UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE 1. LÉKAŘSKÁ FAKULTA
DIPLOMOVÁ PRÁCE
2005
Karla Niklová
UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE 1. LÉKAŘSKÁ FAKULTA
IMUNOCHEMICKÉ STANOVENÍ KRVE VE STOLICI
Diplomant: Karla Niklová Vedoucí diplomové práce: MUDr. Petr Kocna, CSc. Oponenti diplomové práce: doc. MUDr. Miloš Dvořák, CSc. 2005
Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci napsala samostatně a veškeré použité prameny jsem citovala v textu.
Diplomová práce obsahuje 102 219 znaků s mezerami.
20. června 2005
……………………………...
Za konzultace a pomoc děkuji MUDr. Petru Kocnovi, CSc., a MUDr. Zdislavě Vaníčkové.
1
CÍL: 1. Zjistit citlivost imunochemického testu na okultní krvácení Diaquick in vitro s použitím pufru daného testu bez vzorku stolice. 2. Ověřit, zda bude tato citlivost stejná při použití pufru daného testu po aplikaci vzorku stolice.
2
OBSAH 1.
ÚVOD............................................................................................................................. 6
1.1
Incidence kolorektálního karcinomu v České republice ................................................ 7
1.2
Prevence kolorektálního karcinomu ............................................................................... 8
1.3
Testy na okultní krvácení ve stolici (FOB testy)......................................................... 11
1.3.1 Guajakové testy ............................................................................................................ 12 1.3.2 Imunochemické testy.................................................................................................... 13 1.3.3 Hem-porfyrinové testy.................................................................................................. 14 1.4
Parametry účinnosti screeningových metod................................................................. 15
1.4.1 Diagnostická senzitivita................................................................................................ 15 1.4.2 Diagnostická specificita................................................................................................ 17 1.5
Z historie populačního screeningu................................................................................ 19
1.5.1 Česká republika ............................................................................................................ 19 1.5.2 Evropa, USA a Japonsko.............................................................................................. 20 1.6
Jaká je účinnost FOB testů ........................................................................................... 27
1.7
Vztah mezi senzitivitou a specificitou.......................................................................... 31
1.8
Analytická specificita ................................................................................................... 34
1.9
Analytická senzitivita ................................................................................................... 36
2.
MATERIÁL A METODY ........................................................................................... 41
2.1
Diaquick Fecal Occult Blood Test ............................................................................... 41
2.2
Metody.......................................................................................................................... 42
3.
VÝSLEDKY A DISKUSE........................................................................................... 45
4.
ZÁVĚRY...................................................................................................................... 48
5.
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY.......................................................................... 49
6.
PŘÍLOHY..................................................................................................................... 53
3
ABSTRAKT Kolorektální karcinom je v České republice nejčastější malignitou trávicího ústrojí a jeho incidence v posledních desetiletích stále narůstá. Sekundární prevence screeningovým programem je nejrozšířeněji realizována pomocí testů na okultní krvácení ve stolici. Z nich je nejčastěji používán test na bázi guajakové pryskyřice, ale zájem odborníků se také obrací k imunochemickým testům. Ty se používají především v Japonsku a Číně. Studie, které vyhodnocují účinnost screeningu byly realizovány v Evropě, USA a Japonsku. U všech bylo zjištěno snížení úmrtnosti na kolorektální karcinom. Guajakové testy mají oproti imunochemickým testům nízkou senzitivitu a jsou limitovány
compliance
pacientů.
Jejich
specificita
je
vyšší
než
senzitivita,
ale
u imunochemických testů je specificita na stejné nebo mírně vyšší úrovni. Nevýhody imunochemických testů spočívají ve vyšší ceně, mohou přinášet více falešně pozitivních výsledků, což v důsledku zvyšuje náklady screeningu a mohou být nehodnotitelné pro jejich špatnou přípravu. Parametry senzitivity a specificity jsou srovnávány v řadě studií s nejednotnými výsledky i názory na užívání toho či onoho typu testu. Senzitivita a specificita jsou nepřímo úměrné, při posunu meze metody tedy dochází ke zvyšování senzitivity při poklesu specificity a naopak. Cílem výzkumu bylo stanovit analytickou citlivost imunochemického testu a ověřit, zda bude zjištěná citlivost stejná při opakování testu tentokrát s použitím pufru se stolicí. K testování jsem používala imunochromatografický test Diaquick. Z pufru tohoto testu a hemolyzované krve jsem postupně připravovala roztoky o různých koncentracích a vyhodnocovala výsledky. Nejnižší koncentrace, kdy byla odečitatelná pozitivní reakce byla 0,000005 mg hemoglobinu/ml pufru, tzn. že dolní hraniční mez leží v intervalu 0,000005 mg/ml až 0,000001 mg/ml. Nejvyšší koncentrace s pozitivním výsledkem byla 0,5 mg/ml, tzn. že horní hraniční mez leží v intervalu 0,75 mg/ml až 0,5 mg/ml. Koncentrace vyšší než 0,5 mg/ml vykazovaly opět negativní reakci vzhledem k hook-effectu. Obě hladiny byly potvrzeny i s použitím pufru se stolicí, ale k pozitivní reakci došlo za delší časový úsek, než při použití pufru bez stolice. Lze předpokládat, že přítomnost stolice má vliv na výsledek testu.
4
ABSTRACT Colorectal cancer is the most often occurring malignity of the digestive system in the Czech Republic and its incidence has been still growing in the last decades. Secondary prevention by the screening program is the most oftenly realised by the faecal occult blood tests. The guaiac tests are used the most of them but an interest of experts is also focused on immunochemical tests. These ones are mainly being used in Japan and China. Studies evaluating screening efficacy were realised in Europe, the United States and Japan. Reduction of colorectal mortality were found out at all of them. The guaiac tests have low sensitivity in comparison with immunochemical tests and are limited by compliance of patients. Their specificity is higher then sensitivity but in case of immnunochemical tests the specificity is at the same or mildly higher level. These advantages of immunochemical tests lie in higher cost, they can bring more false positive results, which consequently increases the screening costs, and they can be unevaluable because of their incorrect preparation. The sensitivity and specificity parameters are compared in row of studies with unified results and opinions on using of this or that type of test. Although, these parameters are reciprocal proportion, thus when displacing limit of method, senzitivity increase at specificity fall set and vice versa. The aim of the research was established analytical sensitivity of immunochemical test and verify if the detected sensitivity is the same with the use of solution with faeces during repeating test at this time. For testing I used the immunochromatographic Diaquick test. I gradually prepared solutions with different concentrations and hemolysed blood from the test solution and evaluated results. The lowest concentration, at which was positive reaction legible, was 0,000005 mg hemoglobin/ml solution, i. e. that low boundary limit lies within interval from 0,000005 mg/ml to 0,000001 mg/ml. Peak concentration with positive result was 0,5 mg/ml, i. e. that high boundary limit lies within interval from 0,75 mg/ml to 0,5 mg/ml. High limit, when test still returned positive result, was 0,5 mg hemoglobin/ml. The concentrations higher than 0,5 mg/ml showed negative reaction again considering hookeffect. Both levels were also confirmed using solution with faeces but positive reaction was done for longer period of time than using solution without faeces. It is able to suppose that faeces presence impacts the test result.
5
1. ÚVOD Kolorektální karcinom je onemocnění, u něhož dochází – nejen – v České republice ke stále rostoucí incidenci. Nicméně, ve statistických tabulkách, se naše země ocitá na vedoucích místech. Smutný primát zaujímáme ve světě také nejvyšší mortalitou. Je proto třeba věnovat pozornost a aktivně používat prostředků primární a sekundární prevence. Ve své práci se věnuji problematice sekundární prevence, respektive testům na přítomnost okultního krvácení ve stolici. Podávám zde přehled jednotlivých testů, popisuji výsledky screeningových programů u nás i v jiných státech Evropy a světa, zabývám se parametry jejich účinnosti. Cílem výzkumu bylo stanovit analytickou citlivost imunochemického testu a ověřit, zda bude zjištěná citlivost stejná při opakování testu tentokrát s použitím pufru se stolicí.
6
1.1 Incidence kolorektálního karcinomu v České republice V současné době je v České republice kolorektální karcinom nejčastějším nádorem trávicího ústrojí a druhým nejčastějším karcinomem po karcinomu plic u mužů a karcinomu prsu u žen. Tvoří 12,1 % všech nádorů u mužů a 13,7 % všech nádorů u žen. Toto jsou data uváděná národním onkologickým registrem v letech 1977–1997. Celosvětově patří frekvencí svého výskytu a celkovou úmrtností mezi tři nejčastěji se vyskytující nádorová onemocnění (mimo karcinom kůže). Celosvětová incidence je přibližně jeden milion nově diagnostikovaných případů ročně a úmrtnost je větší než 500 000 případů ročně. Zatímco v Asii či v Africe incidence tohoto onemocnění vykazuje značný pokles a v USA a v zemích západní Evropy se inicidence příliš nemění, v zemích střední a jihovýchodní Evropy dramaticky narůstá. V letech 1959–1991 došlo v ČR k nárůstu hrubé incidence o 341 % u nádorů tlustého střeva a o 164 % u nádorů rekta. Velmi nápadný absolutní nárůst incidence kolorektálního karcinomu v letech 1953–1983 (přes 700 %) lze aspoň částečně vysvětlit zvýšením počtu diagnostikovaných případů s rozvojem metod, avšak incidence se zvyšuje dále i v období moderních diagnostických a preventivních přístupů v širší praxi [1, 2]. Vzrůstající trend výskytu této choroby v naší populaci přetrvává již několik desetiletí. V roce 1989 dosáhla incidence nových onemocnění hodnotu 53,8 na 100 000 obyvatel celkové populace, čímž se Česká republika zařadila na první místo v celosvětových statistikách [3]. V roce 1997 bylo v ČR celkem nahlášeno 4 201 nových případů nádorů tlustého střeva a rekta u mužů a 3 088 u žen. Celkem tedy šlo o 7 289 případů, což ve srovnání s rokem 1980, kdy šlo pouze o 4 334 nových případů ukazuje na velmi rychlý nárůst onemocnění. V ČR je v produktivním věku od 35 do 64 let incidence zhoubného nádoru tlustého střeva v Evropě nejvyšší u mužů a pátá nejvyšší u žen. U nádorů konečníku je v ČR incidence v této věkové kategorii nejvyšší v Evropě u mužů i žen. Poslední statistické údaje jsou z roku 1999, kdy incidence kolorektálního karcinomu dosáhla 75/100 000 obyvatel. Incidence výrazně narůstá s věkem. Nejvyšší výskyt je v pozdním věku nad 70 let, kde kolorektální karcinom tvoří 21,2 % všech nádorů u žen a 20,2 % všech nádorů u mužů. Nádory tlustého střeva se vyskytují stejně často u mužů i u žen, nádory konečníku jsou častější u mužů [1]. V zemích s vysokou incidencí kolorektálního karcinomu je většina tumorů lokalizována v rektosigmoideální oblasti. V posledních letech řada autorů pozorovala přesun 7
těchto nálezů směrem proximálním (což však nebylo zcela jednoznačně potvrzeno) [4]. V USA se v letech 1992–1998 zvýšilo procento nádorů vzestupného tračníku. Věří se, že tento nález nastal díky zlepšení diagnostiky, nárůstu sigmoidoskopických vyšetření a odstraňování prekancerózních lézí ze sestupného tračníku [5]. Varovný je fakt, že ČR má u nádorů kolorekta celosvětově nejvyšší mortalitu (52,7/100 000 obyvatel) [1]. 1.2 Prevence kolorektálního karcinomu Kolorektální karcinom představuje v naší populaci problém tak rozsáhlý a závažný, že je třeba v maximální míře realizovat postupy, které mají předpoklady k bezprostřední nápravě současného stavu. Podobně jako u zhoubných nádorů jiné lokalizace je totiž velikost a rozsah kolorektálního karcinomu nejzávažnější individuální prognostický faktor [3]. Navzdory tomu, že je kolorektální karcinom dobře přístupný vyšetření, přichází téměř polovina nemocných v pokročilých stadiích s postižením lymfatických uzlin a s výskytem vzdálených metastáz. Úspěšná léčba kolorektálního karcinomu je možná jen při včasné diagnostice nádorového onemocnění za široké týmové mezioborové spolupráce. Stejně jako vývoj screeningových programů jsou důležité i metody rozvíjející primární a sekundární prevenci [1]. Karcinom tlustého střeva je prakticky jediným onkologickýcm onemocněním, kde je realizovatelná primární prevence nádoru. Jde o nádor, který je důsledkem především chyb životního stylu a vlivu životního prostředí. Proto je zde široké pole pro zdravotnickou osvětu všech stupňů a pokud možno v co nejširší populaci. Preventivní opatření jsou jednak charakteru doporučeného životního stylu a jednak mají charakter optimální diagnostiky prekanceróz nádorového onemocnění [6]. Možnosti sekundární prevence jsou u kolorektálního karcinomu značné, neboť tento nádor často roste poměrně pomalu a přibližně 80 % jich vzniká na podkladě adenomových polypů [3]. Sekundární prevence kolorektálního karcinomu zahrnuje dva druhy programů: 1. Depistáž (screening) asymptomatických jedinců od 50 let věku s opakováním každoročně nebo alespoň v intervalu dvou let. Věk je nízkorizikový faktor sporadického kolorektálního karcinomu, který se objevuje u dosud zdravých jedinců a činí asi 75 % všech případů. Jeho incidence se téměř zdvojnásobuje v každé věkové dekádě od 50 let. Screening je jedinou metodou, která umožňuje bezprostřední zlepšení časné diagnostiky sporadického kolorektálního karcinomu.
8
Úkolem screeningu je vyhledat u asymptomatické populace maximální počet případů skryté fáze onemocnění a v každém z následujících kol screeningu najít nové případy nemoci. Teoreticky odpovídá počet zjištěných onemocnění při prvním screeningu momentálnímu výskytu choroby v populaci (prevalenci), proto se také nazývá prevalentní screening. Nálezy při opakovaných screeningových vyšetřeních odpovídají výskytu nových onemocnění, tedy incidenci, přibývajících v populaci během screeningového intervalu, proto se nazývají incidentní screening. Screening vyžaduje hromadné vyšetřování určitých skupin populace nebo celé populace, tzn. že je spojen s poměrně značnými náklady, i když vlastní vyšetřovací metoda bývá levná. Měl by zahrnovat metody jednoduché, relativně málo náročné jak pro příslušného účastníka, tak pro vyšetřujícího. Náklady se zvyšují potřebou dalších vyšetření u osob s pozitivním nálezem a je nutné kalkulovat i s náklady na další léčbu [7].
