UJI EFEK ANTIPROLIFERATIF CAMPURAN SENYAWA EUGENOL DAN ISOLAT KATEKIN GAMBIR (Uncaria gambier, Roxb) DARI FASE ETIL ASETAT TERHADAP KULTUR SEL KANKER SERVIKS (HeLa CELL LINE)
SKRIPSI
Diajukan Sebagai Tugas Akhir Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Far).
OLEH KIKI ZAKIAH NIM : 107102001475
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2011/1432 H
LEMBAR PERSETUJUAN SKRIPSI NAMA
: KIKI ZAKIAH
NIM
: 107102001475
JUDUL
: UJI EFEK ANTIPROLIFERATIF CAMPURAN SENYAWA EUGENOL DAN ISOLAT KATEKIN GAMBIR (Uncaria gambier, Roxb) DARI FASE ETIL ASETAT TERHADAP KULTUR SEL KANKER SERVIKS (HeLa CELL LINE)
Disetujui oleh :
Pembimbing I
Pembimbing II
Nurmeilis, M.Si, apt
drg. Laifa Annisa H., Ph.D.
NIP:197404302005012003
NIP : 197804022009012003
Mengetahui,
Ketua Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Dr. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt NIP : 1956010619851010001
ii
LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI Skripsi dengan Judul UJI EFEK ANTIPROLIFERATIF CAMPURAN SENYAWA EUGENOL DAN ISOLAT KATEKIN GAMBIR (Uncaria gambier, Roxb) DARI FASE ETIL ASETAT TERHADAP KULTUR SEL KANKER SERVIKS (HeLa CELL LINE) Telah disetujui, diperiksa dan dipertahankan dihadapan tim penguji oleh Kiki Zakiah NIM: 107102001475 Menyetujui, Pembimbing: 1. Pembimbing I
Nurmeilis, M.Si, Apt.
........................
2. Pembimbing II
drg. Laifa Annisa H., PhD
........................
Penguji: 1. Ketua Penguji
Dr. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ........................
2. Anggota Penguji I
Dr. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ........................
3. Anggota Penguji II
Ofa Suzanti Bheta, M.Si, Apt.
........................
4. Anggota Penguji III
Drs. Ahmad Musir, M.Sc, Apt.
........................
Mengetahui, Dekan Fakultas Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Prof. Dr (hc). dr. M.K. Tadjudin, Sp. And Tanggal lulus : 16 Desember 2011 iii
LEMBAR PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul:
UJI EFEK ANTIPROLIFERATIF CAMPURAN SENYAWA EUGENOL DAN ISOLAT KATEKIN GAMBIR (Uncaria gambier, Roxb) DARI FASE ETIL ASETAT TERHADAP KULTUR SEL KANKER SERVIKS (HeLa CELL LINE)
Adalah karya saya sendiri dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tiggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkandari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka.
Penulis
Kiki Zakiah 107102001475
iv
KATA PENGANTAR
Alhamdulillahirrabil ‘alamin, puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang selalu melimpahkan rahmat, karunia, cinta dan kasihNya yang tidak terbatas kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi berjudul “Uji Efek Antiproliferatif Campuran Senyawa Eugenol dan Isolat Katekin Gambir (Uncaria gambir Roxb) dari Fase Etil Asetat Terhadap Kultur Sel Kanker Serviks (HeLa cell line). Skripsi ini disusun untuk memenuhi tugas akhir sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Bunda Nia Nurhamidah Romli, Ayah Muzimi Effendi, Sis Fetty Fatihatun N, Syarief Muiz Abdillah dan Putri Khatami yang selalu memberikan kasih sayang, doa, semangat dan dukungan baik moril maupun materil sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. 2. Bapak Prof. Dr. (hc) dr. M.K Tadjudin Sp.And, selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 3. Bapak. Dr. M. Yanis Musdja M.Sc, Apt, selaku Ketua Jurusan Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 4. Ibu Nurmeilis, M.si, Apt, selaku pembimbing I yang tak bosan mengajarkan dan membimbing penulis di segala kesempatan. 5. Ibu drg. Laifa Annisa H., Ph.D selaku pembimbing II yang juga telah membimbing dan berbagi ilmu kepada penulis. 6. Bapak dan Ibu dosen yang tak hanya memberikan ilmu, hingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini, namun juga semangat dan teladan mulia. Semoga Allah membalas kebaikanmu dengan pahala yang berlipat. 7. Bapak Kusmardi, MSc. yang telah berbaik hati memfasilitasi penulis dalam pengerjaan penelitian di Laboratorium Patology FKUI-Salemba. 8. Para staf dan karyawan program studi yang telah banyak membantu selama proses penelitian. v
9. Kepada sahabat seperjuangan penelitianku (RESONANSI) , Silfia Windy Kusumadewi dan Dahlia Sari, Kepada sahabat Farmasi angkatan 2007 khususnya kelas A. 10. Kepada para senior, Ahmed Rizky F, Dea Arditia R, Ahmad Hariri, Raisani Rusli, Dalilah Qisthina, Purnama Dwi T, dan semua yang tidak bisa disebutkan satu persatu, terimakasih untuk setiap semangat dan masukan yang berharga 11. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang turut membantu menyelesaikan skripsi ini. Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini sangat jauh dari sempurna. Oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis harapkan guna tercapainya kesempurnaan skripsi ini. Akhirnya, dengan segala kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis, khususnya bagi mahasiswa farmasi, masyarakat pada umumnya dan bagi dunia ilmu pengetahuan.
Jakarta, Desember 2011
vi
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL LEMBAR PERSETUJUAN LEMBAR PENGESAHAN LEMBAR PERNYATAAN KATA PENGANTAR DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN ABSTRAK ABSTRACT BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang 1.2. Perumusan Masalah 1.3. Hipotesa 1.4. Tujuan Penelitian 1.5. Manfaat Penelitian BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Eugenol 2.1.1. Sifat Fisika dan kimia 2.1.2. Sumber Eugenol 2.1.3. Pemanfaatan Eugenol 2.2. Tanaman Gambir (Uncaria gambir Roxb.) 2.2.1. Klasifikasi Gambir (Uncaria gambir Roxb.) 7 2.2.2. Nama daerah 2.2.3. Uraiantanaman 2.2.4. Kandungan Kimia 2.2.5. ManfaatTumbuhan 2.2.6. Efekfarmakologis 2.2.7. Katekin 2.3. Simplisia 2.3.1. PengelolaanSimplisia 2.4. EkstrakdanEktraksi 2.4.1. Pengertian 2.4.2. Cara Pembuatan Ekstrak 2.4.3. Metode Ekstraksi 2.4.4. Parameter Ekstrak 2.5. Kanker 2.5.1. PengertianKanker 2.5.2. KankerServiks 2.6. HeLaCell Line 2.7. Antikanker vii
i ii iii iv v vii ix x xi xii xiii 1 4 4 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 8 9 9 11 11 14 14 15 16 18 19 19 21 24 25
2.7.1. Obatantikanker 2.7.2. MekanismeKerjaObatAntikanker 2.7.3. GolonganObatAntikanker 2.8. Cisplatin 2.9. KulturSel 2.10. UjiAntiproliferatif 2.10.1. MetodePengujianAntiproliferatif 2.11. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 2.12. PotensiPenelitian 2.13. KerangkaKonsepPenelitian BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 3.2. Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1. AlatPenelitian 3.2.2. BahanPenelitian 3.3. Prosedur Penelitian 3.3.1. PenyiapanSimplisiaUji 3.3.2. IdentifikasiGambir 3.3.3. IdentifikasiCemaran Urea 3.3.4. Isolasi KatekinGambir 3.3.5. PenapisanFitokimia 3.3.6. PemeriksaanKatekin 3.3.7. SterilisasiAlat 3.3.8. PembuatanReagen 3.3.9. Persiapan LarutanUji 3.3.10. PersiapanKulturHeLaCell Line 3.3.11. PemeliharaanKulturHeLaCell Line 3.3.12. UjiAntiproliferatif 3.3.13. PerhitunganPersentaseKematianSel 3.4. Analisa Data 3.5. AlurPenelitian BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Penelitian 4.1.1. DeterminasidanSertifikasi 4.1.2. KarakteristikSimplisia&Senyawaujicampuran 4.1.3. JumlahKepadatanSel 4.1.4. UjiEfekAntiproliferatif 4.2. Pembahasan BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan 6.1. Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN
viii
25 25 26 30 32 35 35 36 37 40 41 41 41 42 43 43 43 43 44 44 48 50 51 52 53 55 56 57 57 58 59 59 59 60 60 66 72 72 73 82
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 1. Tabel 2. Tabel 3. Tabel 4. Tabel 5. Tabel 6. Tabel 7. Tabel 8. Tabel 9. Tabel 10. Tabel 11. Tabel 12. Tabel 13. Tabel 14. Tabel 15.
Konfigurasi Komponen Katekin ................................................. 10 Karakteristik Simplisia dan Senyawa Uji Campuran .................. 59 Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Sampel 24 jam ................ 60 Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Sampel 48 jam ................ 61 Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Sampel 72 jam ................ 61 Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Cisplatin 24 jam .............. 61 Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Cisplatin 48 jam .............. 62 Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Cisplatin 72 jam .............. 62 Hasil Pengamatan Penapisan Fitokimia ...................................... 86 Perhitungan Persentase Kadar Katekin Sampel .......................... 90 Hasil Perhitungan Konsentrasi Sampel ....................................... 97 Hasil Perhitungan Konsentrasi Cisplatin .................................... 98 Pengujian Efek Antiproliferatif Sampel Tiap Interval Waktu .... 102 PengujianEfekAntiproliferatifCisplatin per Interval Waktu ....... 105 PersenProbit ................................................................................ 111
ix
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1. Gambar 2. Gambar 3. Gambar 4. Gambar 5. Gambar 6. Gambar 7. Gambar 8. Gambar 9. Gambar 10. Gambar 11. Gambar 12. Gambar 13 Gambar 14. Gambar 15. Gambar 16. Gambar 17. Gambar 18. Gambar 19. Gambar 20. Gambar 21. Gambar 22. Gambar 23. Gambar 24. Gambar 25. Gambar 26. Gambar 27. Gambar 28. Gambar 29. Gambar 30.
Struktur Kimia Eugenol .......................................................... 5 Struktur Dasar Katekin dan Galloyl Group......................... ... 10 MTT direduksimenjadiFormazan ........................................... 36 Eugenol ................................................................................... 85 BongkahGambir...................................................................... 85 SerbukGambir ............................................................... 85 HasilIdentifikasi...................................................................... 85 HasilUjiCemaran Urea ........................................................... 85 SerbukKatekinSampel ............................................................ 85 SerbukKatekinStandar ............................................................ 85 Alat Haemocytometer ............................................................. 107 Pemetaan Haemocytometer .................................................... 107 Biology Safety Cabinet ........................................................... 108 Incubator ................................................................................. 108 Autoklaf .................................................................................. 108 Microscope inverted .............................................................. 108 Mikropipet............................................................................... 108 Sentrifuge................................................................................ 108 ELISA reader .......................................................................... 108 T-Flask .................................................................................... 108 Spektrometer ........................................................................... 108 Micro well Plate...................................................................... 108 Medium DMEM ..................................................................... 109 DMSO ..................................................................................... 109 Fetal Bovine Serum ................................................................ 109 MTT ........................................................................................ 109 Tripan Blue ............................................................................. 109 Trypsin EDTA ........................................................................ 109 Phospate Buffer ...................................................................... 109 SosiumDuodecyl (SDS) .......................................................... 109
x
DAFTAR LAMPIRAN Halaman
Lampiran 1. Hasil Determinasi Gambir ...................................................... 82 Lampiran 2. Sertifikasi Eugenol ................................................................. 83 Lampiran 3. Sertifikat Kemurnian Katekin Standar ................................... 84 Lampiran 4. Eugenol, Gambir dan Katekin ............................................... 85 Lampiran 5. Hasil Pengamatan Fitokimia................................................... 86 Lampiran 6. Hasil Pengujian Karakteristik Katekin ................................... 87 Lampiran 7. Lanjutan (lampiran 6) ............................................................. 88 Lampiran 8. Hasil Penetapan Kadar Katekin .............................................. 89 Lampiran 9. Skema Proses Pembuatan Katekin Gambir ............................ 91 Lampiran 10. Skema Kerja Kultivasi sel HeLa ............................................ 92 Lampiran11.Skema Kerja Subkultivasi Sel HeLa ........................................ 93 Lampiran12.Uji MTT .................................................................................... 94 Lampiran13.PerhitunganKonsentrasiSampel ................................................ 95 Lampiran14.Lanjutan (lampiran 13)............... .............................................. 96 Lampiran15.Lanjutan (lampiran 13)............................. ................................ 97 Lampiran16.Perhitungan Konsentrasi Cisplatin ........................................... 98 Lampiran17.Perhitungan Kepadatan Sel ....................................................... 99 Lampiran 18. Skema Pemetaan Sumuran 96............................................... 100 Lampiran 19. Perhitungan IC50 Sampel........................................................ 102 Lampiran 20. Perhitungan IC50Cisplatin............................. ......................... 105 Lampiran 21. Pemetaan Haemocytometer................................ ................... 107 Lampiran22. Alat dan Bahan yang digunakan dalam penelitian .................. 108 Lampiran 23. Deskripsi Medium DMEM................................................ ..... 110 Lampiran 24. TabelTransformasiPersen-Probit......................................... .. 111
xi
ABSTRAK
Judul : Uji Efek Antiproliferatif Campuran Senyawa Eugenol dan Isolat Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dari Fase Etil Asetat Terhadap Kultur Sel Kanker Serviks (HeLa Cell Line)
Penelitian dilakukan untuk mengetahui efek antiproliferatif campuran katekin gambir (Unicaria gambier, Roxb) dan eugenol terhadap sel kanker HeLa secara in vitro. Katekin dari gambir (Unicaria gambier, Roxb)
dicampur
dengan
Eugenol
menggunakan
DMSO.
Uji
antiproliferatif dilakukan melalui metode MTT assay, doubling time. Pada MTT assay dan doubling time sel kanker HeLa dibedakan menjadi lima kelompok perlakuan yakni sampel (sel+medium kultur+sampel), kontrol sel (sel+medium kultur), kontrol positif (sel+medium kultur+cisplatin), kontrol medium (kultur medium) dan kontrol pelarut (sel+medium kultur+DMSO) masing-masing seri konsentrasi tiga kali ulangan. Hasil penelitian efek antiproliferatif ini menunjukkan nilai IC50 masing-masing interval waktu (24, 48 dan 72 jam) sebesar 372.4 µg/mL, 178.24 µg/mL, dan 73.45 µg/mL. Nilai IC50 pada 72 jam menunjukkan adanya potensi sampel sebagai agen kemoprevensi.
Kata kunci : Antiproliferatif, Katekin Gambir (Unicaria gambier, Roxb) dan Eugenol xii
ABSTRACT
Tittle : Antiproliferative Effect Test of Mixed Eugenol and Catechin Isolate of Uncaria gambier Roxb from Ethyl Acetat Phase on Cervix Cancer Culture Cell (HeLa Cell Line)
The aim of this research is to know in vitro antiproliferative effect of mixed catechin of Uncaria gambier Roxb and Eugenol on HeLa cancer cells. The catechin of Uncaria gambier Roxb and Eugenol was mixed by DMSO. Antiproliferative
effect test was performed by MTT
assay,
doubling time methods. Cell was determined by five treatment groups on the MTT assay and doubling time methods. They were the extract group (cells + culture medium + test material), cell control group (cells + culture medium), positive control group (cells + culture medium + cisplatin), medium control group (cells + culture medium), and solvent control group (cells + culture medium + DMSO), which was every series has three times repetition. The result showed that IC50 value of antiproliferative effect test on each time interval (24, 48 and &2 hour) are 372.4 µg/mL, 178.24 µg/mL, and 73.45 µg/mL. IC50 value on 72 hour showed kemopreventive agent potency.
Keyword : Antiproliferative, catechin of Uncaria gambier Roxb, Eugenol xiii
1
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Hingga saat ini, kanker serviks merupakan penyebab kematian terbanyak akibat penyakit kanker di Negara berkembang. Inisiden dan mortalitas kanker serviks di dunia menempati urutan kedua setelah kanker payudara. Semetara itu, di Negara berkembang masih menempati urutan pertama sebagai penyebab kematian akibat kanker pada wanita usia reproduktif. Diperkirakan setiap tahun dijumpai sekitar 500.000 penderita baru di seluruh dunia dan umumnya terjadi di negara berkembang (Desen, 2008). Pada tahun 2008, International Agency for Research on Cancer (IARC) melaporkan inisiden kanker serviks terjadi sebanyak 530.232 jiwa di dunia dengan angka mortalitas 275.008 jiwa. Di tahun yang sama, inisiden kanker serviks di Indonesia terjadi sebanyak 16.413 jiwa dengan mortalitas 7.493 jiwa (Globocan,2008). Dalam 20 tahun terakhir berbagai usaha telah dilakukan untuk mengobati penyakit kanker dengan cara kemoterapi dan imunologik. Namun sayang, sampai sekarang cara tersebut belum memberikan hasil yang efektif, baik yang diberikan secara tunggal, maupun kombinasi. (Aziz, 2006). Terapi kanker sendiri ada bermacam-macam. Namun pada umumnya terapi yang diberikan pada penderita kanker ialah cara sequential, yaitu setelah selesai dengan cara terapi yang satu, bila perlu diikuti dengan cara terapi yang lain. Jarang bermacammacam cara terapi tersebut sekaligus diberikan dalam waktu yang bersamaan. Umumnya penderita tidak mampu menahan pemberian terapi sekaligus.
