UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biologických a lékařských věd
Diplomová práce Stanovení závislosti detekčních časů lahviček BacT/Alert SA na množství inokulovaných mikroorganismů Hradec Králové Květen 2007
Martina Jašková
Poděkování Ráda bych poděkovala všem, kteří mě v průběhu celého studia podporovali.
Děkuji
vedoucímu
této
diplomové
práce,
MUDr.
Pavlovi
Čermákovi, Csc., za vynikající vedení, cenné rady a informace při jejím vypracování.
2
Seznam zkratek CFU – kolonie tvořící jednotka(y) TTD – detekční čas „time to detection“ SIRS – Systemic Inflammatory Response Syndrome - systémová zánětlivá odpověď MODS – Multiple Organ Dysfunction Syndrome – mnohočetná orgánová dysfunkce SPS – sodium polyanethol sulphonate (polyanetholsulfonát sodný) TNF – tumor nekrotizující faktor CMV – cytomegalovirus LPS – lipopolysacharid LIS – laboratorní informační systém SDS – sodium dodecyl sulfate ( dodecylsulfát sodný )
3
Souhrn V této práci jsme se věnovali problematice sepse a možnostem její diagnostiky pomocí kvantitativního bakteriologického vyšetření s použitím hemokultivačních sytémů BacT/Alert a Bactec. Zaměřili jsme se na kvasinky rodu Candida a testovali jsme pět nejčastěji se vyskytujících druhů. První část práce je věnována teoretickému úvodu do celé problematiky infekcí krevního řečiště a sepse. Je zde rozebrána patogeneze těchto infekcí, jejich původci, klasifikace sepsí, rizikové faktory. Jsou zde zmíněny používané způsoby diagnostiky, klinické i laboratorní. Další část teoretické pasáže je věnována
hemokultivaci
a
automatickým
hemokultivačním
systémům
BacT/Alert a Bactec. V praktické části je popis metody, materiálu a pomůcek. Je zde i podrobný popis pracovního postupu. Výsledková část obsahuje grafy a tabulky závislosti
detekčních
časů
na
množství
inokulovaných
kvasinek
do
hemokultivačních lahviček . Z výsledků vyplývá, že detekční čas se zkracuje se zvyšujícím se množstvím inokulovaných mikroorganismů. Oba systémy poskytují rovnocenné výsledky. Námi sestrojené růstové křivky, by mohli být využitelné v klinické praxi ke
kvantitativnímu
stanovení
fungémie
mikrobiologického nálezu.
4
a
dokonalejší
interpretaci
Obsah 1 2
3
4 5
6 7 8 9
Úvod ...........................................................................................................6 Teoretická část ...........................................................................................7 2.1 Definice pojmů ........................................................................................7 2.1.1 Infekce ...........................................................................................7 2.1.2 Bakteriemie ....................................................................................7 2.1.3 Fungémie .......................................................................................7 2.1.4 SIRS...............................................................................................7 2.1.5 Infekce krevního řečiště .................................................................8 2.1.6 Sepse .............................................................................................8 2.1.7 Vzájemný vztah sepse a SIRS .......................................................9 2.1.8 MODS ............................................................................................9 2.2 Patogeneze sepse ................................................................................ 10 2.3 Klasifikace sepsí ................................................................................... 10 2.4 Patofyziologie sepse............................................................................. 11 2.5 Původci sepse ...................................................................................... 12 2.6 Predisponující faktory sepse ................................................................ 13 2.7 Mortalita ................................................................................................ 15 2.8 Diagnostika sepsí ................................................................................. 15 2.8.1 Klinická diagnostika...................................................................... 15 2.8.2 Laboratorní diagostika.................................................................. 15 2.8.2.1 Hematologické a biochemické vyšetření.............................. 15 2.8.2.2 Mikrobiologické vyšetření .................................................... 16 2.8.2.3 Klasické hemokultivace ....................................................... 16 2.9 Hemokultivační systémy ....................................................................... 17 2.9.1 Manuální hemokultivační systémy ............................................... 17 2.9.2 Automatizované hemokultivační systémy .................................... 18 2.9.2.1 Vital...................................................................................... 20 2.9.2.2 BacT/Alert ............................................................................ 22 2.9.2.3 BacT/Alert 3D ...................................................................... 26 2.9.2.4 Bactec.................................................................................. 27 Materiál a pomůcky................................................................................... 32 3.1 Použité kvasinkové kmeny ................................................................... 32 3.2 Zpracování vzorků ................................................................................ 32 Metody ...................................................................................................... 33 Výsledky ................................................................................................... 34 5.1 Detekční časy kvasinek ........................................................................ 34 5.2 Naměřené hodnoty ............................................................................... 35 Diskuse ..................................................................................................... 48 Závěr ........................................................................................................ 50 Summary .................................................................................................. 51 Literatura .................................................................................................. 52
5
1
Úvod Sepse je stav spojený s infekcí a s následnou celkovou odpovědí
organismu na často náhlý vstup infekční noxy. V nepříznivém případě vrcholí sepse orgánovým selháním. Snahou organismu je eliminovat infekční agens mechanismy vycházejícími z buněk imunitního systému, z humorální odpovědi a z cévní reakce. Celý proces od vstupu mikroba do tkáně až po jeho eliminaci představuje
velmi
složité
a
doposud
ne
zcela
prozkoumané
vztahy
mezijednotlivými buněčnými elementy imunitního a cévního systému. V klinickém názvosloví je nutno rozlišovat sepsi od stavů, kde je lokalizovaná infekce provázena přechodnou bakteriémií. Výrazu sepse se často nesprávně užívá pro různé chorobné stavy, které ve skutečnosti sepsí nejsou, mají však podobnou teplotní křivku. Sepse jsou dnes významnou příčinou narůstající morbidity a mortality. Při podezření na septický stav se provádí bakteriologické vyšetření krve – hemokultivace. Cílem této práce bylo charakterizovat vztah mezi množstvím infekční noxy a časem detekce u kvasinek nejčastěji definovaných jako původci sepse a stanovit jejich růstové křivky.
6
Teoretická část
2
Definice pojmů
2.1 2.1.1
Infekce
Zánětlivá odpověď na přítomnost mikroorganismů a/nebo invaze mikroorganismů do normálně sterilních tkání. 2.1.2
Bakteriemie
Tento termín vyjadřuje pouze fakt přítomnosti bakterií v krvi, která může či nemusí být příčinou rozvoje infekce krevního řečiště. •
nízká – 10 až 20 bakterií v 1 ml krve
•
střední – 50 bakterií v 1 ml krve
•
vysoká – 80 a více bakterií v 1 ml krve
Vysoká bakteriemie je typická pro malé děti. Může dosahovat řádově až stovek bakterií na 1 ml krve. Naopak i u zcela zdravých jedinců se v krvi vyskytují bakterie, které pronikají do krevního oběhu z míst, která jsou fyziologicky osídlena bakteriální flórou (např. tlusté střevo). Dalším zdrojem jsou drobné zákroky v oblastech, které jsou osídleny běžnou flórou nebo oblasti ve kterých je rozvinut lokální bakteriální zánět (např. extrakce zubu, ložisko bronchopneumonie, furunkl a pod.). Tyto bakterie jsou průběžně fagocytovány, aniž by se podílely na rozvoji celkového patologického procesu. 2.1.3
Fungémie
Fungémie je přítomnost kvasinek v krvi. Nejčastěji se vyskytuje u imunosuprimovaných, onkologických pacientů nebo u pacientů se zavedeným intravenózním katétrem. 2.1.4
SIRS
Systemic inflammatory response syndrome – systémová zánětlivá odpověď, označující rozvoj systémových známek zánětu za univerzální reakci organismu na řadu inzultů infekční i neinfekční povahy. Pro definici SIRS byla stanovena jako nutná přítomnost minimálně dvou z následujících proměnných: •
abnormální tělesná teplota > 38 °C nebo < 36 °C
•
abnormální srdeční frekvence > 90/min 7
•
abnormální dechová frekvence > 20/ min
•
abnormální počet bílých krvinek ( větší než 12000 nebo naopak menší než 4000)
2.1.5
Infekce krevního řečiště
Stav, kdy je průnik mikroorganismů do krevního řečiště provázen celkovými známkami infekčního procesu. V praxi se tento pojem často zaměňuje s pojmem sepse. 2.1.6
Sepse
Sepse je podmnožinou infekcí krevního řečiště a představuje závažnější stav vedoucí ke spuštění kaskády patologických dějů, které bez terapeutického zásahu závažným způsobem ohrožují život pacienta. Vztah vyjadřuje následující obrázek.
patologický stav
zdraví
infekce krevního řečiště
bakteriemie
sepse
Obrázek 1. Vztah bakteriemie, infekce krevního řečiště a sepse.
Definice sepse je stále otevřenou záležitostí, na niž existují různé názory. Nejčastěji je definována jako SIRS s prokázanou infekcí [4].
8
2.1.7
Vzájemný vztah sepse a SIRS
Sepse je podskupinou SIRS, její etiologie je infekční. Mají společnou patofyziologii: jedná se o systémovou zánětlivou odpověď na inzult – excesivní aktivace obranných mechanizmů (syndrom mediátorováho excesu). SIRS je ve vztahu k sepsi vysoce senzitivní (100%) ale velmi málo specifický (obrázek 2.). Pan kre INFEKCE
SEPS TĚŽKÁ SEPSE
Tra um SIRS Pop álen Jiné
Obrázek 2. Vztah infekce, sepse, SIRS a jejích vyvolávajících příčin.
