1
BAB V HASIL PENELITIAN 5.1. Hasil Uji Pendahuluan 5.1.1 Penentuan DM setelah Induksi Streptozotosin Study preliminary /
uji pendahuluan
dan proses penelitian ini telah
dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada (LPPT-UGM) unit 4. Proses yang dilakukan meliputi pemeliharaan dan perlakuan
hewan coba. Pembuatan preparat
Hematoxylin Eosin (HE),
pengamatan dan pembacaan dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi FKUGM. Sedangkan pembuatan preparat imunohistokimia (IHC) dilakukan di laboratorium Patologi Anatomi RS dr. Sardjito Yogyakarta. Sampel penelitian ini tikus Sprague-dawley jantan berusia 45-75 hari dengan berat badan 50-200 gram. Uji pendahuluan/ Study preliminary dilakukan untuk mengetahui bahwa kondisi hewan coba tetap stabil diabetes melitus, dengan cara melakukan observasi GDS hewan coba pada hari kedua, keempat dan keenam. Penelitian ini menggunakan empat sampel hewan coba yang terbagi menjadi dua sampel puasa dan dua sampel non puasa. Kelompok puasa, dipuasakan selama 12 jam sebelum induksi 34. Rata-rata hasil pemeriksaan GDS untuk menentukan kestabilan hewan coba dalam kondisi tetap diabetes melitus pada hari kedua, keempat dan keenam pada Tabel 5.1. Rata-rata GDS pada sampel puasa satu 370,33 mg/dl, sampel
2
puasa dua 432,33 mg/dl, sampel non puasa satu 399,67 mg/dl dan sampel non puasa dua yaitu 454 mg/dl. Rata-rata gula darah sewaktu pada uji pendahuluan masih dalam kondisi diabetes melitus. Peneliti mengambil keputusan bahwa untuk penelitian selanjutnya, kondisi hewan coba sudah stabil diabetes melitus pada hari kempat dan dipuasakan terlebih dahulu 12 jam sebelum induksi streptozotocin. Tabel 5.1. Karakteristik berat badan, rata-rata gula darah sewaktu uji pendahuluan setelah induksi streptozotosin.
Puasa 1
161,3
258
494
359
Rata-rata GDS (mg/dl) 370,33
Puasa 2
175,2
422
355
520
432,33
Non Puasa 1
173,6
445
349
405
399,67
Non Puasa 2
187,7
378
575
409
454
Sampel
BB (gr)
GDS Hari-2 (mg/dl)
GDS Hari-4 (mg/dl)
GDS hari-6 (mg/dl)
5.1.2 Pemberian Ekstrak Etanol daun Salam (EEDS) Identifikasi atau determinasi sampel Syzygium polyanthum ( Wight. ) dilakukan di Bagian Biologi Farmasi UGM. Pembuatan ekstrak daun salam dilarutkan menggunakan etanol 70% dengan berat serbuk daun salam 455,10 gr dan berat ekstrak daun salam 79,38 gr. Ekstraksi maserasi dilakukan di LPPT Unit 3 UGM dengan hasil ekstraksi berupa supernatan bioaktif daun salam. Uji Fitokimia ekstrak etanol daun salam dilakukan di Laboratorium kimia organik jurusan kimia fakultas sains dan matematika Universitas Diponegoro. Berikut hasil uji fitokimia ekstrak daun salam secara kualitatif menunjukkan bahwa zat
3
yang terkandung dalam daun salam berupa alkaloid, saponin, fenolik, triterpenoid, steroid dan flavonoid yang dapat dijadikan sebagai zat anti oksidatif, yang dapat berfungsi menurunkan gula darah . Tabel 5.2. Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Salam Parameter
Ekstrak
Alkaloid
Positif
Saponin
Positif
Quinon
Positif
Fenolik
Positif
Triterpenoid
Positif
Steroid
Positif
Flavonoid
Positif
