UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA BIOLOGICKÝCH A LÉKAŘSKÝCH VĚD

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA BIOLOGICKÝCH A LÉKAŘSKÝCH VĚD

REZISTENCE BAKTERIÍ RODU PSEUDOMONAS K ANTIBIOTIKŮM BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Vedoucí bakalářské práce: Mgr. MARCELA VEJSOVÁ, Ph. D.

HRADEC KRÁLOVÉ, 2014

LUKÁŠ GOLD

Poděkování Touto cestou bych rád poděkoval vedoucí práce Mgr. Marcele Vejsové, Ph. D. za cenné rady a připomínky, jak při tvorbě práce, tak i při její celkové úpravě. A MUDr. Evě Chudáčkové z Ústavu mikrobiologie ve FN v Plzni za pomoc při získání MALDI – TOF spekter.

2

Prohlášení „Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorských dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpal, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci jsou řádně citovány. Práce nebyla použita k získání jiného nebo stejného titulu.“ V Hradci Králové 18. 4. 2014

Podpis:

3

Obsah

Obsah ..................................................................................................................................... 4 Souhrn.................................................................................................................................... 7 Abstract .................................................................................................................................. 8 1. SEZNAM ZKRATEK ....................................................................................................... 9 2. ÚVOD.............................................................................................................................. 10 3. ZADÁNÍ – CÍL PRÁCE ................................................................................................. 11 4. OBECNÉ VLASTNOSTI RODU PSEUDOMONAS ..................................................... 12 4. 1 Morfologie pseudomonád ......................................................................................... 12 4. 2 Antigenní struktura ................................................................................................... 12 4. 3 Patogenita rodu Pseudomonas .................................................................................. 13 4. 3. 1 Exopolysacharid (Alginát) .................................................................................... 13 4. 3. 2 Exotoxiny ............................................................................................................. 13 4. 3. 3 Exoenzym S (ExoS) ............................................................................................. 13 4. 3. 4 Hemolyziny .......................................................................................................... 14 4. 3. 5 Proteázy ................................................................................................................ 14 4. 4 Produkce pigmentů ................................................................................................... 15 4. 4. 1 Pyocyanin ............................................................................................................. 15 4. 5 Produkce bakteriocinů .............................................................................................. 16 4. 5. 1 Pyocin ................................................................................................................... 16 4. 5. 1. 1 Bakteriocidní aktivita pyocinu ......................................................................... 16 4. 6 Tvorba biofilmu ........................................................................................................ 17 4. 7 Taxonomické rozdělení ............................................................................................ 18 5. KULTIVACE BAKTERIÍ RODU PSEUDOMONAS .................................................... 19 5. 1 Kultivace na krevním agaru ...................................................................................... 19 5. 2 Kultivace na ENDO agaru ........................................................................................ 19 5. 3 Selektivní agary k záchytu pseudomonád ................................................................ 20 5. 3. 1 Pseudomonádový izolační agar ............................................................................ 20 5. 3. 2 Cetrimidový agar .................................................................................................. 20 5. 3. 3 Pseudomonádový agar C-N .................................................................................. 20 4

6. IDENTIFIKACE BAKTERIÍ RODU PSEUDOMONAS .............................................. 21 6. 1 Biochemická detekce cytochromoxidázy ................................................................. 21 6. 1. 1 Princip testu Mikro-La-Test OXItest .................................................................... 21 6. 1. 2 Jednoduchý procesní přehled Mikto-La-Test OXItest ......................................... 21 6. 2 Biochemická identifikace Mikro-La-Test NEFERMtest 24 ..................................... 22 6. 2. 1 Složení soupravy Mikro-La-Test NEFERMtest 24 .............................................. 22 6. 2. 2 Jednoduchý pracovní postup ................................................................................ 23 6. 3 Biochemická identifikace krátkou řadou cukrů ........................................................ 24 6. 4 Biochemická identifikace pomocí VITEK systému ................................................. 26 6. 4. 1 VITEK 2 systém ................................................................................................... 26 6. 4. 2 Hrubý procesní přehled ........................................................................................ 26 6. 5 MALDI-TOF MS ..................................................................................................... 26 6. 5. 1 Princip a charakteristika metody .......................................................................... 27 6. 5. 2 Jednoduchý procesní přehled ............................................................................... 27 6. 5. 3 Analyzátor TOF .................................................................................................... 27 6. 5. 4 Hodnocení identifikace pomocí MALDI – TOF MS ........................................... 28 6. 5. 5 Shrnutí identifikace bakteriálních izolátů pomocí techniky MALDI – TOF ....... 29 6. 6 Molekulární techniky................................................................................................ 30 6. 6. 1 PCR – polymerázová řetězová reakce .................................................................. 30 6. 6. 2 Jednoduchý procesní přehled klasické PCR ......................................................... 30 6. 6. 3 Real Time – PCR .................................................................................................. 31 6. 6. 4 PCR u pseudomonád ............................................................................................ 31 7. REZISTENCE A JEJÍ HLAVNÍ MECHANISMY ......................................................... 32 7. 1 Nepropustnost vnější membrány .............................................................................. 32 7. 1. 1 Průnik antibiotik přes buněčnou membránu Pseudomonas aeruginosa............... 33 7. 1. 2 Vnější membrána jako bariéra .............................................................................. 33 7. 2 Role efluxního systému ............................................................................................ 34 7. 3 Produkce enzymů ..................................................................................................... 35 7. 4 Alginát, biofilm a rezistence..................................................................................... 35 7. 5 Změny v cíli .............................................................................................................. 36 8. PRODUKCE KARBAPENEMÁZ A JEJICH DETEKCE ............................................. 37 8. 1 β-laktamová antibiotika ............................................................................................ 37 8. 2 Rozdělení β-laktamáz ............................................................................................... 37 5

8. 3 Genetika β-laktamáz ................................................................................................. 38 8. 4 Metalo-β-laktamázy .................................................................................................. 38 8. 5 Inhibitory β-laktamáz ............................................................................................... 38 8. 6 Detekce karbapanemáz ............................................................................................. 39 8. 6. 1 Referenční metoda ................................................................................................ 39 8. 6. 2 Molekulární techniky............................................................................................ 39 8. 6. 3 Fenotypové testy ................................................................................................... 39 8. 6. 3. 1 Hodge test ......................................................................................................... 39 8. 6. 3. 2 CARBA NP test ................................................................................................ 40 8. 6. 4 Detekce pomocí MALDI – TOF .......................................................................... 40 8. 6. 4. 1 Detekce degradačních produktů meropenemu ................................................. 40 8. 6. 4. 2 Analýza spekter z MALDI – TOF .................................................................... 42 9. PSEUDOMONÁDOVÉ INFEKCE A JEJICH LÉČBA ................................................. 43 9. 1 Nejčastěji zasažená místa ......................................................................................... 43 9. 2 Nozokomiální nákazy ............................................................................................... 44 9. 2. 1 Pneumonie ............................................................................................................ 44 9. 2. 2 Infekce močových cest ......................................................................................... 44 9. 2. 3 Infekce krevního oběhu ........................................................................................ 44 9. 3 Terapie infekcí vyvolaných pseudomonádami ......................................................... 45 10. DISKUZE ...................................................................................................................... 47 11. ZÁVĚR .......................................................................................................................... 48 12. SEZNAM ORBÁZKŮ .................................................................................................. 49 13. SEZNAM TABULEK ................................................................................................... 50 14. POUŽITÁ LITERATURA ............................................................................................ 51 15. PŘÍLOHY ...................................................................................................................... 59

6

Souhrn Lukáš Gold Rezistence bakterií rodu Pseudomonas k antibiotikům Bakalářská práce Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Zdravotnická bioanalytika; Zdravotní laborant Tato rešeršní práce vznikla za účelem základního shrnutí, poznatků o rezistenci bakterií rodu Pseudomonas k antibiotikům. Spojení mezi rezistencemi a jejich diagnostikou za využití nově využívaných technik, především hmotnostní spektrometrie MALDI – TOF. Pro uvedení do problematiky tohoto široce obsáhlého tématu jsme do práce zařadili kapitoly o obecných vlastnostech pseudomonád. To proto, aby byly objasněny mechanismy vzniku rezistence k antibiotikům. Část rešerše patří také laboratorní diagnostice s využitím klasických fenotypových metod a nově využívaných technik hlavně hmotnostní spektrometrie MALDI – TOF.

Částí práce jsou kapitoly o infekcích

způsobenými rodem Pseudomonas a jejich doporučené terapii. Postavení rodu Pseudomonas jako jednoho z nozokomiálních patogenů je zmíněna obecněji. Tato práce tedy obsahuje obecné poznatky o pseudomonádách, na které navazuje vysvětlení problematiky o rezistencích k antibiotikům – především o mechanismech rezistencí a produkci karbapenemáz, kterou lze detekovat díky technice MALDI – TOF. Klíčová slova: PSEUDOMONÁDY, REZISTENCE K ANTIBIOTIKŮM, KARBAPENEMÁZY

7

Abstract Lukáš Gold The resistance of Pseudomonas bacteria species to antibiotics Bachelor thesis Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove Medical laboratory technician This work was focused on summarising the basic knowledge on the resistance of Pseudomonas bacteria species to antibiotics, and the connection between their resistance and their diagnostics using new techniques, especially the mass spectrometry MALDI – TOF. As an introduction to this very extensive topic, we included a chapter on the general characteristics of Pseudomonas, in order to clarify the mechanisms by which resistance to antibiotics arise. Part of this review also includes laboratory diagnosis using conventional phenotypic methods as well as new techniques, mainly using the mass spectrometry MALDI – TOF. A small and yet considerably significant section of the work includes chapters on the infections caused by the Pseudomonas species and their recommended therapies. The position of the Pseudomonas species as one of the nosocomial pathogens is generally made mention of in this work. This review therefore, contains general information on Pseudomonas species that are related to their resistance to antibiotics, and mainly pertaining to their mechanisms of resistance and production of carbapenemases, which can be detected by MALDI – TOF techniques.