2
Pemberian terapi baik operasi, radioterapi atau kemoterapi akan menurunkan imunitas penderita. (Sukardja, 2000) Dewasa ini, ekstrak tumbuhan telah lama digunakan dalam pengobatan penyakit kanker. Uji antiproliferatif menyediakan data permulaan yang penting untuk membantu dalam pemilihan ekstrak-ekstrak tumbuhan yang berpotensi sebagai agen antineoplasmik (Cardellina et al. 1999). Proliferasi adalah pertumbuhan sel kanker yang tak terkendali sehingga berhasil membentuk kelompok. Gambir (Uncaria gambier Roxb) adalah tumbuhan yang secara empiris telah dimanfaatkan tidak hanya sebagai komponen menyirih, namun juga sebagai obat-obatan. Komponen bioaktif utama pada tanaman gambir adalah flavonoid (terutama gambiriin), katekin (sekitar 51%), zat penyamak (22-50%), serta sejumlah alkaloid (seperti gambir, tannin dan turunan dihidro- dan okso-nya) (Hermawan 2009). Katekin merupakan golongan flavanoid dengan aktivitas antioksidan yang lebih tinggi daripada antioksidan sintetik (Das, 1994) . Tingginya antioksidan katekin menunjukkan potensi senyawa antiproliferatif yang bersifat toksik terhadap sel kanker (Wagner,1985). Navindra P. Seraam (2003) menuliskan dalam jurnalnya bahwa katekin teh hijau dapat menghambat proliferasi sel kanker. Pada konsentrasi 50µM; derivat katekin yakni (–)-gallo-catechin, (–)-epigallocatechin gallate, dan (–)gallocatechin gallate berturut-turut menunjukkan persentase penghambatan terhadap sel kanker payudara sebesar 95%, 100%, dan 97%. Dengan konsentrasi yang sama, yaitu 50µM, (–)-gallo-catechin dan (–)-gallocatechin gallate merupakan katekin yang paling efektif melawan sel kanker kolon dengan
3
persentase 85% untuk (–)-gallo-catechin dan 93% untuk (–)-gallocatechin gallate. Sementara persentase penghambatan pada sel kanker paru-paru adalah 87% untuk (–)-gallo-catechin dan 67% untuk (–)-gallocatechin gallate. Pada percobaan lain, senyawa epigallocatechin gallate (EGCG) dan epicatechin gallate (ECG) menunjukkan efek antiproliferasi pada konsentrasi 100µM. Dibandingkan variabel kontrol, besar hambatan terhadap kultur sel tumor yang ditunjukkan oleh senyawa EGCG pada 24 jam dan 48 jam berturutturut adalah 70.2 ± 1.8% dan 85.6 ± 1.0%. sedangkan nilai hambatan yang ditunjukkan oleh senyawa ECG pada 24 dan 48 jam berturut-turut adalah 34.8 ± 2.2% dan 69.2 ± 1.1%. (Tsuchiya et. al. 2008) Selain katekin, senyawa yang terbukti dapat mempengaruhi pertumbuhan sel kanker adalah eugenol. Eugenol dapat menghambat pertumbuhan tumor sebesar 24.35% dengan dosis 100 mg/kg; i/p. (Jaganathan, 2010). Eugenol juga terbukti mempengaruhi pertumbuhan sel kanker hati secara sinifikan. Sel HCT 15 dan HT 29 ditekan oleh eugenol dengan nilai IC50 berturut-turut 300 µM untuk HTC 15 dan 500 µM untuk HT 29 (Jaganathan, 2010). Beberapa peresepan pengobatan tradisional yang terdiri dari campuran beberapa bahan mempunyai khasiat saling menguatkan, meskipun ketika bahan tersebut berdiri sendiri sudah terbukti memiliki khasiat masing-masing. Ternyata, perpaduan dua ekstrak herbal atau lebih itu memiliki fungsi, antara lain supaya komponen-komponennya saling mendukung atau saling mengurangi efek samping (Sukardiman, 1999). Berdasarkan hal tersebut di atas, penulis merasa perlu untuk melakukan penelitian lanjutan yang melibatkan senyawa katekin gambir dan senyawa
4
eugenol. Campuran senyawa katekin dari gambir dan eugenol murni diharapkan dapat memberikan efek atau aktivitas yang lebih baik dalam merusak atau menghambat proliferasi sel-sel kanker, khususnya sel kanker HeLa.
1.2 Perumusan Masalah Apakah campuran katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol memiliki efek antiproliferatif terhadap kultur sel kanker serviks (HeLa cell line) ?
1.3 Hipotesis Campuran katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol memiliki efek antiproliferatif terhadap kultur sel kanker serviks (HeLa cell line)
1.4 Tujuan penelitian Penelitian ini bertujuan untuk menguji efek antiproliferatif campuran katekin Gambir (Uncaria gambir Roxb) dan Eugenol terhadap kultur sel kanker serviks (HeLa cell line)
1.5 Manfaat penelitian 1.
Memberikan pengetahuan dan informasi mengenai komponen bahan alam yang berkhasiat bagi kesehatan khususnya bagi pengobatan kanker.
2. Memberikan informasi dan pengetahuan mengenai antikanker dari katekin Gambir (Uncaria gambir Roxb) dan Eugenol sehingga penelitian tekait dapat dilanjutkan.
5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1.Eugenol (Eugenolum) 2.1.1.Sifat Fisika dan Kimia (Depkes, 1995)
Rumus Kimia
:
Nama IUPAC
: 4-Alil-2-metoksifenol [97-53-0]
Rumus Struktur : C10H12O2 Berat Molekul : 164,20 Pemerian
: Cairan tidak berwarna atau kuning pucat; bau cenkeh kuat dan menusuk; rasa pedas; tidak memutar bidang polarisasi. Bila terpapar udara warna menjadi lebih tua dan mengental.
Kelarutan
: Sukar larut dalam air; bercampur dengan etanol, dengan kloroform, dengan eter dan dengan minyak lemak. Kelarutan dalam etanol 70% Satu bagian volume larut dalam 2 bagian volume etanol.
Bobot Jenis
: Antara 1,064 dan 1,070
Indeks Bias
: Antara 1,540 dan 1,542 pada suhu 200.
Penyimpanan
: Dalam wadah tertutup rapat, tidak tembus cahaya.
6
2.1.2.Sumber Eugenol Eugenol merupakan komponen terbesar yang terkandung dalam minyak daun cengkeh (49-87%) yang didistilasi uap dari daun pohon cengkeh (Eugenia caryophyllata Thunberg, famili Myrtaceae) (Anonim, 2008). Di Indonesia, daerah produksi cengkeh terdapat di sekitar Padang, Bengkulu dan Lampung (di Pulau Sumatera), dekat Minahasa (di Pulau Sulawesi) dan Ternate, Tidore, Makian, Ambon, Nusa Laut, Saparua, Amadina, Seram dan Banda (di Kepulauan Maluku). Sebagai penghasil cengkeh utama di Indonesia adalah Maluku (Guenther, 1990). Selain terdapat pada cengkeh, eugenol terdapat pula pada pala, kulit manis, salam dan daun sirih (Manopo, 2008). 2.1.3.Pemanfaatan Eugenol Eugenol memiliki aroma yang menyegarkan dan pedas seperti bunga cengkeh kering, sehingga sering menjadi komponen untuk menyegarkan mulut. Eugenol dimanfaatkan sebagai pengaroma parfum, makanan dan pengobatan (antiseptik dan anestetik) (Manopo, 2008). US Food and Administration (FDA) menyetujui penggunaan eugenol sebagai bahan perasa, analgesic dan semen gigi, pewangi dan aromaterapi serta pada obat transdermal delivery system. Eugenol juga diketahui memiliki aktivitas antibakteri, antifungi, antivirus, antitumor, antioksidant dan insektisida (Anonim, 2008).
7
2.2 TANAMAN GAMBIR (Uncaria gambier Roxb.) 2.2.1
Klasifikasi Tanaman (Haryanto, 2009) Kingdom
: Plantae
Divisi
: Spermatophyta
Sub Divisi
: Angiospermae
Kelas
: Dicotyledone
Ordo
: Rubiales
Famili
: Rubiaceae
Genus
: Uncaria
Spesies
: Uncaria gambir Roxb.
Sinonim
: Ourouparia gambir Roxb. Nauclea gambir
2.2.2
Nama Daerah Sumatera
: Gambe, gani (Aceh), kacu (Gayo), sontang (Batak), gambe (Nias), gambie (Minangkabau), pengilom, sepelet (Lampung).
Jawa
: Gambir (Jawa), ghambhir (Madura).
Kalimantan
: Kelare (Dayak), abi (Kayan).
Sulawesi
: Gambere (Sangir), gambele (Gorontalo), gambere (Makassar), gaber (Majene).
Nusatenggara
:
Tagambe (Bima), gamur (Sumba), gabi
(Sawu),
gambe (Flores), nggame (Roti) (Depkes RI, 1989). Halmahera
: Gabi, gagabere (Hariana, 2004).
8
2.2.3
Uraian Tanaman Gambir berasal dari tumbuhan perdu yang membelit dan berbatang keras.Tinggi 1-3 cm. Batang tegak, bulat, percabangan simpodial warna cokelat pucat.Daun tunggal, berhadapan, bentuk elips, tepi bergerigi, pangkal bulat, ujung meruncing, panjang 8-13 cm. lebar 4-7 cm, warna hijau. Bunga majemuk, bentuk lonceng, di ketiak daun, panjang lebih kurang 5 cm, mahkota 5 helai berbentuk lonceng, tongkol-bulat, terdiri dari bunga kecil-kecil yang berwarna putih. Buah berbentuk bulat telur, panjang lebih kurang 1,5 cm, warna hitam (Haryanto, 2009 & Mardisiswojo, 1968).
2.2.4
Kandungan Kimia Senyawa flavonoid katekin (7-33%), asam katekutanat (20-50%) (Thorpe dan Whiteley, 1921) ; gambir Sumatera Barat memiliki kandungan katekin terbanyak (40-80%) (Amos,2010)
2.2.5
Manfaat Tumbuhan Sejak lama gambir digunakan sebagai komponen menyirih (Nazir, 2000). Manfaat glain gambir antara lain digunakan sebagai bahan baku shampo (Shamie et al, 2004), perekat kayu lapis dan papan partikel (Kasim, 2004). Dalam industry tekstil dan batik, gambir digunakan sebagai bahan baku pewarna yang tahan terhadap matahari (Risfaheri et al, 1995). Gambir juga digunakan sebagai penyamak kulit agar tidak terjadi pembusukan serta membuat kulit menjadi lebih renyah setelah dikeringkan (Bachtiar, 1991; Suherdi et al, 1991).
9
2.2.6
Efek Farmakologis Ekstrak gambir memiliki daya hambat terhadap bakteri Streptococcus mutans yang menyebabkan plak pada gigi (Kozai et al, 1995). Khasiat lainnya sebagai obat diare dan disentri serta obat kumurkumur pada sakit kerongkongan. Pada industri farmasi gambir digunakan sebagai bahan baku obat penyakit hati dengan paten catergen (Suherdi et al,1991; Nazir, 2000). Bahan infuse dari gambir digunakan untuk penyembuhan gangguan darah (Sukati dan Kusharyono, 2004), perangsang system saraf autonom (Kusharyono, 2004), sebagai antimikroba (Rahayuningsih et al, 2004) dan bahan toksisitas terhadap organ ginjal, hati, dan jantung (Armenia et al,2004)
2.2.7
Katekin Katekin termasuk golongan flavonoid, merupakan kerabat tanin terkondensasi dan memiliki banyak gugus fungsi hidroksil (Robinson, 1995).Katekin berwarna putih yang memiliki jarak lebur 175177oC (WHO, 1998).Katekin dapat larut dalam air hangat dan memiliki titik didih sebesar 254oC (Alamsyah, 2006). Katekin tidak stabil di udara terbuka dan mudah terurai oleh cahaya serta teroksidasi pada pH mendekati netral (pH 6,9) dan lebih stabil pada pH lebih rendah (pH 2,8 dan 4,9) (Lucida, 2006). Umumnya komponen yang terkadung didalam katekin yaitu (-)-epicatechin (EC), (-)-epicatechin gallate (ECG), (-)epigallocatechin (EGC), (+)-catechin dan (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) (Hartoyo, 2003), yang memiliki struktur sebagai berikut:
10
Gambar 2. Struktur dasar Katekin dan Galloyl Grup (Seeram et al, 2003)
Komponen Katekin
Konfigurasi
R1
R2
(-)-epicatechin (EC)
2S, 3R
OH
H
(-)-epicatechin gallate (ECG)
2R, 3R
GA
H
(-)-epigallocatechin (EGC)
2R, 3R
OH OH
(+)-catechin
2R, 3S
OH
(-)-epigallocatechin gallate (EGCG)
2R, 3R
GA OH
H
Tabel 1. Konfigurasi Komponen Katekin Katekin digunakan sebagai obat tukak lambung (Tika et al, 2004) dan dapat menghambat pertumbuhan tumor mamma pada mencit dengan rasio penghambatan sebesar 57,14% pada pemberian dosis 800 mg/kgBB/hari (Gunawijaya et al, 1999). Katekin juga memiliki aktifitas sebagai antimikroba, antioksidan, antiradiasi, memperkuat
pembuluh
seni.(Alamsyah, 2006).
darah
dan
melancarkan
sekresi
air
11
2.3
Simplisia Simplisia adalah bentuk jamak dari kata simpleks yang berasal dari kata simple, berarti satu atau sederhana. Istilah simplisia dipakai untuk menyebut bahan-bahan obat alam yang masih berada dalam wujud aslinya atau belum mengalami perubahan bentuk. Departemen kesehatan RI membuat batasan tentang simplisia bahwa simplisia adalah bahan alami yang digunakan untuk obat dan belum mengalami perubahan proses apapun, dan kecuali dinyatakan lain umumnya berupa bahan yang telah dikeringkan. Berdasarkan hal itu maka simplisia dibagi menjadi tiga golongan, yaitu simplisia nabati, simplisia hewani, dan simplisia pelikan/mineral (Depkes RI, 1979 & Gunawan, 2004). 2.3.1 Pengelolaan Simplisia a. Sortasi Basah Sortasi basah dilakukan untuk memisahkan kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing lainnya dari bahan simplisia. Misalnya simplisia yang dibuat dari akar suatu tanaman obat, bahan-bahan asing seperti tanah, kerikil, rumput, batang, daun, akar yang telah rusak, serta pengotoran lainnya harus dibuang. Tanah mengandung bermacam-macam mikroba dalam jumlah yang tinggi, oleh karena itu pembersihan simplisia dari tanah yang terikut dapat mengurangi jumlah mikroba awal (Gunawan, 2004). b. Pencucian Pencucian
dilakukan
untuk
menghilangkan
tanah
dan
pengotoran lainnya yang melekat pada bahan simplisia. Pencucian dilakukan dengan air bersih, misalnya air dari mata air, air sumur
12
atau air PAM. Bahan simplisia yang mengandung zat yang mudah larut di dalam air yang mengalir, pencucian hendaknya dilakukan dalam waktu yang sesingkat mungkin (Gunawan, 2004). c. Perajangan Beberapa jenis bahan simplisia perlu mengalami proses perajangan.
Perajangan
bahan
simplisia
dilakukan
untuk
mempermudah proses pengeringan, pengepakan dan penggilingan. Semakin tipis bahan yang akan dikeringkan, semakin cepat penguapan
air,
sehingga
mempercepat
waktu
pengeringan
(Gunawan, 2004). d. Pengeringan Tujuan pengeringan ialah untuk mendapatkan simplisia yang tidak mudah rusak, sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama. Dengan mengurangi kadar air dan menghentikan reaksi enzimatik akan dicegah penurunan mutu atau perusakan simplisia. Air yang masih tersisa dalam simplisia pada kadar tertentu dapat merupakan media pertumbuhan kapang dan jasad renik lainnya. Proses pengeringan sudah dapat menghentikan proses enzimatik dalam sel bila kadar airnya dapat mencapai kurang dari 10 %. Hal-hal yang perlu diperhatikan selama proses pengeringan adalah suhu pengeringan, kelembapan udara, aliran udara, waktu pengeringan, dan luas permukaan bahan (Gunawan, 2004).
13
e. Sortasi Kering Sortasi setelah pengeringan merupakan tahap akhir pembuatan simplisia. Tujuan sortasi memisahkan benda-benda asing seperti bagian-bagian tanaman yang tidak diinginkan dan pengotoranpengotoran lain yang masih ada dan tertinggal pada simplisia kering. Proses ini dilakukan sebelum simplisia dibungkus untuk kemudian disimpan. Pada simplisia bentuk rimpang, sering jumlah akar yang melekat pada rimpang terlampau besar dan harus dibuang. Demikian pula adanya partikel-partikel pasir, besi dan benda-benda tanah lain yang tertinggal harus dibuang sebelum simplisia dibungkus (Depkes RI, 1999). f. Penyimpanan Setelah tahap pengeringan dan sortasi kering selesai maka simplisia perlu ditempatkan dalam suatu wadah tersendiri agar tidak saling bercampur antara simplsia satu dengan lainnya. Selanjutnya, wadah-wadah yang berisi simpilisia disimpan dalam rak pada gudang penyimpanan. Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi pengepakan dan penyimpanan simplisia adalah cahaya, oksigen atau sirkulasi udara, reaksi kimia yang terjadi antara kandungan aktif tanarnan dengan wadah, penyerapan air, kemungkinan terjadinya proses
dehidrasi,
pengotoran
atau
pencemaran,
baik
yang
diakibatkan oleh serangga, kapang atau lainnya (Gunawan, 2004). Untuk persyaratan wadah yang akan digunakan sebagai pembungkus simplisia adalah harus inert, artinya tidak mudah
14
bereaksi dengan bahan lain, tidak beracun, mampu melindungi bahan simplisia dari cemaran mikroba, kotoran, serangga, penguapan kandungan aktif serta dari pengaruh cahaya, oksigen dan uap air (Gunawan, 2004). 2.4
Ekstrak dan Ekstraksi 2.4.1
Pengertian Ekstrak dan Ekstraksi Ekstrak adalah sediaan cair yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukakn sedemikian sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Depkes RI, 1995). Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia yang akan diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang tidak dapat larut dan mempunyai struktur kimia yang berbeda-beda yang dapat mempengaruhi kelarutan dan stabilitas senyawa-senyawa tersebut terhadap suhu, udara, cahaya, dan logam berat (Depkes RI, 2000). Sistem pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus dipilih berdasarkan kemampuannya
dalam
melarutkan
jumlah
yang
maksimum dari zat aktif dan seminimal mungkin bagi unsur yang tidak diinginkan.
15
2.4.2
Cara Pembuatan Ekstrak Proses ekstraksi (pembuatan ekstrak) terdiri atas beberapa tahap, yaitu: 1. Pembuatan serbuk Proses awal pembuatan ekstrak adalah tahapan pembuatan serbuk simplisia yang kering (penyerbukan). Dari simplisia dibuat serbuk simplisia dengan peralatan tertentu sampai derajat kehalusan tertentu. 2. Cairan pelarut Faktor utama untuk pertimbangan pada pemilihan cairan penyari adalah sebagai berikut : selektivitas, kemudahan bekerja dan proses dengan cairan tersebut, ekonomis, ramah lingkungan, keamanan. 3. Separasi dan pemurnian Proses-proses pada tahapan ini adalah pengendapan, pemisahan dua cairan tak campur, sentrifugasi, dekantasi, dan filtrasi. 4. Pemekatan / penguapan (vaporasi dan evaporasi) Pemekatan berarti peningkatan jumlah partikel solute (senyawa terlarut) secara penguapan pelarut tanpa sampai menjadi kondisi kering, ekstrak hanya menjadi kental/pekat. 5. Pengeringan ekstrak Pengeringan berarti menghilangkan pelarut dari bahan sehingga menghasilkan serbuk, masa kering-rapuh, tergantung proses dan peralatan yang digunakan.
