Úloha sacharidů při abiotickém stresu

Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta Katedra fyziologie rostlin

Úloha sacharidů při abiotickém stresu bakalářská práce

Daniel Krsek 2006

1

Obsah Abstrakt..............................................................................................3 Seznam zkratek..................................................................................4 1. Úvod...............................................................................................5 2. Rostliny a stres..............................................................................5 3. Vodní deficit..................................................................................7 4. Desikace.........................................................................................8 5. Zasolení........................................................................................10 6. Chladový stres.............................................................................10 7. Mechanismy navození odolnosti k abiotickým stresům...........11 7.1. Akumulace kompatibilních solutů......................................11 7.1.1. Sacharóza....................................................................12 7.1.2. Trehalóza.....................................................................13 7.1.3. Cukerné alkoholy........................................................15 7.1.3.1.Manitol...................................................................15 7.1.3.2.Sorbitol...................................................................19 7.1.3.3.Inositol....................................................................20 7.1.4. RFO...............................................................................20 7.1.5. Fruktany........................................................................22 7.2. LEA proteiny..........................................................................23 7.3. Ostatní mechanismy................................................................23 8.

Závěr...............................................................................................24

Seznam použité literatury....................................................................25

2

Abstrakt Při reakci na abiotický stres se u rostlin uplatňuje mnoho různorodých látek. Jedná se o molekuly signální povahy, osmoticky aktivní látky, osmoprotektanty, zhášeče volných radikálů a chaperony (zejména ABA, sacharidy, ionty, betain, prolin, HSP, LEA). Řada z těchto látek ovšem plní hned několik odlišných rolí. Jednou z možností, jak rostlina může negativním dopadům působení stresových faktorů předcházet je akumulace kompatibilních solutů, látek nenarušujících rostlinný metabolizmus ani při vysokých koncentracích, jejichž významnou složkou jsou sacharidy. Sacharidy fungují při abiotickém stresu u rostlin jednak jako osmoticky aktivní látky za podmínek, kdy je voda pro rostlinu špatně dostupná (sucho, nízká teplota, zasolení), svou vazbou na makromolekuly a fosfolipidy v membránách nahrazují hydratační obaly a zabraňují tuhnutí membrán. Jejich velkou podskupinou, na které se tato práce nejvíce zaměřuje jsou cukerné alkoholy. Jejich četné hydroxylové skupiny se uplatňují při zhášení volných radikálů, vazbou na membrány předcházejí jejich poškození a chrání proteiny. Snaha zlepšit odolnost proti abiotickým stresům u kulturních rostlin vnesením genů pro syntézu výše uvedených látek vedla v některých případech k pozitivním výsledkům. V jiných experimentech však docházelo k některým negativním dopadům jako jsou nekrózy a zpomalení růstu. Je zřejmé, že vliv sacharidů na rostlinný metabolizmus je komplexnější, než se v minulosti předpokládalo a dobré porozumění dané problematice je proto důležité pro budoucí vývoj genotypů hospodářsky významných rostlin odolnějších k působení stresových faktorů.

3

Seznam zkratek A6PR ABA ABRE DRE GS HXK LEA MTD RS ROS SPS STS TPS TPP

aldóza-6-fosfátreduktáza kyselina abscisová ABA responsible element dehydration-responsive element galaktinolsyntáza hexokináza late embryogenesis protein manitoldehydrogenáza rafinózasyntáza aktivní formy kyslíku sacharózafosfátsyntáza stachyózasyntáza trehalóza-6-fosfátsyntáza trehalóza-6-fosfát fosfatáza

4

1. Úvod Rostliny se podobně jako ostatní organismy setkávají v průběhu svého života se stresovými faktory, před kterými, narozdíl od živočichů nemohou uniknout, proto se u nich v průběhu fylogeneze vyvinula řada komplexních mechanismů, jak se s nepříznivými podmínkami vypořádat. Pro růst a produkci rostlin jsou nejvíce limitující zejména abiotické stresové faktory. V současnosti, kdy se stále větší oblasti potýkají s nedostatkem vody, rozšiřováním pouští a zasolením půd způsobeném umělým zavlažováním, se tato problematika stává obzvláště aktuální a je intenzivně studována. Tradiční metody šlechtění jsou příliš zdlouhavé a finančně náročné a proto se výzkumy soustřeďují na šlechtění hospodářsky významných plodin se zvýšenou odolností k biotickým i abiotickým stresovým faktorům za pomocí biotechnologických metod. Jednou z možností jak zvýšení odolnosti docílit je vnesení genů pro tvorbu kompatibilních solutů a osmoprotekčních látek, mezi které patří celá řada sacharidů, které jsou těžištěm i této bakalářské práce.

2. Rostliny a stres Rostliny jsou díky svému přisedlému způsobu života vystaveny měnícím se životním podmínkám. Ty nejsou vždy ideální a mohou rostlinu ve větší či menší míře poškozovat. Působení nepříznivých podmínek (stresorů) označujeme termínem stres. Rostliny si pro to, aby ve svém prostředí vůbec přežily a mohly se dále rozmnožovat musely vyvinout mechanismy chránící je před negativními dopady působení stresorů. Jeden ze způsobů ochrany mající pasivní a trvalejší charakter, jako je silná kutikula bránící ztrátám vody, trny chránící před býložravci nebo syntéza toxických látek aj. označujeme jako avoidanci. Mechanismy aktivní odolnosti, kdy stresové faktory vyvolávají stresovou reakci nazýváme získanou tolerancí. Stresovou reakci můžeme rozdělit na několik etap. Počátek působení stresoru nazýváme poplachovou fází. Ta je následována spuštěním kompenzačních mechanismů tzv. restituční fází vedoucí ke vzniku odolnosti k působení stresového faktoru (fáze rezistence). Při dlouhodobém působení stresového faktoru může dojít až k fázi vyčerpání a následné smrti rostliny. Průběh stresové reakce však závisí na celé řadě faktorů a je dán mimo jiné genetickou dispozicí rostliny a délkou působení stresoru. Působení stresových faktorů však může mít na rostlinu pozitivní dopad, protože

5

je spouštěčem

některých vývojových procesů jako klíčení semen nebo tvorba květních orgánů (Procházka et al., 1998).

Hlavní stresové faktory v přírodě: Abiotické faktory: •

fyzikální -

mechanické účinky větru

-

nadměrné záření (UV, viditelné)

-

extrémní teploty (horko, chlad, mráz)

• chemické -

nedostatek vody (sucho)

-

nedostatek kyslíku (hypoxie, anoxie)

-

nedostatek živin v půdě

-

nadbytek iontů solí a vodíku v půdě

-

toxické kovy a organické látky v půdě

-

toxické plyny

Biotické faktory: •

herbivorní živočichové

•

patogenní mikroorganizmy (viry. mikrobi, houby)

•

vzájemné ovlivňování (alelopatie, parazitizmus)

(Procházka et al., 1998)

6

3. Vodní deficit Voda je pro všechny živé organismy nezbytnou součástí jejich buněk, kde slouží jako rozpouštědlo, transportní médium a donor elektronů. Vodní deficit můžeme definovat jako mírnější formu vodního stresu, při jehož působení dochází v rostlinách pouze k malým změnám v obsahu vody (Bray, 1997). Desikací je míněna ztráta většiny vody z protoplastu, ve kterém zbývá pouze voda pevně asociovaná s buněčnými povrchy. Nedostatek vody může být způsoben více druhy stresových faktorů mezi něž patří sucho, salinita a chladový stres. Její nedostatek vede v rostlinném těle k celé řadě fyziologických změn, zejména zkoncentrování rozpuštěných látek v cytoplazmě, destabilizaci membrán, denaturaci proteinů a ztrátě turgoru. Rostliny si vyvinuly celou řadu anatomických i fyziologických přizpůsobení, jak se důsledkům vodního stresu vyhnout. K avoidanci můžeme zařadit zesílenou kutikulu zabraňující nadměrnému výparu vody, trichomy na povrchu listů, redukci listové plochy, zanořené průduchy v pokožce či prodloužení délky kořenů a zvýšení jejich hustoty pro lepší příjem vody. Získání tolerance k vodnímu stresu je komplexní reakcí zahrnující řadu fyziologických a biochemických změn mezi něž patří akumulace osmolytů, LEA proteinů a také antioxidantů. Rostliny vnímají nedostatek vody v prostředí prostřednictvím ztráty turgoru buněk.

