UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie
VÝSLEDKY KOPROLOGICKÝCH VYŠETŘENÍ OVCÍ (Ovis ammon f. aries) INFIKOVANÝCH MODELOVÝM PARAZITEM A OŠETŘENÝCH VYBRANÝM ANTHELMINTIKEM
Diplomová práce
Vedoucí diplomové práce: prof. RNDr. Jiří Lamka, CSc.
Hradec Králové 2013
Karolína Škávová
„Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Tato práce nebyla použita k získání jiného či stejného titulu.“
V Hradci Králové dne 2. 4. 2013
Karolína Škávová
Mé upřímné poděkování za všestrannou pomoc, vstřícnost i trpělivost včetně kvalifikovaných cenných rad a připomínek při vypracování diplomové práce věnuji prof. RNDr. Jiřímu Lamkovi, CSc. Dále děkuji své rodině a mému příteli za morální podporu a pomoc během celého studia.
ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Karolína Škávová Školitel: prof. RNDr. Jiří Lamka, CSc. Název diplomové práce: Výsledky koprologických vyšetření ovcí (Ovis ammon f. aries) infikovaných modelovým parazitem a ošetřených vybraným anthelmintikem. Helmintorezistence je v současnosti závažným problémem v chovech mnoha druhů hospodářských zvířat, limituje jejich zdravotní stav a navazující produkčnost chovů. Jsou studovány mechanismy vedoucí ke vzniku helmintorezistence. K dlouhodobě využívaným modelových parazitům patří Haemonchus contortus. Tato krevsající hlístice se řadí k nejvýznamnějším původcům parazitárních infekcí u ovcí a koz. Cílem této diplomové práce bylo popsat pomocí parazitologických metodik průběh parazitóz experimentálně navozených dvěma různě citlivými kmeny Haemonchus contortus u ovcí. Zvířata vstupující do jednotlivých studií byla odčervena suspenzí albendazolu (dávka 30 mg/kg ž. hm.) nebo suspenzí monepantelu (dávka 2,5 mg/kg ž. hm.). Poté byla infikována kmeny ISE (plně citlivý k anthelmintikům) a WR (plně rezistentní k anthelmintikům) s L3 larvami Haemonchus contortus. Ve vzorcích trusu zvířat byl stanoven počet vajíček kvantitativní ovoskopickou metodou a byly identifikovány rody dalších endoparazitů pomocí kvalitativní ovoskopické metody. V případě prvního a druhého experimentu byl během infekce podáván flubendazol vždy ve třech po sobě jdoucích dnech v rozdílně velkých dávkách s cílem využití léčiva k vyvolání helmintorezistence. Bylo prokázáno, že interval mezi podáním L3 infekčních larev zvířatům a vylučováním vajíček trusem je v rozmezí 16-26 dní. Na konci každého experimentu byla zvířata utracena a z jejich slezů byli izolováni dospělci Haemonchus contortus. Získaní dospělci parazitů byli následně využiti k dalšímu ex vivo testování v oblasti helmintorezistence (Katedra biochemických věd Farmaceutické fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové).
ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Student: Karolína Škávová Supervisor: prof. RNDr. Jiří Lamka, CSc.
Title of diploma thesis: Results of coprological diagnosing in sheep (Ovis ammon f. aries) infected by model parasite and treated by selected anthelmintic.
Anthelmintic resistence is currently a serious problem in breeding of many species of farm animals, it restricts their health condition and subsequent productivity of breeding. The mechanisms leading to the formation of anthelmintic resistence are being studied. One of the long term used parasitic models is Haemonchus contortus. This blood-sucking nematode belongs to the most important originators of parasitic infections in sheep and goats. The aim of this thesis was to describe a course of parasitoses experimentally induced by two differently susceptible strains of Haemonchus contortus in sheep by parasitological methods. The animals in each study were dewormed with albendazole suspension (dose of 30 mg/kg bw) or monepantel suspension (dose of 2.5 mg/kg bw). Then they were infected by strains ISE (fully susceptible to anthelmintics) and WR (fully resistant to anthelmintics) with L3 larvae of Haemonchus contortus. The number of eggs in samples of animal faeces was determined by the quantitative ovoscopical method and other genera of endoparasites were identified by the qualitative ovoscopical method. During the first and the second experiment, flubendazole was administered in three days in various doses to induce anthelmintic resistance. The interval from 16 to 26 days between the infecting of the animals with L3 larvae and the excretion of eggs was detected. At the end of each experiment the animals were euthanized and the adults of Haemonchus contortus were isolated from their abomasa. These adult parasites were subsequently used for further ex vivo testing on anthelmintic resistence (Department of Biochemical Sciencies Faculty of Pharmacy, Charles University in Hradec Králové).
OBSAH 1
ÚVOD ....................................................................................................................... 1
2
TEORETICKÁ ČÁST ............................................................................................ 2 2.1
Ovce domácí ...................................................................................................... 2
2.1.1
Přehled vývoje chovu ovcí v ČR ................................................................ 2
2.1.2
Produkty získávané z chovu ....................................................................... 3
2.1.3
Plemena a užitkové typy ............................................................................. 3
2.1.4
Specifika trávicího traktu ............................................................................ 4
2.1.5
Nejčastější parazitární onemocnění ovcí .................................................... 5
2.2
2.1.5.1
Ektoparazitózy ovcí ............................................................................. 5
2.1.5.2
Endoparazitózy ovcí ............................................................................ 6
Haemonchus contortus ..................................................................................... 9
2.2.1
Systematické zařazení ............................................................................... 10
2.2.2
Morfologie ................................................................................................ 10
2.2.3
Vývojový cyklus a způsob přenosu .......................................................... 12
2.2.4
Klinické příznaky a patologické nálezy .................................................... 13
2.2.5
Diagnóza ................................................................................................... 14
2.2.6
Terapie ...................................................................................................... 15
2.2.7
Prevence .................................................................................................... 17
2.3
Farmakoterapie helmintóz ............................................................................ 18
2.3.1
Rozdělení anthelmintik ............................................................................. 18
2.3.2
Helmintorezistence ................................................................................... 19
2.3.3
Léčivé přípravky použité v experimentech ............................................... 21
2.3.3.1
Albendazol ......................................................................................... 21
2.3.3.2
Flubendazol ....................................................................................... 23
2.3.3.3
Monepantel ........................................................................................ 25
3
CÍLE PRÁCE ........................................................................................................ 27
4
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ................................................................................ 28 4.1
Místo a časové rozložení experimentů .......................................................... 28
4.2
Experimentální zvířata .................................................................................. 29
4.3
Použité kmeny Haemonchus contortus ......................................................... 29
4.4
Sběr a uchování vzorků ................................................................................. 29
4.5
Pracovní pomůcky, přístroje, chemikálie a materiál .................................. 30
4.6
Metodiky parazitologických vyšetření ......................................................... 30
4.6.1
Kvalitativní ovoskopická metoda ............................................................. 30
4.6.2
Kvantitativní ovoskopická metoda ........................................................... 31
4.6.3
Metoda koprokultur pro diagnostiku infekčních larev L3 ......................... 32
4.7
Vliv selekčního tlaku (opakované podání dávek flubendazolu) na účinnost
a metabolismus flubendazolu u Haemonchus contortus ........................................ 33 4.7.1
Experiment č. 1 ......................................................................................... 33
4.7.2
Experiment č. 2 ......................................................................................... 35
4.8
Účinnost a metabolismus flubendazolu u citlivých a rezistentních kmenů
Haemonchus contortus .............................................................................................. 36
5
6
4.8.1
Experiment č. 3 ......................................................................................... 36
4.8.2
Experiment č. 4 ......................................................................................... 37
VÝSLEDKY .......................................................................................................... 39 5.1
Experiment č. 1 ............................................................................................... 39
5.2
Experiment č. 2 ............................................................................................... 43
5.3
Experiment č. 3 ............................................................................................... 45
5.4
Experiment č. 4 ............................................................................................... 48
DISKUZE .............................................................................................................. 49 6.1
Systém ustájení zvířat .................................................................................... 49
6.2
Přítomnost vajíček v trusu ............................................................................ 49
6.3
Počty vyprodukovaných vajíček ................................................................... 50
6.4
Produkce vajíček s ohledem na kmen Haemonchus contortus ................... 50
6.5
Vliv flubendazolu na původce parazitózy .................................................... 51
6.6
Porovnání výsledků s literaturou .................................................................. 51
7
ZÁVĚR .................................................................................................................. 53
8
LITERATURA ...................................................................................................... 54
9
PŘÍLOHY .............................................................................................................. 59
1
ÚVOD
Aktuálně vysoce významným tématem experimentální i terénní veterinární parazitologie je tzv. helmintorezistence, tj. odolnost mnohých druhů parazitů prakticky proti všem dostupným skupinám léčiv. Helmintorezistence je diagnostikována celosvětově, přednostně v oblastech s nejintenzivnější živočišnou výrobou využívající běžné hospodářské druhy zvířat (ovce, skot, prase), ale i další druhy (koně, farmově chovaní jelenovití, aj.). Tento nepříznivý vývoj, kdy naprostá většina léčiv přestala být dostatečně účinnými, se mj. promítla do omezení až plného zastavení chovatelských aktivit některých hospodářských druhů (hlavně ovcí a skotu) v oblastech jejich tradičně intenzivního využívání (jižní Afrika, jižní Anglie, aj.). Přirozenou reakcí parazitologických a farmakologických odborných pracovišť po celém světě je snaha rozpoznat důvody vzniku helmintorezistence a nalézt řešení tohoto chovatelského problému. V současnosti existuje několik teorií vysvětlujících důvody vzniku odolnosti parazitů proti antiparazitikům, patří mezi ně i biotransformační změny v jejich organismech, které jim umožní efektivněji přežít kontakt s podaným léčivem. Tento mechanismus je předmětem intenzivního zájmu školitelského pracoviště spolupracujícího s Katedrou biochemických věd Farmaceutické fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové, při kterém jsou využíváni modeloví parazité chovaní na hospodářských či laboratorních zvířecích hostitelích. Tato diplomová práce se zabývá využitím dvou různě helmintorezistentních kmenů hlístice slezovky obecné (Haemonchus contortus), jejíž dospělci byli vychováni na ovcích, z nich izolováni a dále využiti v ex vivo studiích.
1
2
TEORETICKÁ ČÁST
2.1 Ovce domácí Ovce
patří
do
řádu
sudokopytníků
(Artiodactyla),
podřádu
přežvýkavců
(Ruminantia), čeledi turovitých (Bovidae), podčeleď kozy (Caprinae), která má tři rody: ovce (Ovis), kozy (Capra) a kamzík (Rupricapra). Rod ovce má dva druhy: ovce tlustorohá (Ovis canadensis) a ovce obecná (Ovis ammon) (Horák et al. 2004, Laštůvka et al. 2001).
2.1.1 Přehled vývoje chovu ovcí v ČR Ovce patří k nejstarším domestikovaným hospodářským zvířatům. Všestranná užitkovost, kratší reprodukční cyklus, jednodušší ošetřování a velká přizpůsobivost způsobily, že se jejich chov postupně rozšířil do všech zeměpisných pásem a rozdílných nadmořských výšek (Horák et al. 2004). Na území České republiky má chov ovcí dlouholetou tradici, chovají se zde od 9. století. Historicky nejslavnější etapou rozvoje ovčáctví bylo období „zlatého rouna“ (1765-1870). V této době se u nás chovalo přes 2 miliony kusů ovcí a jejich chov byl hlavním odvětvím živočišné výroby. Řada příčin způsobila postupnou stagnaci ovčáctví. Nepříznivé podmínky trvaly i v období tzv. první republiky. V roce 1935 se počet ovcí snížil až na 40 000 kusů. Nerovnoměrný vývoj u nás pokračoval i v poválečném období. Od roku 1970 se početní stavy ovcí postupně zvyšovaly až do roku 1990, kdy bylo v ČR chováno 430 000 kusů. V roce 1990 došlo k výrazné restrukturalizaci zemědělství vlivem přestavby užitkového zaměření ovcí (z vlnařského na masnou a kombinovanou užitkovost). V této souvislosti v letech 1990-2000 klesl stav ovcí o plných 80 %. Prudký pokles počtu ovcí se zastavil až v roce 2000, kdy se chovalo pouze 84 108 kusů. Počet ovcí se od roku 2000 zvýšil na 209 052 kusů v roce 2011, což představuje nárůst o 124 944 kusů, tj. o 148,6 % (viz Tab. 1) (Horák et al. 2004, Roubalová 2011, Vějčík 2007).
2
Tab. 1 Vývoj počtu ovcí chovaných v ČR v letech 1990-2011 1990
1993
1996
1999
429714 254301 134009 86047
2000
2003
2006
2009
2010
2011
84108
103129 148412 183084 196913 209052
Převzato z: Roubalová (2011)
2.1.2 Produkty získávané z chovu Hospodářský význam chovu ovcí spočívá v jejich mnohostranné užitkovosti, kterou tvoří hlavní a vedlejší produkty. Mezi hlavní produkty získávané z chovu ovcí patří maso, vlna, mléko a kůže. K vedlejším produktům se řadí lanolin, krev, vnitřnosti, lůj, endokrinní žlázy, rohy a kosti. Nezanedbatelný je také nepřímý užitek z chovu ovcí, který tvoří produkce mrvy tzv. košárování, což je specifický způsob přímého hnojení travních porostů. Dalším významným nepřímým užitkem je i ochrana životního prostředí, potřeba udržet osídlení venkova a tradiční kulturní ráz zemědělské krajiny (Horák et al. 2004).
2.1.3 Plemena a užitkové typy Ve světě existuje přes 600 kulturních plemen ovcí. Pro jejich třídění a posuzování existují rozdílné hodnotící systémy. Zootechnická klasifikace dělí plemena ovcí podle délky a tvaru ocasu do čtyř základních skupin: krátkoocasé, dlouhoocasé, tlustoocasé a tlustozadké. Dalším typem klasifikace je hodnocení podle stupně prošlechtění, kdy lze plemena rozdělit na primitivní (valaška, kamerunská, jacob), zušlechtěná (cigája, zušlechtěná valaška, zušlechtěná šumavka) a ušlechtilá (plemena merinová, masná, dojná). Plemena ovcí se třídí i podle vlny, a to podle několika hledisek – charakteru vlny, utváření rouna, jemnosti vlny, délky vlny, počtu ročních stříží, lesku vlny, barvy vlny a kůže. Nejčastější způsob klasifikace plemen je podle užitkového typu. Toto členění může být různé, a to s ohledem na výrobní zaměření, chovatelské podmínky a počet chovných plemen. U nás se vžilo následující označení užitkových typů: kombinovaný vlnařsko-masný (merinolandschaf, žírné merino, bergschaf apod.), masný (suffolk, charollais, texel, oxford down aj.), dojný (východofríská, lacaune, assaf atd.) a plodný (romanovská, finská, olkuská) (Horák et al. 2004, Sambraus 2006).
3
Rozdílné chovatelské podmínky, různé systémy chovu, užitkové zaměření a tradice jsou důležité faktory při rozhodování o vhodnosti plemene. Vzhledem k přírodním a klimatickým podmínkám v rámci České republiky je vedle čistokrevné plemenitby chov ovcí zaměřen na ověřené systémy užitkového křížení, které využívá vyšší užitkovosti a odolnosti u nově vzniklých kříženců. Nejpočetnějším masným plemenem rozšířeným v našich výrobních oblastech a chovatelských systémech je plemeno suffolk. Mezi kombinovanými plemeny převládají ovce šumavské a plemeno romney. Dojná a plodná plemena zastupuje ovce východofríská, romanovská a olkuská (Horák et al. 2004, Roubalová 2011).