16
6. Rendemen Rendemen adalah perbandingan antara ekstrak yang diperoleh dengan simplisia awal (Depkes RI, 2000). 2.4.3
Metode Ekstraksi Ada dua cara ekstraksi, yaitu : a. Cara dingin 1) Cara maserasi Maserasi
adalah proses pengekstrakan simplisia dengan
menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruang (kamar). Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol atau pelarut lain. Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan
peralatan
yang
digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Sedangkan kerugian dari maserasi adalah pengerjaannya lama dan penyariannya kurang sempurna. 2) Perkolasi Perkolasi adalah ekstrak dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur ruang.
17
b. Cara panas 1) Refluks Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Biasanya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5 kali sehingga terbentuk proses ekstraksi sempurna. 2) Soklet Soklet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang baru, secara umum dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. 3) Digesti Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinyu) pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan yaitu secara umum pada temperature 40-50°C. 4) Infus Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air mendidih (96-98°C) selama waktu tertentu (15-20 menit). 5) Dekok Dekok adalah infuspada waktu yang lebih lama(>30°C) dan temperatur sampai titik didih air (Depkes RI, 2000).
18
2.4.4
Parameter Ekstrak Parameter non spesifik ekstrak terdiri dari: a. Susut pengeringan Susut pengeringan adalah pengukuran sisa zat setelah pengeringan pada temperatur 105oC selama 30 menit atau sampai berat konstan, yang dinyatakan sebagai nilai persen (%). Tujuannya untuk memberikan batasan maksimal (rentang) tentang besarnya senyawa yang hilang pada proses pengeringan. Nilai untuk susut pengeringan jika tidak dinyatakan lain adalah kurang dari 10 %. b. Kadar air Kadar air adalah pengukuran kandungan air yang berada di dalam bahan. Tujuannya untuk memberikan batasan maksimal (rentang) tentang besarnya kandungan air di dalam bahan. Nilai untuk kadar air sesuai dengan yang tertera dalam monografi. c.
Kadar abu Untuk penentuan kadar abu, bahan dipanaskan pada temperatur dimana senyawa organik dan turunannya terdestruksi dan menguap sehingga hanya tersisa unsur mineral dan anorganik. Tujuannya adalah untuk memberikan gambaran tentang kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai terbentuknya ekstrak. Nilai untuk kadar abu sesuai dengan yang tertera dalam monografi (Depkes RI,2000 ).
19
2.5
Kanker 2.5.1
Pengertian Kanker Kanker atau neoplasma merupakan massa jaringan abnormal dengan
pertumbuhan
berlebihan,
tidak
berkoordinasi
dengan
pertumbuhan jaringan normal, dan tetap tumbuh secara berlebihan setelah stimulus yang menimbulkan perubahan tersebut berhenti (Robbins dan Kumar, 1995). Sel kanker akan menyusup ke jaringan sekitarnya (invasif), lalu bermetastasis ke tempat yang lebih jauh melalui pembuluh darah dan getah bening (Dalimartha, 2001). Sifat umum dari kanker adalah sebagai berikut : 1. Pertumbuhan berlebihan umumnya membentuk tumor. 2. Gangguan diferensasi dari sel dan jaringan mirip jaringan mudigah. 3. Bersifat invasif, mampu tumbuh di jaringan di dekatnya (perbedaan pokok dengan jaringan normal) 4. Bersifat metastatik, menyebar ke tempat lain dan menyebabkan pertumbuhan baru; 5. Memiliki acquired heredity, yaitu keturunan sel kanker juga dapat menimbulkan kanker. 6. Pergeseran metabolisme ke arah pembentukan makromolekul dari nukleosida dan asam amino dan peningkatan katabolisme karbohidrat untuk energi sel. (Farmakologi dan terapi ed. 2 FKUI 1980) Kanker dibedakan menurut jaringan tempatnya berasal yaitu adenoma (benjolan maligne pada kelenjar), limfoma (kanker pada kelenjar limfe), sarkoma (kanker dari pembuluh darah, jaringan ikat, otot
20
atau tulang), leukimia (kanker yang berhubungan dengan produksi leukosit abnormal), myeloma (kanker pada sumsum tulang), carcinoma (kanker pada kelenjar) dan melanoma (kanker pada kulit) (Tjay, 2002). Penyebab
yang
dapat
merangsang
pembentukan
kanker,
diantaranya (Dalimartha, 2001): a. Senyawa kimia (karsinogen), seperti zat pewarna, pengawet, merkuri, dll. b. Faktor fisika, misalnya radioterapi agresif (radiasi sinar pengion). c. Virus, contoh: virus hepatitis B dan C penyebab hepatis kronis, Humam Papilloma Virus (HPV) penyebab kanker serviks, dll. d. Hormon, pemberian hormon tertentu secara berlebihan dapat menimbulkan kanker seperti payudara, rahim, indung telur dan prostat. e. Faktor genetis, dapat terjadi apabila individu memiliki gen rusak yang diwariskan secara genetis dari orang tuanya. Kanker dapat terjadi melalui beberapa tahapan, yaitu (Miller, 2008):
Fase inisiasi, terjadi kerusakan secara langsung dalam bentuk terjadinya mutasi pada DNA dalam sel. Kerusakan akan terbawa pada sel anak yang dihasilkan dari pembelahan oleh sel-sel.
Fase promosi, terjadi perkembangbiakan pada sel yang rusak, hal ini terjadi ketika sel-sel yang mengalami mutasi itu terkena zat karsinogen yang mendorong terjadinya pembelahan secara cepat.
21
Fase progresi, gen-gen pertumbuhan yang diaktivasi oleh kerusakan DNA mengakibatkan mitose dipercepat dan pertumbuhan liar dari selsel ganas. Tumor menjadi manifes. Pengobatan kanker dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu
pembedahan, radioterapi, kemoterapi, imunoterapi, pengobatan dengan hormon serta tumbuhan obat, simplisia dari binatang dan mineral lainnya (Dalimartha, 2001). 2.5.2
Kanker Serviks Penyakit ini berawal dari infeksi virus yang merangsang perubahan perilaku sel epitel serviks.Sel kanker serviks pada awalnya berasal dari epitel serviks yang mengalami mutasi genetik sehingga mengubah perilakunya.Sel yang bermutasi ini melakukan pembelahan sel yang tidak terkendali, immortal dan menginvasi jaringan stroma di bawahnya. Keadaan yang menyebabkan mutasi genetik yang tidak dapat diperbaiki akan menyebabkan terjadinya pertumbuhan kanker ini. (Desen, 2008) Faktor risiko yang merupakan pencetus kanker serviks, antara lain (Rasjidi, 2007): d. Infeksi Human Papilloma Virus (HPV), yang termasuk golongan papovavirus yaitu virus DNA bersifat mutagen memiliki ukuran 55 nm. Tipe HPV antara lain 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 69, diperkirakan masih banyak beberapa tipe lain. Di Indonesia tipe virus risiko tinggi
22
penyebab kanker adalah tipe 16, 18 dan 52. Tipe ini menimbulkan lesi rata dan tidak terlihat sedangkan tipe risiko rendah menimbulkan pertumbuhan seperti jengger ayam pada tipe HPV 6 dan 11 (Aziz, 2006). e. Berganti-ganti mitra seks dan usia saat melakukan hubungan seks yang pertama dibawah umur 15 tahun. f. Merokok, asap rokok bersifat karsinogen dan mutagen. g. Defisiensi terhadap asam folat, vitamin C, E, beta karoten dihubungkan dengan risiko kanker serviks. 1. Gejala dan Tanda Kanker Serviks (Buku Acuan Nasional Onkologi Ginekologi, 2006) Tanda dini kanker serviks tidak spesifik seperti adanya sekret vagina yang agak banyak dan kadang-kadang dengan bercak pendarahan.Umumnya tanda yang sangat minimal ini sering diabaikan oleh penderita. Tanda yang lebih klasik adalah pendarahan bercak yang berulang, atau pendarahan bercak setelah bersetubuh atau membersihkan vagina.Dengan makin tumbuhnya penyakit, tanda menjadi semakin jelas.Pendarahan menjadi semakin banyak, lebih sering, dan berlangsung lebih lama. Juga dapat dijumpai sekret vagina yang berbau terutama dengan massa nekrosis lanjut. Nekrosis terjadi karena pertumbuhan tumor yang cepat tidak diimbangi pertumbuhan pembuluh darah (angiogenesis) agar
23
mendapat aliran darah yang cukup.Nekrosis ini menimbulkan bau yang tidak sedap dan reaksi peradangan non spesifik. Pada stadium lanjut ketika tumor telah menyebar ke luar dari serviks dan melibatkan jaringan di rongga pelvis dapat dijumpai tanda lain seperti nyeri yang menjalar ke pinggul atau kaki. Hal ini menandakan keterlibatan ureter, dinding panggul, atau nervus skiatik.Beberapa penderita mengeluhkan nyeri berkemih, hematuria, perdarahan rektum sampai sulit berkemih dan buang air besar.Penyebaran ke kelenjar getah bening tungkai bawah dapat menimbulkan oedema tungkai bawah, atau terjadi uremia bila telah terjadi penyumbatan kedua ureter. 2.Terapi Secara umum jenis terapi yang dapat diberikan bergantung pada usia dan keadaan umum penderita, luasnya penyebaran, dan komplikasi
lain
yang
menyertai.
Untuk
ini,
diperlukan
pemeriksaan fisik yang seksama.Juga diperlukan kerjasama yang baik antara ginekologi onkologi dengan radioterapi dan patologi anatomi. Pada umumnya kasus stadium lanjut dipilih pengobatan radiasi
yang diberikan secara intrakaviter dan eksternal,
sedangkan stadium awal dapat diobati melalui pembedahan atau radiasi.
24
Terapi tunggal baik radiasi atau operasi merupakan pilihan bila kanker serviks dapat didiagnosis dalam stadium dini. 2.6
HeLaCell Line Sel HeLa ini berasal dari tumor ganas serviks milik Henrietta Lacks. Sel ini telah digunakan di laboratorium di seluruh dunia tak terhitung jumlahnya. Sel tersebut telah membantu penemuan beberapa penelitian. Kutipan ilmiah di US National Library of Medicine menunjukkan bahwa ada sekitar 61.911 studi yang telah menggunakan sel ini. sel HeLa telah menjadi komponen berharga dalam memahami penyakit pada tingkat molekul khususnya model pemahaman kanker invitro. Selain itu, sel ini telah berperan dalam penyaringan obat anti-kanker. Sebagai contoh, sel ini digunakan untuk menyebarkan virus polio yang akhirnya mengarah pada penemuan dan pengembangan vaksin polio. Saat ini strategi tersebut digunakan dalam berbagai laboratorium di seluruh dunia untuk pengembangan vaksin. Sel HeLa adalah sel kanker leher rahim akibat infeksi Human Papillomavirus (HPV 18) sehingga mempunyai sifat yang berbeda dengan sel leher rahim normal. Sel kanker leher rahim yang diinfeksi HPV diketahui mengeekspresikan 2 onkogen, yaitu E6 dan E7. Protein E6 dan E7 terbukti dapat menyebabkan sifat imortal pada kultur primer keratinosit manusia, namun sel yang imortal ini tidak bersifat tumorigenik hingga suatu proses genetik terjadi. Jadi, viral onkogen tersebut tidak secara langsung menginduksi pembentukan tumor, tetapi menginduksi serangkaian proses yang pada akhirnya dapat menyebabkan sifat kanker (Goodwin dan DiMaio, 2000).
25
Sel HeLa merupakan kategori cell line atau sel lestari, yaitu kultur sel yang berasal dari organ atau jaringan yang telah diuraikan secara mekanis dan atau enzimatis menjadi suspensi sel. Suspensi tersebut kemudian dibiakkan menjadi satu lapisan jaringan (monolayer) diatas permukaan yang keras (botol, tabung, cawan) atau menjadi suspensi sel dalam media penumbuh. Monolayer tersebut kemudian dapat diperbanyak lagi sesudah melalui proses pemisahan sel secara enzimatis dan diencerkan dengan media penumbuh. Apabila di subkultur terus menerus maka dihasilkan sel lestari (Malole, 1990). 2.7
Antikanker 2.7.1
Obat Antikanker Obat antikanker merupakan senyawa kemoterapetik untuk pengobatan tumor yang membahayakan dan diharapkan memiliki toksisitas selektif dalam menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel jaringan normal. Terapi dikatakan berhasil apabila mematikan sel tumor yang ganas dan tidak mengganggu sel normal yang berproliferasi (Departemen Farmakologi dan Terapeutik, 2007; Siswandono, 2000)
2.7.2
Mekanisme Kerja Obat Antikanker (Siswandono, 2000; Departemen Farnakologi dan Terapeutik, 2007) Antikanker bekerja berdasarkan gangguan pada salah satu proses sel yang esensial, dengan cara mempengaruhi metabolisme asam nukleat terutama DNA atau biosintesis protein . Sel memiliki siklus kehidupan yang terdiri dari beberapa fase, antara lain:
26
1. Fase mitosis (M), terjadi pembelahan sel aktif. Replikasi kromosom terpisah menjadi dua inti anak sel yang berlangsung selama 1 jam. Pada fase ini terjadi dua alternatif yaitu: a. Menuju fase G1 dan memulai proses proliferasi. b. Masuk ke fase istirahat (Go), kemampuan sel untuk berproliferasi hilang dan sel meninggalkan siklus secara tidak terpulihkan. 2. Fase post mitotik (G1), terjadi sintesis RNA dan protein. Pada fase akhir terjadi sintesis RNA yang optimum. Fase ini umumnya terjadi kurang lebih 5 jam. 3. Fase sintetik (S), terjadi replikasi DNA dengan bantuan DNApolimerase yang menghasilkan DNA baru, sehingga rantai tunggal DNA menjadi rantai ganda. Fase ini terjadi selama 7 jam. 4. Fase post sintetik (G2), terjadi bila sel telah menjadi tetraploid dan mengandung dua DNA, kemudian sintesis RNA dan protein dilanjutkan. Fase ini terjadi selama 3 jam. Selanjutnya sel kembali ke fase mitotik. 2.7.3
Golongan Obat Antikanker a.
Senyawa Pengalkilasi Senyawa pengalkilasi membentuk senyawa kationik antara yang tidak stabil, diikuti pemecahan cincin membentuk ion karbonium reaktif yang akan bereaksi melalui reaksi alkilasi sehingga terjadi cross-linking (saling mengikat) antara rantai-rantai DNA di dalam inti sel. Akibatnya proses pembentukan sel terganggu sehingga pertumbuhan sel kanker terhambat. Senyawa ini untuk
27
pengobatan limfosarkoma, penyakit Hodgkin, leukimia limfositik dan
mieloma.
Contoh
senyawa
pengalkilasi:
mekloretamin,
klorambusil, siklosfosfamid, bisulfan, dan karmustin (Tjay, 2002; Siswandono, 2000). b. Antimetabolit Antimetabolit menghambat asam folat, purin, pirimidin dan asam amino, serta jalur nukleosida pirimidin pada sintesis DNA sel kanker. Replikasi DNA dapat dihambat secara langsung maupun tidak langsung yang menyebabkan sel tidak berkembang biak dan mengalami kematian (Siswandono, 2000; Tjay, 2002). Berdasarkan sifat antagonismenya, golongan ini terdiri dari empat kelompok yaitu (Siswandono, 2000; Tjay, 2002): 1) Antagonis Pirmidin Obat golongan ini mengalami anabolisme menjadi senyawa aktif secara in vivo, sehingga dapat mempengaruhi sintesis DNA pada fase awal yang menyebabkan kekosongan asam timidilat akibatnya sel mengalami kematian. Contoh: 5-fluorourasil, sitarabin, tegafur dan floksuridin. 2) Antagonis Purin Antagonis
purin
menjadi
aktif
setelah
mengalami
anabolisme menjadi nukleotida dan terkadang menjadi turunan difosfat atau trifosfat. Contoh: 6-merkaptopurin, azatioprin dan tioguanin.
28
3) Antagonis Asam Folat Pada golongan ini obat bekerja tidak khas dengan menghambat secara bersaing dihidrofolat reduktase (enzim yang mengkatalisis
reduksi
asam
dihidrofolat
menjadi
asam
tetrahidrofolat). Antagonis asam folat mengikat enzim tersebut sehingga terjadi hambatan tak terpulihkan. Penghambatan enzim dihidrofolat reduktase menyebabkan hambatan sintesis DNA, RNA dan protein. Antagonis asam folat menghambat timidilat sintetase sehingga menyebabkan kematian sel karena kekurangan timin. Contoh: aminopterin, metotreksat dan ketotreksat. 4) Antagonis Asam Amino Antagonis asam amino menghambat beberapa proses metabolik yang memerlukan glutamin sebagai kofaktor. Aktivitas antikanker disebabkan oleh kemampuan menghambat fosforibosil
formilglisinamida
ribonukleotida
menjadi
fosmilglisinamidin ribonukleotida. Contoh: azaserin dan 6diazo-5-okso-L-norleusin (DON). c. Antikanker Produk Alam Senyawa antikanker ini dihasilkan dari alam dan memiliki khasiat sebagai antikanker. Obat antikanker golongan ini terbagi menjadi (Siswandono, 2000; Tjay, 2002): 1) Antibiotika Antikanker Efek samping berupa sitotoksik tinggi dari antibiotika yang dikembangkan sebagai senyawa antibakteri, kemudian dievaluasi
29
dan
dikembangkan
menjadi
obat
antikanker.
Antibiotika
antikanker sukar diabsorpsi pada saluran cerna sehingga diberikan melalui
parenteral.
Contoh:
mitomisin,
daktinomisin,
doksurubisin, dan bleomisin. 2) Antikanker Produk Tanaman Obat-obat antikanker golongan ini bekerja dengan mengikat tubuli dan menghambat pertumbuhan komponen mikrotubuli pada kumparan mitosis sehiggga metafase berhenti. Alkaloid vinca bekerja pada fase M, vinkristin memiliki kemampuan penetrasi ke dalam sel kanker yang lebih baik dibanding vinblastin. Contoh: vinblastin, vinkristin, dan podophyllotoksin (seperti etoposida). 3) Antikanker Produk Rekayasa Genetika Obat yang termasuk dalam golongan ini yaitu interferon α2a (Roferon-A) dan interferon α-2b (Intron-A) yang mengandung 165 asam amino, dihasilkan melalui teknologi rekombinan DNA menggunakan rekayasa genetik pada strain E.coli. contoh lainnya: antineoplaston dan avaron. d. Hormon Hormon androgen, progestin, estrogen dan adrenokortikoid mengikat secara khas reseptor pada sitoplasma dan mengubah struktur reseptor. Bentuk kompleks hormon-reseptor menuju inti, berinteraksi dengan sisi aseptor sehingga mempengaruhi proses transkripsi (Siswandono, 2000; Tjay, 2002).
30
e. Golongan Lain-lain Sitostatika
lainnya
yang
digunakan
berupa
enzim
asparaginase, senyawa-senyawa platina berupa sisplatin dan karboplatin,
hidroksiurea,
procarbazin
dan
topotecan
yang
menghambat enzim topoisimerase-1, yang terlibat pada replikasi DNA. Kompleksnya dengan DNA distabilkan, menimbulkan cacat dan matinya sel (Siswandono, 2000; Tjay, 2002).