Molekulou zodpovědnou za regulaci exprese mnoha genů zúčastněných

v reakci rostliny na vodní deficit je kyselina abscisová (ABA) (Bray, 1997, Munns. 2002). Ta je syntetizována přes karotenoidovou dráhu. Prvním krokem je štěpení 9´-cis-neoxantinu na intermediát xantoxin. V dalším kroku je

oxidován na ABA-aldehyd konvertovaný na

samotnou kys. abscisovou. Krokem regulovaným osmotickým stresem je právě štěpení 9´-cisneoxantinu na xantoxin (Parry et al., 1992). Navýšení hladiny ABA je zodpovědné za aktivaci mnoha genů, jejichž produkty se uplatňují při reakci na většinu abiotických stresů, někdy i při napadení rostliny patogeny. Expresi většiny těchto genů zajišťuje ABRE element v sekvenci DNA, na který se váže aktivátor transkripce, za jehož vazbu na DNA je zodpovědná zvýšená koncentrace ABA (Baker et al.., 1994). Druhou možností regulace genové exprese je DRE element (dehydration-responsive element), který je alespoň v prvních hodinách dehydratace nezávislý na koncentraci ABA. V pozdních stadiích je však i tento element regulován ABA. (Bray, 1997).

7

Obr. 1: Předpokládané funkce produktů genů indukovaných vodním deficitem. Upraveno podle Bray (1993).

4. Desikace Schopnost odolávat desikaci je u celistvých vyšších rostlin až na některé výjimky (rostliny vzkříšení) poměrně vzácným jevem. Je však rozhodující pro přežití disperzních stadií (semena) a pylových zrn, která musejí odolávat nepříznivým podmínkám prostředí. Bylo zjištěno, že hlavní negativní účinky desikace spočívají v poškození buněčných membrán mající za následek změny v jejich propustnosti. Za fyziologických teplot a plné hydrataci jsou biologické membrány ve stavu tekutého krystalu, který umožňuje laterální pohyb fosfolipidů a integrálních proteinů. Při nízkých teplotách dochází k postupnému tuhnutí membrány až do formy gelu s omezeným laterálním pohybem makromolekul a těsným semknutím alifatických řetězců mastných kyselin v molekulách fosfolipidů. Tím je nevratně porušena integrita membrány způsobující nekontrolovaný únik solutů ven z buňky a rozpad multienzymových komplexů. Teplota přechodu jednoho stavu membrány do druhého (TM) závisí na celé řadě faktorů jako je nasycenost řetězců mastných kyselin, přítomnost sterolů a proteinů v membráně, iontová síla prostředí, a zejména hydratace (Crowe et al., 1992, Bochicchio et al., 1998).

8

tekutá mozaika

gelová fáze

Obr. 2: Modely uspořádání fosfolipidů v membránách v desikovaných pletivech

Dřívější výzkumy cyst žábronožky prokázaly, že schopnost přežít úplné vyschnutí koreluje s akumulací neredukujících disacharidů, zejména trehalózy udržující membrány ve stavu tekutého krystalu i za velmi nízkého obsahu vody. Později bylo zjištěno že jak trehalóza u žábronožky a kvasinek, tak i sacharóza u vyšších rostlin se váží vodíkovými můstky k polárním fosfátovým skupinám fosfolipidů a nahrazují tak molekuly vody. Tato vazba zajišťuje zachování správné hydrofobně-hydrofilní orientace molekul fosfolipidů v membránách. Sacharidy chrání před negativními účinky desikace nejen biologické membrány, ale také proteiny vazbou na polární skupiny pomáhající udržovat jejich terciární strukturu (Crowe et al., 1998). Druhým mechanismem, jak sacharidy chrání buňky před negativními účinky desikace je tvorba skla (Koster, 1991). Tento stav vzniká v rostlinných buňkách vlivem nízkého obsahu vody, kdy se cytoplazma stává vysoce viskózní, dochází k zastavení chemických reakcí vyžadujících difuzi a je zabráněno krystalizaci solutů. Nejdůležitějšími látkami, které umožňují vznik tohoto stavu v rostlinných buňkách jsou sacharidy (sacharóza, rafinóza, stachyóza). V tomto stavu se v buňkách nevytvářejí ledové krystaly ani při velmi nízkých teplotách. Při imbibici se cytoplazma stává opět tekutým roztokem bez jakéhokoliv poškození buněk (Koster a Leopold, 1988).

9

5. Zasolení Zasolení má s vodním stresem mnoho společných rysů. Vyšší koncentrace solí v prostředí způsobuje horší příjem vody rostlinou, následuje zastavení růstu vlivem ztráty turgoru, navíc stoupající koncentrace solí v rostlině působí toxicky a vede k předčasné senescenci a zpomalení fotosyntézy (Munns, 2002). Podle schopnosti růst v zasolených půdách můžeme rostliny rozdělit na halofyty adaptované na vyšší koncentraci soli v prostředí a glykofyty, které naopak zasolení nesnášejí. Halofyty mohou růst dlouhou dobu na zasolených půdách díky minimalizaci příjmu solí z prostředí a zamezení jejich akumulace v cytoplazmě. Bylo zjištěno, že ionty Na+ a Cl- se ukládají ve vakuole, a tak je zabráněno jejich hromadění v cytoplazmě v toxických koncentracích. Pro vyrovnání osmotického tlaku ve vakuole se v cytoplazmě mohou akumulovat ionty K+ a organické soluty jako prolin, betain, glycin, sacharidy aj. (Hasegawa et al., 2000).

6. Chladový stres Chladový stres může být definován jako vystavení rostlin nízkým teplotám neklesajícím pod bod mrazu, kdy se ještě nezačínají vytvářet nukleační centra ledu, tedy zhruba v rozmezí 15 – 0°C. Rozhodující je také doba, po kterou nízké teploty působí. Rostliny obvykle nevykazují zřetelné změny v průběhu působení nízkých teplot, ale obvykle až poté, co jsou vráceny do teplot optimálních pro růst. Prvním příznakem negativního vlivu nízkých teplot je ztráta turgoru vedoucí k zastavení růstu rostliny. Při déletrvajícím působení je znatelné žloutnutí listů, ve kterých dochází k poškození chlorofylu způsobeném fotooxidací. Nejcitlivějším místem na nízké teploty jsou biologické membrány. Dochází u nich k laterální separaci fosfolipidů a vzniku rigidních domén s pevně semknutými řetězci mastných kyselin v jinak fluidní membráně. Tento stav se označuje jako gelová fáze. Její vznik vede k dezintegraci membrány, porušení enzymových komplexů a výtoku solutů z buňky do apoplastického prostoru (Lyons, 1973). Ty se následně mohou stát substrátem pro růst patogenních bakterií a hub, které snáze napadají oslabenou rostlinu. Tekutost biomembrán je z velké části dána mírou nenasycenosti řetězců mastných kyselin fosfolipidů. Bylo zjištěno, že druhy dobře snášející nízké teploty obsahují ve svých membránách větší podíl nenasycených mastných kyselin. Pro zjednodušení můžeme říci, že druhy rostlin z tropického a