2.1.4 Specifika trávicího traktu Trávicí soustava umožňuje příjem a trávení potravy, vstřebávání živin a vylučování nestrávených zbytků potravy z těla. Trávicí soustava se také spolupodílí na udržování stálosti vnitřního prostředí, na hospodaření s vodou a minerálními látkami, na ochraně organismu před toxickými látkami a proti mikroorganismům (Cibulka et al. 2011, Marvan et al. 2003). Trávicí ústrojí má u všech druhů hospodářských zvířat velmi podobnou stavbu, která vykazuje s ohledem na charakter potravy druhové rozdíly ve funkci a velikosti jednotlivých orgánových oddílů. V důsledku přizpůsobení se konkrétnímu typu přijímané potravy mohou být zvířata rozdělena na masožravce, všežravce a býložravce. U masožravců je trávicí trakt přizpůsoben pro příjem koncentrované potravy, jejich žaludek je malý, tenké i tlusté střevo kratší, takže trávení trvá pouze několik hodin. U býložravců se některé orgány (předžaludek) zformovaly na rezervoár potravy, do kterého mohou přijímat velké množství rostlinné hmoty určené k následnému trávení. V této souvislosti došlo k prodloužení střeva, ve kterém může být těžko stravitelná potrava trávena i několik dní. Ke strukturálním adaptacím patří i rozdílné utváření zubů u býložravců (mohutně vyvinutý chrup je přizpůsoben k drcení hrubé potravy) a rovněž jejich slinné žlázy jsou více vyvinuté než u masožravců (na 1 kg přijaté čerstvé trávy se vyloučí asi 0,5 l slin, na 1kg sena 4-5 litrů) (Cibulka et al. 2011, Marvan et al. 2003, Miholová a Lipský 1984). U přežvýkavců, u nichž je trávicí ústrojí nejlépe přizpůsobeno k využití rostlinné stravy bohaté především na celulózu, tvoří v břišní dutině rozsáhlé ústrojí předžaludek a žaludek. Předžaludek se skládá ze tří částí, které vznikly jako rozšířeniny jícnu. 4
Jsou to bachor (rumen), který je největší, čepec (reticulum) a kniha (omasum). V předžaludku podléhá potrava fyzikálním změnám a mikrobiálnímu trávení, které je zabezpečeno anaerobními bakteriemi a nálevníky. Vlastním žaludkem přežvýkavců je slez (abomasum), ve kterém je potrava vystavena účinkům kyselé žaludeční šťávy. Tím se přežvýkavci zásadně liší od nepřežvýkavých býložravců, u nichž dochází k trávení celulózy až v tlustém střevě (Cibulka et al. 2011, Marvan et al. 2003, Miholová a Lipský 1984).
2.1.5 Nejčastější parazitární onemocnění ovcí Podnebí v naší geografické oblasti a intenzivní vypásání větších pastevních areálů umožňuje rozvinutí vývojových cyklů mnoha parazitů ovcí. Silné parazitární infekce nezpůsobují pouze ztráty přímé (vyšší úhyn a nižší kvalita masa), ale i nepřímé, které se projevují snížením produkce (výrazně zhoršená užitkovost), negativním vlivem na reprodukci (významně snížená plodnost) a zvýšením vnímavosti k jiným onemocněním (sekundárně vystupňovaný úhyn) (Horák et al. 2012, Kuchtík et al. 2007). Podle lokalizace parazitů na hostiteli nebo uvnitř hostitele dělíme parazity na vnější (ektoparazité) a na vnitřní (endoparazité) (Horák a Scholz 1998). 2.1.5.1 Ektoparazitózy ovcí Svrab (prašivina) Svrab ovcí je nakažlivé rychle šířící kožní onemocnění projevující se těžkým postižením kůže se zánětem a svěděním. Jeho původcem jsou zákožky rodu Sarcoptes (postihující zejména hlavu), Psoroptes (především na krku, hřbetě, bocích a kořenu ocasu jsou považovány za nejzávažnější) a Chorioptes (nacházený obvykle na končetinách u beranů). Svrab propuká zejména v zimních a jarních měsících v důsledku oslabení z neplnohodnotné stravy. Diagnóza se stanoví nálezem zákožek v seškrabech z kůže. Léčba se provádí ivermektinovými injekčními přípravky nebo koupelemi, případně lokálním ošetřením syntetickými pyrethroidy (Axmann a Sedlák 2008, Vějčík 2007). Klošovitost Klošovitost je u ovcí poměrně častá ektoparazitóza, způsobuje ji 5-7 mm velký kloš ovčí (rod Melophagus), jehož celý vývoj se odehrává v rouně. Kloši sají krev, dráždí 5
zvířata a také přenáší další infekční choroby. K terapii klošovitosti se využívá stejných přípravků jako při léčbě svrabu, za nejúčinnější jsou považovány koupele ostříhaných ovcí (Horák et al. 2012, Kuchtík et al. 2007). Vši a všenky Jejich výskyt je zejména v zimním období při ustájení ovcí v ovčíně. Tito parazité zneklidňují chovaná zvířata při svém pobytu na kůži nabodáváním jejich pokožky. K terapii se používá stejných preparátů jako při výskytu prašiviny (Axmann a Sedlák 2008, Kuchtík et al. 2007). Myiáze Tímto termínem se označuje napadení živých zvířat larvami hmyzu. Nejzávažnější zdravotní problémy způsobují larvy much (rod Lucilia, Calliphora), které se po nakladení vajíček samičkami vyvíjejí ve velkém počtu v drobných rankách a oděrkách kůže. Vylíhlé larvy se zavrtávají do kůže, kde velmi často navozují sekundární bakteriální infekci a těžký zánět vedoucí k celkové sepsi a častému úhynu zvířete. Léčba je založena na individuálním ošetření, jež zahrnuje ostříhání vlny v postižené krajině, odstranění larev a ošetření ložiska dezinfekčními, antibiotickými a insekticidními přípravky (Horák et al. 2012, Vějčík 2007). Mezi myiáze patří i střečkovitost, jejímž původcem je střeček ovčí (Oestrus ovis). Samičky střečka nalétávají na ovce a kladou jim do okolí nozder larvy, které vnikají do horních cest dýchacích případně do paranazálních dutin, výjimečně i do mozku. Toto onemocnění je charakterizováno chronickým zánětem nosních a hlavových dutin, které může vyvolat až v 80 % uhynutí zvířat udušením. V současné době není střečkovitost v našich chovech rozšířena, vyskytuje se však v okolních státech (Jagoš et al.1982, Vějčík 2007). 2.1.5.2 Endoparazitózy ovcí Motoličnatost Původcem tohoto onemocnění jsou tři druhy: motolice jaterní (Fasciola hepatica) parazitující v játrech, motolice kopinatá (Dicrocoelium dendriticum) parazitující ve žlučovodech i v játrech a motolice Paramphistomum spp. parazitující v předžaludcích ovcí. Motolice ke svému vývoji potřebují mezihostitele a to suchozemské plže 6
a mravence, jejichž pozřením se zvíře nakazí. Klinické příznaky zahrnují výskyt průjmů, hubnutí, narušení funkce jater, žloutenku, anémii, otoky mezisanační a zhoršení výživného stavu. K terapii se nejčastěji využívají perorálně aplikované benzimidazolové preparáty popřípadě injekční přípravky na bázi avermektinu, jež musejí obsahovat speciální složku zajišťující účinnost proti motolicím (klorsulon) (Axmann a Sedlák 2008, Jagoš et al. 1982). Tasemničnatost Tasemničnatost je parazitóza vyvolávána tasemnicemi rodu Moniezia (Moniezia expansa, M. benedini), jež cizopasí v tenkém střevě ovce. Dorůstají v něm až 8 cm denně a dosahují v dospělosti celkové délky až 4 m. Zralé články s vajíčky parazita odcházejí do vnějšího prostředí trusem, kde probíhá vývojový cyklus přes mezihostitele, kterými jsou půdní roztoči čeledi Orobatidae. K nakažení dalších jedinců, nejčastěji jehňat, dochází na pastvě pozřením roztočů, kteří za vlhka migrují na vrcholky travin. Ke klinickým příznakům patří poruchy trávení, průjmy, hubnutí, křeče a častý úhyn. Podstatný je i sekundární důsledek infekce, kterým je porušení střevní bariéry a rozvoj dalších bakteriálních infekcí, především enterotoxémie ovcí. K léčbě se opět používají benzimidazolové preparáty, které však musejí být podány ve dvojnásobných dávkách (Černošek et al. 1989, Kuchtík et al. 2007). Vrtohlavost Toto onemocnění vyvolává larvální stádium (boubel) tasemnice psí (Polycephalus multiceps), která žije ve střevě psovitých šelem. Ovce se nakazí při pastvě vajíčky tasemnice, která se dostala trusem psa na trávu. Z vajíček se ve střevech ovcí uvolňují larvy (onkosféry), které jsou krví a lymfou zanášeny do mozku. Zde se usazují a přeměnují v larvocysty (boubel). Shluk boubelů dorůstá do velikosti slepičího vejce a svým tlakem způsobuje atrofii mozkové tkáně. Charakteristickými příznaky jsou nekoordinované pohyby a křeče, zvířata se pohybují do kolečka, po celkovém vysílení hynou. Terapie se v našich chovech neprovádí. Důležitým opatřením je pravidelné odčervování psů a bezpečná likvidace hlav napadených ovcí (Jagoš et al. 1982, Vějčík 2007).
7
Kokcidióza V poslední době výrazně narůstá podíl primárních infekcí, kdy jsou kokcidie jediným zdrojem nemocnosti u jehňat. Toto onemocnění způsobuje několik druhů jednohostitelských kokcidií, které jsou nepřenosné na jiná hospodářská zvířata. Klinicky se kokcidióza u jehňat projevuje krvavými průjmy, teplotami, nechutenstvím a rychlým hubnutím. U starších kusů pozorujeme ojedinělý nález vajíček kokcidií v trusu bez jakýchkoli klinických příznaků. Tato skutečnost je dána jejich věkovou rezistencí, kterou zvířata získávají ve věku 5 až 6 měsíců. Včasná léčba je nezbytná, používají se preparáty na bázi toltrazurilu a sulfonamidy (Horák et al. 2012, Vějčík 2007). Plicní červivost Plicní červivost je souhrnné označení pro onemocnění dýchacích cest a plic vyvolané několika druhy parazitů. Poměrně častě jsou u ovcí rozšířeny tzv. malé plicní hlístice. Jde především o plicnivku obecnou (Müllerius capillaris) a o plicnivku kozí (Protostrongylus rufescens). Jsou to drobní vláskovití červy, pouze 15 až 40 mm velcí, kteří parazitují v průduškách plic a způsobují zde lokální záněty tkáně. Oba druhy mají složitý nepřímý vývoj přes mezihostitele, kterými jsou suchozemští plži. Larvy parazita odcházejí z hostitele trusem a vnikají do plžů, kde dospívají v infekční stádia. Zvířata se nakazí na pastvě příjmem kontaminovaného porostu (larvy a mezihostitelé). Klinické příznaky se projevují většinou pouze kašlem. K léčbě se využívají benzimidazolové nebo ivermektinové přípravky (Axmann a Sedlák 2008, Vějčík 2007). Mezi velké plicní hlístice patří plicnivka ovčí (Dictyocaulus filaria), která je až 100 mm dlouhý bělavý nitkovitý červ. Tento parazit prodělává přímý vývoj v hostiteli, kde se usazuje v jeho průdušnici a v průduškách. Přenos, příznaky a léčba nemoci jsou stejné jako u malých plicnivek (Jagoš et al. 1982, Vějčík 2007). Slezová a střevní červivost Gastrointestinální hlístice patří mezi nejčastější a nejrozšířenější skupinu cizopasníků u ovcí. V běžných chovech neexistuje zvíře bez těchto parazitů, vyskytují se prakticky u každého jedince a skoro vždy jde o smíšenou infekci více rodů. Moderní odčervovací programy dnešní doby tyto hlístice potlačují a udržují na určité nízké úrovni tak, aby si zvířata mohla vytvořit vlastní imunitu a nebyla ohrožována na zdraví a životě (Langrová et al. 2007). 8
Původcem tohoto onemocnění jsou rody oblých červů, které parazitují ve slezu (Haemonchus,
Ostertagia),
v tenkém
střevě
(Trichostrongylus,
Nematodirus,
Bunostomum) a v tlustém i slepém střevě (Chabertia, Oesophagostomum, Truchuris). Jejich délka dosahuje od 10 do 50 mm, jsou vláskovitého nebo nitkovitého tvaru. Zdrojem nákazy jsou nemocná zvířata, která vylučují s trusem vajíčka výše uvedených parazitů. Následně se z vajíček líhnou larvy schopné pohybu ve vnějším prostředí. Tyto infekční larvy jsou pak spásány dalšími zvířaty. Vývoj tak probíhá bez mezihostitelů. Klinické příznaky závisí na věku a stavu zvířete a na druhu původců. Typickým projevem parazitózy je nechutenství a průjem velmi často s příměsí krve. Později může nastat anémie, tj. bledost spojivky a sliznic. Dochází k hubnutí, objevují se nezánětlivé otoky na spodině břišní, zhoršuje se růst i kvalita vlny. Pokud nejsou zvířata léčena, zaostávají silně ve vývinu a může dojít až k jejich úhynu. K terapii se využívají benzimidazolové nebo ivermektinové přípravky (Jagoš et al. 1982, Kuchtík et al. 2007).
2.2 Haemonchus contortus K nejvýznamnějším parazitárním onemocněním, která omezují přežití a produktivitu malých přežvýkavců (ovcí a koz), patří infekce vyvolané oblými červi (Nematoda) čeledi Trichostrongylidae (Waller a Chandrawathani 2005). Celosvětově nejnebezpečnějším
a
nejrozšířenějším
patogenním
hlístem
je
Haemonchus contortus známý také jako vlasovka slezová. Tento krev sající parazit se přisaje ke sliznici slezu, kterou následně naruší pomocí malého zubu uloženého v ústní kapsuli. Je pravděpodobně jediným nematodem, jenž může být přesně diagnostikovaný bez pomoci složitých laboratorních testů. Ačkoliv se vyskytuje ve smíšených infekcích s ostatními hlísty, jeho vajíčka vždy v trusu na pastvinách dominují. Nejčastějším klinickým projevem haemonchózy je anémie a poruchy zažívacích orgánů (Langrová et al. 2007, Waller a Chandrawathani 2005). Výskyt této parazitózy je běžný v podhorských a zaplavovaných pastvinách, v deštivém období hlavně v létě. Ekonomické ztráty vznikají hynutím (především jehňat), snížením přírůstků, snížením produkce vlny i mléka a zaostáváním ve vývinu (Jagoš et al. 1982).
9
2.2.1 Systematické zařazení Systematické zařazení parazita do taxonomie: Říše:
Animalia
Podříše:
Metazoa
Kmen:
Vermes
Podkmen:
Nemathelmintes
Třída:
Nematoda
Podtřída:
Secernentea
Řád:
Rhabditida
Podřád:
Strongylata
Čeleď:
Trichostrongylidae
Rod:
Haemonchus
Druh:
Haemonchus contortus
(Kotrlá a Kotrlý 1977, Laštůvka et al. 2001, Ryšavý et al. 1989)
2.2.2 Morfologie Hlístice rodu Haemonchus mají protáhlé až niťovité tělo válcovitého průřezu, nesegmentované a pokryté odolnou kutikulou. Na předním konci těla je ústní aparát, který tvoří rudimentární ústní kapsula s ostrým kyjovitým zubem, pomocí něhož paraziti narušují cévy. Ocasový konec je tupě kuželovitý. Pohlaví je oddělené, přičemž samičky jsou charakteristické svými bílými vaječníky, které prosvítají a dávají vzhled spirálně stočené růžovobílé stužky (viz Obr. 1). Tělo samců je červeně zbarvené (Erhardová et al. 1953, Horák a Scholz 1998, Lax 1956). Sameček má délku 14-22 mm a šířku 0,287-0,389 mm. Zadní konec těla tvoří kopulační burza (bursa copulatrix), která je tvořena dvěma bočními (laterálními) laloky a jedním malým hřbetním (dorzálním) lalokem. Všechny tyto laloky jsou vyztuženy různě uspořádanými žebry. Součástí samčí pohlavní soustavy jsou také pomocné kopulační orgány tzv. spikuly a gubernákulum. Spikuly jsou tmavohnědé barvy a měří
10
0,394-0,486 mm. Gubernákulum je světlejšího zbarvení než spikuly a měří 0,198-0,261 mm (Kotrlá a Kotrlý 1977, Ryšavý et al. 1989). Samička je 17-28 mm dlouhá a 0,378-0,564 mm široká. Pohlavní otvor samiček (vulva) leží 2,8-4,5 mm od konce těla a je krytý nápadným kutikulárním záhybem (Kotrlá a Kotrlý 1977, Lax 1956). Tvar vajíček u druhu Haemonchus contortus je velmi kolísavý. Mohou být široce oválná, pravidelná nebo naopak zcela asymetrická. Jsou kladena samičkami v rozrýhovaném stavu do 4-16 velkých blastomer, které vyplňují uvnitř celý prostor. Blastomery jsou šedě zbarvené, jejich střed je však světlý a jasný, čímž jsou velmi charakteristické a dají se tímto dobře rozeznat od vajíček jiných druhů (viz Obr. 2) (Ryšavý a Erhardová 1953).
