
2. POUŽÍVANÁ ANTHELMINTIKA Anthelmintika tvoří velice rozsáhlou skupinu různorodých léčiv. Prvními anthelmintiky byla léčiva přírodního původu, kdy se pro anthelmintickou aktivitu používaly extrakty z rostlin a z nich izolované látky. Nevýhodou těchto léčiv, ale byla úzká terapeutická šíře a s tím spojená vysoká toxicita při nesprávném dávkování. Přírodní extrakty postupně nahradila syntetická léčiva. Dalšími výzkumy byla zjištěna stejná anthelmintická aktivita i u dalších sloučenin nejrůznějších struktur. Nejdůležitější ale je, aby účinná látka interferovala s životními funkcemi parazita, ale přitom nesmí poškozovat hostitelský organismus (Jíra 1998). Rozdělení anthelmintik může být podle různých hledisek. Nejčastěji používané rozdělení anthelmintik je rozdělení podle taxonomických skupin na tři třídy podle původců nejrozšířenějších helmintózantinematoda, anticestoda a antitrematoda. Toto rozdělení budu používat i já. Pro větší přehlednost v rámci každé třídy je uvedená tabulka se současně registrovanými a používanými anthelmintiky.
2.1 Antinematoda Tab. 1 Léčiva s antinematodním účinkem (upraveno, Lamka a Ducháček 2006) Makrocyklické laktony
Benzimidazoly
Imidothiazoly
Léčiva ostatních chemických struktur
Ivermektin Moxidektin Doramektin Eprinomektin Abamektin Selamektin
Albendazol Febantel Fenbendazol Flubendazol Mebendazol Oxibendazol Tiabendazol
Levamisol
Pyrantel Oxantel Nitroskanat
Jsou to léčiva proti parazitickým hlísticím. Z anthelmintik je jejich význam největší, protože nákazy těmito hlísticemi patří k nejrozšířenějším, jak u zvířat, tak u lidí. Zástupci této skupiny působí výrazné hospodářské škody v chovech zvířat (Volf et al. 2007).
15
Časté podávání antinematod v rámci prevence nebo léčebně s sebou nese zvýšený výskyt rezistence hlístic vůči těmto léčivům. V současnosti se podle Lamky a Ducháčka (2006) dají léčiva s antinematodním účinkem zařadit do čtyř skupin. Jsou to makrocyklické laktony, benzimidazoly, imidothiazoly a léčiva ostatních chemických struktur. Makrocyklické
laktony
jsou
biosyntetického
původu,
vznikají
během
fermentačního procesu bakterií rodu Streptomyces. Mimo antinematodního účinku se využívá i jejich schopnost hubit ektoparazity. Dají se rozdělit do dvou příbuzných skupin na avermektiny a milbemyciny. Mechanizmus účinku makrocyklických laktonů spočívá v jejich interakci s chloridovými iontovými kanály asociovanými s receptory pro glutamát. Glutamát funguje jako inhibiční neurotransmiter a otevírá chloridové kanály. Zvýšenou hladinou chloridových iontů vyvolaná depolarizace buněk má za následek paralýzu parazita a jeho úhyn (Borovanský a Csöllei 2003). Ivermektin podporuje účinek glutamátu, ve vysokých koncentracích je schopný otevírat iontové kanály i sám bez pomoci glutamátu. Původně se usuzovalo, že ivermektin potencuje účinek chloridových iontových kanálů asociovaných s receptory pro kyselinu γ – aminomáselnou (GABA), ale novější studie tuto teorii vyvrátily. GABA sice funguje v těle parazita jako inhibiční neurotransmiter, ale její účinek na iontové kanály ve srovnání s ivermektinem je až třicetinásobně nižší. GABA v tomto případě hraje minimální roli. Ivermektin patří mezi historicky první léčiva z této skupiny, v současné době je i nejvýznamnější (Lamka a Ducháček 2006). Účinkuje na vývojová i dospělá stádia hlístic a členovců. Horák a Scholz (1998) definují ale i jeho nevýhody- zaznamenaná rezistence u trichostrongyloidních hlístic ovcí a výskyt reziduí v exkrementech, které mají po určitou dobu odpuzující či toxický účinek na některé bezobratlé. Stejně jako ivermektin působí na vývojová i dospělá stádia hlístic a členovců i moxidektin, doramektin a eprinomektin. Abamektin našel své využití jako endektocid koní, selamektin působí na infekce u domácích masožravců. Benzimidazoly patří vůbec k nejrozsáhlejší skupině anthelmintik. Část léčiv z této skupiny se vyznačuje širokým spektrem účinků nejen proti parazitickým hlísticím. Vznik benzimidazolů byl zapříčiněn objevením anthelmintického působení u 2- fenylbenzimidazolu. Ten tvoří základní chemickou strukturu, od které byly odvozeny další substituované benzimidazoly. Substitucí v poloze 2 vznikl thiabendazol, který je 16
v současné době používán jako antimykotikum. Při studiu vztahu struktury a účinku tiabendazolu se ukázalo, že anthelmintický účinek benzimidazolů se může zvýšit náhradou thiazolu za substituovanou aminoskupinu, když se současně provede lipofilní substituce na pátém metabolicky citlivém uhlíku (Borovanský a Csöllei 2003). Jako nejvhodnější substituent místo thiazolu se ukázala methylkarbamátová skupina. Jednotlivé substituenty v poloze pět a léčivo k nim přiřazené znázorňuje obrázek 1. Benzimidazoly působí na úrovni energetického metabolismu, který inhibují. Ducháček a Lamka (2006) popisují inhibici syntézy tubulinu, tím dochází k narušení transportu a metabolismu glukózy. Výsledkem je vyčerpání, ztráta pohyblivosti a nakonec úhyn parazita. Stejně jako tomu bylo u makrocyklických laktonů působí tato léčiva na dospělá i vývojová stádia parazitů včetně vajíček (ovocidní působení). Při aplikaci těchto léčiv musíme mít na mysli, zda se jedná o zvířata s jednokomorovým nebo vícekomorovým žaludkem. Anthelmintická aktivita je závislá na délce přetrvání terapeutických koncentrací léčiva v tělních tekutinách a tkáních (Lamka a Ducháček 2006). Proto u zvířat s vícekomorovým žaludkem většinou stačí jednorázové podání. V současné době jsou benzimidazoly velice diskutovanou skupinou léčiv v souvislosti s výskytem rezistentních nematod na celou tuto skupinu léčiv. Imidothiazoly jsou zástupci léčiv s výhradně antinematodním účinkem. Zasahují vývojová a dospělá