2.8
Cisplatin (Farmakologi dan terapi 2008) Cisplatin merupakan obat kanker golongan platinum.Cisplatin juga merupakan metal inorganik.Karena toksisitas cisplastin yang mempunyai sitotoksisitas sinergik dengan radiasi dan obat kemoterapi lain (Mary dan Pamela, 2001; Departemen Farmakologi dan terapi, 2008). Obat ini ditemukan secara kebetulan melalui observasi bahwa komplek platinum menghambat pembelahan Escherichia coli.Golongan obat ini membunuh sel pada semua siklus pertumbuhannya, menghambat biosintesis DNA dan berikatan dengan DNA membentuk ikatan silang (cross linking).Tempat ikatan utama adalah N7 pada guanin, namun juga terbentuk ikatan kovalen dengan adenin dan sitosin.Cisplatin terutama efektif untuk tumor padat seperti karsinoma paru (sel sekil dan sel non kecil), kanker esofagus, gaster, leher dan kepala, genito urinaria (testis, ovarium, buli– buli).Cisplatin dalam kombinasi dengan vinblastin dan23 bleomisin, atau etoposid dan bleomisin dapat memberi hasil yang kuratif untuk tumor testis.(Departemen Farmakologi dan terapi, 2008).
31
Karena toksisitas cisplastin yang mempunyai sitotoksisitas sinergik dengan radiasi dan obat kemoterapi lain (Mary dan Pamela, 2001). 1). Mekanisme kerja: Mekanisme kerja
sama dengan alkilator. Golongan obat ini
membunuh sel pada semua siklus pertumbuhannya, menghambat biosintesis DNA dan berikatan dengan DNA membentuk ikatan silang (cross linking). Sitotoksisitas dapat terjadi pada setiap tahap pengembangan siklus sel, tetapi sel yang paling peka adalah fase G1 dan S. Tempat ikatan utama adalah N7 pada guanin, namun juga terbentuk ikatan kovalen dengan adenin dan sitosin. Pada lingkungan plasma yang tinggi klorida, cisplastin menetapkan sebagai jenis netral, yang masuk sel dan terikat pada N’ guanine DNA, membentuk crosslink inter- dan intra- strand. Lesi sitotoksik yang menghambat sintesis DNA dan RNA (Mary dan Pamela, 2001). 2). Farmakokinetik Cisplatin dan Karboplatin diberikan IV dalam cairan garam, obat-obat ini dapat juga diberikan interperitonial untuk kanker ovarium.Lebih dari 90% cisplatin diikat oleh serum protein.Konsentrasi tertinggi ditemukan dalam hati, ginjal, usus, sel-sel testis dan ovarium, tetapi sedikit yang dapat masuk kedalam cairan serebrospinal (CSS).Ginjal merupakan saluran ekstraksi yang utama. Efek samping dari cisplatin antara lain
muntah yang hebat dan
persisten terjadi 1 jam setelah 24 pemberian cisplatin dan dapat berlangsung sampai 5 hari (Mary dan Pamela, 2001; Departemen Farmakologi dan terapi, 2008).
32
3). Penggunaan dalam terapi Cispaltin banyak digunakan untuk pengobatan tumor padat seperti metastasis karsinoma testis dikombinasikan dengan vinblastin dan bleomisin, karinoma ovarium kombinasi dengan siklofosfamid, atau tunggal untuk karsinoma kanndung kemih (Mary dan Pamela, 2001). 4). Efek samping Muntah yang hebat dan persisten terjadi 1 jam setelah pemberian cisplatin dan dapat berlangsung sampai 5 hari. Premedikasi dengan antiemetik biasanya dapat menolong.Toksisitas terbatas yang paling sering adalah nefrotoksisitas yang tergantung dosis, menyangkut tubulus renalis kontortus distal dan tubulus renalis rektus.Kedaan ini diperburuk oleh hidrasi hebat dan diuresis (Mary dan Pamela, 2001). Efek samping utama cisplat in adalah nefrotoksisitas.Hidrasi yang cukup dengan garam fisiologis atau manitol penting untuk mengurangi nefrotoksisitas.Selain itu, cisplatin juga menyebabkan neurotoksisitas perifer yang irreversibel (Departemen Farmakologi dan terapi, 2008).
2.9
Kultur Sel (Malole, 1990; Freshney,1992) Kultur sel berasal dari organ atau jaringan yang telah diuraikan secara mekanis atau enzimatis menjadi suspensi sel kemudian dibiakan menjadi satu lapisan jaringan (monolayer) diatas permukaan keras (botol, tabung dan cawan) atau menjadi suspensi sel dalam media penumbuh.Monolayer dapat
33
diperbanyak dan diencerkan pada media penumbuh disebut teknik subkultur (pasase). Subkultur yang dilakukan terus-menerus akan dihasilkan sel lestari dengan sifat meningkatnya jumlah sel, memiliki daya tumbuh tinggi, sel-sel tersebut seragam dan mengalami perubahan fenotip atau transformasi. Kultur sel memerlukan adanya pergantian medium secara berkala yang diikuti subkultur jika sel-sel berproliferasi, intervalnya berbeda-beda sesuai jenis sel yang tergantung pada kecepatan pertumbuhan dan metabolisme sel. Sel disimpan dalam inkubator pada lingkungan ber CO2 dengan suhu 37oC. Persediaan sel manusia dan hewan yang akan dibiakan dalam kultur, disimpan beku dalam nitrogen cair. Selama proses penyimpanan ini digunakan larutan dimetil sulfoksida (DMSO) sebagai agen krioprotektan bersama medium untuk mengawetkan sel pada suhu dibawah -70°C. DMSO juga memiliki kemampuan untuk berpenetrasi kedalam sel dan membekukan cairan sel tanpa menyebabkan terbentuknya kristal es. Subkultur bertujuan untuk memperbanyak kultur sel, selain itu juga untuk mempertahankan kelangsungan hidup sel karena labu kultur yang telah penuh dengan sel akan menghambat pertumbuhan sel itu sendiri.Pengaruh lingkungan kultur meliputi: 1. Kondisi alami substrat yang terdiri dari: a. Substrat Kebanyakan sel yang dikultur invitro tumbuh sebagai kultur selapis pada substrat buatan. Labu ukur kultur jaringan (tissue kultur flask)
34
terbuat dari plastik polistiren yang telah diolah dengan radiasi sinar gamma, dengan zat kimia atau dengan pengisian muatan listrik untuk menghasilkan permukaan yang bermuatan sehingga mudah terbasahi. b. pH kebanyakan sel turunan akan tumbuh baik pada pH 7,4 walaupun pH optimum untuk pertumbuhan sel bervariasi antara beberapa jenis sel. c. Dapar (buffer) Dapar ditambahkan kedalam medium untuk mempertahankan pH. Dapar natrium bikarbonat paling sering digunakan karena toksisitasnya rendah, murah dan memberikan nutrisi bagi kultur sel. 2. Komposisi medium Komposisi medium sangat beragam, mulai dari asam amino esensial, vitamin dan garam sampai dengan senyawa yang kompleks 3. Penyusunan fase lag gas (dalam inkubator) Meliputi oksigen dan karbondioksida. 4. Suhu inkubasi Suhu yang biasa digunakan untuk kebanyakan sel turunan adalah 37°C, yang dekat dengan suhu tubuh manusia.
35
2.10 UJI ANTIPROLIFERATIF Proliferasi adalah pertumbuhan sel kanker yang tak terkendali sehingga berhasil membentuk kelompok. Aktivitas antiproliferasi terhadap suatu sel dan harga IC50 ditetapkan melalui uji sitotoksik dan pengamatan kinetika proliferasi dengan metode MTT (Utami, Dwi. 2007) Adanya kemampuan bertahan hidup diartikan sebagai tidak hilangnya kemampuan metabolik atau proliferasi dan dapat diukur dari pertambahan jumlah sel, peningkatan jumlah protein atau DNA yang disintesis. Uji antiproliferatif merupakan salah satu metode untuk mengetahui pertumbuhan sel diukur dari persamaan regresi linear yang dibuat dari slope sehingga menggambarkan kinetika proliferasi sel. Uji ini didasarkan pada uji sitotoksisitas. Jumlah sel yang bertahan hidup pada uji sitotoksisitas ditetapkan dengan beberapa cara yang didasarkan pada parameter kerusakan membran meliputi perhitungan sel yang mengambil (uptake) atau tidak mengambil bahan pewarna seperti biru tripan (Freshney, 1987; Malole, 1990). 2.10.1 Metode Pengujian Antiproliferatif Metode
pengujian
antiproliferatif
dilakukan
dengan
mengghunakan metode reduksi pewarna tetrazolium, menggunakan garam tetrazolium (MTT) yang merupakan singkatan dari (3–[4,5– dimethylthiazol–2Yi]–2,5–diphenyl
tetrazolium
bromide)
yaitu
metode penghitungan sel hidup dengan pewarnaan (kolorimetri) untuk menghitung jumlah sel hidup berdasarkan reduksi oleh enzim suksinat dehidrogenase mitokondria pada sel dari garam tetrazolium (MTT) yang berwarna kuning menjadi produk kristal formazan
36
berwarna ungu. Sel didistribusikan ke dalam sumuran dan diinkubasi, masing-masing sumuran ditambahkan 10 μL MTT. Kemudian diinkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 37oC. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu (Freimoser et al, 1999, Sieuwerts, 1995).
Gambar 3. MTT direduksi menjadi Formazan
2.11 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ELISA merupakan alat uji serologis yang digunakan untuk menemukan antigen tunggal atau antibodi dalam cairan biologis dan penetapan kadar imunosorben taut-enzim. Uji ini dibagi menjadi dua jenis yaitu competitive assay yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim dan non-competitive assay yang menggunakan dua antibodi, antibodi kedua akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator (Baratawidjaya, 2004).
37
2.12 Potensi Penelitian Penelitian-penelitian terdahulu membuktikan adanya potensi yang baik dari senyawa katekin maupun eugenol.Baik secara umum, maupun secara khusus, yang dalam hal ini adalah penghambatan sel-sel kanker. katekin telah teruji memiliki efek antiinflamasi
dengan dosis
pemberian 100 dan 200 mg/KgBB pada marmut (Arundina et al, 2003). Rasio penghambatan pertumbuhan tumor mamma dicapai katekin hingga 57.14% dengan dosis 800 mg/kgBB/hari (Gunawijaya e.t al., 1999). Aktivitas katekin sebagai antioksidan yang diujikan pada suhu 400, 500 dan 600C masingmasing menunjukkan rasio penghambatan sebesar 37,55%, 36,51% dan 29,67% (Hukmah, 2007). Aktivitas katekin sebagai antivirus ditunjukkan oleh derivatisasinya yaitu
epigallokatekin
galat
(EGCG),
epikatekin
galat
(ECG)
dan
epigallokatekin (EGC) yang masing-masing senyawa memiliki nilai EC50 sebesar 22-28 µM, 309-318 µM dan 22-40 µM (Min Song et al, 2005). Epigalokatekin galat (EGCG) memiliki aktivitas sebagai antifungi yang diujikan pada Candida albicans dengan persentase penghambatan sebesar 90% pada konsentrasi 2000 mg/L pada pH 6, 500-1000 mg/L pada pH 6,5 dan 15,6-250 mg/L pada pH 7 (Hirasawa and Takada, 2004). Penelitian yang dilakukan oleh Sadava et. al., (2007) menunjukkan bahwa EGCG mampu mereduksi aktivitas telomerase SCLC (Small-cell Lung Carcinoma) sebesar 50-60% pada konsentrasi IC50 32,1 ppm. Penelitian lainnya oleh menunjukkan bahwa katekin hidrat mampu menghambat proliferasi sel MCF-
38
7 (kanker payudara) yang dikultur selama 48 jam pada konsentrasi 300 µg/ml sebesar 52,95% (Alshatwi, 2010). Eugenol dilaporkan dapat menginduksi apoptosis pada sel melanoma manusia (G361) hingga 50% dalam masa inkubasi selama 24 jam dan 100% dalam masa inkubasi 72 jam (Kim, 2006). Uji antiproliferatif eugenol terhadap sel melanoma malignant manusia (WM1205Lu) mengindikasikan bahwa eugenol dapat menginduksi apoptosis sel WM1205Lu, (Ghosh, 2005). Penelitian aktivitas sitotoksik dari pencampuran beberapa komponen minyak essensial dengan perbandingan 1:1 dan konsentrasi masing-masing komponen 50 μg/mLyang diujikan pada sel MCF-7 (sel kanker payudara) menunjukkan
persen
kematian
sel
eugenol
ataupun
campuran
eugenol:berberapa komponen minyak esensial sebesar < 50%, kecuali pada campuran eugenol:citral yang menunjukkan persen kematian sebesar 90% (Wright, 2007) Efek antioksidant dari eugenol telah dibandingkan dengan beberapa senyawa fenol lainnya, yaitu 4-allyl-2,6-dimethoxyphenol; p,p’-biphenol; 2allyl-6-methylphenol; honokiol; magnolol; caffeic acid; p-ethylphenol dan guaiacol. Berdasarkan
hubungan struktur-aktivitas, aktivitas antioksidant
senyawa fenol yang dihasilkan 4-allyl-2,6-dimethoxyphenol p,p’-biphenol > eugenol > 2-allyl-6-methylphenol > honokiol > magnolol > caffeic acid > p-ethylphenol > guaiacol. Electron Spin Resonance Spin mendeteksi bahwa component fenol dengan substitusi alyl pada cincin aromatic mengikat Superoksida (O2-) dan hanya eugenol yang mengikat hydroxyl radicals
39
sehingga dapat berperan dalam menghentikan reaksi ikatan radikal bebas (Ogata, 1997). Kemampuan antiradikal dari minyak esensial Cinnamomum zelanycum, dengan komponen eugenol 89.1% memiliki aktivitas antiradikal efek dari minyak esensial lebih tinggi dari butylated hydroxyl toluene (BHT) (SC50= 7 mg/L) (Dongmo, 2007). Eugenol juga banyak digunakan dalam kepentingan kedokteran gigi. Salah satu pengujian dilakukan untuk mengetahui pengaruh penambahan eugenol dalam semen temporer. Evaluasi membuktikan eugenol mengurangi kekuatan ikatan padasemen temporer (Wazzan, 1997).
40
2.13 KERANGKA KONSEP PENELITIAN
Senyawa Eugenol
Potensi tanaman gambir (Unicaria gambier)
Pemanfaatan ilmiah : - Bahan baku dalam pembuatan obatobatan antihepatitis B, antidiare (Dharma, 1985). - penghambat pembentuk plak gigi (Kozai et al. 1995; Nazir 2000) - antimikroba, dan antinematoda (Alen, Bakhtiar, dan Noviantri 2004) - dsb
Pemanfaatan empris :
secara
- sebagai komponen menyirih - obat luka bakar (Malaysia) - obat sakit kepala (Kalimantan) - dsb
Pemanfaatan senyawa eugenol: - menghambat pertumbuhan tumor (Jaganathan, 2010) - menekan pertumbuhan sel kanker hati (Jaganathan, 2010)
Senyawa Katekin
Potensi katekin sebagai antikanker ditunjukkan oleh aktivitas derivatnya: EGCG mereduksi 50-60% aktivitas telomerase SCLC (Small-cell Lung Carcinoma) dengan IC50 32.1 ppm (Sadava et al., 2007), katekin hidrat (300 µg/mL) menghambat proliferasi sel MCF-7 (kanker payudara) sebesar 52.95% (Alshatwi, 2010). EGCG memiliki nilai IC50 sebesar 12.51 ppm dan 21.96 ppm untuk menghambat proliferasi sel kanker serviks yaitu sel CaSki dan sel HeLa (Qiao et al., 2009)
Perpaduan dua ekstrak herbal atau lebih memiliki fungsi, antara lain supaya komponenkomponennya saling mendukung atau saling mengurangi efek samping. (Sukardiman, 1999)
Uji Efek antiproliferatif
Analisa IC50 probit
41
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1Waktu dan Tempat Penelitian 3.1.1Waktu Penelitian Penelitian ini berlangsung mulai daribulan Mei hingga Oktober 2011. 3.1.2 Tempat Penelitian Pembuatan sampel uji dan uji antiproliferatif dilakukan di Laboratorium FKIK UIN dan Laboratorium Departemen Patologi dan Anatomi FKUI Salemba. 3.2Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Penelitian T-flask, Biological Safety Cabinet , Microplate 96 sumuran, Haemocytometer, Inkubator CO2, Mikroskop inverted, ELISA reader, Timbangan analitik, pisau, spatula, kertas karton, blender, erlenmeyer, gelas ukur, beker glass, labu ukur, evaporator, kertas saring, kapas, corong, spatula, kain, corong pisah, cawan penguap, vial, lemari es, oven, autoklaf, timbangan analitik, , sentrifuge, sentrifuge tube 15 dan 50 ml, Laminer Air Flow cabinet (LAF), tangki nitrogen cair, , Cryogenic vials, mikro pipet, pipet tips, pipet tips 5 ml, Syringe 200 CC, syringe filter (Corning), vortex, tabung conocal, , tabung falcon, hot plate HP-3000 (Lab Companion), kulkas 4 dan -20oC, kulkas 80oC, pipet tetes, tabung reaksi, ruang asam, hot plate, porselen, kamera digital.
42
3.2.2 Bahan yang Digunakan a. Sampel Uji Sampel uji yang digunakan dalam uji antiproliferasi ini adalah Eugenol dan Katekin gambir (Uncaria gambier, Roxb) dalam fase etil asetat yang telah diidentifikasi di Herbarium Bogoriense Litbang LIPI Bogor, Cibinong. b. Sel Uji Pada uji antiproliferatif ini, sel uji yang digunakan adalah sel HeLa yang diperoleh dari stok Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor – Bogor yang merupakan Pasase 3. c. Bahan Kimia yang Digunakan Aquadest, kloroform, etil asetat, etanol 70%, HCl, dragendorf, meyer, serbuk Mg, amil alkohol, FeCl3, pereaksi Stiasny (Formaldehid 30% : HCl pekat = 2 : 1), Na asetat, NaOH, pereaksi LiebermannBuchard (2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4 pekat), eter, ammonia (NH4OH) 10%, media sel DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (Sigma), Phosphate Buffered Salina (PBS), Penicillin-streptomisin (Pen-Strep), Fetal Bovine Serum (FBS) (Sigma), Trypsin EDTA 5% (Sigma), MTT [3-(4,5 dimetiltiazol-2-yI)2,5 difenil tetrazolium bromide] (Sigma), Trypan Blue (Sigma), Sodium
Duodecyl
Sulphate
(SDS)
Sulfoksida) (Sigma), dan Cisplatin®.