Obr. 1 Samička Haemonchus contortus
Obr. 2 Vajíčka Haemonchus contortus
Převzato z: http://www.nematodes.org
Převzato z: http://www.merckmanuals.com 11
2.2.3 Vývojový cyklus a způsob přenosu Haemonchus contortus patří mezi hlístice s přímým životním cyklem, který probíhá jednak v hostiteli (endogenní fáze) a také ve vnějším prostředí hostitele (exogenní fáze). Dospělá samička parazita je velice plodná, klade průměrně 5000 vajíček denně. Z vajíček se na vzduchu za 14–17 hodin vylíhne larva 1. stádia (L1), která cestuje po vlhké trávě do různé vzdálenosti od trusu. Odolnost larev prvního stádia vůči teplotním a vlhkostním výkyvům je malá, také druhé larvální stádium je málo odolné. Pokud by zvíře tuto larvu pozřelo, byla by v žaludku strávena, aniž by byla schopna vyvolat nákazu. Teprve za 6-8 dní od vylíhnutí, kdy již larva prodělala druhé svlékání, se stává velmi odolným infekčním stádiem (L3). Na pastvině se infekční larvy rozlézají nejen horizontálně, ale i vertikálně. Migrace a délka života těchto larev závisí na různých podmínkách vnějšího prostředí. Mezi 3 hlavní faktory patří teplota, vlhkost a intenzita světla. Ve velké většině případů je na vrcholcích stébel a listů trav největší počet larev v časném ránu (za rosy), večer a v noci. Počet larev závisí na výšce a bujnosti travního porostu (Lax 1956, Kotrlá et al. 1984, Ryšavý a Erhardová 1953). Hostitelské zvíře se nakazí při pastvě spolknutím infekční larvy, která je v předžaludku zbavena kutikuly. Následně cestuje do žaludku, kde se mění a vytváří během 48 hodin čtvrté larvální stádium (L4). Larva 4. stádia se zavrtává do sliznice a začíná sát krev. Po několika dnech se vrací na povrch žaludku a přeměňuje se v dospělého jedince (L5). Tito dospělci se přichycují ke sliznici slezu, během 14-21 dní začínají produkovat první vajíčka (viz Obr. 3) (Elsheikha a Khan 2011, Ryšavý a Erhardová 1953).
Obr. 3 Životní cyklus parazitického hlísta Haemonchus contortus Modifikováno dle: http://www.farmanimalhealth.co.uk 12
2.2.4 Klinické příznaky a patologické nálezy Parazité škodí hlavně tím, že způsobují změny na sliznici slezu, což vede ke špatné funkci zažívacích orgánů. Zvíře nemá dostatek potřebných výživných látek. Jelikož se hlísti živí krví a průměrně jeden dospělý červ vysaje hostiteli 0,05 ml krve denně, dochází při těžkých infekcích k postupné progresivní chudokrevnosti. Vylučovanými toxiny a produkty svého metabolismu působí cizopasníci pomalou otravu u nakažených zvířat. Škodlivé zplodiny často poškozují srdce (Kotrlá et al. 1984, Páv et al. 1981, Ryšavý a Erhardová 1953). Haemonchóza může proběhnout podle síly infekce akutně nebo chronicky. Po masivním napadení nastane taková náhlá ztráta krve, což způsobí úhyn zvířat již během několika málo dní. V případě mírnější infekce se výživný stav ovcí postupně zhoršuje. Zvířata ubývají na váze, ztrácí odolnost vůči všem tělesným zatížením, slábnou, pomalu chodí, snadno padají, zůstávají ležet a nemohou se ihned postavit. Později se objevují otoky na různých částech těla, hlavně v krajině břišní a na hlavě. Zvířata trpí nechutenstvím, objevují se řídké průjmy mnohdy s příměsí krve. V okolí konečníku a na spodní ploše ocasu je srst slepena zaschlým trusem. Sliznice a spojivky jsou nápadně bledé. Vlna je rozcuchaná, lámavá a bez lesku. Tělesná teplota bývá zvýšená (až 40-40,5°C). Nemocné ovce se obvykle vyhýbají ostatním, trpí depresí a vždy stojí s vyklenutým hřbetem stranou. Při zimním nedostatku potravy a vysokém stavu sněhu se přidružují další bakteriální infekce. Snižuje se odolnost proti jiným parazitózám a dochází k úhynu. Nejvíce jsou ohrožena jehňata, u nichž dochází až ke 100 % uhynutí (Kotrlá et al. 1984, Lax 1956, Slanina et al. 1991). V krvi klesá hladina hemoglobinu, zrychluje se sedimentace erytrocytů a enormně se zvyšuje počet leukocytů. Patologickým nálezem je zarudlá sliznice slezu s četnými krváceninami, které se objevují už za týden po infekci. Krev vytékající z ran do dutiny slezu zabarvuje jeho obsah do hněda. Funkční tuk může vymizet a nahrazuje ho rosolovitá hmota. V tělních dutinách je čirý transsudát. Po uhynutí zvířete se nachází ve slezu mnoho živých, v tekutém obsahu čile se pohybujících haemonchů. Jejich počet může být různý, avšak u jedné ovce je maximálně 16 000 haemonchů (viz Obr. 4) (Lax 1956, Slanina et al. 1991).
13
Obr. 4 Haemonchus contortus ve slezu - vlastní fotografie prof. RNDr. Jiří Lamka, CSc.
2.2.5 Diagnóza Diagnóza se stanoví na základě zjištěných klinických příznaků. Tuto diagnózu lze potvrdit mikroskopickým vyšetřením odebraných vzorků trusu. K zjišťování parazitů se nejlépe osvědčuje metoda flotační, která umožní rychlou a spolehlivou diagnostiku na živém zvířeti. Podrobnější popis flotační metody je uveden v experimentální části. Pokud některá z nemocných ovcí uhyne nebo je zabita, naskýtá se možnost potvrdit diagnózu
stanovenou
u
živého
zvířete
pitvou
jejího
těla
(Lax
1956,
Ryšavý a Erhardová 1953). Napadení hlístem je spojeno s výskytem anémie. Stupeň anémie lze zjistit na spojivkovém vaku zvířete pomocí tzv. FAMACHA systému. Jedná se o levný, rychlý a snadno proveditelný test, který pomocí barevné skórovací karty hodnotí zabarvení sliznice spodního víčka u ovce. Tmavě červená barva značí zdravé zvíře (Obr. 5). Světle červená, růžová a světle růžová ukazuje rostoucí úroveň chudokrevnosti. Bílá barva je typická pro těžkou anémii (viz Obr. 6). Tento kontrolní test byl vyvinut v Jižní Africe za účelem včasného záchytu infekce parazitem Haemonchus contortus u malých přežvýkavců. Používáním FAMACHA systému lze zjistit, jak moc zvířata trpí haemonchózou, která z nich je potřeba odčervit a která není nutno odčervovat. Díky této metodě se snižují náklady antiparazitické léčby a také se zpomaluje výskyt rezistence na anthelmintika (Van Wyk et al. 2006). 14
Obr. 5 FARMACHA diagnostická karta u zdravého zvířete – vlastní fotografie prof. RNDr. Jiří Lamka, CSc.
Obr. 6 FARMACHA diagnostická karta u těžce nemocného zvířete - vlastní fotografie prof. RNDr. Jiří Lamka, CSc.
2.2.6 Terapie K terapii haemonchózy se používají antinematoda. Antinematoda jsou řazena do skupin makrocyklických laktonů, benzimidazolů, imidazothiazolů, léčiv ostatních 15
chemických struktur a v současnosti se k nim řadí i aminoacetonitrilový derivát monepantel (AISLP 2012, Lamka a Ducháček 2008). Makrocyklické laktony Jedná se o léčiva biosyntetického původu s antinematodní a antiektoparazitární účinností. Původně tradovaný mechanismus účinku, který byl spojován výhradně s ovlivněním GABA neurotransmise na nervových vláknech parazitů, byl novějšími studiemi opraven tak, že nejvýznamnější roli na receptorech ovládajících chloridové kanály hraje glutamát. Makrocyklické laktony žádoucím směrem pozměňují funkčnost tohoto neurotransmiteru. GABA hraje roli pouze podružnou (Lamka a Ducháček 2008). Ivermektin je historicky prvním léčivem avermektinové skupiny, který stále patří mezi nejvýznamnější makrocyklické laktony a zároveň i veterinární léčiva používaná v ČR u ovcí. Také u přípravků na bázi doramektinu lze nalézt druhovou indikaci pro ovce (AISLP 2012, Lamka a Ducháček 2008). Benzimidazoly Skupina benzimidazolových anthelmintik je nejrozsáhlejší skupinou antinematod odvozenou od jedné chemické struktury. Část benzimidazolů patří mezi anthelmintika s nejširším spektrem účinku. Mechanismus účinku je založen na inhibici β-tubulinových subjednotek, které jsou nezbytné pro tvotbu mikrotubulů v buňkách parazitů. Jejich narušená tvorba se projeví poškozením funkčnosti celé parazitární buňky. Afinita benzimidazolů k parazitárnímu typu β-tubulinu je mnohonásobně vyšší než k β-tubulinu buněk ošetřovaných zvířat, což umožňuje účinné dávkování bez vedlejších projevů u léčených zvířat (Lamka a Ducháček 2008). Druhovou indikaci pro ovce lze nalézt v ČR u přípravků na bázi albendazolu a fenbendazolu (AISLP 2012). Imidazothiazoly Imidazothiazoly patří k dlouhodobě užívané skupině anthelmintik, která má výhradně antinematodní účinky. Mechanismus účinku je založen na stimulaci nikotinových acetylcholinových receptorů, která vede ke svalové paralýze hlístů a jejich vyloučeni z těla hostitele (Lamka a Ducháček 2008, Sutherland a Scott 2009).
16
Do této skupiny patří léčivo levamisol. V současné době nejsou na bázi levamisolu dostupné v ČR žádné přípravky určené přímo pro ovce (AISLP 2012, Lamka a Ducháček 2008). Léčiva ostatních chemických struktur K těmto léčivům se řadí tetrahydropyrimidiny, jejichž mechanismus účinku je stejný jako u skupiny imidazothiazolů, tzn. že působí také jako agonisté nikotinových receptorů na nervosvalových ploténkách (Sutherland a Scott 2009). Mezi tetrahydropyrimidinová léčiva patří morantel a jeho derivát pyrantel. V současnosti nejsou na bázi morantelu a pyrantelu dostupné v ČR žádné přípravky, které by byly přímo určené pro ovce (AISLP 2012, Sutherland a Scott 2009).
2.2.7 Prevence Vzhledem ke skutečnosti, že napadení pouze jedním druhem parazita je v našich chovech vzácné a naopak je častá koexistence několika endoparazitů, je při prevenci životně nutný systémový přístup. Doba odčervení, jeho četnost a volba použitého preparátu je založena na druhovém nálezu parazitů při kontrolním vyšetření a na počtech parazitárních vajíček v trusu. „Ideální anthelmintikum“ by mělo být především bezpečné, vysoce efektivní, rychle a úplně metabolizované, ekonomické a kompatibilní s dalšími léky (Horák et al. 2012). Strategie prevence musí splňovat následující kritéria: 1. Zabránit těžkým infekcím, u nichž dochází k velmi častým úhynům. 2. Snížit kontaminaci pastvin vývojovými stádii jednotlivých parazitů. 3. Minimalizovat dopady parazitóz na užitkovost zvířat. 4. Sledovat koprologickým vyšetřením účinnost odčervení a vývoj rezistence parazitů. Ke splnění těchto bodů by měl mít každý větší chov ovcí účinný odčervovací program. Zásadní chybou je odčervování „naslepo“. Každému odčervení stáda by mělo předcházet koprologické vyšetření, které určí druhy parazitů, počet jejich vajíček a zda je nutné podat anthelmintikum. Za tímto účelem se odebírá směsný vzorek trusu, ve kterém je zastoupen čerstvý trus 5 až 10 %. Pokud odčervení není nutné, hrozí riziko, že zbavíme stádo i toho množství střevních parazitů, které potřebuje k formování svoji imunity. Takový zákrok je velmi kontraproduktivní, protože stojí jen peníze a úsilí. S ohledem na zabránění vzniku parazitární rezistence musí být dodrženo dávkování
17
anthelmintických přípravků, které by mělo být voleno spíše na horních hranicích doporučených dávek, než aby byl preparát poddávkován. Samozřejmou nutností je odčervení všech zvířat ve stádě (Axmann a Sedlák 2008). Do programu prevence musí být zapracováno i střídání pastvin. Část pastvin (minimálně třetinu) je nezbytné celoročně pouze sekat a v daném roce na nich stádo vůbec nepást. Možný přístup ultrafialového záření na půdní plochu a přerušení vývojových cyklů helmintů způsobí na dané pastvině larvální mortalitu. Takováto pastvina je následující rok „čistá“ a je připravena k první pastvě stáda nebo k pastvě stáda po odčervení (Kuchtík 2007). Současně s těmito opatřeními je nutné dodržet základní zoohygienická pravidla (hygienu ovzduší, půdy, vody, staveb zvířat, výživy zvířat a asanaci prostředí). Zvířata nestresovaná, dobře a kvalitně krmená, mají podstatně vyšší šanci odolat jakýmkoli parazitózám. Značný význam mají také meliorace, pravidelné ošetření a hnojení pastvin dusíkatými hnojivy (Jagoš et al. 1982, Langrová et al. 2007).
2.3 Farmakoterapie helmintóz Helmintózy patří mezi infekční choroby, které jsou způsobené červy nebo jejich infekčními stádii. K nejrozšířenějším se řadí infekce vyvolané tasemnicemi (Cestoda), motolicemi (Trematoda) a hlísticemi (Nematoda). Zvířata jsou hostitelem těchto červů, jejichž vývojové cykly probíhají ve vnitřním prostředí hostitele a mezihostitele (biohelmintózy) nebo výhradně v životním prostředí zvířat (geohelmintózy). Vztah hostitele a červa je vztahem parazitickým (Lamka a Ducháček 2008). Prevence a léčba helmintóz využívá velmi rozsáhlé skupiny značně různorodých léčiv s anthelmintickými účinky. Anthelmintika jsou většinou syntetického a částečně biosyntetického původu (Lamka a Ducháček 2008).
2.3.1 Rozdělení anthelmintik Podle anthelmitického účinku se léčiva dělí na anticestoda, antitrematoda a antinematoda.
18
Anticestoda Cestodózy jsou parazitologicky skupinou menšího rozsahu postihující především domácí býložravce, masožravce, ale i ryby. Potlačování cestodóz je možné buď zásahem do vývojového cyklu tasemnic v definitivním hostiteli (užití léčiv) nebo ovlivněním populací mezihostitelů (zoohygienická opatření). Anticestoda jsou chemicky velmi rozdílnou skupinou, zahrnují benzimidazoly a léčiva ostatních chemických struktur (niklosamid, praziquantel, epsiprantel, nitroskanat a arekolin) (Lamka a Ducháček 2008). Antitrematoda Trematodózy jsou z parazitologického hlediska velmi závažnou skupinou helmintóz, které způsobují u užitkových a volně žijících zvířat poměrně velké škody. Boj proti trematodózám lze směřovat na potlačení dospělých a omezeněji nedospělých stádií v definitivním hostiteli (užití léčiv) nebo na narušení vývojových cyklů motolic ovlivněním jejich mezihostitelů (zoohygienická opatření). Některá antitrematoda účinkují také antiektoparaziticky. Mezi nejdůležitější zástupce této skupiny patří benzimidazoly, halogenované salicylanilidy (rafoxanid) a léčivo klorsulon (Lamka a Ducháček 2008). Antinematoda Nematodózy jsou nejrozsáhlejší skupinou helmintóz, které se vyskytují prakticky u všech druhů hospodářských a zájmově chovaných zvířat. Předcházení a aktivní kontrola nematodóz je založena na kombinaci zoohygienických opatření a podávání antinematodik. V terapii se uplatňují léčiva ze skupiny makrocyklických laktonů, benzimidazolů, imidazothiazolů a léčiv ostatních chemických skruktur (pyrantel, oxantel a nitroskanat) (Lamka a Ducháček 2008).