Hasil uji antioksidan dengan metode difenilpikril hidrasil ( DPPH ) pada ekstrak etanol daun salam yaitu IC50 = 89.627, konsentrasi senyawa antioksidan yang terkandung dalam daun salam memyebabkan lebih dari 50% DPPH mengalami penurunan karakter radikal bebas lebih besar dari vitamin C yaitu IC50= 7.587. Ekstrak daun salam dilarutkan dalam larutan Carboxy Methyl Cellulose Natrium (CMC Na) 0,5% untuk mempermudah homogenisasi. Ekstrak daun kemudian dikemas sesuai dosis sebanyak 15 botol dan disimpan dalam lemari pendingin. Pemberian ekstrak daun salam dilakukan peroral dengan disonde selama 15 hari. Pemberian ekstrak ini dimulai pada hari ke lima pasca
4
induksi STZ yang menunjukkan GDS hewan coba dalam kondisi stabil diabetes melitus. 5.2. Karakteristik
Gula Darah Sewaktu, Pre EEDS dan Post EEDS
Penelitian Awal Sampel hewan coba pada penelitian awal sebanyak, 20 ekor yang terbagi menjadi empat kelompok. Pada saat pemberian esktrak etanol daun salam sedang berlangsung terdapat satu hewan coba yang mati sehingga di masukkan dalam kategori drop out. Hewan coba yang mati terdapat pada kelompok perlakuan tiga, sehingga jumlah hewan coba hanya 19 ekor. Hewan coba tidak diganti karena tikus Sprague dawley di LPPT IV jumlahny terbatas. Pada awal penelitian, dosis EEDS pada masing-masing kelompok perlakuan sebagai berikut : Perlakuan 1 : EEDS 18,1 mg/ 200 gr BB, Perlakuan 2 : EEDS 36,2 mg/ 200 gr BB, Perlakuan 3 : EEDS 72,4 mg/ 200 gr BB. Gula darah sewaktu dosis awal ditunjukkan pada tabel 5.3. Dari tabel tersebut diketahui bahwa rata-rata GDS Post EEDS pada kelompok perlakuan dosis 1 : 540,4 mg/dl, sedangkan pada dosis 2: 524,4 mg/dl, dan perlakuan dosis 3 : 553,2 mg/dl. Tabel 5.3. Karakteristik Gula Darah Sewaktu Mean, Median, Standart deviasi dan Nilai minimal – maksimal Pre EEDS dan Post EEDS Penelitian Awal
Karakteristik GDS Pre EEDS
Kelompok Kontrol Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3
Mean ± SD 493 ± 116,2 481,8 ± 77,2 518,2 ± 58,3 540,7 ± 44,2
Median
MinimalMaximal
469 491 543 530
373 – 659 352 – 552 419 – 565 500 – 603
5
GDS Post EEDS
Kontrol Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3
508 ± 117,76 540,4 ± 149,6 524,4 ± 105,04 553,2 ± 105,9
490 511 579 549
381 – 686 328 – 720 397 – 621 428 – 687
Tabel 5.4 Perbandingan Karakteristik Gula Darah Sewaktu, Mean, dan Standart deviasi Pre EEDS dan Post EEDS Penelitian Awal GDS Pre EEDS Post EEDS
Mean ± SD
p value
Jumlah
0,39
19
506,74 ± 76,98 530,37 ± 112,53
Hasil analisis statistik menunjukan bahwa rata-rata GDS Pre EEDS adalah 506,74 mg/dl dengan standard deviasi 76,98 mg/dl. Setelah pemberian EEDS ratarata GDS adalah 530,37 mg/dl dengan standard deviasi 112,53 mg/dl. Pada hasil analisis menggunakan uji t dependent terhadap perbedaan rata-rata GDS Pre EEDS dengan GDS Post EEDS menunjukan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara GDS Pre EEDS dengan GDS Post EEDS (p value : 0,39). Hal tersebut menunjukkan bahwa pemberian ekstrak daun salam pada awal penelitian tidak dapat meregulasi gula darah. Dengan demikian dilakukan ekstraksi maserasi ulang daun salam dengan berat serbuk 700gr, dengan berat ekstrak daun salam 45,12 gr yang dilarutkan dalam etanol 70%. Dosis ekstrak daun salam ditingkatkan sebagai berikut : Perlakuan 1 : EEDS 150 mg/ 200 gr BB, perlakuan 2 : EEDS 300 mg/ 200 gr BB dan dosis perlakuan 3 : EEDS 450 mg/ 200 gr BB 10.