stádia hlístic, oproti benzimidazolům ale postrádají ovocidní účinek. V současnosti je jediným registrovaným přípravkem z této skupiny léčiv levamisol (Ducháček a Lamka 2006). Jedná se o levotočivou formu původně používaného racemátu tetramisolu (Ducháček a Lamka 2006). Levamisol způsobuje stimulaci ganglií a tím vyvolává kontrakci svaloviny helminta na bázi depolarizace a současně inhibicí enzymu fumarát - reduktasy narušuje energetický metabolismus (Borovanský a Csöllei 2003). Hlístice jsou paralyzovány a následně vypuzeny ven z těla. Jejich vypuzení je urychleno zvýšenou pohyblivostí střeva, kterou také způsobuje levamisol. Levamisol se také využívá v kombinaci s niklosamidem, který působí proti tasemnicím. Léčiva ostatních chemických struktur v sobě shrnují tetrahydropyrimidiny (pyrantel, oxantel) a izothiokyanáty (nitroskanat). Ducháček a Lamka (2006) označují pyrantel jako cholinergního agonistu, který působí jako inhibiční neurotransmiter na acetylcholinových receptorech svalových buněk nematod. Neselektivní kanály pro draselné a sodné ionty se otevřou a tím dojde ke kontrakci svalů parazita. Ochrnutý 17
parazit je v živém stavu vypuzen peristaltikou střeva ven z těla. Organický kation oxantel je odvozen od pyrantelu. Výhodou oxantelu oproti pyrantelu je jeho účinek na parazity rodu Trichuris. Pyrantel a oxantel jsou indikovány pro použití především u psů a koček, tato léčiva dobře účinkují při nižších koncentracích. Nitroskanat jako zástupce izothiokyanátů se s úspěchem podává jako antinematodikum a anticestodikum u psů. Způsobuje snížení energetické tvorby buněk parazita a to inhibicí fosfatas a zvýšením exkrece laktátu a acetátu (Ducháček a Lamka 2006).
Obr. 1 Jednotlivé benzimidazoly (Borovanský a Csöllei 2003).
18
2.2 Antitrematoda Tab. 2 Léčiva s antitrematodním účinkem (upraveno, Lamka a Ducháček 2006). Halogenované salicylanilidy
Benzimidazoly
Léčiva ostatních chemických struktur
Rafoxanid
Albendazol Febantel Fenbendazol Triklabendazol
Klorsulon
V zásahu proti motolicím se osvědčila nejen chemická léčiva, ale stejně důležitou roli hraje i přerušení složitého životního cyklu parazita. Omezení disperze vajíček do prostředí ze stolice a moči, tlumení populací mezihostitelských měkkýšů a znemožnění přenosu na definitivního hostitele jsou opatření, která zamezují dalšímu výskytu patogenních motolic (Volf et al. 2007). Z léčiv se využívají halogenované salicylanilidy, benzensulfoamidové léčivo klorsulon a benzimidazoly pro svoje široké spektrum působení (viz. Antinematoda). Z halogenovaných salicylanilidů má význam především niklosamid, který se používá při léčbě cestodóz u psů, koček a ostatních masožravců (viz. anticestoda). Rafoxanid se v kombinaci s mebendazolem používá k dehelmintaci spárkaté zvěře (Borovanský a Csöllei 2003). V jiných zemích našel využití i u hospodářských zvířat (Lamka a Ducháček 2006). Klorsulon reprezentuje anthelmintikum jiné chemické struktury. Tento benzendisulfonamid je u nás k dispozici v kombinovaném přípravku s ivermektinem k prevenci a terapii endo- i ektoparazitóz skotu a ovcí (Borovanský a Csöllei 2003).
19
2.3 Anticestoda Tab. 3 Léčiva s anticestodním účinkem (upraveno, Lamka a Ducháček 2006). Benzimidazoly
Léčiva ostatních chemických struktur
Albendazol Febantel Fenbendazol Flubendazol Mebendazol Oxibendazol
Nitroskanat Niklosamid Praziquantel Epsiprantel Arekolin
Tasemnice využívají ke svému rozšiřování potravní řetězec, zásahem do tohoto řetězce můžeme výskyt cestodóz omezit. Lékem volby v případě cestodóz jsou už výše zmiňované benzimidazoly. Účinná anticestodika, která jsou u nás v současnosti registrovaná, zmiňuje tabulka 3. Febantel a oxibendazol se používají pouze u koček a psů, ostatní benzimidazoly se indikují i u jiných druhů zvířat. O použití nitroskanatu bylo pojednáno v kapitole Antinematoda. Niklosamid jako zástupce halogenovaných salicylanilidů se vyznačuje helmintocidním účinkem proti dospělcům tasemnic. Mechanizmus účinku spočívá v inhibici oxidativní fosforylace v mitochondriích parazita s jeho následným usmrcením a vyloučením stolicí (Borovanský a Csöllei 2003). Hlavním místem spastického a paralytického účinku niklosamidu je scolex a proximální segment tasemnice (Lamka a Ducháček 2006). Tasemnice se pustí střevní stěny, ještě ve střevě zvířete dojde k jejímu natrávení, a proto přítomnost parazita v trusu nemusí být zjistitelná (Lamka a Ducháček 2006). Praziquantel a epsiprantel představují chemicky podobné syntetické pyrazinové deriváty. Epsiprantel se kombinuje s tetrahydropyrimidinem pyrantelem a podává se především kočkám a psům. Účinkuje pouze proti tasemnicím. Použití praziquantelu je rozšířeno o koně. Anthelmintická aktivita praziquantelu je proti tasemnicím, ale i motolicím. Mechanizmus účinku praziquantelu je dvojí. Praziquantel funguje jako acetylcholinový antagonista, který paralyzuje přenos nervových vzruchů (Ducháček a 20
Lamka 2006). Druhý účinek spočívá v narušení permeability buněčné membrány tasemnice pro vápníkové a sodné ionty. Jejich deficit v intracelulárním prostoru vyvolá extrémní kontrakci a paralýzu svalstva parazita, takže je snadno vypuzen stolicí ven (Borovanský a Csöllei 2003). Praziquantel v tomto případě působí vermifugně, při vyšších dávkách dochází k úhynu parazita a projeví se vermicidní účinek praziquantelu. Arekolin se pro svoji anthelmintickou aktivitu používá obsoletně, v současné době je to zastaralé již překonané léčivo. Arekolin je hlavní alkaloid patřící mezi piperidinové alkaloidy izolované z betelové (arekové) palmy (Arekolin- Velký lékařský slovník). Vedle účinku na tasemnice u masožravců je mu připisována i parasympatomimetická aktivita.