Keywords: PSEUDOMONAS, ANTIBIOTIC RESISTANCE, CARBAPENEMASES

8

1. SEZNAM ZKRATEK ARO

Anesteriologicko resuscitační oddělení

BAL

Bronchoalveolární laváž

Bp

Páry bazí

DNA

Deoxyribonukleová kyselina

EDTA

Etylendianintetraoctová kyselina

HISU

Hajny, Indol, Simons, Urea

JIP

Jednotka intenzivní péče

MALDI

Matrix-assisted-desorption-ionization

MBL

Metalo-β-laktamáza

MHT

Modifikovaný Hodge test

MIC

Minimální inhibiční koncentrace

MS

Hmotnostní spektrometrie

MW

Relativní molekulová hmotnost

Na+

Kation sodný

Opr

Porin

PBP

Penicilin vázající protein

PCR

Polymerázová řetězová reakce

PE

Polyethylen

PMK

Permanentní močový katétr

PSAE

Pseudomonas aeruginosa

SOP

Standardní operační postup

TOF

Time-off-flight (čas letu)

9

2. ÚVOD Bakterie rodu Pseudomonas jsou kultivačně a růstově nenáročné mikroorganismy, které kolonizují přírodní i umělá prostředí. Fyziologicky kolonizují různé části lidského těla. Infekce vyvolávají především u imunokompromitovaných pacientů. A jsou příčinou nozokomiálních infekcí, díky schopnosti přilnout k různým materiálům – katétry, cévky apod. Barvící technikou dle Grama a mikroskopií se řadí mezi Gram negativní tyčinky. Díky své neschopnosti štěpit cukry jsou také nazývány jako Gram negativní nefermentující tyčinky. Ve vztahu ke kyslíku jsou aerobní nebo fakultativně anaerobní bakterie. Hlavním zástupcem toho rodu je Pseudomonas aeruginosa. Jsou to bakterie, které vykazují pozoruhodné schopnosti odolávat antibiotikům a to díky různým mechanismům. Velmi znepokojivý je fakt, že tyto mechanismy často bývají přítomny současně, čímž vznikají multirezistentní kmeny, které představují vysoké riziko u imunokompromitovaných pacientů. Infekce vyvolávané pseudomonádami u těchto pacientů bývají často spojovány s vysokou mortalitou. Pro klinickou praxi je velmi důležité stanovení citlivosti pseudomonád k antibiotikům. Podstatou vlastní terapie je empirická léčba, která obvykle zahrnuje léčbu kombinovanou. Při těžkých infekcích je velmi důležitá spolupráce ošetřujícího lékaře a mikrobiologa, pro zahájení včasné terapie.

10

3. ZADÁNÍ – CÍL PRÁCE Cílem této literární rešerše je obecná charakteristika rodu Pseudomonas. Objasnění mechanismů rezistence a genetická výbava. Stanovení citlivosti k antibiotikům. Důležitou částí je produkce karbapenemáz a jejich stanovení. Zjištění výskytu rezistencí za vybrané období. Závěrem by mělo být vyhodnocení výsledků, jejich interpretace a diskuze s využitím teoretických a praktických znalostí dané problematiky. Obecná charakteristika rodu Pseudomonas. Mechanizmy rezistence - genetická výbava, plazmidy, transpozómy. Stanovení citlivosti k antibiotikům. Produkce karbapenemáz a metody stanovení. Diskuze s využitím teoretických a praktických znalostí dané problematiky.

11

4. OBECNÉ VLASTNOSTI RODU PSEUDOMONAS Bakterie rodu Pseudomonas jsou kosmopolitní Gram negativní tyčinky, izolované z půdy, vody, rostlin a živočichů včetně člověka. Jsou běžnými lidskými saprofyty. U zdravých jedinců způsobují onemocnění velmi zřídka. Nejznámějším zástupcem tohoto rodu je Pseudomonas aeruginosa (PSAE). 4. 1 Morfologie pseudomonád Buněčná stěna Gram negativních bakterií je tenká (cca 10 nm), nemá vysokou hmotnost. Svým složením je daleko složitější, než je tomu u Gram pozitivních bakterií. Buněčnou stěnu tvoří tenká vrstva peptidoglykanu. Nad touto vrstvou je membrána, která je tvořena dvojvrstvou fosfolipidů a bílkovinami. Tyto bílkoviny jsou navázány na obě strany fosfolipidové dvojvrstvy. Nazývá se vnější membrána a je připevněna k peptidoglykanu molekulami lipoproteinů. Někdy mohou být obaleny vrstvou slizu, která napodobuje pouzdro. (5, 50) Prostor mezi membránami se nazývá, periplazmatický prostor. Obsahuje řadu makromolekul, které se podílí na metabolické aktivitě Gram negativní bakterie. U pseudomonád jsou v tomto prostoru uloženy β-laktamázy (enzymy, které hydrolyzují βlaktamová antibiotika). Většina kmenů Pseudomonas aeruginosa se pohybuje pomocí jednoho polárního bičíku. Ovšem ne u všech bakterií toho rodu je polární, ale může být i subpolární. Některé kmeny vytvářejí kratší laterální bičíky (např.: Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas mendocina). Jedním z taxonomických znaků je právě počet a umístění bičíků. Široké spektrum Gram negativních bakterií včetně rodu Pseudomonas tvoří fimbrie (pili) typu 4. Jsou složeny z malých strukturálních podjednotek a zodpovídají za adhezi na epitelie. (37, 49, 52) 4. 2 Antigenní struktura Pomocí sérotypizace je doposud rozlišeno 17 hlavních termostabilních somatických antigenů u Pseudomonas aeruginosa. Lipopolysacharid u PSAE obsahuje O-řetězce, složené ze 2 polysacharidových jednotek A a B. Vysoká molekulová hmotnost B jednotky určuje antigenní specifičnost bakterie. (31, 45)

12

4. 3 Patogenita rodu Pseudomonas Na patogenitě bakterií rodu Pseudomonas se podílí několik faktorů. Jednak se může jednat o faktory, které jsou vázané na buňku. Nebo se může jednat o mimobuněčné – extracelulární produkty (hemolyziny, proteázy, exotoxiny), které přispívají k patogenitě. (5, 21, 50)

4. 3. 1 Exopolysacharid (Alginát) Tento polysacharid produkují mukoidní kmeny pseudomonád, které kolonizují dýchací cesty pacientů např. s cystickou fibrózou. Přechod pseudomonády v mukoidní kmen může podpořit její přetrvání v dýchacích cestách těchto pacientů. Tvorba mukoidních kmenů je brána, jako obrana pseudomonád proti imunitnímu systému hostitele (obrana proti fagocytóze). (18) 4. 3. 2 Exotoxiny Exotoxin je jednořetězcový toxin složený ze tří strukturálních domén a inhibuje syntézu proteinů. Jedná se o extracelulární ADP-ribosyl transferázu, která katalyzuje přenos ribosyl-ADP z NAD na elongační faktor 2. Tak vzniká inaktivní protein. Tento mechanismus je stejný jako u difterického toxinu. Exotoxin je brán jako hlavní faktor virulence u Pseudomonas aeruginosa, má smrtelné účinky pro myši a psy. Na buňky tkáňových kultur má cytotoxické účinky. (7, 21) 4. 3. 3 Exoenzym S (ExoS) Jedná se také o extracelulární ADP-ribosyl transferázu pseudomonád. Ovšem odlišnou od exotoxinu A. Odlišnost je způsobena tím, že neupravuje elongační faktor 2, ale přímo proteiny. Je jeden z toxinů, který se podílí na kolonizaci a šíření rodu Pseudomonas během infekce. Může způsobovat poškození tkání při plicních infekcích a mění cytoskelet buňky. (7, 27)

13

4. 3. 4 Hemolyziny Pseudomonas aeruginosa může produkovat dva typy hemolyzinů. Jedním z nich je termolabilní fosfolipáza C, která katalyzuje hydrolýzu fosfatidylcholinu (lecithinu). Výsledkem hydrolýzy je fosfocholin. Fosfolipáza C je důležitá pro zahájení infekce, zejména v plicích. Kde je právě dostatek substrátů ve formě fosfolipidů. Druhým z hemolyzinů, které může Pseudomonas aeruginosa produkovat, je termostabilní glykolipid. Termostabilní glykolipid, je hemolyzin, který se podílí na infekcích očí a plic. Je složený z dvou molekul kyselých glykolipidů. Jeden z nich je rhamnolipid a druhý je také rhamnolipid ovšem s kyselinou β-hydroxydekanovou. Ta se podílí především na aktivitě hemolyzinu. (6, 32) 4. 3. 5 Proteázy Proteázy jsou enzymy, které hrají důležitou roli v patogenezi pseudomonád. Většina pseudomonád produkuje proteázy, které mají odlišné pH optimum, izoelektrický bod a substrátovou specifičnost. Do skupiny proteáz patří:
Endopeptidázy
Elastázy
Alkalické proteázy
LasA (stafylolytická) proteáza
Lysin specifické endopeptidázy Tyto peptidázy se podílí na štěpení fibrinu, elastinu a kolagenu. Mohou tak poškozovat drobné cévy, což vede k dalšímu poškození tkání a ve finálním stádiu až k nekróze. Elastáza a LasA protéza mohou degradovat elastin. LasA protéza má také stafylolytickou činnost, která vyplývá ze štěpení pentaglycinu v příčné vazbě s peptidoglykenem buněčné stěny. (5, 23, 47)

14

4. 4 Produkce pigmentů Bakterie rodu Pseudomonas mohou tvořit veliké množství pigmentů. Syntéza zelenomodrého pyocyaninu a žlutozeleného fluoresceinu, které jsou rozpustné ve vodě, je charakteristickou vlastností právě některých pseudomonád. Patří mezi ně Pseudomonas aeruginoa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida a z fytopatogenů Pseudomonas syringae.

4. 4. 1 Pyocyanin Pyocyanin (PCN) je modrozelený redox – aktivní sekundární metabolit, který patří do rodiny fenazinů. Některé in vitro studie ukázaly, že PCN má škodlivé účinky většinou na savčí buňky. Podílí se na inhibici buněčného dýchání, uvolňuje prostacyklin z endoteliárních buněk plic, inaktivuje katalázu a díky uvolňování interleukinu 2 omezuje růst T – lymfocytů. Indukuje také apoptózu u neutrofilních segmetů a moduluje redoxní cyklus glutationu v epiteliálních a endoteliárních buňkách plic. PCN také inaktivuje inhibitor α1 – proteázy a přispívá k nerovnováze mezi proteázovou a antiproteázovou čínností, která je často detekována u pacientů s cystickou fibrózou plic. Pro syntézu PCN jsou nutné dvě skupiny genových produktů. Nutný je VFR transkripční faktor pro aktivaci phnAB. Genové produkty phnAB syntetizují chinoliny, které regulují phzRABCDEFG operony 1 a 2, tedy strukturální geny pro fenazin. 42, 50)

15

(22, 25, 26,

4. 5 Produkce bakteriocinů Bakteriociny jsou na ribozómech syntetizované proteiny produkované bakteriemi. Exprese těchto proteinů přináší producentům selekční výhodu oproti konkurenčním bakteriálním druhům sdílejícím stejnou mikroekologickou niku. Na syntézu těchto proteinů působí řada faktorů, jako životní prostředí a růstové faktory. Zejména chemická povaha organického uhlíku, přístup vzduchu, pH, množství světla a kationty Mg2+, Zn2+ a Fe3+. Právě pyocin patří mimo jiné k faktorům virulence, proto zde bude zmíněn podrobněji. (34) 4. 5. 1 Pyocin Pyocin produkují pyocinogeny. Jsou popsány 3 typy tohoto proteinu. Jako první byl popsán R – pyocin. Všechny typy R – pyocinu jsou nukleáza a proteáza rezistentní. Tyto vlastnosti usnadňují jeho purifikaci a přípravu specifického antiséra. Druhým typem je F – pyocin. Je známo, že je spojený s R – pyocinem. Je také rezistentní k účinku nukleáz a proteáz. Třetí je S – pyocin, který je proteáza citlivý. (33, 34) 4. 5. 1. 1 Bakteriocidní aktivita pyocinu Bakteriocidní aktivitu má především R – pyocin. Ten zastavuje syntézu makromolekul v citlivých buňkách. Dojde k uvolnění intracelulárního materiálu a během 20 minut k buněčné smrti. Ta vyplývá z depolarizace cytoplazmatické membrány v souvislosti se vznikem pórů. R – pyocin je schopen „usmrtit“ jiné Gram negativní bakterie. Pyocin tedy může zajistit převahu daného bakteriálního kmene. (33, 34)

