UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA BIOCHEMICKÝCH VĚD
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
STANOVENÍ ENZYMŮ V KLINICKOBIOCHEMICKÉ LABORATOŘI
Vedoucí bakalářské práce: Prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc
HRADEC KRÁLOVÉ, 2014
Eva Macounová
Poděkování: Tímto bych ráda poděkovala panu Prof. MUDr. Jaroslavu Dršatovi, CSc za odborné vedení práce, cenné rady a připomínky poskytované při jejím sestavování.
„Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorských dílem. Veškerá literatura a
další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci jsou řádně citovány. Práce nebyla použita k získání jiného nebo stejného titulu.“
V Hradci Králové ………………….. …………………
OBSAH OBSAH ......................................................................................................................................... 4 1.
ABSTRAKT .......................................................................................................................... 6
2.
ABSTRACT .......................................................................................................................... 7
3.
ÚVOD ................................................................................................................................... 8
4.
CÍL PRÁCE .......................................................................................................................... 8
5.
ENZYMY OBECNĚ .............................................................................................................. 9
5.1 Enzymy podle struktury a funkce ..................................................................................... 9 5.1.1 Rozdělení enzymů dle typu katalyzované reakce ..................................................... 10 5.1.2 Faktory ovlivňující enzymovou reakci ........................................................................ 10 5.2 Enzymy v laboratorní diagnostice .................................................................................. 11 5.2.1 Biologické tekutiny pro stanovení enzymů ................................................................ 11 5.2.2 Lokalizace enzymů v organismu................................................................................ 12 5.2.3 Příčiny zvýšené aktivity enzymů ................................................................................ 12 5.2.4 Průběh nárůstu a poklesu enzymové aktivity ............................................................ 13 5.2.5 Subcelulární lokalizace enzymů ................................................................................ 14 5.2.6 Orgánová specifičnost enzymů .................................................................................. 14 5.2.7 Izoenzymy .................................................................................................................. 15 5.2.8 Využití enzymů v klinické diagnostice ........................................................................ 16 6.
ENZYMY STANOVOVANÉ V LABORATOŘI KLINICKÉ BIOCHEMIE............................ 17
6.1 Oxidoreduktázy ................................................................................................................. 17 6.1.1 Laktátdehydrogenáza- LD (LDH) ............................................................................... 17 6.1.1.1 Patologické změny LD ...................................................................................... 18 6.1.1.2 Metody stanovení LD ........................................................................................ 19 6.2 Transferázy........................................................................................................................ 20 6.2.1 Aminotransferázy ....................................................................................................... 20 6.2.1.1 Alaninaminotransferáza - ALT........................................................................... 20 6.2.1.2 Aspartátaminotransferáza - AST ....................................................................... 21 6.2.1.3 Patologické změny ALT a AST ......................................................................... 23 6.2.1.4 Metody stanovení ALT a AST ........................................................................... 24 6.2.2 Gama-glutamyltransferáza - GMT ............................................................................. 25 6.2.2.1 Patologické změny GMT ................................................................................... 26 6.2.2.2 Metody stanovení GMT ..................................................................................... 27 6.2.3 Kreatinkináza - CK ..................................................................................................... 28 6.2.3.1 Patologické změny CK ...................................................................................... 29 6.2.3.2 Metody stanovení celkové CK........................................................................... 30 6.2.4 Kreatinkináza - srdeční izoenzym MB (CK-MB) ........................................................ 31 6.2.4.1 Patologické změny CK-MB ............................................................................... 32 6.2.4.2 Metody stanovení CK-MB ................................................................................. 32 6.3
Hydrolázy........................................................................................................................... 33
4
6.3.1 Alkalická fosfatáza – ALP .......................................................................................... 33 6.3.1.1 Patologické změny ALP .................................................................................... 34 6.3.1.2 Metody stanovení ALP ...................................................................................... 35 6.3.2 Alfa - amyláza - AMS ................................................................................................. 36 6.3.2.1 Patologické změny AMS ................................................................................... 36 6.3.2.2 Metody stanovení AMS ..................................................................................... 37 6.3.3 Lipáza – LPS .............................................................................................................. 39 6.3.3.1 Patologické změny LPS .................................................................................... 40 6.3.3.2 Metody stanovení LPS ...................................................................................... 40 7. VÝZNAM A POSTAVENÍ ENZYMOVÝCH STANOVENÍ V LABORATORNÍ DIAGNOSTICE INFARKTU MYOKARDU.................................................................................. 42 7.1
Osmdesátá léta ................................................................................................................. 42
7.2 Devadesátá léta ................................................................................................................ 43 7.2.1 Aktivita celkové CK .................................................................................................... 43 7.2.2 CK-MB a CK-MB mass .............................................................................................. 43 7.2.3 Izoformy izoenzymů CK-MB a CK-MM ...................................................................... 44 7.2.4 GPBB ......................................................................................................................... 44 7.2.5 Proteiny ...................................................................................................................... 45 7.2.6 Troponiny ................................................................................................................... 45 7.3 Kardiomarkery na prahu třetího tisíciletí ....................................................................... 46 7.3.1 Markery nekrózy myokardu ....................................................................................... 46 7.3.2 Markery ischemie myokardu ...................................................................................... 47 7.3.3 Nové další metody k průkazu strukturálního poškození myokardu .......................... 47 7.3.4 Natriuretické peptidy ( NP) ......................................................................................... 48 7.4
Současnost ....................................................................................................................... 48
7.5
Vývoj kardiomarkerů - výsledky...................................................................................... 50
8.
DISKUZE ............................................................................................................................ 51
9.
ZÁVĚR ................................................................................................................................ 52
10.
POUŽITÉ ZKRATKY...................................................................................................... 53
11.
SEZNAM OBRÁZKŮ ..................................................................................................... 56
12.
SEZNAM TABULEK ...................................................................................................... 56
13.
POUŽITÉ ZDROJE INFORMACÍ................................................................................... 57
5
1. ABSTRAKT
Smyslem této práce je vypracování přehledu nejpoužívanějších enzymů v laboratoři klinické biochemie. Začátek práce je věnován významu enzymů jako klinickobiochemických analytů. V druhé části jsem si vybrala osm enzymů a jeden izoenzym, které se nejčastěji stanovují v klinických laboratořích, konkrétně na mém pracovišti v soukromé laboratoři Prevedig v Praze. Jedná
se
o
enzymy
láktátdehydrogenáza
(LD),
alaninaminotransferáza
(ALT),
asparátaminotransferáza (AST), glutamyltransferáza(GMT), kreatinkináza (CK) myokardiální izoenzym kreatinkinázy (CK-MB), alkalická fosfatáza (ALP), amyláza (AMS) a lipáza (LPS). Zaměřuji se zde na jejich funkci v organismu, výskyt v jednotlivých tkáních a význam v diagnostice chorob. Dále zde uvádím fyziologické meze používané na mém pracovišti a různé používané metody stanovení s přesnějším důrazem na metodu používanou v laboratoři Prevedig. V poslední kapitole se přesněji zaměřuji na význam enzymů ve vztahu ke stanovení akutního infarktu myokardu. Popisuji zde podrobný vývoj biochemických markerů používaných k jeho stanovení od 50. let minulého století, kdy se začaly v laboratoři stanovovat enzymy, přes postupný objev přesnějších izoenzymů až po nejcitlivější markery využívané v současnosti. V závěru práce je porovnání všech popisovaných kardiomarkerů a určení výhod a nevýhod jednotlivých metod.
6
2. ABSTRACT The purpose of this work is to develop a list of commonly used enzymes in clinical biochemistry laboratory . Start of work is dedicated to the importance of enzymes as clinical biochemical analytes. In the second part, I chose eight enzymes and one of isoenzymes , which are mostly determined in clinical laboratories, specifically on my workplace in the private laboratory Prevedig in Prague: lactate dehydrogenase (LD), alanine aminotransferase (ALT) , asparátaminotransferase (AST), -glutamyltransferase (GGT), kreatine kinase (CK), creatine kinase, myocardial isoenzyme (CK - MB) , alkaline phosphatase (ALP), amylase (AMS) and lipase (LPS). I focus here on their function in the organism, presence in various tissues and thein importance in the diagnosis of diseases. Then I present the physiological limits in my workplace and the different enzymes assays with the precise emphasis on the methods used in the laboratory Prevedig. In the last chapter
is specifically focuses on the importance of
enzymes in relation to the setting of acute myocardial infarction. I describe the development of biochemical markers od AIM from the 50s of last century, up to the present day, that is from enzymes, through the gradual discovery of more accurate isoenzymes to the most sensitive markers used at the present. The comparison of all described cardiac markers and determination of advatages and disadvantages of each method is in the conclusion.
7
3. ÚVOD Ke správné funkci biochemických přeměn probíhajících ve všech živých organismech, je zapotřebí látek bílkovinné povahy – enzymů. Tyto látky fungují jako takzvané biokatalyzátory, které urychlují biochemické reakce. První zmínky o existenci enzymů pochází již z 18. století. V roce 1883 byl popsán první enzym alfa-amyláza, kterou
Payen a Persoz purifikovali
z ječmene. Zjistili, že je termolabilní a vyslovili předpoklad o důležitosti enzymů. Roku 1877 byl navržen termín enzym.
Roku 1893 bylo dokázáno, že enzymy jsou biokatalyzátory
(Václavíková 2006). Velký význam v historii enzymů byla 50. léta 20. století, kdy byla identifikována souvislost mezi poškozením tkání a aktivitou některých enzymů. Pro klinickobiochemickou laboratorní diagnostiku to byl obrovský pokrok. Postupně byly objevovány další enzymy přínosné v laboratorní diagnostice a zavádělo se do praxe stanovení jejich katalytických koncentrací. Sedmdesátá léta se označují jako zlatá éra enzymologie. Téměř každý týden vycházely odborné články o nových enzymech, jak z oblasti živočišné, tak i rostlinné říše. Postupem času bylo objeveno, že enzymy se skládají z izoenzymů a tím docházelo k přesnějšímu laboratornímu stanovení a následnému určení diagnózy a léčby. Na přelomu milénia šel vývoj v laboratorní diagnostice neustále rychle kupředu a postupně se zjišťovalo, že některé enzymy nejsou úplně specifické pro danou tkáň. Nové a stále probíhající výzkumy ukazují existenci citlivějších a specifičtějších analytů, které postupně začínají enzymy v laboratorní diagnostice nahrazovat. Nejlepším příkladem je vývoj analytů v diagnostice infarktu myokardu.
4. CÍL PRÁCE Jako cíl práce jsem si vybrala rešeršní formou popsat 1. Význam enzymů jako klinicko-biochemických analytů. 2. Podrobnou
charakteristiku
vybraných
enzymů
nejčastěji
stanovovaných
v laboratoři klinické biochemie včetně diagnostiky chorob a metod stanovení. 3. Vývoj biochemických analytů v diagnostice akutního infarktu myokardu od doby počátků
stanovení
enzymů
v klinických
laboratořích,
přes
postupné
zdokonalování metod až po postupné nahrazovaní enzymových stanovení metodami citlivějšími a specifičtějšími.
8
5. ENZYMY OBECNĚ V živých organizmech probíhá řada chemických reakcí a většina z nich potřebuje ke svému fungování působení katalytického efektu biologických katalyzátorů - enzymů. Enzymy mají několik důležitých vlastností. Jsou vysoce účinné - reakční rychlost reakce katalyzované enzymem bývá až o několik řádů vyšší než u reakce nekatalyzované. Reakce s enzymem mohou probíhat i za poměrně nízkých teplot, normálního atmosférického tlaku a při neutrálním pH. Dále jsou tyto reakce snadno regulovatelné, což je v živém organismu nezbytně nutné.
5.1
Enzymy podle struktury a funkce Enzym je bílkovinná makromolekula různé velikosti. Mohou být enzymy tvořené pouze
bílkovinnou složkou a enzymy se složkou bílkovinnou i nebílkovinnou. Bílkovinná část se nazývá apoenzym a druhá nebílkovinná kofaktor. Kofaktorem mohou být malé částice často 2+
2+
-,
ionty kovů i nekovů (Cu , Zn , Cl …)kovalentně navázané na bílkovinnou část nazývající se prostetická skupina. Druhou skupinou kofaktorů jsou koenzymy, což jsou malé organické +
molekuly (např. pyridoxal-5´-fosfát, nikotinamidadenindinukleotid (NAD ) ). Koenzymy jsou vázané volně a přechodně, mohou se od enzymů odpojit a poté zase připojit. Aby byl enzym účinný, musí vytvořit se substrátem komplex enzym - substrát (ES). Místo enzymu, kde dochází k navázání substrátu, se nazývá aktivní místo. Je to pouze malé místo na povrchu enzymu a většinou bývá na každém enzymu pouze jedno. Jedná se o trojrozměrný útvar tvořený zbytky aminokyselin, který tvarově odpovídá jakési prohlubni neboli zářezu, kam zapadne molekula substrátu a poté se zde naváže. Aktivní místo obsahuje dva druhy funkčních skupin. První skupinou jsou vazebné skupiny zodpovědné za spojení se substrátem a druhou skupinu tvoří katalytické skupiny zajišťující vlastní katalytickou reakci. Dále se na povrchu enzymů nachází determinantní skupiny (epitopy) zajišťující imunitní charakter molekuly a místa vázající jedy a farmaka (Ledvina a kol. 2003). Hlavní funkcí enzymu je snížení aktivační energie reakce. Aby mohlo dojít ke snížení energie, musí se substrát (stanovovaná látka) navázat na aktivní místo enzymu (E) a vytvořit komplex enzym - substrát (ES). Enzym-substrát se přeměňuje na komplex enzym-produkt (EP). Při jeho rozštěpení dojde k uvolnění enzymu do původního stavu. Základní jednotkou katalytické aktivity enzymu je katal (kat).
Aktivitě jednoho katalu
odpovídá takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 molu substrátu za 1 sekundu za definovaných reakčních podmínek. Dříve se používala mezinárodní jednotka (U). Katalytickou aktivitu 1 U má takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 molu substrátu za 1 minutu za definovaných reakčních podmínek. Katalytická koncentrace aktivity enzymu se vyjadřuje v katalech na litr (kat/l). V praxi se spíše používají kat/l a nkat/l.
9
Názvy enzymů se tvoří podle pravidel stanovených Mezinárodní biochemickou unií (IUB). Názvosloví se rozděluje do dvou kategorií, systematické a triviální. Systematický název přesně popisující reakci se skládá z označení substrátů – reakce – koncovka – asa. Příklad: L- alanin 2-oxoglutarát - amino- transfer – asa Triviální
název
je
kratší
a
obsahuje
označení
substrátu
a
typu
reakce
např:
alaninaminotransferáza.
5.1.1
Rozdělení enzymů dle typu katalyzované reakce Enzymy můžeme rozdělit do šesti tříd podle reakce, kterou katalyzují. První třídou jsou
enzymy katalyzující oxidačně - redukční procesy oxidoreduktázy. Patří sem například laktátdehydrogenáza (LD). Druhou skupinou jsou transferázy katalyzující přenos funkčních skupin z jedné molekuly na druhou. Do transferáz zařazujeme AST, ALT, GMT, CK. Další třídou enzymů jsou hydrolázy např. AMS, ALP, LPS, které katalyzují hydrolýzu určité vazby. Čtvrtou třídou jsou lyázy. Tyto enzymy katalyzují nehydrolytické odštěpování malých molekul, odstranění určité skupiny, nebo jejich vnášení za vzniku vazeb. K páté skupině enzymů patří ligázy, enzymy katalyzující reakce, při kterých se spojí dvě molekuly za vzniku energeticky bohatých sloučenin. Poslední skupinou jsou izomerázy, které katalyzují vzájemné přeměny izomerů vnitřním přeskupením substrátové molekuly.