Primární sepse – není známé ložisko infekce. Sekundární sepse – šíření bakterií do krevního řečiště ze známého ložiska infekce. 2.1.8
MODS
Multiple Organ Dysfunction Syndrome je stav, kdy je přítomná alterace dvou a více orgánových systémů , která nevyhnutelně vyžaduje terapeutickou intervenci na udržení homeostázy organismu. Primární MODS – je vyvolán neinfekčním inzultem (trauma, popálení, pankreatitis a jiné příčiny). Sekundární MODS – je vyvolán těžkou sepsí provázenou septickým šokem s hypoperfusí orgánů.
9
2.2
Patogeneze sepse Sepse a zejména její těžká forma je významným celospolečenským
problémem. Na rozdíl od jiných nemocí je spojena jak se stoupající incidencí, tak i se vzestupem počtu úmrtí. Výskyt onemocnění se ročně zvyšuje přibližně o 1,5 % - 8% v souvislosti s nárůstem počtu predisponovaných osob. Udává se, že progrese do stadia těžké sepse je na jednotce intenzivní péče zaznamenána u každého čtvrtého pacienta se sepsí. Počet úmrtí se za posledních 20 let zdvojnásobil a v současnosti přesahuje počet úmrtí spojený s akutním infarktem myokardu, či některými nádorovými chorobami. Dnešní letalita je v průměru 30% a riziko úmrtí stoupá přibližně o 20% na každý selhaný orgán. Primárním místem infekce jsou nejčastěji plíce (40%), sledované nitrobřišní infekci (20%), bakteriémií v souvislosti s nitrožilními katétry (15%) a infekcí močových cest (10%) . V současnosti se etiologicky na vzniku onemocnění srovnatelnou měrou podílejí především gramnegativní i grampozitivní bakterie. Přibližně v jedné třetině případů není infekční agens identifikováno. Jedním z možných vysvětlení je předchozí antibiotická léčba a v tomto případě je odpověď organismu vyvolaná uvolněnými produkty z usmrcených bakteriálních těl [1].
2.3
Klasifikace sepsí První snahy o klasifikaci sepsí se objevovaly již ve dvacátých a třicátých
letech. V roce 1979 a 1980 publikovali F.B.Cerra a J.H . Siegel několik prací, v nichž třídily sepse do stádií A až D dle závažnosti [2]. Jejich dělení vycházelo z měření oběhových, ventilačních a metabolických parametrů. V praxi se ovšem toto třídění neujalo vzhledem k značné náročnosti [3]. Až v roce 1992 byla podle závěrů konsenzuální konference American College of Chest Physicians / Society of Critical Care Medicine ustanovena klasifikační stupnice rozlišující 3 stádia : 1) SEPSE (systémová zánětlivá reakce vyvolaná infekcí) 2) TĚŽKÁ SEPSE (sepse spojená s orgánovou dysfunkcí, hypoperfuzí nebo hypotenzí, hypoperfuze a perfuzní abnormality se mohou manifestovat laktátovou acidózou, oligourií, alterací mentálního stavu , hypoxií) 3) SEPTICKÝ ŠOK (těžká sepse spojená s hypotenzí, která je definována 10
jako systolický tlak nižší než 90 torr pod obvyklou úroveň, přes adekvátní náhrady tekutin, není-li přítomna jiná příčina hypotenze) Tato stádia se liší různým stupněm vědomí, hypotenze a hypoperze orgánů [3, 4]. Sepse, tzv. těžká sepse a septický šok jsou vnímány jako kontinuální proces, na jehož začátku stojí infekční příčina a který může vyústit až do stádia septického šoku (charakterizovaného hypotenzí nereagující na podávání tekutin a známkami orgánové hypoperfuze).[5]
2.4
Patofyziologie sepse Jednotlivé druhy mikroorganismů mají různou schopnost vyvolání
sepse.
Gramnegativní
bakterie
jsou
působením
endotoxinu
účinějším
spouštěcím mechanismem než grampozitivní bakterie [4]. V etiologii sepse se může uplatnit jakýkoliv mikroorganismus. Invaze do krevního řečiště není pro rozvoj sepse nezbytná. Důležitá role se přičítá lokálnímu nebo systémovému rozsevu signalizačních molekul. V této souvislosti byla věnována velká pozornost endotoxinu gramnegativních bakterií [6]. Jedná se o lipopolysacharid (LPS), který je schopen vazby na receptor CD 14 –solubilní nebo vázaný na buněčném povrchu především monocytů. CD 14 receptor je schopen po vazbě na LPS na povrchu monocytů způsobit jejich aktivaci a následně zvyšovat produkci a uvolňování prozánětlivých cytokinů, čímž je zesilována zánětlivá odpověd organismu [7,8,9]. Tento mechanismus odpovídá předpokladu , že k progresi sepse není potřeba trvalá přítomnost mikroorganismů, byl-li počáteční inzult dostatečně silný. Fatální komplikace sepse se tedy mohou objevit i v době, kdy díky činnosti imunitních mechanismů nebo účinné antibiotické terapii jsou všechny tělesné tekutiny septických nemocných již sterilní. V současné době se rozvoj příznaků sepse přičítá především vlastním obranným mechanismům nemocného a úloha mikroorganismů ustupuje do pozadí. Imunitní systém a jeho mechanismy se ve snaze po objevení nových terapeutických možností staly základním směrem výzkumu sepse [10].
11
Mortalita infekcí krevního řečiště je stále velmi vysoká. Vysoké hodnoty mortality jsou zaznamenány u infekcí, které vyvolaly enterobakterie (24%) [11]. Nejvyšší mortalita 50% je uváděna u infekcí způsobených kmeny Pseudomonas aeruginosa [12].
Původci sepse
2.5
Spektrum
původců
sepse
je
velmi
široké
a
historicky
proměnlivé.Příznaky mohou být vyvolány nejen živými,ale i mrtvými bakteriemi nebo jen jejich částmi (endotoxin, peptidoglykan). Kromě bakterií se mohou v etiologii uplatňovat i další mikroorganismy: plísně, viry (CMV) a prvoci (E.histolytica). Jak
již
bylo
řečeno,grampozitivní
bakterie
vzhledem
k obsahu
endotoxinu představují účinější spouštěcí podnět pro rozvoj sepse než bakterie grampozitivní. Podobně G+ i G- bakterie vykazují větší spouštěcí potenciál než cytomegalovirus [3]. Z G- bakterií nejčastěji vyvolává sepsi Escherichia coli, která infikuje močové cesty a horní cesty dýchací [13,14]. Dále Klebsiella pneumonie, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter sp. a Acinetobacter sp. [15]. Z G+ bakterií mají významnou roli viridující streptokoky. Závažným problémem se staly streptokoky skupiny D , a to zejména enterokoky, které jsou často izolovány z hemokultur [16]. Koaguláza – negativní stafylokoky mají stále větší význam jako původci různých infekcí zvláště u pacientů po rozsáhlých léčebných výkonech a se sníženou imunitní odpověďí.Dnes způsobují více jak jednu třetinu všech infekcí krevního řečiště [17,18, 19, 20, 21]. Bývají uváděni jako původci pooperačních infekcí (často totiž adherují na plastový implantát) [13,22]. Jsou častými patogeny na novorozeneckých odděleních a u hematologických pacientů [23]. Anaerobní bakterie, zvláště G – nesporulující tyčky se často vyskytují současně s aeroby. Samy jsou součástí normální mikroflóry. Pro anaerobní sepse je charakteristický rychlý a těžký průběh [24]. Při lokálním poškození epitelu a imunodeficienci , se mohou v etiologii sepse uplatňovat také různé druhy hub, zvláště kvasinky, které se vyskytují na povrchu kůže a sliznic. Nejčastějšímí vyvolavateli v Evropě jsou příslušníci rodu 12
Candida, Aspergillus a Geotrichon.Candida spp. je v současné době čtvrtý nejčastěji izolovaný patogen z krve hospitalizovaných pacientů v USA. Z nosokomiálních infekcí má kandidémie nejvyšší mortalitu ( 40%)
2.6
Predisponující faktory sepse Nejvíce sepsí má nozokomiální původ. Lokalizované infekce postupně
vedou k rozvoji sepse a ohrožení života pacientů zvláště na jednotkách intenzivní péče, ARO, s řízeným dýcháním, po úrazech či operaci mozku, transplantacích atd. Jedná se nejvíce o nozokomiální infekce respiračního traktu (převážně pneumonie), infekce močových cest, infekce místa operačního výkonu a infekce krevního řečiště [18, 26]. Infekce krevního řečiště patří k nejzávažnějším bakteriálním infekcím, především u pacientů hospitalizovaných na jednotkách intenzivní péče, a to z důvodu možného vzniku septického stavu končícího až v septickém šoku. Tyto infekce tvoří podle výsledků EPIC (European Prevalence of Infection in Intensive Care) 12% všech nozokomiálních infekcí [26]. Mezi nejčastější vnitřní rizikové faktory, které podmiňují vznik nozokomiálních nákaz patří věk, malignita, ischemická choroba srdeční a cévní poškození mozku [27, 28, 29]. Ve výčtu zdrojů nelze opomenout ani lokální kožní infekce – dekubity [30]. Časté septické komplikace bývají i u popálenin.