6
5.3.
Hasil Penelitian Sampel hewan coba pada penelitian sebanyak 20 ekor, terbagi menjadi
empat kelompok. Pada saat diberikan perlakuan dengan pemberian esktrak etanol daun salam sedang berlangsung terdapat empat hewan coba yang mati sehingga di masukkan dalam kategori drop out. Hewan coba yang mati terdapat pada kelompok perlakuan satu sebanyak dua ekor, kelompok perlakuan dua sebanyak satu ekor dan kelompok perlakuan tiga sebanyak satu ekor, sehingga jumlah hewan coba hanya 16 ekor. Sampel hewan coba yang mati, tidak diganti dikarenaka tikus Sprague dawley jumlahnya terbatas dan tidak dapat digantikan dari luar LPPT UGM. Karakteristik berat badan, gula darah sewaktu sebelum pemberian EEDS pada penelitian dengan dosis yang telah ditingkatkan,
pada perlakuan satu
menjadi : EEDS 150 mg/ 200 gr berat badan, perlakuan dua : EEDS 300 mg/ 200 gr berat badan dan dosis perlakuan tiga : EEDS 450 mg/ 200 gr berat badan, dapat dilihat pada tabel 5.5.
Tabel 5.5. Karakteristik Berat Badan, Gula Darah Sewaktu, Pre EEDS Karakteristik Berat badan
GDS
Kelompok Kontrol Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3 Kontrol Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3
Mean ± SD 119,76 ± 40,29 98,7 ± 39,99 95,65 ± 45,84 98,47 ± 49,83 344,4 ± 112 360 ± 171,02 356,5 ± 155,97 369 ± 112,9
Median 147,1 87,5 84,4 77,9 393 304 354,5 347
MinimalMaximal 66,5 - 150,8 65,5 - 143,1 56,4 - 157,4 65,4 - 172,7 209 - 469 224 - 552 202 - 515 259 - 523
7
Dari tabel 5.5 tersebut menunjukkan bahwa rata-rata gula darah sewaktu Pre EEDS pada kelompok perlakuan dosis 1 adalah 360 mg/dl, sedangkan pada dosis 2 adalah 356,5 mg/dl, dan perlakuan dosis 3 adalah 369 mg/dl.