(Sigma),
DMSO
(Dimetil
43
3.3
Prosedur Penelitian 3.3.1
Penyiapan Simplisia Uji Penyiapan gambir yaitu dengan cara membersihkannya dari pengotor, gambir yang digunakan yaitu berupa bongkahan yang diperoleh dari Payakumbuh Padang Sumatera Barat. Bongkahan gambir kemudian dihaluskan sampai menjadi serbuk. Serbuk gambir tersebut diidentifikasi dan dilakukan pemeriksaan kadar urea untuk mengetahui kadar urea yang terkandung didalamnya.
3.3.2
Identifikasi Gambir 1. 2 mg serbuk gambir ditambahkan 5 tetes asam sulfat P warna coklat merah 2. 2 mg serbuk gambir ditambahkan asam sulfat 10 N warna coklat muda 3. 2 mg serbuk gambir ditambahkan 5 tetes Na hidroksida 5% dalam etanol warna coklat merah 4. 2 mg serbuk gambir ditambahkan 5 tetes ammonia 25% warna coklat merah 5. 2 mg serbuk gambir ditambahkan 5 tetes larutan FeCl3 5% coklat kehitaman (Depkes RI, 1989).
3.3.3
Identifikasi Cemaran Urea 100 mg serbuk gambir dilarutkan dalam 1 ml air, ditambahkan 1 ml asam nitrat P terbentuk endapan hablur putih (Sirait, 1995).
44
3.3.4
Isolasi Katekin Gambir Sebanyak 500 gram serbuk gambir diekstraksi dengan pelarut air pada temperatur mendidih 90-960C selama 15-20 menit sambil diaduk. Selanjutnya, infusa disaring dalam keadaan panas menggunakan corong yang dilapisi dengan kertas saring (DepKes, 1986). Residu dibilas kembali dengan air panas (900C) dan disaring hingga jernih. Filtrat dipartisi dengan etil asetat dengan perbandingan filtrat:etil asetat yaitu 1:½ kemudian ditambahkan dengan NaCl hingga jenuh. Fase air dipartisi kembali dengan etil asetat. Proses ini dilakukan hingga lima kali, kemudian fase air dibuang dan fase etil asetat yang diperoleh dikumpulkan untuk dievaporasi hingga kental, kemudian diberi air dingin, diambil endapannya dan dikeringkan menggunakan oven pada suhu 70oC, lalu dilakukan penetapan kadar katekin yang dibandingkan dengan katekin standar, penetapan kadar air dan kadar abu, uji jarak lebur dan penghitungan rendemen katekin total serta uji penapisan fitokimia.
3.3.5
Penapisan Fitokimia Pemeriksaan kandungan golongan senyawa kimia dari serbuk ekstrak air gambir (Unicaria gambir) yang dilakukan antara lain ialah ujialkaloid, flavonoid, saponin, tanin, steroid, glikosida, steroid, triterpenoid,dan kumarin. 1) Alkaloid Sebanyak 2 gram serbuk simplisia kemudian dilembabkan dengan 5ml ammonia 30%, digerus dalam mortir, selanjutnya
45
ditambahkan 20 mlkloroform dean digerus kembali dengan kuat. Campuran tersebut disaringdengan menggunakan kertas saring. Filtrat berupa larutan organik diambil(larutan A). Sebanyak 10 ml larutan A diambil kemudian diekstraksi dengan10 ml larutan HCl 1 : 10 dengan pengocokan dalam tabung reaksi, ambillarutan bagian atasnya (larutan B). Larutan A diteteskan beberapa tetes padakertas saring
dan
disemprot
atau
ditetesi
dengan
pereaksi
Dragendorf,terbentuk warna merah/jingga pada kertas saring menunjukkan adanyasenyawa alkaloid. Larutan B dibagi dalam dua tabung reaksi, kemudianditambahkan masing–masing pereaksi Dragendorf dan Mayer, terbentukendapan merah bata dengan pereaksi Dragendorf dan endapan putih denganpereksi Mayer menunjukkan adanya senyawa golongan alkaloid(Fransworth, 1969). 2) Glikosida 5 gram serbuk simplisia
dilarutkan dalam etanol 80%
demudiandisaring. Filtrat yang diperoleh kemudian diuapkan di atas hot plate. Filtratkering dicuci dengan n-heksana sampai larutan nheksana bening (pigmenhilang). Panaskan residu yang bebas lemak (untuk menghilangkan sisa n-heksana). Kemudian ditambahkan FeCl3 sebanyak 3 ml, lalu aduk sampaihomogen. Larutan kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudianditambahkan H2SO4 pekat (melalui dinding tabung reaksi), lalu didiamkan37beberapa saat.
Terbentuk
warna
merah
menjadi
cuklat
kemudian
46
menjadibiru/lembayung menunjukkan adanya glikosida (Guevara et al, 1985). 3) Saponin Ditimbang 0,5 gram serbuk simplisia, dimasukkan ke dalam tabungreaksi, kemudian ditambahkan 10 mL air panas, didinginkan dan kemudiankocok kuat-kuat selama 10 detik. (jika zat yang diperiksa berupa sediaancair, encerkan 1 mL sediaan yang diperiksa dengan 10 mL air dan kocok kuat-kuat selama 10 menit); sehingga terbentuk buih yang mantap selama tidakkurang dari 10 menit, setinggi 1 cm sampai 10 cm. Pada penambahan 1 tetesasam klorida 2 N, buih tidak hilang (Fransworth, 1969). 4) Flavonoid 2 gram serbuk simplisia ditambahkan 100 mL air panas, didihkanselama 5 menit. Setelah 5 menit, saring dengan kertas saring, diperolehfiltrat yang akan digunakan sebagai larutan percobaan. Kedalam 5 mL larutanpercobaan (dalam tabung reaksi), ditambahkan serbuk atau lempengmagnesium secukupnya dan 1 mL HCl pekat, tambahkan 5 mL amilalkohol,dikocok dengan kuat, biarkan hingga memisah, terbentuk warna dalamlarutan amilalkohol menunjukkan adanya senyawa flavonoid (Fransworth,1969). 5) Tanin 2 gram serbuk simplisia ditambahkan 100 mL air, didihkan selama 15 menit, dinginkan dan disaring dengan kertas saring dan filtrat dibagi duabagian. Kedalam filtrat pertama ditambahkan Ferri
47
(III) klorida 1%,terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman menunjukkan adanya senyawa golongan tanin. Kedalam filtrat yang kedua ditambahkan 15 mlpereaksi Stiasny (Formaldehid 30% : HCl pekat = 2:1), dipanaskan di ataspenangas air, terbentuk endapan warna merah muda menunjukkan adanyatanin katekuat. Selanjutnya endapan
disaring,
filtrat
dijanuhkan
dengannatrium
asetat,
ditambahkan beberapa tetes larutan Ferri (III) klorida 1%,terbentuk warna biru tinta menunjukkan adanya tanin galat (Fransworth,1969). 6) Kuinon 2 gram serbuk simplisia ditambahkan 100 ml air panas, didihkanselama 5 menit. Setelah 5 menit, saring dengan kertas saring, diperolehfiltrat yang akan digunakan sebagai larutan percobaan. Di dalam tabungreaksi, filtrat ditambahkan dengan beberapa tetes larutan NaOH 1 N,terbentuk warna merah menunjukkan adanya senyawa golongan kuinon (Fransworth, 1969). 7) Steroid dan Triterpenoid 1 gram serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam (dalam wadah dengan penutup rapat), disaring dan diambil filtratnya. 5 mL dari filtrat tersebut diuapkan dalam cawan penguap hingga diperolehresidu/sisa. Kedalam residu tersebut ditambahkan 2 tetes asam asetatanhidrat dan 1 tetes asam sufat pekat (pereaksi Libermann-Buchard),terbentuk warna hijau atau merah menunjukkan adanya senyawa golongansteroid atau triterpenoid (Fransworth, 1969).
48
8) Kumarin 2 gram simplisia dimasukkan dalam tabung reaksi (volume 20 mL) ditambahkan 10 mL pelarut kloroform dan pasang corong (yang diberilapisan kapas yang telah dibasahi air) pada mulut tabung. Selanjutnyapanaskan selama 20 menit di antas penangas air dan dinginkan, kemudiansaring dengan kertas saring. Filtrat di dalam cawan penguap diuapkansampai kering, sisa ditambahkan air panas sebanyak 10 mL, dinginkan,larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 1,5 mllarutan amonia (NH4OH) 10%, amati di bawah sinar ultraviolet padapanjang gelombang 365 nm, maka terjadi fluoresensi warna biru atau hijau,menunjukkan adanya golongan kumarin (Fransworth, 1969). 3.3.6
Pemeriksaan Katekin a. Penetapan Kadar Katekin Sebanyak 50 mg katekin standar ditimbang dan dilarutkan dalam etil asetat hingga 50 ml (konsentrasi 1 mg/ml). Dari larutan induk diencerkan hingga menjadi 0,04 mg/ml. Diukur panjang gelombang 279 nm dengan spektrofotometer UV. Dari larutan induk diatas dibuat larutan katekin standar dengan berbagai konsentrasi dalam etil asetat: 0.02 mg/mL, 0,03 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,05 mg/mL dan 0,06 mg/mL. Kemudian diukur seserapannya dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 279 nm dan dibuat kurva kalibrasi serta menghitung persamaan regresi.
49
Penetapan kadar katekin sampel dengan cara sebanyak 50 mg katekinditimbang dan dilarutkan dalam etil asetat hingga 50 ml, lalu dibuat larutan katekinmenggunakan etil asetat dengan berbagai konsentrasi, yaitu 0,02 mg/mL, 0,03 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,05 mg/mL, dan 0,06 mg/mL. Kemudian diukur serapannya dengan spektrofotometri UV pada panjang gelombang 279 nm. Kadar katekin dalam larutan dihitung dengan menggunakan kurva kalibrasi (Lucida et al, 2007). b. Kadar Abu Sebanyak 1 gram katekinditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan porselen. Katekin dipijar dengan pembakar bunsen selama kira-kira
1
jam
dan
disempurnakan
pemijarannya
dengan
menempatkan bahan dalam tanur suhu tinggi pada 900o ± 20oC sampai diperoleh abu berwarna abu-abu. Didinginkan dalam desikator, ditimbang serta dicatat pengurangan beratnya. Dihitung kadar abu dari pengurangan berat yang didapat (DepKes, 2000). c.
Kadar air Sebanyak 1 gram sample katekin ditimbang, kemudian ditempatkan didalam cawan porslen yang diketahui beratnya dan dipanaskan dalam oven pada suhu 105oC selama 5 jam. Kemudian didinginkan dalam desikator hingga mencapai suhu kamar dan ditimbang. Dilakukan pemanasan kembali selama 30 menit dan didinginkan dalam desikator. Pemanasan selama 30 menit, pendinginan dan penimbangan dilakukan beberapa kali sampai
50
pengurangan berat antara dua penimbangan berturut-turut lebih kecil dari 0,001 g. Kadar air dihitung dari pengurangan yang didapat (Depkes, 2000). d. Uji Jarak Lebur Menempatkan sejumlah katekin ke dalam tabung kapiler lalu dipanaskan dalam tangas udara atau tangas cair kemudian suhu dicatat pada saat zat melebur dan pada saat semua dimana semua zat melebur. Dengan demikian jarak lebur dicatat sebagai jarak antara suhu permulaan dan suhu akhir peleburan yang sempurna. Laju pemanasan alat diatur sekitar 10oC per menit, ketika mencapai suhu 165-170oC diatur kembali hingga kenaikannya sekitar 1oC per menit (DepKes, 1979). Jarak lebur katekin pada literatur ialah 175-177oC (WHO, 1998). e. Rendemen Katekin Rendemen katekin dihitung dengan membandingkan berat awal serbuk dengan berat akhir katekin yang dihasilkan. Rendemen
= % kemurnian x
Bobot serbuk katekin Bobot serbuk gambir di ekstraksi
3.3.7. Sterilisasi Alat Bahan-bahan seperti media kultur dan reagen-reagen harus dalam keadaan steril. Sterilisasi dilakukan secara aseptis di dalam LAF(Laminar Air Flow) dengan metode filtrasi karena mengandung komponenyang tidak tahan pemanasan. Sterilisasi ini bertujian untuk menghindariterjadinya kontaminasi dari bakteri atau pengotor lain
51
seperti debu yangakan merusak validitas hasil penelitian. Filter yang umumnya digunakanadalah filter MF-Milipore tipe GS dengan ukuran pori 0,2 µm. Alat–alat
gelas
yang
akan
digunakan
dicuci
bersih
kemudiandikeringkan, selanjutnya dibungkus dengan kertas dan disterilkan dalamautoklaf pada suhu 121oC, tekanan 15 lb, selama 15 menit. 3.3.8 Pembuatan Reagen a. Pembuatan Medium DMEM berserum Sebanyak 500 ml medium DMEM berserum ditambahkan 50ml FBS 10% dan penstrep (Penisilin-Streptomisin) sebanyak 5 ml, kemudian dihomogenkan. Selanjutnya larutan medium DMEM berserum disaring dengan syringe filter 0.2 µm membrane non pyrogenic dan disimpan pada suhu -4oC b. Pembuatan Larutan PBS (Phosfhat Buffer Saline) Larutan PBS dibuat dengan cara menimbang dinatrium hydrogen fosfat (Na2HPO4) sebanyak 1,081 gram, kemudian ditambahkan 0,106 gram kalium fosfat (KH2PO4); 4,025 gram natrium klorida (NaCl), dan 0,102 gram kalium klorida (KCl). Selanjutnya
dilarutkan dalam aquadest steril hingga 500 ml.
Stabilkan larutan pada pH 7,2 dengan menggunakan pH meter kemudian disterilkan dengan autoklaf dan disimpan pada suhu kamar.
52
c. Pembuatan Larutan SDS (Sodium Dedocyl Sulfat) 10 % b/v Menimbang SDS sebanyak 10 gram kemudian dilarutkan dalam 90 mlaquadest steril dan 10 ml HCl 0.01 N, kemudian diaduk sampai larut. d. Pembuatan Larutan MTT (3 – [4,5 – dimethylthiazol – 2Yi] – 2,5 – diphenyl tetrazolium bromide) Untuk pengamatan proliferatif sel secara kolorimetri, 5 mg MTT dilarutkan dalam 1 ml PBS dan difilter agar steril. Kemudian MTT diberikan sebanyak 10 µL per 100 µL medium pada tiap-tiap sumuran (Mosmann, 1983). Pada penelitian ini, Larutan MTT dibuat dengan cara melarutkan serbuk MTT sebanyak 1 gram dalam 40 ml PBS steril. Tiap sumuran diberi larutan MTT tersebut sebanyak 10 µl. 3.3.9 Persiapan Larutan Uji a. Suspensi Campuran Katekin Gambir (Uncara gambier Roxb.) dan Eugenol. Sebanyak
masing-masing 125 mgkatekin dan eugenol
ditimbang dan dimasukkan ke dalam mikro tube dan dilarutkan dalam 5000µl DMSO 99 %, sentrifuge sampai homogen. Larutan ini dijadikan larutaninduk dengan konsentrasi 50000 µg/mL (larutan induk 1), diambil 50 μl laluditambahkan media DMEM sebanyak 450 µl untukmemperoleh larutan dengan konsentrasi 5000 µg/mL (larutan induk 2), kemudian larutan uji dengan seri 3.125; 6.25;
53
17.5; 25; 50; 100; dan 200 µg/mL dibuat dengan mengencerkan beberapa μl dari larutan induk 2. b. Kontrol Cisplatin Sediaan cisplatin 10 mg/20 ml (500 µg/mL) sebagai larutan indukdimasukkan dalam mikrotube, kemudian dibuat pengenceran denganmemipet beberapa μl dari larutan induk, agar diperoleh lima konsentrasiyaitu 1.5, 3, 4.5, 6, 7.5, dan 9 µg/mL. c. Kontrol DMSO (kontrol negatif) DMSO yang digunakan merupakan DMSO pro Analysis. 3.3.10 Persiapan Kultur HeLaCell Line a. Aktivasi sel HeLa (Thawing Kultur Sel) 1. Mengeluarkan tabung yang berisi HeLa cell line dari tangki wadah berisi dry ice bersuhu -800C , kemudiandicairkan dalam waterbath 37oC sampai gumpalan di dalam vial mencair. 2. Didalam LAF, HeLacell line diambil seluruhnya dengan menggunakan pipet dan dimasukkan ke dalam tabungsentrifuge kemudianditambahkan
7
ml
medium
DMEM
kemudiandisentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. 3. Supernatan yangdiperoleh kemudian dipisahkan sedangkan pellet diresuspensikan denganmenggunakan 5 ml PBS,selanjutnya disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 4000 rpm. 4.Supernatan kemudian dipisahkan dan pellet yang dihasilkan diresuspensi
dengan
3 ml
DMEM berserum, kemudian
dimasukkan ke dalam T-flaskyang telah berisi 7 ml DMEM
54
berserum lalu diinkubasi pada suhu 37oCdalam inkubator CO2 5% selama 24 jam hingga sel menutupi permukaan cell culture dish dengan tingkat kepadatan 95%. b.
Pembuatan dan Pengembangan sel HeLa (Subkultivasi) 1. T-Flask yang telah diinkubasi selama 1 hari dikeluarkan dari inkubator. 2. Media di dalam T-Flask dibuang kemudian dicuci dengan 15 ml PBS sebanyak 2kali. Kemudian PBS dibuang dan ditambahkan tripsinyang telah diencerkan dengan PBS sebanyak 5,8 ml (400 µl Tripsin + 5400 µlPBS = 5,8 ml). 3. Sel diinkubasi selama 3 menit dalam inkubator CO2dengan suhu 37oC (selama diinkubasi tutup T-Flask dilonggarkan). Setelah 3 menit, dishdikeluarkan dari inkubator CO2 kemudian diketukketuk
horizontal
dindingT-Flaskbagian
luar
dengan
menggunakan telapak tangan agar sel terlepasdari dinding TFlask.