13
Nebezpečí vzniku sepse zvyšují vnější zásahy jako imunosuprese vyvolaná antibiotiky a chemoterapií, infúze, centrální venózní katetry a močové periferní katetry [27, 28].
Základní onemocnění
Defekty obranyschopnosti
Iatrogenní faktory
Předčasný porod
Kožní léze
Katetry
Polytraumata
Slizniční defekty
ATB>než 3 dny
Spáleniny
Bakteriální flóra
Kortikoidy
i.v.drogy
Redukce defektů:
Chemoterapie
Alkoholismus
-humorálních
Imunosuprese
Selhání ledvin
-granulocytů
Operace
(peritoneální
-T-buněk
Umělé klouby
dialýza)
-pomahačů
Protézy cév
Diabetes mellitus
-makrofágů
Transplantace
HIV-infekce
Parenterální
Kolagenózy
výživa
Rakovina
Resuscitace
Pancreatitis Neutropenie Tabulka 1: Rizikové faktory sepse
14
2.7
Mortalita Zejména u kriticky nemocných pacientů představuje sepse běžnou a
důležitou příčinu umrtí. Podle Shafazand et al. představuje celková výše mortality hladinu 31,5% [31]. Vysoké hodnoty mortality byly zaznamenány u kmenů Klebsiella spp. ( 32 %) ,Escherichia coli ( 22 %) a Enterobacter spp. (21 %). Pedersen ve své studii uvádí průměrnou hodnotu mortality 24% u infekcí krevního řečiště způsobených enterobakteriemi [11]. Kusamaka et al. zaznamenali nejvyšší mortalitu vyvolanou gramnegativními bakteriemi ukmenu Pseudomonas aeruginosa ( 50%) [12]. Výběr režimu antibiotické léčby může mít pozitivní vliv na přežití pacienta. Leibovici et al. uvádějí mortalitu pacientů v případě nesprávně zvolené antibiotické léčby 34% v porovnání s 20% u pacientů s adekvátní ATB terapií [32]. Podobně Behrendt et al. uvádějí 16% mortalitu oproti 28% u pacientů s neadekvátní antibiotickou léčbou [33].
2.8
Diagnostika sepsí
2.8.1
Klinická diagnostika
Mezi typické příznaky sepse patří: hypertermie ( >38° C ) nebo hypotermie ( < 35,6°C ), třesavka, zchvácenost, nechutenství, nevolnost, zvracení, průjem, tachykardie ( > 90/ min ) , tachypnoe ( >20dechů/min), splenomegalie,
kožní
(
slizniční)
projevy,
změna
psychiky
(obluzení,
agitovanost), poruchy vědomí až septický šok. Klinický i laboratorní obraz sepse mohou velmi zdařile napodobovat autoimunitní choroby, maligní choroby, granulomatózní choroby či léková horečka. Klinická diagnostika sepse je obtížná a málo spolehlivá. Hlavní význam je proto přikládán diagnostice laboratorní. 2.8.2
Laboratorní diagostika
2.8.2.1
Hematologické a biochemické vyšetření
Obvykle je pozorována leukocytóza s masivním posunem doleva (>12000/mm), často se vyskytují nezralé formy a toxické granulace neutrofilních leukocytů. Dále dochází k poklesu trombocytů, poklesu Fe v séru, k anémii, vzestupu zánětlivých parametrů (sedimentace, C-reaktivní protein, interleukiny), hypalbuminémii, hyponatrémii i hypofosfatémii [3, 24, 31]. 15
Mikrobiologické vyšetření
2.8.2.2
Základem racionální terapie je izolace a identifikace specifického vyvolavatele bakteriémie. Pozitivní výsledek jednoznačně potvrzuje klinickou diagnózu a tím umožní kauzální léčbu. Proto bylo vyvinuto velké množství metod založených na opakovaném odběru krve pacienta a následné kultivaci. Úspěšnost postupu je dána několika hlavními faktory: 1) odebraná krev musí obsahovat bakterie – přítomnost bakterií v krvi závisí na způsobu odběru, množství odebrané krve, počtu a době odběrů. 2) tyto bakterie je nutno prokázat, měly by proto být živé, schopné pomnožení – je tedy nutné: a) odstranit přirozenou baktericidii séra b) zamezit srážení krve (použitím antikoagulancia) c) inaktivovat
antibiotika
z krve
(nejčastěji
se
používá
penicilináza) d) vytvořit vhodné podmínky pro rekonvalescenci a pomnožení mikrobů (vhodné kultivační prostředí) e) vyloučit kontaminaci Ke kontaminaci může dojít jak při vlastním odběru, tak při zpracování v laboratoři [24, 32]. 2.8.2.3
Klasické hemokultivace
Hemokultivace patří k důležitým mikrobiologickým vyšetřením.Provádí se většinou u pacientů s těžkými infekcemi, horečkami neznámého původu, u případů, kde těžko můžeme získat materiál např. Chirurgicky ošetřených abscesů, pneumonií, intravaskulárních infekcí atd. Krev na hemokultivace se zásadně odebírá opakovaně a to venepunkcí, nikoli z kanyly (kromě vyšetření kanyly samé). Nejvhodnějším způsobem odběru krve na vyšetření je odběr pomocí uzavřené odběrové soupravy, kterou převádíme krev přímo do kultivační nádobky. Možnost mikrobního znečištění je tak minimální. Z desinfikovaného místa kůže se provede kožní stěr tamponem a zašle se s vyšetření.
16
hemokulturou ke kontrolnímu
Jednotlivé způsoby hemokultivace se vyvíjeli již od třicátých let. Dobrá kultivační nádobka musí mít kromě vysoké záchytnosti také schopnost do jisté míry neutralizovat vliv antibiotik, komplementu a umožňovat pohodlnou indikaci růstu případných bakterií či mykoorganismů. Do nedávných dob byly používanou technologií Patočkova nádobka, hemotesty, později velkoobjemové nádobky s přídavkem aktivního uhlí. Indikace růstu byla prováděna orientacně dle zákalu, eventuelně změny objemu plynů. Tento postup byl od osmdesátých let nahrazen automatickými hemokultivačními
systémy
s
indikací
oxidu
uhličitého
vznikajícího
při
bakteriálním růstu. V závislosti se zvyšující se morbiditou a mortalitou asociovaných se sepsí, vzrůstají nároky na klinické mikrobiologické laboratoře. Vybrat optimální hemokultivační systém je důležitý a často složitý úkol. V poslední době bylo prezentováno mnoho vylepšení pro redukci času detekce patogenů z krve, např. užití kapalných médií zvyšuje schopnost laboratoří poskytovat rychlé výsledky. V následujícím textu budou detailně popsány dva automatické, neinvazivní hemokultivační systémy, BacT/Alert (Organon Teknika, Corp. Durham, N.C., USA) a BACTEC 9240 (Becton Dickinson, Sparks, MD, USA). Hlavními výhodami obou systémů je plná automatizace, rychlá detekce krevních patogenů a značná úspora práce.
Hemokultivační systémy
2.9 2.9.1
Manuální hemokultivační systémy
Manuální hemokultivační systémy lze rozdělit do tří následujících skupin: 1) Klasické manuální hemokultivační systémy (Dulab, Signal) 2) Bifázické manuální hemokultivační systémy (Hémoline, Septi – Chek) 3) Centrifugační manuální hemokultivační systémy (Izolátor) Od poloviny osmdesátých let jsou k diagnostice sepsí stále více využívány automatizované hemokultivační systémy, klasické hemokultivační metody proto ustupují do pozadí.
17
2.9.2
Automatizované hemokultivační systémy
Zachycení patogenního agens a stanovení jeho citlivosti na antibiotika je předpokladem úspěšné terapie. Dnešní doba klade stále větší požadavky na zrychlení a inovaci metod detekce, izolace a identifikace mikroorganismů. V tomto směru nachází uplatnění především automatizované hemokultivační systémy. Tyto systémy uvádí u každé pozitivní hemokultury hodnotu TTD (time to detection). TTD lze definovat jako dobu (v hodinách) od vložení nádobky do přístroje do vyhodnocení pozitivity. Pokud nedojde do sedmi dnů k ohlášení pozitivity, je hemokultura považována za negativní. TTD závisí na druhu mikroorganismu a na jeho množství v odebrané krvi. Odpovídá tomu i nejrychlejší detekce u nádobek inokulovaných nejvyšší koncentrací mikroorganismů. Průměrné hodnoty TTD nejčastěji zachycovaných mikroorganismů uvádí tabulka 2. Je zřejmé, že hodnota TTD nemůže být použita k odhadu etiologického agens. Lze však říci, že nejrychleji rostou enterobakterie (E. coli, rody Klebsiella, následované
Enterobacter,
Providentia,
nefermentujícími
tyčkami
Citrobacter,
Salmonella),
(Pseudomonas
aeruginosa,
těsně rod
Acinetobacter). TTD okolo 20 hodin mají grampozitivní koky. Anaerobní bakterie rostou podstatně pomaleji a potřebují minimálně tři dny kultivace. Tyto výsledky vychází z řady studií [34,35, 36, 37].
18
Enterobakterie
Neferm. tyčky
Mikrob
čas (hod)
Klebsiella sp.
9,5
Enterobacter sp. Escherichia coli
12,3
Providencia sp.
16,5
Citrobacter sp.
18,3
Salmonella sp.
26,8
Pseudomonas
17,7
Acinetobacter sp.