10

subtropického pásu mají v membránách vyšší procento nenasycených mastných kyselin, než ty z mírného pásu (Teiz a Zeiger, 2002) Jedním ze symptomů narušení fyziologických funkcí vlivem nízkých teplot je také zastavení proudění cytoplazmy v kořenový vláscích. Stejně jako u všech chemických reakcí se spolu se snižující teplotou zpomaluje rychlost respirace. V některých případech však může naopak docházet k vyšší produkci CO2 vlivem zvýšené respirace a produkci tepla. Zda je vznik tepla krátkodobou ochranou před nízkými teplotami, nebo je to pouze důsledek poškození rostliny není známo (Moynihan et al., 1995). Na rostlinu nemá negativní vliv pouze samotné působení nízkých teplot, ale také následná sekundární produkce volných radikálů, produkovaných zejména v mitochondriích. Tvorba volných radikálů je průvodním jevem působení většiny abiotických i biotických stresových faktorů (Purvis et al., 1995). Proti nim se rostlina brání syntézou antioxidantů (Brunner et al., 1995). Na negativní dopady působení nízkých teplot rostlina reaguje zejména změnami složení membrán a syntézou osmoticky aktivních látek hromadících se v buňkách.

7. Mechanismy navození odolnosti k abiotickým stresům 7.1. Akumulace kompatibilních solutů Syntéza a hromadění kompatibilních solutů, či osmolytů při osmotickém stresu je široce rozšířeným mechanismem téměř u všech živých organismů (Bohnert et al., 1995). Svojí přítomností snižují osmotický potenciál buněk a zabraňují tak nadměrným ztrátám vody. Základní podmínkou pro to, aby se nějaká látka mohla stát kompatibilním solutem je její slučitelnost s biochemickými reakcemi probíhajícími v buňce i při vysokých koncentracích. K osmolytům můžeme řadit sacharidy, prolin, kvartérní amoniové sloučeniny, terciární sulfoniové sloučeniny a polyaminy. Na osmotickém přizpůsobení buněk se také podílejí anorganické ionty jako Na+, K+, Cl- uskladněné ve vakuole (Voetberg a Sharp, 1991). Při osmotickém stresu přispívají často anorganické soluty k poklesu osmotického potenciálu buněk dokonce více než organické, zejména v počáteční fázi reakce rostliny na zasolení (Rodríguez et al., 1997).

11

7.1.1. Sacharóza Sacharóza je asi nejrozšířenějším sacharidem v rostlinné říši. Je hlavním transportním cukrem všech vyšších rostlin bez výjimky, kromě nich se také vyskytuje u řas a některých sinic. Narozdíl od trehalózy, která je svou strukturou velmi podobná, není známa u živočichů ani většiny prokaryot. Její biosyntéza je tak zřejmě evolučně mnohem mladší (Goddijn et al., 1999). Tento disacharid (α-D-glukopyranosyl-β-D-fruktofuranosid) plní v rostlinném těle celou řadu úloh. Jako hlavní transportní sacharid je zdrojem uhlíku a energie, může být také skladována v zásobních orgánech a plodech. Je významnou signální molekulou a v neposlední řadě se podílí na odolnosti k abiotickému stresu (Smeekens, 2000). K akumulaci sacharózy v rostlině dochází v důsledku působení stresových faktorů, mezi něž můžeme zařadit působení nízkých teplot a sucha (Guy et al., 1992). Asi nejmarkantnější nárůst jejího obsahu můžeme zaznamenat u „rostlin vzkříšení“, a při dozrávání ortodoxních semen. V obou případech se účastní osmotického přizpůsobení buněk při regulované ztrátě vody. V buňkách slouží také jako osmoprotektant stabilizující biomembrány interakcí hydroxylových skupin s fosfolipidy. Její

syntéza

probíhá

v cytosolu,

kam

jsou

transportovány

triózy

produkované

v chloroplastech. Sacharóza-6-fosfát vzniká činností sacharózafosfátsyntázy (SPS) z UDPglukózy a fruktóza-6-fosfátu. V dalším kroku je hydrolyzován sacharózafosfátfosfatázou na sacharózu (Salerno a Curatti, 2003). Bylo zjištěno, že oba tyto enzymy spolu zřejmě vytvářejí komplex. (Echeverria et al., 1997).

12

Obr. 4: Metabolizmus sacharózy u vyšších rostlin. Upraveno podle Salerno a Curatti (2003).

7.1.2. Trehalóza Trehalóza

(α-D-glukopyranosyl-[1.1]-α-D-glukopyranosid)

je

široce

rozšířeným

disacharidem izolovaným z mnoha druhů organismů jako jsou bakterie, řasy, houby a někteří bezobratlí (Goddijn a Smeekens, 1998). Zde se uplatňuje v obraně proti působení abiotických stresových faktorů, zejména desikace, mrazu a vysokých teplot. (Müller et al., 1990). Dlouhou dobu se předpokládalo, že cévnaté rostliny ve svých pletivech tento disacharid vůbec nesyntetizují až na dvě výjimky z řady tzv. „rostlin vzkříšení“ – Selaginella lepidophylla a Myrothamnus flabellifolius (Bianchi et al, 1993). Srovnáním sekvencí genů, jejichž produkty jsou enzymy klíčové pro syntézu trehalózy u E. coli a S. cerevisiae byly nalezeny homologické sekvence u A. thaliana, později tabáku, bramboru a slunečnice. Jedná se o

13

trehalóza-6-fosfátsyntázu (TPS) katalyzující vznik trehalóza-6-fosfátu z UDP-glukózy a glukóza-6-fosfátu, ten je v dalším kroku defosforylován na trehalózu enzymem trehalóza-6fosfátfosfatázou (TPP) (Goddijn a Smeekens, 1998). Produkty těchto rostlinných genů exprimovaných v kvasinkách s mutací v genu tps dokonce mohou plně nahradit jeho funkci (Blázquez et al., 1998). Schopnost syntetizovat trehalózu u velkého počtu druhů krytosemenných rostlin ukazuje na evoluční starobylost tohoto znaku. U rostlin však byla její funkce zřejmě nahrazena sacharózou, sacharidem vyskytujícím se pouze u rostlin a některých sinic. Důvodem proč nikdy nebyla trehalóza v pletivech rostlin zjištěna ve větším množství je zřejmě dáno vysokou aktivitou trehalázy – enzymu zajišťujícímu její hydrolýzu. To potvrzují experimenty s rostlinami tabáku a bramboru ošetřenými inhibitorem trehalázy validamycinem A, ve kterých bylo zjištěno malé množství akumulované trehalózy. U rostlin A. thaliana vedla inhibice trehalázy k výraznému snížení obsahu sacharózy a škrobu (Goddijn et al., 1997). Vzhledem k příliš nízkým koncentracím trehalózy v rostlinách je nepravděpodobné, že by měla významnou roli v obraně proti stresu. Hypotetickou funkcí trehalózy je zřejmě regulace růstu a vývoje rostlinného těla (Wu a Garg, 2003). Bylo zjištěno, že trehalóza-6-fosfát inhibuje hexokinázovou aktivitu (HXK2) a může tak ovlivňovat tok glukózy v glykolýze. Hexokináza je zřejmě u rostlin, podobně jako u kvasinek a živočichů důležitou součástí signální dráhy vedoucí k regulaci exprese některých genů, v této problematice je však stále mnoho nejasností (Goddijn et al., 1998). Přestože rostliny podobně jako jiné organismy obsahují ve svém genomu geny pro syntézu enzymů nezbytných pro biosyntézu trehalózy, nedochází však k akumulaci jejich produktů. Přestože funkce trehalózy v rostlinách není přesně známa a její nadprodukce v transgenních rostlinách způsobuje rozsáhlé změny v metabolismu vedoucí k zastavení růstu, ukazuje se že vnesení genů umožňujících její syntézu pod stresově inducibilním promotorem minimalizuje její negativní dopad na růst a produkci. Rýže transformovaná fúzním genem (TPSP) pro TPS a TPP vystavená 100 mM koncentraci NaCl vykazovala intenzivní růst stonků i kořenů, naproti tomu kontrolní netransformované rostliny usychaly vlivem poškození způsobeném vysokou koncentrací iontů. Transformované rostliny měly v cytoplazmě mnohem menší koncentraci Na+ což může být dáno jejich rychlejším růstem, nebo přímým působením trehalózy na vylučování Na+ z buňky. Také si zachovaly vyšší intracelulární koncentraci K+ oproti kontrole. Kromě těchto charakteristik byly transformanty odolnější vůči suchu (Garg et al., 2002). Z uvedených experimentů vyplývá, že trehalóza produkovaná řízeně v rostlinách pomocí orgánově, či stresem indukovaného promotoru může významně zvýšit odolnost k abiotickému stresu a zlepšit tak výnosnost hospodářsky významných plodin. 14

