Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd
Laboratorní průkaz infekce Pneumocystis jiroveci (bakalářská práce)
Autor práce: Petra Lišková Vedoucí práce: PharmDr. Barbora Voxová
Hradec Králové, 2012
„Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.“
datum
podpis
Ráda bych tímto poděkovala svojí školitelce PharmDr. Barboře Voxové za pomoc, vlídný přístup a odborné vedení během zpracování mé bakalářské práce, dále svým přátelům a rodině za podporu.
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Kandidát: Petra Lišková Školitel: PharmDr. Barbora Voxová Název bakalářské práce: Laboratorní průkaz infekce Pneumocystis jiroveci
ABSTRAKT Cílem této bakalářské práce je seznámení se s problematikou onemocnění způsobené Pneumocystis jiroveci. Zabývá se nejenom přenosem infekce, moţnostmi léčby a prevence, ale hlavně laboratorními metodami stanovení. Diagnostické metody zde jsou podrobně popsány a následně zhodnoceny podle výsledků z FNHK za období 2008-2011. Výsledky zhodnocení jsou v závěru práce porovnány i s jinými autory zabývající se tímto tématem.
Charles Univerzity in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Candidate: Petra Lišková Supervisor: PharmDr. Barbora Voxová Title of batchelor thesis: Laboratory proof of infection Pneumocystis jiroveci
ABSTRACT The aim of this bachelor thesis is familiarization with the issue of diseases caused by Pneumocystis jiroveci. It deals with the transmission of infection not only, options of treatment and prevention, but primarily with laboratory methods of determination. Diagnostic methods are described in detail and then evaluated according to the results from FNHK for the period 2008-2011. Results of the evaluation are compared with other authors at the end of the work.
OBSAH
1.
ÚVOD................................................................................................................................6
2.
CÍL PRÁCE .........................................................................................................................6
3.
TEORETICKÁ ČÁST .............................................................................................................7
3.1. Pneumocystis jiroveci jako původce pneumocystové pneumonie ....................................7 3.1.1.
Historie .................................................................................................................. 7
3.1.2.
Biologické vlastnosti Pneumocystis jiroveci............................................................. 8
3.1.3.
Epidemiologie PJ .................................................................................................... 8
3.1.4.
Patologie infekce PJ ............................................................................................... 9
3.1.5.
Klinické příznaky PCP ........................................................................................... 10
3.1.6.
Léčba PCP ............................................................................................................ 10
3.1.6.1.
Cotrimoxazol ................................................................................................ 11
3.1.6.2.
Pentamidin .................................................................................................. 11
3.1.6.3.
Dapson......................................................................................................... 12
3.1.6.4.
Eflornithin .................................................................................................... 12
3.1.6.5.
Trimetrexat .................................................................................................. 12
3.1.6.6.
Atovaquon ................................................................................................... 13
3.1.6.7.
Kortikosteroidy ............................................................................................ 13
3.1.7.
Profylaxe PCP....................................................................................................... 13
3.1.7.1.
Vznik rezistence na chemoprofylaktika PCP .................................................. 14
3.2. Diagnostika PCP .............................................................................................................. 15 3.2.1.
3.2.1.1.
Rentgen ....................................................................................................... 15
3.2.1.2.
Výpočetní tomografie (CT)............................................................................ 16
3.2.2.
4.
Zobrazovací metody............................................................................................. 15
Mikrobiologické vyšetření .................................................................................... 16
3.2.2.1.
Materiál pro vyšetření .................................................................................. 17
3.2.2.2.
Odběr materiálu........................................................................................... 17
3.2.2.3.
Mikroskopie a diagnostické barvení.............................................................. 18
3.2.3.
Imunofluorescenční stanovení ............................................................................. 19
3.2.4.
Řetězová polymerázová reakce (PCR)................................................................... 19
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST .................................................................................................. 21
4.1. Vyšetření BAL na přítomnost PJ barvícími technikami Gram-Weigert, GiemsaRomanovski a Grocott ............................................................................................................ 21
4.1.1.
Zpracování materiálů ........................................................................................... 21
4.1.1.1.
Zpracování materiálu v mikrobiologické laboratoři ....................................... 21
4.1.1.2.
Zpracování materiálu v histologické laboratoři ............................................. 21
4.1.2.
Barvení Gram-Weigert ......................................................................................... 22
4.1.3.
Barvení Giemsa-Romanowski ............................................................................... 22
4.1.4.
Barvení dle Grocotta ............................................................................................ 23
4.2. Vyšetření BAL na přítomnost PJ pomocí PCR .................................................................. 24 5.
VÝSLEDKY ....................................................................................................................... 27
5.1. Úvod ............................................................................................................................... 27 5.2. Rozdělení pacientů s pozitivní diagnostikou PJ ............................................................... 27 5.2.1.
Dle pohlaví........................................................................................................... 27
5.2.2.
Dle věku............................................................................................................... 28
5.2.3.
Dle oddělení ........................................................................................................ 29
5.3. Rozdělení dle vyšetření a pozitivních/negativních pacientů ........................................... 30 5.3.1.
Dle počtu vyšetření .............................................................................................. 30
5.3.2.
Dle počtu vyšetřených pacientů ........................................................................... 31
5.4. Určení hodnoty cut-off ................................................................................................... 31 5.4.1.
Koncentrace DNA u vzorků pozitivních metodou PCR i mikroskopicky .................. 32
5.4.2.
Koncentrace DNA u vzorků pozitivních metodou PCR a negativních mikroskopicky 32
5.5. Tabulka diagnóz.............................................................................................................. 33 6.
DISKUSE .......................................................................................................................... 35
7.
ZÁVĚR ............................................................................................................................. 38
8.
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ....................................................................................... 39
9.
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK........................................................................................ 41
1.
ÚVOD Pneumocystis carinii (jiroveci) je v dnešní době povaţována za původce
pneumonie u osob s oslabenou imunitní funkcí. V mojí bakalářské práci se budu zabývat nejenom tím, jak tato houba v minulosti „zamotala hlavu“ mikrobiologům, ale hlavně její laboratorní diagnostikou v dnešní době. V teoretické části bude pojednáno o tomto patogenu, o moţné léčbě a prevenci. Dále se zaměřuji na metody stanovení, které budou podrobněji popsány i v části experimentální. Zhodnocení dat získaných z ÚKM FNHK je věnována část s výsledky a diskuse.
2.
CÍL PRÁCE
Seznámit se s laboratorními metodami detekce Pneumocystis jiroveci. Zpracovat teoretickou část o patogenezi onemocnění Pneumocystis jiroveci. Vypracovat literární rešerši zaměřenou na dané téma. Zpracovat výsledky laboratorních vyšetření za období 2008-2011.
6
3.
TEORETICKÁ ČÁST
3.1.
Pneumocystis jiroveci jako původce pneumocystové pneumonie
3.1.1. Historie Prvok nebo houba? To byl v minulém století velký otazník pro vědce mikrobiology, kteří se touto problematikou zabývali. První identifikoval Pneumocystis na začátku dvacátého století brazilský vědec Carlos Chagas v plicní tkáni morčat. Pouze o rok déle také jeho kolega mikrobiolog A. Carini u krys. A právě v této době došlo k mylnému zařazení Pneumocystis mezi prvoky. Oba mikrobiologové se totiţ domnívali, ţe jde o bakterii příbuznou trypanozomy, jelikoţ právě tímto kmenem infikovali svá pokusná zvířata. Další objevy provedli ve Francii o několik let později pan a paní Delanoe, kteří izolovali Pneumocystis z krys a popsali nový rod. Jako poctu jihoamerickému vědci pojmenovali tohoto ne moc známého prvoka Pneumocystis carinii. Záhadu se podařilo objasnit aţ v 70. letech dvacátého století, kdy aţ prozkoumání molekulární struktury organismu odhalilo, ţe se všichni mýlili a Pneumocystis carinii byla zařazena mezi houby. Ta se v některé literatuře nazývá také Penumocystis jiroveci po českém mikrobiologovi Jírovci. Spolu s Vaňkem vyšetřovali příčinu smrtelné pneumonie u nedonošených kojenců a podařilo se jim prokázat stejný patogen jako o půl století později u pacientů s HIV. V roce 1953 obdrţeli za tento objev státní cenu. Můţe se naskytnout otázka, jaký je rozdíl mezi Pneumocystis jiroveci a Pneumocystis carinii? Votava (2010) uvádí, ţe pro zvířecí kmeny se zachoval název Pneumocystis carinii, pro lidské zase Pneumocystis jiroveci. Tento fakt objasnil i otázku, ţe PJ patří do jednoho samostatného kmene s velkým počtem hostitelů. Největší rozsah pneumocystové pneumonie, jak se tato plicní choroba začala nazývat, vědci zaznamenali s příchodem epidemie viru HIV, kde se nákaza touto houbou stala hlavní smrtelnou komplikací nemoci. Další velká epidemie se datuje do 80. let, kdy se nejenom rozšířil počet pacientů s HIV, ale 7
fatální pneumonie se začala objevovat i u ostatních s oslabenou funkcí imunitního systému, jako jsou nemocní po chemoterapii nebo lidé po transplantaci, kdy je nutností nasadit imunosupresivní léčbu. Díky prevenci se v posledních letech počet nakaţených pneumocystovou pneumonií sníţil, a to hlavně podáváním léků k posílení imunity. (Cantwell, 1986), (Kovacs, a další, 2001), (Skřičková, 2005), (Votava, a další, 2010)
Biologické vlastnosti Pneumocystis jiroveci
3.1.2.