18,7
Stenotrophomonas
22,5
maltophilia Burkholderia cepacia
40
Streptococcus sp.
20,2
Enterococcus sp.
23,1
Staphylococcus sp.
23,7
Peptostreptococcus sp.
58,1
Bacteroides sp.
98,8
Propionibacterium sp.
147,2
G+ tyčky
Corynebacterium sp.
55,9
kvasinky
Candida sp.
27,3
Koky
Anaeroby
Tabulka 2: Průměrné TTD nejčastěji zachycovaných mikroorganismů
19
počet
10000
1000
100
10
kvasinky G+ tyčkyi
7
anaeroby
1
10
G+ koky
20
t (hodiny)
G- nefermentující tyčky
30
Enterobakterie
50 150
100
Graf 1: Průměrné TTD nejčastěji zachycovaných mikroorganismů 2.9.2.1
Vital
Jedná se o první automatický přístroj pro hemokultury pracující na principu H.F,T. (Homogeneous Fluorescence Technology). Je prezentován firmou bioMérieux. PRINCIP: - Všechny mikroorganismy produkují při svém růstu oxid uhličitý. Tím způsobují změnu pH a redox potenciálu. Tyto změny nastávají bez ohledu na druh metabolického procesu. Přirozeně fluoreskující molekuly prezentované výzkumným týmem firmy bioMérieux vykazují při výše uvedených biologických jevech pokles fluorescence. Tyto molekuly jsou součástí kultivačního média a detekují přítomnost mikroorganismů. Mikroorganismy produkující jen malé množství oxidu uhličitého (brucela, acinetobacter), jsou rychle a přesně detekovány spolu se změnou pH a redox potenciálu. Vital automaticky registruje fluorescenci v každé kultivační nádobce 24 hodin denně po 15 minutových intervalech. Čtecí systém využívá k přenosu emitované fluorescence optická vlákna. 20
Detekce je stanovena trojím algoritmem: 1) algoritmus SLOPE detekuje nádobky vložené do analyzátoru krátce po odebrání
vzorku
nebo
nádobky
obsahující
pomalu
rostoucí
mikroorganismy. 2) algoritmus DELTA měří pokles fluorescence a detekuje mikroorganismy v exponenciální fázi růstu. 3) algoritmus TRESHOLD detekuje předinkubované nádobky, které byly pozitivní ještě před zpracováním. KAPACITA: - Centrální procesní jednotka je schopna ovládat jeden až tři analytické moduly. Každý modul může obsahovat dvě až čtyři autonomní jednotky (zásuvky) obsazené nejvíce stem nádobek. Systém je tedy možno sestavit podle potřeby laboratoře na obsah 200 – 1200 nádobek. HEMOKULTIVAČNÍ NÁDOBKY: - Kultivační nádobky obsahují účinné širokospektré médium na bázi sojového kaseinového hydrolyzátu (40ml). V médiu jsou obsaženy také inhibitory činnosti antibiotik a působků krve (0,025% SPS). Existují ve dvojím provedení: - Vital aer pro aerobní kultury a Vital ana pro anaerobní kultury. Obě média mají vyhovovat různorodým typům vzorků (dospělí, děti, pacienti léčení antibiotiky). Nádobky obsahují specifickou atmosféru: Vital aer směs kyslíku a oxidu uhličitého, Vital ana směs oxidu uhličitého a dusíku. Injikuje se 10ml krve. K růstu a detekci mikroorganismů přispívá souvislé protřepávání nádobek. Po vložení nádobky do analyzátoru, je readerem přečten bar – cod a určena poloha. Detekce pozitivních nádobek je signalizována různými způsoby. Jednak světelným indikátorem pozitivity umístěným na čele zásuvky, dále světelným signálem uvnitř zásuvky. Možností je i zvuková signalizace [38]. V současné době již firma bioMérieux ukončila výrobu a distribuci tohoto hemokultivačního systému. Přešla výhradně na distribuci systému BacT/Alert .
21
2.9.2.2
BacT/Alert
Hemokultivační systém BacT/Alert (Organon Teknika Corp., Durham, N.C., USA) byl představen v roce 1990. Různé studie prokazují, že BacT/Alert je plně srovnatelný s jinými hemokultivačními systémy, co se týká rychlosti detekce a výtěžku [39,40].
Jedná se o plně automatický hemokultivační systém zahrnující vlastní přístroj ovládaný počítačem a kultivační nádobky. Umožňuje současně inkubaci, protřepávání a kontinuální monitorování vzorků pacientů.Systém poskytuje kvalitativní vyšetření a záchyt aerobních a anaerobních mikroorganismů (bakterií a hub) z krve všude tam, kde je předpoklad velkého zředění a obtížného záchytu. PRINCIP: - Po vložení nádobky do detekční jednotky systému je k senzoru exponován svazek červeného světla pomocí diody vysílající tenký paprsek (LED = light – emitting diode). -
Odražené světlo je kontinuálně soustředěno k fotodiodě vestavěné v každé cele a transferováno na signál, který je před odesláním zesílen. 22
Za
-
přítomnosti
metabolizován
a
následném
substrát
produkovaného
množení
kultivačního
rostoucími
mikroby
mikroorganismů
média. je
Přítomnost
monitorována
je
CO 2
pomocí
kolorimetrického senzoru přítomného v každé kultivační lahvičce. Výsledkem je změna barvy indikátoru (z tmavě zelené na žlutou). Tento proces je kontinuálně a neinvazivně monitorován v každé cele. Přístrojem je detekována i nepatrná změna barvy senzoru. Komplex algoritmů využívá tři principy detekce: 1) První
princip
rozlišuje
akceleraci
CO 2
produkovaného
mikroorganismy. 2) Druhá metoda hodnotí vysoký stupeň změny produkce CO 2 v závislosti na čase. 3) Třetí princip detekuje počáteční úroveň hladiny CO 2 . Pozitivita či negativita vzorků je určována pomocí rozhodovacího programu. Jednotlivé vzorky jsou automaticky monitorovány a vyhodnocovány každých
10
minut.
Výsledky
jsou
písemně,
zvukově
a
světelně
signalizovány.Ovládací systém shromažduje a analyzuje data přijatá z počítače a zpracovává je v informačních databázích. Pro každou nádobku je vyhodnocen tvar růstové křivky tvorby CO 2 v čase. Inkubace probíhá při 35 – 370 C. Každý vzorek je identifikován čárovým kodem umístěným na firemním štítku nádobek. Neinvazivní technologie účinně eliminuje případnou sekundární kontaminaci vzorku. KAPACITA: - Databázová jednotka je schopna monitorovat více skříní. Jeden přístroj může být obsazen 120 (respektive 240) lahvičkami. Celkem lze systémem detekovat až 1440 nádobek. SOFTWARE SYSTÉMU: - Software systému BacT/Alert vytváří dvousměrnou spojku mezi laboratorním informačním systémem (LIS) a vlastním hemokultivačním systémem. Pacientova data jsou tak automaticky získávána a
23
výsledky mohou být rychle odeslány ze systému BacT/Alert do LIS. Tím je umožněna centralizace výsledků. Těchto několik kroků umožňuje zefektivnit technologii, což vede ke zmenšení pravděpodobnosti vzniku chyby. HEMOKULTIVAČNÍ NÁDOBKY: Je třeba si uvědomit, že rychlost záchytu mikroorganismů závisí do značné míry i na složení kultivačních médií obsažených v nádobkách.