7.1.3. Cukerné alkoholy Cukerné alkoholy jsou vysoce hydroxylované lineární (polyoly), nebo cyklické (cyklitoly) molekuly, vykonávající v rostlinách rozmanité funkce. Mnoho rostlin produkuje tyto látky vedle sacharózy jako primární fotosyntetické produkty (Stoop et al, 1996). Ty jsou dále využívány k transportu na dlouhé vzdálenosti, účastní se osmotického přizpůsobení buněk při působení osmotického stresu, mají schopnost vázat se na makromolekuly, a simulovat tak hydratační obaly vody a v neposlední řadě se mohou uplatňovat jako zhášeče volných radikálů (Smirnoff a Cumbes, 1989). Zajímavou vlastností některých polyolů, je schopnost tvořit komplexy s bórem a podílet se na jeho transportu. U většiny rostlin je bór ukládán v listech, odkud není trasnslokován. To neplatí u druhů produkujících cukerné alkoholy, zejména sorbitol a manitol. U některých růžovitých (Rosaceae) a celeru byly zjištěny komplexy sorbitol-bór-sorbitol nebo analogicky manitol-bór-manitol volně transportovatelné floémem (Bellaloui et al., 1999). Z výše uvedených vlastností je zřejmá jejich významná úloha v toleranci rostlin k abiotickému stresu a cukerné alkoholy se proto staly středem zájmu genových inženýrů ve snaze získat kultivary zemědělsky významných plodin snášející abiotický stres (Bohnert a Jensen, 1996).

7.1.3.1. Manitol Asi nejrozšířenějším a také nejvíce studovaným cukerným alkoholem v rostlinách je manitol. Jeho syntéza byla zjištěna u prokaryot, mnoha druhů řas, hub a více než 100 druhů vyšších rostlin, zejména z čeledí Rubiaceae (kávovník), Oleaceae (oliva, jasan) a Apiaceae, včetně některých zemědělských plodin – např. celer, mrkev. Zajímavá je jeho přítomnost u parazitických rostlin (Orobanche, Striga) (Stoop et al., 1996, Fer et al., 1993). Jedná se o šestiuhlíkatou redukovanou formu manózy. Prekurzory pro jeho syntézu jsou, podobně jako u sacharózy, triózafosfáty dávající vznik fruktóza-6-fosfátu, v dalším kroku izomerovaném na manóza-6-fosfát.

Ten

je

následně

NADPH-dependentní

manóza-6-fosfátreduktázou

redukován na manitol-1-fosfát, v posledním kroku defosforylovaném na manitol (Gao a Loescher, 2000).

15

Obr. 3: Biosyntéza, transport a katabolizmus manitolu v rostlinách. 1 – fosfomanózaizomeráza; 2 – manóza-1-fosfátfosfatáza; 3 – hexokináza; 4 – sacharóza-6-fosfátsyntáza; 5 – sacharóza-6-fosfátfosfatáza; 6 – nereverzibilní triózafosfátdehydrogenáza. Upraveno podle Stoop et al. (1996).

Většina dat o metabolizmu a úloze manitolu v rostlině byla získána na celeru (Apium graveolens), jako jeho významném producentu. Bylo zjištěno že až 50 % asimilovaného CO2 je inkorporováno právě do manitolu, zbývající polovina je využita k syntéze sacharózy (Stoop a Pharr, 1994). Ten je z fotosynteticky aktivních pletiv trasnportován floémem do sinku, kde může být přímo metabolizován, nebo ukládán do zásoby (Pharr et al., 1995). Do floému přechází zřejmě přes specifický přenašeč AgMaT1 (Noiraud et al., 2001). V místech sinku je katabolizován pomocí NAD-dependentní manitoldehydrogenázy (MTD) na manózu. Ta je dále fosforylována na manóza-6-fosfát a konečně pomocí fosfomanózaizomerázy izomerována na fruktóza-6-fosfát. Lokalizace MTD v aktivně rostoucích pletivech s vysokými energetickými nároky, tedy místech s nízkým obsahem hexóz, jako je kořenová

16

špička či apikální meristém, ale také sítkové elementy floému nebo řapíky podporuje domněnku, že lokalizace MTD je regulována přítomností hexóz (Fellman a Loescher, 1987). Soudí se, že exprese MTD v pletivech je reprimována hexokinázovou signální drahou podobně jako některé geny účastnící se fotosyntézy. Krokem spouštějícím dráhu vedoucí k potlačení transkripce daného genu je fosforylace hexózy (nejčastěji glukózy) za pomocí hexokinázy. Rozhodující hodnotou pro cukernou represi zřejmě není samotná koncentrace hexóz, ale spíše vazba hexózy na enzym, a její tok hexokinázovou reakcí (Prata et al., 1997). Represe syntézy MTD tak umožňuje efektivně nakládat s manitolem a pro udržení metabolismu za běžných podmínek využívat energii z ostatních sacharidů, zejména sacharózy. Katabolizmus manitolu je omezen na místa s vysokými energetickými nároky, kde je zásobení hexózami nedostačující (Zamski et al., 2001). Utilizace manitolu přináší rostlině výhodu vyššího energetického zisku díky NADH vznikajícímu činností MTD. Manitol se také může akumulovat v pletivech, kde se pro své osmoprotektivní vlastnosti uplatňuje v toleranci k abiotickému stresu (Pharr et al., 1995). U celeru se uplatňuje zejména při stresu vyvolaném zasolením jako kompatibilní solut (Stoop et al., 1996). Při vystavení rostlin vyšší koncentraci solí dochází k represi MTD a následnému ukládání nemetabolizovaného manitolu. Funkci manitolu jako kompatibilního solutu podporují experimenty prováděné s rostlinami celeru pěstovaných in vitro na médiu obsahujícím výhradně sacharózu jako zdroj uhlíku, které byly srovnávány s kulturami pěstovanými na manitolu. Kultury pěstované na sacharóze obsahovaly téměř výhradně sacharózu a hexózy, ale žádný manitol, u buněk rostlin pěstovaných na manitolu to bylo naopak. Tyto rozdíly mohou být důsledkem nižšího osmotického potenciálu média s manitolem oproti médiu s ekvivalentní koncentrací sacharózy, představující pro buňky větší osmotický stres, který potlačuje degradaci manitolu (Vítová et al., 2001). Buňky celeru obsahující manitol, které byly vystaveny vyšší koncentraci NaCl, vykazovaly dvakrát vyšší toleranci k inhibici růstu způsobené ionty, než ty které obsahovaly pouze sacharózu. Přestože příspěvek k osmotickému potenciálu byl u sacharózy i manitolu podobný, je zřejmé, že manitol působí spíše jako osmoprotektant, než pouhý osmolyt (Stoop a Pharr, 1994). Akumulaci manitolu jako reakci na abiotický stres však není možné zobecnit pro všechny druhy rostlin, které jej produkují. Při porovnávání 4 různých druhů rostlin z čeledi Oleaceae rostoucích na Sicílii – Fraxinus ornus, Fraxinus angustifolia, Olea europaea a Phillyrea media byla zkoumána závislost obsahu manitolu na ročním úhrnu srážek a teplotním průměru. U obou druhů jasanu patřících mezi opadavé dřeviny byl zjištěn významný nárůst obsahu manitolu v průběhu období s nízkým úhrnem srážek, s maximální hodnotou na konci léta, kdy je vodní deficit největší. S nástupem 17