2.3.2 Helmintorezistence Helmintorezistence je definována jako genetická změna ve schopnosti parazitů snížit účinnost anthelmintik. Původně na anthelmintika citlivá populace parazitů dědí schopnost přežít a vyhnout se toxickým účinkům léků po opakovaném podání (Várady et al. 2011).
19
Rezistence se stala významným veterinárním a chovatelským problémem, jenž se týká gastrointestinálních hlístů u malých přežvýkavců. Tento problém se rozvíjí především
u
hlístů
Haemonchus
contortus,
Teladorsagia
circumcincta,
Trichostrongylus colubriformis, Ostertagia spp. a Cooperia spp., kteří parazitují v Austrálii, na Novém Zélandě, v mnoha evropských zemích, v některých státech Asie a na obou amerických kontinentech (Várady et al. 2011). V současné době existuje helmintorezistence u všech tří skupin komerčně dostupných anthelmintik – benzimidazoly, imidazothiazoly a makrocyklické laktony. Odhaduje se, že rezistence na benzimidazolová anthelmintika se vyskytuje až na 90 % farem. Podobně rozšířená, až na 80 %, se uvádí rezistence na další skupinu anthelmintik imidazothiazoly. Nižší úroveň výskytu, okolo 70 % farem, je odhadována u anthelmintik ze skupiny makrocyklických laktonů (Várady et al. 2011). Helmintorezistence může vzniknout díky několika mechanismům, např. změna v cílových buňkách způsobí to, že je již léčivo nikdy více nerozpozná a stává se tak neúčinným. Také změna metabolismu a změna v distribuci léčiva do cílového organismu zabrání správnému účinku léčiva. Benzimidazolová anthelmintika působí přes inhibici polymerizace tubulinu, který je důležitý k budování mikrotubulů. Proto je jasné, že rezistence souvisí s mutacemi na β-tubulinových genech, které zabraňují navázání léčiva. Cholinergní anthelmintika působí jako agonisté na nikotinových acetylcholinových receptorech umístěných na neuromuskulární ploténce parazitů a tím vyvolávají jejich spastickou paralýzu. Rezistenci vyvolávají změny v nikotinových receptorech. Makrocyklické laktony působí na iontové kanály, převážně na glutamátové a GABAergní chloridové kanály. Mechanismus vzniku rezistence souvisí s mutacemi u těchto receptorů. Některé genetické studie také nalezly souvislost mezi P-glykoproteiny a rezistencí na makrocyklické laktony (Wolstenholme et al. 2004). Rostoucí počet případů rezistence si vynutil vytvořit několik in vitro a in vivo detekčních metod. Některé metody mají své nevýhody, jako jsou vysoké náklady, časová náročnost a nižší reprodukovatelnost výsledků. Nejpoužívanější in vivo metodou je test redukce počtu vajíček v trusu (Faecal Egg Count Reduction = FECR). Při této metodě se porovnává počet vajíček na gram trusu (Eggs Per Gram = EPG) v den aplikace a o 10-14 dní později. Testovaná populace hlístů je rezistentní, pokud je redukce EPG při vyšetření nižší než 95 % (Várady et al. 2011). Z in vitro testů je nejrozšířenější metodou test líhnutí larev (Egg Hatch Test = EHT), který je založen na ovocidní vlastnosti benzimidazolových anthelmintik a schopnosti 20
vajíček rezistentních populací tvořit embrya a líhnout se ve vyšší koncentraci anthelmintika benzimidazolové řady, než je to u citlivých populací hlístů. Další in vitro test, test vývinu larev (Larval Development Test = LDT), spočívá ve schopnosti larev přežívat a vyvíjet se v prostředí s různou koncentrací anthelmintik. Jiný test, test larvální paralýzy, je založen na určení procenta paralyzovaných L3 larev, které byly vystaveny různým koncentracím anthelmintik. Poslední na motilitě larev založený migračně-inhibiční test spočívá ve snížené migraci larev přes síta z jedné komůrky do druhé v přítomnosti anthelmintik (Várady et al. 2011). V rámci široké přítomnosti helmintorezistence jsou prioritou opatření, která mají za cíl zlepšit monitorování rezistence, prostudovat podstatu jejího vzniku, zpomalit její rozvoj a pochopit základní biologii parazita. Další možností potlačení rezistence je vývoj nových chemických sloučenin, aplikace účinných očkovacích látek nebo využití nechemických prostředků (Várady et al. 2011,Wolstenholme et al. 2004).
2.3.3 Léčivé přípravky použité v experimentech V experimentech byly použity léčivé přípravky na bázi albendazolu, flubendazolu a monepantelu. 2.3.3.1 Albendazol Struktura Albendazol je syntetické anthelmintikum ze skupiny benzimidazol-karabamátů. Chemicky se jedná o methyl-5-(propylthio)-2-benzimidazol-karbamát (viz Obr. 7) (Šnirc et al. 2007).
Obr. 7 Chemická struktura albendazolu
Převzato z: Woodward (2012)
Farmakodynamika Mechanismus účinku albendazolu spočívá v navázání látky na tubulin, protein nutný k tvorbě mikrotubulů, primárně v absorpčních buňkách parazitů. Výsledkem je 21
neschopnost absorpce živin s následnou redukcí glykogenu a vyhladověním parazita. Mezi tubulinem savců a helmintů existují strukturální rozdíly, proto nedochází k toxickému působení albendazolu na hostitele. Albendazol také narušuje metabolické dráhy parazitů a inhibuje jejich metabolické enzymy malát dehydrogenázu a fumarát reduktázu (Lamka a Ducháček 2008, Plumb 2011). Farmakokinetika Albendazol působí v porovnání s jinými benzimidazoly po perorálním podání rychleji a lépe se absorbuje. Po absorpci se váže na plazmatické bílkoviny v 89-92 %. Krví se dostává do jater, kde podléhá výraznému first-pass effektu. Zde je metabolizován na albendazol sulfoxid, který se pomalu oxiduje na albendazol sulfon. Tyto aktivní metabolity dosahují maximální plazmatické koncentrace za 20 hodin. Hlavní cesty vylučování jsou výkaly, moč a žluč (Plumb 2011, Šnirc et al. 2007). Indikace Albendazol je širokospektrální anthelmitikum určené k léčbě infekcí způsobených dospělými a vývojovými stádii gastrointestinálních a plicních nematod, cestod a dospělých nematod. Albendazol působí také ovocidně proti vajíčkům nematod a trematod, čímž redukuje kontaminaci pastvin. U skotu se použítí vztahuje k těmto parazitům: Ostertagia spp., Haemonchus spp., Trichostrongylus spp., Nematodirus spp., Oesophagostomum spp., Bunostomum spp., Cooperia spp., Strongyloides spp., Dictyocaulus
viviparus, Moniezia spp. a Fasciola hepatica. U ovcí se používá
u helmintóz způsobených: Ostertagia spp., Haemonchus spp., Trichostrongylus spp., Nematodirus spp., Chabertia
spp., Oesophagostomum spp., Dictyocaulus
filaria,
Moniezia spp. a Fasciola hepatica. Albendazol je také možno využít u malých savců, koz a prasat (Plumb 2011, Šnirc et al. 2007). Bezpečnost Albendazol je všeobecně dobře tolerován zvířaty, pokud je podáván v doporučených terapeutických dávkách. U některých druhů zvířat se však můžou vyskytnout nežádoucí účinky jako nauzea, vomitus a průjem. Léčivo se nesmí podávat v období laktace a gravidity (negativně ovlivňuje vývoj raných stádií plodu). Vyšší opatrnosti je třeba dbát u zvířat s poruchou jater a ledvin. Interakce s jinými veterinárními léčivými přípravky nejsou známy (Lamka a Ducháček 2008, Šnirc et al. 2007). 22
Dávkování Albendazol se podává pouze perorálně ve formě suspenze či roztoku. Jednotlivá terapeutická dávka se pohybuje v rozmezí 5-10 mg albendazolu na kg živé hmotnosti zvířete. Ochranná lhůta je v rozpětí 3-10 dnů (Lamka a Ducháček 2008). Registrované přípravky V České republice jsou v současné době registrovány tyto přípravky s účinnou látkou albendazol: Albex 10 % a.u.v. sol 1 l, Aldifal 100 mg/gm a.u.v. sus 100 ml, Aldifal 100 mg/gm a.u.v. sus 1 l, Aldifal 100 mg/gm a.u.v. sus 5 l, Aldifal 25 mg/gm a.u.v. sus 100 ml, Aldifal 25 mg/gm a.u.v. sus 500 ml, Aldifal 25 mg/gm a.u.v. sus 1 l, Aldifal 25 mg/gm a.u.v. sus 5 l (AISLP 2012). 2.3.3.2 Flubendazol Struktura Flubendazol je syntetické anthelmintikum ze skupiny benzimidazol-karabamátů. Chemicky se jedná o methyl-[5-(4-fluorobenzoyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-karbamát (viz Obr. 8) (AISLP 2012, Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives 1993).
Obr. 8 Chemická struktura flubendazolu
Převzato z: Riviere a Papich (2009)
Farmakodynamika Flubendazol účinkuje stejně jako albendazol prostřednictvím narušení funkce mikrotubulů v buňkách parazitů (viz Farmakodynamika albendazolu). Tento způsob účinku je běžný u všech benzimidazolových anthelmintik (Riviere a Papich 2009). Farmakokinetika Flubendazol
je
těžce
rozpustný
ve
vodných
systémech,
jaké
jsou
v gastrointestinálním traktu, což má za následek jeho nízkou rozpustnost a velmi nízkou 23
absorbci. Vstřebaná část účinné látky je v játrech metabolizována, dochází k hydrolýze karbamátu a redukci ketonu. Biotransformované produkty jsou poté konjugovány do glukosiduronátů nebo sulfátových konjugátů. Biologický poločas flubendazolu je 1 až 2 dny. Hlavní cesty vylučování jsou výkaly, moč a žluč (AISLP 2012). Indikace Flubendazol je širokospektrální anthelmitikum určené k léčbě i preventivnímu podání u gastrointestinálních hlístových infekcí a souvisejících chorob. U prasat se použítí vztahuje k těmto parazitům: Metastrongylus apri, Ascaris suum, Hyostrongylus rubidus, Oesophagostomum dentatum, Trichuris suis a Strongyloides ransomi. U drůbeže se používá u helmintóz způsobených: Syngamus trachea, Ascaridia galli, Heterakis gallinarum, Capillaria spp., Amidostomum anseris, Trichostrongylus tenuis a Raillietina spp. Flubendazol je také možno využít u psů, koček a ovcí (AISLP 2012, (Riviere a Papich 2009). Bezpečnost Flubendazol je velmi dobře snášen zvířaty a má široký práh bezpečnosti, nejméně 5-ti násobný. U některých druhů zvířat se však můžou vyskytnout nežádoucí účinky jako nauzea, vomitus a průjem. Vyšší opatrnosti je třeba dbát u zvířat s poruchou jater a ledvin. Kontraindikováno je podávání flubendazolu holubům a papouškům, u kterých způsobuje problémy s opeřením. Interakce s jinými veterinárními léčivými přípravky nejsou známy (AISLP 2012, Lamka a Ducháček 2008). Dávkování Flubendazol se podává perorálně ve formě prášku, pasty, tablety a premixu pro medikaci krmiva. Jednotlivá terapeutická dávka se pohybuje v rozmezí 5-22 mg flubendazolu na kg živé hmotnosti zvířete. Ochranná lhůta je v rozpětí 0-15 dnů (Lamka a Ducháček 2008). Registrované přípravky V České republice jsou v současnosti registrovány tyto přípravky s účinnou látkou flubendazol: Flubenol 5 % a.u.v. plv 600 g, Flubenol 5 % a.u.v. plv 25 kg, Flubenol 50 % a.u.v. prm 10 kg, Flubenol 50 mg/g a.u.v. prm 25 kg,
24
Flubenol KH 44 mg/ml a.u.v. pst 7,5 ml, Flumixan 50 mg/g a.u.v. prm 600 g, Flumixan 50 mg/g a.u.v. prm 12 kg (AISLP 2012). 2.3.3.3 Monepantel Struktura Monepantel je anthelmintikum patřící mezi molekuly třídy aminoacetonitrilových derivátů
Chemicky
(AAD).
se
jedná
o
N-[(1S)-1-kyano-2-(5-kyano-2-
fluoromethylphenoxy)-1-methylethyl]-4-trifluoromethylsulfanylbenzamid (viz Obr. 9) (Woodward 2012).
Obr. 9 Chemická struktura monepantelu
Převzato z: Woodward (2012)
Farmakodynamika Mechanismus
účinku
monepantelu
spočívá
v tom,
že
působí
na
nikotin-acetylcholinový receptor specifický pro hlístice, podjednotku Hco-MPTL-1. Toto je první biologická funkce, která je popsaná pro receptor Hco-MPTL-1. Proto je monepantel
účinný
proti
hlísticím
rezistentním
na
jiné
třídy
anthelmintik
(Rufener et al. 2010). Farmakokinetika Po perorálním podání se monepantel okamžitě vstřebává a oxiduje se na metabolit monepantel sulfon. Maximální koncentrace je dosažena za 24 hodin. Poté se krevní koncentrace snižuje s biologickým poločasem zhruba 5 dnů. Hlavní cesty vylučování jsou především výkaly, ale také i moč (AISLP 2012). Indikace Monepantel je širokospektré anthelmintikum určené pro léčbu a regulaci gastrointestinálních hlístových infekcí a souvisejících chorob u ovcí, včetně jehňat, 25
ročních ovcí, chovných beranů a bahnic. Spektrum účinku zahrnuje čtvrté larvální stádium a dospělé jedince následujících druhů: Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta, Teladorsagia trifurcata, Teladorsagia davtiani, Trichostrongylus axei, Trichostrongylus colubriformis, Trichostrongylus vitrinus, Cooperia curticei, Cooperia oncophora, Nematodirus battus, Nematodirus filicollis, Nematodirus spathiger, Chabertia ovina, Oesophagostomum venulosum. Monepantel účinkuje proti kmenům těchto parazitů rezistentních vůči (pro)benzimidazolům, levamisolu, morantelu, makrocyklickým laktonům a kmenům H. contortus rezistentním vůči salicylanilidům (AISLP 2012). Bezpečnost Bezpečnost nebyla stanovena pro ovce s hmotností nižší než 10 kg nebo mladší než 2 týdny. Monepantel lze používat i u březích a laktujících bahnic. Nežádoucí účinky, kontraindikace a lékové interakce nejsou zatím známy (AISLP 2012). Dávkování Monepantel se podává ve formě perorálního roztoku. Jednotlivá terapeutická dávka je 2,5 mg monepantelu na 1 kg živé hmotnosti zvířete. Ochranná lhůta pro tento veterinární přípravek je 7 dnů (AISLP 2012). Registrované přípravky V České republice je v současnosti registrován tento přípravek s účinnou látkou monepantel: Zolvix 25 mg/ml a.u.v. sol 250 ml, Zolvix 25 mg/ml a.u.v. sol 500 ml, Zolvix 25 mg/ml a.u.v. sol 1 l, Zolvix 25 mg/ml a.u.v. sol 2,5 l, Zolvix 25 mg/ml a.u.v. sol 5 l (AISLP 2012).