2. Dispenzarizaci (surveillance) vysokorizikových skupin kolorektálního karcinomu. Tyto zahrnují 20–25 % všech onemocnění, která jsou v úzkém vztahu k rodinné nebo osobní anamnéze postižených osob [8]. Pro rozpoznávání rizika je velmi důležitá rodinná anamnéza a některé nenápadné příznaky, zejména drobné rektální krvácení. Sledování rizikových skupin umožňuje časnou detekci premaligních lézí [4]. Kolorektální karcinom splňuje podmínky, které byly definovány pro masový screening: je hlavní příčinou morbidity a mortality v průmyslových zemích, při odhadnutém počtu 198 000 nových případů v 15 členských státech Evropské Unie v roce 1995 [9]. Z hlediska zdravotní politiky plní kolorektální karcinom kritéria Světové zdravotnické organizace pro vhodnost screeningu z těchto důvodů: -
jde o závažný zdravotní problém s možností rozpoznávání v časném stadiu a s dobře definovaným průběhem,
-
chirurgická terapie má příznivou prognózu u časných tumorů a tím může být velmi efektivní; detekcí adenomů a endoskopickou polypektomií lze zabránit vzniku malignity,
-
k dispozci jsou různé testy, které umožňují detekci časných lézí a jsou přijatelné pro účastníky screeningu,
-
organizační opatření nutná pro realizaci screeningu by nemusela být závažným problémem,
-
opakovaná aplikace screeningu v přiměřených intervalech vyplývá z klinického průběhu onemocnění samotného,
-
dobrým řízením screeningového programu a vhodným přístupem k účastníkům lze minimalizovat psychickou i případnou fyzickou zátěž spojenou s realizací tohoto programu [10].
9
V současnosti je několik možností screeningového programu kolorektálního karcinomu: test na okultní krvácení ve stolici (faecal occult blood test – FOBT), flexibilní sigmoidoskopie, kombinace obou předchozích metod, kolonoskopie a virtuální kolonografie. Z těchto možností je nejvíce rozšířen FOBT jako úvodní nepřímá metoda [11]. Průběžné hodnocení kontrolovaných prospektivních studií i některé další metodické postupy se shodují v tom, že depistáž u bezpříznakových jedinců je velmi pravděpodobně provázena snížením úmrtnosti na kolorektální karcinom. Tyto nálezy poskytují dostatečně přesvědčivé podklady pro další aplikaci depistážních programů v populaci s vysokou incidencí kolorektálního karcinomu [3]. Kolorektální karcinom poskytuje vhodnou příležitost pro screeningovou strategii, jejímž cílem je časná detekce a prevence tumorů se snížením úmrtnosti. Je pro něj charakteristické jeho velmi časté dlouhotrvající asymptomatické období. Detekce tumoru v tomto období obvykle znamená lepší prognózu než detekce v období symptomatickém [4]. U všech jedinců s pozitivním testem na okultní krvácení se doporučuje diagnostický program ke zjištění zdroje krvácení. Za nejlepší modalitu se považuje totální kolonoskopie jako primární a definitivní metoda, která současně umožňuje splnit i profylaktickou část programu, tj. odstranění adenomu, popřípadě léčení jiného zdroje krvácení přístupného endoskopické terapii. V případě nálezu adenomových polypů je indikována polypektomie a pacienti jsou nadále dispenzarizováni v závislosti na velikosti polypů, histologickém typu a stupni dysplazie [12]. Klinické manifestace rostoucího kolorektálního karcinomu mohou zahrnovat některé z těchto příznaků: obstrukce střevního lumen, krvácení, místní invaze, vzdálené metastázy a skupinu systémových příznaků. Ve vztahu k testování okultní krve ve stolici je krvácení. Při expanzi tumoru v lumen obvykle nebývá prudké. Je-li tumor v blízkosti análního otvoru, bývá krev na povrchu stolice a je pro pacienta dobře viditelná. Častěji však bývá smíchaná se stolicí. Tumory v pravém tračníku mají tendenci k výraznému růstu a mohou být dlouhou dobu bez známek obstrukce; mohou i delší dobu nenápadně krvácet se známkami sideropenické anémie, bez krvácení manifestního (zejména u tumorů v céku), zatímco manifestní krvácení bývá častěji u tumorů rektosigmoideálních [4]. Současný stav diagnostiky a terapie symptomatického kolorektálního karcinomu zůstává neuspokojivý. Jejich výsledky se nepodařilo přes trvající úsilí v průběhu posledních 25 let významně ovlivnit [3]. I přes pokroky v diagnostice a léčbě je procento pětiletého přežití nízké [9]. Chirurgie kolorektálního karcinomu dosáhla pravděpodobně svého zenitu a programy adjuvantní terapie mají omezené indikace a účinek. K tomu přistupuje skutečnost, 10
že první klinické příznaky kolorektálního karcinomu jsou podceněny ze strany nemocného i lékaře [3]. 1.3 Testy na okultní krvácení ve stolici (FOB testy) FOB testy jsou založeny na třech základních technologiích: guajak-peroxidázový test, imunochemický test a hem-porfyrinový test. Hlavní rysy těchto testů znázorňuje tabulka 1. Guajakový test Biochemický základ
peroxidázová aktivita
hemoglobin (všechen) myoglobin (všechen) Detekované složky všechny hemy peroxidázy nehemového původu
Imunochemický test imunoreaktivní hemoglobin lidský hemoglobin lidský globin
Hem-porfyrinový test dikarboxylové porfyriny hemoglobin (všechen) myoglobin (všechen) všechny hemy porfyriny pocházející z hemu vyluhované rozpouštědlo a fluorimetrie
Metoda
chromogenový indikátor1
hemaglutinace, ELISA, latex, PBID
Kvantitativní zhodnocení
ne
někdy ano
ano
Léky ovlivňující chemické vlastnosti testu
ano (vit. C)
ne
ne
Léky ovlivňující ano (léky způsobující vyhodnocení testu krvácení)
ne
ano (léky způsobující krvácení)
Dieta ovlivňující ano (maso, rostlinné vyhodnocení testu peroxidázy)
ne
ano (maso)
Potřebné vybavení žádné
závislé na metodě
fluorimetr
Čas potřebný pro několik minut zpracování vzorku
závislý na metodě
4–8 hodin
Tab. 1 Hlavní rysy základních technologií FOB testů dostupných v současné době Převzato z: Young, GP., Macrae, FA., St John, DJB. Clinical Methods for Early Detection: Basis, Use and Evaluation. In Young, GP., Rozen, P., Levin, B. Prevention and Early Detection of Colorectal Cancer. London: W. B. Saunders Company, 1996, p. 243.
1
Metoda založená na pseudoperoxidázovém účinku hemoglobinu, který katalyzuje přenos kyslíku z peroxidu vodíku na redukovanou formu chromogenu (nejčastěji o-tolidin; guajaková pryskyřice; 3,3,5,5-tetramethylbenzi-din), která je bezbarvá. Oxidací chromogenu vzniká zbarvení [13].
11
1.3.1 Guajakové testy Screening kolorektálního karcinomu pomocí FOBT je dostupný od doby, kdy Greegor [14] aplikoval princip intermitentní ztráty malého množství krve u jinak asymptomatických jedinců s použitím testu s guajakovou pryskyřicí [12]. Pro účely masové depistáže bylo třeba vyšetření stolice na okultní krvácení standardizovat. Postupně byla vyvinuta celá řada firemních testů, z nichž většina užívá k průkazu okultního krvácení guajakovou pryskyřici [3]. Základní složkou guajakových testů je filtrační papír impregnovaný roztokem guajakové pryskyřice. Principem zkoušky je pseudoperoxidázová aktivita hemoglobinu, částečně natráveného proteolytickými enzymy, který katalyzuje v přítomnosti peroxidu vodíku (substrát) přenos kyslíku a přeměnu redukované formy guajakové pryskyřice, která je bezbarvá, na formu oxidovanou (modrou) [12]. Guajakové testy reagují s hemem, který je ve volné formě nebo je sloučený s apoproteinem (globin, myoglobin a některé cytochromy). Nejsou schopny detekovat degradační produkty hemu, které vznikají ve střevech, protože ztrácejí peroxidázovou aktivitu. Samozřejmě, guajakové testy reagují s jakýmikoliv peroxidázami, které jsou přítomny ve stolici, včetně těch, které se do těla dostávají potravou. Hem je přítomen v proximálním gastrointestinálním traktu převážně ve formě hemoproteinu z potravy (jako hemoglobin, myoglobin) nebo ve formě erytrocytů z fyziologického nebo patologického krvácení. V žaludku je hem rychle uvolňován z globinu a vysrážen. V tenkém střevě je rozpuštěn a z 5–15 % je absorbován, tzn. že větší množství putuje do tlustého střeva. V tlustém střevě hem a hemoglobin pochází z tenkého střeva nebo z krvácení. Hem může být modifikován střevní mikroflorou dvěma způsoby: odstraněním železa anebo změnami v bočních vinylových řetězcích porfyrinového kruhu. Výsledkem je řada dikarboxylových porfyrinů odvozených z hemu. Porfyriny neobsahující železo nemají peroxidázovou aktivitu a nejsou tudíž detekovatelné guajakovými testy. Důsledkem toho je, že guajakové testy jsou senzitivnější k distálním (např. kolonickým) než k proximálním (např. žaludečním) lézím [15]. Nejrozšířenější typ testu mezi guajakovými je Haemoccult. Dle Friče et al. [3] má tyto přednosti: je stabilní a standardizovaný (reagenční papír impregnovaný guajakovou pryskyřicí pochází z jednoho zdroje), dává málo falešně pozitivních výsledků, vykazuje nízkou pozitivitu při krvácení do horní části trávicí trubice (pseudoperoxidázová aktivita hemoglobinu se při pasáži trávicí trubicí snižuje) a dovoluje srovnávání výsledků 12
v jednotlivých národních programech. Další výhody dle Bleiberga: je poměrně levný a bez velkých potíží pro pacienta. Senzitivita testu je hodnocena kolem 50 % a specificita je 98 %. V rámci inicializačního screeningu je pozitivita nerehydratovaného Haemoccult testu bez dietních omezení 2 %. V následujících screenincích se pohybuje mezi 1 % a 1,5 %. Procento pozitivity je mírně nižší s dietními omezeními (okolo 1 %), ale ty mohou snížit compliance2. Pozitivita je hodně vyšší u rehydratovaných testů (mezi 6 a 10 %) [9]. Zvýšení citlivosti zvlhčeného Haemoccult testu však představuje nebezpečí v podobě vyššího počtu falešně pozitivních nálezů, což může generovat v následném diagnostickém programu problémy finanční, materiálové i personální [12]. 1.3.2 Imunochemické testy Později byly vyvinuty složitější FOB testy, zejména imunochemické, které jsou specifické na lidský hemoglobin [9]. Zpočátku tyto testy užívaly tradiční technologie jako enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) a dvojitou imunodifusi. V poslední době byly vyvinuty testy užívající kvalitativní hemaglutinaci a latexovou aglutinaci. Latexové testy se užívají v lékařských ordinacích. Imunochemické testy jsou nejselektivnější (tj. nejspecifičtější) v tom, že detekují jenom lidský hemoglobin, a možná i jeho degradované formy v časné fázi. Z toho vyplývá, že imunochemické testy, které vyžadují hemoglobin, který je relativně neporušený, budou selektivnější na krvácení z tlustého střeva než testy, které detekují hem nebo hem-porfyrinové deriváty. Hemoglobin je také odbouráván ve stolici, ale proces degradace je pomalejší než v lumen žaludku nebo tenkého střeva. Za použití imunokvantifikujících metod bylo zjištěno, že hemoglobin v lidské stolici může ztratit za 24 hodin polovinu své imunoreaktivity. Předpokládá se, že stejné odbourávání nastává in vivo během pasáže v tlustém střevě. Jev degradace hemoglobinu během pasáže v tlustém střevě činí imunochemické testy potenciálně zranitelnějšími. Není známo, že by některé z protilátek, používané různými výrobci, měly větší schopnost detekovat částečně degradované formy hemoglobinu [15]. Mezi imunochemickými testy jsou rozdíly v senzitivitě a specificitě. Jde zejména o specificitu závislou pravděpodobně na specificitě antihemoglobinových protilátek 2
Compliance je ochota účastníků screeningu dodržovat stanovená pravidla. Je velmi důležitá při randomizovaných a dlouhodobých studiích, které jsou nutné pro hodnocení vlivu screeningu na úmrtnost.