21
3. NEBEZPEČÍ VZNIKU HELMINTOREZISTENCE Pravidelné používání, rozsáhlé a nesprávné dávkování anthelmintik mnohdy se stejným nebo podobným mechanismem účinku nebo naopak střídání anthelmintik patří k nejčastějším příčinám vzniku rezistence. Citliví parazité podlehnou účinku anthelmintika, ale určitá část populace si vytvoří adaptační mechanismy, díky kterým je schopna odolávat smrtícím účinkům anthelmintika. Rozvíjí se rezistence. Další rozvoj rezistence má svůj podklad v genech. Alely kódující geny pro rezistenci představují existenční výhodu pro populaci parazitů, vlivem mutace se získaná rezistence šíří i na tu část populace, která ještě nebyla účinkům léčiva vystavena. Anthelmintická léčba léčivy, která odpovídají alelám kódujícím geny pro rezistenci, představuje pro populaci parazitů výhodu a díky tomu se frekvence rezistentních alel v populaci parazitů zvýší (Ihler 2010). Zvýšené riziko rozšíření genů pro rezistenci představuje také podání subterapeutické dávky (poddávkování). Heterozygotní jedinci, kteří přežili léčbu a zároveň nesou gen pro rezistenci, umožní jeho rozšíření na další populaci parazitů. Z tohoto důvodu je lepší mírně předávkovat než podat dávku anthelmintika menší (Veterinární a chovatelská opatření proti vnitřním parazitům u koní- Česká hipiatrická společnost). Stejný efekt jako poddávkování způsobí prošlé léčivo. Čím delší doba uplynula od doby expirace, tím více dochází ke snižování účinné látky v léčivu. Poddávkování můžeme dosáhnout, i pokud špatně odečteme hmotnost zvířete. K dalším faktorům vedoucím k rozvoji helmintorezistence patří samotná biologie parazita a jeho patogenita, imunitní stav hostitele a chovatelský management. Chovatelský management zahrnuje péči o pastviny a výběhy, patří sem dodržování zoohygienických zásad ve stájích a antiparazitární programy, jejichž cílem je přerušit vývojový cyklus parazitů (Veterinární a chovatelská opatření proti vnitřním parazitům u koní- Česká hipiatrická společnost). Americká Food and Drug Administration sestavila příručku pro veterináře a chovatele o helmintorezistenci (Antiparasitic Resistance in Cattle and Small Ruminants in the United States: How to Detect It and What to Do About It), kde pojednává i o vlivech chovatelského managementu vedoucích k rozvoji rezistence:
léčení všech zvířat ve stádě
22
pravidelná dehelmintace zvířat bez předchozích diagnostických testů, zda je léčba vyloženě nezbytná
podávání antiparazitik bez ověření, o jaký typ parazita se jedná
spoléhat pouze na účinek antiparazitik bez úpravy chovatelského managementu (vliv refugií, spravování pastvin)
dehelmintace, když je přítomnost refugií v životním prostředí nízká
použití antiparazitik k jinému účelu než k jakému byly schváleny U prvních tří bodů dojde sice k eliminaci citlivých jedinců v populaci, ale
zároveň k rozšíření rezistence na populaci další. Upouští se proto od léčení všech zvířat ve stádě, ale léčí se jen postižení jedinci. S výběrem vhodného anthelmintika jsou spojena mnohá úskalí. Musíme vzít v úvahu, zda jsou podávána terapeuticky nebo preventivně, jaký je mechanizmus účinku podaného léčiva a svou roli hraje i léková forma, ve které zvířeti anthelmintikum podáme. Důležité je mít vypracované detekční systémy (parazitická kontrola), které odhalí přítomnost určitého parazita u nemocného zvířete nebo jeho rezistenci k podanému léčivu. Vliv již zmiňovaných refugií také hraje roli při výskytu helmintorezistence. Refugia tvoří podíl na celkové populaci parazitů a mají vliv na rozvoj rezistence (Antiparasitic Resistance in Cattle and Small Ruminants in the United States: How to Detect It and What to Do About It- U. S. Food and Drug Administration). Citliví jedinci, kteří parazitovali v hostiteli, byli anthelmintickou léčbou zničeni, ale rezistentní zůstávají stále na pastvině spolu s částí populace citlivých jedinců. Vlivem prudkých změn počasí může dojít k eliminaci citlivých jedinců i ve vnějším prostředí a k infekci hostitele dojde pouze rezistentními jedinci. To má za následek zvýšení selekčního tlaku vlivem působení anthelmintika a to vede k dalšímu rozvoji rezistence. Z toho vyplývá, že čím vyšší je podíl parazitů v refugiích, tím dochází k pomalejšímu rozvoji rezistence vlivem nižšího selekčního tlaku na celou populaci (Ihler 2010). Ihler (2010) popisuje tento rozdíl při vzniku anthelmintické rezistence na Novém Zélandu a v Austrálii. Nový Zéland má vlhké podnebí a díky tomu je 75% populace Haemonchus contortus na pastvině v larválním stádiu. Oproti tomu Austrálie má podnebí suché, které larválním stádiím nepřeje, ale dochází tady i k likvidaci refugií. Nedochází k namíchání rezistentních parazitů a parazitů citlivých a tedy k vyššímu 23
selekčnímu tlaku a dřívějšímu rozvoji rezistence. Aby se vůbec zabránilo reinfekci z pastvin, doporučuje se provést dehelmintace u stád před a po pastevním období. Tím se sníží riziko kontaminace pastvin vajíčky parazitů. Abychom toto riziko, co nejvíce minimalizovali, provádí se po dehelmintaci důkladný sběr trusu na pastvinách, který může obsahovat velké množství vajíček. Poslední bod, o kterém hovoří příručka, se týká používání antiparazitik k jinému účelu než k jakému byly schváleny například pro zvýšení tělesné hmotnosti. Krátkodobé používání sice může zvýšit ziskovost, ale je s tím spojeno i riziko vymýcení vnímavých parazitů a zvýšení rezistence u přežívajících. Zvýšení rezistence přežívajících parazitů má negativní dopad na zdraví stáda a vede k ekonomickým ztrátám. Pro zpomalení rozvoje helmintorezistence tvoří používání anthelmintik jen jednu část v rámci antiparazitárních programů (Antiparasitic Resistance in Cattle and Small Ruminants in the United States: How to Detect It and What to Do About It- U. S. Food and Drug Administration). Při příjmu nového zvířete by toho zvíře mělo být nějakou dobu v karanténě, aby v případě že je zdrojem nákazy rezistentních parazitů, nedošlo k rozšíření i na ostatní zvířata v chovu. V rámci zoohygienických opatření by se měla provádět očista chovatelských prostor a preventivní koprologická vyšetření trusu. Důležité je i ošetření pastvin: sběr trusu zejména za vlhkého počasí a po dehelmintaci, rotace různých druhů zvířat na pastvině nebo alespoň různých věkových kategorií, spásání pastviny po menších částech, vysušování pastvin. Svou roli hraje i hustota osazení pastviny a výška spásané trávy. Infekční larvy parazitů se totiž vyskytují přibližně jeden centimetr od země a příliš krátká pastva zvyšuje riziko nákazy zvířete pozřením infekční larvy při pasení (Antiparasitic Resistance in Cattle and Small Ruminants in the United States: How to Detect It and What to Do About It- U. S. Food and Drug Administration). Snížit hustotu osazení pastviny, je - li blízko hnojiště. Trus sesbíraný z pastvin se k hnojení dá použít až po roce kompostování.