26
3
CÍLE PRÁCE
Cíle diplomové práce byly: 1. Vypracovat literární rešerši s tématem infekčních chorob ovce domácí se zaměřením na parazitární infekce a hlístici Haemonchus contortus 2. Spolupracovat na přípravě experimentálních podmínek potřebných k založení infekcí a na monitorování jejich průběhu 3. Být nápomocna izolacím a zpracování populací dospělých parazitů z ovcí a tyto materiály předat spolupracující biochemické skupině
27
4
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
4.1 Místo a časové rozložení experimentů Celkem byly realizovány čtyři experimenty v období březen 2011 až červenec 2012. Experiment č. 1 a č. 2 se zabýval vlivem selekčního tlaku na účinnost a metabolismus flubendazolu u Haemonchus contortus (metodika této studie viz Příloha 1). Experiment č. 3 a č. 4 se věnoval účinnosti a metabolismu flubendazolu u citlivých a rezistentních kmenů Haemonchus contortus (metodika této studie viz Příloha 2). Všechny experimentální práce byly prováděny na jehňatech z ovčí farmy v obci Běleč nad Orlicí, jejímž majitelem je pan Miloš Švec. Každý experiment začal sestavením skupiny pokusných zvířat, která byla chována pro tyto účely separovaně ve stájích, v letních obdobích byl pak zajištěn pastevní odchov. Zvířata byla vedena v centrální evidenci, jejich identifikace byla zabezpečena pomocí ušní známky s číselným kódem (centrální evidenční číslo zvířete). Všem zvířatům byl odebírán trus a vyšetřen kvalitativní metodou na přítomnost vajíček parazitů. K odčervení byla použita suspenze albendazolu v dávce 30 mg/kg ž. hm. nebo suspenze monepantelu v dávce 2,5 mg/kg ž. hm. Suspenze byla podávána podavačem tekutých lékových forem. Po odčervení byla zvířata opět vyšetřena kvalitativní metodou. V případě optimálního nálezu (tj. bez průkazu infekčních zárodků) byla podána suspenze s L3 larvami jednotlivých kmenů Haemonchus contortus. Navozená infekce byla později sledována v daných intervalech pomocí kvantitativní metody vyšetřování trusu. V případě experimentu č. 1 a č. 2 byl během infekce podáván v suspenzi flubendazol vždy ve třech po sobě jdoucích dnech v dávkách odvozených podle experimentálních nálezů jednotlivých fází studie. Na konci každého experimentu byla zvířata utracena, následně odebrány vzorky trusu a ze slezů zvířat byli izolováni dospělí červi parazita Haemonchus contortus. V experimentu č. 2 bylo za účelem diferenciace larev využito metody koprokultur pro diagnostiku infekčních larev L3. Všechny čtyři experimenty byly součástí grantového projektu číslo P502/10/0217 s názvem - Vývoj lékové rezistence u helmintů - možné mechanismy a obrana. Tato studie je řešena na Katedře biochemických věd Farmaceutické fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové pod vedením prof. RNDr. Lenky Skálové, Ph.D.
28
Veškeré experimentální práce byly schváleny Resortní odbornou komisí na ochranu zvířat proti týrání na základě žádosti o povolení projektu pokusu na zvířatech.
4.2 Experimentální zvířata V experimentech byly použity ovce plemene suffolk. Jedná se o bezrohé masné plemeno středního až velkého tělesného rámce, které bylo vyšlechtěno v Anglii na počátku 19. století. Hlava a spodní část končetin jsou pokryty černou krycí srstí až po loket a hlezno. Uši protáhlé, jemné a částečně svislé. Tělo je dlouhé, s klenutou hrudí, širokým hřbetem a velmi dobře svalnatými kýtami. Ovce jsou vysoké 60-70 cm v kohoutku, jejich živá hmotnost se pohybuje okolo 70-90 kg. Plodnost na obahněnou ovci je přes 140 %. Berani mají výšku v kohoutku 70-80cm a jejich živá hmotnost je mezi 110-140 kg. Jehňata mají dobrou růstovou schopnost a průměrný denní přírůstek okolo 450 g. Toto plemeno patří k předním celosvětově rozšířeným masným plemenům. V rámci užitkového křížení se v ČR běžně využívá již 30 let (Sambraus 2006).
4.3 Použité kmeny Haemonchus contortus K experimentálním infekcím byly použity dva různě citlivé kmeny Haemonchus contortus k anthelmintikům. Prvním z kmenů byl kmen ISE, u kterého není objevena žádná rezistence na anthelmintika a je tedy k nim plně citlivý. Druhým použitým kmenem byl kmen WR (White River), který vykazuje multirezistenci k ivermektinu, benzimidazolům, klosantelu a rafoxanidu (Bártíková et al. 2012).
4.4 Sběr a uchování vzorků V experimentech byly použity vzorky trusu. Trus byl odebírán rektálně do igelitových rukavic. Každý vzorek byl řádně označen číslem ušní známky zvířete a datem sběru. Vzorky byly uchovány do doby vyšetření v mrazničce při teplotě - 18 ºC. Koprologická vyšetření byla provedena s časovým odstupem dle možností.
29
4.5 Pracovní pomůcky, přístroje, chemikálie a materiál Pracovní pomůcky: laboratorní sklo (kádinky, odměrný válec, pipety, Petriho misky, Erlenmeyerova baňka, zkumavky), McMasterova počítací komůrka, pinzeta, podložní a krycí mikroskopická sklíčka, PVC rukavice a PVC sáčky, sítko, sklenice s uzávěry, stojánek na zkumavky, třecí miska s tloučkem Přístroje: digitální váhy KERN 440-43, světelný mikroskop DN 45, termostat Chemikálie: flotační roztok chloridu zinečnatého a chloridu sodného, voda, růstové médium vermikulit Biologický materiál: vzorky trusu odebrané z rekta, případně z distální části tlustého střeva u vyřazených kusů
4.6 Metodiky parazitologických vyšetření 4.6.1 Kvalitativní ovoskopická metoda V experimentech byla sledována přítomnost nebo nepřítomnost vajíček parazita Haemonchus contortus kvalitativní flotační metodou. Tato metoda je založena na principu, že vajíčka v roztoku těžším než je specifická váha vajíček vyplouvají na jeho hladinu (Ryšavý a Erhardová 1953). Kádinka o objemu 100 ml se naplnila flotačním roztokem chloridu zinečnatého do výšky cca 1 cm od horního okraje. S přiměřeným množstvím tohoto roztoku byly v třecí misce pečlivě rozetřeny navážené 2,0 gramy trusu. Vzniklá suspenze byla přefiltrována přes sítko do krystalizační misky, prolila se zbytkem flotačního roztoku a byla převedena do 100 ml kádinky. Kádinka s obsahem se ponechala 5 minut ustát a poté se na hladinu za pomocí pinzety položilo krycí sklíčko. Po 20 minutách bylo krycí sklíčko s vyflotovanými vajíčky opatrně vyjmuto, přiložilo se na podložní sklíčko a pod mikroskopem byla provedena identifikace vajíček (Thienpont et al. 1986). Pozitivním výsledkem se u kvalitativní metody rozumí průkaz alespoň jednoho vajíčka daného parazita. Během prvních prací byla také mikroskopicky prokázána
30
přítomnost vajíček Chabertia ovina, Nematodirus spp., Moniezia spp., Trichostrongylus spp., Trichuris ovis a oocyst kokcidií rodu Eimeria spp.
4.6.2 Kvantitativní ovoskopická metoda Ke sledování průběhu a intenzity infekce parazitárního onemocnění v hostitelském zvířeti byla použita kvantitativní ovoskopická metoda, kterou lze vypočítat a zjistit množství vajíček na gram trusu (Eggs Per Gram = EPG). Ke stanovení počtu vajíček v hodnoceném vzorku byla použita počítací komůrka (McMasterova). Komůrka se skládá z podložní skleněné desky o rozměrech 7,5 x 2,6 cm. Její horní plocha je rozdělena 3 skleněnými destičkami přesně 1,5 mm vysokými na dvě stejně velká políčka. Postranní skleněné destičky jsou 1,5 cm široké, střední 4 mm široká. Přes ně leží další skleněná destička o rozměrech 7,5 x 1,7 cm, na jejíž spodní ploše jsou vyryty dvě počítací síťky o ploše 1 cm2, rozdělené příčnými rýhami na 6 stejných dílů, které slouží k vlastnímu počítání vajíček (Komise pre laboratórnu a klinickú diagnostiku 1989). K vyšetření byly naváženy 2,0 gramy trusu, které se důkladně rozetřely v třecí misce s 20 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Takto vzniklá suspenze byla přefiltrována přes sítko do odměrného válce o obsahu 100 ml. Obsah se doplnil nasyceným roztokem chloridu sodného na celkový objem 60 ml. Před samotným plněním počítací komůrky byl obsah válce důkladně promíchán a část suspenze byla odebrána asi z 1/3 až 1/2 výšky vodního sloupce pipetou samovztlakem. Po naplnění obou dílů komůrky se nechala komůrka 2-3 minuty stát. Poté se pod mikroskopem spočítala zleva doprava všechna vajíčka v prostoru ohraničeném vyrytými mřížkami, vajíčka ležící na rysce se počítala do součtu vajíček uvnitř mřížky. Z jednoho vzorku trusu se zaznamenaly vždy 2 číselné hodnoty (1 komůrka = 2 políčka). Každý vzorek byl vyšetřen 2 krát (Komise pre laboratórnu a klinickú diagnostiku 1989). U kvantitativní metody je výsledkem tento výpočet: průměrný počet vajíček ve 4 polích se násobí číslem 200, čímž se obdrží počet vajíček v 1 g trusu (EPG). Každé nalezené vajíčko znamená 50 vajíček v 1 g trusu (Komise pre laboratórnu a klinickú diagnostiku 1989).
31
4.6.3 Metoda koprokultur pro diagnostiku infekčních larev L3 V experimentu č. 2 byla provedena diferenciace infekčních larev L3 po sedmidenní kultivaci ze vzorků trusu. Při přípravě vzorků bylo postupováno metodou koprokultur pro diagnostiku infekčních larev. Ke kultivaci bylo zpracováno 150 g trusu, který se důkladně rozetřel v třecí misce a promíchal s vermikulitem (růstové médium na bázi fylosilikátů) v množství odpovídajícímu konzistenci trusu. Upravený trus byl přenesen do vysterilizovaných sklenic o obsahu 700 ml. Tyto sklenice byly plněny zhruba do 2/3 svého obsahu. Následně se řádně označily číslem ušní známky zvířete a uzavřely víkem, které se však nedotahovalo, aby měl do kultury přístup vzduch. Takto připravené kultury se vložily do termostatu nastaveného na 27 °C a ponechaly se zde po dobu 7 dnů. Vzorky se každých 48 hodin vyjmuly, sejmuly se uzávěry a pipetou se jemně zvlhčily stěny i obsah sklenic. Po uplynutí 7 dnů byly všechny larvy gastrointestinálních nematodů vyvinuty do infekčního stádia L3. Při jejich získávání se postupovalo následovně: kultura se po vynětí z termostatu nechala stát zhruba 5 hodin v difúzním světle, odstranil se uzávěr, sklenice se naplnily až po okraj vodou a na hladinu se přiložila Petriho miska, jejíž průměr přesahoval průměr sklenice po celém obvodě o 1 cm. Sklenice s miskou se otočila dnem vzhůru, miska se doplnila asi do poloviny výšky vodou a ponechala se stát přes noc do druhého dne při teplotě laboratoře. Během tohoto časového úseku docházelo k migraci larev z kultury. Poté se odsála pipetou všechna voda obsahující larvy z misky do Erlenmeyerovy baňky. Po sedimentaci larev ke dnu baňky se provedla celkem třikrát dekantace přebytečné vody. Tyto larvy byly posléze přeneseny do stejných zkumavek označených podle původních kultur a uskladnily se ve stojáncích v chladničce při teplotě 8 °C (Komise pre laboratórnu a klinickú diagnostiku 1989). Vlastní diferenciaci larev je třeba provádět nejpozději do 1 týdne, kdy mají zachovány všechny morfologické znaky. Suspenze larev se přenese mikropipetou na podložní sklíčko, larvy se zafixují a důkladně prohlédnou pod mikroskopem. V každém vzorku se určuje nejméně 50, nejvýše 100 larev a stanoví se druhové zastoupení případně rod hlístic v procentech (Komise pre laboratórnu a klinickú diagnostiku 1989).
32
4.7 Vliv selekčního tlaku (opakované podání dávek flubendazolu) na účinnost a metabolismus flubendazolu u Haemonchus contortus 4.7.1 Experiment č. 1 V tomto experimentu bylo použito osm zvířat, skopců: 1) číslo ušní známky 43353 – živá hmotnost 27,0 kg 2) číslo ušní známky 43364 – živá hmotnost 26,0 kg 3) číslo ušní známky 43469 – živá hmotnost 25,0 kg 4) číslo ušní známky 43391 – živá hmotnost 23,0 kg 5) číslo ušní známky 43432 – živá hmotnost 34,0 kg 6) číslo ušní známky 43359 – živá hmotnost 23,0 kg 7) číslo ušní známky 43436 – živá hmotnost 28,0 kg 8) číslo ušní známky 43467 – živá hmotnost 29,0 kg Experiment byl zahájen 1. 3. 2011, kdy bylo provedeno vyšetření trusu na zjištění parazitostatu před odčervením. Dne 2. 3. 2011 byla zvířata opět navzorkována a byla jim podána perorálně odčervovací suspenze albendazolu. Další odběr a vyšetření trusu bylo provedeno až 29. 3. 2011. Dne 30. 3. 2011 a 5. 4. 2011 byli vyřazeni z experimentu skopci 2, 3, 4, 8. K původním čtyřem skopcům (1, 5, 6, 7) byla dne 9. 5. 2011 přidána čtyři nová zvířata, skopci: 9) číslo ušní známky 7812 – živá hmotnost 26,0 kg 10) číslo ušní známky 7813 – živá hmotnost 25,0 kg 11) číslo ušní známky 7814 – živá hmotnost 22,0 kg 12) číslo ušní známky 7816 – živá hmotnost 27,0 kg Všechna zvířata byla 9. 5. 2011 rektálně vzorkována a vyšetřena. Dne 16. 5. 2011 byl proveden odběr trusu a byla podána perorálně odčervovací suspenze albendazolu. Ke dni 23. 5. 2011 byl vyřazen z experimentu skopec 10. Kontrolní trus byl odebrán dvakrát v termínech 23. 5. a 25. 5. 2011. Jelikož i po odčervení přetrvával pozitivní parazitologický nález, byla zvířatům 25. 5. 2011 opětovně podána dávka albendazolové suspenze. Dne 31. 5. 2011 byla všechna zvířata rektálně vzorkována a infikována kmenem ISE s L3 larvami Haemonchus contortus v počtu 5000/ks. Vzorky trusu byly 33
poté vyšetřeny ve dnech 23. 6., 27. 6. a 28. 6. 2011 kvantitativní metodou. Dne 28. 6. 2011 byla zvířata rozdělena do tří experimentálních skupin (A-C). Skupině A a B byl podáván perorálně v suspenzi flubendazol ve třech po sobě jdoucích dnech v dávce 1,0 mg/kg ž. hm. a 2,5 mg/kg ž. hm. Skupina C byla kontrolní, tedy bez podání přípravku. K terapii byl použit výrobek s komerčním názvem Flubenol 50% prm. Skupina A: skopci 7 a 9, základní dávka flubendazolu činila 3 × 1,0 mg/kg ž. hm. Dávkování suspenze bylo 600 mg Flubenolu 50%/200 ml, což představuje 1,5 mg flubendazolu/1 ml suspenze. Skupina B: skopci 1 a 12, základní dávka flubendazolu činila 3 × 2,5 mg/kg ž. hm. Dávkování suspenze bylo 1,5 g Flubenolu 50%/200 ml, což představuje 3,75 mg flubendazolu/1 ml suspenze. Skupina C: skopci 5, 6 a 11, základní dávka flubendazolu činila 3 × 0,0 mg/kg ž. hm. (samotné podávání vehikula suspenze). Dávkování flubendazolu vzhledem k hmotnosti daného zvířete viz Tab. 2: Tab. 2 Dávkování léčiva flubendazolu živá hmotnost zvířete (kg)
objem podané suspenze flubendazolu (ml)
24
16,0
26
17,3
28
18,7
30
20,0
Zvířatům byl následně rektálně odebírán trus ve dnech 29. 6., 30. 6., 1. 7., 3. 7., 5. 7., 7. 7., 9. 7. a 11. 7. 2011, který byl vyšetřen kvantitativní metodou. Ke dni 11. 7. 2011 byl vyřazen z experimentu skopec 11. Ve dnech 13. 7., 15. 7., 17. 7. a 19. 7. 2011 byly prováděny odběry trusu u zbylých šesti zvířat. K poslednímu uvedenému datu byla všechna zvířata z experimentu vyřazena, ze slezů byli izolováni dospělí červi Haemonchus contortus a z tenkého střeva izolovány tasemnice. Trus vyřazených zvířat byl zpracován a odeslán do Parazitologického ústavu SAV v Košicích, kde byl proveden test helmintorezistence – test líhnutí larev (Egg Hatch Test = EHT).