PJ se řadí mezi askomycety. Svými vlastnostmi se velice podobá mykotickým organismů v první řadě díky struktuře rRNA, v druhé řadě tím, ţe obsahuje téměř totoţné enzymy. Jde o eukaryontní organismus, který díky mitochondriím vyuţívá kyslík k produkci energie. Malou odlišností od ostatních mykotických organismů je obsah cholesterolu místo ergosterolu v buněčné membráně, coţ je zřejmě i důvod, proč je PJ odolná vůči většině antimykotik, které dokáţou ovlivňovat právě ergosterolovou sloţku membránového systému, a tím narušit strukturu mykotické buňky. PJ se vyskytuje ve třech formách: cysty, trofozoiti a precysty. V první fázi hostitel vdechuje cysty, které se v plicích rozpadají na jednotlivá tělíska, ze kterých se vyvíjejí trofozoiti. Ti se rozmnoţují příčným dělením a spojením dvou různých haploidních trofozoitů vznikne zygota, která se vyvine v precystu a následně v cystu. Celý cyklus se následně opakuje. Kaţdé stadium PJ má svůj specifický tvar, velikost i počet jader, podle čehoţ můţeme rozlišit stupeň infekce v klinických vzorcích. (Kovacs, a další, 2001), (Svoboda, 1996), (Votava, a další, 2010)
3.1.3.
Epidemiologie PJ Mikroorganismus PJ je rozšířen po celém světě. Nejvíce však v Severní
Americe a Evropě, kde často dochází ke kombinaci s různými infekcemi, a tím k váţnějšímu průběhu pneumocystové pneumonie. 8
Skřičková (2005) ve svém článku uvadí fakt, ţe dle výsledků sérologických vyšetření se většina naší populace setkala s PJ jiţ v prvních letech ţivota. Znamená to, ţe jsme proti infekci PJ celoţivotně chráněni. Pokud se ovšem nedostaneme do stavu, kdy bude patologicky nebo cíleně oslaben náš imunitní systém. Předpokládá se, ţe PJ se přenáší kapénkovou cestou, coţ bylo prokázáno u pokusných zvířat jako nejčastější cesta přenosu. Zdrojem infekce nejsou pouze nakaţení, ale i zdraví jedinci, u kterých infekce nepropukla a slouţí pouze jako přenašeči. Pneumocystová pneumonie je oportunní infekce. PJ má schopnost se mnoţit a růst pouze u jedinců s oslabenou imunitou, kde proti invazivnímu mikroorganismu nemůţou dostatečně zasáhnout sloţky imunitního systému. Velmi ohroţenou skupinou jsou proto předčasně narozené děti, které ještě nemají dostatečně vyvinutou plicní tkáň, dále pak pacienti při podávání cytostatik nebo při imunosupresivní léčbě po transplantacích, kdy je imunitní systém cíleně potlačován, a v neposlední řade lidé s HIV infekcí ve stadiu AIDS. (Rozsypal, 1998), (Skřičková, 2005), (Votava, a další, 2010)
3.1.4.
Patologie infekce PJ Vdechnutím nejodolnějšího vývojového stadia PJ - cysty se patogen
dostane do dýchacích cest, plic a následně aţ do plicních alveol. Pevně se přichytí na pneumocyty a začne se mnohonásobně dělit. U zdravých jedinců je infekce eliminována hned po usazení v plicních sklípcích pomocí makrofágů, ale u oslabených jedinců imunitní systém nemůţe adekvátně zareagovat. Pomnoţené cysty zaplní povrch alveolu a vytvoří zde velké mnoţství exudátu, které zabraňuje dostatečné výměně plynů mezi plicní tkání a krví. Při postiţení větší části plic pacient pociťuje charakteristické příznaky. (více viz kapitola 3.1.5. Klinické příznaky PCP) Při kombinaci s cytomegalovirem, virem Ebstain-Baarové, atypickými mykobakteriemi nebo s rutinními bakteriálními infekcemi se předpokládá komplikovanější průběh nemoci s velkou pravděpodobností k recidivě. (Kovacs, a další, 2001), (Svoboda, 1996), (Votava, a další, 2010) 9
3.1.5.
Klinické příznaky PCP PJ poškozuje plicní tkáň nejen nekontrolovaným mnoţením, ale
především produkcí pěnovitého infiltrátu, který „blokuje“ stěnu plicního sklípku. Tím nemůţe docházet k dostatečné výměně plynů, a to hlavně kyslíku. Pokud infekce rychle postupuje, dochází k hypoxii. Nedojde-li k časnému odhalení této nemoci, můţe pro pacienta skončit smrtí. Počáteční klinické příznaky PCP jsou totoţné s příznaky infekce virem HIV, proto se tento stav nedá jednoznačně rozpoznat. Pacient ztrácí váhu, má lehce zvýšenou teplotu, trpí dušností a suchým kašlem. Při podezření na PCP si lékař vyţádá nejenom rentgen plic pacienta, ale i mikrobiologické a imunologické vyšetření. Podle výsledku rozhodne, zdali bude nutné zahájit léčbu.(více o těchto metodách v kapitole 3.2. Diagnostika PCP) Klinický obraz PCP mohou ovlivňovat i jiné mykotické, bakteriální nebo virové infekce. Záleţí tedy na tom, jestli je PJ hlavním patogen poškozující alveoly, nebo zda jde o kombinovanou infekci. (Kovacs, a další, 2001), (Skřičková, 2005), (Svoboda, 1996)
3.1.6.
Léčba PCP První úspěchy zaznamenali Ivady a Paldy po parenterálním podání
pentamidinu v roce 1958, tedy po pěti letech od doby, kdy byla tato infekce brána jako smrtelná. V dnešní době se jako lék první volby uvádí většinou cotrimoxazol. V minulosti se spíše pouţíval toxický pentamidin, kterým se také léčila trypanozomiáza. Záleţí však na lékaři, jaký lék zvolí, a v druhé řadě na stavu pacienta. Lék první volby se můţe lišit u pacientů s AIDS a u pacientů po imunosupresivní léčbě. Dalšími medikamenty mohou být dapson, eflornithin, trimetrexat nebo atovaquon. (Skřičková, 2005), (Svoboda, 1996)
10
3.1.6.1. Cotrimoxazol Nejčastější lék první volby. Podává se buď perorální cestou, nebo intravenózně cestou u pacientů s těţkými průjmy. Aţ u 50% nemocných se po podání objeví alergická reakce a u 30% z nich je to důvod k přerušení léčby cotrimoxazolem. Alergie se můţe projevit jako těţké koţní a slizniční vyráţky, mírné sníţení renální funkce. V krvi se můţe nacházet neutropenie, anemie či trombocytopenie. Jde o dvousloţkový lék. Podává se většinou 20 mg/kg/den trimethoprimu a 100 mg/kg/den sulfamethoxazolu ve třech aţ čtyřech dávkách. Terapii je dobré kombinovat s 50 mg acidum folinicum (folinová kyselina) za týden. Úspěšnost léčby cotrimoxazolem se odhaduje na 80%. (Svoboda, 1996)
3.1.6.2. Pentamidin Dříve se pouţíval k léčbě spavé nemoci (trypanozomiázy). Od roku 1958 se však začal dávkovat nakaţeným PCP, coţ vedlo k vysokému sníţení mortality. Pentamidin se u těţkých forem podává intravenózně po dobu tří týdnů v dávce 3 mg/kg/den. U lehčích forem se podává v podobě aerosolu. Podmínkou je, aby pacient při inhalaci aerosolu leţel. Dosáhne se tak vysoké koncentrace léčiva v plicích a bez váţnějších vedlejších účinků jako jsou hypotenze a následné kolapsové stavy, indukce pankreatitidy, hypoglykémie, hypokalcémie, křeče. Anemie nejsou tak rozsáhlé jako u cotrimoxazolu. Předcházet vedlejším účinkům můţeme pouze včasným podáním netlumivých léků proti alergiím. Pokud se jedná o pacienta ve velmi váţném stavu, je moţné podávat první dny léčby pentamidin s cotrimoxazolem současně, obvykle i s kortikosteroidy. (Svoboda, 1996)
11
3.1.6.3. Dapson Obvykle je tento lék podáván v kombinaci s trimethoprimem (dapson 100mg/den, trimethoprim 20mg/den). Oba tyto přípravky mohou způsobovat řadu vedlejších účinků. Trimethoprim v kombinaci s dapsonem nebo jiným léčivem můţe způsobovat váţnou hyperkalémii, která v některých případech můţe končit i smrtí. Neţádoucí účinky dapsonu na lidský organismus jsou anémie a methemoglobinémie, coţ je zvýšený výskyt oxidovaného hemoglobinu v krvi. To má za následek sníţenou vazbu kyslíku na erytrocyty a následnou hypoxii tkání. Účinnost kombinace dapson – trimethoprim se udává kolem 65%. (Svoboda, 1996)
3.1.6.4. Eflornithin Dříve pouţívaný jako lék proti spavé nemoci – trypanozomiázy. Principem působení eflornithinu je inhibice ornithindekarboxyláz. Dávkování po šesti hodinách intravenózně v koncentraci 100 mg/kg v prvních dvou týdnech terapie. Posléze moţnost perorálního podávání v mnoţství 300 mg/den. Jako hlavní vedlejší účinek se uvádí trombocytopenie. Účinnost léčby 60%. (Svoboda, 1996)
3.1.6.5. Trimetrexat Podává se pacientům, u kterých předchozí preparáty neúčinkovaly z důvodu vyvinuté rezistence PJ. Jedná se tedy o celkem toxický lék způsobující inhibici dihydrofolátreduktázy, a proto se mezi neţádoucí účinky řadí jak trombocytopenie, tak patologické zvýšení aminotransferáz. Jde o rizikový faktor, proto se doporučuje v průběhu terapie provádět kontrolní testy. Klasické dávkování je 30 mg/m2/den intravenózně. (Svoboda, 1996)
12
3.1.6.6. Atovaquon Ve srovnání s cotrimoxazolem je tento přípravek daleko lépe snášen, ale s niţším účinkem. K tomu přispívá i jeden z hlavních vedlejších účinků, a to častý průjem. Tím se sníţí vstřebávání tohoto perorálního léčiva. (Svoboda, 1996)
3.1.6.7. Kortikosteroidy U těţkých forem PCP se zavedlo pouţívání kortikosteroidů. S terapií se však musí začít ve správný čas. K tomu nám můţe dopomoci vyšetření krevních plynů. Pokud se hodnota PaO2 pohybuje nad 70 mmHg, léčba pomocí kortikosteroidů ještě není nutná. U hodnot mezi 50 aţ 70 mmHg volíme perorální uţívání. U velmi těţkých PCP s hodnotou PaO2 pod 50 mmHg se kortikosteroidy z počátku podávají intravenózně. Účinnost léčby se hodnotí hlavně podle klinického obrazu pacienta. Hlavní je rentgenový snímek plic a test na krevní plyny PaO2. Nelze hodnotit dle vyšetření perzistence vzorku BAL. To se provádí pouze na začátku onemocnění pro stanovení diagnózy. Pokud terapie kortikosteroidy není účinná, neexistuje v podstatě jiţ ţádný přípravek, který by zabránil ireverzibilní fibróze plic. Zhoršení stavu můţe být způsobeno například jinou infekcí v organismu, a tím většímu oslabení imunity. (Svoboda, 1996)
3.1.7.