24
V rámci prevence helmintóz platí i základní zásady dodržování hygieny ve stájích, kam patří udržování čistoty napáječek a žlabů, nezkrmování sena znečištěného trusem a denní odkliz výkalů. Zásoby krmiva a zdroje vody musí být umístěny v dostatečné vzdálenosti od hnojiště (Veterinární a chovatelská opatření proti vnitřním parazitům u koní- Česká hipiatrická společnost). V posledních letech problém anthelmintické rezistence dosáhl nových výšek, kde už nemůže být ignorován. Rezistence se stává hlavním problémem při kontrole parazitů zvířat (Kaplan a Vidyashankar 2012). Helmintorezistence je v současné době globálním problémem. Austrálie, Nový Zéland, Jižní Afrika a Jižní Amerika se s výskytem rezistentních parazitů potýkají už několik desetiletí, nově se k nim přidávají i Spojené státy americké. Prevalence v Evropě je nízká oproti ostatním regionům světa (Kaplan a Vidyashankar 2012). Největší škody vznikají především v malých chovech zvířat, kde dochází k přímým i nepřímým ztrátám užitkovosti a vzhledem k vysokým nákladům na kontrolní opatření a léčbu dochází i ke ztrátám ekonomickým. Nejčastějšími a nejrozšířenějšími původci těchto problémů jsou rezistentní gastrointestinální nematoda, která postihují nejvíce malé přežvýkavce (ovce, kozy), méně pak koně a dobytek (Várady et al. 2011). Problém u těchto parazitů je, že se u nich postupně vyvinula rezistence nejen v rámci jedné skupiny anthelmintik, ale že se tato rezistence rozšířila i na další anthelmintika. Příkladem může být Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta a Trichostrongylus colubriformis, Ostertagia spp. a Cooperia spp., u nichž je vzniklá rezistence nejzávažnější (Várady et al. 2011). V současné době chemoterapie infekcí způsobených parazity třídy Nematoda u hospodářských zvířat spočívá v použití 3 tříd širokospektrých anthelmintikbenzimidazolů, imidothiazolů, makrocyklických laktonů (Kaminsky et al. 2008b). Z těchto uvedených anthelmintik byly na trh jako poslední uvedené makrocyklické laktony (Ivermektin). To ale bylo roku 1981 (Kaminsky et al. 2008b). Časté používání uvedených anthelmintik v průběhu let mělo za následek vznik vícečetné rezistence nematod, na které už podávané léky přestaly zabírat. V průběhu posledních 25 let byla snaha o vytvoření dalších širokospektrých anthelmintik, která by potlačila vzrůstající incidenci rezistentními nematodami. Objevili se 2 nové třídy anthelmintik cyklodepsipeptidy a paraherquamidy, které ale nebyly na trhu v dostupných přípravcích 25
pro hospodářská zvířata (Karadzovska et al. 2009). Výjimkou byly emodepsidy z nově vytvořené třídy cyklodepsipeptidů, které jsou ale indikovány k použití pouze pro kočky a ne pro hospodářská zvířata (Kinsella et al. 2011). Objevení a výzkum nového léku na rezistentní parazity byl vyloženě nezbytný. Nedávno objevené aminoacetonitrilové deriváty (AADs) představují novou třídu syntetických chemikálií s anthelmintickou aktivitou především proti rezistentním parazitům s víčetnou lékovou rezistencí s novým mechanizmem účinku. Toto nové léčivo a mnohá další jako například derquantel mohou nabídnout dočasnou úlevu od problémů vzniklých selháním starších anthelmintik (Kaplan a Vidyashankar 2012).
26
4. NOVÁ ANTHELMINTIKA 4.1 Aminoacetonitrilové deriváty (AADs) AADs tvoří novou třídu anthelmintik, která se osvědčila v boji proti nematodám s víčetnou lékovou rezistencí a představují naději v parazitické kontrole. Jedná se o syntetické nízkomolekulární sloučeniny (Kaminsky et al. 2008a). Získávány jsou alkylací fenolu chloroacetonem, v dalším kroku následuje Stereckerova reakce na ketonu a posledním krokem je acylace aminoskupiny pomocí chloridu kyseliny benzoové (Stuchlíková et al. 2012). Společné pro tyto deriváty je aminoacetonitrilové jádro, na kterém jsou připojeny aryloxy- a aroylskupiny substituentů (Kinsella et al. 2011).