srážek jeho obsah rychle klesá. Naproti tomu vždyzelené dřeviny Olea a Phillyrea nevykazovaly žádné významnější výkyvy hladiny manitolu v průběhu roku. U žádné ze 4 druhů rostlin nebyl zjištěn jakýkoliv přímý vliv teploty. Jak je z výše uvedených výsledků patrné, přestože uvedené rostliny mají genetickou výbavu umožňující biosyntézu manitolu, jeho využití u opadavých a vždyzelených druhů je odlišné v rámci jedné čeledi (Oddo et al., 2002). Další významnou funkcí manitolu při abiotickém stresu je zhášení volných radikálů. Reaktivní formy kyslíku (ROS), mezi něž patří superoxid, peroxid vodíku a hydroxylové radikály vznikají v chloroplastech ve velkém množství zejména v důsledku působení stresu vyvolaného suchem a nízkými teplotami. Nejreaktivnější z nich, hydroxylový radikál, vzniká Haber-Weissovou nebo Fentonovou reakcí při interakci H2O2 a superoxidu nebo přímo z H2O2 v přítomnosti kovových iontů Fe2+ a Cu2+ (Shen et al., 1997). Bylo zjištěno, že rostliny tabáku transformované genem pro manitol-1-fosfát dehydrogenázu s expresí směrovanou do chloroplastu jsou odolnější vůči oxidativnímu poškození způsobenému hydroxylovými radikály. Manitol zřejmě chrání thiolem regulované enzymy Calvinova cyklu, které jsou na poškození hydroxylovými radikály vysoce citlivé. Jak přesně manitol s ROS reaguje není dosud zcela zřejmé (Shen et al., 1997) . Z uvedených vlastností vyplývá, že biosyntéza manitolu je vhodným kandidátem pro vývoj kultivarů hospodářsky významných plodin odolných k abiotickému stresu. Transformace rostlin tabáku genem mt1D vyvolala vyšší odolnost k osmotickému stresu – zasolení a nadměrné ztrátě vody. Transgenní rostliny byly za nestresových podmínek menšího vzrůstu než divoký typ, ale po vystavení vyšší koncentraci NaCl u nich nebyla zaznamenána redukce suché hmotnosti, zatímco kontrolní ztrácely zhruba polovinu suché hmotnosti. Měřením osmotického potenciálu bylo zjištěno, že manitol přispívá k poklesu osmotického potenciálu pouze 30-40 %. I když je manitol pouze minoritním osmolytem, jeho přítomnost je spojena s osmotickým přizpůsobením buněk. Je to způsobeno soluty přítomnými ve vakuole, zejména ionty Na+ a Cl-, ty vyrovnávají osmotický potenciál manitolu v cytoplazmě. Dále se na osmotickém potenciálu podílejí ionty K+ a zvýšená koncentrace fruktózy u transforomovaných rostlin. Přestože rostliny tabáku přirozeně produkují inositol, který je manitolu velmi podobný, jeho akumulace není spojena s vyšší tolerancí k osmotickému stresu. To je dáno cyklickou strukturou inositolu s hůře přístupnými hydroxylovými skupinami pro interakci s membránovými fosfolipidy (Karakas et al., 1997). Poslední výzkumy naznačují, že se manitol uplatňuje také v odpovědi na napadení rostliny patogeny. Porovnávání databází ukázalo značnou míru homologie sekvence MTD s 18

proteinem ELI3 patřícím mezi proteiny, jejichž exprese je klíčová v rezistenci vůči patogenům (PR proteiny). Domněnku, že MTD by mohla být jedním z PR proteinů podporují experimenty s ošetřením kys. salicylovou, látkou produkovanou rostlinou jako odpověď na napadení patogenem. U takto ošetřených rostlin došlo kromě jiných změn k výraznému nárůstu aktivity MTD (Williamson et al., 1995). Přestože role MTD v reakci na biotický stres není zcela známa, její hypotetická fukce pravděpodobně vyplývá z antioxidačních vlastností manitolu. Jedním z obranných mechanismů využívaných rostlinou při napadení patogeny je zvýšení produkce ROS, které zprostředkovávají hypersenzitivní reakci v místě infekce a působí toxicky na patogenní organismy (Sutherland, 1991). Přítomnost manitolu by tak byla v rozporu s produkcí radikálů a zvýšená aktivita MTD umožňuje jeho efektivní odstranění. Je zajímavé, že některé patogenní houby po proniknutí do hostitele samy produkují manitol, který je tak může chránit před obrannou reakcí rostliny (Joosten et al., 1990).

7.1.3.2. Sorbitol O tomto cukerném alkoholu je známo mnohem méně údajů než o manitolu. Sorbitol je rozšířeným metabolitem především u růžovitých (Rosaceae), zde byl zjištěn u jabloně, hrušně a meruňky, dále také u jitrocele (Plantago) (Moing et al., 1992, Ahdam et al., 1979). Sorbitol je syntetizován v aktivně fotosyntetizujících pletivech, odkud je transportován floémem do sinku. Jeho biosyntéza připomíná syntézu manitolu. Sorbitol-6-fosfát vznikající z glukóza-6fosfátu činností NAD-dependentní aldóza-6-fosfátreduktázy (A6PR) je v posledním kroku defosforylován fosfatázou na sorbitol (Williamson et al., 2002). Jeho syntéza byla podrobněji studována u jabloně, ve které tvoří většinu rozpustných sacharidů, druhým majoritním sacharidem je sacharóza. Při vystavení rostlin vodnímu deficitu došlo ke zvýšení poměru sorbitol : sacharóza ve srovnání s nestresovanými rostlinami. Autoři předpokládají, že rozdíly jsou dané zvýšenou aktivitou A6PR a inhibicí SPS vlivem vodního deficitu (Wang et al., 1996). Využitelnost sorbitolu pro zvýšení tolerance k abiotickému stresu je však diskutabilní. Transgenní rostliny tabáku transformované genem pro sorbitol-6-fosfát dehydrogenázu akumulující větší množství sorbitolu v pletivech vykazovaly nekrotické poškození listů a byly sterilní (Sheleva et al., 1998).

19

7.1.3.3. Inositol Tento nejjednodušší cyklický hexitol je široce rozšířen jak v rostlinné, tak živočišné říši. Rostlinami je využíván jako substrát pro vznik metylovaných derivátů – D-ononitolu (1-D-4O-methyl-myo-inositol) a D-pinitolu (1-D-3-O-metyl-chiro-inositol). Cyklitoly byly zjištěny u řady rostlin mezi něž patří sukulentní Mesembryanthemum crystallinum, tropické luštěniny, Acrostichum aureum z mangrovových porostů a borovice (Pinus pinaster). Inositol se také účastní vzniku sacharidů rafinózové řady. Biosyntetická dráha inositolu začíná glukóza-6fosfátem konvertovaným inositol-1-fosfátsyntázou na inositol-1-fosfát. Ten je za pomocí inositol-1-fosfátfosfatázy defosforylován na samotný inositol (Ishitani et al., 1996). Inositol se v buňce účastní celé řady procesů, mezi které patří buněčná signalizace, úloha při osmotickém přizpůsobení a zhášení volných radikálů. Při vystavení rostlin abiotickému stresu jsou produkty metylace inositolu využívány k osmotickému přizpůsobení buněk. Tabák transformovaný genem pro inositol-o-metyltransferázu účastnící se biosyntézy ononitolu byl odolnější k suchu a zasolení (Sheleva et al., 1998). Inositol se také ve velkém množství vyskytuje v semenech rostlin. Je součástí galaktinolu, který slouží jako donor galaktózy pro biosyntézu sacharidů rafinózové řady (Kuo et al., 1993).