16

4. 6 Tvorba biofilmu Biofilmy jsou strukturální bakteriální společenství buněk, uzavřených v samostatně produkovaných polymerních matricích. Jsou spjaté s živým nebo neživým povrchem. Biofilmy jsou tedy jedním z důvodů, že bakterie mohou přilnout k pevným povrchům a tvořit slizký a kluzký povlak. Biofilmy představují chráněný růstový režim, který umožňuje přežití v nepřátelském prostředí. Struktury vytvářející biofilm, obsahují kanály, kterými mohou protékat živiny. Více než polovina infekčních onemocnění, které postihují mírně kompromitované jedince, zahrnují bakterie, které jsou v komenzálním vztahu s lidským tělem. Biofilmy se rozvíjí především na intertních površích nebo na odumřelých tkáních. Vyskytují se obvykle na lékařských nástrojích, katétrech, cévkách, ale vznikají také v živých tkáních. Tak je tomu např. u cystické fibrózy, kde je tvorba biofilmu v dýchacích cestách tvořenému Pseudomonas aeruginosa velkým rizikem. Růst biofilmů je pomalý. Může probíhat na jednom či více místech. Přisedlé bakteriální buňky uvolňují antigeny a stimulují tvorbu protilátek. Protilátky nejsou účinné při „usmrcení“ bakterií v biofilmu, ale mohou způsobit komplexní imunitní poškození okolních tkání. (10)

17

4. 7 Taxonomické rozdělení Uvádím zde taxonomické rozdělení podle NCBI databáze. Bacteria, Proteobacteria, Grammaproteobacteria, Pseudomonadales, Pseudomonadaceae Pseudomonas aeruginosa group Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas caeni Pseudomonas flavescens Pseudomonas jijuensis Pseudomonas mendocina Pseudomonas nitroreducens Pseudomonas oleovorans Pseudomonas pseudoalcaligenes Pseudomonas cf. pseudoalcaligenes Pseudomonas straminea Pseudomonas Marici Pseudomonas alcaliphia Pseudomonas azotifigens Pseudomonas brasicacearum Pseudomonas chloraphis group Pseudomonas fluorescens group Pseudomonas putida group Pseudomonas stutzei group Pseudomonas syringae group (14)

18

5. KULTIVACE BAKTERIÍ RODU PSEUDOMONAS Bakterie rodu Pseudomonas, jsou růstově a kultivačně nenáročné. Rostou při běžné kultivační teplotě 37°C. Bakterie tohoto rodu vztahem ke kyslíku řadíme mezi aerobní bakterie. Mezi nejčastěji izolovaný a klinicky významný kmen tohoto rodu paří Pseudomonas aeruginosa (PSAE). Kultury narostlé po 18 – 24 hodinách mají charakteristický zápach, označovaný jako jasmínový. (50)

5. 1 Kultivace na krevním agaru Krevní agar patří mezi základní kultivační média využívané v bakteriologických laboratořích (viz. Obr. 4 – přílohy). Některé bakterie rodu Pseudomonas zde mají charakteristický růst – zóna úplné hemolýzy = β hemolýza. Jiné kmeny hemolyziny neprodukují a mohou vytvářet drobné šedavé kolonie nebo naopak mukózní – přímo tekuté – kolonie. Kolonie často vytváří kovový lesk a v jejich přítomnosti je velmi často patrná pigmentace. (5, 50) 5. 2 Kultivace na ENDO agaru ENDO agar je selektivně diagnostické kultivační médium. Selektivita toho média spočívá v přítomnosti bazického fuchsinu odbarveného siřičitanem sodným. Ten působí jako inhibitor růstu Gram pozitivních bakterií. Zároveň působí jako indikátor štěpení laktózy. Laktóza je v agaru substrátem. Díky její přítomnosti rozlišujeme bakterie, které na agaru rostou na: štěpící laktózu a neštěpící laktózu. (viz. Obr. 5 – přílohy). Bakterie rodu Pseudomonas rostou na ENDO agaru ve světlých průhledných koloniích – neštěpí laktózu. Díky neschopnosti štěpit i další cukry se řadí bakterie rodu Pseudomonas mezi tzv. Gram negativní nefermentující tyčinky. (51)

19

5. 3 Selektivní agary k záchytu pseudomonád Jedná se o agary pro izolaci PSAE z klinických nebo potravinářských vzorků. Tyto agary podporují produkci pigmentu pyocyaninu.

Díky přítomnosti síranu draselného

dochází k potlačení produkce fluoresceinu. (51) 5. 3. 1 Pseudomonádový izolační agar Selektivita tohoto agaru je založena na přítomnosti irgasanu a halogenované bifenolované sloučenině. Tyto sloučeniny v určité koncentraci brání růstu ostatních bakterií. Na agaru rostou pouze bakterie PSAE. (51) 5. 3. 2 Cetrimidový agar Již z názvu vyplývá, že tento agar obsahuje vyšší koncentraci cetrimidu (0,3 mg/ml). Kromě Pseudomonas aeruginosa, jejíž kolonie jsou obklopeny modrozeleným pyocyaninem, se mohou na agaru objevit rezistentní kmeny klebsiel, proteů a providencií. (51)

5. 3. 3 Pseudomonádový agar C-N Je vysoce selektivním médiem pro PSAE. Selektivita je dána nižší koncentrací cetrimidu, než u cetrimidového agaru. Dojde tedy ke zlepšení záchytu právě Pseudomonas aeruginosa. K potlačení růstu ostatních Gram negativních nefermentujících tyčinek se do média přidává nalidixát sodný. (50, 51)

20

6. IDENTIFIKACE BAKTERIÍ RODU PSEUDOMONAS Jedním z prvních kroků identifikace je růst na kultivačních médiích, jak základních tak selektivních a selektivně diagnostických. O růstu na kultivačních agarech jsem se zmínil v předchozí kapitole. Bakterie rodu Pseudomonas jsou ovšem málo kdy odlišitelné od ostatních Gram negativních nefermentujících tyčinek. Proto k jejich identifikaci nestačí pouze kultivace, ale i další identifikační postupy. 6. 1 Biochemická detekce cytochromoxidázy Některé pseudomonády jsou k nerozeznání od acinetobakterů, burkholderií nebo stenotrofomonád, pak přichází na řady izolací a oxidázový test. 6. 1. 1 Princip testu Mikro-La-Test OXItest Oxidázový test je specifický pro detekci cytochromoxidázy, což je enzym produkovaný některými bakteriálními rody včetně rodu Pseudomonas. Přítomnost cytochromoxidázy je detekována barevnou reakcí N, N-dimethyl-1, 4-fenylendiaminu s αnaftolem. Výsledkem reakce je vznik idolfenolové modři. (54) 6. 1. 2 Jednoduchý procesní přehled Mikto-La-Test OXItest Sterilní bakteriologickou kličkou se odebere z kultivačního média čistá kolonie. A ta se rozetře na reakční plochu diagnostického proužku testu Mikro-La-Test OXItest. Po uběhnutí inkubační doby (0,5 – 1 minuta) se odečítá vzniklé barevné zabarvení (indofenolová modř). Nebo lze otisknout přímo reakční plošku na čistou kolonii přímo v misce s kultivačním médiem. Uvedl jsem procesní přehled zjednodušeně. Detailní provedení testu je dostupné u každé zakoupené soupravy a na stránkách firmy Erbalachema v sekci: Produktová podpora – pracovní návody – mikrobiologie. (54)

21

Tabulka

1:

Hodnocení

testu

na

detekci

cytochromoxidázy

od

filmy

Erbalachema;

Mikro-La-Test OXItest; kontrolní kmen Pseudomonas aeruginosa, 24 hod, 37°C

Výsledná barevná reakce Test

Zkratka testu

Pozitivní

Negativní

Oxidáza

OXI

modrá, světle modrá

šedá

6. 2 Biochemická identifikace Mikro-La-Test NEFERMtest 24 Testovací set NERERMtest je produktem firmy Erbalachema. Je určen pro rutinní identifikaci Gram negativních nefermentujících bakterií a čeledí Vibrionaceae, Aeromonadaceae a bakterií druhu Plesiomonas shigelloides. Testovací set je určen především pro bakterie z klinických vzorků. Umožňuje povést identifikaci čtyřiceti kmenů za pomocí dvaceti čtyř biochemických testů. (55) 6. 2. 1 Složení soupravy Mikro-La-Test NEFERMtest 24 Diagnostická souprava obsahuje:
10 mikrotitračních destiček (každá pro identifikaci 4 kmenů) se sušidlem
Návod na použití s diferenciační tabulkou
Barevná srovnávací stupnice pro tuto soupravu
40 formulářů pro záznam výsledků
10 PE sáčků pro inkubaci
Skladovací sáček (na uschování nespotřebované destičky), 1 ks
Víčko
CD kódová knihovna

22

6. 2. 2 Jednoduchý pracovní postup Uvádím zde zjednodušený pracovní postup. Detailní pracovní postup a další náležitosti je dostupný u každé zakoupené soupravy a na stránkách firmy Erbalachema v sekci: Produktová podpora – pracovní návody – mikrobiologie.
Izolace kultur Z primokultivace se provede izolace zvoleného bakteriální kultury. Provádí se standardně křížovým roztěrem na zvolené kultivační médium.
Příprava inokula Z čistě vyizolované kultury se připraví v nepufrovaném fyziologickém roztoku suspenze o objemu 3 ml. Zákal dobře homogenizované suspenze musí odpovídat 2,0 – 2,5 stupi McFarlandovy zákalové stupnice.
Inokulace Z připravené suspenze se pomocí automatické pístové pipety pipetuje 0,1 ml suspenze do všech jamek trojstripu. Trojstrip se uzavře hliníkovou fólií.
Inkubace Trojstrip se umístí do PE sáčku a vloží se do termostatu. Inkubace se provádí 24 hodin při 37°C.
Hodnocení Pro hodnocení testu se využívá barevná srovnávací stupnice a diferenciační tabulka, které jsou součástí setu Mikro-La-Test NEFERMtest 24 nebo, jak jsem uvedl úvodem, na webových stránkách společnosti Erbalachema. (55)