Sel
kemudian
diperiksamenggunakan
mikroskopinverted. 4. T-Flask dipindahkan dalam LAF kabinet kemudian didalam TFlaskditambahkan
DMEM
sebanyak
1000
luntuk
menonaktifkan tripsin, kemudian dihomogenkan. 5. Larutan seldipindahkan ke dalam tabung centrifuge tube, lalu disentrifuge dengankecepatan 4000 rpm selama 5 menit. 6 .Kemudian supernatan dipisahkan dandiganti dengan medium DMEM berserum sebanyak 7ml, lalu dihomogenkan kembali
55
dengan pipetsehingga sel menyebar ke seluruh media; untuk selanjutnya dimasukkan ke dalam T-Flask dan diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 24 jam. 7. 10 µl dari larutan sel tersebut dipipet, kemudian ditambahkan 10 µl Tripan blue. Selanjutnya, jumlah sel dihitung menggunakan Haemocytometer. Syaratjumlah sel dalam setiap sumuran adalah 5 x 103. 8. Sel dihitung dari keempat bidang besar pada sudut seluruh permukaan yang terbagi. Penghitungan dimulai dari sisi kiri atas kemudian ke kanan, turun ke bawah dan dari kanan ke kiri. Cara tersebut dilakukan pada keempat bidang besar. Sel yang menyinggung garis batas sebelah kiri atau atas harus dihitung. Sebaliknya, sel yang menyinggung garis batas sebelah kanan atau bawah tidak dihitung. Jumlah sel per ml dapatdihitung dengan rumus: Σ 𝑆𝑒𝑙 𝑝𝑒𝑟 𝑚𝑙 =
𝑛 4
× 𝑃 × 104
n =Σ sel dalam keempat bidang besar 4 =Σ bilik hemositometer yang dihitung P =Faktor pengenceran
3.3.11 Pemeliharaan Kultur HeLa cell line Pemeriksaan
sel
dilakukan
setiap
hari
dengan
menggunakanmikroskop, pemeriksaan ini bertujuan untuk memeriksa kemungkinan terjadipencemaran oleh bakteri atau jamur. Apabila
56
medium kultur telah berubahwarna maka diganti dengan medium DMEMberserum yang baru.
3.3.12 Uji Antiproliferatif Uji antiproliferatif ini menggunakan plat kultur jaringan 96 sumuran sebagai media uji. Padasetiap sumuran pelat kultur jaringan dimasukkan suspensi sel dalammedium DMEM sampai 100 µL. Suspensi tersebutdiinkubasi dalam inkubator CO25% selama 24, 48, dan 72 jam pada suhu 37oC. Ke dalammasing–masing sumuran tersebut ditambahkan 100 µl larutan uji (campuran katekin gambir dan eugenol), kontrol DMSO (kontrol negatif), kontrol Cisplatin® (kontrol positif) dengan konsentrasi yang berbeda-beda. Pada sumuran yang berbeda dimasukkan 200µl DMEM sebagai blanko. lalu diinkubasi dalam inkubator CO2 370C selama 24,48 dan 72 jam. Sel hasil inkubasi masing-masing interval waktu (24, 48, dan 72 jam) kemudian
diamati
dengan
menggunakan
mikroskop.
Setelah
pengamatan, medium pada masing-masing sumuran tersebut dibuang, Selanjutnya 100 µl campuran DMEM berserum+MTT ditambahkan ke dalam tiap-tiap sumur, untuk kemudian diinkubasi selama 4jam pada suhu 37oC di dalam inkubator CO25%. Setelah diinkubasi, sel diamati di bawah mikroskop, untuk dilihat Kristal formazan ungu yang terbentuk. Kemudian ditambahkan 5 µl SDS 10%, dihomogenkan, dan disimpan dalam wadah gelap selama ± 16 jam pada suhu kamar. Masing-masing sumur pada pelat
57
kultur jaringan tersebutdibaca dengan menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 630nm.
3.3.13 Perhitungan Persentase Kematian Sel Pada metode MTT, persentase kematian sel merupakan selisih absorbansi kontrol dengan absorbansi sampel dibagi absorbansi kontrol dikalikan 100%. Masing–masing absorbansi telah dikoreksi dengan absorbansi dari senyawa uji saja tiap kadar. Perhitungan kematian sel dengan menggunakan metode MTT menggunakan rumus sebagai berikut : % kematian sel =
Serapan kontrol negatif sel − Serapan uji × 100% Serapan kontrol negatif sel
3.4 Analisa Data Hasil perhitungan jumlah sel yang hidup digunakan untuk menentukan persentase kematian sel yang dipakai untuk menghitung hargaIC50 dengan analisa probit. Dari data ini dibuat regresi linier hubunganantara logaritma konsentrasi sebagai X dengan probit sebagai Y. Nilai IC50diperoleh dengan cara memasukkan nilai 5 sebagai probit ke dalampersamaan regresi linier, kemudian hasil substitusi, lalu dibuat antilogaritmanya. Persentase kematian yang dibuat ke dalam angka probitdigambarkan hubungannya dengan logaritma konsentrasi. Selanjutnyaditarik garis lurus yang paling baik melalui titik–titik yang ada(berdasarkan penglihatan) dan konsentrasi pada garis ini yang menyatakan50 % kematian (probit -5). Antilog titik ini disebut IC50.
58
3. 5
Alur penelitian Ekstrak air gambir / bongkah gambir (Unicaria gambir) Penapisan fitokimia Reekstraksi Infusa (98-100oC)
Partisi dengan Etil Asetat
Fase air dipartisi kembali dengan etil asetat Cell line HeLa Fase etil asetat dikumpulkan
Fase air dibuang
Thawing
Subkultivasi
Dibilas dengan air dingin, endapan diambil
Katekin Menghitung kepadatan sel dengan Haemocytometer
Suspensi campuran
Eugenol
Uji antiproliferatif dengan metode MTT
% penghambatan
Analisa data IC50
59
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Hasil Penelitian
4.1.1
Determinasi dan Sertifikasi Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman gambir yang digunakan dalam penelitian ini adalah
Uncaria gambier, Roxb.. yang
tergolong suku Rubiaceae. Hasil determinasi dapat dilihat pada lampiran 1. Adapun Eugenol yang digunakan sebagai campuran senyawa uji telah disertifikasi sebagai Eugenol for synthesis oleh Merck. Sertifikasi Eugenol dapat dilihat pada lampiran 2. Karakteristik Simplisia dan Senyawa Uji Campuran Tabel 2. Hasil Karakteristik Simplisia dan Senyawa Uji Campuran Karakteristik
4.1.2
Pemerian a. Bentuk b. Warna
c. Bau d. Rasa Kelarutan
Jarak lebur Spektrum UV Kadar Abu
Serbuk katekin
Syarat*
Standar
Eugenol Syarat **
Sampel
Campuran katekin dan Eugenol
Sampel
Serbuk PutihKuning kecoklatan Khas khelat Tidak larut air
Serbuk Kuning
Serbuk Putih kekuningan
Cair Bening kekuningan
Cair Bening kekuningan
Cair Bening kekuningan
Khas khelat Tidak larut air
Khas Khelat Tidak larut air
Khas Pedas
Khas Pedas
175-177oC
174-177oC
174-177oC
279 nm
292 nm
292 nm
-
-
Khas Pedas-pahit Tidak larut air, Mudah larut dengan DMSO -
Maks 7%
0.053%
0.062%
-
-
-
60
Kadar Air Rendemen Kemurnian Berat jenis
100% 1.064 1.070 *The Merck Index.2006; WHO.1998; SNI gambir 01-3391-2000 ** Farmakope Indonesia Ed. IV
4.1.3
Maks 7 % Min 40% 100% -
0.047% 93.32% -
0.044% 49.30% 79.73% -
99.9% 1.065
-
Jumlah Kepadatan Sel Perhitungan jumlah kepadatan sel dilakukan dengan menggunakan Haemocytometer. Sel yang telah diinkubasi ditambahkan tripanblue dengan pengenceran 10x kemudian dilihat di bawah mikroskop. Syarat jumlah kepadatan sel yang digunakan dalam tiap sumuran dalam penelitian ini adalah 5 x 103 sel/mL. Adapun jumlah kepadatan sel yang diperoleh ialah 1.51 x 106 sel/mL. Maka, jumlah suspensi sel yang harus dipipetkan dalam tiap sumuran adalah sebanyak 3.31 µL/sumuran kemudian ditambahkan medium DMEM berserum ad 100 µL. Perhitungan kepadatan sel dapat dilihat pada lampiran 17 .
4.1.4
Uji Efek Antiproliferatif a.
Pengujian Efek Antiproliferatif Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol terhadap sel HeLa Tabel 3. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol 24 jam Kons [µg/ mL] 3.125 6.25 12.5 25 50 100 200
Ratarata Abs. DMSO 0.463 0.472 0.477 0.466 0.458 0.451 0.448
Std. dev.
0.039 0.029 0.045 0.007 0.025 0.004 0.018
Ratarata Abs. Sampel 0.430 0.404 0.440 0.352 0.334 0.314 0.242
Std. dev.
0.104 0.015 0.003 0.043 0.012 0.030 0.086
% Hidup
% Inhibisi
92.87 85.59 84.28 74.55 72.93 69.62 54.02
7.13 14.41 15.72 25.45 27.07 30.38 45.98
Log kons.
Probit
0.495 0.796 1.097 1.398 1.669 2 2.301
3.5316 3.9375 3.9931 4.3380 4.3872 4.4842 4.8970
IC50
372.4 μg/ mL
61
Tabel 4. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol 48 jam Kons [µg/ mL] 3.125 6.25 12.5 25 50 100 200
Ratarata Abs. DMSO 0.358 0.444 0.427 0.365 0.328 0.335 0.331
Std. dev.
0.050 0.176 0.136 0.079 0.003 0.012 0.017
Ratarata Abs. Sampel 0.320 0.316 0.295 0.247 0.216 0.186 0.164
Std. dev.
0.097 0.031 0.006 0.095 0.015 0.029 0.035
% Hidup
% Inhibisi
89.39 71.17 70.53 67.67 65.85 55.52 49.55
10.61 28.83 29.47 32.33 34.15 44.48 50.45
Log kons
Probit
0.495 0.796 1.097 1.398 1.669 2 2.301
3.7519 4.4408 4.4583 4.5407 4.5903 4.8592 5.0100
IC50
178.24 μg/ mL
Tabel 5. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol 72 jam Kons [µg/ mL ] 3.125 6.25 12.5 25 50 100 200
Ratarata Abs. DMSO 0.349 0.301 0.281 0.263 0.259 0.251 0.247
Std. dev.
0.119 0.037 0.072 0.011 0.019 0.027 0.019
Ratarata Abs. Sampel 0.294 0.213 0.192 0.164 0.141 0.121 0.092
Std. dev.
0.025 0.038 0.060 0.012 0.009 0.070 0.047
% Hidup
% Inhibisi
84.24 70.76 68.33 62.36 54.45 48.21 38.17
15.76 29.24 31.67 37.64 45.55 51.79 61.83
Log kons
Probit
0.495 0.796 1.097 1.398 1.669 2 2.301
3.9931 4.4524 4.5230 4.6480 4.8870 5.0426 5.3002
Perhitungan IC menggunakan persamaan: Y = a + bx (lampiran 19 )
b.
Pengujian Efek Antiproliferatif Kontrol Pembanding (Cisplatin) terhadap sel HeLa Tabel 6. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Kontrol Pembanding (Cisplatin) 24 jam Kons [µg/ mL ] 1.5 3 4.5 6 7.5 9
Rata-rata Abs. sampel 0.302 0.279 0.387 0.225 0.197 0.166
Rata-rata Abs Blangko
0.479
Std. dev.
% Hidup
0.073 0.067 0.013 0.045 0.058 0.079
63.05 58.25 51.98 46.97 41.13 34.66
% Inhibisi
36.95 41.75 48.02 53.03 58.87 65.34
Log kons.
0.176 0.447 0.653 0.778 0.875 0.954
Probit
4.6681 4.7930 4.9408 5.0753 5.2250 5.3934
IC50
4.305 μg/ mL
IC50
73.45 μg/ mL
62
Tabel 7. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Kontrol Pembanding (Cisplatin) 48 jam Kons [µg/ mL ] 1.5 3 4.5 6 7.5 9
Ratarata Abs. sampel 0.296 0.257 0.247 0.217 0.179 0.119
Rata-rata Abs Blangko
0.513
Std. dev.
% Hidup
% Inhibisi
Log konsent rasi
0.045 0.055 0.046 0.002 0.026 0.026
57.70 50.10 48.15 42.30 34.88 23.2
42.30 49.90 51.85 57.70 65.12 76.80
0.176 0.447 0.653 0.778 0.875 0.954
Probit
IC50
4.8058 4.9975 5.0476 5.1942 5.3880 5.7323
2.904 μg/ mL
Tabel 8.Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Kontrol Pembanding (Cisplatin) 72 jam Kons [µg/ mL] 1.5 3 4.5 6 7.5 9
Ratarata Abs. sampel 0.255 0.215 0.198 0.144 0.101 0.087
Rata-rata Abs Blangko
0.542
Std. dev.
% Hidup
% Inhibisi
Log konsen trasi
0.044 0.051 0.020 0.022 0.004 0.086
47.05 39.67 36.53 29.89 18.63 16.05
52.95 60.33 63.47 70.11 81.37 83.95
0.176 0.447 0.653 0.778 0.875 0.954
Probit
IC50
5.0753 5.2611 5.3451 5.5273 5.8927 5.9945
1.626 μg/ mL
Perhitungan IC menggunakan persamaan: Y = a + bx (lampiran 20)
63
A. Grafik Hubungan Antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi 1. Hubungan Antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi Sampel
Hubungan Antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi
% Hidup
100% 90%
3.125 µg/mL
80%
6.25 µg/mL
70%
12.5 µg/mL
60%
25 µg/mL
50%
50 µg/mL
40%
100 µg/mL
30%
200 µg/mL
20%
linier 3.125 µg/mL
10%
linier 6.25 µg/mL
0%
linier 12.5 µg/mL
24 jam
48 jam
linier 25 µg/mL
72 jam
linier 50 µg/mL
Waktu inkubasi
Grafik 1. Hubungan antara % hidup dengan waktu inkubasi sampel
2. Hubungan Antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi Cisplatin
Hubungan Antara Waktu Inkubasi Terhadap %Hidup 70% 1.5 µg/mL
60%
3 µg/mL
%Hidup
50%
4.5 µg/mL
40%
6 µg/mL
30%
7.5 µg/mL
20%
9 µg/mL
10%
linier 1.5 µg/mL linier 3 µg/mL
0% 24 jam
48 jam
72 jam
Grafik 2. Hubungan antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi
linier 4.5 µg/mL
64
B. Grafik Hubungan Antara % Hidup dengan IC50 1. Hubungan Antara % Hidup dengan IC50 Sampel
Hubungan Waktu Inkubasi Terhadap IC50 400
350
IC50 (ppm)
300 250 IC50 Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier, Roxb.) dan Eugenol
200 150 100 50 0 24 jam
48 jam
72 jam
Grafik 3. Hubungan Waktu Inkubasi Terhadap IC50
2. Hubungan Antara % Hidup dengan IC50 Cisplatin
IC50 (ppm)
Hubungan Waktu Inkubasi Terhadap IC50 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 0
IC50 Cisplatin
24 jam
48 jam
Grafik 4. Hubungan Waktu Inkubasi terhadap IC50
72 jam
65
C. Grafik Hubungan Antara Log Konsentrasi dengan Probit 1. Hubungan Antara % Hidup dengan Probit Sampel
Hubungan Antara Log Konsentrasi dengan Probit 6,000 5,000
Probit
4,000 24 Jam
3,000
48 Jam 2,000
72 Jam
1,000 0,796
1,097
1,398
1,699
2
2,301
Grafik 5. Hubungan antara Log Konsentrasi dengan Probit
2. Hubungan Antara % Hidup dengan Probit Cisplatin
Hubungan Antara Log Konsentrasi dengan Probit 7,000 6,000
Probit
5,000 4,000
24 Jam
3,000
48 Jam 72 Jam
2,000
1,000 0,477
0,653
0,778
0,875
Grafik 6. Hubungan antara Log Konsentrasi dengan Probit
0,954
66
4.2 Pembahasan Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol digunakan untuk uji antiproliferatif karena masing-masing komponen memiliki aktivitas sitotoksik
berdasarkan penelitian-penelitian sebelumnya. Dikatakan
bahwa derivat katekin yakni senyawa EGCG dan ECG menunjukkan efek antiproliferasi pada konsentrasi 100µM (Tsuchiya et. al. 2008) dan Eugenol dapat menghambat pertumbuhan tumor sebesar 24.35% dengan dosis 100 mg/kg; i/p. (Jaganathan, 2010). Sehingga diharapkan senyawa campuran ini memiliki hasil yang lebih baik dalam penghambatan sel kanker. Uji sitotoksistas dan antiproliferatif dengan kultur sel saat ini digunakan karena berbagai alasan. Diantaranya dengan menggunakanan kultur sel, mekanisme toksisitas biokimia dapat dikerjakan dengan lebih efektif karena kondisi lingkungan sel mudah dikontrol. Pengembangan metode invitro sebagai alternatif pengganti uji dengan menggunakan hewan uji mempunyai relevansi yang cukup baik yang bertujuan untuk mendeteksi potensi suatu obat pada manusia. Uji efek antiproliferatif pada penelitian ini menggunakan sel HeLa. Sel ini bersifat immortal dan sangat agresif sehingga mudah untuk dikultivasi tetapi sel ini mudah menginvasi kultur sel lain (Doyle dan Griffiths, 2000). Dibanding sel tumor lainnya, proliferasi sel ini sangat cepat dan abnormal. Sifat immortal yang dimiliki sel ini diduga akibat peran dari enzim telomerase saat proses pembelahan diri.