13
používaných v komerčně dostupných kitech; tyto protilátky mohou mít zkřížené reakce se zvířecím hemoglobinem a mohou být kontaminovány protilátkami proti erytrocytárnímu enzymu [23]. 1.3.3 Hem-porfyrinové testy Hem-porfyrinové testy jsou specifické na dikarboxylové porfyriny, takže detekují nejen nezměněný hem v jakékoliv formě (volný nebo jako hemoprotein), ale také jeho degradační produkty. Metoda jejich detekce (fluorescentní spektrofotometrie) je však pro praxi nevhodná. Jak používat a zacházet s FOB testy Na pravděpodobnost, že FOBT detekuje krev z gastrointestinálního traktu, má vliv anatomická výše krvácení, faktory vztahující se k pacientovi, jako je rychlost střevní pasáže, promíchávání stolice a degradace hemoglobinu ve střevě a charakteristický rys krvácení z gastrointestinálních lézí (např. nepravidelné krvácení) [16]. Vzhledem k posledně jmenovanému faktu je ideální odebrat vzorek alespoň ze tří separátních stolic. Měl by se odebírat z místa, kde je podezření na přítomnost krve nebo z povrchu stolice, kde se krev často nachází [15]. Ovšem viditelnou krev z povrchu stolice nelze testem prokázat, neboť odhalí pouze krev hydrolyzovanou. Ideálně by stolice neměla přijít do kontaktu s vodou v záchodové míse, neboť hemoglobin či hem by se mohl vyluhovat [15]. Protože hemoglobin je ve stolici odbouráván, je zde zřejmé riziko degradace analytů (hemu nebo hemoglobinu) v době, kdy jsou vzorky posílány do ordinace nebo laboratoře. Při pokojové teplotě rychle ztrácí antigenicitu. Tento jev je závislý na teplotě a délce skladování stolice. Tato nestálost hemoglobinu přináší falešně negativní výsledky, zvláště u vzorků, které obsahují malé množství krve. Je důležité, aby byl vzorek dostatečně stabilní během transportu a skladování, proto by měly být dodržovány pokyny výrobce týkající se přípravy vzorků. Obecně je stabilnější tenký nátěr stolice na filtr testovací karty než silná vrstva. Do laboratoře by neměl být posílán celý objem stolice, neboť ve vlhkém prostředí probíhá degradace ještě rychleji. V současné době neexistuje metoda, která by zabraňovala odbourávání hemoglobinu, takže vzorky by měly být testovány co nejdříve nebo by měly být uchovávány zmražené [15]. Relativní poměr pevných a tekutých komponent stolice ovlivňuje složení vzorku a tím konstantní množství stolice pro testování, což může způsobovat falešně pozitivní i falešně negativní výsledky. 14
1.4 Parametry účinnosti screeningových metod Pro posuzování účinnosti screeningových metod se používá několik parametrů, které vycházejí z výsledků příslušných metod: -
senzitivita je pravděpodobnost, že pozitivní test vyjadřuje skutečně pozitivní diagnózu,
-
specificita je pravděpodobnost, že negativní test vyjadřuje opravdu negativní diagnózu,
-
pozitivní prediktivní hodnota je pravděpodobnost, že bude diagnóza přítomna při pozitivním testu,
-
negativní prediktivní hodnota je pravděpodobnost, že diagnóza nebude přítomna při negativním testu, [17]
-
poměr „pre-test“ a „post-test“ je pravděpodobnost přítomnosti kolorektálního karcinomu u pozitivního testu ve srovnání s pravděpodobností, když test proveden nebyl, anebo byl negativní. Jde vlastně o vyjádření senzitivity testu dělené jeho falešně pozitivním podílem. Tato „míra pravděpodobnosti“ souvisí se stupněm senzitivity a specificity příslušného testu [10]. 1.4.1 Diagnostická senzitivita Diagnostická senzitivita je ukazatelem spolehlivosti metody odhalit nemoc, udává
pravděpodobnost, že výsledek testu bude pozitivní, je-li vyšetřovaná osoba nemocná. Je definována jako podíl počtu nemocných s pozitivním testem a celkového počtu testovaných nemocných (správně pozitivní + falešně negativní). Její hodnota se pohybuje od 0 do 1 (0–100 %). Diagnosticky nejcennější testy mají samozřejmě nejvyšší senzitivitu [18]. Senzitivita
je
kritická
pro úspěch screeningového programu,
protože v kombinaci
s compliance subjektů je klíčovým faktorem při detekci lézí, a proto má určující vliv na úmrtnost v rámci programu. Guajakové testy Ranější studie sledující senzitivitu guajakových testů zahrnovaly poměrně malé počty pacientů (částo méně než 70), kteří měli kolorektální karcinom, z nichž mnoho vykazovalo symptomy. Zaznamenané senzitivity Haemoccult testů byly 53–82 %. Později byly k dispozici senzitivnější testy jako je Haemoccult Sensa a Fecatwin Sensitive. Předtím, než se začaly vyrábět, se jako prostředku za účelem zvýšení senzitivity používala rehydratace testovací karty s nátěrem stolice těsně před jejím vyhodnocením. Rehydratace pravděpodobně zvyšuje senzitivitu tím, že usnadňuje interakci jednotlivých komponent reakce a způsobuje hemolýzu. Nevyhnutelným důsledkem rostoucí senzitivity je 15
zhoršování specificity testu. Ve švédské studii se pozitivita u rehydratovaných testů ztrojnásobila, i když u pacientů, kteří dodržovali dietu s omezením syrového tmavého masa rostla jenom z 3,1 % na 5,0 %. U senzitivnějších guajakových testů musí být omezen příjem rostliných peroxidáz a hemu v potravě, aby byla zachována specificita na přijatelné úrovni [15]. Snaha provádět FOBT při různých dietních omezeních jej předem odsuzuje k nezdaru. Tak se došlo k závěru, že nevýhody rehydratace převažují nad výhodami. To preferuje nerehydratovaný Haemoccult II test před jeho rehydratovanou variantou a Haemoccultem II Sensa [19]. Obecně je senzitivita pro Haemoccult II 50–75 % a pro rehydratovaný Haemoccult II vyšší než 90 % [15]. Imunochemické testy Když byly vyhodnocovány imunochemické testy u pacientů, kteří měli kolorektální karcinom, z nichž mnoho vykazovalo symptomy, pak citlivost byla často mezi 80–97 %, což svědčí o výhodě oproti guajakovým testům. Neexistují žádné studie, srovnatelné s těmi pro Haemoccult, kde by se používaly imunochemické testy v rozsáhlých screeningových programech s 2–4letým následným sledováním ke zjištění karcinomů diagnostického okénka. Předběžná senzitivita pro FHH test, hodnotící více než 6 200 subjektů, byla 82,8 %. Senzitivita na adenomy Guajakové testy jsou podstatně méně citlivé na adenomy než na karcinomy a pro zjišťování malých adenomatózních polypů (< 1 cm) jsou nevyhovující. Ve studiích s radiochromem bylo dokázáno, že adenomy, zvláště velké, krvácejí. Nadto bylo zjištěno, že adenomy odhalené screeningovými programy jsou často větší než 1 cm, zatímco ty, které byly nalezeny při rutinní kolonoskopii nebo během pitvy jsou zpravidla menší než 1 cm. Je zřejmé, že guajakové testy přispívají k detekci velkých adenomů. Imunochemické testy jsou citlivější pro diagnostiku adenomů než Haemoccult. Imunochemický test HemeSelect byl pozitivní u 75 % pacientů s velkými (> 1 cm) adenomy, v porovnání s 42% pozitivním nálezem při použití Haemoccultu. FHH, test radiální imunodifúze, byl pozitivní u 15 z 29 pacientů s adenomy, zatímco Haemoccult byl pozitivní v jednom případě. Haemoccult Sensa detekuje více adenomů než Haemoccult a HemeSelect, ale to může být především způsobeno vysokým počtem kolonoskopií u testu Haemoccult Sensa.
16
Bereme-li v úvahu, že zvrhnutí adenomu v karcinom je – jak se zdá – pomalé, u 90 % adenomů nedojde k malignímu zvrhutí po dobu života pacienta, a proto malé, tubulární, rektální adenomy představují menší riziko než jiné typy kolorektálních karcinomů, relativní necitlivost FOB testů detekovat malé adenomy může být výhodou screeningového programu, jsou-li testy opakovány v pravidelných (např. ročních) intervalech. Místo neoplazie a senzitivita Při průchodu tlustým střevem hem pomalu ztrácí svou peroxidázovou aktivitu a hemoglobin svou imunoreaktivitu. Což, jak se zdá, způsobuje sníženou citlivost FOB testů na proximální léze. Až dosud se věnovalo praktickému významu tohoto problému málo studií. U pacientů s příznaky kolorektálního karcinomu nebyly ani guajakové, ani imunochemické testy méně citlivé na proximálně uložené karcinomy v porovnání s distálně uloženými. Účinek degradace při průchodu střevem je vyvážen faktem, že proximální nádory krvácejí mnohem intenzivněji než distální. Nicméně u lézí, které krvácejí stejným množstvím, je zkoušení obou typů FOB testů pravděpodobně méně citlivé u proximálních než u distálních lézí [15]. 1.4.2 Diagnostická specificita Diagnostická specificita je měřítkem spolehlivosti metody vyloučit přítomnost nemoci, vyjadřuje pravděpodobnost negativního výsledku u zdravé osoby. Je definována jako podíl počtu zdravých osob s negativním testem a celkového počtu testovaných zdravých jedinců (správně negativní + falešně pozitivní). Její hodnota se opět pohybuje v rozmezí 0–1 (tj. 0–100 %) a i zde je žádoucí, aby metoda měla co nejvyšší specificitu [18]. Pro dosažení přesného změření specificity (s tolerancí ± 1 %) je nutné podrobit stovky normálních jedinců kolonoskopickému vyšetření. Taková studie dosud nebyla provedena. Proto lze hrubě odhadnout specificitu poté, co se vyloučí ti, u nichž byla diagnostikována neoplazie, za předpokladu, že jedinci s negativními testy jsou zdraví. Odhady budou ještě přesnější, pokud jsou lidé s negativními výsledky vyšetřeni znovu alespoň za 2 roky, aby se vyloučili ti, jejichž karcinom nebyl zachycen. Procento pozitivity (sestávající ze správně a falešně pozitivních) je závažným rozhodujícím činitelem vstupních nákladů, protože z něj vychází počet následných nezbytných diagnostických vyšetření. K jejich provedení musí být adekvátní zdroje.
17
Jaké jsou tedy příčiny falešně pozitivních výsledků Příčiny falešně pozitivních výsledků jsou povahy analytické, biologické, patologické nebo bihaviorální. Mezi analytické příčiny patří případy, kdy subjekt provádí test nesprávnou technikou (např. silný nátěr na kartu testu Haemoccult) a chybné vyhodnocení testu. Vizuální interpretace konečného výsledku testu je závislá na subjektivním posouzení pozorovatele. Faktem je, že instruktáž laboranta zvyšuje jeho spolehlivost. Podstatný problém guajakových testů, jako je Haemoccult II, je nestálá modrá barva indikující pozitivní výsledek. Haemoccult Sensa používá vývojku, která zvyšuje stabilitu barvy, což redukuje na minimum problém čitelnosti Haemoccultu II. Latex aglutinační testy, musí být vyhodnocovány v rámci určitého časového období, pozdější vyhodnocování může vést v pozdní aglutinaci, jejíž důsledkem je pozitivní výsledek. Biologická odchylka od normální fyziologické ztráty krve u náhodného subjektu, která je mimo normální rozsah hodnot a tím nad prahovým limitem detekce, je další potenciální příčinou, která by mohla ovlivnit FOB testy, jejichž analytická senzitivita je nastavena blíže hornímu limitu normálního rozsahu hodnot, při pokusu zvýšit jejich senzitivitu na patologické léze (viz graf 2). Patologické příčiny zahrnují začínající patologie, které krvácejí, např. hemoroidy. Do bihaviorálních příčin spadá tlačení na stolici, provozování náročných sportů, které způsobují krvácení a špatná compliance dietních a lékových omezení (pro guajakové a hemporfyrinové testy), která začíná být nejčastější příčinou falešně pozitivních výsledků; viz kapitola 1.7. Řešení problému falešně pozitivních výsledků, zvláště používá-li se guajakový test s nízkou specificitou jako je rehydratovaný Haemoccult, je dvoukrokový přístup, kde pacienti s pozitivním guajakovým testem podstoupili potvrzení imunochemickým testem. To uspoří náklady na imunochemické testy a předejde potřebě následné diety. Byla navrhována kombinace FECA-EIA a Fecatwin-Sensitive a za plně hodnotnou se pokládá kombinace Haemoccult Sensa a Heme-Select. Výsledky screeningů Publikované výsledky screeningů nerehydratovaným testem Haemoccult II mají pozitivitu většinou v rozmezí 1–3 % u těch studií, kde compliance pacientů přesáhla 50 %. Připomeňme si, že největší studie, v Dánsku a UK, měly senzitivitu 50–70 % a specificitu 98 % nebo vyšší; tyto jsou příkladem FOB screeningu s testy s vysokou specificitou. 18
Používání rehydratovaného testu Haemoccult opakovaně po dobu 13 let trvání Minnesotské studie vedlo ke kolonoskopickému vyšetření u 39 % subjektů. Specificita byla stanovena na 90,4 % pro rehydratovaný test (používán ve většině případů) a 97,7 % pro standardně používaný Haemoccult. Ačkoli hydratace zvyšuje senzitivitu (z 80,8 % na 92,2 %), děje se tak očividně na úkor specificity. Minnesotská studie je příkladem FOB screeningu s testem s nízkou specificitou. Přímá srovnávání pozitivit mezi senzitivnějším testem Haemoccult Sensa a testem Haemoccult II ukazují hodnoty 4,2 % versus 3,3 % u populace, která dodržovala dietu. Pozitivity imunochemických testů ve screeningových studiích nejsou tak dobře prozkoumány jako pro Haemoccult. Studie užívající širokou škálu obchodních značek a technologií obecně přinášejí výsledky v rozmezí 2,0 %–4,9 %. Některé jsou zmíněny v tabulce E. Tyto výsledky dopadly dobře ve srovnání s Haemoccultem II. U australské populace, která dodržela dietu 3 dny před testováním a s využitím školeného personálu pro vyhodnocování testů, byl hrubý odhad specificity testu Haemoccult Sensa 96,1 % ve srovnání s 97,8 % testu HemeSelect. Specificita testu HemoQuant je uváděna 96 % a 94,7 % (při koncentraci 2 mg · g-1) [15]. 1.5 Z historie populačního screeningu 1.5.1 Česká republika V ČR má screening kolorektálního karcinomu již dvacetiletou tradici. V letech 1979–1984 se uskutečnilo 6 pilotních studií. Hlavní poznatky a zkušenosti s depistáží kolorektálního karcinomu přinesl multicentrický screening probíhající v letech 1985–1991 ve všech krajích a analýza nákladů a užitku tohoto programu. Program realizovalo více než 100 praktických lékařů ve spolupráci s gastroenterology a klinickými onkology. Věk probandů byl omezen na 45–60 let. Screening probíhal multicentricky s jedním referenčním centrem a byl preferován systém závodní zdravotní péče (95 % probandů byli zaměstnanci různých továren, úřadů a institucí). Test okultního krvácení ve stolici byl proveden s použitím tří psaníček Haemoccult testu (HT), která nebyla před provedením detekční reakce zvlhčována. Z celkového počtu 90 763 vrácených psaníček bylo zjištěno 2 659 (2,9 %) pozitivních testů, z toho bylo 13,1 % osob s karcinomem a 28,7 % osob s polypy. Incidence 3,8 karcinomů a 8,4 adenomů na 1 000 HT je vyšší než v jiných studiích obdobného rozsahu a dokládá vysoký výskyt kolorektálních nádorů v české populaci.