23

6. 3 Biochemická identifikace krátkou řadou cukrů Krátká řada cukrů, označována v některých laboratořích jako HISU je jednou z jednodušších způsobů biochemické identifikace bakterií. Využívá se k identifikaci některých bakterií čeledě Enterobacteriaceae a příbuzných Gram negativních tyčinek. Tento způsob identifikace zde uvádím proto, že bakterie rodu Pseudomonas lze také touto metodou orientačně identifikovat. Ve své podstatě se jedná o řadu zkumavek, ve kterých se sleduje výsledek jednotlivých biochemických testů. Kombinace těchto testů je charakteristická pro daný rod.
1. zkumavka – Glukóza Zkumavka je naplněná roztokem glukózy a v ní je ještě malá zkumavka, obrácená dnem vzhůru (někdy označována jako tzv.: plynovka). Obsahuje indikátor – bromthymolovou modř. Hodnocení: (+)…pozitivní reakce – zkvašení glukózy (zežloutnutí obsahu zkumavky – změna pH) a tvorba plynu (bublinka v plynovce). (+/-)…pozitivní reakce – zkvašení glukózy, ale bez tvorby plynu (-)…negativní reakce – nedochází ke zkvašení glukózy (obsah zkumavky zůstává v barvě indikátoru, tedy modrozelený) ani k tvorbě plynu
2. Zkumavka – Hajnyho agar Zkumavka je naplněna Hajnyho agarem a indikátorem je zde citrát železitoamonný. V této zkumavce se zjišťuje tvorba sirovodíku (H2S). Původní barva agaru je červená. Hodnocení: (+)…pozitivní reakce – zčernání agaru v různém rozsahu (-)… negativní reakce – červené nebo žluté zabarvení
3. Zkumavka – Urea Jedná se o agar, který obsahuje močovinu (ureu) a sleduje se zde její enzymatické štěpení. Enzym štěpící močovinu se nazývá ureáza. Původní barva agaru je zelená. Hodnocení: (+)…pozitivní reakce – zmodrání agaru (štěpení urey) (-)...negativní reakce – zelená, žlutá barva agaru

24


4. Zkumavka – Simmons citrát Agar obsahuje citrát sodný a sleduje se zde jeho využití jako jediného zdroje uhlíku. Původní barva agaru je také zelená. Hodnocení: (+)…pozitivní reakce – zmodrání agaru (-)…negativní reakce – zelená, žlutá barva agaru
5. Zkumavka – Hottingerův bujon Hottingerův bujon je tekuté, bezbarvé médium sloužící k záchytu tvorby indolu. Přítomnost indolu se detekuje pomocí Kovacsova činidla. Činidlo se přikapává do zkumavky po proběhlé kultivaci. Hodnocení: (+)…pozitivní reakce – červený prstenec na hladině (-)… negativní reakce – žlutý prstenec na hladině Tabulka 2: Výsledek testu pro Pseudomonas aeruginosa izolována z BAL; 24 hod, 35°C Po inokulaci médií ve zkumavkách; 24 hod, 35°C Čísla

zkumavek

odpovídají

v popisu

číslování

testu

a

použité

symboly

také.

Číslo zkumavky

1.

2.

3.

4.

5.

Výsledek testu

-

-

-

+

-

Krátká řada cukrů z důvodu nejasné identifikace se rozšiřuje o různé mikrometody (již zmíněný Mikro-La-Test NEFERMtest 24). Mikrometody pracují s malým objemem a obsahují více testů. (51)

25

6. 4 Biochemická identifikace pomocí VITEK systému Systém VITEK vznikl v roce 1970 jako automatizovaný systém pro identifikaci s určení citlivosti bakterií k antibiotikům. Postupem času se vyvinul do systému VITEK 2 (bioMérieux). 6. 4. 1 VITEK 2 systém Jedná se o integrovaný modulární systém složený z: plnící jednotky, čtečky karet, řídícího PC modulu, datového terminálu a tiskárny. Optický systém detekuje bakteriální růst a metabolické změny v jamkách tenkých plastových karet. Jamky v kartách obsahují buď různá antibiotika (karty pro stanovení citlivosti k antibiotikům) nebo biochemické substráty (karty pro identifikaci). Detekce je založena na měření ve vícekanálovém fluorimetru a fotometru. Měřením se získávají hodnoty fluorescence, zákalu a kolorimetrické signály. (15, 30) 6. 4. 2 Hrubý procesní přehled Identifikační karty spolu s připravenou bakteriální suspenzí se vkládají do plastových stojánků. Ty jsou vloženy do inkubační – čtecí části. Inkubační teplota je cca 35,5 °C. Karty jsou automaticky naplněné suspenzí díky vakuovému zařízení. Karty jsou zapečetěné a podstupují kinetickému měření fluorescence každých 15 minut. Výsledky jsou interpretovány databází ID – 6 PC po inkubační periodě 4 hodiny. Konečné výsledky jsou získány automaticky, minimálně po 4 a maximálně po 15 hodinách inkubace. Všechny použité karty jsou automaticky vyřazené do odpadkového kontejneru. (15)

6. 5 MALDI-TOF MS Od svého uvedení na trh MATRIX-ASSISTED-DESORPTION-IONIZATION = MALDI ve spojení s analyzátorem doby letu (time-off-flight = TOF) nachází uplatnění v mnoha oblastech. Jednou z nich je právě i mikrobiální diagnostika, identifikace a diferenciace bakteriálních izolátů. (2, 53)

26

6. 5. 1 Princip a charakteristika metody Jedná se o analytickou techniku založenou na zjištění relativní molekulové hmotnosti. MALDI je měkká ionizační technika. Umožňuje desorpci peptidů a proteinů z celých kultivovaných mikroorganismů. Technika spočívá v ionizaci vzorku krátkými pulsy laserového záření (obvykle dusíkový laser s pracovní vlnovou délkou λ = 337 nm). (8, 53) 6. 5. 2 Jednoduchý procesní přehled Vzhledem k tomu, že MALDI – TOF hmotnostní spektrometrie je velice citlivá technika, postačuje pro vlastní analýzu malé množství mikrobiální masy (104 – 106 CFU). Mikrobiální masa se rozpustí nebo resuspenduje v nadbytku matrice v poměru koncentrací 1:104. Některé studie uvádí, že postačí 1 µl roztoku matrice. Jako matrice se používají deriváty kyseliny benzoové a kyseliny skořicové (např.: α-kyano-4hydroxyskořicová, sinapinová a další). Získaná směs se nanáší na ocelovou destičku a po vysušení se umístí do hlubokého vakua (10-4 Pa). Matrice absorbuje energii krátkého laserového pulsu. Energie je velmi šetrně předána molekulám vzorku. Molekuly vzorku se uvolňují ve formě molekulových iontů [M + H]+. Takto vzniklé ionty se dostávají díky extrakčním mřížkám, na které je vloženo vysoké napětí, do analyzátoru. (2, 8, 11) 6. 5. 3 Analyzátor TOF MALDI společně s analyzátorem doby letu TOF je velmi citlivou metodou pro detekci molekul o vyšší molekulové hmotnosti. Ionty s rozdílným poměrem m/z (hmotnosti k náboji) mající stejnou energii, se budou pohybovat stejnou rychlostí. Což je princip analyzátoru doby letu. Energie se iontům dodává pomocí soustavy extrakčních mřížek, na které je obvykle vloženo napětí 10 – 20 kV.

27

Pro daný bakteriální kmen tento postup během několika minut poskytne spektrum. Získané spektrum se skládá z řady píků, které odpovídají poměru m/z jednotlivých iontů. (8, 11)

6. 5. 4 Hodnocení identifikace pomocí MALDI – TOF MS Získané spektrum se porovná s knihovnou spekter a dojde k identifikaci.

Obrázek 1: Spektrum Pseudomonas aeruginosa izolované z BAL; 18 hod, 35°C

28

6. 5. 5 Shrnutí identifikace bakteriálních izolátů pomocí techniky MALDI – TOF Pro jednoduchost jsem zvolil tabulkové uspořádání. Tabulka 3: SOP Identifikace bakteriálních izolátů (46)

ČISTÁ KULTURA

Získána izolací jedné kolonie z primokultivace.

MIKROSKOPIE

Preparát obarvený dle Grama.

MALDI – TOF IDENTIFIKOVÁNO VALIDACE IDENTIFIKACE INTERPRETACE VALIDACE KLINICKÁ CITLIVOST ATB VÝSLEDEK

29

6. 6 Molekulární techniky Metody na bázi identifikace genotypu obcházejí problém proměnlivého fenotypu. Poskytují přesnější identifikaci bakteriálních druhů. Nicméně taxonomické složitosti, nejistá fylogeneze a nedostatek sekvenčních genomových dat v rámci širokého rodu Pseudomonas, představují překážku pro genotypové identifikační testy. (48) 6. 6. 1 PCR – polymerázová řetězová reakce Jedná se o amplifikační metodu, která umožňuje namnožení specifického úseku templátové DNA. Jedná se o techniku probíhající in vitro. (1)

6. 6. 2 Jednoduchý procesní přehled klasické PCR Amplifikace cílové DNA se provádí v reakčním objemu (většinou 25 µl) celá reakční směs se označuje jako „master-mix“. Složení master-mixu:
MgCl2 (Mg2+)
Pufr
Deoxynukleotidtrifosfáty (DTP)
Specifické primery
Taq polymeráza (termostabilní)
Genomová DNA
Redestilovaná voda
Bakteriální lyzát Takto připravený master-mix v mikrozkumace, umístíme do termocykleru kde probíhá střídání teplotních cyklů a probíhá vlastní PCR reakce. Teplotní fáze PCR reakce
Denaturace templátové DNA (95°C)
Annealing – navázání primerů (50°C)
Polymerace (72°C) Cykly se mnohokrát opakují, dokud nedojde k požadovanému namnožení produktu. (1, 48)

30

6. 6. 3 Real Time – PCR Je revoluční metoda využívaná v mikrobiologii pro diagnostiku lidských patogenů. Tato metoda kombinuje PCR s fluorescenční detekcí sondy amplifikovaného produktu ve stejné reakční nádobě. Obecně platí, že PCR a detekce amplifikovaného produktu jsou dokončeny asi za hodinu, což je podstatně rychlejší než klasická PCR a detekce. (13) 6. 6. 4 PCR u pseudomonád Tato PCR je založena na specifických primerech, které se podílejí na selektivní amplifikaci 990 bp fragmentu 16S rDNA pseudomonád. 16S rDNA se používá jako „zlatý standard“ v určování taxonomie a fylogeneze bakteriálního druhu. Selektivní amplifikace 16s rDNA rodu Pseudomonas pomocí PCR je následována analýzou délky restrikčních fragmentů nebo gradientovou gelovou elektroforézou. (8, 41)

31

7. REZISTENCE A JEJÍ HLAVNÍ MECHANISMY Pseudomonas aeruginosa je rezistentní k různým antibiotikům. Nízká permeabilita její vnější membrány, konstitutivní exprese různých efluxních pump, produkce enzymů inaktivující antibiotika (indukovatelné cefalosporinázy) – to jsou jedny z důležitých mechanismů, které dělají z kosmopolitně rozšířené bakterie velice obávaného patogena. Dále má kapacitu rozvinout nebo získat nové mechanismy rezistence proti antibiotikům. Obecná rezistence vzniká díky kombinaci několika faktorů:
PSAE je rezistentní k antibiotikům v důsledku nízké propustnosti její buněčné membrány.
PSAE má genetickou schopnost vyjadřovat široký repertoár mechanismů rezistence.
Může se stát rezistentní díky mutacím chromozomálních genů, které regulují geny rezistence.
Může získat geny rezistence z jiných organismů, přes plazmidy nebo transpozómy a bakteriofágy. (11, 24) 7. 1 Nepropustnost vnější membrány K tomu aby antibiotika mohla vyvíjet své účinky na pseudomonády, musí pronikat k jejich intracelulárním strukturám. U pseudomonád to vyžaduje podstatnou propustnost vnější membrány. Vnější membrána tvoří semipermeabilní bariéru na vychytávání antibiotik a molekul substrátů. Protože vychytávání malých hydrofilních molekul jako jsou β-laktamy, je omezená jen na malou plochu vnější membrány (přesněji na vodné kanály porinových proteinů). Vnější membrána limituje pohyb těchto molekul do buňky.