Obr. 2 Princip chemické syntézy AADs (Kaminsky et al. 2008a). Je známo přes 600 sloučenin, které byly syntetizovány a hodnoceny pro svoji anthelmintickou aktivitu, lišících se pouze substituenty na benzenovém jádře (Kaminsky et al. 2008a). Podle rozdílných substituentů mají jednotlivé AADs i různá označení. AADs jsou opticky aktivní látky, vyskytují se v racemátech. Můžou se podávat jako racemáty, kdy farmakologicky aktivní je jen jedna složka. Kaminsky et al. (2008 b) se rozhodli identifikovat vhodného kandidáta z celé široké třídy AADs, který by splňoval požadavky, co největší účinnosti proti všem gastrointestinálním nematodám včetně rezistentních izolátů a aby měl, co nejmenší toxicitu a nejlepší snášenlivost. Prováděli in vitro výzkum a studie k ověření účinnosti a snášenlivosti u hlodavců, ovcí a dobytka. Při studiích se nejlépe osvědčil AAD 1566 označovaný jako monepantel (racemická směs AAD 96: aktivní AAD 1566 a neaktivní AAD 96i) a AAD 85a (racemická směs AAD 85: aktivní AAD 85a), které eliminovali citlivé i rezistentní H. contortus u pískomilů ve stejné dávce. Tyto výsledky byly později potvrzeny i u ovcí (Kaminsky et al. 2008b). 27
4.1.1 AAD 1566: monepantel Monepantel (obr. 3) splňuje všechny požadavky, které jsou vyžadovány pro nové anthelmintikum: široké spektrum účinku proti nematodám s jednoduchou i s vícečetnou rezistencí díky novému mechanismu účinku, nízká toxicita pro savce a vynikající snášenlivost u ovcí díky specifickému zacílení proti nematodám (Kaminsky et al. 2008b).
Obr. 3 Chemická struktura monepantelu (Karadzovska et al. 2009). Monepantel a ostatní AADs působí jako nikotinoví agonisté na nikotinový acetylcholinový receptor (nAChR) nematod. Stejné účinky mají i další cholinergní anthelmintika jako levamisol a pyrantel (Rana a Misra-Bhattacharya 2013). Rufener et al. (2009) provedli genetické studie s AAD s citlivými a rezistentními mutanty Caenorhabditis elegans a Haemonchus contortus. Po osekvenování celé délky kódující sekvence nAChR u citlivé a mutantní populace se ukázalo postižení mutantů rezistentních k AAD ve dvou genech (Rufener et al. 2009). Postižené geny monepantel1 (Hco-mptl-1) u H. contortus a gen acr- 23 u C. elegans tvoří součást pro nematoda specifických DEG - 3 podrodiny nAChR α- podjednotky. Tyto receptory u jiných živočichů nejsou. Monepantel působí jako pozitivní alosterický modulátor specifického receptoru acetylcholinu MPTL - 1 u nematod (Epe a Kaminsky 2013). Navázání léčiva na receptor způsobí podnět, receptor se otevře, ale nelze už zavřít. Dochází tak k nekontrolovatelnému konstantnímu toku iontů, což způsobí u parazita hyperkontrakci stěny svalů vedoucí k paralýze, křečovitým kontrakcím přední části hltanu a následuje smrt parazita (Kaminsky et al. 2008a).
28
Monepantel je po per orálním podání rychle metabolizován. Dochází k přeměně sulfidu monepantelu na přechodný sulfoxid a následně na sulfon (Kinsella et al. 2011). Sulfon tvoří hlavní aktivní metabolit přeměny monepantelu a stanovení jeho hladiny slouží k posouzení účinnosti monepantelu a také k posouzení množství reziduí v kozím a v ovčím mase a mléce. Monepantel je od března roku 2009 registrován pod komerčním názvem Zolvix (obr. 4) jako per orální anthelmintikum pro ovce firmy Novartis. Zolvix se zvířatům podává speciálním dávkovačem, který eliminuje kolísání dávky a tak zajišťuje snadné a přesné dávkování s omezením plýtvání a rizikem poranění (The Zolvix OPTIMUM System- Zolvix Monepantel). Podávaná dávka je 2,5 mg monepantelu na kilogram živé váhy zvířete a účinkuje proti dospělým a L4 vývojovým stádiím všech hlavních druhů gastrointestinálních hlístic. Zolvix je v současné době dostupný především na Novém Zélandě, v Austrálii, v zemích Jižní Ameriky a některých státech Evropy (Epe a Kaminsky 2013).
Obr. 4 Preparát Zolvix a speciální dávkovač (The Zolvix OPTIMUM System- Zolvix Monepantel).
29
4.2 Derquantel Jedná se o další nové širokospektré anthelmintikum, které by mohlo pomoci zvládnout boj s rezistentními nematodami. Derquantel sám byl poprvé patentován v roce 2001, ale na trh se dostal až roce 2010 jako Startect- kombinovaný přípravek s abamectinem (Epe a Kaminsky 2013). Derquantel (2- deoxy- paraherquamid) je polosyntetická sloučenina patřící do třídy spiroindolů (Little et al. 2011). Svůj původ má odvozený od paraherquamidu, který vzniká jako fermentační produkt z Penicillium simplicissimum po chemické redukci (Epe a Kaminsky 2013).
Obr. 5 Chemická struktura derquantelu (An Entirely New Class of Anhelmintic.Startect). Mechanizmus
účinku
derquantelu
spočívá
v tom,
že
blokuje
účinek
acetylcholinu a tím nedochází k aktivaci 45 - pS kanálu. U parazita dojde k ochrnutí a paralýze. Oproti monepantelu je tedy antagonistou aktivace nikotin acetylcholinových receptorů. Derquantel v kombinaci s abamektinem (makrocyklický lakton-avermektin B1a) v přípravku Startect firmy Pfizer působí aktivně proti dospělým a L4 vývojovým stádiím všech hlavních gastrointestinálních nematod. Jeho použití má ale háček. První omezení spočívá v tom, že je to orální anthelmintikum pouze pro ovce. U koní je přípravek Startect extrémně toxický. Druhé omezení je spojeno s jeho použitím u různých druhů nematod s vícečetnou lékovou rezistencí. Kaminsky et al. (2011) uvádí vysokou účinnost proti T. colubriformis rezistentní k makrocyklickým laktonům, ale oproti monepantelu pouze 18,3 % účinnost proti vývojovým stádiím H. contortus rezistentním k makrocyklickým laktonům. Monepantel u obou parazitů dosahoval účinnosti 99,9%. K podobným závěrům došel i Sager et al. (2012), který tvrdí, že
30
přípravek Startect nemusí poskytovat dostatečnou účinnost proti larválním a dospělým fázím H. contortus. I přes tato negativní fakta dává tento kombinovaný přípravek novou naději v boji proti rezistentním parazitům, protože došlo poprvé ke kombinaci látek, z nichž jedna má nový účinek a nebyla dosud použita jako samostatné anthelmintikum. Jak uvádí Little et al. (2011) je to v rozporu s předchozími terapeutickými postupy, protože dříve se kombinovala anthelmintika, která se k léčbě používala i samostatně a tím se rozvoj rezistence ještě více podpořil. Kombinace abamektinu, který má odlišný mechanizmus účinku oproti derquantelu, by měla minimalizovat rozvoj rezistence k derquantelu a celkově zpomalit rozvoj další rezistence (Little et al. 2011). Přípravek Startect (obr. 6) stejně jako Zolvix se podává ovcím per orálně speciálním dávkovačem- 2 mg/ kg derquantelu a 0,2 mg/ kg abamectinu. Startect byl v roce 2010 registrován na Novém Zélandě a v roce 2012 v Anglii (Epe a Kaminsky 2013).