K dispozici jsou následující typy:
Nádobky BacT/ALERT SA (Standard Aerobic) Nádobky obsahují pankreaticko natrávený kasein, papainem natrávený sojový substrát, SPS, pyridoxin chlorid a další komplexní substrát obsahující aminokyseliny a cukry v purifikované vodě (celkový objem 40ml). Nádobky jsou připraveny pod vakuem v atmosféře CO 2 a vzduchu. Injikuje se 5 – 10ml krve. Používají se k získání a detekci aerobních mikroorganismů ve vzorcích krve a jiných tělních tekutin, odebraných pacientům podezřelých z bakteriémie či fungémie. Nádobky BacT/ALERT SN (Standard Anaerobic) Tyto nádobky obsahují pankreaticko natrávený kasein, papainem natrávený sojový substrát, SPS, menadion, hemin, redukující činidla a další komplexní substrát obsahující aminokyseliny a cukry v purifikované vodě (celkový objem 40ml). Nádobky jsou připraveny pod vakuem v atmosféře CO 2 a dusíku. Po inokulaci 5 – 10ml krve se nádobky nesmějí odvzdušnovat. Používají se k získání a detekci anaerobních mikroorganismů ve vzorcích krve 24
a jiných tělních tekutin, odebraných pacientům podezřelých z bakteriémie či fungémie. Nádobky BacT/ALERT FA (FAN Aerobic) Nádobky obsahují 30ml média o složení: aktivní uhlí, sojový extrakt natrávený trypsinem, mozko-srdcovou infuzi, SPS, pyridoxin chlorid, menadion, hemin, L-cystein a další komplex aminokyselin a karbohydrátových substrátů v purifikované vodě. Nádobky jsou připraveny pod vakuem v atmosféře kyslíku. Používají se k získání a detekci aerobních mikroorganismů ve vzorcích krve a jiných tělních tekutin, odebraných pacientům podezřelých z bakteriémie či fungémie. Tyto nádobky se jeví jako citlivější než nádobky typu BacT/ALERT SA (39, 47, 48). Nádobky tohoto typu jsou ve srovnání s dříve vyráběnými nádobkami označovanými typu FAN kvalitnější v záchytu Burkholderia cepacia a kvasinek, zejména Candida albicans a Cryptococcus neoformans. Pro ostatní klinicky významné mikroorganismy jsou srovnatelné. Nádobky BacT/ALERT FN (FAN Anaerobic) Obsahují 40ml kultivačního média o stejném složení jako nádobky typu BacT/ALERT FA. Nádobky jsou připraveny pod vakuem v atmosféře dusíku. Používají se k získání a detekci anaerobních mikroorganismů ve vzorcích krve a jiných tělních tekutin, odebraných pacientům podezřelých ze septikémie. Nádobky BacT/ALERT PF (Pediatric FAN) Médium obsahuje 20ml mozko-srdcové infuze s heminem, menadionem a pyridoxinem. Jako antikoagulans je použit 0,02% SPS. Atmosféru tvoří směs CO 2 s dusíkem. Dle doporučení výrobce se odebírá minimálně 0,5ml krve, maximálně však 4ml krve. Malý objem je ideální pro použití v pediatrii nebo pro pacienty v těžkém stavu. Nádobky BacT/ALERT MP (Mycobacteria Process) Nádobky obsahují 10ml suplementovaného bujónu. Používají se k získání a detekci mykobakterií ze sterilních tělních tekutin (vyjma krve). Jsou navrženy pro objem vzorku 0,5ml. Při jejich použití je nutné mít k dispozici také nádobky typu BacT/ALERT MAS. Nádobky BacT/ALERT MAS (Mycobacterial Antibiotic Supplement) Jedná se o médium o následujícím složení: kyselina olejová, glycerol,
25
hovězí sérový albumin, amaranth a voda. Důležitou součástí jsou lyofilizovaná antibiotika, konkrétně amphotericin B, azlocillin, polymyxin B, trimethoprim, kyselina nalidoxová a vankomycin. Nádobky tohoto typu se používají tak, že 0,5ml jejich kultivačního média přidáme do každé nádobky BacT/ALERT MP. Nádobky BacT/ALERT MB (Mycobacteria Blood) Nádobky obsahují 29ml tekuté půdy obohacené o SPS a glycerol. Používají se k detekci a získání mykobakterií z krevních vzorků. Jsou navrženy pro objem 3 – 5ml krve. Při jejich použití je nutné mít k dispozici také nádobky MB/BacT. Firma bioMérieux přichází na trh s dalšími novinkami. Jednou z nich jsou hemokultivační nádobky systému BacT/ALERT vyrobené z plastu. Nové plastikové nádobky obsahují kultivační média o shodném složení, jsou však o 30% lehčí než klasické skleněné nádobky. Tím dochází k výraznému snížení nákladů souvisejících s jejich odstraňováním. 2.9.2.3
BacT/Alert 3D
Přístroj pracuje na stejném principu jako BacT/Alert 120 a 240. Technický vývoj se zaměřil na zmenšení rozměrů a uživatelský komfort. Základem je modulární stavba. Kontrolní modul s vestavěným řídícím počítačem se ovládá dotykovou obrazovkou.. Snímač čarového kódu je vestavěný. Ke kontrolnímu modulu je možné připojit až šest inkubátorů. Každý inkubátor se skládá ze čtyř kultivačních jednotek. Každá jednotka obsahuje 60 buněk (tři bloky po 20 buňkách), celkem je v inkubátoru 240 buněk. Každá jednotka může být samostatně naprogramována pro kultivaci krve, tělesných tekutin nebo mykobakterií. Ovládání systému je velmi jednoduché a nevyžaduje složité zaškolování. Součástí systému je BacT/VIEW ovládající databázi s kapacitou 1,8 milionu lahviček. BacT/REMOTE
je druhá pracovní stanice
BacT/VIEW, která může být umístěna v i mimo laboratoř pro přijímání dat z různých lokalit. S LIS je BacT/Alert 3D propojen pomocí výše popsaného systému BacT/LINK.
26
Přístroj je dodáván ve třech základních sestavách o kapacitě 60,120 a 240 buněk.
2.9.2.4
Bactec
Automatizovaný hemokultivační systém Bactec umožňuje detekci růstu mikroorganismů během inkubace. Výrobcem je firma Becton Dickinson, Sparks, MD, USA.
První přístroj tohoto typu byl uveden na trh v roce 1970. Diagnostika růstu mikroorganismů byla založena na radiometrickém stanovení. Kultivační médium obsahovalo glukózu se značeným uhlíkem
14
C. Vlivem metabolické
činnosti bakterií byl vytvářen radioaktivní CO 2 , jehož tvorbu měřilo speciální čidlo. Počítač pak provedl vyhodnocení.
27
Modernější systémy Bactec 660, 730, 860 (označované také NR – non radiometric) detekovaly tvorbu CO 2 fotometricky v oblasti infračerveného záření. Nevyžadovaly tedy opatření nutná při práci s radioaktivním materiálem. Hemokultivační nádobky musely být napojeny na okruh, který zajišťoval odsávání plynné fáze nad médiem. Tím se získávaly vzorky pro měření a doplňoval se nový plyn. Toto uspořádání však vedlo k riziku kontaminace. PRINCIP: Poslední verze systému Bactec (Bactec 9120, 9140 a 9050) využívá k detekci CO2 principu fluorescence. - Hemokultivační nádobky mají na svém dně senzitivní vrstvu, která je od média oddělena speciální membránou propouštějící pouze CO 2. -
CO2 uvnitř senzitivní vrstvy reaguje s vodou za vzniku H2CO3, přičemž klesá lokální pH. pH je závislé na množství vyzářeného světla (fluorescence) a nepřímo se tak měří množství CO2 vzniklé při metabolismu mikroorganismů. Přístroj vysílá každých 10 minut přes dno nádobky k senzitivní vrstvě světelný paprsek o definované vlnové délce, aktivuje ji a ta se po vyzáření vrací do původního stavu.
-
Množství a kvalita vyzářeného světla je závislá na p H. Detektor vyzářeného světla tedy měří tvorbu CO 2 v nádobce, měření je
neinvazivní. Inkubace probíhá při 350C za pravidelného protřepávání nádobek. Počítač vyhodnocuje signály z detektorů a hlásí opticky a akusticky pozitivitu hemokultur. Také podává obraz aktuálního využití kapacity, včetně polohy a stavu nádobek. Je schopen sestrojit křivku tvorby CO 2 v čase. KAPACITA: -V přístroji může být najednou umístěno 120 (Bactec 9120), 240 (Bactec 9240), 50 (Bactec 9050) hemokultivačních nádobek. SOFTWARE SYSTÉMU: -U systému Bactec má každý blok s celami svůj mikropočítač, kde se veškerá data shromaždují a ihned vyhodnocují. Do stolního počítače tak putují jen výsledky. Mikropočítač má omezenou kapacitu paměti, proto se veškerá data z paměti po týdnu vymazávají. Počítač tedy představuje pouze spojku mezi hemokultivačním systémem a LIS. Výsledkem je lepší komunikace a obsluha.
28
HEMOKULTIVAČNÍ NÁDOBKY: Pro Bactec řady 9000 lze použít následující typy: Nádobky BACTEC Standard Aerobic/F Standardní aerobní nádobky obsahují 25ml tekuté půdy na bázi sojového kaseinového hydrolyzátu, s přídavkem heminu, manadionu, SDS, glukózy, pyridoxinu, kvasničného extraktu. Plynnou fázi tvoří vzduch obohacený CO 2 . V nádobce je podtlak umožňující nasátí 5-10ml krve. Používají se k detekci a získání aerobních mikroorganismů z krevních vzorků. Nádobky BACTEC Standard Anaerobic/F Nádobky obsahují 25ml tekuté půdy, která je navíc (oproti aerobní nádobce) obohacena o savčí tkáňový lyzát, fruktózu, arginin, thioly (L-cystein), citrát sodný a fosfát draselný. Plynná fáze je tvořena směsí CO 2 a dusíku. Opět je zde podtlak umožňující nasátí 5-10ml krve. Používají se k detekci a získání anaerobních mikroorganismů z krevních vzorků. Nádobky BACTEC PLUS Aerobic/F Nádobky obsahují 25ml tekuté půdy na bázi sojového kaseinového hydrolyzátu s přídavkem heminu, manadionu, glukózy, pyridoxinu, kvasničného extraktu a SDS. Navíc obsahují 16% neionogenních adsorpčních přísad (RESIN=kuličky sorpční pryskyřice) a 1% kationtově-výměnných přísad (katex), které jsou určené k inaktivaci antibiotik a baktericidně působících složek krve a k inhibici hemokoagulace. Plynnou fázi tvoří vzduch obohacený CO 2 .