Profylaxe PCP Vzhledem ke stoupajícímu počtu pacientů s PCP bylo nutné zahájit
preventivní opatření – profylaxi. Dělíme ji na primární, kdy se preventivní léčba zahajuje ještě před nákazou PJ. Hlavním signálem pro zahájení primární profylaxe je sníţení CD4+ T lymfocytů pod 0,2 x 10 9/l. Sekundární je doporučena aţ po prodělání PCP. Dále musí lékař nutně zohlednit stav pacienta a příčinu nákazy PJ. Poté zvolí rozdílnou preventivní léčbu pro pacienty s HIV, rakovinou nebo po transplantaci. 13
Nejčastěji se podává cotrimoxazol. Tedy dvousloţkový lék skládající se z sulfamethoxazolu a trimethoprimu. Malou nevýhodou je zatím neprokázaná účinnost proti Toxoplazmě gondii. Při takové profylaxi se pravidelně kontroluje krevní obraz pacientů, kvůli riziku leukopenie. Sporadicky se objevují vedlejší nepříznivé účinky v podobě vyráţek na kůţi a sliznicích. Jako další alternativa pro prevenci PCP se uvádí dapson. Pacienty je lépe tolerován, aţ na riziko methemoglobinémie, a navíc je účinnou prevencí i proti Toxoplazmě gondii. Pokud v průběhu profylaxe vedlejší účinky neustupují, můţeme zvolit aplikaci léčiva pomocí aerosolu. Tato terapie by měla probíhat výhradně v poloze v leţe pomocí inhalátorů. Ve většině případů se jako inhalační léčivo pouţívá pentamidin nebo kombinovaný přípravek sulfadoxinu a pyrimethaminu. Tato profylaxe však nemůţe zabránit klinickým projevům extrapulmonární infekce PJ. Účinnost preventivní profylaxe se v dnešní době pohybuje okolo 90%. Dalším způsobem, jak ochránit rizikovou skupinu pacientů, je zvýšit odolnost jejich imunitního systému pomocí podpůrné léčby různého druhu. (Kovacs, a další, 2001), (Skřičková, 2005), (Svoboda, 1996)
3.1.7.1. Vznik rezistence na chemoprofylaktika PCP Většinovou sloţku terapie i profylaxe tvoří sulfonamidy. Podávají se jako dvě účinné látky: sulfamethoxazol a trimethoprim. Při zkouškách účinnosti terapie na zvířatech však došlo k zjištění, ţe druhá sloţka – trimethoprim na PJ nepůsobí. Proto vědci došli k názoru, ţe dvousloţková léčba je vlastně pouze léčba sulfamethoxazolem. Ten působí na PJ enzymem DHPS, který negativně ovlivňuje syntézu kyseliny listové. Rezistentní na sulfonamidy je řada mikrobů. Uplatňuje se přitom bodová mutace v oblasti genu pro DHPS. Proto se předpokládá, ţe při časté profylaxi si vyvine rezistenci i PJ. Dnešní rezistence PJ má poměrně nízký dopad na účinnost terapie. Dá se ale předpokládat, ţe vlivem časté sulfonamidové profylaxe se bude síla rezistence PJ zvyšovat. Největší měrou se na tom budou podílet další bodové mutace v genomu PJ, a proto se část výzkumu v laboratořích molekulární 14
biologie zaměřuje i na tuto problematiku. Snaţí se sekvenovat genetickou informaci, a tím přispět k lepší terapii pacientů s PCP. (Kovacs, a další, 2001)
3.2.
Diagnostika PCP Odhalit nákazu PJ můţe být na počátku onemocnění poněkud obtíţné. U
pacientů s AIDS je průběh PCP pozvolný a subakutní, naopak u jedinců po transplantaci nebo chemoterapii bývá nástup rychlý a komplikovaný. V dnešní době se k diagnostice PCP pouţívají metody pro zobrazení plic pacienta a speciální mikrobiologické testy pro odhalení PJ v biologickém materiálu. (Kovacs, a další, 2009)
3.2.1.
Zobrazovací metody Pomocí zobrazovacích metod u pacientů se sníţenou imunitní funkcí
můţeme potvrdit nebo vyloučit porušení plicní tkáně a určíme i velikost poškození plicního parenchymu. Dále se tyto metody vyuţívají ke sledování stavů pacientů během léčby. (Cetkovský, a další, 2009)
3.2.1.1. Rentgen Snímání hrudníku se provádí z přední a zadní strany. Pacient musí stát a mít zadrţený dech. Popřípadě lze doplnit i snímky zleva a zprava. V některých případech, kdy je pacient ve váţném stavu a není schopen vyšetření ve stoje, se můţe pouţít přenosný přístroj, který je součástí vybavení některých oddělení. Dále je moţné nemocného převést na radiologii a provést vyšetření vleţe. Pomocí rentgenu hrudníku můţeme rozlišit patologické změny v plicním parenchymu, rozvinutí plicních křídel, a také lze potvrdit nebo vyvrátit tekutinu v pleurální dutině. 15
Kaţdá diagnostická metoda má samozřejmě své pro a proti. Mezi výhody rentgenu patří snadná dostupnost, rychlost, poměrně nízká cena, a tudíţ i moţná opakovatelnost. Jako nevýhodu spatřujeme velké riziko radiačního záření, zvláště u mladších pacientů nebo u těhotných ţen. Při vyhodnocení snímku u pacientů s PCP často nalezneme infiltráty, které později napadají alveoly. Jedná se většinou o symetrické, intersticiální nebo retikulogranulární útvary. (Cetkovský, a další, 2009), (Kovacs, a další, 2009)
3.2.1.2. Výpočetní tomografie (CT) CT neboli computed tomography se také pouţívá k získání snímků hrudníku pacienta, ale jedná se o snímky rozdílné od těch rentgenových. Jde totiţ o kombinaci klasického rentgenového vyšetření a výpočetní techniky. Princip metody se zakládá na postupném snímání těla v transverzální rovině, kdy dostáváme podrobnou informaci o sloţení jednotlivých tkání. Nejčastěji se vyuţívá k vyšetření mozku, páteře, hrudníku i orgánů v břišní dutině, a to většinou k odhalení nádorového bujení. Pro lepší zobrazení struktury cévního systému se můţe pacientovi před vyšetřením intravenózně aplikovat kontrastní látka. Tím lékař přesněji rozpozná cévy od patologických loţisek. V dnešní době je při onemocnění plic moţné vyšetření s vysokou schopností rozlišení. U této metody jsou jednotlivé vrstvy široké 1 aţ 2 mm, ale mají mezi sebou mezeru 10 aţ 20 mm, coţ můţe zapříčinit chybu v detekci malého loţiska. Jedinou výhodou je sníţená radiační zátěţ. Při porovnání s klasickou rentgenovou technikou se CT řadí mezi ty citlivější, ale cena je samozřejmě mnohonásobně vyšší. (Cetkovský, a další, 2009)
3.2.2.