34
4.7.2 Experiment č. 2 Do tohoto experimentu bylo zařazeno sedm zvířat, skopců: 1) číslo ušní známky 47420 – živá hmotnost 30,0 kg 2) číslo ušní známky 47234 – živá hmotnost 32,0 kg 3) číslo ušní známky 47428 – živá hmotnost 36,0 kg 4) číslo ušní známky 47487 – živá hmotnost 34,0 kg 5) číslo ušní známky 45468 – živá hmotnost 30,0 kg 6) číslo ušní známky 47392 – živá hmotnost 28,0 kg 7) číslo ušní známky 47431 – živá hmotnost 27,0 kg Experiment byl zahájen 9. 9. 2011. Zvířatům byla provedena v termínech 12. a 13. 9. 2011 kontrola parazitostatu. Dne 13. 9. 2011 jim byla podána perorálně odčervovací suspenze albendazolu. V týdnu do 18. 9. 2011 uhynuli skopci 5, 6, 7. Zbylá čtyři zvířata byla 21. 9. 2011 rektálně vzorkována a infikována kmenem ISE s L3 larvami Haemonchus contortus v počtu 4000/ks. Následně byly vzorky trusu vyšetřeny ve dnech 12. 10., 17. 10., 20. 10. a 24. 10. 2011 kvantitativní metodou. Dne 24. 10. 2011 byla zvířata rozdělena do dvou experimentálních skupin (A-B). Skupině A byl podáván perorálně v suspenzi flubendazol ve třech po sobě jdoucích dnech v dávce 2,0 mg/kg ž. hm. Skupina B byla kontrolní, tedy bez podání přípravku. K terapii byl použit výrobek s komerčním názvem Flubenol 50% prm. Skupina A: skopci 1 a 2, základní dávka flubendazolu činila 3 × 2,0 mg/kg ž. hm. Dávkování suspenze bylo 1,8 g Flubenolu 50%/300 ml, což představuje 3,0 mg flubendazolu/1 ml suspenze. Skupina B: skopci 3 a 4, základní dávka flubendazolu činila 3 × 0,0 mg/kg ž. hm. (samotné podávání vehikula suspenze). Dávkování flubendazolu vzhledem k hmotnosti daného zvířete viz Tab. 3: Tab. 3 Dávkování léčiva flubendazolu živá hmotnost zvířete (kg)
objem podané suspenze flubendazolu (ml)
30
20,0
32
21,3
35
Zvířatům byl poté odebírán trus ve dnech 25. 10., 26. 10., 28. 10., 30. 10., 1. 11., 3. 11., 5. 11., 7. 11., 9. 11., 11. 11., 13. 11. a 14. 11. 2011, který byl vyšetřen kvantitativní metodou. Dne 14. 11. 2011 byla všechna zvířata z experimentu vyřazena a ze získaných slezů byli izolováni dospělí červi Haemonchus contortus. Trus ze střev vyřazených zvířat byl rozdělen, 250 g trusu bylo odesláno do Parazitologického ústavu SAV v Košicích a 150 g bylo zpracováno v termínu od 14. 11. do 22. 11. 2011 metodou koprokultur pro diagnostiku invazivních larev L3. Vlastní diferenciace larev byla provedena na Katedře biochemických věd Farmaceutické fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové.
4.8 Účinnost a metabolismus flubendazolu u citlivých a rezistentních kmenů Haemonchus contortus 4.8.1 Experiment č. 3 V tomto experimentu bylo použito šest zvířat, skopců: 1) skopec č. 1 – živá hmotnost 28,0 kg 2) skopec č. 2 – živá hmotnost 30,0 kg 3) skopec č. 3 – živá hmotnost 32,0 kg 4) skopec č. 4 – živá hmotnost 24,0 kg 5) skopec č. 5 – živá hmotnost 26,0 kg 6) skopec č. 6 – živá hmotnost 30,0 kg Experiment byl zahájen 17. 2. 2012. Zvířatům bylo provedeno 28. 2. 2012 vyšetření trusu na zjištění parazitostatu před odčervením. Dne 2. 3. 2012 byla zvířata rektálně vzorkována a byla jim podána perorálně odčervovací suspenze albendazolu. Další odběr a vyšetření trusu bylo provedeno 5., 8. a 9. 3. 2012. Ke dni 9. 3. 2012 uhynul skopec 1. Jelikož po odčervení přetrvával u zbylých zvířat pozitivní parazitologický nález, byla jim 9. a 10. 3. 2012 podána opětovně dávka albendazolové suspenze. Trus byl poté odebírán v termínech 19. 3., 22. 3., 2. 4., 3. 4. a 5. 4. 2012. Dne 5. 4. 2012 uhynul skopec 4, proto bylo 20. 4. 2012 zařazeno do experimentu další zvíře, skopec 6. Zvířata byla 25. 4. 2012 infikována kmeny ISE a WR s L3 larvami Haemonchus contortus v počtu 4000 a 8000/ks (viz Tab. 4). Ve stejný den byl proveden i odběr trusu. 36
Tab. 4 Označení zvířat, hmotnost, podaný kmen a dávka Haemonchus contortus číselné označení
hmotnost zvířete
kmen H. contortus
zvířete
dávka L3 larev H. contortus
5
26
ISE
4000
2
30
ISE
8000
6
30
WR
4000
3
32
WR
8000
Výpočet dávky kmenu s larvami Haemonchus contortus: Larvy ISE kmenu byly dodány v počtu 25000 v 11 ml. K získání 4000 larev bylo potřeba 1,7 ml kmenu a k infikaci v počtu 8000 larev bylo využito 3,5 ml tohoto kmenu. Kmen WR obsahoval v 10,5 ml 30000 larev. K získání 4000 larev bylo použito 1,5 ml kmenu a k infikaci v počtu 8000 larev bylo zapotřebí 3,0 ml tohoto kmenu. Tímto způsobem výpočtu dávky se postupovalo i v dalších experimentech. Vzorky trusu byly následně vyšetřeny kvantitativní metodou ve dnech 10. 5., 14. 5., 17. 5., 21. 5., 24. 5. a 29. 5. 2012. Experiment byl ukončen k poslednímu uvedenému datu, všechna zvířata byla utracena a ze získaných slezů byli izolováni dospělí červi Haemonchus contortus. Trus vyřazených zvířat byl předán k dalšímu výzkumu na Katedru biochemických věd Farmaceutické fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové.
4.8.2 Experiment č. 4 Do tohoto experimentu bylo zařazeno šest zvířat, skopců: 1) skopec č. 1 – živá hmotnost 28,0 kg 2) skopec č. 2 – živá hmotnost 26,0 kg 3) skopec č. 3 – živá hmotnost 30,0 kg 4) skopec č. 4 – živá hmotnost 32,0 kg 5) skopec č. 5 – živá hmotnost 30,0 kg 6) skopec č. 6 – živá hmotnost 28,0 kg Experiment byl zahájen 8. 6. 2012. Zvířatům byla dne 11. 6. 2012 podána perorálně odčervovací suspenze monepantelu. Z důvodu silného průjmu nebylo možné odebrat vzorky trusu. Standardní odběr a vyšetření trusu bylo provedeno až 18. 6. 2012. Ve 37
stejný den byla zvířata infikována kmeny ISE a WR s L3 larvami Haemonchus contortus v počtu 4000/ks (viz Tab. 5). Tab. 5 Označení zvířat, hmotnost, podaný kmen a dávka Haemonchus contortus číselné značení
hmotnost zvířete
kmen H. contortus
zvířete
dávka L3 larev H. contortus
1
28,0
ISE
4000
2
26,0
ISE
4000
3
30,0
ISE
4000
4
32,0
WR
4000
5
30,0
WR
4000
6
28,0
WR
4000
Ke dni 3. 7. 2012 uhynul skopec 2. Vzorky trusu byly poté vyšetřeny kvantitativní metodou ve dnech 4. 7., 9. 7. a 11. 7. 2012. Všechna zvířata byla 11. 7. 2012 z experimentu vyřazena a ze slezů byli izolováni dospělí červi Haemonchus contortus. Trus vyřazených zvířat byl zpracován a odeslán do Parazitologického ústavu SAV v Košicích, kde byl proveden test helmintorezistence – test líhnutí larev (Egg Hatch Test = EHT).
38
5
VÝSLEDKY
Tato kapitola shrnuje zásadní kroky v jednotlivých experimentech a v přehledných tabulkách uvádí výsledky parazitologických vyšetření.
5.1 Experiment č. 1 Dne 2. 3. 2011 byla zvířatům podána albendazolová suspenze. Následně byl odebrán kontrolní trus a vyšetřen kvalitativní metodou na přítomnost vajíček parazitů (viz Tab. 6). Ve vzorcích trusu byla u zvířat č. 43364, 43469, 43391 a 43467 nalezena vajíčka rodu Moniezia, proto byli tito jedinci z experimentu dne 30. 3. 2011 a 5. 4. 2011 vyřazeni a z jejich střev byly izolovány tasemnice (viz Tab. 7). Do experimentu byla 9. 5. 2011 přidána čtyři nová zvířata, skopci č. 7812, 7813, 7814 a 7816. Všechna zvířata byla rektálně vzorkována a stejným způsobem 16. 5. 2011 odčervena. V mikroskopickém vyšetření byla nalezena vajíčka rodu Haemonchus, Chabertia, Nematodirus, Moniezia, Trichuris a oocysty kokcidií rodu Eimeria (viz Tab. 6). Ke dni 23. 5. 2011 byl vyřazen z experimentu skopec č. 7813, z jeho střev byly izolovány tasemnice (viz Tab. 7). Jelikož po odčervení přetrvával pozitivní parazitologický nález, byla zvířatům 25. 5. 2011 opětovně podána dávka albendazolové suspenze. Dne 31. 5. 2011 byla zvířata infikována larvami Haemonchus contortus. Vzorky trusu byly v následujících dnech vyšetřeny kvantitativní ovoskopickou metodou (viz Tab. 8). Dne 28. 6. 2011 byla zvířata rozdělena do tří experimentálních skupin (A-C). Skopci ze skupiny A a B byli přeléčeni flubendazolem, skupina C byla kontrolní. Poté byl v daných intervalech prováděn rektální odběr trusu, který byl podroben kvantitativní ovoskopické analýze (viz Tab. 8). Ke dni 11. 7. 2011 byl vyřazen z experimentu skopec č. 7814, u kterého nebyl prokázán nález tasemnic (viz Tab. 7). Z dostupných údajů lze konstatovat, že se první vajíčka Haemonchus contortus objevila 23. den po infikaci. Počty vyprodukovaných vajíček značně kolísaly, nejvyšší počet byl přibližně 10400 vajíček v 1 g trusu.
39
Tab. 6 Výsledky kvalitativních parazitologických vyšetření – experiment č. 1 číslo
koprologické nálezy k termínu vyšetření
ušní známky
2. 3. 2011
29. 3. 2011
9. 5. 2011
16. 5. 2011
23. 5. 2011
25. 5. 2011
31. 5. 2011
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Haemonchus
Chabertia ovina
Chabertia ovina
zvířete 43353
43364
43469
Haemonchus
Haemonchus
Haemonchus
Haemonchus
contortus,
contortus,
contortus,
contortus,
contortus,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina
Trichuris ovis
Trichuris ovis
Trichuris ovis
Trichuris ovis
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Moniezia spp.,
Moniezia spp.,
Nematodirus spp.
Nematodirus spp.
Haemonchus
Haemonchus
contortus,
contortus,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Moniezia spp.,
Moniezia spp.,
Nematodirus spp.,
Nematodirus spp.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Trichuris ovis
43391
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Haemonchus
Haemonchus
contortus,
contortus,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Moniezia spp.,
Moniezia spp.,
Nematodirus spp.,
Nematodirus spp.
Trichuris ovis
43432
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Haemonchus
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
contortus,
Nematodirus spp.,
Nematodirus spp.,
Ostertagia spp.,
Trichuris ovis
Trichuris ovis
Trichuris ovis
Chabertia ovina,
Trichuris ovis
Ostertagia spp.,
Trichuris ovis
Eimeria spp.
Trichuris ovis
43359
Trichuris ovis
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Haemonchus
Haemonchus
Haemonchus
Haemonchus
Haemonchus
Haemonchus
contortus,
contortus,
contortus,
contortus,
contortus,
contortus,
Chabertia ovina
Chabertia ovina
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina
Chabertia ovina
Trichuris ovis
Trichuris ovis
40
pokračování tabulky
43436
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Haemonchus
Chabertia ovina,
bez vzorku
Haemonchus
Chabertia ovina,
Haemonchus
contortus,
Trichuris ovis
contortus,
Trichuris ovis
contortus,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Moniezia spp.,
Moniezia spp.
Moniezia spp.
bez vzorku
Trichuris ovis
43467
Haemonchus
Haemonchus
contortus,
contortus,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Moniezia spp.,
Moniezia spp.,
Trichuris ovis
Nematodirus spp.,
-
-
-
-
-
Trichuris ovis
7812
-
-
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Haemonchus
Haemonchus
Haemonchus
Haemonchus
contortus,
contortus,
contortus,
contortus,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina
Nematodirus spp.,
Moniezia spp.,
Nematodirus spp.,
Trichuris ovis
Nematodirus spp.,
Trichuris ovis
bez vzorku
Trichuris ovis
7813
7814
-
-
-
-
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
-
Haemonchus
Haemonchus
Haemonchus
contortus,
contortus,
contortus,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Moniezia spp.,
Moniezia spp.,
Moniezia spp.,
Nematodirus spp.,
Nematodirus spp.,
Nematodirus spp.,
Trichuris ovis
Trichuris ovis
Trichuris ovis
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Haemonchus
Chabertia ovina,
Trichuris ovis
Trichuris ovis
contortus,
Nematodirus spp.,
Chabertia ovina,
Trichuris ovis
-
Eimeria spp.
Nematodirus spp., Trichuris ovis
7816
-
-
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Nematodirus spp.
Nematodirus spp.,
Moniezia spp.,
Nematodirus spp.
Nematodirus spp.
Trichuris ovis
Nematodirus spp.