7.1.4. RFO Sacharidy rafinózové řady, mezi něž patří rafinóza, stachyóza, verbaskóza a ajugóza jsou α-galaktosyl deriváty sacharózy. Jedná se o vůbec nejrozšířenější oligosacharidy v rostlinách, z nichž nejhojnější je stachyóza následovaná rafinózou, verbaskózou a poměrně vzácnou ajugózou. Rostlinami jsou využívány především jako transportní formy uhlíku. RFO s vyšším počtem monomerů jsou ukládány zejména v zásobních orgánech a listech. K syntéze stachyózy, hlavního transportního sacharidu u Ajuga reptans dochází v průvodních buňkách sítkovic ze sacharózy difundující z mezofylu přes plazmodezmy. Z těchto buněk stachyóza nemůže difundovat zpět, protože její molekula je větší než je průměr póru plazmodezmů. Stachyóza tak po spádu koncentračního gradientu přechází do sítkovic. Druhým místem syntézy stachyózy jsou buňky mezofylu, odkud nemůže být transportována, a tak se zde akumuluje. Oba tyto pooly, jak zásobní tak transportní jsou od sebe odděleny (Bachmann a Keller, 1995). Biosyntéza RFO probíhá v buňce z části v cytoplazmě a ve vakuole. Počátečním krokem syntézy RFO je reakce mezi UDP-galaktózou a myo-inositolem zprostředkovaná galaktinolsyntázou (GS) za vzniku galaktinolu. Připojením galaktosylu

20

k sacharóze za účasti rafinózasyntázy (RS) vzniká rafinóza, na kterou může být napojen další galaktosyl za vzniku stachyózy aktivitou stachyózasyntázy (STS). Do tohoto bodu probíhá biosyntéza v cytoplazmě, odkud je stachyóza transportována proti koncentračnímu gradientu, zřejmě H+ antiportem (Greuert a Keller, 1993). Ve vakuole probíhá za účasti galaktan:galaktan galaktosyltransferázy (GGT) syntéza vyšších homologů RFO, zřejmě z důvodu nižšího pH optima této reakce. Tato biosyntéza je analogická k syntéze fruktanů probíhající také ve vakuole za účasti fruktan:fruktan fruktosyltransferázy (Bachmann a Keller, 1995).

Obr. 5: Metabolismus RFO v listu Ajuga reptans. Upraveno podle Bachmann a Keller (1995).

Kromě zdroje uhlíku a energie poskytují RFO rostlině vyšší odolnost vůči chladu. Rafinóza akumulovaná v cytoplazmě může fungovat jako kryoprotektant, váže se na proteiny a biomembrány a zabraňuje tak jejich poškození nízkými teplotami, v neposlední řadě zamezuje krystalizaci sacharózy (Caffrey et al., 1988). Polymerizace a katabolizmus RFO může také měnit osmotický potenciál vakuoly ovlivňující turgor (Bieleski, 1993). RFO jsou výrazně zastoupeny v ortodoxních semenech rostlin, v nichž se hromadí zejména v embryu, aleuronové vrstvě obilnin a dělohách, tedy částech které musí zůstat živé v průběhu desikace

21

(Horbowicz a Obendorf, 1994). K jejich akumulaci dochází v pozdních stadiích vývoje a je to právě jejich koncentrace, nikoliv obsah samotné sacharózy, která ovlivňuje životnost semen. Ne všude je odolnost vůči stresu spojena s vyšší odolností vůči stresu. U Coleus blumei bylo zjištěno, že působením sucha dochází spolu s poklesem fotosyntetické aktivity také k redukci galaktinolsyntázové aktivity a tím poklesu produkce RFO (Pattangul a Madore, 1999).

7.1.5. Fruktany Fruktany jsou polymery fruktózy produkované asi 15 procenty rostlinných druhů. Vedle škrobu jsou hlavními zásobními sacharidy u čeledí Poaceae, Liliaceae a Asteraceae. Délka polyfruktózových řetězců se pohybuje od 10 do 200 fruktózových podjednotek. Jejich délka není dána pouze druhovou specifitou, ale je také ovlivňována vnějšími faktory prostředí (Pilon-Smits et al., 1995). Biosyntéza fruktanů v rostlinách zahrnuje více než 2 enzymy, narozdíl od bakterií, které si vystačí pouze s jedním. Klíčovým bodem je enzym katalyzující syntézu trisacharidu glukóza-fruktóza-fruktóza. Ten je v dalších krocích prodlužován přidáváním dalších fruktózových podjednotek působením fruktan:fruktan fruktosyltransferázy podobně jako tomu je u RFO (Pollock a Cairns, 1991). Fruktany ukládané ve vakuole jsou ve vodě rozpustné, narozdíl od nerozpustného škrobu v plastidech. I přes svoji rozpustnost se fruktany mohou účastnit osmotického přizpůsobení buněk vlivem regulace délky řetězce (Bieleski, 1993). Mohou také hrát roli v toleranci k chladu a suchu (Pollock, 1986). Jejich úloha v reakci na vodní stres není zcela zřejmá. Transgenní tabák transformovaný bakteriálním genem pro levansacharázu vykazoval vyšší odolnost k působení vodního stresu, ale koncentrace fruktanů v listech byla příliš nízká na to, aby fungovaly jako osmotikum. Autoři se domnívají, že fruktany mohou chránit membrány a makromolekuly před negativními dopady vodního stresu, nebo akumulace fruktanů může vyvolat zvýšení produkce strukturních sacharidů vedoucí ke zpevnění buněčné stěny. Dalším možným vysvětlením je vliv fruktanů na větvení kořínků, zvyšující tak jejich povrch umožňující lepší příjem vody (Pilon-Smits et al., 1995). Experimenty in vitro ukazují, že fruktany mohou interagovat s fosfolipidy a zabraňovat tak tuhnutí membrán, nejčastější příčině poškození buněk působením chladového stresu (Hincha et al., 2000).

22

7.2. LEA proteiny LEA proteiny jsou velkou skupinou proteinů, které se akumulují v pozdní fázi embryogeneze zejména v semenech, nebo v odpovědi na dehydrataci, působení nízkých teplot a zasolení ve vegetativních pletivech. Tyto proteiny jsou vysoce hydrofilní a dobře rozpustné ve vodě. Jejich úloha spočívá zřejmě v ochraně buněčných struktur (membrán, proteinů) před negativními dopady dehydratace, mohou také fungovat jako chaperony a sekvestrovat ionty. LEA proteiny můžeme rozdělit do 5 skupin podle jejich charakteristických motivů. Skupina 1 obsahuje ve své sekvenci typický 20 aminokyselinový motiv. Skupina 2 nazývaná také dehydriny obsahuje 15 aminokyselinový motiv bohatý na lysin, formující amfipatický α-helix, následovaný serinovými zbytky a konzervovanou sekvencí DEYGNP na N-terminálním konci. Skupina 3 je charakterizována 11 aminokyselinovým peptidem tvořícím amfipatický αhelix umožňující intra- a intermolekulární interakce. Skupina 4 obsahuje na N-terminálním konci konzervativní sekvenci α-helixů a konečně skupina 5 obsahující hydrofobní zbytky (Bray, 1993).