Mikrobiologické vyšetření Rutinní vyšetření jako je analýza krve, moči, základní biochemická
stanovení nebo rentgenové snímky hrudníku nemohou s určitostí potvrdit infekci 16
způsobenou PJ. Proto se vyuţívá mikrobiologické vyšetření materiálu, který přímo souvisí s plicní tkání. Další moţností důkazu jsou histologické techniky, které prokáţou po vhodném obarvení PJ přímo v tkáňovém řezu. (Skřičková, 2005)
3.2.2.1. Materiál pro vyšetření Při průkazu PJ rozlišujeme různé druhy biologického materiálu. Mezi ty nejčastější patří bronchoalveolární tekutina, indukované sputum, neindukované sputum, plicní tkáň získaná biopsií a další. Senzitivita záchytu je u kaţdého materiálu rozdílná. Viz tabulka č. 1. (Skřičková, 2005) Tab. 1. Porovnání senzitivity záchytu PJ u různých materiálů (Skřičková, 2005) Materiál
Senzitivita
transbronchiální biopsie + BAL
95 - 100%
otevřená plicní biopsie transbronchiální biopsie BAL - bronchoalveolární laváţ indukované sputum + imunofluorescence laváţ nebronchoskopickou cestou indukované sputum bronchiální výplach bronchiální brushing neindukované sputum
99% 88 - 97% 79 - 97% 94% 83 - 88% 55 - 80% 79% 39 - 79% 30%
3.2.2.2. Odběr materiálu Nejsnáze získaný biologický materiál pro diagnostiku PCP je neindukované sputum. Tento typ sputa pacient samovolně vykašlává do plastové zkumavky, poté je vzorek centrifugován, nabarven a zkušeným laborantem odečten výsledek. Jde o materiál, ze kterého zachytíme PJ s opravdu malou pravděpodobností. Viz. Tab. 1. Postupem doby se odebírání vzorků zdokonalilo. Zlepšení se projevilo při odebírání sputa, bronchoalveolární tekutiny, a také u biopsie plicní tkáně. 17
V dnešních nemocničních zařízeních se provádí odběr indukovaného sputa. Jde o techniku, kdy se pacientům nebulizátorem před odběrem navlhčí dýchací cesty. Díky tomu se získá kvalitnější materiál a moţnost záchytu PJ se zvýší. BAL neboli bronchoalveolární laváţ je poněkud nepříjemná procedura, při které se nemocným zavádí do dýchacích cest hadička. Tou se nejdříve plíce naplní daným objemem fyziologického roztoku a poté se zpátky odsaje do připravených zkumavek. Metoda je často vyuţívaná pro svou specifičnost i nízké náklady na provedení. Mezi nejdokonalejší a nejnáročnější metody odebrání materiálu patří biopsie. Náročnost je nejenom na provedení, ale jde také o velký zásah do organismu pacienta. V minulosti byly pouţívány obyčejné bronchoskopy, neţ se přešlo na modernější ohebné. Díky nim jsou dnes do histologických laboratoří přijímány vzorky lepší kvality a s téměř stoprocentní senzitivitou pro odhalení PJ. (Kovacs, a další, 2001), (Kovacs, a další, 2009), (Skřičková, 2005)
3.2.2.3. Mikroskopie a diagnostické barvení Hlavní materiály pro barvení jsou bronchoalveolární tekutina, indukované sputum nebo bioptická tkáň. Můţeme je rozdělit na přirozeně sterilní materiál, kde neočekáváme ţádné jiné antigeny a kam řadíme právě bronchoalveolární laváţ. Mezi přirozeně nesterilní materiály patří sputa, která fyziologicky obsahují širokou řadu mikroorganismů, které nám mohou zkreslovat výsledek vyšetření, a proto není tolik specifické jako například BAL. Pokud máme dostatek materiálu, můţeme se rozhodnou, zda budeme pozorovat nativní nebo obarvený preparát. Oba nám poskytnou poměrně rychlou odezvu o tom, co se v organismu děje. Protoţe ale tato technika není dostatečně citlivá, musíme mikroskopii doplnit o další vhodně zvolená vyšetření nebo specifické barvení. Je zřejmé, ţe různá stadia PJ se budou barvit různě a bude tedy potřeba pouţít dobré barvící techniky. V praxi se nejčastěji pouţívá barvení dle Giemsy-Romanowského, Gram-Weigerta nebo stříbření dle Grocotta pro obarvení histologických řezů. Další moţností je imunofluorescence, která zvyšuje 18
nejen senzitivitu stanovení, ale i pravděpodobnost pozitivního záchytu PJ. (Viz. 3.2.3. Imunofluorescenční stanovení) Správná volba diagnostického barvení závisí na celém výsledku stanovení. V dnešní době není klasické mikrobiologické barvení povaţováno za nejlepší diagnostický postup, ale pro svou jednoduchost a rychlost se stále pouţívá. Ovšem doplněno o další metody, jako je například řetězová polymerázová reakce. (Cetkovský, a další, 2009), (Kovacs, a další, 2001), (Kovacs, a další, 2009), (Kultan, a další, 2008), (Skřičková, 2005)
3.2.3.
Imunofluorescenční stanovení Ve většině zdrojů se metoda imunofluorescence uvádí jako
nejcitlivější. Začala se pouţívat kolem roku 1986 pro odhalení cystických i trofozoitových stadií PJ v biologickém materiálu. I kdyţ trofozoiti nejsou ve vzorku tolik rozpoznatelné. Hlavní princip spočívá ve vyuţití monoklonálních protilátek, které reagují s lidskými kmeny PJ. Tento postup se postupem času zdokonaloval a například při pouţití protilátek 2G2 se dají odhalit i dříve problematická trofozoitová stadia. Jde o metodu poměrně jednoduchou na provedení a velice citlivou. Uvádí se, ţe senzitivita se pohybuje okolo 90 - 95% a specificita aţ 100%. Odborníci v oboru však vţdy doporučují doplnit stanovení nepřímou fluorescencí i cytologickým vyšetřením. (Kovacs, a další, 2001), (Kovacs, a další, 2009), (Skřičková, 2005)
3.2.4.
Řetězová polymerázová reakce (PCR) Řetězovou polymerázovou reakci řadíme do molekulárně-biologických
metod. V dnešní době je široce vyuţívána nejenom v laboratořích zaměřených na molekulární biologii, ale i v ostatních vědních oborech. Principem je několikanásobné zmnoţení úseku nukleové kyseliny ve třech teplotních skocích. Přitom dochází k postupné denaturaci dvouvláknové 19
nukleové kyseliny a k rozpletení na dva jednotlivé řetězce. Následně se pomocí oligonukleotidových primerů označí úseky na nukleové kyselině, které se v následujícím kroku namnoţí. Díky tomu lze odhalit pozitivní nález i v mikroskopických mnoţstvích vzorku. Další výhodou je moţnost rychlého vyhodnocení. Vyuţívá se nejenom k detekci daného agens, ale také k typizaci a identifikaci. Nezbytnou součástí reakční směsi musí být řada specifických látek. Patří mezi ně enzym DNA-polymeráza, která katalyzuje syntézu vznikající DNA. Kvůli velkým teplotním změnám se pouţívá termostabilní Taq-polymeráza, izolovaná z Thermus aquaticus. Odolá teplotám do 98˚C. V mikrozkumavce, ve které probíhá PCR, nesmí dále chybět hořečnaté ionty s katalytickou funkcí, deoxynukleotidtrifosfáty na stavbu nové DNA a pufr pro udrţení stabilního pH. Jednou z nevýhod klasické PCR je nemoţnost kvantifikace v průběhu reakce, jelikoţ se vyhodnocuje aţ výsledný produkt. Zavedení takzvané real-time PCR umoţnilo měřit koncentraci produktu za jednotku času. (Cetkovský, a další, 2009), (Průša, 1997)
20
4.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
4.1.
Vyšetření BAL na přítomnost PJ barvícími technikami GramWeigert, Giemsa-Romanovski a Grocott
4.1.1.