Obr. 6 Preparát Startect a speciální dávkovač (A New Class of Anthelmintic. A Novel Combination. – Startect).
31
5. DALŠÍ MOŽNOSTI V BOJI PROTI HELMINTŮM 5.1 Kombinace anthelmintik V lidské medicíně je naprosto běžné kombinovat léky například při rakovině, ale i virové nebo bakteriální infekci. Pro pacienta z toho plynou výhody v podobě zvýšení účinnosti léků a také se zmenší riziko rezistence. Strategie kombinace dvou veterinárních anthelmintik byla studována pomocí počítačových simulací a ukazuje na to, že kombinace léčiv může zpomalit rozvoj rezistence na nové třídy anthelmintik tím, že se sníží výskyt rezistentních alel v populaci, jak jen to nejvíc půjde (Leathwick 2012, Geurden et al. 2012). World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology proto vydala pokyny, proč je výhodné kombinovat veterinární anthelmintika, s cílem poskytnou vědecký základ o této problematice a doporučit globálně platná pravidla o schvalování fixní jednotlivé dávky, kterou tvoří kombinace anthelmintik (Geary et al. 2012). Kombinované přípravky by měly být navržené tak, aby kryly požadované spektrum, aby minimalizovaly nebo přinejmenším zpozdily rozvoj a šíření rezistence na nové a stávající třídy anthelmintik nebo k překonání stávající rezistence specifické pro daný druh (Geary et al. 2012). Ukázkou, že kombinace anthelmintik může fungovat je přípravek Startect firmy Pfizer. I přesto ale na tuto strategii mají některé země odlišný názor (Little et al. 2011).
5.2 Vakcinace Mimo snahu vyvíjet nová anthelmintika je i snaha vytvořit vakcínu proti helmintům. Stále je to ale běh na dlouhou trať. Nedávné pokroky v oblasti genomiky a proteomiky nám umožní in vivo i in vitro molekulární studie k pochopení interakcí helminta a jeho hostitele (Foster a Elsheikha 2012). Možnosti na vyvinutí vakcíny, která by byla účinná, jsou omezené díky antigenní složitosti parazitů (Adamu et al. 2013). Je nutné pochopit, které efektorové molekuly a jakým mechanizmem spolu interagují, jak helmint
komunikuje s imunitním
systémem
hostitele
a
jaká
je
patogeneze
helmintoparazitárních onemocnění. Znalost imunitních reakcí může přispět ke zkvalitnění sérologické diagnostiky helmintóz nebo k vývoji adekvátních vakcín poskytujících ochranu lidem i zvířatům
32
v endemických oblastech (Volf et al. 2007). Na žádné lidské parazitární onemocnění dosud neexistuje účinná vakcína, u ovcí a skotu se v rámci prevence cestodóz rodu Taenia a Echinococcus používá aplikace povrchových antigenů onkosfér připravených rekombinantními technologiemi, k prevenci nematodóz se používá perorální vakcína založená na radiačně atenuovaných larvách třetího stádia (Volf et al. 2007). Dle Mertové (2011) byly jediné úspěšné vakcíny vyvinuty proti larválním stádiím Dictyocaulus viviparus a Dictyocaulus filaria.
5.3 Rostlinné alternativy V současné době se vyrojilo velké množství studií zabývajících se využitím výtažků z rostlin jako potencionálních anthelmintik. Náklady na řízení parazitické kontroly a používání chemoterapeutik jsou vysoké a patří mezi nejčastější způsoby zdolávání onemocnění vyvolaných helminty. Jedním z dalších způsobů, jak odolávat parazitickým onemocněním, je získat nové léčebné látky hodnocením anthelmintické aktivity výtažků z rostlin. Rostliny by mohly vést k objevu nových chemických koster, které by se mohly rozvíjet dalším výzkumem v laboratoři za účelem získání vyšší účinnosti a nižší toxicity. Adamu et al. (2013) prováděli výzkum toxicity a účinnosti u výtažků z listů celkem 13 rostlin používaných v ethnoveterinární medicíně v Jižní Africe. Stanovovali inhibiční aktivitu acetonových extraktů rostlin, které jsou tradičně používané pro jejich schopnost ovlivňovat líhnutí z vajíček a larvální vývoj Haemonchus contortus. Jako nejslibnější pro další výzkum se ukázaly extrakty z Maesa lanceolata, Heteromorpha trifoliata, Leucosidea sericea. Problém, se kterým se ale Adamu a jeho tým potýkali, byla toxicita acetonových extraktů pro buňky. Domnívají se, že při použití organického rozpouštědla k extrakci, může dojít k uvolnění toxických látek. Tradiční léčitelé používají vodu jako extrakční médium a proto budou budoucí studie k ověření účinnosti a toxicity prováděny ve vodném prostředí. Lone et al. (2013) zase studovali účinek vodních a metanolových extraktů Euphorbia helioscopia L. (obr. 7) proti H. contortus. Ve své studii zjistili, že metanolový výtažek z této rostliny má dobrou in vitro a in vivo účinnost. In vitro studie ukázaly, že největší schopnost na snížení motility červů má dávka 50 mg/ml metanolového extraktu, je účinnější než vodný extrakt o stejné koncentraci (Lone et al.
33
2013). Je možné, že taniny obsažené v extraktech E. helioscopia by mohly způsobovat smrt H. contortus.