29
V nádobce je podtlak, který umožňuje nasát 8-10ml krve. Média obsahující přísady inaktivující antibiotika vykazují vyšší záchyt klinicky významných mikroorganismů. Především u stafylokoků a streptokoků došlo ke zkrácení detekčního času. Nádobky BACTEC PLUS Anaerobic/F Nádobky obsahují 25ml tekuté půdy, která je (oproti aerobní nádobce) obohacena o savčí tkáňový lyzát, fruktózu, arginin, thioly (L-cystein), citrát sodný a fosfát draselný. Opět navíc obsahují 16% neionogenních adsorpčních přísad (RESIN) a 1% kationtově-výměnných přísad (katex). Plynná fáze je tvořena směsí CO 2 a dusíku. Je zde podtlak umožňující nasátí 8-10ml krve. Používají se k detekci a získání anaerobních mikroorganismů (bakterií a kvasinek) z krevních vzorků. Nádobky BACTEC MYCO/F LYTIC Obsahují 40ml tekuté půdy, která je obohacena (oproti standardní aerobní nádobce) o saponin (lyzační činidlo). Plynnou fázi tvoří vzduch s přídavkem CO 2 . Injikuje se 1 – 5ml krve. Nádobky jsou určené pro detekci kvasinek, hub a mykobakterií z krve nebo jiných tělních tekutin. Používají se často pro diagnostiku infekcí krevního řečiště u pacientů s AIDS. Vyvinutím tohoto média se čas detekce kvasinek ve srovnání s použitím BACTEC PLUS Aerobic/F média snížil z 74-57h na 29-14h. Nádobky BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Nádobky obsahují 40ml tekuté půdy s SPS a saponinem. Plynná fáze je tvořena směsí CO 2 a dusíku. Injikuje se 3 – 10ml krve. Toto médium vykazuje u pacientů bez antibiotické terapie vyšší záchyt klinicky významných mikroorganismů než PLUS Aerobic/F médium. Nádobky BACTEC Peds Plus/F Nádobky obsahují 40ml tekuté půdy, která je obohacena (oproti PLUS Aerobic/F nádobce) o savčí tkáňový lyzát a pyruát sodný, 10% neionogenních adsorpčních přísad (RESIN) a 1% kationtově-výměnných přísad. Plynné prostředí tvoří vzduch s přídavkem CO 2 . Tyto nádobky jsou určeny pro objem krve 1 – 3ml (41, 55). Používají se k detekci a získání aerobních mikroorganismů (převážně bakterií a hub) z pediatrických či jiných krevních
30
vzorků, jejichž objem je menší než 3ml. Nádobky BACTEC Mycosis IC/F Médium obsahuje tobramycin a chloramphenicol, které potlačují bakteriální růst. Další součástí média je saponin, který se podílí na uvolňování fagocytárních hub a kvasinek z leukocytů. Injikuje se 8 – 1Oml krve. Nádobky se používají pro selektivní detekci a získání hub či kvasinek z krevních vzorků. Jsou určeny především pro imunosupresované neutropenické pacienty. Správná volba kultivační nádobky je nutným předpokladem úspěšného záchytu patogenního agens.
31
Materiál a pomůcky
3 3.1
Použité kvasinkové kmeny •
Candida albicans
•
Candida crusei
•
Candida glabrata
•
Candida parapsilosis
•
Candida tropicalis
Zpracování vzorků
3.2
Zkumavky
Polštářky z buničiny
Kultivační půdy – sabouraudův agar, sušené základy, Becton Dickinson, 1. Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417
Automatická pipeta – Transferpette 20 – 200 μl, Brand GMBH, 97861 Wetrheim
Kličky – MEDIN a.s., Nové Město na Moravě
Třepačka – Vortex Genie2, Scientific IndustriesINC., Bohemia, N.Y., 11716, USA
Injekční stříkačky a jehly
Gumové rukavice
Roztok lihobenzinu
Fyziologický roztok
Hemokultivační lahvičky pro aerobní bakterie – Bactec Standard aerobic/F BacT/Alert SA
Hemokultivační systémy
Bactec 9240, Becton Dickinson, 1. Beton Drive, Franklin Lakes, NJ,USA 07417
BacT/Alert 120 – bioMérieux, 100 Akzo Avenue, Durham, NC 277 12, USA
32
4
Metody Zjištění hodnoty TTD nejčastěji zachycovaných kvasinek v závislosti na
množství inokulovaných mikroorganismů ( CFU, colony forming units ) Příprava inokula: Z čisté kultury připravíme suspenzi ve 1,8 ml sterilního fyziologického roztoku.Zákal musí odpovídat 0,5 stupni McFarlandovy zákalové stupnice.Tuto zkumavku označíme jako ředění 1. Příprava ředící řady: Připravíme si řadu šesti zkumavek obsahujících 1,8 ml sterilního fyziologického roztoku, označíme je ředění 2 - 7. Po důkladném protřepání suspenze ( ředění 1) odebereme automatickou pipetou 0,2 ml a přeneseme do zkumavky s označením 2. Suspenzi opět důkladně protřepeme, odebereme 0,2 ml a přeneseme do zkumavky číslo 3. Takto pokračujeme až připravíme ředění 1 – 7. Inokulace
hemokultivačních
lahviček:
Použijeme
ředění
3
–
7.Připravíme si pět zkumavek se 4 ml sterilního fyziologického roztoku, označíme je čísly 3 – 7. Do každé zkumavky přidáme 0,1 ml suspenze odpovídajícího ředění.Po důkladném protřepání jsme obsah zkumavky odebrali sterilní injekční stříkačkou se sterilní jehlou a vstříkli jsme ho do hemokultivační lahvičky systému Bactec a stejně jsme postupovali i systému BacT/Alert. Gumovou zátku jsme před i po inokulaci dezinfikovali lihobenzinem. Lahvičky jsme popsali jménem mikroba a jeho koncentrací v roztoku a dali jsme je kultivovat. Z každého ředění jsme pak ještě odebrali automatickou pipetou se sterilní špičkou 0,1 ml roztoku a vyočkovali ho na Petriho misku se Sabouraudovým agarem. Vzorek jsme rozetřeli po celé ploše půdy sterilní plastovou kličkou. Misku jsme rovněž označili názvem a koncentrací daného mikroba a dali jsme ji kultivovat. Po vyhodnocení pozitivity hemokultivačních lahviček jsme zjištěné detekční časy patogenů přiřadili k množství kolonií spočítaných na příslušných agarových půdách, kam byl inokulován vzorek o stejné koncentraci mikrobů.
33
5
Výsledky 5.1
Detekční časy kvasinek Závislost TTD obou systémů na počtu inokulovaných CFU znázorňují
tabulky
č. 3 – 14 a grafy č. 2 -11. Detekce C.albicans a C.parapsilosis byla
rychlejší v systému BacT/Alert. Naopak detekce C.crusei, C.glabrata a C.tropicalis byla rychlejší v systému Bactec. Z výsledků měření vyplývá, že detekční čas je závislý na druhu a množství inokulovaných kvasinek, čím vyšší byl počet inokulovaných CFU, tím byl detekční čas kratší.
34
5.2
Naměřené hodnoty
Tabulka 3: TTD C.albicans zjištěné kultivací v přístroji Bactec a odpovídající hodnoty CFU Candida albicans CFU/ na nádobku
TTD Bactec
488
20,07
48
23,74
13
28,71
324
19,57
54
21,75
6
30,55
168
22,98
1
32,35
1
32,35
1
38,85
442
19,59
94
26,68
16
20,46
1
33,85
Průměrný TTD
26,54
35
C.albicans Bactec SA y = -2,3611Ln(x) + 33,74 R2 = 0,8024
45 40
TTD [h]
35 30 25 20
ttd Logaritmický (ttd)
15 10 5 0 1
10
100 CFU
Graf 2 Závislost TTD C.albicans na CFU - Bactec
36
1000
Tabulka 4: TTD C.albicans zjištěné kultivací v přístroji BacT/Alert a odpovídající hodnoty CFU Candida albicans CFU/ na nádobku
TTD bacT/Alert
1008
20,5
244
24,2
75
26,8
51
26,8
9
31,2
1932
20,3
276
24,3
89
27,3
43
27,7
3000
13,7
284
22,2
66
24,3
4
29
472
20
4
27
212
20
60
23,7
547
19,3
102
23,2
14
25
800
20
83
23,2
13
25,7
Průměrný TTD
23,71
37
C.albicans BacT/Alert SA y = -1,8025Ln(x) + 32,158 R2 = 0,7264
35 30
TTD [h]
25 20
ttdCA
15
Logaritmický (ttdCA)
10 5 0 1
10
100
1000
10000
CFU
Graf 3 Závislost TTD C. albicans na CFU - BacT/Alert
38
Tabulka 5: TTD C. Crusei zjištěné kultivací v přístroji BacT/Alert a odpovídající hodnoty CFU Candida crusei CFU / na nádobku
TTD BacT/Alert
216
34
48
39,5
11
43,5
448
29,3
70
40,8
13
40
Průměrný TTD
37,85
C.crusei BacT/Alert SA 50
y = -3,1811Ln(x) + 50,873 R20,8171 =
45 40
TTD [h]
35 30
ttdKRU
25
Logaritmický (ttdKRU)
20 15 10 5 0 1
10
100
1000
CFU
Graf 4 Závislost TTD C.crusei na CFU - BacT/Alert
39
Tabulka 6: TTD C.crusei zjištěné kultivací v přístroji Bactec a odpovídající hodnoty CFU Candida crusei CFU / na nádobku
TTD Bactec
108
32,14
17
36,15
664
28,14
115
31,48
12
40,34
1
42,54
Průměrný TTD
735,13
C.crusei Bactec SA y = -2,3757Ln(x) + 43,543 R20,9388 =
50
TTD [h]
40 30
ttd Logaritmický (ttd)
20 10 0 1