Zpracování materiálů
4.1.1.1. Zpracování materiálu v mikrobiologické laboratoři 1) Necháme odstředit při 2 000 – 2 500 ot/min po dobu 10 minut. 2) Naneseme sediment na 6 podloţních sklíček a rozetřeme do velikosti pokrývající asi dvě třetiny plochy sklíčka. (5x k barvení, 1x na úschovu) 3) Sušíme dle hustoty materiálu 2-24 hodin v uzavřené papírové krabičce. (k zabránění náhodného kontaktu s hmyzem apod.) 4) Barvíme dle Giemsy-Romanowského (GR). – 2 sklíčka 5) Barvíme dle Gram-Weigerta (GW). – 2 sklíčka 6) Barvíme dle Grama (G). – 1 sklíčko 7) Původní BAL uschováme v chladničce do uzavření výsledku, poté umístíme předepsaným způsobem do biologického odpadu. 4.1.1.2. Zpracování materiálu v histologické laboratoři 1) Připravíme 3 podloţní sklíčka, která si popíšeme.(2x 200μl, 1x400μl) 2) Sklíčka umístíme do speciálního svěráku, na kaţdé vloţíme filtrační papír s otvorem 5 mm a speciální nálevku na tekutý vzorek. Svěrák utáhneme. 3) Do kaţdé nálevky nadávkujeme daný objem vzorku. (2x200μl, 1x400μl)
Příprava preparátu
Foto: Petra Lišková
4) Vloţíme do přístroje Cytospin 4, vhodně vyváţíme. 5) Necháme točit při 400 ot/min, 5 minut.
21
6) Po dotočení vyndáme svěráky z přístroje, sklíčka uvolníme ze svěráků, necháme zaschnout a obarvíme.
4.1.2.
Barvení Gram-Weigert
Foto: Petra Lišková
Cytospin 4
1) Připravíme roztěry na podloţní sklíčka, necháme řádně zaschnout při pokojové
teplotě,
fixujeme
metanolem (3-5 minut), necháme zaschnout. 2) 1% eosin Y po dobu 5 min. 3) Barvivo
spláchneme
pod
proudem vody – mírně tekoucí. 4) Roztok krystal violeti – 5 min.
Barvení Gram-Weigert
Archiv ÚKM FNHK
5) Barvivo smyjeme Gram-jódovým roztokem – odchází jako lesklé obláčky. 6) Gram-jódový roztok nechat převrstvený po dobu 5 minut 7) Roztok
opatrně
opláchneme
pod
proudem
mírně
tekoucí
vody
(vodovodní), necháme zaschnout. 8) Po zaschnutí preparáty diferencujeme roztokem anilin-xylenu (na sklíčka kapeme roztok anilin-xylenu tak dlouho, dokud odchází modré barvivo), odbarvování ukončíme opláchnutím sklíčka v xylenu. 9) Po usušení prohlíţíme mikroskopem (imerzí). 10) Odečtené preparáty uchováváme v označené krabičce. 4.1.3.
Barvení Giemsa-Romanowski
1) Zaschlý preparát fixujeme metylalkoholem 5 min, poté sklopíme sklíčko a necháme Barvení Giemsa-Romanowski
www.ucsf.edu
22
uschnout. 2) Preparáty umístíme do barvicí kyvety 3) Barvíme roztokem Giemsy-Romanowského, ředěným 1:10 pufrovanou vodou pH 7,2 - 7,6. 15 min – 25 min, dle vybarvení leukocytů při prvním barvení danou šarţí. (K přípravě pracovního roztoku 1 : 10 pouţíváme plastový odměrný válec 100 ml, na kterém jsou vyznačeny fixem dvě značky. Ke spodní značce nalijeme pufrovanou vodou, pak se k horní značce dolije roztok GiemsyRomanowského). 4) Asi 2 minuty před koncem doby barvení dolijeme kyvety pufrovanou destilovanou vodu a 1-2 minuty jemně poklepáváme kyvetou – tzv. probarvování. 5) Opláchneme proudem vodovodní vody jemně vpouštěným do rohu kyvety tak, aby barvivo s případnými artefakty odtékalo vrchem aţ do odtékání čisté vodovodní vody. 6) Preparáty necháme uschnout při pokojové teplotě, příp. osušíme v digestoři proudem vzduchu – odtah. 7) Preparáty se prohlíţí imerzním systémem při zvětšení 400-1 000. 8) Zhodnocené preparáty se ukládají do kontejnerů a uchovávají se v laboratoři po dobu 3 let. 4.1.4. Barvení dle Grocotta Toto barvení se pouţívá výjimečně pro barevní histologických řezů většinou plicní tkáně při podezření na nákazu PJ. 4.1.4.1. Postup 1) Vzorek odparafinujeme a
Barvení dle Grocotta
anapath-paris7.aphp.fr
opláchneme destilovanou vodou. 2) Pouţijeme kyselinu jodistou (5%vodný roztok) a necháme působit 10 minut. 3) Vypereme v tekoucí vodě a poté oplachujeme v destilované vodě po dobu 10 minut. 23
4) Naneseme kalium metabisulfit (1%) a necháme působit 1 minutu a opláchneme pitnou vodou. 5) Opláchneme destilovanou vodou (3x vyměníme) po dobu 5 minut. 6) Vloţíme vzorky do impregnačního roztoku ve vodní při 60˚C na dobu 2545 minut. Po tomto kroku následuje kontrola barvení v mikroskopu. 7) Opláchneme destilovanou vodou ve vodní lázni při 60˚C. 8) Nakapeme chlorid zlatitý 0.1% (1ml 10% chloridu zlatitého + 98ml destilované vody) a necháme působit 5 minut. 9) Opláchneme v destilované vodě. 10) Nakapeme sirnatan sodný 2% (2g doplnit do 100ml destilovanou vodou) a necháme působit 1 minutu. 11) Opláchneme v destilované vodě po dobu 3 minut. 12) Pouţijeme jádrovou červeň a necháme působit 5-10 minut. 13) Opláchneme v destilované vodě. 14) Odvodníme a montujeme. 4.1.4.2. Hodnocení výsledků Plísně se barví černě, vnitřní části mycelií a hyf starorůţově, mucin černě, jádra buněk červeně.
4.2.
Vyšetření BAL na přítomnost PJ pomocí PCR
4.2.1. Princip K průkazu a kvantifikaci DNA PJ se pouţívá metoda rtPCR (real-time PCR) s vyuţitím primerů a hydrolytické sondy z oblasti mitochondriální rRNA na přístroji RotorGene 3000. Sonda je na jednom konci značena fluorescenčním barvivem FAM (6karboxyfluorescein) a na druhém konci BHQ (Black Hole Quencher), který slouţí jako nefluorescenční zhášeč. Kontrola inhibice DNA polymerázy je zajištěna koamplifikací DNA inhibiční kontroly, která je součástí
Digestoř pro přípravu master mixu Foto: Petra Lišková
amplifikační směsi QuantiFast Pathogen PCR + IC. DNA inhibiční kontroly je 24
syntetická DNA unikátní sekvence, která není homologní s jinou sekvencí z GenBank databáze. Sonda pro inhibiční kontrolu je značena fluorescenční barvou MAX™ NHS Ester, která má detekční profil JOE. Detekce PJ je umoţněna on-line záznamem fluorescence reporteru na konci kroku o teplotě 60˚C univerzálního teplotního profilu pro hydrolytické sondy, tzn. měření fluorescence na kanálu JOE (555 nm). Velikost produktu pro mitochondriální rRNA je 232 bp.
4.2.2. Postup 1) Izolace DNA Pneumocystis jiroveci Izolace DNA se provádí komerčním kitem. Zpracování materiálu, izolace DNA a její uchování se provádí ve speciální místnosti určené pro tuto činnost. Vyizolovaná DNA je skladována do provedení rtPCR a výdeje výsledku v lednici v 1,5ml
Autosampler s PCR zkumavkami Foto: Petra Lišková
zkumavkách označených štítkem, na kterém je uvedeno jméno pacienta, typ materiálu a datum odběru. V případě potřeby je DNA skladována při - 20˚C nebo - 70˚C v označených krabičkách.
2) Amplifikace metodou PCR Pro amplifikaci DNA se pouţívá metoda real-time PCR na přístroji RotorGene 3000, primery a sonda z oblasti mitochondriální rRNA. Během reakce dochází zároveň ke koamplifikaci inhibiční kontroly (QuantiFast Pathogen® PCR + IC). Příprava amplifikační směsi („master mixu“) probíhá podle návodu a surovin dodaných od výrobce. Pipetujeme 10 μl připravené směsi a přidáme směs
RotorGene 3000
Foto: Petra Lišková
primery/sonda/voda o objemu 10 μl (dle tabulky). 25
Primer 1 (Reverse)
0,3 μmol/l
0,75 μl
Primer 2 (Forward)
0,3 μmol/l
0,75 μl
Sonda
0.25 μmol/l 0,625 μl
Voda ad 10 μl
7,875 μl
Celkem
10 μl
Amplifikační směs se připravuje v laminárním boxu ve speciální místnosti. 3) K 20 μl připravené směsi přidáme ve speciální místnosti templátovou DNA 5 μl. 4) Amplifikace probíhá na přístroji RotorGene 3000 určeném pro real-time PCR. Denaturace: 95˚C
5 min.
Annealing: 96˚C
15 s
Elongace: 60˚C
30 s
45x
5) Fluorimetrická detekce s on-line záznamem na počítači. Odečet fluorescence se provádí na kanále JOE na konci kroku o teplotě 60˚C. Nastavení thesholdu je prováděno softwarem na základě vyhodnocení kalibrační křivky vytvořené pomocí standardů, připravených desítkovým ředěním zásobního roztoku o koncentraci 1017 kopií/μl.
4.2.3.