5.1.2 Faktory ovlivňující enzymovou reakci První důležitou podmínkou pro průběh enzymové reakce je správná teplota. Pro většinu enzymů je teplotní stabilita v rozmezí 20 – 40°C. Jako optimální teplota se považuje 37°C. Po dosažení této teploty začne rychlost reakce klesat, což je způsobeno denaturací bílkovinných molekul enzymu. Druhým důležitým faktorem je pH. Ionizace funkčních skupin aktivního centra enzymu závisí na pH prostředí a tím pH ovlivňuje enzymovou aktivitu. Při optimálním pH probíhá reakce nejrychleji a se vzdalováním od tohoto místa rychlost klesá. Většina enzymů má optimální pH mezi 7 - 8. Některé enzymy tvoří výjimku, například trávicí enzym pepsin, jehož pH optimum je 1.5 - 2.0. Naproti tomu enzymy argináza, glycerolkináza a sukcinátdehydrogenáza, jsou nejaktivnější v mírně alkalickém až alkalickém prostředí. Dalším aspektem je koncentrace substrátu. Pokud je koncentrace substrátu vysoká, probíhá reakce podle reakce nultého řádu, což znamená, že závislost rychlosti na čase je lineární. Pokud je koncentrace substrátu nízká, závislost rychlosti na čase má tvar paraboly a probíhá podle reakce prvního řádu. Rychlost reakce se snižuje a s tím klesá pravděpodobnost, že se molekula substrátu setká s enzymem.
10
K faktorům působícím na enzymovou reakci patří také látky, které reakci urychlují aktivátory, nebo látky které ji naopak zpomalují či úplně zastavují - inhibitory. Jako aktivátory 2+
2+
2+
mohou působit ionty dvojmocných kovů, jako např. Ca , Mg , Zn , Mn 2+
ionty Fe , Fe
3+
2+ ,
+
+,
ale i Na , K nebo
3+
a Co . Inhibitory rozdělujeme do dvou skupin kompetitivní a nekompetitivní.
Inhibitor kompetitivní má podobnou strukturu jako substrát a soutěží s ním o navázání na aktivní místo enzymu. Pokud se inhibitor naváže, nemůže dojít k přeměně. Účinek inhibitoru je závislý na poměru koncentrací inhibitor/substrát, a proto je možné inhibici potlačit nadbytkem substrátu. V tomto případě se jedná o inhibici reverzibilní. Nekompetitivní inhibitor je látka chemicky odlišná od substrátu, která se naváže na jiné než aktivní místo. V současné chvíli se naváže i substrát na aktivní místo, nedochází tedy k soutěžení mezi substrátem a inhibitorem. Navázáním tohoto inhibitoru dojde ke změně konformace molekuly enzymu a to způsobí zpomalení až zástavu reakce. Tuhle inhibici nelze potlačit nadbytkem substrátu a v případě že dojde ke kovalentní vazbě inhibitoru je inhibice nevratná, inhibitor nelze odpoutat. V případě nekovalentní vazby, lze snížit koncentraci inhibitoru a tím pádem může být inhibice vratná. Dále může existovat smíšená inhibice vykazující jak prvky kompetitivní, tak prvky nekompetitivní inhibice. Pokud se inhibitor neváže na volný enzym, ale na komplex enzym - substrát mluvíme o inhibici akompetitivní (Dastych, Breinek a kol. 2011, Ledvina a kol. 2003, Racek a kol. 2006).
5.2
Enzymy v laboratorní diagnostice Vzhledem k tomu, že cílem mé práce je stanovení enzymů v laboratoři klinické
biochemie, není zde podstatné, jakou mají enzymy strukturu a jak probíhá reakce katalyzovaná enzymem. Mnohem důležitější je, kde se stanovované enzymy v těle nacházejí, jaká je zde jejich úloha a kdy jsou uvolňovány do krevního oběhu, kde je můžeme následně stanovit.
5.2.1 Biologické tekutiny pro stanovení enzymů V klinické laboratoři stanovujeme enzymy nejčastěji z krevního séra, protože krev je biologická tekutina protékající všemi orgány a tkáněmi, takže nejlépe odráží jejich stav a složení. Také odběr krevního vzorku je velmi snadný. Dále můžeme stanovovat enzymovou aktivitu v moči. Glomerulární membrány zdravých ledvin představují pevnou bariéru pro bílkoviny a tedy i pro enzymy. Z běžně vyšetřovaných enzymů se za běžných podmínek dostává moče pouze -amyláza díky své malé molekule. V některých případech se mohou enzymové aktivity stanovovat i z žaludeční a duodenální šťávy, mozkomíšního moku, exsudátů a transudátů. V případě vyšetření enzymových defektů se odebírají bioptické vzorky tkání, které se nadále zpracovávají. Tyhle metody se však v běžné rutinní praxi nepoužívají, podstatné je
11
vyšetřovaní enzymové aktivity z krevního séra, případně plazmy a vyšetření aktivity - amylázy z moče ( Dršata 1983).
5.2.2 Lokalizace enzymů v organismu Enzymy nalézané v plazmě můžeme rozdělit do dvou typů. První skupinou jsou enzymy, které jsou v plazmě přítomny za normálních okolností a hrají zde svoji úlohu. Jedná se například o enzymy krevního srážení. Dále se zde nacházejí enzymy uvolněné z buněk různých tkání neplnící zde žádnou funkci a za fyziologických podmínek je jejich koncentrace minimální. Enzymy nespecifické pro plazmu rozdělujeme na enzymy buněčné a sekreční. Buněčné jsou enzymy buněčných metabolických dějů a v buňce jsou buď rozpuštěné v cytoplazmě, nebo vázané na buněčné struktury například na mitochondrie. Mezi intracelulární enzymy patří z nejznámějších ALT, AST, LD a CK. Pokud dojde k poškození buněk, vyplavují se tyto enzymy do krve, kde se projeví vzestupem jejich koncentrace. Příkladem je AST, jejíž hladina se zvyšuje při nekróze hepatocytu. Při mírnějším poškození se uvolňuje cytoplazmatická AST, následně při vyšším poškození AST z mitochondrií. Enzymy secernovány buňkami žláz do extracelulárního prostoru, nikoliv však do plazmy, se nazývají sekreční. Typickým příkladem sekrečních enzymů jsou enzymy trávící (Táborská 2008).
5.2.3 Příčiny zvýšené aktivity enzymů Při patologickém poškození buněk například chemickými látkami, anoxií, hypoxií, zánětem nebo viry dochází ke zvýšení permeability buněčné membrány, což může vést až k buněčné degradaci. Při odumírání buňky dochází k aktivaci fosfolipáz, a tím k odbourávání fosfolipidů membrány, což vede k jejímu proděravění. V důsledku pronikají makromolekuly z cytoplazmy do extracelulárního prostoru a následně odtud do krve. Jedná se o nejčastější způsob patologického uvolňování enzymů z buněk. Další příčinou zvýšené aktivity enzymů v krvi je jejich zvýšená syntéza. Dobrým příkladem je zvýšená hodnota alkalické fosfatázy v séru u dětí díky zvýšené aktivitě osteoblastů při růstu kostí. Zvýšené uvolňování enzymů z buněk může nastat i bez souvislosti s buněčnou smrtí nebo zvýšenou syntézou. Například vlivem etanolu může dojít k expresi mitochondriální AST na povrch hepatocytu a následnému uvolnění do krve. Některé jaterní enzymy (ALP, GMT) jsou vázány na povrch hepatocytů, které jsou v kontaktu se žlučovými kanálky. Při zadržení odtoku žluče dojde ke zvýšení koncentrace žlučových kyselin, což může vyvolat uvolnění membránových fragmentů s navázanými enzymy do cirkulace. V některých případech může
12
být zvýšená hladina enzymů způsobená nedostatečným odstraňováním z cirkulace. Malé enzymy, amyláza a lipáza, jsou z oběhu odstraňovány glomerulární filtrací. V případě renálního selhání se zvyšuje jejich hladina v krvi. Proti některým enzymům se vytváří v krvi protilátky. Dochází k tvorbě komplexů enzym - protilátka tzv. makroenzymy (Táborská 2008). Z praktického hlediska můžeme buněčné enzymy rozdělit na tři druhy. Prvním jsou lyoenzymy, které můžeme snadno extrahovat z buněk i bez porušení buněčné membrány. Druhým jsou endoenzymy, které lze extrahovat při porušení buněčné membrány. Posledním jsou desmoenzymy, enzymy vázané na organely, které můžeme extrahovat až po rozrušení organel (Dršata 1983).
5.2.4 Průběh nárůstu a poklesu enzymové aktivity Časový průběh nárůstu a poklesu enzymové aktivity je ovlivněn řadou faktorů. V případě buněčné smrti se membránové defekty prohlubují s časem, tudíž se z buňky nejprve uvolňují menší molekuly a následně potom velké. Například při infarktu se jako první uvolňují AST a CK, protože jsou menší než LD, která se uvolňuje až později. Enzymy vázány k membránám nebo lokalizovány v mitochondriích se uvolňují až při nekróze buněk na rozdíl od enzymů cytoplazmatických. Dobrým příkladem je cytoplazmatická a mitochondriální AST. Množství enzymu v krvi odpovídá úměrně počtu poškození buněk. Například aktivita celkové CK u infarktu myokardu (IM) odpovídá velikosti ložiska infarktu. V případě vymizení příčiny poškození buněk, zvýšená hladina enzymové aktivity po určitou dobu přetrvává a následně poté klesá. Například při akutní hepatitidě je možné na základě sledování enzymových aktivit rozlišit virovou hepatitidu od ischemického nebo toxického poškození. Při toxickém nebo ischemickém poškození dochází k rychlejšímu návratu k normálu na rozdíl od virových hepatitid, kdy imunologické poškození buněk prodlužuje buněčné odumírání provázené uvolňováním enzymů. Dalším faktorem je gradient koncentrace enzymu mezi buňkou a plazmou. Například v cytoplazmě hepatocytu má nejvyšší hladinu AST následně ALT a mnohokrát méně LD. Při poruše jaterní buňky je proto v séru zaznamenán nejrychlejší nárůst AST.
Podobně u
myokardu má CK mnohem vyšší gradient než LD. Hladina enzymu je také ovlivněna rychlostí jeho odstraňování. Nízkomolekulární enzymy jsou z krve odstraněny pomocí glomerulární filtrace do moče. Většina ostatních enzymů je v plazmě
inaktivována,
a
poté
odstraňována
buňkami
retikuloendotelového
systému
receptorově zprostředkovanou endocytózou. Doba, po kterou je enzymová aktivita v krvi zvýšená se nazývá biologický poločas. To je čas, za který by množství enzymu kleslo na polovinu za předpokladu, že by enzym nebyl do plazmy doplňován ze tkání. Hodnota biologického poločasu je u různých enzymů velice odlišná, s čímž je třeba počítat při
13
interpretaci výsledků. V následující tabulce jsou uvedeny biologické poločasy nejznámějším enzymů (Táborská 2008).
Tabulka 1 Biologické poločasy běžně stanovovaných enzymů
Biologický Enzym
poločas
ALP
3-7 dní
AMS
9-18 hodin
ALT
2 hodin
AST
12-14 hodin
CHS
10 dní
CK-MB
10 hodin
GMT
3-4 dny
LD-1
4-5 hodin
LD-5
10 hodin
LPS
7-14 hodin
5.2.5 Subcelulární lokalizace enzymů Buněčné enzymy mohou být v rámci jedné buňky lokalizovány na různých místech. Nejlepším příkladem je buňka hepatocytu. ALT, cytoplazmatický izoenzym AST (30 % AST) a LD jsou umístěny v cytoplazmě. Při poškození membrány se tyto enzymy uvolní a dostávají se do sinusoidů. Důsledkem je zvýšená hladina v plazmě a v séru. 70 % AST se nachází v mitochondriích a primárně se uvolňuje při jejich poškození například alkoholem. ALP a GMT jsou na povrchu hepatocytů a uvolňují se převážně při cholestáze v důsledku působení žlučových kyselin na membránu. GMT se nachází také v mikrosomech, kde je indukována některými léky. V Golgiho komplexu a endoplazmatickém retikulu jsou obsažené GMT, AMS a cholinesteráza (CHS). V lyzosomu se naopak nachází kyselá fosfatáza (Táborská 2008).
5.2.6 Orgánová specifičnost enzymů Různé tkáně a orgány obsahují různé enzymy podle toho, jaké jsou jejich funkce a jaké v nich probíhají biochemické přeměny. Rozlišujeme enzymy orgánově specifické a enzymy přítomné ve všech buňkách v organismu. Jestliže chceme stanovit, který orgán je poškozen pomocí enzymů, musíme hledat enzymy specifické pro určitý orgán. Například lipáza se nachází pouze v pankreatu. Amyláza v pankreatu a příušní slinné žláze. Alkalická fosfatáza se
14
nachází v játrech, žlučovodech, ledvinách a v kostech, přičemž větší koncentraci nalézáme v kostech a žlučovodech. Celková kreatinkináza je obsažena přibližně stejně v myokardu a příčně pruhovaném svalu. ALT nalezneme v játrech, myokardu a příčně pruhovaném svalu, ale nejvíce v játrech, proto se jedná o specifický jaterní enzym. Velký význam má stanovení izoenzymů, umožňuje nám identifikaci poškozené tkáně, ze které pocházejí dané enzymy. Jak enzymy orgánově specifické, tak nespecifické jsou v orgánech zastoupeny v různých koncentracích. V případě, kdy je v orgánu zastoupeno více enzymů, nazývá se jejich relativní zastoupení enzymový rejstřík. Různé orgány mají různé enzymové rejstříky. V případě takového poškození buněk, kdy jsou poškozeny všechny struktury, vyplaví se všechny enzymy do krve. Enzymový rejstřík séra je v podstatě stejný jako enzymový rejstřík poškozeného orgánu. V případě mírnějšího poškození buněk daného orgánu se vyplavují jen enzymy volně obsažené v cytosolu, tudíž se enzymový rejstřík séra liší od enzymového rejstříku orgánu. Rejstříky orgánů a séra (plazmy) se nemusí také shodovat z dalších důvodů. Tím může být fakt, že různé enzymy mají různé biologické poločasy a také často bývá poškozeno více orgánů najednou. Přesto však porovnání enzymových rejstříků může přispět ke stanovení diagnózy a následně také k určení rozsahu buněčného poškození (Dršata 1983).
5.2.7
Izoenzymy Izoenzymy jsou molekuly enzymů se stejnou funkcí - katalyzují stejnou reakci, ale liší se
svou primární strukturou a tedy i fyzikálně chemickými vlastnostmi. Různé tkáně obsahují různé izoenzymy, které se mohou lišit afinitou k různým substrátům a také možností regulace jejich aktivity. Jednotlivé izoenzymy můžeme dále rozlišovat na izoformy lišící se obsahem cukerné složky. Typickým příkladem je alkalická fosfatáza. V organismu se vyskytuje ve formě tří izoenzymů placentárním, kostním a střevním. Kostní izoenzym má tři izoformy vyskytující se v kostech, játrech a ledvinách (Racek a kol. 2006). Nejčastější metodou pro průkaz izoenzymů je jejich rozdělení pomocí elektroforézy, to znamená pomocí jejich různé pohyblivosti v elektrickém poli. K dalším metodám pro rozlišení izoenzymů se využívá inhibice teplem, chemická inaktivace a dále rozdílné imunologické vlastnosti.
Stanovení izoenzymů nám umožňuje přesnější určení poškození tkáně než při
stanovení celkové hladiny enzymu. Stanovení izoenzymů nám může pomoci v diagnostice choroby i v případě, kdy je aktivita celkového enzymu ve fyziologických rozmezích.
15
5.2.8
Využití enzymů v klinické diagnostice
Hlavními důvody proč je požadováno stanovení enzymů v klinické diagnostice, je detekce poškození dané tkáně, identifikace počátku jejího poškození a stanovení rozsahu poškození. Pokud potřebujeme odhadnout, k jak závažnému poškození buněk došlo. Dále ke stanovení diagnózy základního onemocnění a následně dalších diagnóz v rámci poškozeného orgánu. K upřesnění diagnózy nám může pomoci stanovení katalytické koncentrace, která je přímo úměrná ke stupni poškození orgánu. Pokud chceme specifičtější výsledek, můžeme stanovit jednotlivé izoenzymy. Při těžkém poškození orgánu nám může pomoci stanovení přítomného spektra enzymů v krvi. Například u jaterního poškození LD > AST > ALT. Výpočet poměru enzymových aktivit je též dobrý k upřesnění diagnózy. může pomoci k určení fáze onemocnění.
