03/10/2014
UJI-UJI ANTIMIKROBA KIMIA BIOESAI PS-S2 KIMIA IPB 2014
Uji Suseptibilitas Antimikrobial ► Metode
Difusi
Menggunakan cakram filter, mengandung sejumlah antibiotik dengan konsentrasi tertentu ► Metode
Dilusi
Berbagai konsentrasi antibiotik dalam media kaldu Umumnya penentuan MIC dan MBC
Dr.T.V.Rao MD
2
1
03/10/2014
Metode untuk Mendeteksi Antibiotik ► Metode
Diffusi: The Kirby-Bauer test
-Metode ini berdasarkan difusi antibiotik pada agar yang diinokulasi mikroorganisme. - Efek dari antibiotik diekspresikan dengan terbentuknya suatu zona pertumbuhan yang terhambat.
Pengukuran sensitivitas mikroorganisme terhadap antibiotik ► Pengukuran
dengan Uji Difusi Cakram (disk diffusion test).
► Larutan
antibiotik/sampel uji dengan konsentrasi tertentu dikeringkan pada kertas cakram.
►
kemudian diletakan pada permukaan agar yang sudah dioleskan mikroba yang standar.
2
03/10/2014
Mengapa harus memakai metode standar? Faktor-faktor yang mempengaruhi diameter zona 1. Diffusi antibiotik 2. Medium 3. Kedalaman agar 4. Hidrasi medium 5. Ukuran Inokulum 6. Kecepatan tumbuh inokulum 7. Waktu Pre-inkubasi 8. Waktu Inkubasi
Metode paling umum dan standar: Kirby-Bauer (NCCLS), Calibrated Dichotomous Sensitivity (CDS) Method
► Efektivitas
antibiotik berhubungan dengan zona inhibisi pertumbuhannya. Makin luas diameternya, makin potensi sample antibiotik tsb..
R
I
S R - Resistant I - Intermediate S - Susceptible
3
03/10/2014
Metode Agar Difusi Cakram ►
Medium
Mueller Hinton
ketebalan 4 mm pH 7.2 to 7.4
►
CakramAntibiotik storage temperature
-20oC minimum
►
Inokulum
McFarland 0.5
(108 bacteria/mL)
►
Inkubator
temperatur 35oC
►
Atmosphere
udara ambient
7
7
Galur Standar utk
quality assurance
Presisi dan akurasi dilakukan dengan menggunakan galur terkontrol Suseptibilitasnya sudah diketahui. Galur Standard Staphylococcus aureus ATCC 25923 Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
4
03/10/2014
Prosedur Persiapkan kultur murni berumur 18-24 jam pada medium non selektif. Sesuaikan kekeruhan sekitar standar kekeruhan 0.5 McFarland
Sample Dr.T.V.Rao MD
0.5 McFarland Standard 9
Pindahkan koloni secara aseptik utk perbanyakan Pilih 4-5 koloni murni dari plat agar dan pindahkan ke dalam tabung media kaldu spt kaldu tryptic-soy. Inkubasi semalam pada 35°C atau sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0.5 McFarland,
Dr.T.V.Rao MD
10
5
03/10/2014
McFarland 0.5 dan tabung berisi mikroorganisme yang disesuaikan kekeruhannya
11
Dr.T.V.Rao MD
Inokulasi pada lempeng secara merata ►
►
Dr.T.V.Rao MD
Dalam 15 menit setelah distandarkan, ambil dengan aplikator steril dan tanam pada lempeng agar Muller Hinton secara rotasi berulang kali. Yakinkan utk menyerap kelebihan cairannya pada sisi lempeng. Biarkan 3-5 menit agar kelebihan cairan mengering atau terabsorb. 12
6
03/10/2014
Memilih cakram antibiotik dan memasangkannya
Select disks
Dr.T.V.Rao MD
13
HATI- HATI ► ► ► ► ►
Medium agar harus pH 7.2 to 7.4 pada suhu ruangan. Permukaan harus lembab tanpa tetesan air. Cakram antibiotik harus disimpan pada 8°C atau disimpan pada -14°C Sebelum digunakan biarkan dahulu pada suhu ruangan Jangan gunakan yang sudah kadaluarsa Inkubasi pada 32 oC selama 16-18 jam
Dr.T.V.Rao MD
14
7
03/10/2014
Hasil Antibiotik berdifusi ke dalam agar konsentrasi antibiotik terus berkurang menjauh dari cakramnya Setelah inkubasi, perhatikan daerah bening pada permukaan agar dan disebut sbg zona inhibisi
Bacterial growth incubation
Dr.T.V.Rao MD
Zone of inhibition 15
Masalah dengan uji cakram inokulum sesuai dan inokulum yang kebanyakan
16
Dr.T.V.Rao MD
16
8
03/10/2014
Masalah dengan difusi cakram
cakram yang dipasang dengan benar
cakram dipasang tidak tepat
17
Dr.T.V.Rao MD
Metode Dilusi ►
Minimum Inhibition Concentration (MIC) Konsentrasi terendah suatu antimikroba yang menghambat pertumbuhan bakteri.
►
Minimum Bactericidal Concentration (MBC) or Minimum Lethal Concentration (MLC) Konsentrasi terendah dari suatu antimikroba yang menunjukkan kurang dari 0.1% inokulum awal masih bisa bertahan
18
9
03/10/2014
Penentuan MIC dengan metode dilusi kaldu ► Tabung
berisi kaldu dengan larutan antibiotik yang diencerkan dua kali lipat dan inokulum standar ► Setelah inkubasi semalam, MIC ditentukan berdasarkan tabung pertama pertumbuhan yang dihambat. ► Makin resisten suatu organisme, berarti MIC makin tinggi.
Metode Dilusi Kaldu ►Prosedur Buat pengenceran dua kali dari antibiotik dalam kaldu Mueller-Hinton, Tryptic Soy Broth Inokulasi bakteri , inkubasi semalam. ►kontrols: tanpa inokulum, tanpa antibiotik Tervisualisasi kekeruhan MIC Kemudian subkultrul tabung yang tidak keruh selama semalan. Ada pertumbuhan (bacterial count) MBC 20
10
03/10/2014
Antibiotik diencerkan pada berbagai konsentrasi untuk menguji MIC
Grafik hasil uji MIC
11
03/10/2014
Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Minimum Bactericidal Concentration (MBC)
Prinsip Uji Suseptibilitas
Dr.T.V.Rao MD
24
12
03/10/2014
Metode Dilusi Kaldu ► 100%
dari konsentrasi awal bakteri
= 5*105 CFU/ml ► 0.1%
= [(5*105)*0.1]/100 CFU/ml = 500 CFU/ml ► Jumlah
bakteri sebaiknya kurang dari 5 CFU (colonoy forming unit) pada plat untuk kultur dengan 0.01 ml 500*0.01 = 5 CFU 25
Antimicrobial Gradient Testing E-test®
Read plates after recommended Incubation Read MIC where elipse intersects scale
13