19
Na tento screening navázal tzv. „Pražský projekt” v letech 1997–1998. Účastnilo se jej 61 soukromých praktických lékařů. Ti nabídli screening HT pojištěncům Všeobecné zdravotní pojišťovny starším 45 let. Osoby, které souhlasily se screeningem, obdržely HT se třemi psaníčky a informační brožuru pro probandy. Detekční reakci prováděli praktičtí lékaři podle návodu a předchozích instruktáží. Probandi s pozitivním výsledkem HT byli odesláni ke kolonoskopii na jedno ze čtyř gastroenterologických pracovišť. V souboru 11 265 probandů (4 415 mužů a 6 850 žen), kteří použili a vrátili HT, byla pozitivita zjištěna u 442 (3,9 %) osob, z nichž bylo 199 (4,5 %) mužů a 243 (3,5 %) žen. Rozdíl pozitivity mezi oběma pohlavími je statisticky významný (p < 0,01). Pozitivita stoupá od 2,8 % na 5,3 % a 5,0 % ve věkových skupinách 45–49 roků, 70–74 a 75–79 roků [12]. Mimoto vznikl následující depistážní program, který je uskutečňován od roku 1993 mezi pojištěnci Zdravotní pojišťovny Škoda. Pro depistáž byla zvolena věková skupina od 40 do 60 let a na programu se podílelo 53 praktických lékařů. Celkem bylo předáno 10 660 Haemoccultových „psaníček“, zpětně pak bylo převzato 6 911. Návratnost tedy činila 65,2 %; z toho bylo Haemoccult pozitivních 144 pojištěnců, což je 2,1 %. Totální kolonoskopie byla provedena u 140 pojištěnců. Pozitivní nález byl zjištěn u 35 nemocných, z toho 10krát šlo o karcinom, v ostatních případech o adenom, který byl odstraněn endoskopickou cestou [20]. 1.5.2 Evropa, USA a Japonsko Úvod V průmyslových
zemích
potýkajících
se
s vysokou
incidencí
a
prevalencí
kolorektálního karcinomu zákonitě vyvstala otázka: „Má význam použít FOBT pro populační screening karcinomu tlustého střeva?“ K tomu bylo ovšem nutné provést rozsáhlé a dlouhodobé studie, zahrnující desetitisíce lidí. Tyto projekty začaly v sedmdesátých a osmdesátých letech, kdy bylo do screeningu zahrnuto celkem asi 450 000 lidí [19]. Největší populační screening kolorektálního karcinomu v Evropě se konal pomocí testování na okultní krev v Německu, Francii, Dánsku, Švédsku a Anglii (mimo Německo jde o randomizované studie). Ve Švédsku byly srovnávány výsledky s rehydratovaným testem, které se liší senzitivitou a specificitou; mimo švédskou studii používali ostatní jen nerehydratovaný test, který má větší specificitu. Compliance byla maximálně 70 %, většinou 50–60 %. Výsledky potvrzují vhodnost metody pro celopopulační screening s hlavním efektem detekce tumoru v časném stadiu a předpokladem snížení vzniku kolorektálního karcinomu endoskopickou polypektomií. Definitivní hodnocení vyžaduje dlouhodobé, 20
rozsáhlé prospektivní studie. Problémy zahrnují compliance a docílení určité rovnováhy mezi senzitivitou a specificitou testu. Některé předběžné zkušenosti naznačují vhodnost kombinace testování na okultní rektální krev (ročně) a flexibilní sigmoidoskopii (v pětiletých intervalech). Německo Testování na okultní krev ve stolici bylo v Německu zavedeno již v roce 1977 jako součást národního screeningového programu v rámci statutárního systému národního pojištění. Test je nabízen všem mužům a ženám od 45 let. Od roku 1979–1985 bylo v této „case control“ studii u 2 790 osob nalezen kolorektální karcinom, u 522 případů byl kolorektální karcinom uveden jako příčina úmrtí. Compliance byla nízká, 15 % u mužů a 25 % u žen; u žen došlo ke snížení úmrtnosti o 60 %. Podle uvedených výsledků lze předpokládat 2–3 kolorektální karcinomy a 5–8 polypů na 1 000 vyšetřených [21]. V SRN jsou pro tento účel schváleny preparáty Hemofec, Hemocare a Haemoccult. Posledně jmenovaný dosáhl největší rozšíření a byl uznán za referenční test v tom smyslu, že jiné preparáty nemají vykazovat významně vyšší pozitivitu, neboť se na ní převážně podílejí falešně pozitivní nálezy [3]. Francie (Burgundská studie) Studie zahrnuje 45 495 osob ve věku 45–74 let v prvním a 43 371 osob ve druhém screeningu. První kolo screenigu se uskutečnilo od ledna do července roku 1988 a 1989. Druhé bylo zahájeno v lednu 1990. Screening se prováděl nerehydratovaným guajakovým testem (Haemoccult). Compliance byla 54 % v prvním a 55,5 % ve druhém screeningovém období. Dosavadní výsledky ukázaly 1,6 případů kolorektálního karcinomu na 1 000 účastníků. Švédsko (Goethenburská studie) V roce 1982 bylo pozváno k účasti na screeningu 27 700 obyvatel Goeteborgu od 60–64 let. O pět let později 23 822 obyvatel stejného věkového rozmezí. Účastníci byli randomizovaným způsobem rozděleni na skupinu testovanou a kontrolní. Následoval rescreening, u první skupiny o 16–22 měsíců později, u druhé 14–17 měsíců později. Účastníci byli požádáni, aby dodržovali dietní omezení dva dny před provedením testu. Testovaná skupina prvního turnusu byla rozdělena na dvě podskupiny – bez rehydratace a s rehydratací testu. Pozitivita u nerehydratovaných testů byla 1,9 % a rehydratovaných 21
5,8 %. Díky velkému počtu falešně negativních výsledků u skupiny bez rehydratace se při rescreeningu používaly jen rehydratované testy (Haemoccult). Test byl pak pozitivní u téměř 6 % testovaných osob. Compliance byla 65 % v prvním a 60 % ve druhém turnusu. Při iniciálním screeningu bylo zjištěno 0,9 kolorektálních karcinomů na 1 000 u nerehydratovaných a 2,7 na 1 000 u rehydratovaných testů. Při rescreeningu bylo diagnostikováno 1,7 kolorektálních karcinomů na 1 000 vyšetřovaných osob. Vzhledem k tomu, že téměř 6% pozitivita je pokládána za příliš vysokou pro nutnost dalšího náročného vyšetření, bylo u účastníků s pozitivním testem provedeno další vyšetření, tentokrát se 6 Haemoccultovými testy: pozitivita klesla z 5,9 % na 1,9 %, specificita se zvýšila z 95 % na 98 %, to znamená o 65 % snížení počtu osob u nichž by bylo nutné další vyšetření a sledování. Dánsko (Funenská studie) V roce 1985 bylo ve Funen 30 970 osob ve věku od 45–74 let randomizovaným způsobem testováno Haemoccultem a dalších 30 968 tvořilo kontrolní skupinu. Rescreening se prováděl každé dva roky. Haemoccult nebyl rehydratován, dietní omezení nebylo vyžadováno. Compliance s iniciálním screeningem byla 67 % a s rescreeningem 93 %. Pozitivita byla 1,1 % iniciálně a 0,9 % při rescreeningu. Celková incidence se v testované skupině signifikantně nelišila od kontrolní; teprve další
dlouhodobé
polypektomické
odstraňování
adenomů
povede
pravděpodobně
k definitivnímu snížení incidence kolorektálního karcinomu. Anglie (Nottinghamská studie) Shromažďování účastníků probíhalo v Nottinghamu od roku 1981 do roku 1991, s rozdělením na testovanou a kontrolní skupinu. Po iniciálním screeningu následoval dvakrát rescreening ve dvouletých intervalech. Věkové rozmezí bylo 50–74 let. Haemoccult test se prováděl bez rehydratace, dietní omezení nebylo požadováno. Od roku 1985 byli pacienti s pozitivním testem žádáni, aby test zopakovali během 6 dnů, kdy neměli jíst tmavé maso ani zeleninu s obsahem peroxidázy. Osoby, u nichž byl test pozitivní podruhé, byly kompletně vyšetřovány, zatímco ty s negativním výsledkem byly pozvány k opakování testu – opět po dodržení dietních omezení – za 3 měsíce. V případě pozitivního testu byly kompletně vyšetřovány, zatímco ty s negativním výsledkem nebyly dále sledovány, ale pozvány na rescreening až za dva roky.
22
Compliance v průběhu turnusu byla 50–70 %. Počet pozitivních iniciálních testů byl 2 %, při rescreeningu mezi 1 % až 1,5 %. Tabulka 2 ukazuje počet účastníků v jednotlivých turnusech a počty nalezených kolorektálních karcinomů a adenomů (zvlášť adenomů menších než 1 cm) na 1 000 osob. účastníci
počet
kolorektální karcinom
adenom menší než 1 cm
adenomy celkem
1. turnus
40 797
2,2
7,8
11,3
2. turnus
31 945
1,7
3,9
6,4
3. turnus
29 383
1,3
3,1
4,9
4. turnus
22 114
2,3
3,4
5,3
5. turnus
10 304
1,6
4,2
8,2
dodatečně*
7 787
4,5
8,5
11,0
Tab. 2 Výsledky populačního screeningu Nottinghamské studie (5 turnusů) *Účastníci, kteří původně odmítli, ale pak se zúčastnili pozdějších turnusů. Převzato z: Jablonská, M. Kolorektální karcinom – časná diagnóza a prevence. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2000. Kapitola 8.3, Populační screening – zkušenosti evropské, s. 371.
Hrubý odhad senzitivity pro nerehydratovaný test je přibližně 58,6 % (podle vzorce správně pozitivní děleno součtem správně pozitivní a falešně negativní). To je srovnatelné s 46 % ve švédské studii a 55,5 % v dánské studii. Během skladování dochází k dehydrataci FOB testu, což snižuje jeho senzitivitu. Díky tomu byla ve švédské studii prováděna rehydratace testu před jeho vyhodnocením. Rehydratace ale nebyla prováděna v Nottinghamské studii. Publikované výsledky z obou těchto studií byly použity ke stanovení efektivnosti nákladů rehydratace. Bylo zjištěno, že vyšší senzitivita způsobená rehydratací je provázena snížením specificity. I přesto, že je tímto způsobem diagnostikováno více karcinomů, zdá se, že rehydratace zdvojnásobuje náklady na screening jedné osoby a o 50 % zvyšuje náklady na detekci jednoho karcinomu [21, 22]. Severní Amerika (Minnesotská studie) Screeningové studie v USA (Minnesota) prokázaly během třináctiletého screeningu s ročním testováním na okultní krev (rehydratovaným testem) zřetelné snížení incidence a úmrtnosti na kolorektální karcinom. Pět velkých randomizovaných studií ukázalo, že karcinom objevený screeningem je v časnějším stadiu než karcinom pacientů, kteří se screeningu neúčastnili.
23
Ve
studii
z Minnesoty
bylo
více
než
46 000
asymptomatických
osob.
Randomizovaným způsobem byli rozděleni do tří skupin, z nichž jedna byla testována na okultní krev ročně, druhá po dvou letech a třetí byla ponechána bez screeningu. Klíčovým cílem bylo hodnocení vlivu na úmrtnost v průběhu 13 let. Byl používán rehydratovaný guajakový test s následnou kolonoskopií u pozitivních případů, která se uskutečnila u 81 % pozitivních nálezů. Compliance byla 75–78 % pro obě skupiny ve screeningu. Rehydratované testy zvýšily počet pozitivních výsledků více než čtyřikrát, z 2,4 % na 9,8 %. Senzitivita testu pro kolorektální karcinom byla 92,2 % pro rehydratovaný test a 80,8 % u nerehydratovaného. Zvýšená senzitivita vlivem rehydratace je na úkor specificity testu (snížení z 97,7 % na 90,4 %), což vede k většímu počtu falešně pozitivních výsledků a nutnosti většího počtu kolonoskopií, které značně zvyšují náklady. Specificita má vliv na pozitivní
prediktivní
hodnotu,
která
byla
u
rehydratovaného
testu
2,2 %
a
u
nerehydratovaného 5,6 %. Screening umožnil detekci většího počtu karcinomů časnějšího stadia s výrazným snížením typu D (dle Dukesovy klasifikace3) ve skupině s ročním screeningem. V této skupině byla úmrtnost o 33 % nižší než ve skupině bez screeningu. Snížení však nebylo signifikantní ve skupině s testováním každé dva roky; snad vlivem mimořádně vysoké incidence v časném období studie. Rostoucí procento pozitivních výsledků v průběhu trvání studie mělo přímý vliv na zvýšení nákladů screeningu. Ve studii byla během třinácti let provedena kolonoskopie ve skupině s ročním rescreeningem u 38 % účastníků. Na základě důkladných kolonoskopických screeningových studií prováděných v USA bylo zjištěno, že 30 % subjektů, kteří se zúčastnili screeningu, má asymptomatické polypy. Proto příznivý vliv tohoto screeningu byl některými autory částečně připisován spíš velkému počtu kolonoskopií, než samotnému screeningu. V souhrnu, minnesotská studie uvádí, že časná detekce při užití ročního screeningu s rehydratací testu snižuje mortalitu. Připouští, že to také může být způsobeno vyšším počtem provedených kolonoskopií. Účinnost může být závislá na opakování screeningu. Aby se zvýšila senzitivita, je lepší opakovat screening jednou ročně než jednou za dva roky. Zvýšení senzitivity lze také dosáhnout rehydratací, ovšem na úkor specificity.
3
Dukesova klasifikace A: tumor neprorůstá muscularis propria B: tumor prorůstá muscularis propria C: postižení regionálních lymfatických uzlin D: vzdálené metastázy (doplněno Turnbullem, et al., v roce 1967)
24
Kombinace testování na okultní krev a flexibilní sigmoidoskopie ukazuje podle simulačního modelu pro 100 000 osob ještě výraznější snížení úmrtnosti a incidence. Pro úspěch populačního screeningu je velmi důležitý stupeň compliance, kterou lze podle amerických zkušeností zlepšit kontaktem zdravotníků s účastníky screeningu. Kolonoskopie, nejpřesnější metoda detekce kolorektálních karcinomů a premaligních stavů se dosud v rámci screeningu používala jen málo, uvažuje se však o jejím uplatnění v rámci screeningu u asymptomatických osob s průměrným rizikem ve věku nad 50 let anebo i jednorázově během šesté dekády. Současně probíhající screeningové studie jsou zaměřeny zejména na flexibilní sigmoidoskopii s testováním na okultní krev, která prokázala slibné výsledky. Otázka screeningu kolorektálního karcinomu v USA není tedy bez problémů přes dosažené příznivé výsledky. Lze očekávat, že zlepšení testu na okultní krev a zlepšení compliance výrazně přispějí k jejich řešení [23, 24]. Japonsko Japonsko patří k zemím, v nichž se incidence kolorektálního karcinomu významně zvýšila. K největšímu nárůstu, téměř dvojnásobnému, došlo v letech 1975–1984; u mužů z 8,26 na 15,49 na 100 000 obyvatel a u žen z 7,32 na 10,82 na 100 000 obyvatel. V letech 1965–1985 se mortalita bezmála ztrojnásobila. Tento fakt vedl vládní instituce k přípravě populačního screeningu. V roce 1981 doporučila japonská gastroenterologická společnost pro screening v populačním rozsahu guajakový test a v roce 1990 imunochemické testování na okultní krev ve stolici. V roce 1992 začal populační screening dvoudenním imunochemickým testem pro fekální krev. Tento typ testu se v Japonsku provádí dosud. Zájem japonských autorů o imunochemické testy se zakládá na snaze zlepšit bilanci mezi senzitivitou a specificitou, která není zcela vyhovující u guajakových testů. V roce 1983 vyvinuli japonští autoři imunochemický hemaglutininový test s vysoce purifikovanou protilátkou s názvem Hem-Sp. Výsledky studie s 239 pacienty, která jej srovnávala s Haemoccult testem ukázaly, že Hem-Sp byl pozitivní ve 12 případech (5 %) a diagnostikoval dva pacienty s kolorektálním karcinomem (Dukes A a C). Naproti tomu Haemoccult byl pozitivní v 17 případech (7 %) a diagnostikoval pouze jednoho pacienta (Dukes C).