16
Monitorování enzymové aktivity nám
6. ENZYMY STANOVOVANÉ V LABORATOŘI KLINICKÉ BIOCHEMIE 6.1
Oxidoreduktázy
6.1.1 Laktátdehydrogenáza- LD (LDH) +
(L- laktát NAD oxidoreduktáza EC 1.1.1.27.) Laktáthedydrogenáza je enzym patřící do skupiny oxidoreduktáz a katalyzující poslední reakci anaerobní glykolýzy redukci pyruvátu na laktát. Je obsažen ve většině tkání lidského těla, především v játrech, ledvinách, srdečních a kosterních svalech, nádorových buňkách a krevních elementech. Strukturu LD tvoří čtyři podjednotky (tetramer) typu H ( heart = srdce ) a
M
(muscle = sval). Kombinací těchto podjednotek vzniká 5 izoenzymů, které můžeme stanovit z krevního séra.
Obr. 1 Pyruvát je redukován na laktát za spotřeby NADH (nikotinamidadenindinukleotid redukovaná forma) ( YIKRAZUUL 2009)
Tabulka 2 Izoenzymy LD izoenzym
podjednotky
výskyt
LD1
H4
myokard+ erytrocyty
LD2
H3M
myokard+erytrocyty
LD3
H2M2
kosterní svaly
LD4
HM3
játra+kosterní svaly
LD5
M4
játra+ kosterní svaly
17
Izoenzymy obsahující podjednotky H mají schopnost katalyzovat i oxidaci homologického substrátu hydroxybutyrátdehyrogenázy (HBD). Aerobně pracující tkáně (srdce) obsahující více podjednotek H preferují jako substrát laktát. Tkáně obsahující M podjednotky mající anaerobní metabolismus preferují substrát pyruvát. Laktátdehydrogenázu můžeme vyšetřovat ze séra a z plazmy. Nesmí se stanovovat hemolytické vzorky, je zde riziko falešně pozitivního výsledku. Stabilita LD je 3 dny při teplotě 2 - 8°C (Dastych,Breinek a kol. 2011, Racek a kol. 2006).
Referenční meze 0D – 2R 3.75 – 10.00 kat/l 2R – 15R 2.00- 5.00 kat/l 15R – 99R 1.60 – 3.20 kat/l (D – dny, R - roky) Hodnota LD je ovlivněna sezónními vlivy, v létě hodnoty rostou až o 20%. Aktivita LD klesá bezprostředně po jídle, při sníženém příjmu tuků a při poloze vleže. Naopak roste s rostoucí tělesnou hmotností. Dále je vyšší u černé populace a v pupečníkové krvi. Během těhotenství se aktivita nemění. ( Prevedig 2008)
6.1.1.1
Patologické změny LD
1. Onemocnění myokardu Pro onemocnění myokardu je typické zvýšení izoenzymů LD 1 a LD2. Ve srovnání s ostatními enzymy stanovanými při IM, stoupá nejpomaleji. Ke zvyšování dochází za 6 -12 hodin po atace, k maximálním hodnotám dochází za 24-60 hodin a k návratu k normálním hodnotám za 7-15 dní. Nejvhodnější doba stanovení LD pro správné rozpoznání IM je po 5 dnech, kdy se hodnoty ostatních enzymů (CK, AST) vrátily do normálních hodnot. V případě reinfarktu a náhlé srdeční nedostatečnosti dochází též k vzestupu LD. Při IM může být hodnota LD zvýšená až 8x a převažuje izoenzym LD1 nad LD2. Poměr LD1/LD2 je větší než 1, normálně tomu bývá naopak. Při infarktu plic stoupá hodnota LD 2 - 4x a na rozdíl od IM už během prvních 24 hodin. 2. Onemocnění jater Při poškození jater se zvyšují převážně izoenzymy LD 4 a LD5. U poškození jater organickými rozpouštědly dochází ke zvýšení všech enzymů v buňce, hodnota LD se může zvýšit až 100x a převyšuje zvýšené hodnoty AST a ALT. Při akutním selhání jater se aktivita LD
18
zvyšuje 10 - 20x. V porovnání s ostatními enzymy v pořadí LD > AST > ALT > GMT. U maligních nádorů, kdy dochází k metastáze do jater, pozorujeme zvýšení LD přibližně 5x. V tomto případě se zvyšuje i LD3. U hepatitidy a při infekční mononukleóze se zvyšuje LD pocházející z monocytů, jedná se o izoenzym 3 a hodnota se zvyšuje přibližně 5x. U akutní virové hepatitidy se LD zvýší 2 - 3krát, u jaterní cirhózy a obstrukčního ikteru maximálně 2krát. 3. Krevní choroby U hemolytických a megaloblastových anemií se hodnoty zvyšují 10krát i více. U hematologických malignit výše LD koreluje s velikostí nádoru 1. Ostatní nemoci Při progresivní svalové dystrofii roste hladina LD4 a LD5 2 - 5krát. U onemocnění ledvin dochází k přibližně dvojnásobnému zvýšení LD1 a LD2 při tubulární nekróze, pyelonefritidě a infarktu ledviny (Masopust 1998).
Metody stanovení LD
6.1.1.2
Metoda doporučená Mezinárodní federací klinické chemie (International Federation of Clinical chemistry; IFCC). Jedná se o metodu referenční. Substrátem je zde L- laktát, který je +
oxidován laktátdehydogenázou na pyruvát za současně probíhající redukce (NAD ) na redukovaný (NADH). L-laktát + NAD <----LD----> Pyruvát + NADH + H +
+
Metoda používaná laboratoří Prevedig Laktátdehydrogenáza je zde stanovaná na automatickém analyzátoru firmy Beckman Coulter - Unicel DxC 800 Systém ve spojení se Sychron systémem a reagencií LD. Jedná se o měření aktivity enzymatickou rychlostní (rate) metodou na výše uvedeném principu doporučeném IFCC. Systém Synchron automaticky dávkuje příslušné objemy vzorků a reagencie do kyvety. Používá se zde poměr 1 díl vzorku ku 20 dílům reagencie. Měří se zde změna absorbance při 340 nm, která je přímo úměrná aktivitě LD ve vzorku ( Beckman Coulter 2005). Jiné metody Druhou metodou používanou dříve než byla popsaná referenční metoda je metoda opačná, kde je substrátem pyruvát. Ten je v přítomnosti NADH redukován na laktát za +
současné oxidace NADH na NAD . +
Pyruvát + NADH + H <----LD----> L-laktát + NAD
19
+
Metody založené na redukci tetrazoliových solí Tato metodika se používá jak pro stanovení celkové aktivity LD, tak pro vizualizaci aktivity izoenzymů LD po rozdělení elektroforézou. Laktát je účinkem LD v přítomnosti NAD oxidován na pyruvát za současné redukce NAD
+
+
na NADH. NADH redukuje pomocí
fenazinmetosulfátu tetrazoliovou sůl na barevný formazan, který je velmi stabilní a ve vodě nerozpustný (Dastych,Breinek a kol. 2011). Stanovení izoenzymů LD Nejčastěji se používá rozdělení pomocí elektroforézy, kdy LD 1 se pohybuje k anodě a LD5 ke katodě. Klasickou metodou je elektroforéza na agarozovém gelu, důležité je zde chlazení při elektroforetickém dělení, protože LD4 a LD5 jsou termolabilní. K detekci se používají tetrazoliové soli nebo fluorescenční vizualizace. Stanovení izoenzymů laktátdehydrogenázy lze i pomocí ionexové chromatografie a pomocí metod eliminujících jednotlivé enzymy na základě inaktivace či inhibice.
6.2
Transferázy
6.2.1 Aminotransferázy Enzymy
s dřívějším
názvem
transaminázy
katalyzují
přenos
aminoskupiny
z aminokyseliny na ketokyselinu a obráceně. Stanovení aminotransferáz se považuje za nejcitlivější a nejrychlejší v oblasti vypovídající o funkčním stavu a integritě celé jaterní buňky. V běžné
laboratorní
diagnostice
se
stanovuje
aktivita
dvou
aminotrasferáz
-
alaninaminotrasferázy (ALT) a aspartátaminotransferázy (AST). Obě dvě jsou citlivými indikátory hepatobiliárních poruch. V séru jsou přítomny jako holoenzymy nebo apoenzymy závislé na asociaci s kofaktorem pyridoxal-5-fosfátem. ALT je ve srovnání s AST specifičtější pro jaterní poškození. Pro určení vážnosti poškození hepatocytu se počítá poměr AST/ALT de Ritisův index. Poměr vyšší než 0,7 - 1,0 svědčí o závažnějším jaterním poškození.
6.2.1.1
Alaninaminotransferáza - ALT
(L-alanin: 2-oxoglutarátaminotransferáza, EC 2.6.1.2) Funkcí ALT je přenos aminoskupiny z alaninu na oxoglutarát za vzniku glutamátu a pyruvátu. Vyskytuje se převážně v cytoplazmě hepatocytů a v buňkách ledvin. V menším
20
množství jí najdeme ve všech tkáních kde je AST tj. v srdečním a kosterním svalu, pankreatu, slezině, plicích a erytrocytech, proto hemolytické vzorky mohou způsobit falešnou pozitivitu. ALT se vyskytuje pouze v cytoplazmě buněk, ze které se uvolňuje do krevní cirkulace, kde má poločas asi 48 hodin. Diagnostická senzitivita ALT se uvádí kolem 83 %. ALT je stabilní v séru 2 dny při teplotě 2 - 8 °C.
Obr. 2. Funkce ALT (Vejražka 2010)
6.2.1.2
Aspartátaminotransferáza - AST
(L-aspartát: 2-oxoglutarátaminotransferáza, EC 2.6.1.1.) Enzym AST přenáší aminoskupinu z aspartátu na oxoglutarát za vzniku glutamátu a oxalacetátu. Nachází se v srdečním a kosterním svalu, játrech, ledvinách, pankreatu, slezině, plicích a erytrocytech. Stejně jako u ALT je problém se stanovením hemolytických vzorků. AST se nachází asi 35% v cytoplazmě a zbytek v mitochondriích. Cytoplazmatická AST se uvolňuje do krve při mírném poškození hepatocytu, mitochondriální až při nekróze jaterní buňky. Poločas cirkulace v krvi je u AST jen 18 hodin. Diagnostická specifita i senzitivita je pod 70 %. Stabilita AST v séru je 7 dní při teplotě 2-8°C (Racek 2006 a kol, Masopust 1998, Schneiderka a kol. 2004, Dastych,Breinek a kol. 2011, Zima a kol. 2007).
21
Obr. 3 Funkce AST ( Vejražka2010)
Referenční meze ALT 0D – 6T 0,05 – 0,73 kat/l 6T – 1R 0,05 - 0,85 kat/l 1R – 15R 0,05- 0,71 kat/l 15R – 99R 0,05 – 0,75 kat/l AST 0D – 6T 0,38 – 1,21 kat/l 6T – 1R 0,27 – 0,97kat/l 1R – 15R 0,10 – 0,63kat/l 15R – 99R 0,05 – 0,65 kat/l Snížená aktivita ALT i AST je v těhotenství a v poloze vleže. Aktivita je přímo úměrná tělesné hmotnosti, proto bývá u mužů vyšší než u žen. Zvýšené hodnoty můžeme naměřit po fyzické zátěži. Vyšší hodnoty nalézáme fyziologicky u dětí, s přibývajícím věkem dochází k jejich poklesu. Hodnota ALT může kolísat ze dne na den o 10-30 % jak u zdravých osob tak i osob s jaterním poškozením. U AST je to přibližně o 15-20 % ( Prevedig 2008).
22
6.2.1.3
Patologické změny ALT a AST
1. Akutní virová hepatitida Při akutním virovém poškození jater dosahují ALT i AST nejvyšších hodnot. V prodromálním stádiu onemocnění dosahují přibližně dvojnásobných hodnot, na vrcholu onemocnění 7 - 12. den po nástupu ikteru mohou hodnoty dosahovat zvýšení 20x - 100x u ALT a 10x - 100x u AST. Průměrně hodnoty dosahují hodnot odpovídajícím přibližně 50-ti násobnému zvýšení. Po druhém týdnu dochází k sestupu hodnot a k normalizaci kolem 8. týdne. U hepatitidy B a cholestatické formy je normalizace hodnot pomalejší přibližně 12. týden. U nekomplikovaného průběhu virové hepatitidy je poměr AST/ALT < 0.7, u nekrotizujícího typu je však vyšší než 0,7. U chronických hepatitid dochází pouze k 2 - 5 - ti násobnému zvýšení hodnot ALT a AST. 2. Cirhóza U posthepatické, primární biliární a alkoholové toxické cirhózy dochází ke zvýšení přibližně 2-3x. Při alkoholickém poškození jater bývá vyšší hodnota AST než ALT. Dokazuje to de Ritisův index, kde poměr AST/ALT je vyšší než 2. 3. Akutní toxické poškození U toxického poškození jater chlorovanými uhlovodíky a faloidinem může být vzestup hodnot až 30 – ti násobný. U poškození chlorpromazinem je pouze mírné zvýšení přibližně 1,5x. 4. Infekční mononukleóza U infekční mononukleózy dochází též k výraznému zvýšení hodnot obou aminotransferáz až 20x. 5. Ostatní nemoci Při nástupu obstrukčního ikteru může dojít až k 10- ti násobnému zvýšení, jde však pouze o přechodné zvýšení a po několika dnech se hodnoty vrací k normálu. Při karcinomu jater se hodnoty ALT a AST zvyšují 5x - 10x. Dále můžeme najít zvýšené hodnoty při steatóze, metastázách do jater a při srdečním selhání, kdy dochází k městnání krve v játrech. Při městnání krve v játrech se jedná o zvýšení až 50x. Převážně AST stoupá při onemocnění kosterních svalů - v časném stadiu svalové dystrofie, po zhmoždění svalů, při otravě oxidem uhelnatým a v šoku. Snížení aktivity aminotransferáz v séru je známkou nedostatku vitamínu B6 ( pyridoxinu). Derivát pyridoxidu pyridoxalfosfát je koenzymem aminotransferáz (Masopust 1998, Schneiderka a kol. 2004, Zima a kol. 2007, Racek a kol. 2006).
23
Metody stanovení ALT a AST
6.2.1.4
Metody používané laboratoří Prevedig V naší laboratoři používáme metody doporučené IFCC. Vyšetřujeme je na automatickém analyzátoru Unicel DxC 880i Systém ve spojení se Synchron Systémem,
s reagenciemi ALT
nebo AST a kalibrátorem Synchron Systems Enzyme Validator Set. Jedná se o kvantitativní stanovení
aktivity
pyridoxal-5-fosfát
asparátaminotransferázy
(AST)
a
alaninaminotransferázapyridoxal-5-fosfátu (ALT). ALT - Při reakci zde ALT katalyzuje reverzibilní transaminaci L-alaninu a alfa-ketoglutarátu na pyruvát a L-glutamin. Pyruvát je dále redukován na laktát v přitomnosti LD za současné oxidace +
NADH na NAD . Pyridoxal-5-fosfát zde funguje jako kofaktor nezbytný pro aktivitu transaminázy aktivovaný pomocí Schiffovy báze. Systém Synchron zde dávkuje poměr jednoho dílu vzorku k 11 dílům reagencie. Systém monitoruje rychlost změny absorbance při 340 nm po pevně daný časový interval. Rychlost změny absorbance je přímo úměrná aktivitě ALT ve vzorku. AST- Při reakci zde AST katalyzuje reverzibilní transaminaci L-asparátu a alfa-ketoglutarátu na oxalacetát
a
L-glutamát.
Oxalacetát
je
dále
redukován
na
malát
v přítomnosti
+
malátdehydrogenázy (MDH) za současné oxidace NADH na NAD . Funkce pyridoxal-5-fosfátu, poměr vzorku s reagencií a vlnová délka, kde se měří rychlost změny absorbance, jsou stejné jako u ALT ( Beckman Coulter 2005). Ve většině laboratoří se dnes používají kvantitativní optické metody stanovení založené na výše uvedeném principu. Jedinou výjimkou jsou metody bez přidání pyridoxal-5- fosfátu, ale ty se dnes již skoro nepoužívají.