5.4. Karakteristik Berat Badan, Gula Darah Sewaktu, dan
HbA1c Post
Pemberian EEDS Karakteristik berat badan, gula darah sewaktu dan HbA1c setelah pemberian EEDS pada penelitian dengan dosis yang telah ditingkatkan dapat dilihat pada tabel 5.6 sebagai berikut: Tabel 5.6. Karakteristik Berat Badan, Gula Darah Sewaktu, dan HbA1c Post Pemberian EEDS Karakteristik Kelompok
Mean ± SD
Median
MinimalMaximal
Berat Badan
Kontrol Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3
132,96 ± 29,71 125,26 ± 14,34 119,62 ± 26,31 129,62 ± 32,11
144,9 124 120,4 118,5
96,4 - 165,6 111,6 - 140,2 90,5 - 147,2 104,7 – 176,8
GDS
Kontrol Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3
411 ± 195,9 344,33 ± 75,83 271,75 ± 141,94 286,25 ± 133,75
434 328 275 291
217 – 686 278 – 427 140 – 397 135 – 428
HbA1c
Kontrol Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3
5,7 ± 1,59 5,7 ± 1,5 5,85 ± 2,49 4,85 ± 2,49
6,3 5,7 5,15 4,5
4 – 7,50 4,2 – 7,2 3,9 – 9,2 4 – 6,4
Dari tabel 5.6 tersebut menunjukkan bahwa rata-rata gula darah sewaktu post EEDS pada kelompok perlakuan dosis 1 adalah 344,33 mg/dl, dengan rata-
8
rata HbA1c 5,7%, pada dosis 2 adalah 271,75 mg/dl , dengan rata-rata HbA1c 5,85% dan perlakuan dosis 3 adalah 286,5 mg/dl dengan rata-rata HbA1c 4,85%. 5.5. Perbandingan GDS Pre EEDS dan Post EEDS Pada Penelitian Akhir Tabel 5.7 Gula Darah Sewaktu Pre EEDS dan Post EEDS Pada Penelitian Akhir GDS
Mean ± SD
Pre EEDS
356,5 ±121,47
Post EEDS
332,5 ± 149,15
p value
Jumlah
0,006
16
Hasil analisis menunjukan bahwa rata-rata GDS Pre EEDS adalah 356,5 mg/dl ±121,47 mg/dl. Setelah pemberian EEDS rata-rata GDS adalah 332,5 mg/dl ±149,15 mg/dl. Analisis uji t dependent terhadap perbedaan rata-rata GDS Pre EEDS dengan GDS Post EEDS menunjukan bahwa ada perbedaan yang signifikan antara GDS Pre EEDS dengan GDS Post EEDS (p value : 0,006). Hal ini menunjukkan bahwa pada dosis daun salam
yang ditingkatkan, dapat
meregulasi gula darah. 5.6. Uji Statistik Reliabilitas Terhadap Allred Score Ekspresi VEGF Podosit Glomerulus Pembaca 1 dan Pembaca 2 Pengamatan allred score VEGF podosit glomerulus dalam penelitian ini dilakukan oleh 2 orang pembaca (dr. Didik Setyoherianto dan dr.Nur Hidayah). Uji statistik reliabilitas terhadap hasil pembacaan allred score menunjukan bahwa
9
tidak ada perbedaan hasil pembacaan allred score diantara pembaca 1 dan pembaca 2 (p value > 0,6).
5.7. Distribusi Allred Score Ekpresi VEGF Hewan Uji Berdasarkan Dosis Pemberian EEDS
Distribusi
allred score ekspresi VEGF pada kelompok kontrol dan
kelompok perlakuan dosis satu, dosis dua dan dosis tiga setelah diberikan ekstrak daun salam selama 15 hari ditunjukkan pada tabel 5.8 sebagai berikut: Tabel 5.8 Allred Score Ekpresi VEGF Hewan Uji Berdasarkan Dosis Pemberian EEDS Karakteristik VEGF
Kelompok Kontrol Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3
Mean ± SD 1,2 ± 1,09 1,3 ± 1,15 0,50 ± 1,00 0,00
Median 2 2 0 0
P value
0,20
Berdasarkan tabel 5.8. diatas diketahui bahwa rata-rata score VEGF kelompok kontrol adalah 1,2±1,09, kelompok dosis 1: 1,3±1,15 , kelompok dosis 2 : 0,50±1,00 sedangkan rata-rata score ekspresi VEGF kelompok dosis 3 adalah nol. Hasil uji statistik Krusskall-Wallis menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan score VEGF diantara masing-masing kelompok penelitian (p > 0,05), sehingga bila dilakukan uji Mann-Whitney untuk mengetahui perbedaan rerata score VEGF pada masing-masing kelompok dibandingkan dengan kelompok kontrol dengan p value sebagai berikut: kontrol vs dosis 1 (150 mg/200 gr BB) p value = 0,86
10
sedangkan kontrol vs dosis 2 (300 mg/200 gr BB) p value = 0,32 dan kontrol vs dosis 3 (450 mg/200 gr BB) p value = 0,07.