25
Výzkumná komise Ministerstva zdravotnictví a sociální péče provedla srovnávací studii komerčních kazet FOB testů a podrobila ji ROC analýze4. Ta ukázala výhodu imunochemických testů ve srovnání s guajakovými z hlediska senzitivity a specificity a dále, že nejvyšší senzitivitu má právě dvoudenní imunochemický test. První screeningový projekt s imunochemickým FOB testem v letech 1983–1984, ještě s jednodenním screeningem (1 712 účastníků od 40 let), měl ve srovnání s Haemoccultem větší senzitivitu a specificitu. Obdobná screeningová studie v roce 1985 (1 260 účastníků) byla navíc kombinovaná se screeningem rektoskopickým; výsledky (při poměrně malém počtu nalezených karcinomů) naznačují, že testy na okultní krev mají relativně nízkou senzitivitu pro malé karcinomy [23, 25]. V další
studii
populačního
rozsahu
se
ukázala
i
ekonomická
vhodnost
imunochemického testu ve srovnání s guajakovým, jednodenní imunochemický test byl levnější než třídenní test s Haemoccultem [26]. Po uvedených zkušenostech byla screeningová imunochemická metoda v roce 1992 přijata do programu veřejného zdravotnictví, když se v roce 1991 z kooperativní studie typu „case control“ usoudilo, že uvedenou metodou by populační screening mohl snížit úmrtnost na kolorektální karcinom o 70 %. Doporučený
screeningový
program
se
skládá
z
dvoudenního
testování
imunochemickým testem. Vzorky stolice musí být po odběru uchovávány za nízké teploty nebo zmražené až do doby testování. Následné vyšetření v pozitivních případech je pak totální kolonoskopie (anebo sigmoidoskopie s irigografií). Screeningu se zúčastnilo 2,5 milinou osob od 40 let; Japonskou gastroenterologickou společností byly získány výsledky od 1,1 milionů účastníků. Z 76 323 (7,1 %) účastníků s pozitivním výsledkem bylo vyšetřeno 53 536 a u 2 017 byl zjištěn kolorektální karcinom včetně 1 139 (56 %) karcinomů limitovaných na sliznici nebo podslizniční vrstvu. Operováno bylo 55 % případů, u 45 % byla provedena endoskopická polypektomie [23, 25].
4
ROC křivka vyjadřuje vztah správné pozitivity a falešné negativiry u jednotlivých diagnostických metod. Umožňuje nám posouzení meze, kdy lze hodnotu výsledku považovat za pozitivní a negativní.
26
1.6 Jaká je účinnost FOB testů Účinnost FOBT je vyhodnocována randomizovanými prospektivními studiemi a „case control“ studiemi. Vyhodnocením účinku screeningu na úmrtnost na kolorektální karcinom se zabývalo pět studií, které používaly test Haemoccult. Jedna studie byla provedena na dobrovolnících (Minnesotská studie), zatímco zbývající čtyři byly populační. Čtyři studie byly randomizované (Minnesotská, Funenská, Nottinghamská a Goethenburská). Minnesotská studie uvádí snížení kolorektální mortality o 33 %, používá-li se rehydratovaný test jednou ročně. Při screeningu prováděném každé dva roky je to u Minnesotské studie 21 %, Funnenské studie 18 %, Nottinghamské studie 15 % a u Burgundské studie 14 %. Snížení bylo dosaženo hlavně díky zjištění nádoru v rané fázi. Poslední metaanalýza randomizovaných studií s Haemoccult testem ukázala 16% snížení úmrtnosti na kolorektální karcinom. Autoři Minnesotské studie soudí, že používání FOBT, ať už v ročním nebo dvouletém intervalu, také signifikantně snižuje incidenci kolorektálního karcinomu [9]. Schopnost FOBT snižovat úmrtnost na kolorektální karcinom bude, kromě senzitivity a specificity, vždy omezena ochotou obyvatel ke spolupráci při poněkud nepříjemném vyšetření a také tím, že test není prevencí rakoviny, pouze jejím indikátorem. FOBT musí být prováděn jednou za jeden až dva roky, aby byl efektivní. To je další faktor určující compliance populace ke screeningu. Snaha provádět FOBT při různých dietních omezeních jej předem odsuzuje k nezdaru. To preferuje nerehydratovaný Haemoccult II test před jeho rehydratovanou variantou a Haemoccultem II Sensa [19]. Třebaže se z výsledků zkoumání, které uvádějí, že senzitivita a specificita imunochemických testů je vyšší než pro Haemoccult, očekávala vyšší účinnost imunochemického testu, neexistuje studie ke zhodnocení účinnosti screeningového programu na kolorektální karcinom výlučně imunochemickým testem [27]. Jednou z možných metod k vyhodnocení účinnosti screeningu je retrospektivní studie (case control) v oblastech, kde již byl screening uskutečněn. Anamnéza subjektů, kteří zemřeli na kolorektální karcinom je porovnávána s anamnézou subjektů z kontrolní skupiny. Bylo provedeno šest case-control studií, aby se odhadla účinnost screeningu FOBT se zřetelem na kolorektální karcinom. V pěti studiích se jednalo o Haemoccult test, v jedné o imunochemický test. Třebaže byly zaznamenány určité nesrovnalosti, studie svědčí o 30–40% 27
teoretickém snížení mortality na kolorektální karcinom u účastníků screeningového testu. Je třeba podotknout, že výsledky jsou nezávislé na compliance, neboli jsou platné pouze tehdy, je-li compliance 100% [9]. Konkrétně ve studii s imunochemickým testem, která probíhala v Japonsku, se jednalo o snížení úmrtnosti na kolorektální karcinom o 60 %. Oproti studiím s Haemoccultem šlo o dvojnásobnou hodnotu. Autoři nacházejí vysvětlení v lepší citlivosti imunochemického hemaglutinačního testu [27]. Srovnávací studie FOB testů k posouzení senzitivity a specificity Přímá porovnání různých typů FOB testů byla prováděna převážně na pacientech, kteří měli neoplazii a zahrnovala srovnání tří nebo čtyř testů. Pouze jedna studie přímo srovnávala tři různé typy testů: guajakové, imunochemické a hem-porfyrinové. Každý pacient připravil vzorky pro jednotlivé testy podle pokynů výrobce a výsledky jsou zapsány v tabulce 3. Citlivosti testů HemoQuant a Haemoccult II byly přibližně na stejné úrovni a mírně se zlepšovaly při použití citlivějšího a čitelnějšího testu Haemoccult Sensa. Nejvyšší citlivosti na karcinomy nebo adenomy bylo dosaženo pomocí testu HemeSelect (hemaglutinační imunochemický test). Počet pacientů
Haemoccult
Haemoccult Sensa
HemeSelect
HemoQuant*
Karcinom
107
95 (89)
100 (93)
104 (97)
76 (71)
Adenom ≥ 1 cm
45
19 (42)
27 (60)
34 (76)
19 (42)
Adenom ≤ 1 cm
36
6 (17)
9 (25)
13 (36)
11 (31)
Léze
Tab. 3 Porovnání senzitivit tří typů FOB testů na kolorektální karcinom Hodnoty v závorkách jsou procenta * Pozitivita při koncentraci větší než 2 mg · g-1 Převzato z: Young, GP., Macrae, FA., St John, DJB. Clinical Methods for Early Detection: Basis, Use and Evaluation. In Young, GP., Rozen, P., Levin, B. Prevention and Early Detection of Colorectal Cancer. London: W. B. Saunders Company, 1996, p. 255.
Několik studií srovnávalo dvě ze tří existujících metod testů. Haemoccult byl přímo srovnáván s hem-porfyrinovým testem HemoQuant u pacientů, kteří zároveň podstoupili plánovanou kolonoskopii, a v obou případech byla zjištěna nízká citlivost na nové karcinomy (33 % a 28 %). Odběr vzorků pro testování Haemoccultem byl opožděn a nastala ztráta
28
aktivity enzymu peroxidázy. V jiné studii s pacienty s diagnostikovaným karcinomem byl Haemoccult II citlivější (89,5 %) než HemoQuant (74,2 % při koncentraci 2 mg · g-1). Guajakové a imunochemické metody byly srovnávány pouze v několika studiích s odlišnými výsledky. Test založený na latexové aglutinaci, Hemolex, neuspěl, protože při jeho použití se nepodařilo dosáhnout citlivosti jako u tří guajakových testů (Haemoccult, Hemopreuve a Hemofec), ale naopak se u něj prokázala daleko lepší specificita v případech, kdy pacienti nedodrželi příslušnou dietu, nezbytnou pro guajakové testy [15]. Naopak v České republice autoři Ferkl, Kocna a Frič [28] při srovnání testů Hemolex a Haemoccult zjistili vyšší senzitivitu Hemolexu (48,6 %) oproti Haemoccultu (17,1 %), přičemž rozdíl je statisticky významný na 1% hladině významnosti při hodnocení chí-kvadrát testem. Specificita je nevýznamně nižší u Hemolexu (90 %) oproti Haemoccultu (100 %). U 50 pacientů s karcinomem byl HemeSelect (94 %) senzitivnější než Haemoccult (58 %) [15]. V jiné studii HemeSelect zjistil devět karcinomů z devíti, v porovnání s výsledkem jeden z devíti zjištěný Haemoccultem u téměř 1 500 účastníků screeningu [29]. Vyšší citlivost testu HemeSelect (49,3 %) oproti Haemoccultu (16 %) potvrzuje i práce českých autorů [30]. Specificita však byla u testu HemeSelect výrazněji nižší (72,4 %) než u Haemoccultu (100 %). U 40 pacientů s karcinomem byla nepatrně senzitivnější imunochemická imunodifúzní metoda (79,2 %) než Haemoccult (71,8 %) [15]. Tabulka 4 znázorňuje několik případů, při kterých byly porovnávány imunochemické testy s Haemoccultem v rámci rozsáhlých screeningových studií (> 5 000 subjektů). Ve všech případech imunochemické testy zjistily více karcinomů, což znamená lepší citlivost těchto testů. Menší screeningové studie přinesly různé výsledky; v jedné studii, do níž bylo zařazeno přes 3 200 subjektů, bylo zjištěno jen pět karcinomů, a ukázalo se, že imunochemický test FECA-EIA je citlivější než Haemoccult [15]. Bilance informací ukazuje, že imunochemické testy, zvláště HemeSelect/Immudia Hem-Sp (stejný test vyjma testovací karty), jsou citlivější než Haemoccult [15]. Autoři Iwase [26] a St. John et al. [31] v porovnání s testem Haemoccult vyhodnotili imunochemický test senzitivnější i specifičtější. Výše uvedené studie byly publikovány v letech 1992 až 1994. Pozdější práce uvádějí následující výsledky. Allison et al. [32] prospektivně hodnotili senzitivitu, specificitu a prediktivní
hodnotu
guajakových
testů
Haemoccult
II,
Haemoccult
II
Sensa,
imunochemického testu HemeSelect a kombinaci Haemoccult II Sensa a HemeSelect ve screeningovém programu u osob starších 50 let se středním rizikem onemocnění 29
kolorektálním karcinomem. Výsledky říkají, že senzitivita Haemoccult II byla v porovnání s ostatními testy nejnižší, a sice o polovinu menší; spolu s kombinovaným testem měl ale nejvyšší specificitu. Haemoccult II Sensa měl největší citlivost pro detekci nádorů, nejnižší specificitu. Specificita HemeSelect byla střední. Pozitivní prediktivní hodnota byla nejnižší u Haemoccult II Sensa a nejvyšší u kombinovaného testu. Autoři se domnívají, že flexibilní sigmoidoskopie a kombinovaný test jsou pravděpodobně schopny detekovat většinu kolorektálních neoplazií u populace se středním rizikem na kolorektální karcinom. Reference Frommer (radiální imunodifuze) Počet pacientů Počet pozitivních testů Počet zjištěných karcinomů
Imunochemický test 13 675 1 027 (7.5) 77 (0.6)
Haemoccult 6 903 138 (2.0) 11 (0.2)
Weller et al. (FHH) Počet pacientů Počet pozitivních testů Počet zjištěných karcinomů
6 208 311 (5.0)
— —
24 (0.4)
—
Petrelli et al. (HemeSelect) Počet pacientů Počet pozitivních testů Počet zjištěných karcinomů
8 933 438 (4.9)
Fujita (Immudia-HemSp) Počet pacientů Počet pozitivních testů Počet zjištěných karcinomů
15 488 496 (3.2) 30 (0.2)
18 (0.1)
Iwase (Immudia-HemSp) Počet pacientů Počet pozitivních testů Počet zjištěných karcinomů
5 715 391 (6.8)
5 715 410 (7.2)
16 (0.3)
8 (0.1)
21 (0.24)
8 933 456 (5.1) 16 (0.2) 12 520 2 602 (20.8)
St John and Young (HemeSelect) 850 850 Počet pacientů 21 (2.5) 28 (3.3) Počet pozitivních testů 5 (0.6) 6 (0.7) Počet zjištěných adenomů* Tab. 4 Porovnání screeningových studií prováděných imunochemickými testy a Haemoccultem Hodnoty v závorkách jsou procenta *nebyly nalezeny žádné karcinomy Převzato z: Young, GP., Macrae, FA., St John, DJB. Clinical Methods for Early Detection: Basis, Use and Evaluation. In Young, GP., Rozen, P., Levin, B. Prevention and Early Detection of Colorectal Cancer. London: W. B. Saunders Company, 1996, p. 256.
30
Srovnávací
screening
senzitivního
guajakového
testu
Haemoccult
Sensa
a specifického imunochemického testu FlexSure OBT vedl k výsledkům, že guajakový test je signifikantně senzitivnější na jakoukoliv kolorektální neoplazii než imunochemický; Haemoccult detekuje více adenomů při specificitě, která je nízká, ale akceptovatelná pro populační screening [33]. Ve
studii
[34]
porovnávající
výsledky
a
klinický
přínos
biochemického
a imunochemického stanovení bylo zjištěno, že senzitivita imunochemického testu ImmoCare je zřetelně vyšší (61,2 %) proti Haemoccultu (29,4 %), specificita je jen nevýrazně nižší (95 %, resp. 98 %). Vyšší citlivost imunochemického testu je za cenu ekonomicky i technicky vyšších nároků a vyššího počtu falešně pozitivních výsledků. Výsledky potvrzují oprávněné místo Haemoccultu ve screeningových či depistážních programech, nákladnější a pracnější ImmoCare test je vhodnější pro vyšetření symptomatických či rizikových pacientů. V roce 2002 publikovali autoři Trojan, Povse, Schroder a Stein [35] studii s novým rychlým imunologickým testem, Prevent ID CC, pro detekci krve ve stolici u lůžka pacienta. Srovnání s guajakovým testem Hemocare prokázalo vyšší senzitivitu imunologického testu, zatímco specificita obou byla srovnatelná. Klinická validita imunologického testu však musí být teprve prokázána. Jiná studie [36] si kladla za cíl rozhodnout, zda by měly imunochemické testy nahradit guajakové v běžné klinické praxi. Ve svém výzkumu došli autoři k závěru, že imunochemické testy, i přes své teoretické výhody, nepodaly přesvědčivý důkaz, aby nahradily tradiční guajakové testy. Vedlo je k tomu zjištění, že jejich pozitivní prediktivní hodnota pro adenomy větší než 1 cm a kolorektální karcinomy byla téměř o polovinu nižší než u guajakových testů (17 % versus 30 %) a dále vysoký počet vrácených imunochemických testů, které nemohly být zpracovány laboratoří. 1.7 Vztah mezi senzitivitou a specificitou Rozhodující pro poměr diagnostické senzitivity a specificity je určení takové hodnoty testu, od které bude výsledek považován za pozitivní (tzv. „cut-off value“, diskriminační hodnota) [18]. Co se týče Haemoccult testu, převážně užívaného pro screening kolorektálního karcinomu, jeho specificita je vysoká (nad 90 %), citlivost je však podstatně nižší. Jak píše Jablonská a kol. [12] tento charakter vyhovuje pro účely masové depistáže. Vysoká specificita a nižší citlivost jsou přijatelným kompromisem pro účinný program při splnění podmínky
31
opakované depistáže bezpříznakových jedinců vzhledem ke zmíněnému pomalému růstu kolorektálních nádorů a dlouhotrvající maligní transformaci adenomu v karcinom. Graf 1 zobrazuje teoretickou distribuci hladiny krve ve stolici u normální populace a u skupiny pacientů s kolorektálním karcinomem. Když bude analytická senzitivita testu, jehož práh detekce hemoglobinu je nastaven jako pro test A, test bude falešně pozitivní u x procent normálních jedinců (specificita 100-x %) a správně pozitivní ve 100-y % pacientů s karcinomem. Jestliže je analytická senzitivita zmenšena, jako pro test B, diagnostická senzitivita pro karcinom se zvýší, ale diagnostická specificita se zhorší. Jinými slovy, jestliže zvýšíme analytickou senzitivitu, jako pro test C, falešně pozitivní reakce u normálních subjektů nebudou, ale bude se zvyšovat podíl pacientů s karcinomem, kteří budou mít výsledek negativní. Zpravidla, čím senzitivnější test, tím horší je jeho specificita.