Ostatní metody stanovení (dříve používané) ALT Druhou metodou dnes již pro rutinní vyšetření nepoužívanou je barevný test end point dle Reitman-Frankel, kde vzniklý pyruvát reaguje s dinitrofenylhydrazinem na dinitrofenylhydrazon, jehož vybarvení se alkalizuje přidáním NaOH. AST Opět se zde dříve používal barevný test Reintman-Frankel. Vzniklý oxalacetát podléhá spontánní dekarboxylaci na pyruvát, který reaguje dinitrofenylhydrazinem stejně jako u ALT za vzniku hnědočerveného zbarvení. Dalším byl kvalitivní barevný test používaný na transfuzních odděleních k vyloučení nevhodných dárců krve. Byl založen na reakci barviva Fast fioleť B s kyselinou oxaloctovou za vzniku žlutohnědé barvy (Nezbeda 2014).
24
6.2.2 Gama-glutamyltransferáza - GMT (gama-glutamyl-peptid: aminokyselina gama-glutamyl transferáza, EC 2.3.2.2.) Tento enzym katalyzuje hydrolýzu antioxidantu glutationu, nebo přenos gamaglutamylového zbytku z gamaglutamylových peptidů na jiné peptidy nebo aminokyseliny. GMT se účastní transportu aminokyselin z extracelulární tekutiny do buňky. Štěpení glutationu je nezbytné pro to, aby mohl být absorbován. Funkcí GMT je tedy schopnost udržení intracelulární koncentrace glutationu a zabránění jeho ztrátám vylučováním. GMT je přítomna v membránách mnoha tkání, především v ledvinách, pankreatu, játrech, žlučovodech, střevě ale i v srdci, slezině, mozku, prostatě a seminálních váčcích, což vysvětluje, proč mají muži vyšší aktivitu. GMT je rovněž přítomná v placentě, což je příčinou zvýšené aktivity u novorozenců. Díky subcelulární lokalizaci se uvolňuje do příslušných sekretů převážně do žluče a v malém množství také do krve. U stanovení GMT nevadí kontakt s erytrocyty, tudíž můžeme změřit hemolytický vzorek. Stabilita vzorku v séru je 7 dní při teplotě 2-8 °C (Racek a kol. 2006, Zima a kol. 2007, Schneiderka a kol. 2004).
Obr. 4 Gama-glutamylový cyklus (Vejražka 2010)
25
Referenční meze Muži 0 - 0,92 kat/l Ženy 0 - 0,63 kat/l Fyziologické zvýšení GMT nalezneme, jak bylo již uvedeno u mužů a novorozenců. Vyšší aktivita je též u obézních osob díky steatóze jater. V těhotenství není hladina GMT ovlivněna (Prevedig 2008).
6.2.2.1
Patologické změny GMT
Zvýšené hodnoty GMT provází především onemocnění jater. 1. Virové hepatitidy Při akutní virové hepatitidě dochází ke zvýšení přibližně 2x - 5x. Pokud má onemocnění normální průběh je zvýšení mírnější, než pokud průběh provází cholestáza. U chronické formy se GMT zvyšuje až 6x a bývá vyšší než aminotransferázy. Poměr GMT/AST dosahuje v tomto případě hodnot 1-3. Při posthepatické cirhóze dochází ke zvýšení GMT jen mírně asi 1,5x.
2. Alkoholové poškození jater Při chronické alkoholové toxické hepatitidě se aktivita GMT zvyšuje až 10x. Poměr GMT/AST je 6, což nám umožňuje odlišení od ostatních chronických hepatitid. U alkoholtoxické cirhózy je hodnota GMT zvýšená průměrně 7násobně. 3. Ostatní jaterní poruchy U primární biliární cirhózy a obstrukčního ikteru je aktivita GMT vyšší přibližně 10x. K mírnému zvýšení dochází u steatózy jater, u anikterické formy cholelitiázy, akutní cholecystitidy a také u infekční mononukleózy. K významným diagnózám patří také akutní toxické poškození jater léky nebo jedy, kdy se GMT může zvýšit až 10x. 4. Jiné poruchy K mírnému zvýšení aktivity GMT dochází při metastázách do jater a při městnání krve v játrech při poškození srdce. Gama-glutamyl transferáza se též mírně zvyšuje při infarktu myokardu. Významný je také karcinom hlavy pankreatu, kde se GMT zvyšuje 5x - 15x. Zvýšenou hodnotu můžeme stanovit i při zvýšené činnosti štítné žlázy. Naopak při snížené činnosti je aktivita GMT snížená. Významnou skutečností je, že hladina GMT je vyšší u kuřáků. Vyšší hodnoty GMT byly naměřeny i u pacientů s diabetem, revmatoidní artritidou a obstrukční plicní nemocí (Masopust 1998, Schneiderka a kol. 2004, Zima a kol. 2007).
26
6.2.2.2
Metody stanovení GMT
Metoda používaná laboratoří Prevedig Opět se jedná o metodu doporučenou IFCC. Metoda se provádí na analyzátoru Unicel DxC 880i Systém ve spojení se Sychron systémem, reagencií - glutamyl transferase reagent (GGT) a sadou kalibrátorů Synchron systems Enyzyme Validator Set. Jedná se o kvantitativní stanovení aktivity -glutamyltrasferázy v séru, nebo v plazmě enzymatickou rate metodou. Gama-glutamyltransferáza katalyzuje přechod gamma-glutamylové skupiny z bezbarvého substrátu, -glutamyl-p-nitroanilinu, na akceptor, glycylglycin za vzniku barevného produktu, pnitroanilinu. Systém Synchron automaticky dávkuje do kyvet jeden díl vzorku na 20 dílů reagencie. Optický systém monitoruje změnu absorbance při 410 nm, která je přímo úměrná aktivitě GGT ve vzorku (Beckman Coulter 2005).
-Glutamyl-p-nitroanilin + glycylglycin ---GGT---> p-nitroanilin + -Glutamylo-glycylglycin
Obr. 5 Reakce katalyzovaná GGT ( Nezbeda 2014)
Ostatní metody stanovení Druhým typem fotometrických metod jsou metody s karboxylovaným substrátem.
-glutamyl- 3- karboxy-p-nitroanilin + glycylglycin ---GGT---> -glutamylglycilglycin + kyselina2-nitro-5-amino-benzoová Vzniká zde barevný produkt kyselina-2-nitro-5-amino-benzoová, kde měříme změnu absorbance při 400 - 430 nm. Výhoda metody s karboxylovaným substrátem je snadná rozpustnost ve vodě při laboratorní teplotě na rozdíl od nekarboxylovaného substrátu, který se musí rozpouštět za tepla a během reakce udržovat při 37 °C, jinak krystalizuje (Nezbeda 2014).
27
6.2.3 Kreatinkináza - CK ( ATP-kreatin N-fosfotransferáza, EC 2.7.3.2.) Kreatinkináza
katalyzuje
fosforylaci
kreatininu
na
kreatinfosfát,
nebo
zpětnou
defosforylaci kreatinfosfátu na kreatin. Při fosforylaci se přenáší fosfát z adenosintrifosfát (ATP) na kreatin za vzniku kreatinfosfátu a adenosindifosfátu (ADP). Tento enzym je obsažen v cytoplazmě a v mitochondriích svalu srdečního, kosterního a mozku. CK má tři izoformy skládající se ze dvou podjednotek M (muscle) a B (brain). První izoenzym CK – MM najdeme převážně v příčně pruhovaném svalu srdečním a kosterním. Druhý CK-MB se nachází především v myokardu, ale v kosterním svalu ho nalezneme také. Poslední CK-BB najdeme ve vyšších koncentracích v mozku, placentě, prostatě a uteru, může být též produkován tkání některých nádorů. Největší zastoupení v krevním séru tvoří CK-MM, CK-MB tvoří pouze malou část a CK-BB není u zdravých osob díky hematoencefalické bariéře prakticky přítomna. Aktivita CK-MB v myokardu stoupá při jeho ischemickém poškození a přetížení, jako je například hypertenze. Koncentrace celkové CK v séru je nespecifickým ukazatelem poškození myokardu. Čím větší je podíl CK-MB na celkové aktivitě CK v séru, tím je větší pravděpodobnost, že se jedná
CK-MB
kardiálního
původu.
Stanovení
celkové
CK
bylo
po
dlouhá
léta
nejvyšetřovanějším enzymem při podezření na poškození myokardu. Význam vyšetření v současnosti poukazuje především na onemocnění kosterního svalstva. Při stanovení celkové kreatinkinázy vadí hemolytické vzorky. Kreatinkináza je v séru stabilní 7 dní při teplotě 2-8 °C (Dastych,Breinek a kol. 2011, Zima a kol. 2007, Racek a kol. 2006).
Obr. 6 Reakce katalyzovaná kreatinkinázou (Nezbeda 2014)
Referenční hodnoty 0D - 6T 1,26 - 6,66 µkat/l 6T - 15R 0,2 - 2,27 µkat/l Ženy 15R - 99R 0
- 2,42 µkat/l
28
Muži 15R - 99R 0 - 2,85 µkat/l Hladina celkové CK odpovídá množství svalové hmoty, proto je u mužů větší než u žen. Rovněž se zvyšuje při zvýšené svalové zátěži obzvlášť u netrénovaných jedinců. Zvýšená hladina je též u novorozenců. V pupečníkovém séru je přítomen izoenzym CK-BB, který pochází z placenty. V prvních dnech života dochází k vzestupu hladiny díky jeho uvolnění z mozkové tkáně. Ke snížené aktivitě CK dochází v těhotenství a u ležících pacientů. Před stanovením je nutné vynechat svalovou zátěž a intramuskulární aplikaci léků, též by se nemělo vyšetřovat po chirurgických výkonech, kde dochází k zásahu do svalové tkáně (Masopust 1998, Racek a kol. 2006, Prevedig 2008).
Patologické změny CK
6.2.3.1
1. Poškození kosterního svalstva Při progresivní svalové dystrofii a toxickém poškození kosterního svalstva může dojít ke zvýšení CK až 1000x. Jak už bylo výše uvedeno hladina CK se zvyšuje po chirurgických výkonech, intramuskulárních injekcích, při zvýšené svalové zátěži, kdy se u netrénovaných osob může zvýšit až 20- ti násobně. Při šoku a svalových křečích dochází ke zvýšení až 40x, po porodu po dobu dvou týdnů je CK zvýšená asi 4x-8x. 2. Srdeční choroby U nemocí srdce nebývá vzestup tak dramatický. U akutního infarktu myokardu začíná CK stoupat 4-8 hodin po atace, maximálních hodnot dosahuje po 16-32 hodinách, kdy může být zvýšená až 25x, avšak běžně bývají hodnoty přibližně 7násobné. K návratu k normální hladině dochází za 3-6 dní. Pacienti s prokázaným IM na elektrokardiogramu (EKG), nemusí mít vždy zvýšenou hladinu CK. U dalších srdečních chorob jako je angina pectoris, tachykardie, vrozené a získané srdečních vady je zvýšení CK jen mírné, maximálně 2 násobek normální hodnoty. Při myokarditidě je zvýšení pouze malé, avšak pokud se jedná o akutní virovou myokarditidu, může dojít až k 10násobnému zvýšení. Kardiochirurgické operace mohou také způsobit zvýšení CK, ale zde se jedná spíše o trauma hrudních svalů. 3. Ostatní nemoci Hladina celkové CK se zvyšuje i při intoxikaci alkoholem, plicní embolii, hypotyreóze, kolagenózách a maligní hypertermii. Také vzrůstá při některých nádorových onemocněních například
u
hepatocelulárního
karcinomu.
Při
zvýšení
CK
u
onemocnění
prostaty,
gastrointestinálního traktu (GIT), cerebrálního traumatu, mozkové mrtvice a meningitidy se jedná o uvolnění izoenzymu CK-BB do krevního oběhu. U mozkových poruch je to způsobené rozsáhlejším poškozením mozkové tkáně s poškozením hematoencefalické bariéry (Masopust 1998, Schneiderka a kol. 2004, Zima a kol. 2007).
29
6.2.3.2
Metody stanovení celkové CK
Fotometrické metody Metoda využívaná laboratoří Prevedig V naší laboratoři stanovujeme CK pomocí fotometrické metody doporučené IFCC. Metodu provádíme na analyzátoru Unicel DxC 800 ve spojení se Synchron systémem, reagencií CK a kalibrátorem Enzyme Validator Set. Reakce je založena na principu defosforylace kreatinfosfátu za vzniku kreatinu a ATP, katalyzovaná kreatinkinázou. Následuje druhá reakce, kdy vzniklý kreatin reaguje s glukózou za katalýzy hexokinázou ( hexokinázová reakce) a vzniká glukóza-6- fosfát a ADP. V poslední reakci se glukóza-6-fosfát oxiduje na 6+
fosfoglukonát za současné redukce nikotinamiduadenindenukleotidu fosfátu (NADP ) na NADPH. Reakce je katalyzovaná glukóza -6-fosfátdehydrogenázou. Následně se měří rychlost nárůstu koncentrace NADPH při 340 nm, což odpovídá katalytické koncentraci CK ve vzorku (Beckman Coulter 2014).
Obr. 7 Princip fotometrických metod stanovení celkové aktivity CK (Nezbeda 2014)
Ostatní metody Dříve se používal barevný test vycházející z reakce: kreatin+ ATP ---CK---> kreatinfosfát + ADP
30
Zde je možné stanovit buď uvolněný kreatin, který dává barevnou reakci s diacetylem a -naftolem, nebo fosfátový anion uvolněný hydrolýzou kreatinfosfátu, který se deproteinuje a následně stanovuje jako žlutý roztok kyseliny molybdáto-vanadáto-fosforečné.
Stanovení izoenzymů CK Izoenzymy můžeme stanovit pomocí elektroforézy, ionexové chromatografie, využitím rozdílů v kinetických vlastnostech, využitím různé aktivace SH skupin a imunochemickými metodami kam patří imunoprecipitace, imunoinhibice a stanovení mass concentration (Nezbeda 2014).
6.2.4 Kreatinkináza - srdeční izoenzym MB (CK-MB) CK-MB je izoenzym typický pro myokard. V myokardu je jeho zastoupení 42 %, zbylou část tvoří CK-MM. V kosterním svalu má CK-MB zastoupení jen velmi malé a to hlavně při svalovém poškození. Stanovení CK-MB bylo donedávna hlavní metodou pro diagnostiku akutního infarktu myokardu. Dnes je součástí souboru metod, jako jsou troponiny, myoglobin, AST, CK a LD. Enzymové metody pro stanovení CK-MB zachycují jen jeho aktivní část, proto se používají imunochemické metody umožňující stanovení celkové hmotností koncentrace této specifické bílkoviny bez ohledu na její enzymovou aktivitu, vyšetření se označuje CK-MB mass. Dále se také může stát, že je v séru přítomný izoenzym CK-BB a při použití běžných enzymových metod dochází k falešně pozitivním výsledkům. Též si musíme dát pozor, abychom nevyšetřovali hemolytické vzorky, které výsledky značně ovlivňují. CK-MB je v séru stabilní 5 dní při teplotách od 2 do 8 °C (Zima a kol. 2007, Masopust 1998, Schneiderka a kol. 2004).
Referenční hodnoty 0D – 99 R
0 - 0,1 kat/l
U zdravých osob může koncentraci stejně jako u CK ovlivnit množství svalové hmoty a tělesná aktivita. Za fyziologických podmínek aktivita CK-MB nepřekročí v žádné tkáni 6 % celkové CK. Při hemodynamickém zatížení myokardu a anaerobních metabolických podmínkách se podíl CK-MB v myokardu může zvýšit až o 30 % (Prevedig 2008).
31
Patologické změny CK-MB
6.2.4.1
1. Akutní infarkt myokardu Při poškození myokardu aktivita CK-MB stoupá do 4 hodin od začátku ischemie, maximálních hodnot dosahuje za 24-36 hodin, kdy hodnoty dosahují 6 % - 30 % celkové aktivity CK. K normalizaci dochází do 3-5 dnů. 2. Další srdeční poruchy Zvýšené hodnoty CK-MB nacházíme po chirurgickém výkonu na srdci, u myokarditid a perikarditid, při kontuzi srdce a po úrazech elektrickým proudem. 3. Ostatní nemoci Zvýšení hladiny CK-MB se zjišťuje také u chronického renálního selhání, svalové dystrofie, maligní hypertermie a při různých šocích. U mozkové mrtvice (apoplexie), hypotyreózy a akutní psychózy můžeme též pozorovat mírné zvýšení (Zima a kol. 2007, Masopust 1998).