Obr. 7 Euphorbia helioscopa L. (Shah et al. 2006). Éterické oleje z máty jsou zase studovány jako potencionální anthelmintika pro léčbu cystické echinokokózy (Maggiore et al. 2012). Cysteinové proteinázy obsažené v ovoci jako je papája, fíky, kiwi a ananas by mohly být další potencionální skupinou nových anthelmintik. Buttle et al. (2011) ukazuje na silnou anthelmintickou aktivitu supernatantu papájového latexu, který by mohl být účinný v boji proti dospělým stádiím H. contortus ve slézu ovcí. Zahir et al. (2012) zjistili, že metanolový extrakt z Ricinus communis v jejich studii byl z 94% účinný proti motolici Paramphistomum cervi. Zároveň z extraktu vyseparovali a identifikovali epikatechin, který by mohl být potenciální nová antiparazitární sloučenina. Rostliny jsou nová naděje v anthelmintické léčbě. Jejich využití v terapii je ale omezeno z důvodu nutnosti provádět další screening ke standardizaci efektivní účinné látky, poznat jejich mechanizmus účinku a především stanovit jejich toxicitu.
34
Závěr Helmintorezistence je v současné době celosvětovým problémem v chovech malých přežvýkavců a koní, dříve používaná širokospektrá anthelmintika nezabírají a vlivem selekce se rezistence šíří dál. Objev aminoacetonitrilových derivátů a jejich zástupce monepantelu, kombinace anthelmintik, snaha o vývin vakcíny a využití rostlinných výtažků v léčbě helmintóz by mohlo zastavit nebo alespoň zpomalit vývoj rezistence. Ve své práci jsem se především zaměřila na nová anthelmintika a jejich mechanizmy účinku a pak na další metody, jak oddálit rozvoj rezistence. Jednoznačně největší plus vidím ve využití rostlinných výtažků. Rostlin je kolem nás nepřeberné množství, nejsou dostatečně prozkoumané a skrývají v sobě možnost, že v nich najdeme účinný lék, který další rozvoj rezistence zarazí. Rostliny byly předchůdci prvních anthelmintik, postupně je nahradily semisyntetické a syntetické sloučeniny a teď se k nim zase vracíme. Problémem je ale jejich poměrně úzké terapeutické rozmezí. Kompromisem by mohlo být využití látky rostlinného původu jako základu pro nové anthelmintikum. Stále se snažíme hledat nové strategie v boji proti helmintům, abychom jim mohli vzdorovat i v budoucnu, kdy třeba nové léky vzniklé teď už nebudou účinné.
35
POUŽITÁ LITERATURA A OSTATNÍ ZDROJE ADAMU, M., NAIDOO, V., ELOFF, J.N. Efficacy and toxicity of thirteen plant leaf acetone extracts used in ethnoveterinary medicine in South Africa on egg hatching and larval development of Haemonchus contortus. BMC Veterinary Research, 2013, vol. 9, no. 1, s. 9. BUTTLE, D.J., BEHNKE, J.M., BARTLEY, Y., ELSHEIKHA, H.M., BARTLEY, D.J., GARNETT, M.C., DONNAN, A.A., JACKSON, F., LOWE, A., DUCE, I.R. Oral dosing with papaya latex is an effective anthelmintic treatment for sheep infected with Haemonchus contortus. Parasites & Vectors, 2011, vol. 4, no. 1, s. 11. DUCHÁČEK, L., LAMKA, J. Veterinární vademecum pro farmaceuty. 1. vyd. Praha: Karolinum 2006. s. 18- 28 ISBN 80-246-1263-1. EPE, CH., KAMINSKY, R. New advancement in anthelmintic drugs in veterinary medicine. Trends in Parasitology, 2013, vol. 29, no. 3, s. 129- 134.
FOSTER, N., ELSHEIKHA, H.M. The immune response to parasitic helminths of veterinary importance and its potential manipulation for future vaccine control strategies. Parasitology Research, 2012, vol. 110, no. 5, s. 1587- 1599. GEARY, G.T., HOSKING, B.C., SKUCE, P.J., von SAMSON- HIMMELSTJERNA, G., MAEDER, S., HOLDSWORTH, P., POMROY, W., VERCRUYSSE, J. World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P.) Guideline: Anthelmintic combination products targeting nematode infections of ruminants and horses. Veterinary Parasitology, 2012, vol. 190, no. 1- 2, s. 306- 316. GEURDEN, T., HODGE, A., NOÉ, L., WINSTANLEY, D., BARTLEY, D.J., TAYLOR, M., MORGAN, C., FRASER, S.J., MAEDER, S., BARTMAN, D. The efficacy of a combined oral formulation of derquantel- abamectin against anhelmintic resistant gastro- intestinal nematodes of sheep in the UK. Veterinary Parasitology, 2012, vol. 189, no. 2- 4, s. 308- 316. HORÁK, P., SCHOLZ, T. Biologie helmintů. 1. vyd. Praha: Karolinum 1998. 140 s. ISBN 80-7184-782-8. IHLER, C.F. Anthelmintic resistance. An overview of the situation in the Nordic countries. Acta Veterinaria Scandinavica, 2010, vol. 52, suppl. 1:S 24, 5 s. JÍRA, J. Lékařská helmintologie: Helmintoparazitární nemoci. 1. vyd. Praha: Galén 1998. 496 s. ISBN 80-85824-82-5.