7.3. Ostatní mechanismy K dalším mechanismům umožňujících rostlině minimalizovat účinky vodního stresu patří indukce syntézy nespecifických proteinů transportujících lipidy, podílejících se na zesílení kutikuly. Vodním deficitem a působením ABA jsou také indukovány některé geny pro akvaporiny, regulující propustnost membrán pro vodu. Akvaporiny samotné jsou regulovány fosforylací řízenou vodním potenciálem v apoplastu. Při vodním deficitu dochází k jejich defosforylaci a snížení propustnosti pro vodu a zamezení jejích nadměrných ztrát (Maurel a Chrispeels, 2001). Také dochází k expresi inhibitorů proteáz, které zřejmě brání degradaci proteinů důležitých pro stresovou reakci a chaperonů nezbytných pro zachování terciární struktury proteinů. Aby nedocházelo k oxidačnímu poškození proteinů ROS, které vznikají působením abiotických stresových faktorů, akumulují se enzymy a antioxidanty odstraňující tyto radikály. Zhášení volných radikálů se účastní i některé kompatibilní soluty (zejména polyoly). Vzhledem k tomu, že vodní deficit způsobuje poškození proteinů, jako je jejich deaminace, jsou také produkovány proteiny účastnící se jejich oprav (Mudgett a Clarke, 1994).

23

8. Závěr Problematika rostlinného stresu je značně komplexní a stále v ní zůstává mnoho nejasností. Jednou z možností, jak rostliny mohou předcházet negativním účinkům působení stresových faktorů je syntéza a akumulace kompatibilních solutů, jejichž významnou složkou jsou sacharidy. Tato bakalářská práce je zaměřena především na shrnutí dosavadních základních poznatků o úloze sacharidů při abiotickém stresu u rostlin. Některé z těchto poznatků mohou být aplikovány v bioinženýrství při šlechtění nových odolnějších odrůd hospodářsky významných rostlin. V dané problematice však stále zůstává mnoho nezodpovězených otázek a výzkum v této oblasti rostlinné fyziologie může přinést zajímavé poznatky o funkční integritě rostlinného těla a interakcích rostliny s prostředím.

24

Seznam použité literatury Ahdam, I., Larher, F., Stewart, G.R. (1979). Sorbitol, a compatible osmotic solute in Plantago maritima. New Phytol 82: 671-678 Bachmann, M., Keller, F. (1995). Metabolism of the raffinose family oligosaccharides in leaves of Ajuga reptans L. Inter- and intracellular compartmentation. Plant Physiol. 109: 991-998 Baker, S.S., Wilhelm, K.S., Thomashow, M.F. (1994). The 5´-region of Arabidopsis thaliana cor15a has cis-acting elements that confer cold-, drought- and ABA-regulated gene expression, Plant Mol. Biol. 24: 701-703 Bellaloui, N., Brown, P.H., Dandekar, A.M. (1999). Manipulation of in vivo sorbitol production alters boron uptake and transport in tobacco. Plant Physiol. 119: 735-741 Bieleski, R.L. (1993). Fructan hydrolysis drives petal expansion in the ephemeral daylily flower. Plant Physiol. 103: 213-219 Blázquez, M.A., Santos, E., Flores, C.L., Martínez-Zapater, J.M., Salinas, J., Gancedo, C. (1998). Isolation and molecualr characterization of the Arabidopsis TPS1 gene, encoding Tre-6-phosphate synthase. Plant J. 13: 685-690 Bohnert, H.J., Nelson, D.E., Jensen, R.G. (1995): Adaptation to environmental stress. Plant Cell 7: 1099-1111 Bohnert, H.J., Jensen, R.G. (1996). Strategies for engineering water stress tolerance in plants. Trends Biotechnol. 14: 89-97 Bochicchio, A., Vazzana, C., Puliga, S., Alberti, A., Cinganelli, S., Vernieri, P. (1998). Moisture content of the dried leaf is critical to dessication tolerance in detached leaves of the ressurection plant Boea hygroscopica. Plant Growth Regulation 24: 163-170 Bray, E.A. (1993). Molecular responses to water deficit. Plant Physiol. 103: 1035-1040 Bray, E.A. (1997). Plant responses to water deficit. Trends in Plant Science 2(2): 48-55 Brunner, M., Kocsy, G., Ruegsegger, A., Schmutz, D., Brunold, C. (1995). Effect of chilling on assimilatory sulfate reduction and glutathione synthesis in maize. J. Plant Physiol. 146: 743-747 Caffrey, M., Fonseca, V., Leopold, C. (1988) Lipid-sugar interactions. Plant Physiol. 86: 754758 Crowe, J.H., Hoekstra, F.A., Crowe, L.M. (1992). Anhydrobiosis. Annu. Rev. Physiol. 54: 579-599 Crowe, J. H., Carpenter, J. F., and Crowe, L. M. (1998). The role of vitrification in anhydrobiosis. Annu. Rev. Physiol. 60: 73-103 Echeverria, E., Salvucci, M.E., Gonzales, P., Paris, G., Salerno, G. (1997). Physical and kinetic evidence for an association between sucrose-phosphate synthase and sucrosephosphate phosphatase. Plant Physiol. 115: 223-227 Fellman, J.K., Loescher, W.H. (1987). Comparative studies of sucrose and mannitol utilization in celery (Apium graveolens). Physiol. Plantarum 69: 337-341 Fer, A. Simier, P., Arnaud, M.C., Rey, L., Renaudin, S. (1993). Carbon acquisition and metabolism in a root hemiparasitic angiosperm, Thesium humile (Santalaceae) growing on wheat (Triticum vulgare). Aust. J. Plant Physiol. 20: 15-24 Gao, Z., Loescher, W.H. (2000). NADPH supply and mannitol biosynthesis. Characterization, cloning, and regulation of the non-reversible glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in celery leaves. Plant Physiol. 124: 321-330 Garg, A.K. et al. (2002). Trehalose accumulation in rice plants confers high tolerance levels to different abiotic stresses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 15898-15903