6.2.4.2
Metody stanovení CK-MB
Enzymová metoda Enzymové metody pro stanovení CK-MB jsou založené na stejném principu jako stanovení celkové CK doplněné imunoinhibiční metodou. Součástí reagencie je protilátka vázající podjednotku M, čímž inhibuje její enzymatickou aktivitu. Tím pádem se měří pouze podjednotka B. Výskyt CK-BB je v krevním oběhu minimální, a proto získaná hodnota vynásobená faktorem 2 (bere se v úvahu, že aktivita CK-MB je 2x vyšší než aktivita samotné CK-B) odpovídá katalytické aktivitě CK-MB (Nezbeda 2014). Imunochemické metody – stanovení CK-MB mass Roche Cardiac CK-MB Test je založený na principu ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) a provádí se z heparinizované venózní krve. V testu jsou obsažené 2 monoklonální protilátky proti epitopům molekuly CK-MB, jedna značená zlatem, druhá biotinylovaná. Tyto protilátky tvoří s CK-MB v krvi sendvičový komplex. Po odstranění erytrocytů ze vzorku přechází plazma přes detekční zónu, kde se hromadí sendvičové komplexy značené zlatem a pozitivní signál je zobrazený jako červená linka (signální linie). Přebytečné zlatem značené protilátky se hromadí kolem kontrolní
32
linie, jako důkaz že byl test platný. Intenzita signální linie je přímo úměrná koncentraci CK-MB. Optický systém detekuje obě linie a měří intenzitu signální linie, kterou převádí na kvantitativní výsledek ( Roche 2013).
Hydrolázy
6.3
6.3.1 Alkalická fosfatáza – ALP (orthofosfát: monoesterfosfohydroláza, alkalické optimum, EC 3.1.3.1) Alkalická fosfatáza katalyzuje hydrolýzu monoesterů kyseliny ortofosforečné v alkalickém prostředí za vzniku alkoholu nebo fenolu a fosforečnanového aniontu. ALP se také účastní přenosu fosfátové skupiny na jiný alkohol za vzniku esteru. Alkalická fosfatáza je tvořena izoenzymy, které potřebují ke své aktivitě zinek. Rozlišujeme tři izoenzymy lišící se primární strukturou a to placentární, střevní a izoenzym obsažený v kostech, játrech a ledvinách. Třetí typ se v různých orgánech liší nestejným obsahem sacharidů včetně kyseliny sialové v molekule. Podle toho můžeme odlišit další izoformy a to jaterní, kostní a z ledvin. Ledvinný izoenzym se však nevyskytuje v krvi. V krvi dospělých zdravých osob převažuje jaterní forma, u dětí kostní a u těhotných žen placentární. U osob s krevní skupinou B a 0 najdeme i střevní izoenzym, zvýšený především po tučném jídle. Poločas celkové ALP v séru je 3 – 5 dní. Aktivitu ve vzorku, může inhibovat citrát, kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA) a oxalát, naopak hemolýza aktivitu zvyšuje. ALP se běžně stanovuje ze séra, pokud se stanovuje z plazmy, tak jen z heparinizované. Stabilita ALP v séru je 3 dny při teplotě 2-8 °C (Zima a kol. 2007, Racek a kol 2006).
Obr. 8 Funkce ALP - 1. Hydrolýza monoesteru za vzniku alkoholu, 2. Přenos fosfátu na alkohol za vzniku esteru (Nezbeda 2014)
Referenční rozmezí 0D - 6T
1,20 - 6,30µkat/l
33
6T - 1R
1,40 - 8,00µkat/l
1R - 10R
1,12 - 6,20µkat/l
10R - 15R 1,35 - 7,50µkat/l 15R - 99R 0,66 - 2,20µkat/l Vyšší hodnoty jsou u dětí než u dospělých, zvýšení odpovídá růstu kostí. U mužů je hodnota mírně vyšší než u žen. U žen však roste v menopauze, kdy může být vyšší než u mužů. Vyšší hodnoty u starých lidí mají souvislost s osteoporózou a Pagatetovou chorobou. Aktivita ALP roste též během těhotenství díky placentárnímu izoenzymu. Zvýšenou hladinu mají i lidé po tučném jídle, především ti s krevními skupinami 0 a B ( Prevedig 2008).
6.3.1.1
Patologické změny ALP
1. Onemocnění jater a žlučových cest Nejčastěji bývá ALP zvýšená 3 – 5- ti násobně u cholestázy, cholelitiázy, při obstrukci nádorem, nebo při intrahepatální cholestáze. U nádorových onemocnění jako je hepatom, nebo metastázy do jater dochází ke zvýšení 2x - 3x, ke kterému dojde dříve než k hyperbilirubinémii. U jaterní cirhózy se hladina zvyšuje 2x - 3x. Při primární biliární cirhóze, akutní alkoholové a toxické hepatitidě se ALP zvyšuje 3x - 5x. U akutní virové hepatitidy se hladina ALP zvyšuje jen mírně, pokud se jedná o cholestatickou formu dochází k většímu zvýšení. U akutní cholangitidy roste společně s ikterem a leukocytózou. U chronického zánětu žlučníku se zvyšuje pouze ALP. K až 20násobnému růstu aktivity může dojít u idiopatické hyperfosfatemie, což se u dětí objevuje bez známek jakéhokoliv onemocnění. 2. Onemocnění kostí Vzestup aktivity kostního izoenzymu se objevuje u rachitidy už 6 týdny před klinickými příznaky. Dále se celková ALP zvyšuje při osteomalacii, primárních nádorech kostí jako je osteosarkom, při sekundárních kostních nádorech například metastázách nádorů prostaty. U Pagetetovy choroby (ostitis deformans) roste ALP spolu s progresí onemocnění. Pouze lehké zvýšení nebo normální hodnoty jsou u primární osteoporózy, hojení zlomenin, osteolytických metastáz a mnohočetném myelomu. Zvýšenou hladinu ALP můžeme též najít u primární a sekundární hyperparatyreózy. 3. Ostatní nemoci Aktivita ALP roste i při nedostatku vitamínu D a zhoubných novotvarech plic a GIT. Ke snížení hladiny ALP v séru dochází u hypofosfatazémie, což je autozomálně recesivní onemocnění se zvýšeným vylučováním fosfoetanolaminu močí. Nízké hodnoty dále můžeme najít u hypotyreózy, perniciózní anemie, skorbutu, deficitu zinku a vitamínu B (Masopust 1998, Zima a kol. 2007, Schneiderka a kol. 2004, Racek a kol. 2006).
34
6.3.1.2
Metody stanovení ALP
Většina v současnosti používaných metod vychází z reakce č. 1 - hydrolytického uvolnění fosfátové skupiny z monoesteru.
Pufr může obsahovat různé aminoalkoholy mající vliv na
aktivitu enzymu.
Obr. 9 Princip stanovení ALP (Nezbeda 2014)
Metoda využívaná laboratoří Prevedig V laboratoři měříme metodu doporučenou IFCC na analyzátoru Unicel DxC 880i ve spojení se systémem synchron, reagencií ALP a kalibrátorem Enzyme Validator Set. Jedná se o kinetickou rate metodu za použití 2-amino-2-methyl-1-propanol pufru. Alkalická fosfatáza katalyzuje hydrolýzu bezbarvého organického fosfátového esteru p-nitrofenylfosfátu za vzniku žlutého produktu p-nitrofenolu a fosfátu. Reakce probíhá při alkalickém pH 10.3 a za přítomnosti horečnatých iontů, které mají zásadní význam pro funkci enzymu. Systém synchron dávkuje automaticky do kyvet 1 díl vzorku ku 50 dílům reagencie. Dále systém monitoruje změnu absorbance při 410 nm ve fixních časových intervalech. Míra změny absorbance je přímo úměrná aktivitě ALP ve vzorku (Beckman Coulter 2005). Stanovení izoenzymů ALP Izoenzymy alkalické fosfatázy můžeme stanovit elektroforézou, inaktivací teplem či inhibicí fenylalaninem, homoargininem, močovinou a EDTA. Dále imunochemií a gelovou chromatografií. Rozlišení izoforem ALP je obtížné, nejčastěji potřebujeme rozlišit kostní a jaterní izoformu. Stanovuje se imunochemicky a vazbou kostní ALP na speciální lektin (Nezbeda 2014).
35
6.3.2 Alfa - amyláza - AMS (Alfa-1.4.D-glukan-4-glukanohydroláza, ES 3.2.1.1.) Alfa amyláza katalyzuje hydrolýzu alfa - 1.4 - glykosidické vazby v polysacharidech za vzniku oligosacharidů, složených ze 6 – 7 glukózových jednotek. Amylázu produkují především slinné žlázy a slinivka břišní, v menším množství i játra, vaječník a prsní žláza. Podle původu rozlišujeme dvě izoformy AMS lišící se cukernou složkou. Jedná se o amylázu slinnou (S) a pankreatickou (P). Díky malé molekulové hmotnosti snadno prostupuje do moči. V tubulech dochází asi k 50 % zpětné resorpci, zbytek se objevuje v konečné moči, kde ho můžeme jako jeden z mála enzymů prokázat. Hladina AMS v moči může být však vyšší než v séru díky zahuštění moči. Pro diagnostické účely se také vypočítává clearence amylasy/kreatininu (Racek a kol. 2006, Masopust 1998, Schneiderka a kol. 2004).
Referenční hodnoty S-amyláza 0D – 99 R
0,42 – 1,92 kat/l
U- amyláza 0,79 – 6,76 kat/l
0D – 99
Fyziologicky nižší hodnotu - amylázy v séru mají novorozenci a ležící pacienti. U dětí do 2 let není žádná aktivita pankreatické amylázy. Naopak těhotné ženy mívají aktivitu zvýšenou. U stanovení je nutné zabránit hemolýze, stejně tak pacienti s lipidémií mohou mít falešně zvýšené hodnoty. Amyláza v moči se vyšetřuje z ranní moče, obzvlášť vhodná k vyšetření je moč z dvouhodinového sběru. Stabilita sérové amylázy je 7 dní a močové 4 týdny při teplotě 2-8 °C (Prevedig 2008).
6.3.2.1
Patologické změny AMS
1. Onemocnění pankreatu Nejčastějším diagnostickým důvodem zvýšení amylázy v séru je akutní pankreatitida. Hladina se zvyšuje více než 3x. K růstu dochází 3 - 12 hodin po atace, maximum je dosaženo za 20-30 hodin a k normalizaci dochází do 4 dnů. Hladina amylázy roste rovněž v moči, ale zvýšení se objevuje později a také déle přetrvává. U chronické pankreatitidy AMS nemusí být
36
zvýšena, je zde nutné provedení funkčních testů. U chronické obstrukční pankreatitidy může hladina vzrůst až 20x.
K mírnému nárůstu dochází při výskytu pseudocyst. Dále se může
zvyšovat po operaci, nebo úrazu pankreatu, při přetlaku žlučových cest, nebo v případě perforovaného žaludečního, duodenálního vředu, nebo při perforaci žlučníku. 2. Ostatní nemoci Ke zvýšení slinného izoenzymu dochází u parotitid, sialolitiázy, při užívání opiátů a v 10 % případů u akutního alkoholismu. Mírné zvýšení AMS může nastat i u virové hepatitidy a infekční mononukleózy jako projev současné pankreatitidy.
Růst hladiny AMS přibližně 2x
zaznamenáváme u renálního selhání, díky snížení glomerulární filtrace. Makroamylázemie je další případ zvýšené hladiny AMS, kdy dochází k hromadění makromolekulového komplexu AMS s imunoglobulinem G (IgG) nebo s imunoglobulinem (IgA) v krvi. Komplex neprochází glomerulem, proto se hladina v moči nezvyšuje. Posledním případem zvýšené hladiny AMS jsou metastazující nádory ( Masopust 1998, Racek a kol. 2006).
6.3.2.2
Metody stanovení AMS
Metody se substrátem na bázi škrobu První skupinou jsou Sacharogenní metody, kde je substrátem přirozený škrob, po jehož štěpení se stanovují štěpné produkty - redukující cukry. Druhou skupinou jsou Amyloklastické metody, zde se štěpením mění optické vlastnosti škrobu, které se stanoví turbidimetricky, nefelometricky, nebo pomocí barvení škrobu jódem. Poslední skupinou jsou metody Chromogenní. Substrát je tady syntetický škrob s navázaným barvivem, které se štěpením uvolňuje do roztoku. Jeho koncentrace odpovídá aktivitě enzymu. Tyto metody se dnes již moc nepoužívají. Metody s definovanými substráty Hydrolýza malých oligosacharidů katalyzovaná - amylázou vede ke vzniku lépe definovaných produktů na rozdíl od hydrolýzy škrobu. Využívají se 4-nitrofenyl- glykosidové substráty.
37
Obr. 10 Příklad reakce s 4-nitrofenylglykosidovým substrátem ( Nezbeda 2014)
Metoda využívaná laboratoří Prevedig Amylázu měříme metodou využívající jako substrát etyliden-pNP-G7, též známý jako EPS. Použití etylidenu má za úkol bránit exo-enzymům ( -glykosidáza) rozkládat substrát, takže pokud není přítomna AMS, nedojde ke změně zbarvení. Měření provádíme na analyzátoru Unicel DxC 880i od firmy Beckman Coulter ve spojení se systémem synchron a reagencií Amylase EPS-G7 Reagent. Alfa-amyláza přítomna ve vzorku štěpí substrát za vzniku fragmentů, které se dále štěpí za přítomnosti -glykosidázy a nakonec dojde k uvolnění chromoforu.
Obr. 11 Etyliden-pNP-G7 - Etyliden-4-nitrofenyl-maltoheptaosid – vzorec ( Nezbeda 2014)
1. EPS + H2O ---AMS---> 4.6-Etyliden-G x + 4-Nitrofenyl-G (7-x) 2. 4- Nitrofenyl-G (7-x) + (7-x) H2O ----glykosidáza---> (7-x) Glukóza + 4-nitrofenoxid
38
Rychlost tvorby 4-nitrofenoxidu je přímo úměrná množství -amylázy ve vzorku a měří se pomocí růstu absorbance při 410 nm. Výsledky korespondují s hodnotami doporučenými IFCC (Panteghini a kol. 2006, Lab Med 2006).
6.3.3 Lipáza – LPS ( triacylglycerol- acylhydroláza, EC 3.1.1.3) Lipáza
je
hyrolytický
enzym,
který
štěpí
triacylglyceroly
na
diacylglyceroly,
monoacylglyceroly a mastné kyseliny v přítomnosti žlučových kyselin. Stejně jako - amyláza je lipáza tvořena žlázovými buňkami pankreatu odkud je produkována do střeva v pankreatické šťávě. Kromě pankreatické lipázy existuje lipáza lipoproteinová vyskytující se v endotelu, která hydrolyzuje triacylglyceroly (TAG) lipoproteinů jako je lipoprotein s velmi nízkou hustotou (VLDL) a chylomikrony. Dále je lipáza jaterní, žaludeční, jazyková a intersticiální. Množství pankreatické lipázy je v séru až 35x vyšší, než množství ostatních, avšak při jejím stanovení musíme ostatní lipázy oddělit. LPS je filtrována glomerulární filtrací, ale v tubulech je všechna zpět resorbována, proto se u zdravých jedinců lipáza v moči prakticky nevyskytuje. Stanovení hemolytických vzorků výrazně ovlivňuje výsledek. Stabilita lipázy v séru je 3 týdny při teplotě 28 °C (Racek a kol. 2006, Schneiderka a kol. 2004).
Obr. 12 Úloha lipázy v organismu – hydrolýza triacylglycerolu ( Nezbeda 2014)
Referenční hodnoty 0 – 99 R
0 - 0,85 kat/l
Koncentrace lipázy v séru (stanovena imunochemicky) je u novorozenců výrazně nižší než u dospělých ( Prevedig 2008).