Výsledky Vysokoškolský pracovník provede odečet výsledků a analytickou kontrolu,
u pozitivních vzorků s poţadavkem na kvantifikaci provede přepočet výsledku z kopií/μl na kopie/ml dle daného vzorce. Forma výsledku – DNA prokázána/ DNA neprokázána, v případě kvantifikace je zapsána číselná hodnota v kopiích plazmidové DNA/ml.
26
5.
VÝSLEDKY
5.1.
Úvod Zde jsou zhodnoceny výsledky praktické části tj. výsledky vyšetření
pomocí metody PCR a barvícími metodami. Tyto metody budu porovnávat a dále rozdělovat vyšetřené pacienty dle různých aspektů. Podkladový materiál tzn. diagnózy, oddělení a výsledky vyšetření jsem získala z Ústavu klinické mikrobiologie FNHK a z Ústavu klinické biochemie a diagnostiky FNHK. Výsledky jsou zpracovány za období 1.1.2008 – 31.12.2011.
5.2.
Rozdělení pacientů s pozitivní diagnostikou PJ
5.2.1.
Dle pohlaví
Počet pacientů s PCP
Rozdělení nemocných s PCP dle pohlaví
120 100 80
60
119 70
40
49
20 0 Celkový počet pacientů s PCP
Muţi s PCP
Ţeny s PCP
Procentuální zastoupení můţů a ţen s PCP Muţi
41%
Ţeny
59%
27
Závěr: Výsledky zpracovány za období 2008 – 2011. Z dosaţených dat vyplývá, ţe zastoupení muţů a ţen s diagnostikovanou PCP je podobné. Nedá se tedy o PCP jasně říci, zdali je typická pro muţskou nebo ţenskou skupinu populace. 5.2.2.
Dle věku Rozloţení pacientů s PCP mezi věkové skupiny 40
Počet pacientů
35 30
< 30 let
25
30 aţ 40 let
20
34
37
4
10 5
40 aţ 50 let
27
15
2
7
8
< 30 let 30 aţ 40 let
40 aţ 50 let
50 aţ 60 let 60 aţ 70 let 70 aţ 80 let
0 50 aţ 60 let
60 aţ 70 let
70 aţ > 80 let 80 let
> 80 let
Věková skupina
Procentuální rozloţení věkových skupin 3% 2% 6%
28%
7% < 30 let 30 aţ 40 let
23%
40 aţ 50 let 50 aţ 60 let 60 aţ 70 let 70 aţ 80 let > 80 let
31% Závěr: Nejvíce pozitivních pacientů spadá do skupiny mezi 60 aţ 70 lety, následovány jsou věkovými skupinami 70-80 let a 50-60 let. Nejméně jich nalezneme ve skupině mladších 30-ti let.
28
5.2.3.
Dle oddělení Rozdělení pozitivních pacientů dle oddělení
60
1.INT 2.INT
51 50
Plicní klinika KARIM
40
KOR KGM
30
KCH
23
OKH
18
20
10
7
Odd. TRN nem. Jičín Hem. por. PCE
6 3
4 1
0
Chirurgie
2
1
1
1
1
Hemodial. středisko Náchod Neurologie Náchod
1.INT - 1.Interní klinika; 2.INT - 2.Interní klinika; KARIM - Klinika anesteziologie, resuscitace a intenzivní medicíny; KOR - Klinika onkologie a radioterapie; KGM - Klinika gerontologická a metabolická; KCH - Kardiochirurgická klinika; OKH - Oddělení klinické hematologie
Závěr: Nejvíce vzorků pozitivních na PJ bylo do laboratoře zasláno z plicní kliniky FNHK.
29
5.3.
Rozdělení dle vyšetření a pozitivních/negativních pacientů
5.3.1.
Dle počtu vyšetření Mikroskopická vyšetření PJ 294
Počet vyšetření
300 250
297
238 208
200
Počet vyšetření
150
Počet pozitivních vyšetření
100 50
5
4
1
0
0 2008
2009
2010
2011
Rok
Počet vyšetření
Vyšetření PJ metodou PCR 400 350 300 250 200 150 100 50 0
347
351 288
265 Počet vyšetření Počet pozitivních vyšetření
33
2008
43
2009
28 2010
34
2011
Rok
Závěr: Zatímco mikroskopicky bylo pozitivních 10 vyšetření z 1 037. Metodou PCR bylo pozitivních 138 vzorků z 1 251. Všechny hodnoty sečteny za období 1.1.2008 - 31.12.2011.
30
5.3.2.
Dle počtu vyšetřených pacientů Počet pacientů vyšetřených mikroskopicky
Počet pacientů
250
240
250
203
179
Počet vyšetřených pacientů
200 150
Počet pozitivních pacientů
100 50
4
4
1
0
0 2008
2009
2010
2011
Rok
Počet vyšetřených pacientů metodou PCR
Počet pacientů
250
279
281
300
231
223
Počet vyšetřených pacientů
200
Počet pozitivních pacientů
150 100 50
39
30
28
22
0 2008
2009
2010
2011
Rok
Závěr: Mikroskopicky bylo vyšetřeno celkem 872 pacientů a z toho 9 s pozitivním výsledkem. Metodou PCR se vyšetřilo 1 014 pacientů a pozitivní výsledek mělo 119. Veškeré výsledky sečteny za období 1.1.2008 – 31.12.2011.
5.4.
Určení hodnoty cut-off
V této kapitole se pokusím odhadnout hodnotu cut-off, tedy hodnotu koncentrace, při které je PJ moţno odhalit nejenom metodou PCR, ale i barvícími technikami.
31
5.4.1.
Koncentrace DNA u vzorků pozitivních metodou PCR i mikroskopicky Kvantifikace PCR u pacientů mikroskopicky pozitivních
4,00E+07
3,47E+07
Počet kopií DNA/ml
3,50E+07 3,00E+07
2,24E+07
2,50E+07 2,00E+07
1,41E+07
1,50E+07
7,61E+06
1,00E+07
5,00E+06
6,00E+05
1,43E+05
4,00E+02
5,20E+02
1,32E+03
0,00E+00 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Pacienti
Závěr: Jak je podle grafu patrné, hodnoty koncentrací se liší. Dle nejniţší koncentrace by se dala odhadovat hodnota, při které by byl moţný záchyt PJ mikroskopií. V tomto případě se jedná o hodnotu E+02 (10 2).
5.4.2.
Koncentrace DNA u vzorků pozitivních metodou PCR a negativních mikroskopicky Kvantifikace PCR u pacientů mikroskopicky negativních 1,50E+05
1,60E+05
Počet kopií DNA/ml
1,40E+05 1,20E+05 1,00E+05 8,00E+04 6,00E+04
3,30E+04
4,00E+04 2,00E+04
2,70E+04 1,80E+04 2,04E+03 1,00E+02
1,91E+03
1,73E+04 4,46E+03
0,00E+00 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Pacienti
Závěr: Náhodně vybrané koncentrace pacientů s negativními mikroskopickými výsledky. Hodnoty jsou rozptýleny stejně jako v předešlém grafu. Tyto hodnoty ovšem nesplňují výše uvedenou podmínku, ţe pokud bude koncentrace nukleové kyseliny ve vzorku vyšší neţ E+02 (102), bude tento vzorek pozitivní i mikroskopicky. Nelze tedy určit 32
hodnotu cut-off, jelikoţ záchyt PJ mikroskopicky zřejmě není závislý na její koncentraci ve vzorku.
5.5.