41
Tab. 7 Přehled izolovaných tasemnic – experiment č. 1 číslo ušní známky zvířete
počet izolovaných tasemnic
43364
2
43469
8
43391
2
43467
2
7813
6
7814
0
Tab. 8 Hodnoty EPG nálezů Haemonchus contortus v trusu jednotlivých zvířat v průběhu experimentální infekce – experiment č. 1 číslo ušní známky zvířete – dávka flubendazolu v mg/kg ž. hm.
datum sběru 7814
43432
43359
7812
43436
7816
43353
3 × 0,0
3 × 0,0
3 × 0,0
3 × 1,0
3 × 1,0
3 × 2,5
3 × 2,5
23. 6. 2011
550
1300
1350
400
950
1750
200
27. 6. 2011
650
1450
2850
1550
1400
1350
350
28. 6. 2011
1100
1350
1500
700
800
1300
300
29. 6. 2011
1450
750
1600
1250
750
1200
200
30. 6. 2011
2150
750
1350
600
850
300
300
1. 7. 2011
3050
750
1200
550
200
100
200
3. 7. 2011
3250
1250
1400
400
250
0
200
5. 7. 2011
2650
1600
1750
200
150
0
200
7. 7. 2011
1700
2550
2650
600
500
0
200
9. 7. 2011
1100
1950
2950
500
600
100
200
11. 7. 2011
10100
9050
10400
1550
850
250
250
13. 7. 2011
-
1950
2050
650
800
100
200
trusu
42
pokračování tabulky 15. 7. 2011
-
1700
2250
bez
850
200
200
vzorku 17. 7. 2011
-
3600
5200
800
2250
150
250
19. 7. 2011
-
3600
4350
450
1100
250
200
5.2 Experiment č. 2 Zvířata byla před podáním odčervovací suspenze albendazolu dne 13. 9. 2011 vyšetřena kvalitativní ovoskopickou metodou. Ve vzorcích byla nalezena vajíčka rodu Chabertia, Nematodirus, Trichuris a oocysty kokcidií rodu Eimeria (viz Tab. 9). V týdnu do 18. 9. 2011 uhynuli skopci č. 45468, 47392 a 47431. Zbylá čtyři zvířata byla 21. 9. 2011 rektálně vzorkována a infikována larvami Haemonchus contortus. Vzorky trusu byly v následujících dnech vyšetřeny kvalitativní (viz Tab. 9) a kvantitativní ovoskopickou metodou (viz Tab. 10). Dne 24. 10. 2011 byla zvířata rozdělena do dvou experimentálních skupin (A-B). Skopci ze skupiny A byli přeléčeni flubendazolem, skupina B byla kontrolní. Poté byl v daných intervalech prováděn rektální odběr trusu, který byl podroben kvantitativní ovoskopické analýze (viz Tab. 10). První vajíčka produkovaná dospělými červi Haemonchus contortus byla v trusu prokázána 26. den po infikaci. Počty vajíček značně kolísaly, nejvyšší počet byl přibližně 1350 vajíček v 1 g trusu. Metodou koprokultur pro diagnostiku invazivních larev L3 byly kultivovány larvy gastrointestinálních nematodů. Jejich diferenciace byla provedena na Katedře biochemických věd Farmaceutické fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové.
43
Tab. 9 Výsledky kvalitativních parazitologických vyšetření – experiment č. 2 číslo ušní
koprologické nálezy k termínu vyšetření 12. 9. 2011
13. 9. 2011
21. 9. 2011
12. 10. 2011
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina
Chabertia ovina
Nematodirus spp.,
Nematodirus spp.,
Trichuris ovis
Trichuris ovis
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina
Chabertia ovina
Nematodirus spp.,
Nematodirus spp.,
Trichuris ovis
Trichuris ovis
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina
Chabertia ovina
Nematodirus spp.,
Nematodirus spp.,
Trichuris ovis
Trichuris ovis
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina
Nematodirus spp.,
Nematodirus spp.,
Nematodirus spp
Trichuris ovis
Trichuris ovis
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Nematodirus spp.
Nematodirus spp
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Nematodirus spp.,
Nematodirus spp.,
Trichuris ovis
Trichuris ovis
Eimeria spp.,
bez vzorku
známky zvířete
47420
47234
47428
47487
45468
47392
47431
-
-
-
-
-
-
Chabertia ovina, Nematodirus spp., Trichuris ovis
44
Tab. 10 Hodnoty EPG nálezů Haemonchus contortus v trusu jednotlivých zvířat v průběhu experimentální infekce – experiment č. 2 číslo ušní známky zvířete – dávka flubendazolu v mg/kg ž. hm.
datum sběru
47487
47428
47420
47234
trusu
3 × 0,0
3 × 0,0
3 × 2,0
3 × 2,0
17. 10. 2011
50
50
50
50
20. 10. 2011
0
50
50
50
24. 10. 2011
150
700
1350
650
25. 10. 2011
0
50
0
0
26. 10. 2011
0
0
0
50
28. 10. 2011
50
50
0
50
30. 10. 2011
100
350
100
50
1. 11. 2011
50
0
0
100
3. 11. 2011
50
50
0
50
5. 11. 2011
0
250
50
0
7. 11. 2011
100
100
100
50
9. 11. 2011
0
100
150
100
11. 11. 2011
50
100
100
150
13. 11. 2011
50
300
50
650
14. 11. 2011
100
300
100
700
5.3 Experiment č. 3 Zvířata byla před podáním odčervovací suspenze albendazolu dne 2. 3. 2012 vyšetřena kvalitativní ovoskopickou metodou. Ve vzorcích byla nalezena vajíčka rodu Haemonchus, Chabertia, Moniezia, Trichostrongylus, Trichuris a oocysty kokcidií rodu Eimeria (viz Tab. 11). Kontrolní vyšetření trusu po odčervení odhalilo přetrvávající parazitologický nález, proto byla zvířatům podána další dávka albendazolové suspenze a to ve dnech 9. 3. a 10. 3. 2012. Ke dni 9. 3. 2012 uhynul skopec č. 1. Důvodem úhynu byla akutní tympanie (nadmutí). V následujících dnech byl trus zvířat podroben kvalitativní ovoskopické analýze (viz Tab. 11). Dne 5. 4. 2012 uhynul skopec č. 4. Důvodem úhynu byla špatná kondice zvířete nebo neprokázaný patologický stav. 45
Tento jedinec byl během experimentu nahrazen skopcem č. 6. Zvířata byla 25. 4. 2012 infikována larvami Haemonchus contortus. Poté byl v daných intervalech prováděn rektální odběr trusu, který byl vyšetřen kvantitativní ovoskopickou metodou (viz Tab. 12). Dospělí červi Haemonchus contortus začali produkovat první vajíčka od 19. dne po infikaci. Zpočátku byl nález vajíček ojedinělý, ale postupně rostl. Nejmasivnější výskyt byl přibližně 9900 vajíček v 1 g trusu.
Tab. 11 Výsledky kvalitativních parazitologických vyšetření – experiment č. 3 číselné označení zvířete
koprologické nálezy
1
2
3
4
5
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
bez vzorku
Eimeria spp.,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Haemonchus
Haemonchus
Trichuris ovis
contortus,
contortus,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Trichuris ovis
Trichuris ovis
6
k termínu vyšetření
28. 2. 2012
2. 3. 2012
Eimeria spp.,
bez vzorku
Chabertia ovina
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Haemonchus
Haemonchus
contortus,
contortus,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina
-
bez vzorku
-
-
Trichuris ovis
5. 3. 2012
Eimeria spp.,
Eimeria spp.
Chabertia ovina
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Chabertia ovina
Chabertia ovina,
Haemonchus
Nematodirus
contortus,
spp., Trichuris
Trichuris ovis
ovis
8. 3. 2012
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Haemonchus
Haemonchus
Haemonchus
Haemonchus
contortus,
contortus,
contortus,
contortus,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina,
Chabertia ovina
Chabertia ovina,
Moniezia spp.,
Trichostrongylus
Trichostrongylus
spp
spp
Moniezia spp.
Eimeria spp.
-
46
pokračování tabulky
9. 3. 2012
19. 3. 2012
22. 3. 2012
-
Eimeria spp.
-
Eimeria spp.
-
Eimeria spp.
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Haemonchus
Chabertia ovina
Haemonchus
contortus,
contortus,
Chabertia ovina
Chabertia ovina
Eimeria spp.,
Haemonchus
Haemonchus
contortus,
contortus
Chabertia ovina
Eimeria spp.
-
bez vzorku
-
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
-
Chabertia ovina
Haemonchus contortus
3. 4. 2012
5. 4. 2012
-
Eimeria spp.
-
bez vzorku
Eimeria spp.
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Haemonchus
Haemonchus
contortus,
contortus,
Chabertia ovina
Chabertia ovina
bez vzorku
-
Eimeria spp
-
-
.
25. 4. 2012
-
Eimeria spp
Eimeria spp
-
Eimeria spp.
Eimeria spp.
Tab. 12 Hodnoty EPG nálezů Haemonchus contortus v trusu jednotlivých zvířat v průběhu experimentální infekce – experiment č. 3 datum sběru
číselné označení zvířete
trusu
2
3
5
6
10. 5. 2012
0
0
0
0
14. 5. 2012
0
0
200
50
17. 5. 2012
50
0
200
100
21. 5. 2012
100
700
6800
4200
24. 5. 2012
150
350
2650
2100
29. 5. 2012
550
4450
9900
8950
47
5.4 Experiment č. 4 Zvířatům byla dne 11. 6. 2012 podána perorálně odčervovací suspenze monepantelu. Následně byl odebrán kontrolní trus a vyšetřen kvalitativní metodou na přítomnost vajíček parazitů. V mikroskopickém vyšetření byla nalezena vajíčka rodu Chabertia, Moniezia, Trichuris a oocysty kokcidií rodu Eimeria (viz Tab. 13). Zvířata byla 18. 6. 2012 infikována larvami Haemonchus contortus. Ke dni 3. 7. 2012 uhynul skopec č. 2. Důvodem úhynu byla špatná kondice zvířete nebo neprokázaný patologický stav. Poté byl v daných intervalech prováděn rektální odběr trusu, který byl podroben kvantitativní ovoskopické analýze (viz Tab. 14). První vajíčka vyprodukovaná dospělými červi Haemonchus contortus byla v trusu prokázána 16. den po infikaci. Počty vajíček jemně kolísaly, nejvyšší počet byl přibližně 450 vajíček v 1 g trusu.
Tab. 13 Výsledky kvalitativních parazitologických vyšetření – experiment č. 4 číselné označení zvířete
koprologické nálezy k termínu
1
2
3
4
5
6
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Eimeria spp.,
Moniezia spp.,
Chabertia
Moniezia spp.,
Chabertia
Moniezia spp.
Trichuris ovis
Trichuris ovis
ovina,
Trichuris ovis
ovina,
vyšetření
18. 6. 2012
Trichuris ovis
Moniezia spp.
Tab. 14 Hodnoty EPG nálezů Haemonchus contortus v trusu u jednotlivých zvířat v průběhu experimentální infekce – experiment č. 4 datum sběru
číselné označení zvířete
trusu
1
3
4
5
6
4. 7. 2012
100
200
100
150
50
9. 7. 2012
150
450
0
100
100
11. 7. 2012
100
350
0
200
100
48
6
DISKUZE
Kapitola shrnuje experimentální data získaná v této práci, odůvodňuje způsob ustájení zvířat s ohledem na navozenou infekci hlísticí Haemonchus contortus, hodnotí přítomnost vajíček parazitů v trusu a kolísání počtu vajíček v jednotlivých experimentech, dále posuzuje rozdíly produkce vajíček s ohledem na kmen Haemonchus contortus, vliv použitého léčiva flubendazolu na původce parazitózy a porovnává dosažené výsledky s literaturou.
6.1 Systém ustájení zvířat Zvířata byla ustájena časově separovaně po skupinách zohledňujících dávku použitého léčiva flubendazolu a především kmen parazita, kterým byla infikována. To zaručovalo, že následná izolace dospělých červů Haemonchus contortus poskytla zisk čisté populace parazita bez možnosti kontaminace od jiných zvířat či jinými kmeny. Tento způsob ustájení je ideální, ale není nezbytný. Po infikaci probíhá v žaludku hostitelského zvířete dospívání larev až do stádia, kdy dospělé samičky začnou během cca 21 dnů produkovat první vajíčka, která společně s trusem odchází do vnějšího prostředí. Pokud by byla taková vajíčka v krátké době pozřena, nejsou schopna vyvolat infekci. Trvá dalších 6-8 dnů než se z vajíček vyvinou infekční larvy (podle podmínek i déle). Z těchto poznatků vyplývá, že by zvířata mohla být v průběhu každého experimentu ustájena i společně vzhledem k tomu, že experiment se zvířaty zapojenými do studie dříve byl vždy ukončen s předstihem před objevením se nové generace infekčních larev hlístice Haemonchus contortus (Kotrlá et al. 1984, Ryšavý a Erhardová 1953).
6.2 Přítomnost vajíček v trusu Kvalitativní ovoskopická metoda odhalila přítomnost vajíček Haemonchus contortus, Chabertia ovina, Nematodirus spp., Moniezia spp., Trichostrongylus spp.,
49
Trichuris ovis a oocyst kokcidií rodu Eimeria spp. Jedná se o parazity běžně se vyskytují v chovu ovcí. Za zmínku stojí, že při použití tohoto vyšetření je jednou z předvídatelných nástrah falešná pozitivita. Tato situace nastává, když zvíře pozře s potravou (pevnou, tekutou) vajíčko parazita, které projde nezměněné trávicím traktem a je následně koprologicky posouzeno jako pozitivní nález. Další nevýhodou je to, že i nález jediného vajíčka ve vzorku trusu znamená průkaz přítomnosti daného parazita a přitom může jít o kontaminaci vzorku, falešnou pozitivitu, zvíře je zdravé, již imunní po překonané infekci.
6.3 Počty vyprodukovaných vajíček Ve všech fázích studie značně kolísají hodnoty EPG nálezů Haemonchus contortus v průběhu rozvoje experimentální infekce. Výsledky kvantitativního ovoskopického nálezu se nesmí nadhodnocovat. K určení síly infekce obyčejně pouhé stanovení počtu vajíček v trusu nestačí a nemůže se podle něho usuzovat ani na přibližný počet parazitů v těle hostitele. Produkce vajíček dospělými červi je velmi nepravidelná, mění se jak v delším časovém období (během týdne, měsíce), tak i v průběhu jediného dne. Toto je zřejmě i důvodem námi popsaného kolísání hodnot EPG nálezů (Ryšavý a Erhardová 1953) U cizopasných oblých červů je i velmi hrubé stanovení odpovídajícího počtu parazitů naprosto nemožné, protože tímto způsobem se nedají zaznamenat samečci, kteří svou přítomností v těle hostitele škodí stejně jako samičky. Také se nepostihnou samičky teprve dospívající a zatím ještě nekladoucí vajíčka, i když svou velikostí odpovídají dospělým červům (Ryšavý a Erhardová 1953).
6.4 Produkce vajíček s ohledem na kmen Haemonchus contortus Zvířata byla experimentálně infikována dvěma různě citlivými kmeny Haemonchus contortus. Z námi dosažených výsledků vyplývá, že mezi kmeny ISE a WR neexistují markantní rozdíly v produkci vajíček. Toto je v souladu s výsledky předchozí diplomové práce (Lochmanová 2010). 50
6.5 Vliv flubendazolu na původce parazitózy Kvantitativní vyšetření trusu prokázalo u skupin zvířat, kterým byl podáván v suspenzi flubendazol vždy ve třech po sobě jdoucích dnech v dávkách 1,0 mg/kg ž. hm., 2,0 mg/kg ž. hm. a 2,5 mg/kg ž. hm., že hodnoty EPG nálezů korespondovaly s velikostí dávky anthelmintika, tj. nižší dávka flubendazolu znamenala vyšší výskyt vajíček a naopak vyšší dávka flubendazolu znamenala nižší výskyt vajíček. Toto je důsledek vlivu velikosti dávky použitého anthelmintika na hlístici Haemonchus contortus, který vedl k útlumu až omezení jejích reprodukčních schopností a k navození helmintorezistence. U kontrolní skupiny zvířat byly nejvyšší hodnoty EPG nálezů, což lze jednoduše vysvětlit podáním samotného vehikula suspenze.