32

7. 1. 1 Průnik antibiotik přes buněčnou membránu Pseudomonas aeruginosa Všechny hlavní třídy antibiotik používaných k léčbě infekcí vyvolaných PSAE, musí proniknout přes buněčnou membránu ke svému cíli. Tabulka 4: Místa působení antibiotik u infekcí způsobených Pseudomonas aeruginosa

Skupina

Antibiotikum Působení antibiotika

antibiotik

Gentamicin AMINOGLYKOSIDY Tobramycin Amikacin CHINOLONY

Ciprofloxacin

Inhibují

syntézu

proteinů

vazbou

na

podjednotku 30S ribozómu. Váží se na podjednotku DNA – gyrázy, která udržuje strukturu chromozómu uvnitř buněk.

Piperacilin Ceftazidim β – LAKTAMY

Imipenem Meropenem

Inhibují ukotvení transpeptidáz peptidoglykanu na vnější povrch cytoplazmatické membrány.

Aztreonam POLYMYXINY

Colistin

Váží

se

na

fosfolipidy

cytoplazmatické

membrány a ničí její ochrannou funkci.

7. 1. 2 Vnější membrána jako bariéra Vnější membrána Pseudomonas aeruginosa představuje významnou překážku k pronikání antibiotik. Omezuje rychlost pronikání malých hydrofilních molekul, kromě větších molekul. Malá hydrofilní antibiotika, jako β-laktamy a chinolony mohou procházet pouze vnější membránou při průchodu vodnými kanály podle porinů. PSAE produkuje několik různých porinů (Opr). OprF reprezentuje neefektivní cestu uptakeu. OprD je specializovaný porin, který má specifické role v příjmu kladně nabitých aminokyselin jako je lysin. Ztráta OprD je často spojovaná s rezistencí k imipenemu. Je zajímavé, že meropenem není ovlivněn ztrátou OprD. To naznačuje, že karbapenemy přeskočily vnější membránu prostřednictvím různých kanálů. Rezistence k aminoglykosidům a kolistinu byly pozorovány u PSAE v důsledku zvýšené exprese

33

vnějšího membránového proteinu OprH, který chrání lipopolysacharid od vazby na antibiotikum. Vnější membrána jako mechanismus rezistence je významná v souvislosti s dalšími mechanismy rezistence. (17, 24, 40)

7. 2 Role efluxního systému Efluxní (výtokové) systémy vyjadřují širokou substrátovou specifitu. Jejich exprese u Gram negativních bakterií je spojena s rezistencí na více klinicky příslušných antimikrobiálních látek. Efluxní systémy pro vícero léčiv se skládají ze tří proteinových komponent.:
Pumpa závislá na energii, přítomná na cytoplazmatické membráně
Poriny vnější membrány
Spojovací protein, který spojuje dvě komponenty membrány dohromady Toto tříčlánkové uspořádání dává vzniknout efektivnímu vylučovacímu systému pro toxické molekuly, přítomné v cytoplazmě, cytoplazmatické membráně nebo periplazmě (oblast mezi vnější a cytoplazmatickou membránou). U PSAE byly popsány čtyři různé efluxní systémy pro antibiotika:


Mex AB – oprM, zodpovědný za vylučování β-laktamů, chinolonů a desinfekčních prostředků




Mex XY – oprM, podílí se na vylučování aminogykolsidů




Mex DC – oprJ




Mex EF – oprN 10, vylučují karbapenemy a chinolony

Efluxní systém zahrnující tyto proteiny je zásadní pro vlastní rezistenci Pseudomonas aeruginosa. Delece v kterémkoli z genů kódující tyto proteiny vede k čtyř až deseti násobnému nárůstu citlivosti na chinolony, β-laktamy (kromě imipenemu), tetracykliny a chloramfenikol. Geny efluxních systémů jsou přítomny ve všech kmenech, ale nejsou exprimovány ve vysokých hladinách. Zvýšená exprese může být způsobena mutací v regulačních genech, jako jsou např.: Mex R, který kóduje expresi Mex AB – oprM genů. Expozice jednomu antibiotiku může selektovat mutanty PSAE se zvýšenou produkcí pump. Ty mají křížovou rezistenci vůči všem antibiotikům, které jsou substráty potlačených pump. Chinolony, které jsou substráty všech Mex efluxních pump, jsou

34

náchylné k výběru na křížovou rezistenci proti aminoglykosidům nebo β-laktamům.

(11, 24,

40)

Eflux obvykle uděluje nízký až středně těžký stupeň rezistence. A hraje významnou roli u klinických izolátů, nejméně ze tří důvodů: 1. Výrazně snižuje výběr účinných antibiotik (např.: nadexprese Mex XY – oprM u klinických izolátů uděluje rezistenci nejenom k aminoglykosidům, ale i cefepimu a fluorochinolonům). 2. Spolupracuje s jinými mechanismy (např.: mutace v cílových strukturách chinolonů nebo produkce β-lakatamáz) zvyšuje úroveň rezistence. 3. Dává vzniknout mutacím, které snižují koncentraci antibiotika uvnitř bakterie. (11, 17) 7. 3 Produkce enzymů Převládající mechanismus rezistence k β-laktamovým antibiotikům zůstává u produkce β-laktamáz enzymů, které inaktivují antibiotikum hydrolýzou amidové vazby βlaktamového kruhu molekuly. Rozeznáváme čtyři molekulární třídy β-laktamáz: třída A penicilinázy, třída B metalo-β-laktamázy, třída C cefalosporinázy a třída D oxacilinázy. Rezistence vzniká přirozenou nebo mutační derepresí chromozomálních genů nebo získáním extrachromozomálních genetických elementů (plazmidy a transpozomy) nesoucí geny rezistence. (40) 7. 4 Alginát, biofilm a rezistence Charakteristickým rysem mnoha kmenů Pseudomonas aeruginosa u pacientů s cystickou fibrózou, je produkce polysacharidu – alginátu. Ten se podílí na tvorbě biofilmů a snížení citlivosti k antibiotikům. Charakteristickým rysem biofilmů je jejich pozoruhodná odolnost k vymícení fyzikálními a chemickými vlivy včetně antibiotik. (24, 48)

35

7. 5 Změny v cíli Záměny lékových cílů, které interferují nebo omezují vzájemné působení antibiotik, zabraňují bakteriostatickým (bakteriocidním) účinkům těchto látek a tím zvyšují rezistenci. Tento mechanismus rezistence je důsledkem mutačních změn v cílových enzymech, které nevedou k udržování jejich zásadní role v buněčném metabolismu, ale v rezistenci vůči selektivnímu působení antibiotik. U Pseudomonas aeruginosa se setkáváme s rezistencí k chinolonům. Díky mutaci v genu Gyra, který kóduje podjednotku cílového enzymu DNA – gyrázy. Dojde ke změně ve struktuře podjednotky 30S ribozómu (cíl aminoglykosidů). Změny v penicilin vázajících proteinech (PBP) vedou také k odolnosti proti β-laktamům. (24, 40)

36

8. PRODUKCE KARBAPENEMÁZ A JEJICH DETEKCE Jedním z mnoha mechanismů, jak se bakterie rodu Pseudomonas brání účinné terapii je produkce enzymů. Funkce těchto enzymů je inaktivace antibiotik. Karbapenemázy jsou β-laktamázy s univerzální hydrolytickou kapacitou představují velikou hrozbu klinické prospěšnosti pro všechna β-laktamová antibiotika. (3, 9) 8. 1 β-laktamová antibiotika β-laktamová antibiotika mají různé strukturální podtypy. Tato antibiotika mají společnou chemickou strukturu, tzv. β-laktamový kruh. Strukturální podtypy:
Penemy (penicilin, ampicilin)
Cefemy (cefalosporiny, cefamyciny)
Monobaktamy (monocyklické β-laktamy zahrnující aztreonam)
Karbapenemy Enzymy, které hydrolyzují amidovou vazbu na čtyřčlenném β-laktamovém kruhu, se nazývají β-laktamázy. Jsou tedy hlavní příčinou odolnosti – rezistence bakterií k βlaktamovým antibiotikům. (3, 4) 8. 2 Rozdělení β-laktamáz Získané karbapenemázy představují heterogenní skupinu β-laktamáz, které patří do 3 různých molekulárních skupin. Tabulka 5: Hlavní skupiny β-laktamáz (rozdělení dle Amblera). (20)

Supina

Označení karbapenemáz

A

KPC, GES, SME, IMI, NMC

serin-β-laktamázy

B metalo-β-laktamázy D serin-β-laktamázy

VIM, IMP, GIM, SIM, NDM, SPM, AIM, KMH, DIM, TMB OXA-48, OXA-162, OXA-181 Skupiny OXA-23, -58, -40

37

Bakteriální druhy u kterých byly nalezeny Enterobacteriaceae (Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens atd.), Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Escherichia coli; Acinetobacter baumannii

8. 3 Genetika β-laktamáz Geny kódující β-laktamázy mohou být umístěny na bakteriálním chromozómu, na plazmidech nebo transpozómech. Β-laktamové geny = BLA geny určují, zda budou β-laktamázy syntetizovány přirozeným nebo získaným způsobem. V poslední době roste počet BLA genů, které se nachází na integronech. Integrony, jsou geny proměnlivé délky. Na 5´ konci obsahují genovou kazetu (zásobník) s ostatními geny antibiotické rezistence. Dále obsahují integrační místo pro genové kazety (ATTI). Integrony nejsou mobilní. Ovšem jejich umístění v mobilních genetických elementech (plazmidy a transpozómy) umožňuje jejich pohyb. Mobilní genetické prvky, které obsahují integrony jsou důležitým zdrojem pro šíření BLA genů a jiných determinant rezistence. (3) 8. 4 Metalo-β-laktamázy Vznik získaných metalo-β-laktamáz (MBL) u hlavních Gram negativních podmíněných patogenů (Pseudomonas aeruginosa, Acitenobacter spp.) má závažné klinické a epidemiologické důsledky. Jsou tedy předmětem zájmu po celém světě. MBL mohou degradovat všechna β-laktamová antibiotika, s výjimkou monobaktamů. Mezi klinicky důležité metalo-β-laktamázy patří skupiny IMP a VIM. Tyto skupiny způsobují rezistenci na všechna β-laktamová antibiotika, kromě monobaktamů. Další klinicky významné metalo-β-laktamázy jsou uvedeny v tabulce číslo 5. (3, 9) 8. 5 Inhibitory β-laktamáz Doposud všechny známé inhibitory nebo inaktivátory serin-β-laktamáz nejsou účinné na metalo-β-laktamázy. Šíření metalo-β-laktamáz u nozokomiálních bakteriálních patogenů, odůvodňuje vyhledávání sloučenin, které mohou snížit aktivitu těchto enzymů. Bohužel objev klinicky užitečného a specifického inhibitoru MBL je ztížen tím, že tato sloučenina musí zůstat aktivní na lidských proteinech, které jsou členy nadrodiny MBL. Nebo na jiných metalo-enzymech (např.: angiotensin konvertující enzym). Dalším problémem je nalézt sloučeniny aktivní pro všechny podskupiny MBL. (4)

38

8. 6 Detekce karbapanemáz Detekce producentů karbapenemáz z klinických izolátů je především založena na výsledcích

citlivosti

k antibiotikům.