Tabulka diagnóz
Kód dg. Popis diagnózy C341 Zhoubný novotvar průdušky - bronchu a plíce, Horní lalok, bronchus nebo plíce C349 Zhoubný novotvar průdušky - průduška a plíce C504
Zhoubný novotvar prsu - horní zevní kvadrant prsu
C64
Zhoubný novotvar ledviny mimo pánvičku
C712
Zhoubný novotvar mozku - spánkový lalok (lobus temporalis)
C829
Ne-Hodginův folikulární (nodulární) lymfom - N-H folikulární lymfom, NS
C833
Ne-Hodginův (difúzní) lymfom - (difúzní), velké (histiocytické) buňky, retikulocelulární sarkom
C835
Ne-Hodginův (difúzní) lymfom - (difúzní), imunoblastický
C839
Ne-Hodginův (difúzní) lymfom - (difúzní) lymfoblastický
C859
Ne-Hodginův lymfom, jiných a neurčených typů - NH lymfom, typ NS, maligní lymfom NS
C911
Lymfoidní leukémie - Chronická lymfocytární leukemie
C920
Myeloidní leukémie - Akutní myeloidní leukémie
D467
MDS - Jiné myelodysplastické syndromy
D591
Získané hemolytické anémie - Jiné autoimunní hemolytické anémie
D598
Získané hemolytické anémie - Jiné získané hemolytické anémie
D611
Jiné aplastické anémie - Aplastická anémie vyvolaná léky
D693
Purpura a jiné krvácivé stavy - Idiopatická trombocytopenická purpura, Evansův syndrom
D696
Purpura a jiné krvácivé stavy - Trombocytopenie, NS
D70
Agranulocytóza
D860
Sarkoidóza - sarcoidosis - Sarkoidóza plic
E240
Cushingův syndrom - Cushingův syndrom závislý na hypofýze
I38
Endokarditis neurčené chlopně
I460
Srdeční zástava - Srdeční zástava s úspěšnou resuscitací
I499
Jiné srdeční arytmie - Srdeční arytmie, NS
I500
Selhání srdce - Městnavé selhání srdce
I501
Selhání srdce - Selhání levé komory
I652
Uzávěr (okluze) a zúţení (stenóza) přívodných mozkových tepen nekončící mozkovým infarktem - Okluze a stenóza krkavice (karotidy)
I714
Výduť aorty - aneurysma aortae - a disekce - Aneurysma břišní aorty, bez zmínky o ruptuře
J029
Kutní zánět hltanu - Akutní zánět hltanu, NS
J159
Bakteriální zánět plic, nezařazený jinde - Bakteriální zánět plic, NS
J180
Pneumonie, původce NS - Bronchopneumonie, NS
J189
Pneumonie, původce NS - Pneumonie, NS
J209
Akutní zánět průdušek - bronchitis acuta - Akutní bronchitida. NS
J40
Zánět průdušek - bronchitis - neurčený jako akutní nebo chronický
J42
Neurčená chronická bronchitida
J441
Jiná chronická obstruktivní plicní nemoc - Chronická obstruktivní plicní nemoc s akutní exacerbací, NS
J448
Jiná chronická obstruktivní plicní nemoc - Jiná určená chronická obstruktivní plicní nemoc
J449
Jiná chronická obstruktivní plicní nemoc - Chronická obstruktivní plicní nemoc, NS
J450
Astma - Astma převáţně alergické
J459
Astma - Astma, NS
J47
Bronchiektazie - rozšíření průdušek
33
J82
Plicní eozinofilie, nezařazená jinde
J841
Jiné intersticiální plicní nemoci - Alveolární a parietoalveolární stavy
J848
Jiné intersticiální plicní nemoci - Jiné určené intersticiální plicní nemoci
J849
Jiné intersticiální plicní nemoci - Intersticiální plicní nemoc, NS
J90
Pohrudniční výpotek, nezařazený jinde
J960
Respirační selhání, nezařazené jinde - Akutní respirační selhání
J989
Jiné poruchy dýchací soustavy - Onemocnění dýchací soustavy
K261
Dvanáctníkový vřed - Akutní s perforací
K558
Vaskulární onemocnění střeva - Jiná vaskulární onemocnění střeva
K570
Divertikulární nemoc střeva - Divertikulární nemoc tenkého střeva s perforací a abscesem
K709
Alkoholické onemocnění jater - Alkoholické onemocnění jater, NS
K720
Selhání jater nezařazené jinde - Akutní nebo subakutní selhání jater
M313
Jiné nekrotizující vaskulopatie - Wegenerova granulomatóza
M318
Jiné nekrotizující vaskulopatie - Jiné určené nekrotizující vaskulopatie
M319
Jiné nekrotizující vaskulopatie - Nekrotizující vaskulopatie, NS
M321
Systémový lupus erytematosus - Systémový lupus erymatosus s postiţením orgánů a systémů
M332
Dermatopolymyositis - Polymyositis
M359
Jiné systémová postiţení pojivové tkáně - Systémová postiţení pojivové tkáně, NS
N033
Chronický nefritický syndrom - Difúzní mesangiální proliferativní glomerulonefritida
N180
Chronické selhání ledvin - Konečné stadium ledvinného onemocnění
N189
Chronické selhání ledvin - Chronické selhání ledvin, NS
R042
Krvácení z dýchacích cest - Hemoptýza
R05
Kašel
R060
Nepravidelné dýchání - Dušnost
R074
Bolest v hrdle a na hrudi - Bolest hrudi, NS
R509
Horečka neznámého původu - Horečka, NS
R570
Šok, nezařazený jinde - Kardiogenní šok
R91
Abnormální nález při diagnostickém zobrazení plic
S720
Zlomenina kosti stehenní - fractura femoris - Zlpmenina krčku kosti stehenní - fractura colli femoris Celková prohlídka a vyšetření osob bez obtíţí nebo uvedené diagnózy - Celkové lékařské vyšetření
Z000 Z940
Pacient s transplantovaným orgánem a tkání - Transplantovaná ledvina
Závěr: Pacienti pozitivní na PJ trpí celou řadou onemocnění. Jsou to většinou pacienti s váţně oslabenou imunitou při léčbě rakoviny, po transplantaci nebo při onemocnění HIV. Nejvíce vyskytující se diagnózy jsou v tabulce označeny tmavě ţlutou barvou.
34
6.
DISKUSE
Hlavním úkolem této práce bylo zhodnocení výsledků vyšetření na přítomnost Pneumocystis jiroveci a porovnání obou diagnostických metod – tedy mikrobiologické vyšetření, spojené s různými druhy barvení, a PCR. Na počátku zpracovávání výsledků pacientů s pneumocystovou pneumonií jsem získala základní přehled nejen o výskytu v různých věkových skupinách, ale i o široké řadě diagnóz pacientů. Hlavní věc, která mne upoutala na výsledcích, byly neshody mezi některými pacienty, u kterých byla prokázána nákaza PJ metodou PCR, ale výsledky z mikrobiologické laboratoře byly negativní. Pacientů diagnostikovaných jako pozitivní metodou PCR bylo dohromady 119/119, ovšem pozitivních mikroskopicky bylo z této skupiny pouze 9/119. Coţ by znamenalo, ţe senzitivita barvících metod by se v tomto výběrovém souboru rovnala pouze 7,6%. Otázkou je, co zapříčinilo takto malý záchyt PJ mikroskopií. Linssen et al.(2006) se domnívá, ţe hlavní překáţkou v neúspěšném stanovení PJ mikroskopií je lidská chyba personálu laboratoře a nezkušenost hodnotících laboratorních pracovníků. Dodává, ţe by měl být kladen větší důraz na proškolení laboratorních pracovníků v mikrobiologických metodách a práci s mikroskopem. Jako moţná budoucí pracovník v laboratoři tomu musím oponovat, jelikoţ si myslím, ţe odbornost českých mikrobiologů i laborantů je na velmi dobré úrovni, a ţe stanovení pozitivity/negativity u vzorku na podloţním sklíčku ovlivňuje řada faktorů nezávislých na laboratoři. Mezi tyto faktory bych zařadila preanalytické chyby v odběru materiálu, coţ je v dnešní době velký problém nejenom v mikrobiologických laboratořích, i přesto, ţe jsou sestry i další nemocniční personál na tyto chyby opakovaně upozorňovány. A právě u takového materiálu jako je bronchoalveolární laváţ je provedení odběru jeden z nejdůleţitějších faktorů pro správné stanovení. Odebírá se několik zkumavek bronchoalveolární tekutiky, u kterých se samozřejmě liší koncentrace patogenu tak, ţe v nejpozději odebrané zkumavce je koncentrace nejniţší. Pokud tedy taková zkumavka přijde do mikrobiologické laboratoře, můţe být stanovení patogenu o něco komplikovanější neţ v koncentrovanějším vzorku.