39
6.3.3.1
Patologické změny LPS
1. Onemocnění pankreatu Zvýšenou hladinu lipázy nacházíme především u akutní pankreatitidy. Hodnoty se zvyšují po 4 - 8 hodinách po atace, vrcholu dosahují za 24 hodin a za 8-14 dnů se vrací k normálním hodnotám. LPS se zvyšuje mnohokrát více než amyláza a zůstává i déle zvýšená. Hodnoty lipázy mohou růst 300 – 10 000x. Průměrné hodnoty dosahují 2000 násobného zvýšení. Pankreatická lipáza roste většinou současně s -amylázou, jsou ale případy, kdy se zvýší jen jeden enzym. Stanovení lipázy je ve srovnání se stanovením amylázy u akutní pankreatitidy přesnější a specifičtější. Při poškození pankreatu (penetrace duodenálního vředu, ileus, cholecystitida) stoupá lipáza až 5x. 2. Ostatní nemoci Zvýšená aktivita lipázy se nachází u primární biliární cirhózy a renálního selhání. Mírně vyšší hodnoty můžeme najít u diabetické ketoacidózy a virové hepatitidy. Dále se může lipáza zvýšit u chronického alkoholismu a po hemodialýze (díky heparinem indukované lipolytické aktivitě lipoproteinové a jaterní lipázy). Snížení aktivity LPS můžeme najít v pokročilém stadiu chronické pankreatitidy a u mukoviscidózy (Masopust 1998).
6.3.3.2
Metody stanovení LPS
Fotometrické metody Enzymové stanovení se substrátem 1.2.diacylglycerolem Pankreatická lipáza rozkládá 1.2-diacylglycerol na 2-monoacylglycerol a mastnou kyselinu. 2-monoacylglycerol je štěpen monoglycerolovou lipázou na glycerol + MK ( mastnou kyselinu. Působením glycerolkinázy je glycerol převeden na glycerol-3-fosfát a následně glycerolfosfát oxidázou na dihydroxyaceton-fosfát a peroxid vodíku. H2O2 se stanoví pomocí Trinderovy
reakce
za
vzniku
chinoniminového
barviva,
které
se
dále
stanoví
spektrofotometricky. Měří se nárůst absorbance při 550 nm, který je přímo úměrný aktivitě LPS ve vzorku (Nezbeda 2014).
40
Metoda používaná v laboratoři Prevedig Pankreatickou lipázu měříme na analyzátoru Unicel DxC 880i ve spojení se systémem Synchron, reagencií lipase reagent a kalibrátorem Enzyme validator set. Stanovení využívá metodiku Panteghini, kde je substrát 1.2-O-dilauryl-rac-glycerol-3-glutarová kyselina-(6`methylresorufin)-ester. Při dvou spontánních reakcích využívajících tento substrát se tvoří methylresorufin. Rychlost jeho tvorby je přímo úměrná aktivitě LPS se vzorku, rychlost změny absorbance se měří při 560 nm. Systém dávkuje objemový poměr 1 díl vzorku ku 54 dílům reagencie (Panteghini 1996, Beckman Coulter 2005). -
1.2-O-dilauryl-rac-glycerol-3-glutarová kyselina-(6`-methylresorufin)-ester ---LIP---- OH --------> 1.2-O-dilauryl-rac-glycerol-3-glutarová kyselina-(6`-methylresorufin)-ester (nestabilní produkt) ---
OH ----> glutarová kyselina + methylresorufin
Ostatní metody – dříve používané Turbidimetrické metody:
Mléčně zbarvená emulze tuků (nejčastěji triolein) ve vodě je
projasňována působením lipázy. Měří se fotometricky pokles intenzity zákalu. Titrační metody jsou založené na principu, kdy lipáza ve zkoumaném vzorku hydrolyzuje směs TAG. Po určité době jsou uvolněné mastné kyseliny titrovány pomocí NaOH. Ekvivalentní bod se detekuje fenolftaleinem, nebo thymolftalienem. Jedná se o nejstarší používanou metodu stanovení lipázy, která byla dlouho metodou referenční. Stanovení je však dosti komplikované a časově náročné, proto bylo nahrazeno novějšími metodami ( Dastych, Breinek a kol 2011).
41
7. Význam a postavení enzymových stanovení v laboratorní diagnostice infarktu myokardu Na počátku laboratorní diagnostiky infarktu myokardu v první polovině 20. století bylo sledování nespecifických zánětlivých ukazatelů jako je leukocytóza, zvýšená sedimentace atd. V období od 50. let minulého století byla věnována vyšší pozornost zavedení nových biochemických metod. Velkou roli zde hrála enzymologie a stanovení koncentrací jednotlivých složek bílkovin. Počátkem enzymologie byl průkaz zvýšené aktivity AST u pacienta nemocného akutním infarktem myokardu v roce 1955. V roce 1956 následoval průkaz LD a v roce 1960 zvýšená aktivita CK. Od roku 1963 začalo nabývat na významu vyšetření izoenzymů LD. V sedmdesátých letech byl objeven význam stanovení CK-MB. Zavedení enzymologie bylo pro laboratorní diagnostiku této doby obrovským pokrokem. V této kapitole bych se chtěla zaměřit na vývoj enzymových stanovení ve prospěch zkvalitnění laboratorní diagnostiky až po postupné nahrazování enzymových stanovení metodami specifičtějšími, citlivějšími a časnějšími.
7.1
Osmdesátá léta RNDr Miloš Tichý, CSc a plk. Doc. MUDr Vladimír Pidrman, CSc provedli v roce 1981
na pracovišti vojenského lékařského výzkumného a doškolovacího ústavu J. E. Purkyně v Hradec Králové výzkum, kde porovnávali v té době nejpoužívanější metody stanovení na akutní infarkt myokardu (AIM). Jednalo se o stanovení celkové CK, CK-MB, poměru izoenzymů LD1:LD2 a z proteinových zkoušek stanovení myoglobinu. Smyslem této studie bylo porovnání metod lišících se svoji specifitou a senzitivitou ve vztahu k potvrzení, nebo upřesnění klinické a elektrokardiografické diagnózy. U dvaceti pacientů nemocných s AIM bylo provedeno měření CK, CK-MB, LD1:LD2 a myoglobinu ve tříhodinových intervalech. Jako nejcitlivější ukazatel poškození myokardu byl prokázán myoglobin, který byl pozitivní vždy při prvním odběru a jeho průkaz svědčí pro ireverzibilní nekrózu myokardu. Myoglobin byl také ukazatel, který se v séru jako první normalizoval. Význam stanovení CK tkví v citlivosti během prvních 3 dnů po atace a především k výpočtu celkové ztráty CK k odhadu velikosti nekrotického ložiska. Díky ověření na sestavě 48 lidí nemocných infarktem bylo prokázáno, že se jedná o dobrý prognostický faktor. Vzhledem k tomu, že je stanovení CK značně nespecifické, používá se současné stanovení izoenzymu CK-MB. Index LD1:LD2 byl určen u 127 nemocných a z toho byla nalezena pozitivita u 93.7 % případů. U 20 nemocných byla sledována tato pozitivita po dobu dvou měsíců. Sedmý den pozorování byl tento index pozitivní ještě v 80 % případů, zatímco ostatní ukazatele byly v této době již normalizovány. Poměr izoenzymů LD je tedy dobrým ukazatelem starších příhod (Tichý a Pidrman 1981).
42
Z výše uváděných metod stanovení se stalo nejpoužívanějším vyšetřením CK doplněné vyšetřením CK-MB.
Tyto metody převážně CK-MB tvořily takzvaný zlatý standard
v biochemické diagnostice akutního infarktu myokardu od sedmdesátých let, kdy bylo CK-MB zavedeno, až přibližně do poloviny devadesátých let.
7.2
Devadesátá léta V polovině devadesátých let došlo díky ekonomickému tlaku a potřebě časnější
diagnostiky k zavedení řadě nových markerů, které svou citlivostí a specifičností převyšovaly dosud využívané. Tím pádem bylo vyšetření CK a CK-MB zpochybněno. Vzhledem k ohledu na patofyziologii ischemické choroby srdeční je potřebné využít kombinace více markerů osvětlující různé části procesu AIM, což je zánět, trombóza, snížený průtok krve, ischémie a nekróza. V roce 1998 byly využívány následující metody CK, CK-MB, CK-MB mass, izo – LD, izoformy izoenzymů CK-MM a CK-MB. Novým stanovením, které v této době bylo ve stadiu prvních klinických zkušeností, je stanovení izoenzymu glykogenfosforylázy GPBB. Dále se stanovovaly proteiny: CRP,myoglobin, těžké a lehké řetězce myosinu a pomalu se začalo zavádět stanovení troponinů T a I.
7.2.1
Aktivita celkové CK Stanovení aktivity celkové CK bylo v této době považováno za nepřesné, díky její
závislosti na věku, pohlaví, rase, objemu svalové hmoty a fyzické aktivitě. U lidí nad 60 let dochází k úbytku svalové hmoty a tím pádem ke snížení aktivity CK. Hrozí zde nebezpečí u pacienta s AIM, který má sice hodnotu CK 2 - 3 krát zvýšenou, ale díky snížení svalové hmoty je tato hodnota stále ve fyziologických rozmezích. Naproti tomu běžec po maratonu má celkovou CK vysokou, přitom je zdravý.
7.2.2
CK-MB a CK-MB mass CK-MB má poločas 12 hodin a izoelektrickou fokusací jej můžeme rozdělit na dvě
subformy. V průběhu 16 hodin po AIM můžeme pozorovat zvýšení asi u 97 % nemocných. Nevýhodou stanovení CK-MB je nedostatečná citlivost v prvních hodinách po AIM a špatná prokazatelnost u starších případů, protože do 48 hodin dochází k normalizaci. Tento marker není také na 100% kardiospecifický. Falešně pozitivní výsledky můžeme pozorovat při poškození kosterního svalstva, elektrické defibrilaci, extrémním cvičení, chronické renální insuficienci, rhabdomyolýze, resuscitaci, chronickém alkoholismu a při hyper a hyponatrémii.
43
Pokrok ve stanovení CK-MB vedl od kvalitativního průkazu aktivity, přes kvantitativní průkaz aktivity ke kvantitativnímu stanovení koncentrace CK-MB mass. CK-MB mass je specifičtější a má vyšší analytickou citlivost. Umožňuje nám přesnější průkaz malých změn CK-MB v rozsahu referenčních hodnot, a tím můžeme detekovat mikroinfarkty. Velkou výhodou CKMB mass je výrazná citlivost v prvních 2-4 hodinách po AIM (Tichý 1998).
7.2.3
Izoformy izoenzymů CK-MB a CK-MM CK-MM má poločas v séru 16 hodin a izoelektrickou fokusací jej můžeme rozdělit na 3
subfrakce. CK-MM je také zvýšena po AIM, ale i u svalových dystrofií, dermatomyositidy, polymyositidy a hypotyreózy. Existenci izoforem izoenzymů popsal Smith v roce 1972. CK-MM tvoří subformy MM3 MM2 a MM1. CK-MB můžeme rozdělit na CK-MB2 a CK-MB1. Tkáňová forma CK-MM tj. MM3 se v séru hydrolyzuje karboxypeptidázou na MM2 a MM1 . MM3 se při AIM uvolňuje do oběhu, takže dochází k velmi časnému zvýšení indexu MM3/MM1 asi 3 hodiny po AIM. Přibližně za 9 hodin dosahuje vrcholu. Index MB 2 a MB1 se zvyšuje do 2 hodin po AIM a vrcholu dosáhne po 8 hodinách. Stanovení subforem izoenzymů se využívá také jako citlivý indikátor úspěšné trombolýzy. Automatické stanovení izoforem na bázi elektroforézy umožňuje stanovení do 30 minut a díky tomu rutinní použití v klinické laboratoři (Tichý 1998, Baral 1994).
7.2.4 GPBB Glykogenfosforyláza-izoenzym BB je glykolytický enzym hrající důležitou roli při glykogenolýze.
Glykogenfosforyláza
(GP)
tvoří
v lidském
těle
3
izoenzymy
GPMM
(muscle=sval), GPLL (liver= játra) a GPBB (brain= mozek). V srdci jsou přítomny MM a BB. GPBB je obsažen jen v mozku a myokardu, a proto je považován za vysoce specifický marker pro srdeční poškození. Považuje se za specifický indikátor dysbalance v energetickém metabolismu srdce u AIM. Normální koncentrace v plazmě je 1,7 - 2,9 g/l a u AIM 40 -170 g/l. GPBB je vhodný pro časnou diagnostiku AIM, protože se zvyšuje přibližně za 2-3 hodiny, též je vhodný k hodnocení úspěšnosti trombolýzy. Maximálních hodnot dosahuje při perfúzi za 5.7 +- 2 hod a bez perfúze za 14.4 +- 2 hod po atace. K normálu se vrací po 24 - 36 hodinách. V prvních hodinách je považován nejcitlivější indikátor dokonce citlivější než myoglobin (Tichý 1998, Mair 1998).
44
7.2.5 Proteiny Ze stanovení proteinů hraje významnou roli C reaktivní protein. Je to typický protein akutní fáze, jehož koncentrace v séru je za fyziologických podmínek velmi nízká asi do 5 mg/l. U akutních zánětů, bakteriálních, mykotických a parazitárních infekcí a traumatického poškození tkáně prudce vzrůstá až 2000 krát. U AIM se zvyšuje CRP u všech nemocných. K růstu dochází 8 - 10 hodin po začátku AIM a vrcholu dosahuje za 2 - 3 dny. CRP je nespecifický pro AIM, ale je dobrý ukazatel reperfúze po trombolýze. Koncentrace CRP pozitivně koreluje s rozsahem AIM. Myoglobin je kyslík vázající protein příčně pruhovaného svalstva, ze kterého je při poškození uvolňován. Díky své malé molekulové hmotnosti se rychle vylučuje z tkáně a přechází do krve. Dále je filtrován glomerulární filtrací a vylučován močí. Společně s GPBB byl koncem devadesátých let považován za nejcitlivější biochemický marker v prvních hodinách po AIM. V krvi ho můžeme prokázat do 2 hodin po atace, maxima dosáhne za 6 hodin, a během
12-24 hodin se vrátí k normálním hodnotám. Normální hodnoty
myoglobinu v séru jsou do 70 mg/l.
Myofibrilární proteiny příčně pruhovaného svalstva se
vyskytují ve formě specifických izoforem, které se dají rozlišit imunologickými metodami. Mezi tyto izoformy patří lehké řetězce myozinu, beta typ těžkých řetězců myozinu, srdeční alfa-aktin, trombomyozin a troponin. Podjednotky srdečního myozinu jsou tvořeny těžkými řetězci (MHC z angl.myosin heavy chain), lehkým řetězcem 1 ( MLC - 1 z angl. myosin light chain) a lehkým řetězcem 2 ( MLC - 2). Význam v diagnostice AIM spočívá v rozlišném zvyšování MHC a MLC v různých fázích infarktu. MLC se používá k diagnostice AIM v akutní fázi, kdežto MHC pro pozdní fázi AIM a k určení velikosti ložiska (Tichý 1998, Mair 1997).
7.2.6 Troponiny Struktura příčně pruhovaného svalu je tvořena dvěma typy myofilament. První je tlusté filamentum, obsahující myozin. Druhé je tenké tvořené aktinem, tropomyozinem a troponinem. Troponin se skládá z komplexu tří bílkovin – troponinu T, troponinu I a troponinu C. Funkcí troponinu je schopnost regulovat svalovou kontrakci. Podjednotka C váže kalciové ionty, troponin I se váže na aktin, a tím inhibuje interakce mezi aktinem a myozinem. Poslední složka troponin T se váže na tropomyozin, což podporuje svalové kontrakce.
Troponin T (cTnT
z angl.cardiac troponin T) – se zvýší asi 3,5 hodiny po začátku AIM a zůstává zvýšený 10-14 dní. Hodnoty se zvyšují přibližně 30 - 40krát nad normální limit, který je v séru 0,1 ng/l. Troponin T není úplně specifický pro myokard, zkříženou reakcí s TnT kosterního svalstva mohou vzniknout falešně pozitivní výsledky. Nejvyšší koncentrace dosahuje od 2 do 5. dne. Nejprve se uvolňuje cTnT z cytosolu, ten při časné reperfúzi dosáhne vrcholu za 14-27 h. Později se dostává do krve troponin vázaný v kontraktilních myofibrilárních strukturách. K dalšímu již nižšímu vrcholu dochází po 4 - 5 dnech, proto můžeme použít stanovení TnT pro
45
pozdní diagnostiku AIM. Troponin T je vhodný marker pro určení rozsahu AIM a také dobrý indikátor rejekce po srdeční transplantaci. Troponin I (cTnI z angl. cardiac troponin I) je na rozdíl od troponinu T kardiospecifický. Po AIM se zvyšuje za 4.5 h, vrcholu dosáhne za 9 - 16 hodin a séru zůstává pozitivní asi 7 dní. Troponin I se vyznačuje vysokou specifitou a senzitivitou a je ideální k diagnostice AIM, při současném poškození kosterního svalstva a renální insuficienci (Tichý 1998, Mair 1997).