Buď

diskovou

difúzní

metodou,

nebo

automatizovanými systémy. Určení těchto producentů je jedním z hlavních způsobů pro výběr vhodného terapeutika. Detekce karbapenemázové aktivity v klinickém izolátu může být pro laboratoř náročná. První důvod k podezření, že se na infekci podílejí karbapenemázy, je zvýšená hodnota minimální inhibiční koncentrace (MIC) pro karbapenemová antibiotika. (9, 35, 36) 8. 6. 1 Referenční metoda Spektrofotometrické

měření

koncentrace

EDTA,

která

inhibuje

karbapenemovou hydrolýzu se provádí s hrubým buněčným extraktem, je referenční metodou pro potvrzení produkce MBL. Tato metoda není vhodná k použití v rutinních laboratořích. Jednodušší fenotypové testy, založené na difúzních nebo dilučních metodách jsou v rutinních laboratořích brány jako specifické. (9) 8. 6. 2 Molekulární techniky Molekulární metody (PCR nebo DNA hybridizace) potvrzují přítomnost MBL genu v klinických izolátech a mohou být přijaty jako součást screeningu. Tyto metody jsou omezeny pouze na referenční nebo výzkumné laboratoře. Pro menší laboratoře je jejich náročnost nepřijatelná. Kromě toho molekulární metody detekují pouze MLB geny, které jsou v uznávané nabídce dostupných sond. Mohou tedy minout detekci nově vzniklých genů. (9) 8. 6. 3 Fenotypové testy Řada jednoduchých fenotypových testů pracuje na principu diluce nebo diskové difúze. Využívají některých látek (EDTA, kyselina fenylboritá) inhibovat karbapenemázy. Nejsou ovšem tolik specifické. Některé karbapenemázy OXA-typu nelze takto detekovat. (20, 35) 8. 6. 3. 1 Hodge test Metoda jetelového listu (modifikovaný Hodge test (MHT)) byla používána jako hlavní fenotypová metoda pro detekci karbapenemázové aktivity. Metoda je založena na inaktivaci karbapenemu buď celými buňkami, nebo buněčnými extrakty 39

organismů produkujících karbapenemázy. Umožňuje karbapenem citlivému druhu rozšířit růst směrem ke karbapenemovému indikátorovému disku. V Evropě tento test není uznáván jako hlavní diagnostická metoda. (9, 20, 35) 8. 6. 3. 2 CARBA NP test Tento test rozlišuje izoláty pseudomonád na karbapenemázy produkující a karbapenemázy neprodukující. Je založen na biochemické detekci hydrolýzy karbapenemu a imipenemu, což má za následek změnu barvy indikátoru pH. Test eliminuje potřebu detekce pomocí Hodge testu, fenotypových testů pro inhibici β-laktamáz. Test je vysoce specifický, citlivý a rychlý (méně než 2 hodiny). (12)

8. 6. 4 Detekce pomocí MALDI – TOF Pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI – TOF je možno detekovat molekuly karbapenemu a jeho dalších variant (produkty odbourávání, sodná sůl atd.). Na rozdíl od molekulárních technik nám tato metoda podává reálné informace o produkci karbapenemáz. 8. 6. 4. 1 Detekce degradačních produktů meropenemu Β-laktamázy degradují meropemen ve dvou fázích: 1. hydrolýza amidové vazby v β-laktamovém kruhu 2. dekarboxylace molekuly Vznikají tedy degradační produkty o různých molekulových hmotnostech, které jsou detekovány pomocí této metody. (20) Tabulka 6: Degradační produkty meropenemu a jeho molekulové hmotnosti (20)

Molekula

poměr hmotnost/náboj

Meropenem MW

383,5

[Meropenem+H]+

384,5

[Meropenem+Na]+

406,5

[Meropenem+2Na]+

428,5

40

Obrázek 2: Chemické struktury meropenemu: 383,464 Da (A), jeho disodná sůl, 427,422 Da (B), produkt rozkladu meropenemum s narušenou amidovou vazbou, 401,483 Da (C), a jeho trisodná sůl, 467,420 Da (D)

Obrázek 3: Hmotnostní spektra meropenemu (nalezená hmotnost 382,975 m / z) a jeho sodné soli (405,193 m / z a 427,428 m / z) (A) a meropenem s narušenou amidovou vazbou (401,072 m / z) a jeho sodná sůl (423,282 m / z, 445,583 m / z, a 467,839 m / z) (B). Píky testovaných molekul jsou označeny šipkami. Jednotky na ose y představuje relativní intenzitu.

41

8. 6. 4. 2 Analýza spekter z MALDI – TOF Zjištěné vrcholy jsou porovnávané s molekulovými hmotnostmi meropenemu a jeho degradačními produkty. (19)

42

9. PSEUDOMONÁDOVÉ INFEKCE A JEJICH LÉČBA Pseudomonády jsou všudy přítomné v přírodě, jsou izolovány z vody, půdy, odpadního vod, rostlin, zvířat a člověka. Pseudomonas aeruginosa se stala významnou příčinou infekce, u pacientů se sníženou funkcí obranných mechanismů nebo se specializovanou povahou základního onemocnění (např.: cystická fibróza). Je nejčastějším patogenem izolovaným od pacientů, kteří byli hospitalizováni déle než jeden týden. Je důležitým nozokomiálním patogenem. Výrazně přispívá k výskytu močových cest u pacientů s permanentním močovým katétrem (PMK). Pseudomonádové infekce jsou složité a mohou být život ohrožující. Velkým rizikem je infekce vyvolaná rezistentní pseudomonádou. (16, 28, 29) 9. 1 Nejčastěji zasažená místa Pseudomonádové infekce mohou zahrnovat následující části těla s odpovídajícími příznaky a projevy.


Dýchací cesty (zápaly plic)




Krevní oběh (bakteriémie)




Srdce (endokarditida)




Centrální nervový systém (meningitida, mozkový absces)




Uši (zánět středního a zevního ucha)




Oči (bakteriální keratitida)




Klouby a kosti (osteomyelitida)




Gastrointestinální trakt (průjem, enteritida, enterokolitida)




Močové cesty




Kůže

Infekce vyvolané rezistentními pseudomonádami, jsou velice problematické, protože jsou asociované s třikrát vyšší mortalitou, devětkrát vyšší mírou sekundární bakteriémií a výrazně delší dobou hospitalizace. (28, 29)

43

9. 2 Nozokomiální nákazy Nozokomiální nákazy neboli nemocniční infekce postihují osoby v souvislosti s hospitalizací ve zdravotnických zařízeních. Postihují především pacienty, ale také i personál a návštěvy nemocných. Riziko vzniku nozokomiální infekce přímo souvisí s invazí zdravotnických prostředků nebo chirurgickými zákroky. Rizikovou skupinou pacientů jsou pacienti, kteří jsou již oslabeni (hematoonkologičtí pacienti, pacienti s popáleninami). Nejčastější jsou ventilátorové pneumonie a infekce močových cest. (38, 39)

9. 2. 1 Pneumonie Nozokomiální pneumonie jsou nejčastější infekce ohrožující život pacienta. Ve většině případů jsou spojeny s mechanickou ventilací. Vyskytují se u 10 – 20 % pacientů napojených na ventilátory delší dobu než 48 hodin. Jsou spojeny s prodloužením délky hospitalizace a úmrtností. Kromě Pseudomonas aeruginosa se na nich podílí i Acinetobacter baumannii a různí zástupci čeledi Enterobacteriaceae. (43, 44) 9. 2. 2 Infekce močových cest Téměř všechny gram negativní organismy včetně PSAE způsobují infekce močových cest. Tyto infekce jsou spojeny často se zavedením močového katetru. Po druhém dni katetrizace se odhaduje, že počet bakterií se zvyšuje o 5 – 10 % za den. Většina případů je asymptomatická bakteriurie. Účinným řešením je odstranění katétru, něž léčba antibiotiky. (38) 9. 2. 3 Infekce krevního oběhu Tyto infekce jsou život ohrožující událost a nejčastěji jsou spojovány s přítomností centrálního žilního katétru. Mohou být také spojeny s Gram negativní infekcí v jiných částech těla, jako jsou plíce, močové cesty a gastrointestinální trakt. (38)

44

9. 3 Terapie infekcí vyvolaných pseudomonádami Základem antimikrobiální léčby může být kombinace dvou antibiotik (např.: antipseudomonádové β-laktamy a aminoglykosidy). Empirická terapie musí být komplexní a měla by zahrnovat všechny pravděpodobné patogeny v souvislosti s klinickým prostředím. Gentamicin Jedná se o aminoglykosid a má široké gram negativní pokrytí.

Tikarcilin Infibuje biosyntézu buněčné stěny a je účinný v aktivní fázi růstu. Jedná se o antipseudomonádový penicilin s inhibitorem β-laktamáz. Piperacilin Antipseudomonádový

penicilin

s inhibitorem

β-laktamáz.

Inhibuje

biosyntézu buněčné stěny a je účinný v průběhu aktivního množení. Imipenem Je širokospektrým β-laktamovým antibiotikem. Aztreonam Monobaktam, který inhibuje biosyntézu buněčné stěny v průběhu růstu. Je aktivní proti gram negativním patogenům. Je nevhodný pro anaeroby a gram pozitivní patogeny. Používá se u pacientů alergických na peniciliny a cefalosporiny. Ciprofloxacin Má fluorochinolonové účinky proti pseudomonádám. Inhibuje syntézu bakteriální DNA.

45

Cefepim Slouží pro léčbu pseudomonádových infekcí a patří do čtvrté generace cefalosporinů. Je nejlepším β-laktamem pro intra muskulární podání. Ovšem špatně překračuje hematoencefalickou bariéru.