Normální jedinci
Četnost
Pacienti s karcinomem
Koncentrace krevních analytů ve stolici Graf 1 Teoretický výskyt koncentrací krevních analytů ve stolici u normálních jedinců a pacientů s karcinomem. Obrázek znázorňuje situace, které se týkají testů tří citlivostí (A, B, C). Oblast x představuje průnik, kdy normální jedinci mají falešně pozitivní výsledek testu a oblast y je podíl pacientů s rakovinným ložiskem a negativním testem. Převzato z: Young, GP., Macrae, FA., St John, DJB. Clinical Methods for Early Detection: Basis, Use and Evaluation. In Young, GP., Rozen, P., Levin, B. Prevention and Early Detection of Colorectal Cancer. London: W. B. Saunders Company, 1996, p. 259.
Stupeň překrytí dvou křivek na grafu 1 se může měnit v závislosti na analytech, které ve stolici měříme. Takové překrytí se očividně vyskytuje pro hem detekovatelný 32
hem-porfyrinovými nebo guajakovými testy, nicméně se zdá, že pravidlo, že zvyšující se senzitivita zhoršuje specificitu neplatí pro imunochemické testy. Jak ukazuje jedna zpráva, může to být vysvětleno tím, že distribuční křivky imunoreaktivního hemoglobinu pro zdravé a pacienty s karcinomem se překrývají menší měrou než ty pro hem. Opět to může být vysvětleno dvěma faktory: rozpětí distribuční křivky hemoglobinu ve stolici je užší než pro hem; a hem z potravy a rostlinné peroxidázy rozšiřují normální rozpětí o peroxidázy ve stolici detekovatelné guajakovými testy. Další způsob jak uvážit vzájemnou závislost mezi senzitivitou a specificitou a jak pomoci ve výběru FOB testu je použití ROC křivky (Receiver Operating Characteristics). Čím větší je plocha pod křivkou neboli čím blíže je diagram levému hornímu rohu, tím má test lepší schopnost rozlišit zdravé subjekty od pacientů s karcinomem [15]. Většina FOB testů jsou jednoduché kvalitativní testy; jejich diskriminační hodnota analytické senzitivity je kontrolována výrobcem, ačkoli manipulace, jako je např. hydratace, ji může pozměnit. Jestliže je používán kvantitativní FOB test, diskriminační hodnota se může měnit dle potřeby a podle populace ve studii. V japonské studii [37] se pokusili stanovit optimální diskriminační hodnotu tak, aby měl příslušný screening optimální efektivnost nákladů a vysokou diagnostickou hodnotu. Hodnota „cut-off“ imunochemického testu OC-Hemodia byla vyhodnocována srovnáním průměrů nákladů potřebných k diagnostice jednoho kolorektálního karcinomu u tří diskriminačních hodnot. Výzkum ukázal, že vzhledem k vynaloženým nákladům je efektivní diskriminační hladina 150 ng/ml. Je proto doporučená jako optimální pro screening imunochemickým testem OC-Hemodia z pohledu efektivnosti nákladů a stejně tak diagnostické přesnosti. Autoři Wong et al. [38] ve své studii používali automatický imunochemický FOBT Magstream 1000/Hem-Sp u čínské populace, která byla odeslána ke kolonoskopickému vyšetření. Test se vzorky ze dvou separátních stolic byl vyhodnocován automatickým přístrojem s nastavitelným prahem citlivosti. Podle návodu výrobce autoři vypočítali senzitivitu, specificitu a pozitivní prediktivní hodnotu pro detekci kolorektálních adenomů a karcinomů na několika úrovních senzitivit. Výsledky byly závislé na zvoleném prahu a ukázaly, že jsou vhodné pro screening a konzistentní s výsledky jiných studií, které používaly imunochemické testy ke screeningu velkých populací.
33
Jak dosáhnout rovnováhy Jak tedy dosáhnout rozumné rovnováhy mezi senzitivitou a specificitou FOBT? Odpovědět na tuto otázku se pokusila dát Oaklandská a Nottinghamská studie. Oaklandská práce byla zaměřena na srovnání senzitivity a specificity různých testů pro FOBT. Stolice byla vyšetřována Haemoccultem II, Haemoccultem II Sensa (guajakový test se zvýšenou senzitivitou srovnatelnou s rehydratovaným Haemoccult II), HemeSelectem (test pro imunodetekci
lidského
hemoglobinu)
a
kombinovaným
testem
(Haemoccult
II
Sensa + HemeSelect). Haemoccult II Sensa odhalil nejvíc kolorektálních karcinomů (senzitivita 79,4 %), avšak jeho specificita byla nízká, vysoce ovlivněná dietou, podobně jako u rehydratovaného Haemoccultu II. HemeSelect dosahuje při slušné senzitivitě vysoké specificity. Vyžaduje však větší vzorek a dokonalejší rozetření stolice na papírku než guajakové testy a je také mnohem dražší. V uvedené práci byl proto velký počet HemeSelect testů nehodnotitelných pro jejich špatnou přípravu. V závěru Oaklandské studie její autoři doporučují kombinovaný test, kdy pozitivita málo specifického Haemoccult II Sensa je navíc ověřená vysoce specifickým HemeSelect testem, detekujícím lidský hemoglobin. Hromadné vyšetření těmito testy však nebylo doposud ověřeno rozsáhlejšími populačními studiemi. Oaklandská studie zahrnovala celkem pouze 8 000 jedinců a trvala jeden rok [19]. 1.8 Analytická specificita Analytická specificita je vlastnost, která vyjadřuje, do jaké míry a jakým způsobem je stanovení určité látky ovlivněno jinými látkami, přítomnými v biologickém materiálu. Protože biologický materiál představuje velice bohatou směs látek různého (často i neznámého) složení, lze očekávat, že s činidlem může reagovat nejen stanovovaná látka, ale i jiné látky v analyzovaném materiálu přítomné [39]. Značný vliv mají dietní nebo farmakologické látky, které reagují s chemickým složením určitých FOB testů. S výjimkou imunochemických testů vedou k falešně pozitivním nebo falešně negativním výsledkům. Falešně pozitivní výsledky mohou být znásobeny požitím velkého množství syrového a tmavého masa, některých druhů ovoce a zeleniny (rostlinné peroxidázy), nesteroidních antirevmatik a kyseliny acetylsalicylové. Naopak falešně negativní nález se může objevit při konzumaci extrémního množství kyseliny askorbové (kolem 10 g denně) nebo prostě v důsledku toho, že některé karcinomy a adenomy krvácejí intermitentně nebo v nedostatečné míře [12]. Železo pravděpodobně nezpůsobuje pozitivní reakci. Viz tabulka 5.
34
Falešně pozitivní výsledky díky tmavému masu nejsou známkou nedostatku analytické specificity, protože hem hemoglobinu a myoglobinu je totožný. Tato pozitivita představuje problém diagnostické specificity, protože abnormální výsledek není známkou patologického krvácení. U senzitivnějších testů jako je Haemoccult Sensa je omezení spotřeby tmavého masa žádoucí, u méně senzitivních jako je Haemoccult je to vhodné; zvláště u populací, kde je spotřeba tmavého masa vysoká jako např. v USA, Kanadě, Austrálii a Novém Zélandu [15]. Autoři Sinatra, St. John a Young [40] ve své studii s testem Haemoccult a Haemoccult Sensa dospěli k závěru, že dodržování diety s omezením rostlinných peroxidáz není nutné, jestliže se vyhodnocení testu provádí 48 hod. po aplikaci stolice na testovací kartu. Bohužel toto neplatí pro rehydratovaný Haemoccult, kde je naopak nutné dodržovat striktní zákaz požívání syrového ovoce a zeleniny. Vlastnost
Test† Hem-pofyrinový
Guajakový
Imunochemický
Použitelnost u lůžka ++++ 0 0 až + + Čas k vyvolání 1 minuta 1 hodina 5 minut až 24 hodin Cena‡ $ 18 $ 33 $ 18–35 Důvody falešně pozitivních výsledků Zvířecí hemoglobin ++++ ++++ 0 Peroxidázy v dietě +++ 0 0 Rehydratace +++ 0 0 Železo 0 0 0 Důvody falešně negativních výsledků Degradace hemoglobinu +++ 0 +++ Skladování ++ 0 ++ Vitamín C ++ 0 0 Tab. 5 Vlastnosti různých skupin FOB testů Vzájemná porovnání zobrazuje škála od 0 do + + + +; + + + + vyjadřuje vysokou pravděpodobnost a 0 nízkou pravděpodobnost. † Obvykle užívané guajakové testy jsou Haemoccult II a Haemoccult II Sensa, hem-porfyrinové HemoQuant a imunochemické HemeSelect a FlexSure OBT. ‡ Částka udávaná pro guajakový test je cenou za tři testovací karty. Převzato z: Rockey, DC. Occult gastrointestinal bleeding. The New England Journal of Medicine, Jul. 1999, vol. 341, no. 1, p. 38–46.
Imunochemické testy jsou specifické na lidský hemoglobin a výrobci prohlašují, že nemají zkřížené reakce s myoglobinem nebo se zvířecími hemoglobiny, které jsou součástí dietních režimů západní civilizace. Zdá se být nepravděpodobné, že by zvířecí hemoglobiny
35
prošly zažívacím ústrojím člověka nedotčené a byly vyloučeny stolicí, navíc dvě studie ukázaly, že imunochemické testy nejsou ovlivněny dietami. Dietní omezení je proto u těchto testů zbytečné. Hem-porfyrinové testy jsou specifické na dikarboxylové porfyriny. Množství těchto hem-porfyrinů přítomných ve stolici narůstá nejen krvácením, ale také díky spotřebě potravin obsahujících krev a myoglobin, např. tmavé maso [15]. 1.9 Analytická senzitivita Analytická citlivost (senzitivita) je určena směrnicí kalibrační závislosti, vyjadřuje se tedy jako závislost přírůstku měřené veličiny (odezvy) na jednotku koncentrace. Jiná definice určuje citlivost jako nejmenší rozdíl koncentrací, který lze ještě s určitou spolehlivostí (nejčastěji 95 %) rozlišit. Konečně se někdy určuje tzv. mez stanovitelnosti jako nejnižší hodnota, která se statisticky významně liší od slepé zkoušky (výsledku, který poskytne biologický materiál neobsahující stanovovanou látku) [39]. Je zřejmé, že hladina koncentrace, kdy test spolehlivě detekuje krev ve stolici je hlavním rozhodujícím činitelem jeho schopnosti diagnostikovat krvácivé léze. Na základě studií využívajících radiochromové metody činí ztráta krve stolicí u normálního jedince 0,5 ± 0,4 (SD) ml za den s horním limitem 1,5 ml [15]. Totéž říká práce z roku 1982 [41], kdy byly naměřeny střední hodnoty ztráty krve u zdravých subjektů 0,62 ± 0,07 ml/den (SD), u pacientů s adenomatózními polypy vzestupného a přímého tračníku 1,28 ± 0,31 ml/den a sestupného tračníku a rektosigmoidea 1,36 ± 0,14 ml/den. Pozdější
studie
[42]
uvádí
střední
hodnoty
ztráty
krve
subjektů
s negativním
kolonoskopickým vyšetřením 0,67 ml/den, u pacientů s kolorektálními polypy 0,74 ml/den, rektální karcinom krvácí 1,26 ml/den a kolonický 2,18 ml/den. Výzkum, že krevní analyty ve stolici (tzn. krevní deriváty, které reagují s daným testem) jsou různé v závislosti na místu krvácení, svědčí o tom, že jednotlivé analyty nejsou přítomny ve stejných množstvích. Čím je krvácení proximálněji, tím více jsou hlavními produkty hem-porfyrinové deriváty. Čím je krvácení distálněji, je přítomen neporušený hemoglobin (viz obr. 1).
36
Obr. 1 Místa gastrointestinálního krvácení a relativní pravděpodobnost pozitivního výsledku FOBT Převzato z: Rockey, DC. Occult gastrointestinal bleeding. The New England Journal of Medicine, Jul. 1999, vol. 341, no. 1, p. 38–46.
Legenda k obrázku 1: Sites of gastrointestinal Bleeding
Místa gastrointestinálního krvácení
Relative Likelihood of a Positive Fecal
Relativní pravděpodobnost pozitivního
Occult-Blood Test
výsledku FOBT
Upper gastrointestinal tract
Horní gastrointestinální trakt
Porphyrins
Porfyriny
partially degraded heme
částečně degradovaný hem
degraded globin
degradovaný globin
Middle gastrointestinal tract
Střední gastrointestinální trakt
partially degraded globin
částečně degradovaný globin
Lower gastrointestinal tract
Dolní gastrointestinální trakt
Intact heme and intact globin
neporušený hem a globin
Guaiac-based
Guajakový (test)
Heme-porphyrin
Hem-porfyrinový (test)
Immunochemical
Imunochemický (test)
Testy, které detekují jen některé z těchto analytů (jako např. guajakové testy detekují hem, imunochemické testy hemoglobin) by měly mít podle toho nastaven svůj práh citlivosti.
37
Že tomu tak je, ukazuje tabulka 6, která uvádí analytické senzitivity různých typů FOB testů v závislosti na místě krvácení. Ztráta krve [ml/den] Typ testu (analyt)
z tlustého střeva
ze žaludku
Hem-porfyrinový (hemoglobin, hem, hem-porfyrinové deriváty)
>2
>2
Guajakový (hemoglobin, hem)
> 0,5
10–20
Imunochemický (hemoglobin)
> 0,25
> 100
Tab. 6 Odhady senzitivit tří typů testů na okultní krvácení vyjádřených množstvím ztráty krve z jednotlivých lokalizací Pozn. skutečné citlivosti se liší u různých výrobních verzí každého typu testu Převzato z: Young, GP., Macrae, FA., St John, DJB. Clinical Methods for Early Detection: Basis, Use and Evaluation. In Young, GP., Rozen, P., Levin, B. Prevention and Early Detection of Colorectal Cancer. London: W. B. Saunders Company, 1996, p. 246.