10
100 CFU
Graf 5 Závislost TTD C.crusei na CFU - Bactec
40
1000
Tabulka 7: TTD C.glabrata zjištěné kultivací v přístroji BacT/Alert a odpovídající hodnoty CFU Candida glabrata CFU / na nádobku
TTD BacT/Alert
1600
20,5
136
24,7
30
26,8
10
28,8
108
28,5
7
33,2
1
44,5
1100
22,5
89
29
13
33,7
2
37,2
1
38
1200
23,5
Průměrný TTD
30,07
C.glabrata BacT/Alert SA 50 y = -2,4802Ln(x) + 38,933 R2 = 0,8629
TTD [h]
40 30
ttdGLA Logaritmický (ttdGLA)
20 10 0 1
10
100
1000
10000
CFU
Graf 6 Závislost TTD C.glabrata na CFU - BacT/Alert
41
Tabulka 8: TTD C. Glabrata zjištěné kultivací v přístroji Bactec a odpovídající hodnoty CFU Candida glabrata CFU / na nádobku
TTD Bactec
432
17,55
108
21,08
17
27,63
664
18,91
115
22,42
12
26,46
Průměrný TTD
22,34
C.g lab r ata Bacte c SA 30
y = -2,3709Ln(x) + 33,134 2 R = 0,9248
25 20
ttd
15
Logaritmický (ttd)
10 5 0 1
10
100
1000
Graf 7 Závislost TTD C.glabrata na CFU - Bactec
42
Tabulka 9: TTD C.parapsilosis zjištěné kultivací v přístroji BacT/Alert a odpovídající hodnoty CFU Candida parapsilosis CFU / na nádobku
TTD BacT/Alert
10000
21,5
864
24,3
61
29,2
11
33
10000
18,8
Průměrný TTD
25,36
C.parapsilosis BacT/Alert SA y = -1,8575Ln(x) + 37,133 R2 = 0,9702
35 30
TTD [h]
25 20
ttdPARA
15
Logaritmický (ttdPARA)
10 5 0 1
10
100
1000
10000
CFU Graf 8 Závislost TTD C.parapsilosis na CFU - BacT/Alert
43
Tabulka 10: TTD C. Parapsilosis zjištěné kultivací v přístroji Bactec a odpovídající hodnoty CFU Candida parapsilosis CFU / na nádobku
TTD Bactec
564
20,96
11
32,01
1
26,51
1
33,68
576
28,88
89
26,51
9
31,01
560
21,79
84
27,31
16
30,31
1
37,31
685
20,77
106
26,81
12
30,31
Průměrný TTD
28,16
C.parapsilosis -Bactec SA y = -1,5429Ln(x) + 33,554 R2 = 0,6134
40 35 30 25
ttd
20
Logaritmický (ttd)
15 10 5 0 1
10
100
Graf 9 Závislost TTD C.parapsilosis na CFU -Bactec
44
1000
Tabulka 11: TTD C.tropicalis zjištěné kultivací v přístroji BacT/Alert a odpovídající hodnoty CFU Candida tropicalis CFU / na nádobku
TTD BacT/Alert
10000
15,2
808
17,8
190
16,7
38
22
10
23,7
1
24,3
Průměrný TTD
19,95
C.tropicalis BacT/Alert SA 30
y = -1,1072Ln(x) + 24,949 R2 = 0,8733
TTD [h]
25 20
ttdTRO
15
Logaritmický (ttdTRO)
10 5 0 1
10
100
1000
10000
CFU Graf 10 Závislost TTD C.tropicalis na CFU – Bact/Alert
45
Tabulka 12: TTD C.tropicalis zjištěné kultivací v přístroji Bactec a odpovídající hodnoty CFU Candida tropicalis CFU / na nádobku
TTD Bactec
648
12
78
13,50
7
17,07
1
20,44
744
12,50
57
13,50
9
19,76
Průměrný TTD
15,54
C. tropicalis Bactec SA 25
y = -1,3394Ln(x) + 20,442 R2 = 0,8634
TTD [h]
20 15 ttd 10
Logaritmický (ttd)
5 0 1
10
100 CFU
Graf 11 Závislost TTD C:tropicalis na CFU - Bactec
46
1000
Tabulka 13: Závislost TTD na počtu inokulovaných CFU - BacT/Alert mikrob
Rovnice
C.albicans
y = -1,8025 Ln(x) + 32,158
C.crusei
y = -3,1811 Ln(x) + 50,873
C.glabrata
y = -2,4802 Ln(x) + 38,933
C.parapsilosis
y = -1,8575 Ln(x) + 37,133
C.tropicalis
y = -1,1072 Ln(x) + 24,949
y = TTD x = CFU Tabulka 14: Závislost TTD na počtu inokulovaných CFU - Bactec mikrob
Rovnice
C. albicans
y = -2,3611 Ln(x) + 33,74
C.crusei
y = -2,3757 Ln(x) + 43,543
C.glabrata
y = -2,3709 Ln(x) + 33,134
C.parapsilosis
y = -1,5429 Ln(x) + 33,554
C.tropicalis
y = -1,3394 Ln(x) + 20,442
y =TTD x = CFU Tabulka 15: Srovnání průměrných TTD Průměrný TTD Mikrob
BacT/Alert
Bactec
C.albicans
23,71
26,54
C.crusei
37,85
35,13
C.glabrata
30,07
22,34
C.parapsilosis
25,36
28,16
C.tropicalis
19,95
15,54
27,37
25,54
Průměrný TTD
47
6
Diskuse V této práci jsme se věnovali problematice infekcí krevního řečiště
způsobených kvasinkami rodu Candida.Naším cílem bylo stanovení závislosti TTD na množství inokulovaných buněk. Na začátku naší práce jsme se potýkali s problémem přerůstání kvasinek v lahvičkách bakteriemi, hlavně enterokoky, PK- stafylokoky a alfastreptokoky. Problém jsme řešili nejprve zvýšenými nároky na sterilitu, pracovali jsme v laminárním boxu, samozřejmostí bylo používání sterilních rukavic a roušky, používali jsme sterilní fyziologický roztok. Změnili jsme i dezinfekční prostředek. Potíže stále přetrvávali, proto jsme do každého ředění přidali antibiotické disky, které tento problém vyřešily. V pokusech byly porovnávány kultivace pěti druhů kvasinek v hemokultivačních lahvičkách, které podle doporučení výrobců odpovídají stejnému použití.Lahvičky srovnávaných systémů se liší složením kultivační půdy i vlastním detekčním systémem. Fluorescenční detekce u systému Bactec a kolorimetrická detekce u přístroje BacT/Alert.Oba systémy jsou srovnatelné pro identifikaci klinicky významných mikroorganismů od dospělých pacientů s bakteriemií či fungemií, kteří byli v čase odběru léčeni antibiotiky[37]. Existuje několik studií, které se zabývají srovnáním obou systémů, ale je v nich zaznamenán jen malý počet episod kandidémie, zejména C.albicans. Horvath et al. dospěl ve své studii k závěru, že systém BacT/Alert je lepší než Bactec v celkové detekci, detekčních časech i počtu falešně negativních výsledků [25]. Naše práce toto tvrzení nepotvrzuje, u C.crusei , C.glabrata a C.tropicalis jsme naměřili kratší TTD právě v systému Bactec. V porovnání námi získaných průměrných TTD s výsledky publikovanými v jiných studiích jsme zaznamenali statisticky nevýznamné rozdíly. Světové studie se zabývají hlavně srovnáváním standardních aerobních a anaerobních médií s médii určenými pro detekci kvasinek. Výsledky těchto studií jednoznačně ukazují zkrácení TTD a snížení počtu falešně negativních výsledků při kultivaci v lahvičkách, které jsou určeny pro detekci kvasinek [41,42]. 48
Bohužel, tyto média jsou zhruba třikrát dražší než aerobní a anaerobní ,a proto se běžně v klinické laboratoři nepoužívají [25] . Dalším diskutovaným problémem je optimální doba inkubace pro detekci kvasinek v automatických hemokultivačních systémech. Většina klinických laboratoří inkubuje hemokultury v automatických systémech po dobu pěti dnů a pak negativní lahvičky vyřadí bez terminální kultivace, tak jak to doporučuje Americká společnost patologů ( The College of Americian Pathologists). Data získaná v našich pokusech a v několika světových studií ukazují, že třídenní inkubace je dostačující k izolaci klinicky významných bakteriálních a fungálních patogenů a laboratoře by v budoucnu mohly třídenní kultivační dobu přijmout [25]. Kvasinky jsou stále častěji příčinou nosokomiálních infekcí krevního řečiště a to nejen dříve nejvíce zastoupená C.albicans, ale i non-C.albicans druhy. Rozhodně si tato problematika zaslouží pozornost a další výzkum.
49
7
Závěr Z naměřených TTD a zjištěných CFU jsme sestrojili grafy závislosti a z
nich odvodili rovnice,které charakterizují závislost TTD na CFU u pěti vybraných druhů kvasinek rodu Candida. Z výsledků měření vyplývá, že detekční čas je závislý na druhu a množství inokulovaných kvasinek, čím vyšší byl počet inokulovaných CFU, tím byl detekční čas kratší. Detekce C.albicans a
C.parapsilosis byla
rychlejší v systému
BacT/Alert. Naopak detekce C.crusei, C.glabrata a C.tropicalis byla rychlejší v systému Bactec. Při srovnání průměrných TTD obou systémů nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly. Hemokultivační lahvičky obou systémů prokázaly vysoké schopnosti detekce kvasinek i v případě velmi nízkého počtu inokulovaných buněk. Růstové křivky umožňují zjištění počátečního množství kvasinek v hemokultuře. Z počátečního množství kvasinek a objemu inokulované krve lze velmi jednoduše vypočítat fungémii v CFU na 1 ml krve. K získání validních výsledků a k možnému využití v klinické praxi je nutné provést větší počet měření.