Ceftazidim Patří do třetí generace cefalosporinů s vysokou aktivitou proti rodu Pseudomonas. Znemožňuje růst bakteriím vazbou na jeden nebo více penicilin vazebných proteinů (PBP). Tobramycin Získává se ze Streptomyces tenebrarius. Je dvakrát až čtyřikrát silnějším antipseudomonádovým antibiotikem ve srovnání s gentamicinem. Meropenem Polosyntetické antibiotikum, které inhibuje syntézu buněčné stěny. (28)

46

10. DISKUZE V několika posledních letech představují bakterie rodu Pseudomonas jedny z nejobávanějších patogenů. Díky neustálému rozvoji rezistence, včetně vzniku nových mechanismů rezistence a složitosti multirezistentních fenotypů nutí k vývoji vhodných diagnostických nástrojů. Podle mého názoru je jedním z těchto nástrojů, právě technika MALDI – TOF MS, která slouží k diagnostice bakteriálních kmenů a detekci jednoho z mechanismů rezistence – produkce karbapenemáz. Dalšími diagnostickými nástroji jsou i molekulární techniky, ovšem jejich aplikace je značně omezená. Myslím si, že díky jejich rychlému rozvoji, by se mohly v následujících letech rozšířit i na menší pracoviště. Problém k aplikaci těchto metod bude kromě financí i personální zajištění. Jedním z cílů práce bylo právě objasnění techniky MALDI – TOF MS, která je rozšířena na mnoha mikrobiologických pracovištích. Mechanismy vzniku rezistence u pseudomonád byly do jisté míry popsány také, zvláště produkce karbapenemáz, která je dle mého názoru jednou z těch důležitějších. Pro kontrolu infekcí mikrobiologové a kliničtí lékaři realizují preventivní opatření, která jsou zaměřena na snížení nozokomiálních nákaz. Prioritou léčby infekcí vyvolaných pseudomonádami by měli být farmakologické a mikrobiologické údaje. Infekce vyvolané pseudomonádami by měly být včas diagnostikovány – dbát na kvalitu mikrobiologického vyšetření. Důležitým postupem je také dodržení správnosti odběru (lokalizace, včasný transport do laboratoře). U

pacientů,

kteří

jsou

oslabeni

(hematoonkologičtí

pacienti,

pacientnti

hospitalizováni na ARO a JIP) je velmi důležité pravidelné provádění screeningu.

47

11. ZÁVĚR Tato rešerše informuje o vzniku rezistence bakterií rodu Pseudomonas a o možnostech její detekce. Obecné vlastnosti rodu Pseudomonas popisují morfologii, metabolickou aktivitu a některé vlastnosti, které přispívají k patogenitě pseudomonád – tvorby biofilmu, produkce extracelulárních látek. Pro kultivaci pseudomonád se používají základní kultivační agary – krevní agar. Ovšem na ENDO agaru, který je diagnosticky specifický je možné pseudomonády zařadit, jako neštěpící laktózu. Selektivní agary pro kultivaci pseudomonád nejsou v klinické praxi často využívány. Identifikace rodu Pseudomonas, je založena na klasických fenotypových metodách – detekce cytochromoxidázy, sledování zkvašování jednotlivých substrátů (Mikro-La-Test NEFERMtest 24). Novými metodami je především využití techniky MALDI – TOF a VITEK 2 SYSTÉM. Molekulární techniky PCR, především Real Time PCR – umožňující kvantifikaci. Rezistence bakterií rodu Pseudomonas je závislá na mnoha mechanismech, jako je nepropustnost vnější membrány, produkce řady enzymů, tvorba porinů a důležitou roli má i efluxní systém. Karbapenemázy, které štěpí β-laktamový kruh jsou velice významné a jejich stanovení není radno podceňovat. Detekce jejich tvorby je díky systému MALDI – TOF MS daleko jednodušší, než klasickými fenotypovými metodami. Detekce je založena na měření degradačních produktů meropenemu. Infekce vyvolané pseudomonádami jsou velice obávané díky své schopnosti rychle vytvářet mechanismy rezistence. Nozokomiální infekce vyvolané pseudomonádami jsou spojeny s prodloužením délky hospitalizace a s vyšší mortalitou.

48

12. SEZNAM ORBÁZKŮ Obrázek 1: Spektrum Pseudomonas aeruginosa izolované z BAL; 18 hod, 35°C

28

Obrázek 2: Chemické struktury meropenemu: 383,464 Da (A), jeho disodná sůl, 427,422 Da (B), produkt rozkladu meropenemum s narušenou amidovou vazbou, 401,483 Da (C), a jeho trisodná sůl, 467,420 Da (D)

41

Obrázek 3: Hmotnostní spektra meropenemu (nalezená hmotnost 382,975 m / z) a jeho sodné soli (405,193 m / z a 427,428 m / z) (A) a meropenem s narušenou amidovou vazbou (401,072 m / z) a jeho sodná sůl (423,282 m / z, 445,583 m / z, a 467,839 m / z) (B). Píky testovaných molekul jsou označeny šipkami. Jednotky na ose y představuje relativní intenzitu.

41

Obrázek 4: Pseudomonas aeruginosa izolována z BAL, Krevní agar, kultivace: 35°C 48 hodin.

Po prodloužené kultivaci je pozorována výrazná zóna β hemolýzy.

59

Obrázek 5: Pseudomonas aeruginosa izolována z BAL, ENDO agar, 35°C, 24 hodin. Na agaru pozorujeme světlé kolonie v barvě agaru, nedochází ke štěpení laktózy.

49

59

13. SEZNAM TABULEK Tabulka 1: Hodnocení testu na detekci cytochromoxidázy od filmy Erbalachema; Mikro-La-Test OXItest; kontrolní kmen Pseudomonas aeruginosa, 24 hod, 37°C 22 Tabulka 2: Výsledek testu pro Pseudomonas aeruginosa izolována z BAL; 24 hod, 35°C 25 Tabulka 3: SOP Identifikace bakteriálních izolátů (46)

29

Tabulka 4: Místa působení antibiotik u infekcí způsobených Pseudomonas aeruginosa 33 Tabulka 5: Hlavní skupiny β-laktamáz (rozdělení dle Amblera). (20)

37

Tabulka 6: Degradační produkty meropenemu a jeho molekulové hmotnosti (20)

40

50

14. POUŽITÁ LITERATURA 1. ALBERTS, Bruce. Základy buněčné biologie: úvod do molekulární biologie buňky. 2. vyd. Překlad Arnošt Kotyk, Bohumil Bouzek, Pavel Hozák. Ústí nad Labem: Espero, c1998, 1 sv. (různé stránkování). ISBN 80-902-9062-0. 2. AMIRI-ELIASI, Bijan a Catherine FENSELAU. Characterization of Protein Biomarkers Desorbed by MALDI from Whole Fungal Cells. Analytical Chemistry. 2001, vol. 73, issue 21, s. 5228-5231. DOI: 10.1021/ac010651t. Dostupné z: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac010651 3. BABIC, M, A HUJER a R BONOMO. What's new in antibiotic resistance? Focus on beta-lactamases. Drug Resistance Updates. 2006, vol. 9, issue 3, s. 142-156. DOI: 10.1016/j.drup.2006.05.005. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1368764606000446 4. BEBRONE, Carine. Metallo-β-lactamases (classification, activity, genetic organization, structure, zinc coordination) and their superfamily. Biochemical Pharmacology. 2007, vol. 74, issue 12, s. 1686-1701. DOI: 10.1016/j.bcp.2007.05.021. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0006295207003309 5. BEDNÁŘ, Marek et al. Lékařská mikrobiologie. Praha: Mavril, 1996, s. 246-247. ISBN 80-2380-297-6. 6. BERKA, R. M.; GRAY, G. L.; VASIL, M. L. Studies of phospholipase C (heat-labile hemolysin) in Pseudomonas aeruginosa. Infection and immunity, 1981, 34.3: 1071-1074. 7. BJORN, M. J., et al. Incidence of exotoxin production by Pseudomonas species. Infection and immunity, 1977, 16.1: 362-366.

51

8. CARBONNELLE, B et al. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nonfermenting Gram-Negative Bacilli Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Journal of Clinical Microbiology. 2008-10-03, vol. 46, issue 10, s. 3361-3367. DOI: 10.1128/JCM.00569-08. Dostupné z: http://jcm.asm.org/cgi/doi/10.1128/JCM.00569-08 9. CORNAGLIA, Giuseppe et al. Metallo-β-lactamases as emerging resistance determinants in Gram-negative pathogens: open issues. International Journal of Antimicrobial Agents. 2007, vol. 29, issue 4, s. 380-388. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2006.10.008. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S092485790600464X 10. COSTERTON, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 1999, vol. 284, issue 5418, s. 1318-1322. DOI: 10.1126/science.284.5418.1318. Dostupné z: http://www.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.284.5418.1318 11. DOMIN, Mark A., Kevin J. WELHAM a David S. ASHTON. The Effect of Solvent and Matrix Combinations on the Analysis of Bacteria by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-flight Mass Spectrometry. Rapid communications in mass spectrometry. č. 13, s. -. DOI: 10.1002/. Dostupné z: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/(SICI)10970231(19990228)13:4%3C222::AID-RCM440%3E3.0.CO;2-Y/pdf 12. DORTET, L., L. POIREL a P. NORDMANN. Rapid Detection of CarbapenemaseProducing Pseudomonas spp. Journal of Clinical Microbiology. 2012-10-12, vol. 50, issue 11, s. 3773-3776. DOI: 10.1128/JCM.01597-12. Dostupné z: http://jcm.asm.org/cgi/doi/10.1128/JCM.01597-12 13. ESPY, M. J et al. Real-Time PCR in Clinical Microbiology: Applications for Routine Laboratory Testing. Clinical Microbiology Reviews. 2006-01-17, vol. 19, issue 1, s. 165256. DOI: 10.1128/CMR.19.1.165-256.2006. Dostupné z: http://cmr.asm.org/cgi/doi/10.1128/CMR.19.1.165-256.2006 52

14. FEDERHEN, Scott. The NCBI taxonomy database. Nucleic acids research, 2012, 40.D1: D136-D143. 15. GARCIA-GARROTE, Fernando; CERCENADO, Emilia; BOUZA, Emilio. Evaluation of a new system, VITEK 2, for identification and antimicrobial susceptibility testing of enterococci. Journal of clinical microbiology, 2000, 38.6: 2108-2111. Dostupné z: http://jcm.asm.org/content/38/6/2108.full 16. GIAMARELLOU, Helen. Therapeutic guidelines for Pseudomonas aeruginosa infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 2000, vol. 16, issue 2, s. 103106. DOI: 10.1016/S0924-8579(00)00212-0. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0924857900002120 17. HANCOCK, Robert E. W. Resistance Mechanisms in Pseudomonas aeruginosa and Other Nonfermentative Gram‐Negative Bacteria. Clinical Infectious Diseases. 1998, vol. 27, s1, S93-S99. DOI: 10.1086/514909. Dostupné z: http://cid.oxfordjournals.org/lookup/doi/10.1086/514909 18. HENTZER, M et al. Alginate Overproduction Affects Pseudomonas aeruginosa Biofilm Structure and Function. Journal of Bacteriology. 2001-09-15, vol. 183, issue 18, s. 5395-5401. DOI: 10.1128/JB.183.18.5395-5401.2001. Dostupné z: http://jb.asm.org/cgi/doi/10.1128/JB.183.18.5395-5401.2001 19. HRABAK, J et al. Capenemase Activity Detection by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry. Journal of Clinical Microbiology. 2011-08-30, vol. 49, issue 9, s. 3222-3227. DOI: 10.1128/JCM.00984-11. Dostupné z: http://jcm.asm.org/cgi/doi/10.1128/JCM.00984-11 20. HRABÁK, Jaroslav, et al. Detekce karbapenemáz u enterobakterií pomocí MALDITOF hmotnostní spektrometrie (MS), fenotypových inhibičních testů a molekulárněmikrobiologickými technikami. Zprávy CEM (SZÚ, Praha), 2012, 21.4: 148-156.