36
KAMINSKY, R. ET AL. 2008a A new class of anthelmintik effective against drugresistant nematodes. NATURE, 2008, vol. 452, s. 176- 180. KAMINSKY, R. ET AL. 2008b Identification of the amino-acetonitrile derivative monepantel (AAD 1566) as a new anthelmintic drug development candidate. Parasitology Research, 2008, vol. 103, no. 4, s. 931- 939. KAMINSKY, R., MOSIMANN, D., SAGER, H., STEIN, P., HOSKING, B. Determination of the effective dose rate for monepantel (AAD 1566) against adult gastro- intestinal nematodes in sheep. International Journal for Parasitology, 2009, vol. 39, s. 443- 446. KAMINSKY, R., BAPTS, B., STEIN, P.A., STREHLAU, G.A., ALLAN, B.A., HOSKING, B.C., ROLFE, P.F., SAGER, H. Differences in efficacy of monepantel, derquantel and abamectin against multi-resistant nematodes of sheep. Parasitology Research, 2011, vol. 109, no. 1, s. 19- 23. KAPLAN, R.M., VIDYASHANKAR, A.N. An inconvenient truth: Global worming and anthelmintic resistance. Veterinary Parasitology, 2012, vol. 186, no. 1- 2, s. 70- 78. KARADZOVSKA, D., SEEWALD, W., BROWNING, A., SMAL, M., BOUVIER, J., GIRAUDEL, J.M. Pharmacokinetics of monepantel and its sulfone metabolite, monepantel sulfone, after intravenous and oral administrativ in sheep. Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 2009, vol. 32, no. 4, s. 359- 367. KINSELLA, B., BYRNE, P., CANTWELL, H., McCORMACK, M., FUREY, A., DANAHER, M. Determination of the new anthelmintic monepantel and its sulfone metabolite in milk and muscle using a UHPLC- MS/MS and QuEChERS method. Journal of chromatogramy B, 2011, vol. 879, s. 3707- 3713. KOŘÍNKOVÁ, K. Obecná parazitologie: význam a biologie parazitů. 1. vyd. Ústí nad Labem: Univerzita J. E. Purkyně Přírodovědecká fakulta 2006. 92 s. ISBN 80-7044798-2. LAMKA, J., DUCHÁČEK, L. Veterinární léčiva pro posluchače farmacie. 3. vyd. Praha: Karolinum 2006. s. 61- 71 ISBN 80-246-1243-7. LEATHWICK, D.M. Modelling the benefits of a new class of anthelmintic in combination. Veterinary Parasitology, 2012, vol. 186, no. 1- 2, s. 93- 100.
37
LITTLE, P.R., HODGE, A., MAEDER, S.J., WIRTHERLE, N.C., NICHOLAS, D.R., COX, G.G., CONDER, G.A. Efficacy of a combined oral formulation of derquantel– abamectin against the adult and larval stages of nematodes in sheep, including anthelmintic-resistant strains. Veterinary Parasitology, 2011, vol. 181, no. 2- 4, s. 180193. LONE, B.A., BANDH, S.A., CHISHTI, M.Z., BHAT, F.A., TAK, H., NISA, H. Anthelmintic and antimicrobial activity of methanolic and aqueous extracts of Euphorbia helioscopia L. Tropical Animal Health and Production, 2013, vol. 45, no. 3, s. 743- 749. MAGGIORE, M., ALBANESE, A.A., GENDE, L.B., EGUARAS, M.J., DENEGRI, G.M., ELISSONDO, M.C. Anthelmintic effect of Mentha spp. essential oils on Echinococcus granulosus protoscoleces and metacestodes. Parasitology Research, 2012, vol. 110, no. 3, s. 1103- 1112. MERTOVÁ, J. Léková rezistence u parazitických helmintů. Hradec Králové, 2011. 74 s. Diplomová práce na Farmaceutické fakultě Univerzity Karlovy na katedře biochemických věd. Vedoucí diplomové práce Doc. Ing. Barbora Szotáková, Ph.D. RANA, K.J., MITRA- BHATTACHARYA, S. Current drug targets for helminthic diseases. Parasitology Research, 2013, vol. 112, no. 5, s. 1819- 1831. RUFENER, L., MÄSER, P., RODITI, I., KAMINSKY, R. Haemonchus contortus Acetylcholine Reseptors of the DEG- 3 and Their Role in Sensitivity to Monepantel. PLoS Pathogens, 2009, vol. 5, no. 4, s. 11. SAGER, H., BAPTS, B., STREHLAU, G.A., KAMINSKY, R. Efficacy of monepantel, derquantel and abamectin against adult stages of a multi-resistant Haemonchus contortus isolate. Parasitology Research, 2012, vol. 111, no. 5, s. 2205- 2207. SHAH, S.R.U., QASIM, M., KHAN, I.A., SHAH, S.A.U. Study of Medicinal Plants Among Weeds of Wheat and Maize in Peshawar Region. Pakistan Journal of Weed Science Research, 2006, vol. 12, no. 3, s. 191- 197. STUCHLÍKOVÁ, L., JIRÁSKO, R., VOKŘÁL, I., LAMKA, J., ŠPULÁK, M., HOLČAPEK, M., SZOTÁKOVÁ, B., BÁRTÍKOVÁ, H., POUR, M., SKÁLOVÁ, L. Investigation of the metabolism of monepantel in ovine hepatocytes by UHPLC/MS/MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, vol. 405, no. 5, s. 1705- 1712. VÁRADY, M., PAPADOPOULOS, E., DOLINSKÁ, M., KÖNIGOVÁ, A. Anthelmintic resistance in parasites of small ruminants: sheep versus goats. Helminthologia, 2011, vol. 48, no. 3, s. 137- 144. 38
VOLF, P., HORÁK, P., ET AL. Parazité a jejich biologie. 1. vyd. Praha: Triton 2007. 318 s. ISBN 978-80-7387-008-9. ZAHIR, A.A., RAHUMAN, A.A., BAGAVAN, A., GEETHA, K., KAMARAJ, CH., ELANGO, G. Evaluation of medicinal plant extracts and isolated compound epicatechin from Ricinus communis against Paramphistomum cervi. Parasitology Research, 2012, vol. 111, no. 4, s. 1629- 1635.
OSTATNÍ ZDROJE Anthelmintika- Velký lékařský slovník [online]. [cit. 2013-03-20]. Dostupné z:
. Terapie- Multimediální trenažér plánování ošetřovatelské péče [online]. [cit. 2013-0320]. Dostupné z: . Arekolin- Velký lékařský slovník [online]. [cit. 2013-04-14]. Dostupné z: . Antiparasitic Resistance in Cattle and Small Ruminants in the United States: How to Detect It and What to Do About It- U. S. Food and Drug Administration [online]. Poslední revize 04.2013 [cit. 2013-04-22]. Dostupné z: . Veterinární a chovatelská opatření proti vnitřním parazitům u koní- Česká hipiatrická společnost [online]. [cit. 2013-04-22]. Dostupné z: . The Zolvix OPTIMUM System- Zolvix Monepantel [online]. [cit. 2013-04-24]. Dosupné z: . An Entirely New Class of Anhelmintic.- Startect [online]. [cit 2013-04-28]. Dostupné z: . A New Class of Anthelmintic. A Novel Combination. – Startect [online]. [cit. 2013-0428]. Dostupné z: < http://www.startect.co.nz/quick-facts/ >.
39