7.3
Kardiomarkery na prahu třetího tisíciletí V prvním desetiletí nového tisíciletí již biochemie nabízí stanovení mnoha parametrů
vztahujících se k průběhu patologických dějů od zánětlivých změn cévní stěny protizánětlivých cytokinů- interileukinu 6 (IL6) a tumor nekrotizující faktor (TNF) přes stanovení markerů destabilizace koronárního plátu, tj. myeloperoxidázy a adhezních molekul, markerů ruptury plátu až po markery ischemie a nekrózy. V klinické se praxi se také začala používat skupina molekul odrážející funkci myokardu - natriuretické peptidy (Pudil a kol. 2007).
7.3.1 Markery nekrózy myokardu Novým zlatým standardem ve vyšetření myokardiální nekrózy se staly po roce 2000 troponiny, které nahradily dříve používaný CK-MB. Především se vyšetřovaly dva troponiny, jejichž kardiální formy jsou obsažené pouze v myokardu. Jedná se o troponiny I a T. U obou forem dochází k vzestupu hladiny do 4 - 6 hodin po AIM, vrchol následuje za 12 - 48 hodin a k návratu k normálním hladinám dojde postupně do 14 dnů. Jak bylo již zmíněno, v počátcích stanovení troponinu T se vyskytovaly jisté problémy se zkříženou reaktivitou se skeletálními formami troponinu. Tento problém se postupem času eliminoval vývojem reagencií nových generací. Stanovení CK se touto dobou považovalo již za značně nespecifické. CK-MB bylo doporučováno v případech, kdy nebylo možné stanovit troponiny. Imunologická metoda CK-MB mass byla považována za nejlepší marker reainfarktu a byla relativně akceptovatelná pro laboratoře, které nemohly stanovit troponiny. Metoda využívá monoklonální protilátku specifickou pro MB dimer, kombinuje vysokou senzitivitu a specifitu s krátkým časem odezvy. Přesto není tato metoda zcela kardiospecifická, může se zvyšovat při poškození kosterního svalstva, myopatiích, kardioverzi, hypotyreóze a po vytrvalostním běhu ( Pudil a kol. 2007).
46
7.3.2 Markery ischemie myokardu Nově vyšetřovaným markerem je ischemií modifikovaný albumin (IMA). Jedná se o stanovení vazebné kapacity albuminu pro kobalt. Metoda je založena na schopnosti Nterminálního
konce
albuminu
snižovat
svou
afinitu
pro
kobalt
v průběhu
ischemie.
K přechodnému zvýšení IMA dochází během ischemie myokardu, a to i když není přítomna nekróza. Vyšetření tohoto markeru lze použít u pacientů s bolestí na hrudi s nespecifickými změnami elektrokardiogramu a negativitou markerů nekrózy myokardu (Aslan 2004, Pudil a kol. 2007). K dalším metodám na vyšetření ischemie patří volné mastné kyseliny (FFA z angl. free fatty acid). Většina mastných kyselin vyskytujících se v krevním séru (FFAs) se váže na albumin, pouze drobná skupina je přítomná v solubilní formě (FFAu). Mechanismus zvýšení FFAu po ischemii nebyl v roce 2007 zatím zcela jasný, předpokládal se vliv katecholaminů v krvi, ischemií aktivovaná lipolýza, hydrolýza lipidů v myokardu, metabolické změny a změny substrátu v myokardu. Zvýšená hladina FFAu je časný ukazatel ischemie myokardu (za 30 minut
14x vyšší hladina), ale jsou potřeba další studie u nemocných akutním koronárním
syndromem (AKS), protože zvýšená hodnota byla zjištěna i u sepse a po užití kokainu (Pudil a kol. 2007). .
7.3.3 Nové další metody k průkazu strukturálního poškození myokardu Do této skupiny testů patří vyšetření cholinu. Cholin je společně s fosfatidovou kyselinou hlavním produktem štěpení fosfolipidové membrány účinkem fosfolipázy D -
(PLD
z angl. phospholipase D). Za klíčový faktor destabilizace koronárního plátu je považována právě aktivace PLD.
V roce 2007 bylo laboratorní stanovení cholinu zcela obtížné. Průkaz BB
izoenzymu glykogenfosforylázy se začal používat již na konci devadesátých let. Jedná se o velmi časný marker myokardiální nekrózy a ischemie, ale v roce 2007 dosud chyběly kvalitní komerční soupravy pro běžné laboratorní použití. Dalším z nových markerů je pregnancyassociated plasma protein A (PAPP-A). Je syntetizován trofoblastem v průběhu těhotenství a používá se ke screenignu Downova syndromu. PAPP-A se dále nachází v lidských fibroblastech, ze kterých je při ruptuře nestabilního aterosklerotického plátu uvolňován do cirkulace. Bylo prokázáno, že zvýšený PAPP-A je nezávislým ukazatelem výskytu ischemie myokardu a může být pomocníkem při indikaci koronárních intervencí ( Heeschen
2003).
Placentární růstový faktor ( PIGF z angl. placental growth factor ) patří do proteinů odvozených od destiček s funkcí chemoatraktantu pro monocyty. Je to marker ruptury aterosklerotického plátu, ischemie a trombózy. PIGF se ukazuje jako nezávislý ukazatel nepříznivého vývoje u nemocných
s akutními
koronárními
syndromy.
Solubilní
CD40
ligand
(sCD40L)
je
transmembránový protein s výskytem v aktivovaných trombocytech, buňkách hladkého svalstva
47
a makrofázích. Zvýšené hodnoty se vyskytují u akutních koronárních syndromů. Stanovení sCD40L může být užitečné k odhalení pacientů s rizikem trombózy, a také jako indikátor nestabilního aterosklerotického plátu u AKS ve spojení s markery srdeční ischemie. Stanovení CRP ve vztahu k AIM a ateroskleróze má již dlouhou historii, avšak v posledních letech se objevila metoda umožňující s vysokou přesností stanovit jeho velmi nízké koncentrace. Metoda se nazývá vysoce senzitivní C reaktivní protein (hsCRP z angl. high senzitivity C - reaktive protein) (Pudil a kol 2007).
7.3.4 Natriuretické peptidy ( NP) Natriuretické peptidy fungují v lidském organismu jako antagonisté renin-angiotenzinaldosteron a sympatického nervového systému. Vyznačují se schopností stimulovat vazodilataci, natriurézu, diurézu, snižovat sekreci aldosteronu, inhibovat buněčný růst a snižovat nervovou aktivitu sympatiku. Rozlišujeme čtyři druhy natriuretických peptidů. První je atriální natriuretický peptid (ANP), který je produkován především myocyty v srdeční síni. Podnětem k jeho sekreci je napětí stěn síní. Mozkový natriuretický peptid (BNP z angl. brain natriuretic peptide) se tvoří hlavně v myocytech srdečních komor a jeho sekreci se zvyšuje napětím stěn a volumovým zatížením komor. S rostoucím přetížením roste produkce BNP i ANP a v endotelu cév je produkován natriuretický peptid C (CNP). Impuls k jeho sekreci se nazývá endoteliální stres. Jeho koncentrace jsou však mnohem nižší než koncentrace ANP a BNP. Čtvrtým natriuretickým peptidem je urodilatin tvořený a působící v ledvinách. NP se tvoří ve formě prohormonů, které jsou postupně štěpeny na biologicky aktivní natriuretické peptidy. K diagnostice srdečního selhání se využívá především stanovení plazmatických koncentrací BNP. Má ze všech NP nejdelší poločas. Ještě delší poločas má biologicky neaktivní N-terminální fragment proBNP (NT-proBNP z angl. N-terminal prohormone of brain natriuretic peptide). Plazmatické koncentrace NT-proBNP dobře korelují s BNP, a proto jsou také využívány k diagnostice srdečního selhání. Stanovení BNP a NT-pro BNP je využíváno hlavně k vyloučení srdečního selhání u náhle dušného pacienta a pro určení prognózy nemocného se srdečním selháním (Janota 2003).
7.4
Současnost Během posledních deseti let zaznamenalo vyšetření srdečních troponinů obrovský vývoj.
Schopnost stanovit jejich přítomnost v krevní plazmě je současné době nejcitlivějším a nejspolehlivějším biochemickým markerem v diagnostice myokardiální nekrózy. Přestože jsou
48
troponiny vysoce senzitivní metodou k poškození myokardu, zůstává trvalým problémem diagnostiky AIM založené na troponinu jeho relativně malá specifita. Troponin může být detekován u mnoha dalších akutních a chronických onemocnění, kdy nemusí dojít k ischemické nekróze myocytu. V každém případě se nemůžeme spoléhat na zvýšení troponinu jako důkaz vzniku AIM. Podle univerzální definice je IM definován jak klinickým obrazem, EKG změnami, změnami kontraktility a viability myokardu, tak detekcí alespoň jednoho biochemického biomarkeru nekrózy. Pro správné určení diagnózy musí být následně zaznamenán relativně rychlý pokles markeru s návratem pod diagnostickou hranici během hodin až dnů. Vzhledem k lehčímu zvýšení troponinu u dalších srdečních poruch je správné k určení diagnózy IM vyšetření alespoň dvou kardiomarkerů. V poslední době jsou zaváděny nové vysoce senzitivní metody cTn. Jedná se o metody hs-cTnI a hs-cTnT (z angl. high senzitivity cardiac troponin) vysoce senzitivní troponiny I a T. Jejich hlavní podstatou je detekce cTn u 50-90 % zdravých dospělých. Druhým přínosem je rychlý vzestup koncentrací v plazmě během 1 - 3 hodin. Metodu lze použít pro včasnou diagnostiku, a tím nahradit používání starších metod jako myoglobin a GPBB. Diagnóza je však určena až na základě změny koncentrací troponinů v čase. Při použití metody hs se druhý odběr provede po třech hodinách, v případě standardních metod za 6 hodin. Stanovení hmotnostní koncentrace CK-MB mass díky troponinům již nepatří mezi nejspolehlivější markery nekrózy myokardu. Nadále jej však můžeme použít k diagnostice IM obzvlášť v případě, kdy nemáme k dispozici troponiny. Tato metoda se též považuje přínosnou v diagnostice reinfarktu. Stanovení katalytické aktivity celkové CK a CK-MB se dnes již nedoporučuje. Ostatní enzymové markery AST, ALT a LD se v dnešní době už v diagnostice AIM nevyužívají. Jejich stanovení se provádí jen jako součást komplexního vyšetření. K rychlému potvrzení či vyloučení IM může sloužit specifický kardiální protein vážící mastné kyseliny, uvolňující se z poškozeného kardiomyocytu již po 30 minutách. Nazývá se heart - type fatty acid binding protein (H - FABP). Vyšetření se provádí standardní ELISA metodou, ale je velmi náročné. Izoenzym fosforylázy GPBB se v první hodině obtíží ve studii prováděné metodou ELISA ukázal jako nejcitlivější marker myokardiálního poškození (96%) ve srovnání s ostatními metodami, myoglobinem (71%), CK-MB mass (63%) a cTnT (54%). Problémem tohoto vyšetření je však nízká specifita (Janoušek 2011, Janota 2013).
49
7.5
Vývoj kardiomarkerů – výsledky
Tabulka 3 Přehled kardiomarkerů Marker
Počátek vzestupu
Maximum
Normalizace
Výhody
AST
4-8 h
16-48 h
3-6 dní
LD
6-12 h
24-60 h
7-15 dní
pozdní marker
LD1
do 12 h
do 120 h
pozdní marker
CK
do 6 h
CK-MB (kat)
do 4 h
CK-MB (mass)
do 3 h
CK-MB (izoformy) CK-MM (izoformy)
16- 36 h
3-5 dní
do 48 h
časný marker, levný pomocník pro hodnocení rozsahu postižení větší citlivost a specifita než CK
do 65 h
časný, velmi specifický, nejlepší marker reinfarktu
do 2,5
do 24 h
časný marker
do 2,5
do 24 h
časný marker
9-24 h
Myoglobin
do 2 h
5 -8 h
do 19 h
velmi časný marker
GPBB
0,5 h
1h
do 4 h
cTnT
do 3,5 h
12- 72 h
10-14 dní
cTnI
do 3,5 h
12-30h
do 7 dní
MHC MLC-1
do 46 h do 10 h
do 120 h do 96 h
do 173 h do 164 h
nejčasnější marker vysoká senzitivita i specifita, časný a pozdní marker vysoká senzitivita i specifita časný a pozdní marker velmi pozdní marker pozdní marker
CRP
hlavní marker zánětu
hs CRP
vysoká citlivost časný a velmi citlivý marker časný a velmi citlivý marker k rychlému potvrzení, nebo vyloučení AIM určení prognózy u srdečního selhání nebo jeho vyloučení určení prognózy u srdečního selhání, nebo jeho vyloučení
hs cTnT
1-3 h
hs cTnI
1-3 h
h - FABP
0,5 h
1-3 h
BNP NT- pro BNP
50
Nevýhody málo specifický, pouze součást komplexního vyšetření málo specifický, dnes jen jako součást komplexního vyšetření málo specifický v časné fázi negativní málo citlivý málo specifický stále není úplně specifický není úplně kardiospecifický nahrazuje se troponiny
není kardispecifický, nahrazován hs troponiny není úplně specifický pro AIM není úplně specifický pro AIM malá specifita malá specifita nespecifický, málo senzitivní
8. DISKUZE Za posledních přibližně 50 let, kdy se zavedlo do laboratorní praxe stanovení katalytických koncentrací enzymů, prošla diagnostika poškození myokardu obrovským vývojem. Přibližně před 15-ti lety se v laboratořích začali stanovovat kardiální troponiny, které jsou dnes stále považovány za metody nejvíce citlivé a specifické. V diagnostice IM tvoří stále „ zlatý standard“. Během doby od jejich zavedení do praxe se vyvíjí neustále citlivější a specifičtější diagnostické soupravy. V poslední době se pomalu začíná zavádět do praxe stanovení vysoce senzitivních troponinů hsTn, které umožňují stanovení velmi nízkých koncentrací a tím je možné stanovit hladinu troponinu i u zdravých osob. Druhým velmi pozitivním přínosem těchto metod je časnějším vzestup jejich plazmatických koncentrací. Předpokládá se, že stanovení hsTn bude postupně nahrazovat dosud používané nejčasnější markery IM, jako je stanovení myoglobinu a GPBB. Z nejnovějších metod k rychlému potvrzení, nebo vyloučení AIM může posloužit i metoda h- FABP.
Svůj význam má také vyšetření vysoce senzitivního CRP, který odhalí
zánětlivé změny ve velmi nízkých koncentracích, což klasické stanovení CRP neumí. Co se týče enzymových stanovení v diagnostice kardiálního poškození, největší význam má stanovení CK-MB mass. Je to nejspolehlivější marker reinfarktu a pro určení AIM se používá většinou v případech, kdy není k dispozici stanovení troponinu.
Ostatní enzymové metody
počínající katalytickým stanovením CK-MB, které tvořilo asi 25 let zlatý standard laboratorní diagnostiky IM, se z dnešního pohledu díky nedostatečné specifitě již nedoporučují. Enzymy jako katalytická koncentrace CK, AST a LD se doporučují pouze jen jako součást komplexního vyšetření. Z mého pohledu bych řekla, že velmi záleží na konkrétní laboratoři, na jakou skupinu pacientů je zaměřena. Například laboratoř vyšetřující odběry především pro praktické lékaře a ambulantní specialisty enzymová stanovení i dnes velmi využívá. Jedná se především o komplexní vyšetření vedoucí k prvnímu záchytu daného onemocnění, nebo o průběžné kontroly pacientů z kardiologických ambulancí. Naproti tomu, laboratoř ve fakultní nemocnici musí být dobře vybavena, aby dokázala co nejrychleji a nejlépe vyšetřit pacienta s akutní příhodou, a pečlivě sledovat pacienty na lůžkových odděleních typu JIP a ARO.
Samozřejmě záleží i na
finančních možnostech jednotlivých nemocnic a laboratoří a na počtu vyšetřovaných vzorků v dané laboratoři.