Ovšem, na skupině imunochemických testů si můžeme ukázat, že jednotlivé analytické citlivosti se různí. Následující tabulka 7 uvádí některé konkrétní příklady. Některé citlivosti jsou definovány na mg hemoglobinu/g stolice a jiné v mg hemoglobinu/ml roztoku. Ve druhém případě je již výrazná závislost na zpracování vzorku pacientem, např. množství stolice, které do roztoku přidá. Actim Fecal Blood
50
µgHb/l
ImmoCare
20
µgHb/ml
Hemo-Pack Diaquick FOBT
0.88 mgHb/g 40
ngHb/ml
1
mgHb/g
HemeSelect
10
µgHb/g
InSure FIT
10
µgHb/g
FlexSure OBT
75
µgHb/g
OC-Hemodia [37]
50
ngHb/ml
Hemolex
Magstream analyzátor [38] 20 mgHb/l Tab. 7 Analytické citlivosti imunochemických testů Ačkoli je ztráta krve u pacientů s kolorektální neoplazií obvyklá, nižší hodnoty u některých pacientů se částečně překrývají s normálním rozmezím hodnot viz graf 2.
38
Ztráta krve (ml/den)
Zdraví
Pacienti s kolorektálním karcinomem
Graf 2 Průměrná denní ztráta krve měřená 8–10 dní u zdravých subjektů a 46 pacientů s kolorektálním karcinomem metodou značených erytrocytů. Horizontální čára je horní limit normálního rozsahu hodnot (1,5 ml za den). Převzato z: Young, GP., Macrae, FA., St John, DJB. Clinical Methods for Early Detection: Basis, Use and Evaluation. In Young, GP., Rozen, P., Levin, B. Prevention and Early Detection of Colorectal Cancer. London: W. B. Saunders Company, 1996, p. 245.
Měření ztráty krve ve stolici analyzováním hemu a současně hem-porfyrinových derivátů testem HemoQuant ukazují tentýž problém. A sice testy, které jsou závislé na objemu ztráty krve nebo na přítomnosti hemu a jeho degradačních produktů ve stolici nedostatečně rozlišují normální jedince a pacienty s karcinomy.
39
HQT (mg Hb/g stolice)
Haemoccult Pozitivní Negativní
Pacienti Graf 3 Okultní hladiny hemoglobinu ve stolici měřené 2 týdny u 12 pacientů s asymptomatickým pokročilým kolorektálním karcinomem diagnostikovaným testy HemoQuant a Haemoccult. Šedá zóna představuje obvyklé normální rozmezí hodnot. Převzato z: Ahlquist, D. A., Shuber, A. P. Stool screening for colorectal cancer: evolution from occult blood to molecular markers. Clinica Chimica Acta. 2002, 315, p. 161.
Velikost krvácení z nádoru není závislá na stadiu, ale spíš na poloze nádoru a eventuálně jeho velikosti. Proximálně uložené velké karcinomy krvácejí nejvíce. Jak ukazují výsledky s HemoQuantem a radiochromem, adenomy krvácejí méně než karcinomy a krvácení z malých adenomů (< 1 cm) je vzácně mimo normální rozmezí. U pacientů s velkou střevní neoplazií jsou krevní ztráty variabilní v různých dnech. Používáme-li guajakové testy, testování jen jedné nebo dvou stolic má nižší senzitivitu než testování tří, ale testování více než tří je malým přínosem na úkor zhoršení specificity [15].
40
2. MATERIÁL A METODY 2.1 Diaquick Fecal Occult Blood Test Ve své práci jsem používala Diaquick Fecal Occult Blood Test (DIALAB, Vienna, Austria), šarže 14229 s exspirací 2005/11. Dialab FOB test je vizuální imunochromatografický test pro kvalitativní průkaz lidského hemoglobinu ve vzorku stolice. Hlavní uplatnění tohoto testu je ve screeningu patologií distální části gastrointestinálního traktu, které krvácejí, např. kolorektálních karcinomů a velkých adenomů. Je určen pro in vitro diagnostické použití. Skládá se z kazety, která je zabalená v hliníkové fólii a z plastové zkumavky, která obsahuje pufr. Kazeta testu je bílá, plastová krabička obdélníkového tvaru o velikosti 65 mm x 30 mm x 7 mm (š x v x h). Uprostřed je obdélníkové indikační okénko o rozměrech 20 mm x 5 mm (š x v). Vpravo, vedle něj, je trychtýřovitý otvor pro nakapání pufru, tzv. zóna „Sample“. Vlevo od indikačního okénka, kolmo k jeho podélné ose, jsou umístěny tři průduchy. Nad indikačním okénkem jsou písmena C a T, které označují zónu Control a zónu Test (význam zbarvení pod těmito písmeny je vysvětlen níže). V levém horním rohu je nápis FOB. Zkumavka je na jednom konci opatřena kapátkem a na druhém odšroubovatelným uzávěrem. Na vnitřní straně uzávěru je odběrová tyčinka, která má podobu spirály a slouží k tomu, aby se na ní zachytila stolice. Po zašroubování uzávěru se tyčinka i se vzorkem stolice vnoří do pufru. Uvnitř zkumavky se při jejím horním okraji nachází speciální zúžení, které zajišťuje, aby se do pufru dostalo omezené množství stolice. Kapátko se do funkčního stavu uvede odlomením plastové tyčinky, která je zatavena na jeho ústí. Princip testu Principem testu je kombinace užití monoklonálních a polyklonálních protilátek proti lidskému hemoglobinu. Výrobce prohlašuje, že tato kombinace zajišťuje vysoký stupeň selektivity a citlivosti. Vzorek je pomocí kapátka zkumavky vpraven do testační kazety, kde je přítomna protilátka proti lidskému hemoglobinu značená zlatem. Po proběhnutí imunochemické reakce komplex antigen – značená protilátka migruje testační kazetou do zóny „Test“, která obsahuje imobilizovanou protilátku, která vyváže migrující značený
41
komplex, který v případě pozitivity vytvoří fialovou zónu. V testační kazetě je imobilizován ještě druhý komplex antigen – značená protilátka, který zajišťuje kontrolu provedení testu v zóně „Control“. Metoda stanovení je tenkovrstvá chromatografie, sendvičový typ imunostanovení. Interpretace testu Pozitivní výsledek – v zóně „Test“ i „Control“ vznikne fialový pás, který indikuje přítomnost humánního hemoglobinu. Intenzita barevného probarvení v obou zónách může být odlišná. Negativní výsledek – v zóně „Test“ nevznikne fialový pás, v zóně „Control“ vznikne fialový pás. Neplatný výsledek – v zóně „Control“ nevznikne žádný fialový pás. Výsledek se odečítá během 5 minut při pokojové teplotě, ne později než po 8 minutách. Výrobce udává citlivost testu 40 ng hHb/ml pufru. V některých případech mohou mít pozitivní výsledek i vzorky s nižší koncentrací. Při koncentracích do 0,5 mg/ml je test ještě pozitivní. 2.2 Metody Cílem práce bylo zjistit hraniční koncentrace hemoglobinu, které test vyhodnotí jako pozitivní. Výzkum jsem prováděla v Gastroenterologické laboratoři Ústavu klinické biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF a VFN v období od 12. 5. 2004 do 29. 6. 2004, celkem v sedmi dnech. Laboratorní podmínky byly během všech měření srovnatelné, teplota se pohybovala v rozmezí 20–25 °C a testy byly vyhodnocovány za denního světla. Při práci jsem používala poloautomatické pipety. K testování jsem používala vlastní krev, kterou jsem zpracovala následujícím způsobem. Objem 20 ml krve jsem po odběru nechala 10 minut srážet při pokojové teplotě. Poté jsem provedla centrifugaci 15 minut při 2 000 otáčkách. Sérum nad krevním koláčem jsem odsála a do zkumavky jsem doplnila shodný objem 0,45% fyziologického roztoku, a sice 5,9 ml. Obsah zkumavky jsem promíchala 5 minut pomocí trnové třepačky. Krev byla uskladněna 24 hodin v mrazničce při -25 °C, aby došlo k hemolýze zmražením. Po 42
rozmražení byla provedena centrifugace 40 minut při 5 000 otáčkách. Získaný hemolyzát byl neprůhledný a temně červené barvy. Poté, co jsem jej v 1 ml alikvotech rozpipetovala do 13 plastových zkumavek, zbyla na dně malá peleta. Zkumavky byly uskladněny v mrazničce při -25 °C. Jedné zkumavky takto připraveného hemolyzátu bylo použito ke zjištění hladiny hemoglobinu v krvi. Měření bylo provedeno na analyzátoru Abbot 3700. Výchozí koncentrace činila 129 g/l. Při hledání horní a dolní hraniční meze jsem testovala 11 roztoků o těchto koncentracích lidského hemoglobinu: 1 mg/ml; 0,75 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,01 mg/ml; 0,001 mg/ml; 0,0001 mg/ml; 0,00001 mg/ml; 0,000005 mg/ml a 0,000001 mg/ml. Roztoky jsem připravovala z pufru získaného ze zkumavek Diaquick FOB testu a hemolyzované krve. FOB testy i kapátka byly skladovány v lednici při teplotě +8 °C a předtím, než jsem s nimi začala pracovat a než jsem použila hemolyzát, jsem oba uvedené nástroje nechala vytemperovat na pokojovou teplotu. Do zóny „Sample“ kazety jsem kapala vždy dvě kapky roztoku. Výsledek jsem odečítala po pěti minutách. Celkem bylo provedeno 57 testů. Nejprve jsem si připravila koncentrace 1 mg/ml a 0,1 mg/ml a podle výsledných reakcí jsem koncentrační řadu doplňovala o další roztoky. První odhad byl stanoven na jedné kazetě neboli každá z jedenácti koncentrací byla testována jedenkrát. Zjistila jsem hraniční koncentrace. Při následujícím měření jsem pokus opakovala a hladiny hraničních koncentrací, které byly shodné jako při prvním stanovení, jsem pak vyhodnocovala na deseti kazetách současně. Vpravení roztoku do kazet testů trvalo přibližně 45 až 60 sekund. Dále jsem se pokusila zjistit, do jaké míry ovlivní přítomnost stolice v pufru mé zjištěné výsledky. K testování jsme potřebovali stolici, kterou poskytla zdravá žena ve věku 29 let, neměla menstruaci, nedodržovala dietní omezení ani neužívala žádné léky a před odběrem nevykonávala fyzicky namáhavou práci nebo sport. Před analýzou byla stolice dvě hodiny uchovávána v lednici při teplotě +8 °C. Stolici jsem nejprve vyšetřila pěti Diaquick FOB testy. Dle návodu jsem odběrovou tyčinkou odebrala vzorek z několika míst stolice. Po zašroubování uzávěru jsem zkumavku protřepala a po odlomení plastové tyčinky kapátka jsem pufr nakapala do zóny „Sample“ jednotlivých kazet. Výsledky byly negativní.
43
V laboratoři jsem na analytických vahách zn. Sartorius zvážila 5 uzávěrů zkumavek s odběrovou tyčinkou, nejprve před a poté po odběru vzorku stolice. Zkumavky jsem promíchala, aby se vytvořila homogenní suspenze. Při přípravě obou roztoků hraničních koncentrací jsem postupovala stejně jako v předchozím pokusu, jen jsem použila pufr „se stolicí“ z první zkumavky. Každý z roztoků jsem současně testovala na 5 kazetách. Nakapání roztoků do kazet testů trvalo asi 30 sekund.
44
3. VÝSLEDKY A DISKUSE Koncentrace hemoglobinu v pufru bez stolice U všech kazet se objevil kontrolní proužek tz., že žádný z testů nebyl neplatný. Pozitivní reakce byla odečtena u koncentrací 0,5 mg/ml; 0,2 mg/ml a 0,1 mg/ml; 0,01 mg/ml; 0,001 mg/ml; 0,0001 mg/ml; 0,00001 mg/ml a 0,000005 mg/ml. Naopak negativní byla u koncentrací 1 mg/ml; 0,75 mg/ml a 0,000001 mg/ml. Nejvyšší koncentrace, kdy Diaquick FOB test vykázal pozitivní reakci byla 0,5 mg/ml. Z výše uvedeného vyplývá, že horní hraniční mez leží v intervalu 0,75 mg/ml až 0,5 mg/ml. Vedlejší důležitý výsledek je zjištění, že roztoky o vyšší koncentraci vrátily negativní výsledky. Nalezla jsem zde shodu s výrobcem, jelikož udává, že koncentrace 0,5 mg/ml ještě může vykazovat pozitivitu. Proč test nevyhodnotil jako pozitivní vzorky s vyšší koncentrací hemoglobinu lze s největší pravděpodobností vysvětlit tzv. „hook effectem“. Testy, při kterých se antigen inkubuje spolu se značenými protilátkami a imobilizovanými protilátkami v kapalné fázi přinášejí riziko, že nezředěné vzorky obsahující extrémně vysoké koncentrace antigenu povedou k hodnotám měření, které budou pod hodnotami nejvyššího standardu. Pokud je podezření, že se bude pracovat s takovými hodnotami, po dalším ředění vzorku (např. faktory 10, 100, 1000) se musí měření opakovat nebo se musí použít dvoukroková metodika. Nejnižší koncentrace, kdy Diaquick FOB test vykázal pozitivní reakci byla 0,000005 mg/ml. Proto dolní hraniční mez leží v intervalu 0,000005 mg/ml až 0,000001 mg/ml. Od hodnoty 0,1 mg/ml jsem při ředění nižších koncentrací používala faktor 10 a abych mohla stanovit výsledek co možná nejpřesněji, poslední interval ředění jsem ještě rozpůlila. Mé testování prokázalo osmkrát vyšší citlivost, než jakou udává výrobce. Je to hodnota velmi nízká a pakliže by testování probíhalo za stejných podmínek, znamená to, že test je schopen detekovat ve vzorku stolice menší množství krve, a tím stanovit u většího množství vzorků pozitivní výsledek. Což s sebou samozřejmě přináší záchyt nejen správně pozitivních, ale i falešně pozitivních výsledků. Jak bylo řečeno výše, vysoké procento pozitivity není ideální pro screeningový program. Pozorovala jsem závislost mezi koncentrací roztoku a probarvováním testovacích proužků. Nejsytější byly při koncentracích 0,01 mg/ml a 0,001 mg/ml. Směrem k nižším, ale i k vyšším koncentracím byl proužek méně sytý a vývoj jeho zabarvení vyžadoval delší dobu. 45
Při testování roztoků hraničních koncentrací na deseti kazetách v pokusu s pufrem bez stolice měly intenzity proužků současně hodnocených kazet obdobnou intenzitu a nijak výrazně se od sebe nelišily. Koncentrace hemoglobinu v pufru se stolicí Tabulka 8 udává hmotnosti uzávěrů zkumavek s odběrovou tyčinkou, hmotnosti uzávěrů po aplikaci stolice a vypočtené hmotnosti vzorku stolice na odběrové tyčince. Jak je vidět, v našem případě se množství stolice „zachycené“ na odběrové tyčince lišilo až čtyřnásobně (7,5–31 mg stolice, průměr 16,9 mg stolice), a to i přesto, že odběr prováděla stejná osoba a dodržela instrukce dle přiloženého návodu. hmotnost uzávěru [g]
hmotnost uzávěru se vzorkem stolice [g]
hmotnost vzorku stolice [g]
1
1,8133
1,8245
0,0112
2
1,8025
1,8100
0,0075
3
1,7914
1,8050
0,0136
4
1,7914
1,8224
0,0310
5
1,7871
1,8082
0,0211
průměr
1,79714
1,81402
0,01688
měření
Tab. 8 Hmotnosti vzorků stolice Mělo by být vyvinuto zařízení, které by bylo schopné zajistit shodnou velikost vzorku stolice. Zatím lze jeho velikost jen těžko standardizovat. Pokyny výrobců se zpravidla zaměřují na to, aby byly odchylky minimální. Čím větší je vzorek, tím je pravděpodobnější pozitivní reakce [15]. Bez poznámky by také neměla zůstat otázka kvality, resp. konzistence stolice. Je to potenciálně důležitá, ačkoli nekontrolovatelná proměnná. Tuhá stolice má tendenci vracet méně pozitivních výsledků Haemoccult testu než řídká stolice [43]. V deseti měřeních koncentrací 0,5 mg/ml a 0,000005 mg/ml se i s použitím pufru „se stolicí“ ze zkumavky použité pro první měření potvrdila pozitivní reakce na těchto hladinách.