50
8
Summary This work deals with the sepsis problems and possibilities of its
diagnostics with the help of a quantitative bacteriological investigation using hemocultural systems of BacT/Alert and Bactec. We focused on the yeasts genus Candida and tested the five most frequent species. The first part is dedicated to a theoretical introduction of the whole issue concerning the blood-course and the sepsis. It analyses the pathogeny of these infections and its generators, sepsis clasification and risk factors. It also mentions the diagnostic methods, both clinical and laboratory.
Then the
following part of the theoretical text is concerned with the hemoculture and automatic hemocultural systems BacT/Alert and Bactec. The practical part shows the used method description as well as the materials and tools. There is also a detailed work process description. The result part contains various graphs and tables of the dependance of the times to detection on the amount of the inoculum yeasts into hemocultural small bottles. The results show that the times to detection become shorter with the increasing amount of inoculum micro-organisms. Both systems deliver equivalent results. The growth curves designed by us could be used in a clinical practice for a quantitative determination of fungemia and a more sophisticated interpretation of a microbiologic finding.
51
9
Literatura 1.Kula R, Chýlek V, Szturz P, Tichý J, Sklienka. Patogeneze těžké sepse od makrocirkulace k mitochondriím. Klin mikrobiol inf lék 2006;12(4):143149) . 2.Cerra F. B., Siegel J. H. et al.: Correlations between metabolic and cardiopulmonary measurements in patients after trauma, general surgery and sepsis. J. Trauma, 19, 1979, 621 – 629. 3.Beneš J.: Klinický pohled na sepsi. Klin. Mikrobiol. Inf. Lék., 2, 1996, 5964. 4.Vacek V.: Současné pohledy na problematiku sepse. Epidemiol. Mikrobiol. Imunol., 43, 1994, 5-15. 5.Černý V, Novák I, Cvachovec K et al. Sepse v intenzivní péči. Maxdorf, Praha 2002. 6.Howe L.M.: Novel agents in the therapy of endotoxic shock. Expert. Opin. Investig. Drugs., 9, 2000, 1363-1372. 7.Bednář M., Souček A., Vávra J.: Lékařská speciální mikrobiologie a parazitologie. Triton, Praha 1994. 8.Bednář M., Fraňková V.,Schindler J., Souček A., Vávra J.: Lékařská mikrobiologie. Marvil, Praha 1996. 9.Gutvirth J.: Na počátku sepse jsou receptory (minireview). Klin. Mikrobiol. Inf. Lék., 6, 2000, 238-241. 10. Holub M.: Imunologické aspekty sepse. Klin. Mikrobiol. Lék., 4, 1998, 200-204. 11. Pedersen G., Schonheyder H.C., Sorensen H.T.: Antibiotic therapy and outcome of monomicrobial gram-negative bacteraemia. A 3-year population-based study. Scand. J. Infect. Dis., 29, 1997, 601-606. 12. Kumasaka K., Hosokawa N., Yanai M. et al.: Clinical analysis of Pseudomonas aeruginosa bacteremia. Rinsho. Byori., 47, 1999, 10641069. 13. Allerberger F., Schneidiger M., Neher C. et al.: The spectrum of pathogens in positive blood cultures – Tyrol 1991. Abstr. Wien. Med. Wochenschr., 142, 1992, 385-389. 14. Biancone L., Conaldi P.G., Toniolo A. et al.: Escherichia coli porin induces proinflammatory alterations in renal tubular cells. Exp. Nephrol., 5, 1997, 330-336. 15. Ibraim E.H., Sherman G., Ward S. et al.: The influence of inadequate antimicrobial treatment of bloodstream infections on patient outcomes in the IUC setting. Chest, 118, 2000, 146-155. 16. Landry S. L., Kaiser D. L., Wenzel R. P.: Hospital stoy and mortality attributed to nosocomial enterococcal bacteremia. Am J. Infect. Control., 6, 1989, 323 – 329. 17. Hyánek T., Jindrák V., Kafka B., Vaniš V.: První zkušenosti s monitorováním katétrových infekcí na ARO Nemocnice Na Homolce. Klin. Mikrobiol. Inf. Lék., 6, 2000, 189-192. 18. Jindrák V.: Nozokomiální infekce a současná medicína. Klin. Mikrobiol. Inf. Lék., 6, 2000, 166-171. 19. Jindrák V.: Změny v epidemiologii infekčních komplikací v intenzivní péči, 52
význam mikrobiologické monitorace kriticky nemocných. Klin. Mikrobiol. Inf. Lék., 6, 2000, 3-6. 20. Jones R.N., Low D., Pfaller M.: Epidemiologic trends in nosocomial and community-acquired infections due to antibiotic resistant gram-positive bacteria. The role of new streptogramins and other newer compounds. Diagn. Microb. Infect. Dis., 33, 1999, 101-112. 21. Richards M.J., Edwards J.R., Culver D.H. et al.: Nosocomial infections in medical intensive care units in the United States. National Nosocomial Infections Surveillance Systém. Crit. Care Med., 27, 1999, 887-892. 22. Petráš P.: ORIDES – Orientační identifikace koaguláza-negativních stafylokoků z humánního klinického materiálu. Epidemiol.Mikrobiol. Imunol., 44, 1995, 15-19. 23. Paisley J.W., Lauer B.A.: Pediatric blood cultures. Clin. Lab. Med., 14, 1994, 17-30. 24. Potužník V.: Klinická mikrobiologie sepse. Avicenum, Praha 1978. 25. Lynn L. Horvath,1* Benjamin J. George,1 Clinton K. Murray,1 Linda S. Harrison,2 and Duane R. Hospenthal1,:Comparison of the BACTEC 9240 and BacT/ALERT 3D Automated Blood Culture Systems for Candida Growth Detection 26. Vincent J.L. et al.: The prevalence of nosocomial infection in intensive care units in Europe. Results of the European Prevalence of Infection in Intensive Care (EPIC) Study. EPIC International Advisory Committee. JAMA 274, 1995, 639-644. 27. Ansari A.,Mc Namara E.B., Cunney R.J. et al.: Experience with Enterobacter bacteremia in a Dublin teaching hospital. J. Hosp. Inf., 27, 1994, 69-72. 28. Gray J., Marsch P.J., Stewart D. et al.: Enterococcal bacheraemia. A prospective study of 125 epizodes. J. Hosp. Inf., 27, 1994, 179-186. 29. Mizushima Y., Kawasaki A., Hirata H. et al.: An analysis of bacteraemia in a university hospital in Japan over a 10-year period. J. Hosp. Inf., 27, 1994, 285-298. 30. Šrámová H.: Výskyt sepsí v České republice. Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 44, 1995, 155-160. 31. Shafazand S, Weinacker AB, et al. Blood Cultures in the Critical Care Units. Chest 2002; 122:1727-1736. 32. Leibovici L, Shraga I, drucker M, et al. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in pacients with bloodstream infection. J Intern Med 1998; 244:379-386. 33. Behrendt G, [25]. Schneider S, Brodt HR, Just-Nubling G, Shah PM. Influence of antimicrobial treatment on mortality in septicemia. J Chemother 1999; 11:179-186. 34. Čermák P., Pozlerová E., Morávková M., Zapomělová L.: Zkušenosti s provozem poloautomatického hemokultivačního systému BacT/Alert v průběhu tří let (1996-1998) ve Fakultní nemocnici v Hradci Králové. Klin. Mikrobiol. Inf. Lék., 6, 2000, 39-43. 35. Jorgensen J.H., Mirrett S., McDonald L.C. et al.: Controlled clinical laboratory comparsion of Bactec Plus aerobic/F medium with BacT/Alert aerobic FAN medium for detection of bacteremia and fungemia. J. Clin. 53
Microbiology, 35, 1997, 53-58. 36. Wilson M.L., Weinstein M.P., Mirrett S. et al.: Controlled evaluation of BacT/Alert standard anaerobic and FAN anaerobic blood culture bottles for the detection of bacteremia and fungemia. J. Clin. Microbiol., 33, 1995, 2265-2270. 37. Ziegler R., Johnscher I., Martus P. et al.: Controlled clinical comparsion of two supplemented aerobic and anaerobic media used in automated blood culture systems to detect bloodstream infections. J. Clin. Microbiol., 36, 1998, 657-661. 38. Reklamní materiál firmy bioMérieux. 39. Šrámová H. Výskyt sepsí v České republice. Epidemiol Mikrobiol Imunol 1995; 44: 155-160. 40. Tomšíková A. Nosokomiální mykózy. Karolinum 2003. 41. Clifford McDonald,1 Melvin P. Weinstein,2,3,4 Jose Fune,3 Stanley Mirrett,1,* Larry G. Reimer,5 and L. Barth Reller1,6,:Controlled Comparison of BacT/ALERT FAN Aerobic Medium and BACTEC Fungal Blood Culture Medium for Detection of Fungemia 42. Marie-Hélène Meyer,Valérie LetscherBru, BenoîtJaulhac, Jocelyn Waller,and Ermanno Candolfi,:Comparison of Mycosis IC/F and Plus Aerobic/F Media for Diagnosis of Fungemia by the Bactec 9240 System
54