25

Goddijn, O.J., Verwoerd, T.C., Voogd, E., Krutwagen, R.W., de Graaf, P.T., van Dun, K., Poels, J., Ponstein, A.S., Damm, B., Pen, J. (1997). Inhibition of trehalase activity enhances trehalose accumulation in transgenic plants. Plant Physiol. 113: 181-190 Goddijn, O., Smeekens, S. (1998). Sensing trehalose biosynthesis in plants. The Plant J. 14(2): 143-146 Goddijn, O.J.M., van Dun, K. (1999). Trehalose metabolism in plants. Trends in Plant Science 4(8): 315-319 Greuert, H., Keller, F. (1993). Further evidence for stachyose and sucrose/H+ antiporters on the tonoplast of Japanese artichoke (Stachys sieboldii) tubers. Plant Physiol. 101: 13171322 Guy, C.L., Huber, J.L.A., Huber, S.C. (1992). Sucrose phosphate synthase and sucrose accumulation at low temperature. Plant Physiol. 100: 502-508 Hasegawa, P.M.,Bressan, R.A., Zhu, J.-K., Bohnert, H.J. (2000). Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Bilogy 51: 463-499 Hincha, D.K., Hellwege, E.M., Heyer, A.G., Crowe, J.H. (2000). Plant fructans stabilize phosphatidylcholine liposomes during freeze-drying, Eur. J. Biochem. 267: 535-540 Horbowicz, M., Obendorf, R.L. (1994). Seed desiccation tolerance and storability: Dependence on flatulence-producing oligosaccharides and cyclitols. Seed Science Research 4: 385-405 Ishitani, M., Majumder, A.L., Bornhouser, A., Michalowski, C.B., Jensen, R.G., Bohnert, H.J. (1996). Coordinate transcriptional induction of myo-inositol metabolism during environmental stress. Plant Journal 9: 537-548 Joosten, M.H.A.J., Hendricks, L.J.M., de Wit, P.J.G.M. (1990) Carbohydrate composition of apoplastic fluids isolated from tomato leaves inoculated with virulent or avirulent races of Cladosporium fulvum. Neth. J. Plant Pathol. 96: 103-112 Karakas, B., Ozias-Akins, P., Stushnoff, C., Suefferheld, M., Rieger, M. (1997) Salinity and drought tolerance of mannitol-accumulating transgenic tobacco. Plant Cell and Enviroment 20: 609-616 Koster, K.L., Leopold, A.C. (1988). Sugars and dessication tolerance in seeds. Plant Physiol. 88: 829-832 Kuo, T.M., Lowell, C.A., Doehlert, D.C., Wolf, W.J. (1993). Enzymatic activities associated with soluble oligosaccharide changes in the cotyledon and embryonic axis of germinating soybean (Glycine max) seeds. Plant Physiol. 93: 1514-1520 Lyons, J. M. (1973) Chilling injury in plants. Ann .Rev. Plant Physiol.: 445-466 Maurel, C., Chrispeels, M.J. (2001). Aquaporins. A molecular entry into plant water relations. Plant Physiol. 125 : 135-138 Moing, A., Carbonne, F., Rashad, M.H., Gaudillére, J.P. (1992). Carbon fluxes in mature peach leaves. Plant Physiol. 100: 1878-1884 Moynihan, M. R., Ordentlich, A., Raskin, I. (1995). Chilling-induced heat evolution in plants. Plant Physiol. 108: 995-999 Mudgett, M.B., Clarke, S. (1994). Hormonal and environmental responsiveness of a developmentally regulated protein repair L-isoaspartyl methyltransferase in wheat. J. Biol. Chem. 269: 25605-25612 Müller, J., Aeschbacher, R., Sprenger, N., Boller, T., Wiemken, A. (1995). Trehalose and trehalase in plants: recent developments. Plant Sci. 112: 1-9 Munns, R. (2002). Comparative physiology of salt and water stress. Plant, Cell and Environment 25: 239-250 Noiraud, N., Maurousset, L., Lemoine, R. (2001). Transport of polyols in higher plants. Plant Physiol. Biochem. 39: 717-728

26

Oddo, E., Saiano, F., Alonzo, G., Bellini, E. (2002). An investigation of the seasonal pattern of mannitol content in deciduous and evergreen species of the Oleaceae growing in Norther Sicily. Annals of Botany 90: 239-243 Parry, A.D., Griffiths, A., Horgan, R. (1992). Abscisic acid biosynthesis in roots II The effects of water-stress in wild-type and abscisic-acid-deficient mutant (notabilis) plants of Lycopersicon esculentum Mill. Planta 187: 192-197 Pattangul, W., Madore, M.A. (1999). Water deficit effects on raffinose family oligosaccharide metabolism in Coleus. Plant Physiol. 121: 987-993Teiz, L., Zeiger, E. (2002). Stress Physiology. Plant Physiology: 607-608 Pharr, D.M., Stoop, J.M.H., Williamson, J.D., Feusi, M.E.S., Nassel, M.O., Conkling, M.A. (1995). The dual role of mannitol as osmoprotectant and photoassimilate in celery. HortScience 30 (6): 1182-1188 Pilon-Smits, E.A.H., Ebskamp, M.J.M., Paul, M.J., Jeuken, M.J.W., Weisbeek, P.J., Smeekens, S.C.M. (1995). Improved performance of transgenic fructan-accumulating tobacco under drought stress. Plant Physiol. 107: 125-130 Pollock, C.J., Cairns, A.J., (1991). Fructan metabolism in grasses and cereals. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 77-101 Pollock, C.J. (1986). Fructans and the metabolism of sucrose in vascular plants. New Phytol. 104: 1-24 Prata, R.T.N., Williamson, J.D., Conkling, M.A., Pharr, D.M. (1997). Sugar repression of mannitol dehydrogenase activity in celery cells. Plant Physiol. 114: 307-314 Purvis, A.C., Shewfelt, R.L., Gegogeine, J.W. (1995). Superoxide production by mitochondria isolated from green bell pepper fruit. Physiol. Plant 94: 743-749 Rodríguez, H.G., Justin, K.M.R., Wayne, R.J., Malcolm, C.D. (1997). Growth, water relations, and accumulation of organic and inorganic solutes in roots of maize seedlings during salt stress. Plant Physiol. 113: 881-893 Salerno, G.L., Curatti, L. (2003). Origin of sucrose metabolism in higher plants: When, how, and why? Trends in Plant Science 8(2): 63-69 Sheleva, E.V., Marquez, S., Chmara, W., Zegeer, A., Jensen, R.G., Bohnert, H.J. (1998). Plant Physiol. 117: 831-839 Shen, B., Jensen, R.G., Bohnert, H.J. (1997). Increased resistance to oxidative stress in transgenic plants by targeting mannitol biosynthesis to chloroplast. Plant Physiol. 113: 1177-1183 Smeekens, S. (2000). Sugar-induced signal transduction in plants. Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51: 49-81 Schmidhalter, U. (1998). Spatial distributions and net deposition rates of mineral elements in the elongating wheat (Triticum aestivum L.) leaf under saline soil conditions. Planta 204: 212-219 Smirnoff, N., Cumbes, Q.J. (1989). Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes. Phytochemistry 28: 1057-1060 Stoop, J.M.H., Williamson, J.D., Pharr, D.M. (1994). Mannitol metabolism in celery stressed by excess macronutrients. Plant Physiol. 106: 503-511 Stoop, J.M.H., Williamson, J.D., Pharr, D.M. (1996). Manitol metabolism in plants: a model for coping with stress. Trends in Plant Science 1: 139-144 Sutherland, M.W. (1991). The generation of oxygen radicals during host plant responses to infection. Physiol. Mol. Plant Pathol. 39: 79-93 Teiz, L., Zeiger, E. (2002). Stress physiology. Plant physiology: 607-608 Vítová, L., Stodůlková, E., Bartoníčková, A., Lipavská, H. (2001). Mannitol utilisation by celery (Apium graveolens) plants grown under different conditions in vitro. Plant Science 163: 907-916

27

Voetberg, G.S., Sharp, R.E. (1991). Growth of the maize primary root at low water potentials. Plant Physiol. 96: 1125-1130 Wang, Z., Quebedeaux, B., Stutte, G.W. (1996). Partitioning of [14C] glucose into sorbitol and other carbohydrates in apple under water stress. Aust. J. Plant Physiol. 23: 245-251 Williamson, J.D., Stoop, J.M.H., Massel, M.O., Conkling, M.A., Pharr, D.M. (1995). Sequence analysis of a mannitol dehydrogenase cDNA from plants reveals a function for the pathogenesis related protein ELI3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7148-7152 Williamson, J.D., Jennings, D.B., Guo, Wein-Wen, Pharr, D.M. (2002). Sugar alcohols, salt stress, and fungal resistance: Polyols-multifunctional plant protection?. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 127(4): 467-473 Wu, R., Garg, A. (2003). Engineering rice plants with trehaloseproducing genes improves tolerance to drought, salt, and low temperature. ISB News Report Zamski, E., Guo, W., Yamamoto, Y.T., Pharr, D.M., Williamson, J.D. (2001). Analysis of celery (Apium graveolens) mannitol dehydrogenase (MTD) promoter regulation in Arabidopsis suggest roles for MTD in key environmental and metabolic responses. Plant Moleculat Biology 47: 621-631

28