67
Sel HeLa dapat tumbuh dengan agresif dalam media kultur. Media yang digunakan adalah media DMEM berserum. Di dalamnya terkandung nutrisi yang cukup untuk pertumbuhan, yaitu asam amino, vitamin, garam-garam anorganik, dan glukosa. Serum yang ditambahkan mengandung hormon-hormon yang mampu memacu pertumbuhan sel. Albumin berfungsi sebagai protein transport, lipid diperlukan untuk pertumbuhan sel, dan mineral berfungsi sebagai kofaktor enzim (Freshney, 1986). Inkubasi sel yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan inkubator CO2 5%. Hal tersebut dikarenakan pada konsentrasi tersebut, buffer pada medium dapat berinteraksi dengan CO2 sehingga meningkatkan konsentrasi ion hidroksil yang dapat menstabilkan pH menjadi pH normal yaitu 7,4. Jika pH di dalam medium terjadi penurunan maka dapat memperlambat pertumbuhan sel dan memperpanjang proses produksi (Malole, 1990). Penghitungan sel dilakukan dengan menggunakan haemocytometer. Proses penghitungan ini memakai pewarnaan biru tripan (trypan blue) yang diencerkan 100x. Jumlah sel dihitung dibawah mikroskop. Sel hidup terlihat sebagai bulatan bening dengan bintik biru inti sel ditengah bulatan, sedangkan sel mati terlihat sebagai bercak biru pekat yang bentuknya tidak teratur. Selanjutnya dihitung persentase penghambatan zat uji terhadap pertumbuhan sel. Cisplatin dipakai sebagai kontrol positif karena cisplatin merupakan obat terpilih kanker yang telah banyak digunakan pada pengobatan penyakit ini. Sitotoksisitas pemberian cisplatin dapat terjadi pada setiap tahap pengembangan siklus sel, khususnya ketika sel berada pada fase G1 dan S , sedangkan antikanker produk tanaman bekerja dengan memblokade mitosis. Kromosom
68
akan terpecah-pecah, menyebar atau berkelompok. Kromosom tidak mampu membagi dan memisah dengan benar akan menyebabkan sel menjadi mati dan perkembangan berhenti pada stadium metafase (Wahyudi 2009). Konsentrasi Cisplatin yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1,5 µg/mL; 3 µg/mL; 4,5 µg/mL; 6 µg/mL; 7,5 µg/mL dan 9 µg/mL. Konsentrasi ini mengacu pada konsentrasi IC50 Cisplatin terhadap HeLa cell line yang sebelumnya diteliti yakni 0,66 ppm (2.2 µM )-12,6 ppm (42 µM) (Minagawa, 1999). Pengujian aktivitas ini sel uji atau ekstrak dilarutkan dengan DMSO. Karena DMSO bersifat bipolar, sehingga dapat melarutkan ekstrak lebih sempurna bila dibandingkan dengan metanol atau pelarut lain. DMSO juga diperlukan sel sebagai cryoprotektan dalam proses cryopreservasi (Malole, 1990). Konsentrasi DMSO yang digunakan sama dengan konsentrasi sampel uji. DMSO digunakan sebagai kontrol dimaksudkan untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh DMSO terhadap pertumbuhan sel. Konsentrasi DMSO yang digunakan harus ≤ 0.5%. Pengujian antiproliferatif dilakukan dengan mengghunakan metode reduksi pewarna tetrazolium (MTT) / (3–[4,5–dimethylthiazol–2Yi]–2,5–diphenyl tetrazolium bromide) . Sel hidup dapat diketahui jumlahnya berdasarkan hasil reaksi reduksi oleh enzim suksinat dehidrogenase mitokondria pada sel dari garam tetrazolium (MTT) yang berwarna kuning menjadi produk kristal formazan berwarna ungu
69
Hasil yang diperoleh dari pembacaan Elisa Reader berupa nilai absorbansi dari tiap sumuran yang telah diberi bahan uji sesuai kelompok perlakuan. Nilai absorbansi selanjutnya digunakan untuk mengukur pertumbuhan sel kanker serviks HeLa pada waktu inkubasi berikutnya. Uji doubling time merupakan metode untuk mengetahui pertumbuhan sel diukur dari persamaan regresi linier yang dibuat dari slope sehingga menggambarkan kinetika proliferasi sel. Langkah kerja uji ini menggunakan Metode MTT assay dengan waktu inkubasi 24, 48 dan 72 jam. Hasil pengamatan untuk uji proliferasi doubling time menunjukkan bahwa persentase kehidupan sel kanker pada inkubasi 24 jam kelompok perlakuan sampel campuran terendah, yakni 3.125 µg/mL
cukup besar;
mencapai angka 92.87 % sel hidup. Selanjutnya pertumbuhan sel tampak terus mengalami penurunan seiring bertambah besarnya konsentrasi, sampai pada kadar 200 µg/mL, persentase sel yang hidup mencapai 54.02%. Pada inkubasi 48 jam terlihat perbedaan yang cukup jelas antara masing-masing
konsentrasi sampel uji. Pada konsentrasi 3.125 µg/mL,
persentase sel hidup turun menjadi 89.39%, lebih rendah 3.48% dari pengamatan 24 jam . Sementara pada konsentrasi 200 µg/mL, persentase kehidupan sel menjadi 49.55%. Pada inkubasi 72 jam juga terlihat penurunan antar perlakuan konsentrasi. Adanya kematian sel menunjukkan bahwa sampel (campuran katekin gambir dengan eugenol) pertumbuhan sel HeLa.
telah berinteraksi untuk menghambat
70
Pengamatan kontrol sel yang menunjukkan adanya penurunan jumlah sel setelah inkubasi dan perbandingan perlakuan sampel dengan kontrol menunjukkan bahwa pada kontrol sel, masih ada aktifitas proliferasi pada sel HeLa karena tidak ada yang menghambat. Sampel campuran katekin gambir (Uncaria gambier, Roxb)
menjadi faktor utama penghambat proliferasi sel
HeLa. Namun, adanya penurunan sel hidup pada kelompok kontrol inkubasi maing-masing waktu dapat disebabkan karena jumlah sel yang terlalu banyak dan sumber nutrisi yang tersedia semakin lama semakin menipis. Akibatnya sel kanker HeLa kekurangan sumber nutrisi dan akhirnya sebagian sel mengalami kematian. Data doubling time selanjutnya dibuat profil hubungan antara prosentase sel hidup dan waktu inkubasi. Slope dari persamaan ini menggambarkan kinetika pertumbuhan sel HeLa dengan perlakuan sampel uji (Grafik 1) dan cisplatin (Grafik 2). Nilai IC50 menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan proliferasi sel 50 % dan menunjukkan potensi ketoksikan suatu senyawa terhadap sel. Nilai ini merupakan patokan untuk melakukan uji pengamatan kinetika sel (Meiyanto, 2002). Nilai IC50 menunjukkan potensi suatu senyawa sebagai sitostatik. Semakin besar harga IC50 maka senyawa tersebut semakin tidak toksik. Pada penelitian ini sampel campuran katekin gambir (Uncaria gambier Roxb) memiliki IC50 73.45 μg/mL (inkubasi 72 jam). Sementara pada sampel katekin gambir sendiri (tanpa campuran), IC50 yang diperoleh pada inkubasi 72 jam adalah 73.96 dan bernilai 144,880 µg/mL pada Eugenol.
71
Menurut garis panduan American National Cancer Institute (ANCI) suatu ekstrak dikatakan mempunyai efek antiproliferasi yang signifikan apabila nilai IC50 yang diperoleh ≤ 20 μg/mL. Adapun menurut Meiyanto et al. (2008) Nilai IC50 dibawah 100 μg/mL menunjukkan adanya potensi ekstrak uji sebagai agen kemoprevensi Dengan demikian campuran katekin gambir (Uncaria gambier Roxb) kemoprevensi.
dan eugenol dapat dikatakan berpotensi sebagai agen
72
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan 1. Perlu dilakukan pemurnian katekin gambir (Uncaria gambier, Roxb) dari sampel. 2. Campuran senyawa eugenol dan isolat katekin gambir (Uncaria gambier Roxb) dari fase etil asetat mempunyai aktivitas antiproliferatif (mampu menghambat pertumbuhan sel kanker serviks/ HeLa cell line) 3. IC50 yang diperoleh dari sampel campuran ini pada masing-masing waktu inkubasi 24, 48, dan 72 jam berturut-turut adalah 372.4 ppm, 178.24 ppm, dan 73.45 ppm. 4. Pada inkubasi 72 jam dengan IC50 73.45 μg/mL, sampel campuran ini berpotensi sebagai agen kemoprevensi.
5.2 Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengeni senyawa campuran katekin gambir (Uncaria gambier, Roxb) dengan Eugenol menggunakan sel kanker lain atau sel yang sama dengan kombinasi senyawa campuran yang berbeda.
73
DAFTAR PUSTAKA Agoes, A. 1994. Catatan Kuliah Farmakologi I Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya. Jakarta: EGC Agoes, Goeswin. 2007. Teknologi Bahan Alam. Bandung: ITB Alamsyah, A.N. 2006. Taklukkan Penyakit dengan Teh Hijau. Jakarta : penerbit Agrimedia Pustaka Alshatwi, Ali A,. 2010. Catechin Hydrate Suppresses MCF-7 Proliferation Through TP53/Caspase-Mediated Apoptosis. Journal of experimental and Clinical Cancer Research, 29:167, doi:10.1186/1756-9966-29-167. Diambil dari: http://www.jeccr.com/content/29/1/167 diakses pada tanggal 30 Maret 2011 Amos. 2010. Kandungan Katekin Gambir Setra Produksi di Indonesia. Diambil dari: http://www.bsn.or.id diakses pada tanggal 30 November 2011 Amos, I. Zainuddin., A. Triputranto dan B. Rusmandana. 2000. Peralatan Pengolahan Gambir. Jakarta: Majalah BPPT Anonim. Rendang tahan tengik berkat gambir. . Koran Jakarta. . 8 Mei 2011 Ansel, H.C. 1989. Pengatar Bentuk Sediaan Farmasi Edisi 4. Jakarta: UI Press Aparicio, Xochitl -Fernandez. 2006. Chemopreventive Activity of Polyphenolics from Black Jamapa Bean (Phaseolus vulgaris L.) on HeLa and HaCaT Cells. Journal of agricultural and food chemistry. (J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 2116−2122) Armenia, A., Siregar dan H. Arifin. 2004. Toksisitas Ekstrak Gambir (Uncaria gambir Roxb) terhadap Organ Ginjal, Hati dan Jantung Mencit. Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat Indonesia XXVI. Tanggal 7-8 Sepetember 2004 Arundina, Ira., Soebagyo, Retno L., dan Setyari Y, Wisnu. 2003. Efek Antiinflamasi Catechin Pada Marmut dengan Metode Pembentukan Oedema yang Diinduksi Suspensi Karagenik. Laporan Penelitian Lembaga Penelitian Universitas Airlangga. ATCC. 2011. HeLa Cell. Diambil dari: http://www.atcc.org diakses pada tanggal 30 November 2011 Aziz, M.Farid. 2006. Onkologi Ginekologi Buku Acuan Nasional. Jakarta : Yayasan Bina Pustaka Sarwana Prawirohardjo
74
Bachtiar, A. 1991. Manfaat Tanaman Gambir. Makalah Penataran Petani dan Pedagang Pengumpul Gambir di Kecamatan Pangakalan Kab. 50 Kota, 2930 November 1991. Padang: FMIPA Unand Baratawidjaya. 2004. Imunologi Dasar Edisi ke-6. Jakarta : Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI. 1995. Penapisan Farmakologi, Pengujian Fitokimia dan Pengujian Klinik Pengembangan dan Pemanfaatan Obat Bahan Alam. Jakarta: Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI Burkill, I.H. 1935. Dictionary of The Economic Product of Malay Peninsula. Kuala Lumpur: Goverment of Malaysia and Singapore, PP 2196-2204 Cardellina II, J.H., Fuller, R.W., Gamble, W.R., Westergaard, C., Boswell, J., Munro, M.H.G. ,Currens, M. & Boyd, M.R., 1999. Evolving strategies for the selection, dereplication and prioritization of antitumor and HIV-inhibitory natural products extract. Dlm. Bohlin, L. & Bruhn, J.G. (pnyt.). Biossay methods in natural product research and development. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. Cho, S.J, H.L. Valerie, S.H. Wu-Sing, K.Y. Sing, J.P. Pereira, and S.H Goh. 1998. Novel Cytotoxic Polyprenilaterd Xanthones From Garcinia gaundichaudii (Guttifeae), Tetrahedron, 54 (10915-10924). Dalimartha, Setiawan. 2007. Deteksi dini kanker 7 simplisia antikanker. Jakarta : Dirjen POM. Departemen kesehatan RI. Dalimartha, Setiawan. 2001. Ramuan Tradisional untuk Pengobatan Kanker. Jakarta: Penebar Swadaya Das, D.K. 1994. Naturally Occuring Flavonoids: Structure, Chemistry and High Performance Chromatography Methods for Seperation and Characterization. Methods in Enzymology, 234: 410-412 Departemen Kesehatan RI. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Jakarta: Dirjen POM Departemen Kesehatan RI Departemen Keseharan Repubik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Departemen Kesehatan Republik Indonesia Departemen Kesehatan RI. 1986. Sediaan Galenik. Jakarta: Badan Pengawasan Obat dan Makanan Departemen Kesehatan RI. 1989. Materia Medika Indonesia Jilid V. Jakarta: DepKes RI
75
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan Makanan. Direktorat Pengawasan Obat Tradisional. Departemen Farmakologi dan Terapeutik. 2007. Farmakologi dan Terapi Edisi V. Jakarta: Fakultas Kedokteran Desen, wan. 2008. Buku ajar onkologi klinis Edisi 2. Jakarta : Balai penerbit FKUI. Dongmo, piere M. Jazet, et. Al,. 2007. Chemical Composition, Antiradical and Antifungal Activities of Essential Oil of the Leaves of Cinnamomum zelanycum Blume from Cameroon. Natural Product Communications I. 2 (12): 1287-1290 Eskinazi, Daniel. 1999. Botanical Medicine. United States of America : Mary Ann Liebert Inc. Publisher Errol, Norwitz dan John Schorge. 2007. At a Glance Obstetri dan Ginekologi. Jakarta: EGC Farnsworth, N.R. 1969. Biological and Phytochemical Screening of Plants, Journal Pharmaceutical Science. 55 (3): 255-276 Fitrya dan Lenny Anwar. 2009. Uji Aktivitas Antikanker Secara In Vitro dengan Sel Murine P-388 Senyawa Flavonoid dari Fraksi Etilasetat Akar Tumbuhan Tunjuk Langit (Helmynthostachis zeylanica (Linn) Hook). Jurnal Penelitian Sains Vol.12, No.1(C), (12106). Freismoser, Florian M., Claude A. Jakob, Markus Aebi and Urs Tuor. 1999. The MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide] Assay Is a Fast and Reliable Method for Colorimetric Determination of Fungal Cell Densities. Applied and Environmental Microbiology, p.37273729. Vol 65, No.8. Diambil dari: http://aem.asm.org diakses pada tanggal 20 April 2011 Freimoser, Florian M. 1999. The MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5Diphenyltetrazolium Bromide] Assay Is a Fast and Reliable Method for Colorimetric Determination of Fungal Cell Densities. American Society for Microbiology. All Rights Reserved. Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture, A Practical Approach, 1st Ed. Washington D.C : Oxford University Press. Freshney, RI.. 1992. Animal cell culture practical approach. Second edition. Oxford New York : Oxford University Press.
76
Ghosh, Rita et. al., 2005. Eugenol causes melanoma growth suppression through inhibition of E2F1 activity. JBC Papers in Press. Published on January 18, 2005 as Manuscript M411429200 Globocan. 2008. Diambil dari: http://globocan.iarc.fr diakses pada tanggal 30 November 2011 Goodwin, E.C., DiMaio, D., 2000, Repression of human papillomavirus oncogenes in Hela cervical carcinoma cells causes the orderly reactivation of dormant tumor suppressor pathways, Biochemistry, Vol.97, no.23. Guevara BQ. 1985. Phytocemical microbiological and pharmacology cell screening of the medicinal plants. Research Center University of Santo Thomas, Philipines Gunawan, 2004. Farmakope Indonesia edisi III. Jakarta : Departemen Kesehatan Republik Indonesia Gunawijaya, F.A., Gandasentana R., dan Wahyudi K. 1999. Efek Pemberian Katekin Teh Hijau Pada Pertumbuhan Tumor Kelenjar Susu Mencit Strain GR. Majalah Ilmu Fakultas Kedokteran Usakti Vol.18, No.2. Hal: 61-67 Hadad, E.A., N.R. Ahmadi, M. Herman, H. Supriadi dan A.M Hasibuan. 2007. Teknologi Budidaya dan Pengolahan Hasil Gambir. Diambil dari: http://balittri.litbang.go.id diakses pada tanggal 22 April 2011 Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Bandung : Penerbit ITB Hartoyo, A. 2003. Teh dan Khasiatnya Bagi Kesehatan. Yogyakarta : Penerbit Kanisius Haryanto, Sugeng. 2009. Ensiklopedi Tanaman Obat Indonesia. Yogyakarta: Pallmal Hasanah, Uswatun. 2006. Uji sitotoksitas Ekstrak Etanol Biji Mimba (Azadirachta Indica A. Juss) terhadap sel HeLa secara in vitro. Skripsi. FMIPA. UHAMKA Hayani, Eni. 2003. Analisis kadan catechin dari gambir dengan berbagai metode. Bulletin teknik pertanian Vol. 8 No. 1 Hirasawa, Masatomo., and Takada, Kazuko. 2004. Multiple Effects of Green Tea Catechin on The Antifungal Activity of Antimycotics Against Candida Albicans. Journal of Antimicrobial Chemotheraphy 53, 225-229. Diambil dari: www.jac.oxfordjournals.org diakses pada tanggal 22 Juni 2011. Hutapea & JR. 1991. Inventaris tanaman obat Indonesia. Jilid I. Jakarta : Departemen Kesehatan Republik Indonesia
77
Hukmah, Sho’irotul. 2007. Skripsi: Aktivitas Antioksidan Katekin dari Teh Hijau (Camellia sinensis O.K. var. Assamica (Mast))Hasil Ekstraksi dengan Variasi Pelarut dan Suhu. Malang: Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Malang. Jaganathan, 2010. Effect of Honey and Eugenol on Ehrlich Ascites and Solid Carcinoma. Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2010, Article ID 989163. Hindawi Publishing Corporation Jaganathan, Savarana Kumar. 2010. Apoptotic effect of eugenol in human colon cancer cell lines. Cell Biology International Immediate Publication. Published on 02 Nov 2010 as manuscript CBI20100118
Karsono. 2009. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam. Jakarta: Interna Publishing Kasim, A. 2004. Peluang dan Tantangan Pemanfaatan Gambir Sebagai Bahan Baku Perekat Pada Industi Kayu Lapis dan Papan Partikel. Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat Indonesia XXVI. Tanggal 7-8 Sepetember 2004 Katzung, Betram G. 2001. Farmakologi Dasar dan Klinik. Buku 3 edisi 8. Jakarta : Penerbit Salemba Medikamalole, M.B.M. 1990. Kultur sel dan jaringan hewan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Bioteknologi. Institut Pertanian Bogor Kim, Gyoo Cheon, dkk. 2006. Caspases-dependent Apoptosis in Human Melanoma Cell by Eugenol. The Korean Journal Anatomy. Hal 245-253. Kozai, K., M. Soto, M. Yamaguchi, N. Nagasaka and S. Pradopo. 1995. Potential of Gambir as an Inhibitor of Dental Plaque Formation. Dent, 5 Vol. 28 No.3, 95-96 Kusharyono. 2004. Efek Infus Gambir (Uncaria gambir Roxb) yang Diperoleh dari Pasar terhadap Sistem Syaraf Otonom Mencit Jantan. Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat Indonesia XXVI. Tanggal 7-8 Sepetember 2004 Lucida, H. 2006. Determination of The Ionization Constants and The Stability of Catechin from Gambir (Uncaria gambir Roxb). Padang: ASOPMS 12 International Conference Lucida, Henny., Amri Bakhtiar dan Wina Astari Putri. 2007. Formulasi Sediaan Antiseptik Mulut dari Katekin Gambir. Padang: FMIPA Universitas Andalas. Jurnal Sains Teknogi Farmasi 12 (1). Diambil dari: http://farmasi.unand.acid diakses pada tanggal 30 november 2011
78
Malole, MBM. 1990. Kultur Sel dan Jaringan Hewan. Bogor: Institut Pertanian Bogor Manopo, J. L. 2008. Isolasi Eugenol dari Bunga Cengkeh. Skripsi. Ambon: Universitas Kristen Ambon. Mary dan Pamela, 2001; Departemen Farmakologi dan terapi, 2008). Meiyanto, Edi., Ratna Asmah Susidarti, Sri Handayani dan Fitria Rahmi. 2008. Ekstrak Etanolik Biji Buah Pinang (Areca catechu L.) Mampu Menghambat Proliferasi dan Memacu Apoptosis Sel MCF-7. Majalah Farmasi Indonesia, 19(1), 12-19. Miller, Gregg. 2008. Pencegahan dan Pengobatan Penyakit Kanker. Jakarta: PT. Pustakaraya Min Song, Jae., Kwang Hee Lee, and Baik Lin Seong. 2005. Antiviral Effect of Catechins in Green Tea on Influenza Virus. Antiviral Research Vol.68, 6674. Diambil dari: www.sciencedirect.com pada tanggal 24 Mei 2011 Minagawa, Yukihisa., Junzo Kigawa, Hiroaki Itamochi, Yasunobu Kanamori, Muneaki Shimada, Masakuni Takahashi and Naoki Terakawa. 1999. Cisplatin-resistant HeLa Cells are Resistant to Apoptosis via p53-dependent and –independent pathways. Jpn. J. Cancer Res. 90. 1373-1379 Mosmann, Tim. 1983. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal oflmmunologicalMethods, 65 (1983) 55-63 55 Elsevier Muchtar, Hendri., Yusmeiarti dan Gustri Yeni. 2008. Pengaruh Jenis Absorban Dalam Proses Isolasi Katechin Gambir. Jurnal Riset Industri Vol.2, No.1: 14-23
Nafrialdi & Gan, Sulistia. 1995. Farmakologi & terapi edisi IV. Jakarta : FKUI Nazir, M. 2000. Gambir: Budidaya, Pengolahan dan Prospek Diverifikasinya. Padang: Yayasan Hutanku Nugroho, Agung Endro. 2009. Efek sitotoksik dan antiproliferasi dari gamavuton-0 pada kultur sel leukemia basofilik tikus. Majalah farmasi Indonesia Ogata, Masahiro, et. Al. 1997. Antioxidant Activity f Magnolol, Honokiol, and Related Phenolic Coumpounds. JAOCS. 74: 557-562 P. Seraam, Navindra. 2003. Inhibition of Proliferation of Human Cancer Cells and Cyclooxygenase Enzymes by Anthocyanidins and Catechins.