35
Další ovlivňující faktor při hodnocení preparátu můţe být kvalita nátěru. Zde bych porovnala nátěry z mikrobiologické a histologické laboratoře. Jak jsem se mohla na vlastní oči přesvědčit, je systém přípravy preparátu v histologické laboratoři v dokonalosti o něco dál neţ oddělení mikrobiologie, kde se připravují nátěry klasickým způsobem. Při kterém se nejprve provede zahuštění vzorku pomocí centrifugy a poté se nanese blíţe neurčený objemu sedimentu na sklíčko. V histologické laboratoři je princip podobný, ale podle mne jednodušší a přesnější. Pomocí přístroje cytospin, který funguje na principu odstředivé síly, se připraví koncentrovaný preparát z přesně definovaného mnoţství vzorku. Domnívám se tedy, ţe toto zařízení by usnadnilo práci klinickým mikrobiologům nejenom při přípravě, ale i při hodnocení. Jiným důvodem pro malý záchyt PJ mikroskopií můţe být, ţe se při PCR namnoţí DNA i z mrtvých PJ, které ovšem nejsou v nátěru viditelné. Dalším úkolem bylo porovnání obou metod a zhodnocení výsledků. Myslela jsem, ţe postačí vynést do grafu hodnoty koncentrací PCR u pacientů pozitivních mikroskopicky a odečíst nejniţší koncentraci, při které bylo ještě mikrobiologické vyšetření pozitivní. K mému překvapení se v tomto souboru pacientů koncentrace velice lišily. Nejniţší hodnoty se pohybovaly v řádech 102 a nejvyšší aţ 107. Stejně taky byly rozptýleny i koncentrace u mikrobiologicky negativních pacientů. Stanovit tedy hodnotu cut-off, podle které by se hodnotila moţná úspěšnost při mikroskopickém stanovení bylo téměř nemoţné. Takovou hodnotu se mohu pokusit pouze hrubě odhadovat a porovnat ji s jinými studiemi. Z mého malého výběrového souboru obsahující 9 hodnot koncentrace samozřejmě nemohu určit přesnou hodnotu pro hodnocení výsledků, ale pokud bych ji tedy zkusila alespoň odhadovat, určila bych stejnou hodnotu jako před čtrnácti lety Ribes et al.(1997), a to 102, coţ by ideálně znamenalo, ţe pokud bude ve vzorku koncentrace nukleové kyseliny po proběhnuté PCR vyšší neţ 102, můţe být PJ pozitivně stanovena i mikroskopicky. Podle dostupných zdrojů se stanovená hodnota cut-off liší. Například nejstarší dohledaný zdroj Leigh et al.(1993) uvání hodnotu 104 aţ 106 kopií nukleových kyselin PJ, nejnovější zdroj Flori et al.(2004) hodnotu 104, z praxe mikrobiologů z FNHK je PJ videtelná v mikroskpu při koncentraci 104, ale pouze vyjímečně. Kaţdé měření, ať uţ v hematologické, mikrobiologické nebo molekulárněbiologické laboratoři, je zatíţeno určitou chybou. Torres et al. (2000) to 36
demonstruje na příkladu, kdy byla vyšetřena skupina pacientů s podezřením na PCP. Část byla prokázána jako negativní a část jako pozitivní. Do skupiny pozitivních ale spadali i pacienti bez jakýchkoliv příznaků onemocnění. Při pravidelném pozorování těchto bezpříznakových pacientů se ani po dvanácti měsících nemoc neprojevila. Z celého souboru se jednalo o 13,7% falešně pozitivních pacientů. Proto zde vystupuje otázka, zdali je problém více na straně barvení nebo na straně PCR? Musím se přiklonit k názoru, ţe i přes poměrně vysoké procento falešně pozitivních výsledků, je PCR neomylná při diagnostice nemocných. Senzitivita PCR je 100%, coţ znamená, ţe touto metodou se zachytí 100% pozitivních pacientů z testované populace. Torres et al.(2000) dále uvádí, ţe pokud hodnotíme metodu PCR vzhledem k predikčním hodnotám, bude negativní predikční hodnota 100% (všichni s negativním výsledkem budou zdraví). Pozitivní predikční hodnota je 81,8% (nemocných pacientů mezi pozitivními je 81,8%). Důvodem pro falešně pozitivní výsledky můţe být, stejně jako u barvících metod, chyba při odběru, při transportu, při skladování vzorku, ale i kontaminace samotným laborantem. Proto vţdy musíme brát v úvahu vlivy, které nám mohou výsledek vyšetření zkreslovat, a neřídit se pouze podle hodnot, které nám vydá přístroj.
37
7.
ZÁVĚR
I přesto, ţe se počet pacientů s PCP sniţuje díky včasné profylaxi, je toto onemocnění stále aktuální. V dnešní době jím trpí více nemocní při cytostatické léčbě nebo po transplantaci, neţ HIV pozitivní pacienti, u kterých je zahájena preventivní léčba hned po pozitivní diagnóze. Do nejvíce ohroţené skupiny tedy spadají většinou senioři kolem 60 aţ 70 lety a riziko infekce je pro muţe a ţeny stejné. Diagnózy se u pozitivních pacientů liší, nejvíce jich trpí maligním onemocněním nebo komplikovanou pneumonií. Po zhodnocení všech výsledků vyšlo najevo, ţe při stanovení PJ mikroskopicky zřejmě nezáleţí na její koncentraci v odebraném materiálu. I přesto je ovšem důleţitý správný odběr bronchoalveolární tekutiny, rychlý transport do laboratoře při dobře zvolené teplotě a šetrné zacházení se vzorkem při přípravě preparátu. Zvláštní pozornost tedy musíme věnovat analytickým chybám, které mohou výsledek zkreslit na falešně pozitivní nebo falešně negativní. Všechny tyto vlivy zohledňujeme při vydávání výsledků.
38
8.
SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY
BABULA, PETR. 2009. Archebakterie, bakterie, houby, protista. 1.vydání. Brno : Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2009. str. 144. ISBN 978-80-7305057-3. CANTWELL, ALAN. 1986. AIDS: The mystery and the solution. Los Angeles : Aries Rising Press, 1986. str. 210. ISBN 0-917211-08-1. CETKOVSKÝ, PETR, KOUBA, MICHAL a další. 2009. Diferenciální diagnostika plicních infiltrátů a pokroky v léčbě mykotických infekcí u imunokompromitovaných pacientů. Praha : TRITON, 2009. str. 259. ISBN 97880-7387-343-1. FLORI, PIERRE, BELLETE, BAHRIE a další. 2004. Comparison between realtime PCR, conventional PCR and different staining techniques for diagnosing Pneumocystis jiroveci pneumonia from bronchoalveolar lavage speciments. Journal od Medical Microbiology. 53, 2004, stránky 603-607. GREENWOOD, DAVID, SLACK, RICHARD C. B. a další. 1999. Lékařská mikrobiologie. 1.vydání. Praha : Grada, 1999. str. 686. ISBN 80-7169-365-0. KAŠÁK, VIKTOR, KOBLÍŢEK, VLADIMÍR a další. 2008. Naléhavé stavy v pneumologii. Praha : MAXDORF, 2008. str. 520. ISBN 978-80-7345-158-5. KOOP, MARIA JOHANNA. 1964. Pneumocystis-Pneumonie. Amsterdam : autor neznámý, 1964. str. 159. KOVACS, J.A., GILL, V.J. a další. 2001. New insights into transmission, diagnosis, and drug treatment of Pneumocystis carinii pneumonia. JAMA. 2001, Sv. 286, 19, stránky 2450-2460. KOVACS, JOSEPH, A. a MASUR, H. 2009. Evolving Health Effects of Pneumocystis. JAMA. 2009, Sv. 301, 24, stránky 2578-2584. KULTAN, JURAJ, JAKUBEC, PETR a KOLEK, VÍTĚZSLAV. 2008. Pneumocystová pneumonie u HIV pozitivních osob. Interní medicína pro praxi. 2008, Sv. 10, 11, stránky 531-534. 39
LEIGH, T. R., GAZZARD, B.G., ROWBOTTOM, A. a COLLINS, J. V. 1993. Quantitative and qualitative comparison of DNA amplification by PCR with immunofluorescence staining for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. Journal of Clinical Pathology. 1993, 46, stránky 140-144. LINSSEN, CATHARINA F. M., JACOBS, JAN A., BECKERS, PIETER a další. 2006. Inter-laboratory comparison of three different real-time PCR assays for the detection of Pneumocystis jiroveci in bronchoalveolar lavage fluid samples. Journal of Medical Microbiology. 2006, 55, stránky 1229-1235. PRŮŠA, RICHARD. 1997. Základy analytických metod v klinické molekulární biologii. Praha : 2.LF UK, Lambda bio-med, 1997. str. 45. ISBN 80-238-0940-7. RIBES, J. A., LIMPER, A. H., ESPY, M. J. a SMITH, T. F. 1997. PCR detection of Pneumocystis carinii in bronchoalveolar lavage specimens: analysis od sensitivity and specificity. Journal of Clinical Microbiology. 35, 1997, stránky 830835. ROZSYPAL, HANUŠ. 1998. AIDS klinický obraz a léčba. Praha : MAXDORF, 1998. str. 236. ISBN 80-85800-92-6. SKŘIČKOVÁ, JANA. 2005. Pneumocystová pneumonie. Klinická farmakologie a farmacie. 19, 2005, 2, stránky 106-110. SVOBODA, JAROSLAV. 1996. Imunologie v klinické praxi I - HIV onemocnění a AIDS jako modely postižení imunitního systému. 1.vydání. Praha 2 : Marvil, 1996. str. 435. ISBN X03418 TORRES, JUAN, GOLDMAN, MITCHELL, WHEAT, L. JOSEPH a další. 2000. Diagnosis of Pneumocystis carinii Pneumonia in Human Immunodeficiency Virus - Infected Patients with Polymerase Chain Reaction: A Blinded Comparison to Standart Methods. Clinical Infectious Diseases. 30, 2000, stránky 141-145. VOTAVA, MIROSLAV a další. 2003. Lékařská mikrobiologie speciální. Brno : Neptun, 2003. str. 495. ISBN 80-902896-6-5. VOTAVA, MIROSLAV a další. 2010. Lékařská mikrobiologie vyšetřovací metody. Brno : Neptun, 2010. str. 495. ISBN 978-80-86850-04-8. 40
9.
SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK
AIDS - Acquired Immunodeficiency Syndrome (Syndrom získaného selhání imunity) BAL - Bronchoalveolární laváţ CT
- Computed tomography (Počítačová tomografie)
DNA - Deoxyribonucleic acid (Deoxyribonukleotidová kyselina) FNHK- Fakultní nemocnice Hradec Králové HIV
- Human Immunodeficiency Virus (Virus lidské imunitní nedostatečnosti)
PC
- Pneumocystis carinii
PCP - Pneumocystová pneumonie PCR - Polymerase Chain Reaction (Polymerázová řetězová reakce) PJ
- Pneumocystis jiroveci
rRNA - Ribosomal ribonucleic acid (Ribosomální ribonulkeotidová kyselina) ÚKM - Ústav klinické mikrobiologie
41