6.6 Porovnání výsledků s literaturou K odčervení byla jednorázově použita albendazolová suspenze v dávce 30 mg/kg ž. hm. a suspenze monepantelu v dávce 2,5 mg/kg ž. hm. Albendazol je látka ze skupiny benzimidazolových anthelmintik, která má antinematodní, z části antitrematodní a anticestodní aktivitu. Působí proti vývojovým i dospělým stádiím helmintů a také ovocidně. U polygastrických zvířat (skot, ovce, kůň, aj.) lze benzimidazoly podávat i jednorázově (Lamka a Ducháček 2008). U většiny experimentů po odčervení zvířat připravovaných do studie přetrvával pozitivní parazitologický nález. Ve vzorcích trusu byly nalezeny kromě vajíček rodu Haemonchus také nematoda rodu Chabertia, Nematodirus, Trichuris, Trichostrongylus a cestoda rodu Moniezia. Z toho vyplývá, že podání odčervovací suspenze albendazolu v jednotlivé terapeutické dávce nebylo úspěšné a pro dosažení požadované účinnosti léčiva je třeba opakovaného podání. V úvahu je třeba také vzít možnost existence helmintorezistence u prokazovaných druhů parazitů ve využitých chovatelských podmínkách. Monepantel je látka z třídy aminoacetonitrilových derivátů, která má antinematodní účinnost a představuje jedno z řešení v boji proti rezistenci na běžně používaná anthelmintika (AISLP 2012, Woodward 2012). Po odčervení suspenzí monepantelu v jednotlivé terapeutické dávce byla v mikroskopickém vyšetření prokázána přítomnost vajíček nematodů rodu Chabertia, 51
Trichuris a cestoda rodu Moniezia. Z toho můžeme usoudit, že kromě nálezu tasemnice je k úspěšnému odčervení vhodné také u této látky podat ji opakovaně. Nejranější interval od pozření infekčních larev do produkce prvních vajíček prokázaných v trusu byl 21 dnů. Tato doba odpovídá údajům uvedeným v literatuře, která uvádí rozmezí 14-21 dní (Lax 1956, Ryšavý a Erhardová 1953) a je velmi blízká výsledkům předchozí diplomové práce (Prušková 2008).
52
7
ZÁVĚR
V teoretické části byla vypracována literární rešerše týkající se infekčních chorob ovce domácí se zaměřením na parazitární infekce a hlístici Haemonchus contortus. Experimentální část diplomové práce byla zaměřena na kontrolu účinnosti odčervení zvířat vstupujících do jednotlivých studií. Po kvalitativním vyšetření trusu na přítomnost vajíček parazitů byla zvířatům podána suspenze s L3 larvami dvou různě citlivých kmenů Haemonchus contortus. Navozená infekce byla později sledována v určitých intervalech pomocí kvantitativního vyšetřování trusu. V případě prvního a druhého experimentu byl během infekce podáván zvířatům flubendazol s cílem využití léčiva k vyvolání helmintorezistence. Na konci každého experimentu byla zvířata utracena a z jejich slezů byli izolováni dospělci parazita Haemonchus contortus. Tito červi byli využiti k dalšímu výzkumu v oblasti helmintorezistence na Katedře biochemických věd Farmaceutické fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové. Z provedených experimentů vyplývá, že interval mezi podáním infekčních larev a začátkem vylučování vajíček dospělými červi je v rozmezí 16-26 dní.
53
8
LITERATURA
Seznam literárních zdrojů Axmann R, Sedlák J. Základy veterinární péče o ovce a kozy pro chovatele. 1.vyd. Brno: Svaz chovatelů ovcí a koz v ČR, 2008: 47 s. Bártíková H, Vokřál I, Kubíček V, Szotáková B, Prchal L, Lamka J, Várady M, Skálová L. Import and efflux of flubendazole in Haemonchus contortus strains susceptible
and
resistant
to
anthelmintics.
Veterinary
Parasitology.
2012,
187(3-4): 473-479 s. Černošek A, et al. Zdraví zvířat v drobných chovech. 1.vyd. Praha: Státní zemědělské nakladatelství, 1989: 354 s. Cibulka J, Fučíková A, Hartlová H, Jílek F, Lánská V, Sedmíková M. Základy fyziologie hospodářských zvířat. 1.vyd. Praha: Česká zemědělská univerzita v Praze, 2011: 200 s. Elsheikha HM, Khan NA. Essentials of Veterinary parasitology. Norfolk,UK: Caister Academic Press, 2011: 221 s. Erhardová B, Kotrlý A, Páv J, Ryšavý B. Choroby lovné zvěře. 1.vyd. Praha: Státní zemědělské nakladatelství, 1953: 106 s. Horák F, et al. Chováme ovce. 1.vyd. Praha: Brázda, 2012: 381 s. Horák F, et al. Ovce a jejich chov. 1.vyd. Praha: Brázda, 2004. 303 s. Horák P, Scholz T. Biologie helmintů. 1.vyd. Praha: Karolinum, 1998: 139 s. Chroust K. Výskyt anthelmintické rezistence u strongylidních nematodů ovcí a koní v České republice. Veterinární medicína. 2000, 45 (8): 233 -239 s. Jagoš P, et al. Nemoci hospodářských zvířat. 1.vyd. Praha: Státní zemědělské nakladatelství, 1982: 356 s. Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Meeting. Residues of Some Veterinary Drugs in Animals and Foods: Monographs Prepared by the Fortieth Meeting 54
of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Geneva: Food and Agriculture Organization of the United Nations, 1993, vol 5: 177 s. Komise pre laboratórnu a klinickú diagnostiku. Veterinárne laboratórne metodiky, Parazitológia. 1.vyd. Bratislava: Štátna vetrinárna správa, 1989: 167 s. Kotrlá B, et al. Parazitózy zvěře. 1.vyd. Praha: Academia, 1984: 191 s. Kotrlá B, Kotrlý A. Cizopasné hlístice zažívacího ústrojí spárkaté zvěře v ČSR. 1.vyd. Praha: Academia, 1977: 74 s. Kuchtík J, et al. Chov ovcí. 1.vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2007: 110 s. Lamka J. Ústní sdělení a vlastní fotografie. 2013 Lamka J, Ducháček L. Veterinární léčiva pro posluchače farmacie. 3.vyd. Praha: Univerzita Karlova, nakladatelství Karolinum, 2008: 151 s. Langrová I, Jankovská I, Vadlejch J. Nejčastější gastrointestinální parazité našich ovcí. Náš chov. 2007, 8: 52-53 s. Laštůvka Z, Zoologie pro zemědělce a lesníky. 2.,dopl.vyd. Brno: Konvoj, 2001: 267 s. Lax T. Nemoci ovcí. 1.vyd. Praha: Státní zemědělské nakladatelství, 1956: 209 s. Lochmanová Eva. Hemonchóza ovce domácí - výsledky laboratorní kontroly v průběhu experimentální infekce. Diplomová práce. Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta, Hradec Králové, 2010: 39 s. Marvan F, et al. Morfologie hospodářských zvířat. 3.vyd. Praha: Česká zemědělská univerzita, 2003: 303 s. Miholová B, Lipský D. Anatomie a fyziologie hospodářských zvířat. 2.rozš.vyd. Praha: Státní zemědělské nakladatelství, 1984: 404 s. Páv J, et al. Choroby lovné zvěře. 1.vyd. Praha: Státní zemědělské nakladatelství, 1981: 262 s. Plumb DC. Plumb's Veterinary Drug Handbook. 7th ed. Ames: Willey-Blackwell, 2011: 1208 s. 55
Prušková Ludmila. Výsledky parazitologické kontroly jehňat v grantovém experimentu I. Diplomová práce. Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta, Hradec Králové, 2008: 53 s. Riviere JE, Papich MG. Veterinary Pharmacology and Therapeutics. 9th ed. Ames: Willey-Blackwell, 2009: 1524 s. Roubalová M. Situační a výhledová zpráva: ovce-kozy. Praha: Ministerstvo zemědělství, prosinec 2011: 50 s. Rufener L, Baur R, Kaminsky R, Mäser P, Sigel E. Monepantel Allosterically Activates DEG-3/DES-2 Channels of the Gastrointestinal Nematode Haemonchus contortus. Molecular pharmacology. 2010, 78(5): 895-902 s. Ryšavý B, et al. Základy parazitologie. 1.vyd. Praha: Státní pedagogické nakladatelství, 1989: 215 s. Ryšavý B, Erhardová B. Parasiti ovcí. 1.vyd. Praha: Nakladatelství Československé akademie věd, 1953: 188 s. Sambraus H. Atlas plemen hospodářských zvířat: skot - ovce - kozy - koně - osli prasata: 250 plemen. 1.vyd. Praha: Brázda, 2006: 295 s. Slanina Ľ, Sokol J, et al. Vademecum veterinárneho lekára. 1.vyd. Bratislava: Príroda, 1991: 1182 s. Sutherland I, Scott I. Gastrointestinal Nematodes of Sheep and Cattle: Biology and Control. West Sussex: Wiley-Blackwell, 2009: 242 s. Šnirc J, Sokol J, Seginko J, Hera A, et al. Klinická veterinárna farmakológia. Martin: Neografia, 2007: 1184 s.. Thienpont D, Rochette F, Vanparijs OFJ. Diagnosing Helminthiasis by Coprological Examination. 2.vyd. Beerse, Belgium: Janssen Research Foundation, 1986: 205 s. Van Wyk JA, Hoste H, Kaplan RM, Besier RB. Targeted selective treatment for worm management? How do we sell rational programs to farmers? Veterinary parasitology. 2006, 139(4): 336-346 s.
56
Várady M, Papadopoulos E, Dolinska M, Königová A. Anthelmintic resistance in parasites of small ruminants: sheep versus goats. Helmintologia. 2011, 48(3): 137-144 s. Vějčík A. Teorie a praxe v chovu ovcí: odborná monografie=Theory and practice of sheep breeding: professional monograph. 1.vyd. České Budějovice: Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Zemědělská fakulta, 2007: 72 s. Waller PJ, Chandrawathani P. Haemonchus contortus: Parasite problem No.I from Tropics-Polar Circle. Problems and aspect for control based on epidemiology. Tropical biomedicine. 2005, 22(2): 131-137 s. Wolstenholme AJ, Fairweather I, Prichard R, von Samson-Himmelstjerna G, Sangster NC. Drug resistance in veterinary helminths. Trends in parasitology. 2004, 20(10): 469-476 s. Woodward K. Antiparasitic Drugs. In: Woodward K, Marrs T, Waters MD, Anderson D, Wilks MF, Silley P, Renshaw D. Toxicological Effects of Veterinary Medicinal Products in Humans. Cambridge: The Royal Society Of Chemistry, 2012, vol 2: 95-154 s. Seznam elektronických zdrojů Anonym. Sheep worms control, treatments and advice. In: Novartis Animal Health. 2013. Dostupné na URL: http://www.farmanimalhealth.co.uk/sheep-worms. Přístup: 20. 3. 2013 Blaxter
M.
Haemonchus
contortus
–
Blaxter
Lab
Nematode
Geconomics.
In: Nematodes. 2010. Dostupné na URL: http://www.nematodes.org/nembase4/species_info.php?species=HCC. Přístup 20. 3. 2013 Fox MT. Gastrointestinal Parasites of Sheep and Goats. In: The Merck Veterinary Manual for Veterinary Professional. 2012. Dostupné na URL: http://www.merckmanuals.com/vet/digestive_system/gastrointestinal_parasites_of_rumi nants/gastrointestinal_parasites_of_sheep_and_goats.html?qt=haemonchus%20contortu s&alt=sh. Přístup 20. 3. 2013 57
SÚKL. AISLP mikroverze – ČR 2012, 4. [CD-ROM]. Praha: SÚKL, stav k 1. 10. 2012
58
9
PŘÍLOHY
Příloha 1 Vliv selekčního tlaku (opakované podání dávek flubendazolu) na účinnost a metabolismus flubendazolu (FLU) u Haemonchus contortus – metodika studie Výchozí podmínky: -
plně citlivý kmen ISE, vajíčka a L3 budou otestovány na citlivost k benzimidazolům včetně FLU (Várady)
-
zvířata vstupující do studie budou prostá parazitů, tj. parazitologicky opakovaně zkontrolována, v případech potřeby odčervena (albendazol, 1 x 30 mg/kg ž. hm.) (Lamka)
-
FLU bude podáván enterálně v suspenzi vždy ve třech po sobě jdoucích dnech v dávkách odvozených podle experimentálních nálezů jednotlivých fází studie (Lamka, Skálová, Szotáková)
1. podání flubendazolu a) infekce 6 jehňat, ISE kmen, dávka 5 tis. L3 / zvíře (Lamka) b) in vivo kultivace L3 do stádia dospělých červů (30-40 dní, průběžné sledování EPG), dále rozdělení jehňat do třech skupin po dvou: A skupina: podání FLU, dávka 3 x 1,0 mg/kg ž. hm. B skupina: podání FLU, dávka 3 x 2,5 mg/kg ž. hm. C skupina: kontrolní, podání vehikula suspenze (Lamka) c) sběr experimentálních materiálů / způsoby jejich zhodnocení 1) trus / stanovení EPG (Lamka) 2) trus / materiál pro kultivace L3 a následnou infekci (Lamka) 3) trus / in vitro testy citlivosti vajíček a larev k FLU + modelovým látkám (Lamka, Skálová, Szotáková, Várady) 4) L3 / PCR detekce mutací (Lamka, Bártíková) 2. podání flubendazolu a) infekce celkem 8 jehňat dávkou 5 tis. L3 / zvíře, z toho 6 zvířat bude infikováno L3 vykultivovanými z předchozího podání FLU skupině A či B, 2 zvířata budou infikována L3 vykultivovanými z předchozího podání kontrolní skupině (Lamka)
59
b) in vivo kultivace L3 do stádia dospělých červů (30-40 dní, průběžné sledování EPG), dále rozdělení 6 jehňat do tří skupin po dvou: A skupina: podání FLU, dávka bude určena podle nálezů předchozího podání FLU B skupina: podání FLU, dávka bude určena podle nálezů předchozího podání FLU C skupina: kontrolní, vehikulum suspenze (Lamka) c) sběr experimentálních materiálů / způsoby jejich zhodnocení 1) trus / stanovení EPG (Lamka) 2) trus / materiál pro kultivace L3 a následnou infekci (Lamka) 3) trus / in vitro testy citlivosti vajíček a larev k FLU + modelovým látkám (Lamka, Skálová, Szotáková, Várady) 4) dospělci parazita skupin A-C a C skupiny z 1. podání FLU / PCR detekce mutací (Lamka, Bártíková) 5) dospělci parazita skupin A-C a C skupiny z 1. podání FLU / izolace subcelulárních frakcí (Lamka, Skálová, Szotáková) 6) dospělci parazita skupin A-C a C skupiny z 1. podání FLU / ex vivo ověření FLU transportu a metabolismu v parazitech (Lamka, Skálová, Szotáková) 7) dospělci parazita skupin A-C a C skupiny z 1. podání FLU / izolace RNA (Lamka, Skálová, Szotáková) 3. a další podání FLU obdobně 2. podání
60
Příloha 2 Účinnost a metabolismus flubendazolu (FLU) u citlivých a rezistentních kmenů Haemonchus contortus – metodika studie Výchozí podmínky: -
kmeny ISE (plně citlivý), ISE-S (rezistentní k makrocyklickým laktonům), WR (rezistentní k většině běžných anthelmintik), BR (rezistentní k benzimidazolům) budou vyprodukovány a vajíčka L3 otestována na citlivost k benzimidazolům včetně FLU (Várady)
-
zvířata vstupující do studie budou prostá parazitů, tj. parazitologicky opakovaně zkontrolována, v případech potřeby odčervena (albendazol, 1 x 30 mg/kg ž. hm.) (Lamka)
-
in vivo kultivace L3 do stádia dospělých červů (30-40 dní, průběžné sledování EPG) (Lamka)
Experimentální materiál / způsoby jeho zhodnocení 1) L3, vajíčka / in vitro testy citlivosti s porovnáním citlivostí k modelovým anthelmintikům (TBZ, IVM) (Lamka, Várady) 2) dospělci parazita, L3 / PCR detekce mutací (Lamka, Bártíková) 3) dospělci parazita / ex vivo transport FLU do červů a jeho biotransformace (Lamka, Skálová, Szotáková, Kubíček) 4) dospělci parazita / ex vivo kultivace s FLU a LC/MS identifikace + kvantifikace metabolitů (Lamka, Vokřál) 5) dospělci parazita / izolace subcelulárních frakcí a jejich biotransformační zhodnocení (Lamka, Skálová, Szotáková, Kubíček)
61