51
9. ZÁVĚR Závěrem bych chtěla říci, že zavedení enzymových stanovení do klinicko-biochemických laboratoří znamenalo pro laboratorní diagnostiku té doby obrovský pokrok. Od té doby se metody sloužící k diagnostice daných chorob rychlým tempem vyvíjely a neustále se vyvíjejí k metodám čím dál tím citlivějším, specifičtějším a časnějším. Pravdou je, že nejnovější metody už kolikrát nemají s enzymy moc společného, ale každopádně bych řekla, že stanovení enzymů má v dnešní laboratorní diagnostice stále svůj význam. V případě pacienta s akutním infarktem myokardu, by metodou první volby bylo samozřejmě stanovení troponinu, ještě lépe stanovení vysoce senzitivního troponinu. Na druhou stranu pracuji v laboratorně diagnostickém centru Prevedig spol. s.r.o., kde se zaměřujeme převážně na laboratorní vyšetření pro praktické lékaře, některé ambulantní specialisty a pro samoplátce na osobní žádost. Enzymová stanovení zde tvoří poměrně velkou část vyšetření. Například vyšetření ALT, AST a GGT v diagnostice jaterních onemocnění jsou zde jedny z nejvyšetřovanějších parametrů. Samozřejmě jejich metody stanovení se také neustále vyvíjejí k přesnějším a pro praxi snáze použitelnějším.
52
10.
POUŽITÉ ZKRATKY
ADP
adenosindifosfát
AIM
akutní infarkt myokardu
AKS
akutní koronární syndron
ALT
alaninamino transferáza
ALP
alkalická fosfatáza
AMS
–amyláza
ANP
atriální natriuretický peptid
AST
asparátamino transferáza
ATP
adenosintrifosfát
BNP
mozkový natriuretický peptid
CK
kreatinkináza
CK-BB
(creatinkinase brain ) mozkový izoenzym kreatinkinázy
CK-MB
(creatinkinse muscle brain) myokardiální izoenzym kreatinkinázy
CK-MB-mass
imunologická metoda stanovení CK-MB
CK-MM
(creatinkinase muscle ) svalový izoenzym kreatinkinázy
CNP
natriuretický peptid C
CRP
C reaktivní protein
cTnC
(cardiac troponin C)srdeční troponin C
cTnI
(cardiac troponin I) srdeční troponin I
cTnT
(cardiac troponin T) srdeční troponin T
EDTA
(ethylenediaminetetraacetic acid) kyselina ethylendiamintetraoctová
EKG
elektrokardiografie
ELISA
(enzyme linked immuno sorbent assay) enzymoimunoanalýza
EP
enzym-produkt
EPS
etyliden-4-nitrofenyl-maltoheptaosid
ES
enzym-substrát
FFAs
(free fatty acid ) volné mastné kyseliny vázané na albumin
FFAu
(free fatty acid ) volné mastné kyseliny v solubilní formě
GIT
gastrointestinální trakt
GPBB
(glykogen phosphorylase izoenzyme brain ) mozkový izoenzym glykogen fosforylázy
GPLL
(glykogen phosphorylase izoenzyme liver ) jaterní izoenzym glykogen fosforylázy
GPMM
(glykogen phosphorylase izoenzyme muscle) svalový izoenzym glykogen fosforylázy
HBS
hydroxybutyrátdehydrogenáza
H-FABP
(heart fatty acid binding protein) vazebný protein pro mastné kyseliny srdeční izoforma
hs CRP
(high sensitivity C- reactive protein) vysoce senzitivní C- reaktivní protein
hs –cTnI
(high senzitivity cardiac troponin I) vysoce senzitivní srdeční troponin I
hs – cTnT
(high senzitivity cardiac troponin T) vysoce senzitivní srdeční troponin T
CHS
cholinesteráza
IFCC
(International federation of clinical chemistry) Mezinárodní federace klinické chemie
IL-6
interleukín 6
IgA
imunoglobulin A
IgG
imunoglobulin G
IgM
imunoglubulin M
IM
infarkt myokardu
IMA
ischemií modifikovaný albumin
LD (LDH)
laktátdehydrogenáza
LPS
lipáza
MDH
malátdehydrogenáza
MHC
( myosin heavy chain) těžký řetězec myosinu
MLC
( myosin light chain) lehký řetězec myosinu
NAD
nikotinamidadenindinukleotid
NADH
nikotinamidadenindinukleotid redukovaná forma
NADP (NADPH) nikotinamidadenindinukleotid fosfát (redukovaná forma) NP
natriuretický peptid
NT – proBNP (N-terminal prohormone of brain natriuretic peptide) N - terminální fragment prohormonu BNP PAPP-A
( pregnancy-associated plasma protein A) glykoprotein syntetizovaný v průběhu těhotenství
PLD
(phospholipase D) fosfolipáza D
PIGF
(placental growth factor) placentární růstový faktor
sCD40L
solubilní ligand CD 40
TAG
triacylglycerol
TNF-
tumor nekrotizující faktor
VLDL
(very low density lipoprotein) liporotein s velmi nízkou hustotou
11. SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Pyruvát je redukován na laktát za spotřeby NADH (nikotinamidadenindinukleotid redukovaná forma) ..................................................................................................................... 17 Obr. 2. Funkce ALT ................................................................................................................... 21 Obr. 3 Funkce AST ...................................................................................................................... 22 Obr. 4 Gama-glutamylový cyklus .............................................................................................. 25 Obr. 5 Reakce katalyzovaná GGT .............................................................................................. 27 Obr. 6 Reakce katalyzovaná kreatinkinázou ............................................................................. 28 Obr. 7 Princip fotometrických metod stanovení celkové aktivity CK ......................................... 30 Obr. 8 Funkce ALP - 1. Hydrolýza monoesteru za vzniku alkoholu, 2. Přenos fosfátu na alkohol za vzniku esteru ......................................................................................................................... 33 Obr. 9 Princip stanovení ALP ..................................................................................................... 35 Obr. 10 Příklad reakce s 4-nitrofenylglykosidovým substrátem ................................................ 38 Obr. 11 Etyliden-pNP-G7 - Etyliden-4-nitrofenyl-maltoheptaosid ............................................ 38 Obr. 12 Úloha lipázy v organismu – hydrolýza triacylglycerolu ................................................ 39
12. SEZNAM TABULEK Tabulka 1 Biologické poločasy běžně stanovovaných enzymů ................................................ 14 Tabulka 2 Izoenzymy LD ............................................................................................................ 17 Tabulka 3 Přehled kardiomarkerů ............................................................................................... 50
13. POUŽITÉ ZDROJE INFORMACÍ ALT - Alaninaminotransferáza Pyridoxal-5`-phosphate. Katalogové č. 467840, Informace o soupravě, Systémy Synchron, Beckman Coulter. c2005. s.1-2. ALP (IFCC-DGKCh) Alkaline phosphatase. Katalogové č. 476821, Informace o soupravě, Systémy Synchron, Beckman Coulter. c2005. s.1. ASLAN, D., APPLE, FS. Ischemia modified albumin: clinical and analytical update. Lab Med, 2004, 35, 1–5. AST – Asparátaminotransféráza Pyridoxal-5`-fosfát. Katalogové č. 467845. Informace o soupravě, Systémy Synchron, Beckman Coulter. c2005. s. 1-2. BARAL,R. - LUO, X. - WATANABE, H . -YAMASAWA,I. - IBUKIAMA,C. Role of MB isoforms (Isomers) in early diagnosis of acute myokardial infarction. Inter. Med., 33, 1994, č. 4, s. 210215. CK Creatine Kinase. REF. 442635. Chemistry information Sheet, Synchron Systems, Beckman Coulter. c2013. s. 1 DASTYCH, M., BREINEK, P., BEŇOVSKÁ, M., BUČKOVÁ, D., ČERMÁKOVÁ, Z., SOŠKA, V., TŮMOVÁ, J., VÁVROVÁ, J., VERNER, M., VINOHRADSKÁ, H. Klinická biochemie: bakalářský obor zdravotní laborant. Masarykova Univerzita. Druhé vydání. Brno: Coprint. s.r.o., 2011. s. 193-206. ISBN 978-80-87192-18-4. DRŠATA, J. Patobiochemie pro farmaceuty. Univerzita Karlova V Praze, Fakulta farmaceutická v Hradci Králové. Praha: Státní pedagogické nakladatelství, 1983. GGT - Glutamyltransferáza. Katalogové č. 442650, Informace o soupravě, Systémy Synchron, Beckman Coulter. c2005. s. 1. HEESCHEN, C., FICHTLSCHERER, S., HAMM C.W. Pregnancy-associated plasma protein-A (PAPPA) plasma level independently predict outcome in troponin negative patients with acute coronary syndrome. Circulation, 2003, 108 (Suppl IV):470. IFCC primary reference procedures for measurement of catalytre aktivity concentrations of enzymes at 37°C. Část 8. Reference procedure for the measure of catalytre concentration amylase. Clin Chem Lab Med. 2006: 1146-55. JANOTA, T. Natriuretické peptidy v diagnostice srdečního selhání, Zdravotnické noviny[online]. Roč. 2003, vol. 19, s. 8. ISSN 1214-7664. Dostupné z
JANOTA, T. Biochemické markery nekrózy myokardu v současné klinické praxi. Intervenční a akutní kardiologie, 2013, roč. 12, č. 1, s. 28-33. ISSN: 1213-807X. JANOUŠEK, S. Troponin u akutního infarktu myokardu – zlatý standard, nebo dobrý sluha, ale špatný pán? Některá úskalí při užívání troponinu pro stanovení diagnózy akutního infarktu myokardu. Intervenční a akutní kardiologie, 2011, roč. 10, č. 1, s. 18-22. ISSN: 1213-807X. LD Laktátdehydrogenáza. Katalogové č. 442655, Informace o soupravě, Systémy Synchron, Beckman Coulter. c2005. s. 1 LEDVINA, M., STOKLASOVÁ, A., CERMAN, J. Biochemie pro studující medicíny. I. první vydání. Praha: Karolinium, 2003.s 26-46. ISBN 978- 80-2460-8495 LIP Lipáza. Katalogové č. 476851, Informace o soupravě, Systémy Synchron, Beckman Coulter. c2005. s. 1-2. MAIR, J. Cardiac troponin I and troponin T: Are enzymes still relevant as cardiac markers? Clin. Chim. Acta, 257, 1997, č 1, s. 99-115 MAIR, J. Glycogen Phosphorylase isoenzyme BB to diagnose ischaemic myocardial damage. Clin. Chim, Acta, 272, 1998, č. 1, s. 79-86 MASOPUST, J. Klinická biochemie, požadování a hodnocení biochemických vyšetření část I. a II. 1. Vydání. Praha: Karolinium, 1998. ISBN 80-7184-649-3. NEZBEDA, P. Enzymy 2013. CEVA [online]. 9. duben 2014, poslední aktualizace 9. duben 2014 [cit. 2014-08-02 ]. Dostupný z WWW: http://www.ceva-edu.cz/course/view.php?id=91. ISSN 1803-8999. PANTEGHITI, M., BAIS and van SOLINGE. Enzymes in Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Elsevier Saunders, 2006, Kapitola 21, s. 1-2 PANTEGHITI, M., Bonora R.’’Measurement of Pancreatic Lipase Activitz in Serum by a Kinetic Colorimetric Assay Utiliying a Chromogenic Substrate Reagent, Abstrakt, Clin Chem, 1996, 42:S101 PREVEDIG SPOL. S.R.O. seznam vyšetření [online] 9.12.2008, [ cit.2014-08-16]. ALP v séru. Dostupné z http://www.prevedig.cz/index.php?p=278-pojem-18, ALT v séru. Dostupné z http://www.prevedig.cz/index.php?p=278-pojem-46,
AMS
v moči.
Dostupné
z
http://www.prevedig.cz/index.php?p=278-pojem-53,
AMS
v séru.
Dostupné
z
http://www.prevedig.cz/index.php?p=278-pojem-54,
AST
http://www.prevedig.cz/index.php?p=278-pojem-47,
CK-MB
v séru. v séru.
Dostupné
z
Dostupné
z
http://www.prevedig.cz/index.php?p=278-pojem-106,
CK
v séru.
Dostupné
z
http://www.prevedig.cz/index.php?p=278-pojem-107,
LD
v séru.
Dostupné
z
http://www.prevedig.cz/index.php?p=278-pojem-168, http://www.prevedig.cz/index.php?p=278-pojem-174
Lipáza
v séru.
Dostupné
z
PUDIL, R., TICHÝ, M., VOJÁČEK, J. Kardomarkery na prahu třetího tisíciletí. Intervenční a akutní kardiologie, 2007, roč. 6, č. 1, s. 20-23. ISSN: 1213-807X. SCHNEIDERKA, P., JIRSA, M., KAZDA, A., KOCNA, P., MAŠEK, Z., NEKULOVÁ, M., PICK P., ŠEBESTA, I., ŠIMÍČKOVÁ, M., ŠTERN, P., ZIMA, T. Kapitoly z klinické biochemie. 2. Vydání. Praha: Karolinium, 2004. s. 113-118, 137-139, 165-167. ISBN 80-246-0678-X. RACEK, J., EISELT, J., FRIEDECKÝ, B., HOLEČEK, V., NEKULOVÁ, M., PITTROVÁ, H., RUŠAVÝ, Z., SENFT, V., ŠAVLOVÁ, M.,TĚŠÍNSKÝ, P., VERNER, M. Klinická biochemie. 2. přepracované vydání.Praha: Galén, 2006. S 81-90, 181-197. ISBN 80-7262-324-9. ROCHE Cardiac CK-MB, Cobas [online]. 30. 7.
2013,
[cit. 2014-08-16]. Dostupné z
https://www.google.cz/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=6&cad=rja&uact=8& ved=0CEsQFjAF&url=https%3A%2F%2Fpim-eservicestst.roche.com%2FeLD%2Fsk%2Fcs%2FDocuments%2FGetDocument%3FdocumentId%3Db 34f0b13-409e-e311-a887-00215a9b0bb8&ei=T2LwUi3Guap7AaX3YGgAg&usg=AFQjCNHJqxLAVG2RvQivtg0ebmEkJCZNSA TÁBORSKÁ, E. Enzymy v klinické diagnostice [online]. 2008-01-18 [cit.2014-06-29]. Dostupné z https://is.muni.cz/el/1411/jaro2008/VSBC041s/um/enzymy_v_diagnostice_-_podklady.pdf TICHÝ,M.,PIDRMAN V. Moderní biochemická diagnostika akutního infarktu myokardu. Vojenské zdravotnické listy, 1981, roč. 50, č. 5, s. 208-213. ISSN: 0372-7025. TICHÝ, M. Biochemické markery akutního infarktu myokardu. Labor aktuell Czech, 1998, č. 3, s. 13-17. ISSN: 1211-5665. VÁCLAVÍKOVÁ L. Stanovení enzymových aktivit pomocí kapilární elektroforézy. Brno, 2006. Bakalářská práce na Přírodovědecké fakultě Masarykovy Univerzity na katedře biochemie. Vedoucí bakalářské práce RNDr Zdeněk Glatz, Csc. VEJRAŽKA, M. Reakční schéma stanovení aktivity ALT [online]. 2010-04-06, poslední aktualizace
2010-04-06
[cit.
2014-07-20].
Dostupné
z
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:Stanovení_ALT.png, VEJRAŽKA, M. Reakční schéma stanovení AST Warburgovým nepřímým optickým testem [online]. 2010-04-06, poslední aktualizace 2010-04-06 [cit. 2014-07-20]. Dostupné z http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:Stanovení_AST.png VEJRAŽKA, M. Schéma gama-glutamylového cyklu[online]. 2010-04-06, poslední aktualizace 2010-04-06 [ cit. 2014-07-20 ] Dostupné z http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:Gama3glutamylový_cyklus.png YIKRAZUUL. Reakce katalyzovaná laktátdehydrogenázou [online]. 2009-01-04, poslední změna
2010-04-20
[
cit.
2014-03-06].
http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:LDH_01.png
Dostupné
z
ZIMA, T. a kolektiv autorů. Laboratorní diagnostika. Druhé doplněné a přepracované vydání. Praha: Galén, 2007. s. 15, 100-102. ISBN: 978-80-7262-372