46
Pozorovala jsem ale rozdílnou dobu, než se objevila reakce ve srovnání s měřeními bez stolice. Zatímco u předchozích pokusů se testovací i kontrolní proužek vybarvily do 3 minut od nakapání pufru, zde se jednalo o časovou prodlevu, kdy se zabarvení v testovací zóně začalo objevovat po 3 minutách a bylo odečitatelné v době od 5 do 8 minut. U současně hodnocených testů, na jednotlivých hraničních hladinách, měly intenzity proužků obdobnou intenzitu a opět se od sebe výrazně nelišily. V mém případě byl sice limit určený pro vyhodnocení testu dostačující k odečtení pozitivní reakce, vyvstává zde ale otázka, do jaké míry ovlivňuje množství stolice v pufru výsledek testu. Je možné, že při dané koncentraci by větší množství stolice v pufru mohlo způsobit negativní výsledek. Velké množství stolice napěchované do testovací zkumavky, by dokonce mohlo zcela znemožnit vyhodnocení testu, neboť vyluhované částečky stolice se usadí na začátku kazety v místě pro nakapání pufru a tím znemožní zvlhčení testovací kazety. Větší množství stolice se samozřejmě do zkumavky dostane nedodržením návodu výrobce, kdy se testované osoby snaží poskytnout dostatek materiálu.
47
4. ZÁVĚRY Testy na okultní krvácení ve stolici jsou jedním z preventivních přístupů k odhalení kolorektálních lézí. Vzhledem k tomu, že jsou neinvazivní, patří mezi nejpoužívanější. Jejich nevýhodou je, že testy nejsou testem na přítomnost kolorektálního karcinomu, ale na přítomnost intermitentního okultního krvácení, které doprovází růst velkých adenomů a kolorektálního karcinomu. Existují tři různé typy těchto testů, které detekují různé analyty ve stolici. Imunochemické testy jsou selektivní na kolorektální karcinom tím, že jsou velmi málo senzitivní na krvácení z proximální části gastrointestinálního traktu. Guajakové testy jsou také méně senzitivní k proximálnímu než distálnímu krvácení, ale ne tolik jako imunochemické. Zvýšení citlivosti lze dosáhnout zvlhčováním guajakového testu před detekcí nebo použitím
imunochemických
metod
stanovení
hemoglobinu
ve
stolici.
Použití
imunochemických testů pro screening je limitováno jejich cenou, neboť jsou asi 5x dražší než guajakové. V průběhu experimentální části mé práce se mi podařilo naplnit stanovené cíle. Nejnižší koncentrace při níž je výsledek testu pozitivní je 0,000005 mg/ml tz., že dolní hraniční mez leží v intervalu 0,000005 mg/ml až 0,000001 mg/ml. Nejvyšší koncentrace při níž je výsledek testu pozitivní je 0,5 mg/ml tz, že horní hraniční mez leží v intervalu 0,75 mg/ml až 0,5 mg/ml. Výsledky mé práce ověřily analytickou citlivost, kterou deklaroval výrobce. Zároveň jsem zjistila, že koncentrace vyšší než 0,5 mg/ml vykazovaly opět negativní reakci vzhledem k hook-effectu. Byla prokázána stejná citlivost testu při použití pufru po aplikaci vzorku stolice. Dále jsem zjistila, možnou závislost mezi množstvím stolice v pufru a výsledkem testu a závislost mezi koncentrací hemoglobinu v pufru a intenzitou vybarvení testovacího proužku.
48
5. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY [1] Holubec, L. Kolorektální karcinom – současné možnosti diagnostiky a léčby. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2004. Kapitola 1, Epidemiologie kolorektálního karcinomu, s. 15–18. [2] Jablonská, M. Kolorektální karcinom – časná diagnóza a prevence. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2000. Kapitola 1.2, Epidemiologie kolorektálního karcinomu, s. 37–53. [3] Frič, P., Zavoral, M., Dvořáková, H., et al. Depistáž, časná diagnostika, dispenzarizace a profylaxe kolorektální neoplazie. In Aktuality v gastroenterologii. Praha: AZ servis, 1994, s. 139–153. [4] Jablonská, M. Kolorektální karcinom – časná diagnóza a prevence. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2000. Kapitola 3.2, Kolorektální karcinom – klinické aspekty, s. 146–158. [5] Boyle, P., Leon, ME. Recent development in the epidemiology of colorectal cancer. In Bleiberg, H., Kemeny, N., Rougier, P., Wilke, H. Colorectal Cancer A Clinical Guide to Therapy. London: Martin Dunitz, 2002, p. 11–29. [6] Holubec, L. Kolorektální karcinom – současné možnosti diagnostiky a léčby. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2004. Kapitola 14, Prevence a dispenzární péče, s. 157–159. [7] Prevalentní a incidentní screening. Zdrav. Nov. ČR, 2001, 50, 41, s. 15. [8] Frič P, Zavoral M.: Sekundární prevence kolorektálního karcinomu – aktuální přehled. Endoskopie, 2001, vol. 10, no. 2, s. 39–42. [9] Faivre, J., Benhamiche, A-M. Hemoccult as an approach to colorectal cancer screening. In Bleiberg, H., Kemeny, N., Rougier, P., Wilke, H. Colorectal Cancer A Clinical Guide to Therapy. London: Martin Dunitz, 2002, p. 33–37. [10] Jablonská, M. Kolorektální karcinom – časná diagnóza a prevence. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2000. Kapitola 8.1, Populační screening kolorektálního karcinomu – úvod, podstata, hlavní metody, s. 344–352. [11] Frič P, Zavoral M.: Screening kolorektálního karcinomu: projekce zahraničních zkušeností – jak se lze poučit, jak dále?. Prakt. Lék., 2002, vol. 82, no. 4, s. 203–204. [12] Jablonská, M. Kolorektální karcinom – časná diagnóza a prevence. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2000. Kapitola 8.2, Screening kolorektálního karcinomu testováním na okultní krev ve stolici – zkušenosti v České republice, s. 353–366. [13] Doležalová, V. Principy biochemických vyšetřovacích metod část II. 2. vyd. Brno: Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, 1995. Kapitola VI., Stolice, s. 91–97.
49
[14] Greegor, DH. Occult blood testing for detection of asymptomatic colon cancer. Cancer, 1971, 28, p. 131–134. [15] Young, GP., Macrae, FA., St John, DJB. Clinical Methods for Early Detection: Basis, Use and Evaluation. In Young, GP., Rozen, P., Levin, B. Prevention and Early Detection of Colorectal Cancer. London: W. B. Saunders Company, 1996, p. 241–270. [16] Rockey, DC. Occult gastrointestinal bleeding. The New England Journal of Medicine, Jul. 1999, vol. 341, no. 1, p. 38–46. [17] Kasal, P., Svačina, Š. Lékařská informatika. 1. vyd. Praha: Karolinum, 1998. Kapitola 1.4.2 Hodnocení vyšetření, s. 68–73. [18] Racek, J. Klinická biochemie. 1. vyd. Praha: Galén, Karolinum, 1999. Kapitola 4, Vlastnosti laboratorní metody z hlediska klinického, s. 39–42. [19] Musil, D. Populační skríning kolorektálního karcinomu vyšetřením stolice na okulní krvácení. Vnitř. Lék., 1999, vol. 45, no. 8, s. 496–499. [20] Horák, L., Zavoral, M., Frič, P. et al. Sekundární prevence sporadického kolorektálního karcinomu mezi pojišťenci ZP Škoda. Prakt. Lék., 1998, vol. 78, no. 11, s. 623–624. [21] Jablonská, M. Kolorektální karcinom – časná diagnóza a prevence. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2000. Kapitola 8.3, Populační screening – zkušenosti evropské, s. 367–374. [22] Hardcastle, JD., Bennett, DH., Whynes, DK. Mass Screening: European/UK Perspective. In Young, GP., Rozen, P., Levin, B. Prevention and Early Detection of Colorectal Cancer. London: W. B. Saunders Company, 1996, p. 275–288. [23] Jablonská, M. Kolorektální karcinom – časná diagnóza a prevence. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2000. Kapitola 8.4, Populační screening – zkušenosti mimoevropské, s. 375–384. [24] Lieberman, D. Mass Screening: North American Perspective. In Young, GP., Rozen, P., Levin, B. Prevention and Early Detection of Colorectal Cancer. London: W. B. Saunders Company, 1996, p. 289–300. [25] Saito, H., Yoshida, Y. Mass Screening: Japanese Perspective. In Young, GP., Rozen, P., Levin, B. Prevention and Early Detection of Colorectal Cancer. London: W. B. Saunders Company, 1996, p. 301–311. [26] Iwase, T. Evaluation of an immunochemical fecal occult blood test by reversed passive hemagglutination compared with Hemoccult II screening for colorectal cancer. In Young, GP., Saito, H. Fecal occult blood tests: current issues and new tests. Proceedings of a satellite meeting of the World Congresses of Gastroenterology, San Jose: Smith Kline Diagnostics, 1992, p. 90–94. 50
[27] Saito, H., Soma, Y., Koeda, J. et al. Reduction in risk of mortality from colorectal cancer by fecal occult blood screening with immunochemical hemagglutination test. A case-control study. Int. J. Cancer., 1995, 61, p. 465–469. [28] Ferkl, M., Kocna, P., Frič, P. Srovnání stanovení okultního krvácení ve stolici imunochemickou a biochemickou metodou. Čas. Lék. čes., 1992, 131, č. 5, s. 149–151. [29] Robinson, MHE., Marks, CG., Farrands, PA. et al. Population screening for colorectal cancer: comparison between guaiac and immunochemical faecal occult blood tests. Brit. J. Surg., 1994, 84, p. 448–451. [30] Benešová, A., Frič, P., Zavoral, M., Kocna, P., Matějovič, F., Vokráčka, V., Mareš, K. Srovnání imunochemického a biochemického testu okultního krvácení ve stolici. Čas. Lék. čes., 1993, 132, č. 17, s. 523–525. [31] St. John, DJB., Young, GP., Alexeyeff, MA. et al. Evaluation of new occult blood tests for detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology, 1993, 104, p. 1661–1668. [32] Allison, JE., Tekawa, IS., Ransom, LJ. et al. A comparison of fecal occult-blood tests for colorectal-cancer screening. N Engl J Med, 1996, 334, p. 155–159. [33] Rozen, P., Knaani, J., Samuel, Z. Comparative screening with a sensitive guaiac and specific immunochemical occult blood test in an endoscopic study. Cancer. Jul. 2000, vol. 89, no. 1, p. 46–52. [34] Dvořák, M., Kocna, P., Vaníčková, Z. Okultní krvácení ve stolici – srovnání imunochemického a biochemického testu stanovení. Čas. Lék. čes., 2002, 141, č. 7, s. 217–219. [35] Trojan, J., Povse, N., Schroder, O., Stein, J. A new immunological test strip device for the rapid, qualitative detection of faecal occult blood. Gastroenterology. Nov. 2002, vol. 40, no. 11, p. 921–924. [36] Ko, CW., Dominitz, JA., Nguyen, TD. Fecal Occult Blood Testing in a General Medical Clinic: Comparison between Guaiac-Based and Immunochemical-Based Tests. Am J Med., 2003, 115, p. 111–114. [37] Nakama, H., Zhang, B., Zhang, X. Evaluation of the optimum cut-off point in immunochemical occult blood testing in screening for colorectal cancer. European Journal of Cancer. 2001, 37, p. 398–401. [38] Wong, WM., Lam, SK., Cheung, KL. et al. Evaluation of an Automated Immunochemical Fecal Occult Blood Test for Colorectal Neoplasia Detection in a Chinese Population. Cancer. May 2003, vol. 97, no. 10, p. 2420–2424.
51
[39] Racek, J. Klinická biochemie. 1. vyd. Praha: Galén, Karolinum, 1999. Kapitola 3, Analytické vlastnosti laboratorní metody, s. 33–37. [40] Sinatra, MA., St John, DJB., Young, GP. Interference of Plant Peroxidases with Guaiacbased Fecal Occult Blood Tests Is Avoidable. Clinical Chemistry. 1999, vol. 45, no. 1, p. 123–126. [41] Herzog, P., Holtemuller, KH., Preiss, J. et al. Fecal blood loss in patients with colonic polyps: a comparison of measurement with 51chromium-labeled erythrocytes and with the Haemoccult test. Gastroenterology. Nov. 1982, vol. 83, no. 5, p. 957–962. [42] Dybhal, JH., Daae, LN., Larsen, S., Myren, J. Occult faecal blood loss determined by a 51Cr method and chemical tests in patients referred for colonoscopy. Scand J Gastroenterol., Mar. 1984, vol. 19, no. 2, p. 245–254. [43] Ahlquist, DA., McGill, DB., Schwartz, S. et al. HemoQuant, a new quantitative assay for fecal hemoglobin. Comparison with Hemoccult. Ann Intern Med., Sep. 1984, vol. 101, no. 3, p. 297–302.
52
1
[mg/ml]
0,1
[mg/ml]
53
0,001
[mg/ml]
0,0001
[mg/ml]
54
0,00001 C
T
[mg/ml]
0,000005
[mg/ml]
55