53

21. HWANG, Jaulang et al. Functional domains of pseudomonas exotoxin identified by deletion analysis of the gene expressed in E. coli. Cell. 1987, vol. 48, issue 1, s. 129-136. DOI: 10.1016/0092-8674(87)90363-1. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0092867487903631 22. JULÁK, J. Klinicky významné bakterie. Praha: Triton, 2012. ISBN 978-80-7387-588-6. 23. KESSLER, Efrat, et al. Elastase and the LasA protease of Pseudomonas aeruginosa are secreted with their propeptides. Journal of Biological Chemistry, 1998, 273.46: 3022530231. 24. LAMBERT, P. A. Mechanisms of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa. Journal of the Royal Society of Medicine, 2002, 95.Suppl 41: 22. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1308633/pdf/12216271.pdf 25. LAU, G. W et al. The role of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa infection. Trends in Molecular Medicine. 2004, vol. 10, issue 12, s. 599-606. DOI: 10.1016/j.molmed.2004.10.002. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1471491404002606 26. LAU, G. W et al. Pseudomonas aeruginosa Pyocyanin Is Critical for Lung Infection in Mice. Infection and Immunity. 2004-06-22, vol. 72, issue 7, s. 4275-4278. DOI: 10.1128/IAI.72.7.4275-4278.2004. Dostupné z: http://iai.asm.org/cgi/doi/10.1128/IAI.72.7.4275-4278.2004 27. LEE, V. T et al. Activities of Pseudomonas aeruginosa Effectors Secreted by the Type III Secretion System In Vitro and during Infection. Infection and Immunity. 2005-02-23, vol. 73, issue 3, s. 1695-1705. DOI: 10.1128/IAI.73.3.1695-1705.2005. Dostupné z: http://iai.asm.org/cgi/doi/10.1128/IAI.73.3.1695-1705.2005 28. LESSNAU, Klaus-Dieter. Medscape Medical News [online]. 2014 [cit. 2014-03-25]. Dostupné z: http://emedicine.medscape.com/article/226748-clinical

54

29. LIANG, X et al. Identification of a Genomic Island Present in the Majority of Pathogenic Isolates of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 2001-02-01, vol. 183, issue 3, s. 843-853. DOI: 10.1128/JB.183.3.843-853.2001. Dostupné z: http://jb.asm.org/cgi/doi/10.1128/JB.183.3.843-853.2001 30. LIGOZZI, M et al. Evaluation of the VITEK 2 System for Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing of Medically Relevant Gram-Positive Cocci. Journal of Clinical Microbiology. 2002-05-01, vol. 40, issue 5, s. 1681-1686. DOI: 10.1128/JCM.40.5.1681-1686.2002. Dostupné z: http://jcm.asm.org/cgi/doi/10.1128/JCM.40.5.1681-1686.2002 31. LIU, PINGHUI V.; WANG, Shipeng. Three new major somatic antigens of Pseudomonas aeruginosa. Journal of clinical microbiology, 1990, 28.5: 922-925 32. LIU, PINGHUI V. Survey of hemolysin production among species of pseudomonads. Journal of bacteriology, 1957, 74.6: 718. 33. MEYER, J. M. a M. A. ABDALLAH. The Fluorescent Pigment of Pseudomonas fluorescens: Biosynthesis, Purification and Physicochemical Properties. Journal of General Microbiology. 1978-08-01, vol. 107, issue 2, s. 319-328. DOI: 10.1099/00221287-107-2319. Dostupné z: http://mic.sgmjournals.org/cgi/doi/10.1099/00221287-107-2-319 34. MICHEL-BRIAND, Yvon a Christine BAYSSE. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 2002, vol. 84, 5-6, s. 499-510. DOI: 10.1016/S03009084(02)01422-0. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0300908402014220 35. MIRIAGOU, V et al. Acquired carbapenemases in Gram-negative bacterial pathogens: detection and surveillance issues. Clinical Microbiology and Infection. 2010, vol. 16, issue 2, s. 112-122. DOI: 10.1111/j.1469-0691.2009.03116.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1469-0691.2009.03116.x 36. NORDMANN, Patrice, Thierry NAAS a Laurent POIREL. Global Spread of Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Emerging Infectious Diseases. 2011, vol. 55

17, issue 10, s. 1791-1798. DOI: 10.3201/eid1710.110655. Dostupné z: http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/17/10/11-0655_article.htm 37. PALLERONI, Norberto J. Pseudomonas. Topley [online]. Chichester, UK: John Wiley, 2010-03-15 [cit. 2014-03-09]. DOI: 10.1002/9780470688618.taw0062. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/9780470688618.taw0062 38. PELEG, Anton Y. a David C. HOOPER. Hospital-Acquired Infections Due to GramNegative Bacteria. New England Journal of Medicine. 2010-05-13, vol. 362, issue 19, s. 1804-1813. DOI: 10.1056/NEJMra0904124. Dostupné z: http://www.nejm.org/doi/abs/10.1056/NEJMra0904124 39. PODSTATOVÁ, Hana. Mikrobiologie, epidemiologie, hygiena: učebnice pro zdravotnické školy a bakalářské studium. 1. vyd. Olomouc: Epava, 2001, 164 - 165. ISBN 8086297071 40. POOLE, K. Mechanisms of bacterial biocide and antibiotic resistance. Journal of Applied Microbiology. 2002, vol. 92, s1, 55S-64S. DOI: 10.1046/j.1365-2672.92.5s1.8.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1046/j.1365-2672.92.5s1.8.x 41. PORTEOUS, L.Arlene, Franco WIDMER a Ramon J SEIDLER. Multiple enzyme restriction fragment length polymorphism analysis for high resolution distinction of Pseudomonas (sensu stricto) 16S rRNA genes. Journal of Microbiological Methods. 2002, vol. 51, issue 3, s. 337-348. DOI: 10.1016/S0167-7012(02)00108-2. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0167701202001082 42. RAN, H., D. J. HASSETT a G. W. LAU. Human targets of Pseudomonas aeruginosa pyocyanin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2011-05-01, vol. 100, issue 24, s. 14315-14320. DOI: 10.1073/pnas.2332354100. Dostupné z: http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.2332354100

56

43. SADIKOT, Ruxana T et al. Pathogen–Host Interactions in Pseudomonas aeruginosa Pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2005, vol. 171, issue 11, s. 1209-1223. DOI: 10.1164/rccm.200408-1044SO. Dostupné z: http://www.atsjournals.org/doi/abs/10.1164/rccm.200408-1044SO 44. SADIKOT, Ruxana T et al. Pathogen–Host Interactions in Pseudomonas aeruginosa Pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2005, vol. 171, issue 11, s. 1209-1223. DOI: 10.1164/rccm.200408-1044SO. Dostupné z: http://www.atsjournals.org/doi/abs/10.1164/rccm.200408-1044SO 45. SADOVSKAYA, Irina et al. Structural characterization of the outer core and the Ochain linkage region of lipopolysaccharide from Pseudomonas aeruginosa serotype O5. European Journal of Biochemistry. 2000, vol. 267, issue 6, s. 1640-1650. DOI: 10.1046/j.1432-1327.2000.01156.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1046/j.14321327.2000.01156.x 46. SCHARFEN, Josef. Diferenciální diagnostika v klinické mikrobiologii. 1. vyd. Praha: Nucleus HK, 2013, s. 40-41. Mikrobiologie. ISBN 978-80-87009-32-1. 47. SOKOL, Pamela A.; OHMAN, Dennis E.; IGLEWSKI, Barbara H. A more sensitive plate assay for detection of protease production by Pseudomonas aeruginosa. Journal of clinical microbiology, 1979, 9.4: 538. 48. SPILKER, T et al. PCR-Based Assay for Differentiation of Pseudomonas aeruginosa from Other Pseudomonas Species Recovered from Cystic Fibrosis Patients. Journal of Clinical Microbiology. 2004-05-06, vol. 42, issue 5, s. 2074-2079. DOI: 10.1128/JCM.42.5.2074-2079.2004. Dostupné z: http://jcm.asm.org/cgi/doi/10.1128/JCM.42.5.2074-2079.2004 49. VADILLO-RODRIGUEZ, V., S. R. SCHOOLING a J. R. DUTCHER. In Situ Characterization of Differences in the Viscoelastic Response of Individual Gram-Negative and Gram-Positive Bacterial Cells. Journal of Bacteriology. 2009-08-10, vol. 191, issue 17, s. 5518-5525. DOI: 10.1128/JB.00528-09. Dostupné z: http://jb.asm.org/cgi/doi/10.1128/JB.00528-09 57

50. VOTAVA, M et al. Lékařská mikrobiologie speciální. Brno: Neptun, 2003, s. 32-33. ISBN 80-902896-6-5. 51. VOTAVA, M. Kultivační půdy v lékařské mikrobiologii. 1. vydání. Brno, Hortus, spol. s.r.o. 2000. ISBN 80-238-5058-X. 52. WHITCHURCH, C. B et al. Phosphorylation of the Pseudomonas aeruginosa Response Regulator AlgR Is Essential for Type IV Fimbria-Mediated Twitching Motility. Journal of Bacteriology. 2002-08-15, vol. 184, issue 16, s. 4544-4554. DOI: 10.1128/JB.184.16.4544–4554.2002. Dostupné z: http://jb.asm.org/cgi/doi/10.1128/JB.184.16.4544-4554.2002 53. WIESER, Andreas et al. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics— identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl Microbiol Biotechnol. 2012, č. 93, s. 965-974. DOI: 10.1007/s00253-011-3783-4. Dostupné z: http://download.springer.com/static/pdf/500/art%253A10.1007%252Fs00253-011-37834.pdf?auth66=1393688239_fedda4673024a55369ba01bf179626ea&ext=.pdf 54. Www.erbalachema.com. Https://www.erbalachema.com/produktovapodpora/pracovni-navody/pracovni-navody-mikrobiologie/ [online]. [cit. 2014-03-02]. Dostupné z: https://www.erbalachema.com/attachments/OXItest-CZ+SK+EN+RU+PL.pdf 55. Www.erbalachema.com. Https://www.erbalachema.com/produktovapodpora/pracovni-navody/pracovni-navody-mikrobiologie/ [online]. [cit. 2014-03-02]. Dostupné z: https://www.erbalachema.com/attachments/NEFERMtest%2024CZ+SK+EN+RU+PL.pdf

58

15. PŘÍLOHY

Obrázek 4: Pseudomonas aeruginosa izolována z BAL, Krevní agar, kultivace: 35°C 48 hodin. Po prodloužené kultivaci je pozorována výrazná zóna β hemolýzy.

Obrázek

5:

Pseudomonas

aeruginosa

izolována

z BAL,

ENDO

agar,

Na agaru pozorujeme světlé kolonie v barvě agaru, nedochází ke štěpení laktózy.

59

35°C,

24

hodin.