79
Parameter Umum Standard Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, 2000; Buku panduan Teknologi Ekstrak, Prijono, J. 1988. Pengujian Insektisida. Bogor : Fakultas Pertanian IPB Qiao, Yanyan., Jinyan cao, Liangqun Xie and Xiaolin Shi. 2009. Cell Growth Inhibition and Gene Expression Regulation by (-)-Epigallocatechin-3Gallate in Human Cervical Cancer Cells. Arch Pharm Res Vol 32, No 9, Radde, Ingeborg C. 1999. Farmakologi Terapi dan Pediatri Edisi II. Jakarta : Hipokrates. Rahayuningsih, C., T.E. Basjir dan Y. Warastuti. 2004. Uji Ekstrak Daun Gambir (Uncaria gambir Roxb) Awet Radiasi terhadap Kemampuannya Sebagai Anti Mikroba. Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat, Indonesia XXVI. Tanggal 7-8 September 2004 Rasjidi, Imam. 2007. Panduan Penatalaksanaan Kanker Ginekologi Berdasarkan Evidence Base. Jakarta : EGC Risfaheri dan L. Yanti. 1993. Pengaruh Ketuaan dan Penanganan Daun Sebelum Pengempaan terhadap Rendemen dan Mutu Gambir. Buletin Penelitian Rempah dan Obat 8 (1): 46-51 Robbins dan Kumar. 1999. Buku Ajar Patologi I Edisi IV. Jakarta Robinson, T. 1995. Kandungan Senyawa Organik Tumbuhan Tinggi. Diterjemahkan oleh Prof. Dr. Kosasih Padmawirata. Bandung: ITB Ruddon, Raymond W. 2007. Cancer Biology Fourth Edition NewYork : Oxford University Press Sadava, David., Elizabeth Whitlock, and Susan E. Kane,. 2007. The Green Tea Polyphenol, Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Telomerase and Induces Apoptosis in Drug-Resistant Lung Cancer Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 360 (2007), 233-237. Diambil dari: http://www.sciencedirect.com diakses pada tanggal 29 April 2011 Sait, S., A. Sudibyo dan E.H. Loebis. 1987. Penelitian Pengolahan Getah Gambir. Balai Penelitian dan Pengembangan Industri Hasil Pertanian Bogor: Proyek Penelitian dan Pengembangan Industri Hasil Pertanian.
Seeram, P. Navindra., Yanjun Zhang and Muraleedharan G. Nair. 2003. Inhibition of Proliferative of Human Cancer Cell and Cyclooxigenase Enzymes by Anthocyanidins and Catechins. Nutrition and Cancer, 46 (1): 101-106.
80
Diambil dari: http://www.encognitive.com diakses pada tanggal 29 April 2011 Shanie, M., V. Hosiana dan A. Bakhtiar. 2004. Formulasi Shampo Gambir Murni. Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat Indonesia XXVI. Tanggal 7-8 Sepetember 2004 Sieuwerts, Anieta M. 1995. The MTT Tetrazolium Salt Assay Scrutinized: How to Use this Assay Reliably to Measure Metabolic Activity of Cell Cultures in vitro for the Assessment of Growth Characteristics, IC50-Values and Cell Survival. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1995; 33:813-823 Sigma. 2011. Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Formulations. Diambil dari: http://www.sigmaaldrich.com diakses pada tanggal 01 Oktober 2011 Siswandono dan Bambang Soekarjo. 2000. Kimia Medisinal Edisi II. Surabaya: Universitas Airlangga press Sudjarwo, Sri Agus. 2004. Protective Effect of Catechin on Endothelial Cell in Hypercholesterolemia. Journal kedokteran Trisakti, Vol.23, No. 1: 1-5. Diambil dari: http://isjd.pdii.lipi.go.id diakses pada tanggal 25 Mei 2011. Suherdi, A., Denian dan H. Syamsu. 1991. Budidaya dan Pasca Panen Gambir serta Permasalahannya. Biro Bina Pengembangan. Sarana Perekonomian, Dati I Sumbar, Padang Sukati, K., dan Kusharyono. 2004. Efek Infus Gambir (Uncaria gambir Roxb) yang Diperoleh dari Pasar terhadap Parameter Onset dan Durasi Waktu Tidur Tiopental Pada Mencit Jantan. Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat, Indonesia XXVI. Tanggal 7-8 September 2004 Sukardiman. 1999. Paduan Senyawa Aktif Kunyit dan Sambiloto Sebagai Antikanker. Surabaya: Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Sukardja, I Dewa Gede. 2000.Onkologi Klinik edisi 2. Surabaya : Airlangga University Press Tedjo, Aryo., Dondin Sajuthi dan Latifah K. Darusman. 2005. Aktivitas Kemoprevensi Ekstrak Temu Mangga. Jurnal Kesehatan, Vol.9, No.2 : 57-62
The Merck Index. 2006. An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, 14th ed. Merck and Co Inc, Pathway W.J.USA. Thorpe, J.F., and Whiteley M.A. 1921. Thorpe’s Dictionary of Applied Chemistry, Fourth Edition, Vol.II. London: Longman, Green and Co, 434-438
81
Tika, F.H., H. Mukhtar dan A. Bakhtiar. 2004. Efek Katekin dari Gambir terhadap Tukak Lambung Tikus Putih Betina. Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat, Indonesia XXVI. Tanggal 7-8 September 2004
Tjay. 2007. Obat-obat penting. Jakarta : Elex Media Komputindo Tsuchiya, Hironori., Toshiyuki Tanaka and Motohiko Nagayama. 2008. Antiproliferative Effects Assosiated with Membrane Lipid Interaction of Green Tea Catechins. Journal of Health Science 54 (5): 576-580. Diambil dari: http://jhs.pharm.or.ip diakses pada tanggal 29 April 2011 Utami, Dwi. 2007. Sintesis senyawa Kalkon dan turunannya serta uji antiproliferasi terhadap sel HeLa. Thesis. Universitas Gadjah Mada Wagner, H. 1985. Immunostimulants from Medicinal Plants. In Advances in Chines Medicinal Material Research (Eds.) H.M Chang; H.w. Yeung; W.W. Tso and A. Koo. World Scintific Publ. Co. Singapura: 159-170 Wazzan, Khalid A. Al, Ali A. Al_ Harbi dan Ihab A. Hammad. 1997. The effect of Eugenol-Containing Temporary Cemment on The Bond Strength of Two Resin Composite Core Materials to Dentin. Journal of Prostodhontic. 6 (1): 37-42 Wattemberg LW. 1992. Inhibition of Carcinogenesis by Minor Dietary Constituents. Cancer Res. 52: 2085-2087 WHO. 1998. Quality Control of Methods for Medicinal Plants Material. Switzerland: Geneva Yoshino et al. 1996. Antimicrobial Activity of Tea Extracts on Cariogenic Bacterium (Streptococcus mutans). J. Food hyg. Soc. Japan Vol. 37, No.2: 104-108. Diambil dari: http://rms1.agsearch.agropedia.affrc.go diakses pada tanggal 22 Mei 2011. Zwavelling, A., R.J. Van Zonneveld dan A. Schaberg. 1985. Onkologi. Jakarta: Balai Pustaka
82
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Hasil Determinasi Gambir
83
Lampiran2. Sertifikasi Eugenol
84
Lampiran 3. Sertifikat Kemurnian Katekin Standar
85
Lampiran 4. Eugenol, Gambir(Uncaria gambier Roxb), dan Katekin
Gambar 4. Eugenol
Gambar 8. Hasil Uji Cemaran Urea
Gambar 5. Bongkah Gambir (Uncaria gambier Roxb)
Gambar 9. Serbuk Katekin Sampel
Gambar 6. Serbuk Gambir
Gambar 10. Serbuk Katekin Standar
Gambar 7. Hasil Identifikasi Gambir
86
Lampiran 5. Hasil Pengamatan Penapisan Fitokimia
a. Hasil Pengamatan Penapisan Fitokimia Serbuk Gambir Golongan 1. Flavonoid
Hasil +
Pengamatan Filtrat ditambahkan serbuk Zn, HCl P, amilalkohol,dikocok kuat, didiamkan hingga memisah. Hasilnya terbentuk warna coklat dalam amilalkohol.
2. Tanin
+
Pada filtrat terbentuk warna hijau tua setelah diteteskan FeCl3 1%.
3. Alkaloid
+
1. Pada filtrat terbentuk endapan merah bata setelah ditambahkan pereaksi Dragendorf. 2. Terbentuk endapan putih pada filtrat setelah diteteskan pereaksi Meyer.
4. Saponin
+
Pada filtrat terbentuk buih setelah dikocok kuat dan buih tetap stabil setelah ditaeteskan HCl 2N
5. Kuinon
+
Terbentuk warna merah pada filtrat setelah diteteskan peraksi NaOH 1N
6. Steroid dan
-
Triterpenoid
Tidak adanya perubahan warna pada residu setelah penambahan pereaksi asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat.
7. Minyak Atsiri
-
Tidak adanya bau aromatis pada residu yang telah diuapkan.
Tabel 9. Hasil Pengamatan Penapisan Fitokimia Serbuk Gambir
87
Lampiran 6. Hasil Pengujian Karakteristik Katekin
a. Penetapan Kadar Air - Berat botol kosong sebelum dikeringkan
= 24.5662 gram
- Berat botol kosong setelah dikeringkan
= 24.5592 gram
- Berat botol + katekin sebelum dikeringkan (W0) = 25.5644 gram - Berat botol + katekin setelah dikeringkan (W1) Susut pengeringan
=
=
𝑊0 −𝑊1 𝑊0
= 25.5532 gram
𝑥 100%
25.5644 −25.5532 25.5644
𝑥 100%
= 0.044% Maka, susut pengeringan katekin adalah sebesar 0.044%
b. Penetapan Kadar Abu - Berat cawan kosong sebelum dikeringkan
=
19.0531 gram
- Berat cawan kosong setelah dikeringkan
=
19.0379 gram
- Berat cawan + katekin sebelum dikeringkan (W0)
=
20.0400 gram
- Berat cawan + katekin setelah dikeringkan (W1)
=
20.0259 gram
Kadar abu =
=
𝑊0 −𝑊1 𝑊0
𝑥 100%
20.0400 −20.0259 20.0400
𝑥 100%
= 0.070% Maka, kadar abu katekin adalah 0.070%
88
Lampiran 7. Lanjutan
c. Penetapan Rendemen - Bobot serbuk katekin yang diperoleh
= 309.37 gram
- Bobot serbuk gambir yang diekstraksi = 500.29 gram Rendemen = % kemurnian x
Bobot serbuk katekin Bobot serbuk gambir di ekstraksi
= 79.73% x 309.37 500.29 = 49.30 % Maka, persentase rendemen katekin adalah 49.30 %
89
Lampiran 8. Hasil Penetapan Kadar Katekin
1. Hasil Absorbansi standar katekin
Berdasarkan data absorbansi dan konsentrasi standar katekin di atas, diperoleh nilai : A = -0,0274
B = 3,1757R = 0,9514
Perhitungan konsentrasi standar : y = a + bx 1. 0,013 x 2. 0,045 x 3. 0,088 x 4. 0,152 x 5. 0,173 x
= -0,0274 + 3,1757 x = 0,0127 = -0,0274 + 3,1757 x = 0,0228 = -0,0274 + 3,1757 x = 0,0363 = -0,0274 + 3,1757 x = 0,0565 = -0,0274 + 3,1757 x = 0,0631
2. Hasil absorbansi katekin sampel
90
Perhitungan konsentrasi sampel : y = a + bx 1. 0,002 x 2. 0,035 x 3. 0,067 x 4. 0,108 x 5. 0,138 x
= -0,0274 + 3,1757 x = 9,2578 x 10-3 = -0,0274 + 3,1757 x = 0,0196 = -0,0274 + 3,1757 x = 0,0297 = -0,0274 + 3,1757 x = 0,0426 = -0,0274 + 3,1757 x = 0,0521
Tabel 10. Perhitungan Persentase Kadar Katekin Sampel No
Konsentrasi
Konsentrasi
standar
sampel
1
0,0127
9,2578 x 10-3
9,2578 x 10-3/ 0,0127 = 72,90
2
0,0228
0,0196
0,0196 / 0,0228 = 85,96
3
0,0363
0,0297
0,0297 /0,0363 = 81,82
4
0,0565
0,0426
0,0426 / 0,0565 = 75,40
5
0,0631
0,0521
0,0521 / 0,0631 = 82,57
𝑋=
Persentase kadar (%)
72.89% + 85.96% + 81.82% + 75.40% + 82.57% = 79.73% 5
91
Lampiran 9. Skema Proses Pembuatan Katekin Gambir (Uncaria gambierRoxb)
Bongkahan Gambir (Uncaria gambier Roxb) Sortasi kering dan penggilingan
Di tumbuk halus hingga menjadi serbuk
Serbuk di re-ekstraksi infusa dengan pelarut aquades pada 90-960C selama 15-20 menit Peyaringan
Ekstrak gambir
Partisi dengan etil asetat (filtrat:etil asetat = 1:½), ditambahkan NaCl hingga jenuh dilakukan hingga 5 kali
Fase air dipisahkan
Fase etil asetat dikumpulkan
Dipartisi kembali dengan etil asetat (berulang-ulang)
Dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 500C
Fase air dibuang
Disaring dengan kertas saring
Ekstrak kental dilarutkan dalam air dingin bagian tidak larut (Katekin)
Dikeringkan dengan oven 50oC
Serbuk katekin gambir
Penetapan kadar katekin Uji efek antiproliferatif
92
Lampiran 10.Skema Kerja Kultivasi Sel HeLa
Sel dalam cryo vial
Thawing di water bath pada suhu 370C
Pindahkan sel ke Flask yang sudah berisi medium. (Sebelum larutan dalam cryo vial mencair semua )
Media Kultur + 10% FBS
Inkubasi pada inkubator (suhu 370C, CO2 5%) hingga sel menempel pada dasar flask (± 4-24 jam)
Sel diamati jika sel sudah menempel, buang medium, cuci dengan PBS 1X (12x), lalu ganti dengan medium baru. Setelah itu sel diamati lagi dengan mikroskop Inkubasi pada inkubator (suhu 370C, CO2 5%) hingga sel mencapai kerapatan 70-80%
Sel disubkultur apabila kerapatan mencapai 70-80% dari permukaan flask
93
Lampiran 11.Skema Kerja Subkultivasi Sel HeLa
Sel HeLa hasil kultivasi didalam T-flask
Sel diamati , buang medium, cuci dengan PBS 1X (1-2x), Menambahkan Trypsin EDTA 400 µL + PBS 5400 µL
Inkubasi dalam inkubator (suhu 370C, CO2 5%) selama ± 3 menit
Tambahkan medium kultur DMEM berserum (900 µL)
Centrifuge 1000 rpm ± 5 menit
Didekantasi, endapan diambil
Endapan disimpan dalam cryo vial
Endapan dimasukkan kedalam cuvet
Endapan dimasukkan ke T-flask ,dikultur kembali
+ Trypan blue 50 µL Kerapatan sel dihitung dengan Haemocytometer dibawah mikroskop inverted
Rasio sel 5x103 sel/100 µL
94
Lampiran 12. Uji MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2yI]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)
Suspensi sel dalam DMEM berserum dimasukkan ke dalam tiap sumuran sebanyak 100 µL + 100 µL perlakuan dimasukkan ke dalam tiap sumuran Diinkubasi dalam inkubator CO2 pada suhu 37oC selama 24, 48 dan 72 jam
Hasil inkubasi sel dalam sumuran ditambahkan 10 µL MTT Diinkubasi dalam inkubator CO2 pada suhu 37oC selama 4 jam
Hasil inkubasi sel dalam sumuran + 50 µL SDS 10% ke dalam tiap sumuran dan diinkubasi dalam ruang gelap selama 16 jam Sel dihitung dengan ELISA reader pada panjang gelombang 490 dan 630 nm
95
Lampiran 13.Perhitungan Konsentrasi Sampel (Campuran Katekin dan Eugenol)
- Sebanyak masing-masing 125 mg katekin dan eugenol ditimbang dan dimasukkan ke dalam mikro tube. (total : 250 mg) - Ditambahkan 5000 µL DMSO 99.9% disentrifuge 250 𝑚𝑔
=
5 𝑚𝐿
250000 µ𝑔 5000 µ𝐿
= 50 µ𝑔/µ𝐿 = 50000 µ𝑔/𝑚𝐿 = 50000 µg/mL (larutan induk 1) - Larutan induk 1 diencerkan hingga 10 kali Rumus pengenceran pada masing-masing konsentrasi 𝑉1 . 𝑁1 = 𝑉2 . 𝑁2 Keterangan : V1 =
Volume yang digunakan (µL)
N1 =
Konsentrasi larutan induk (µg/mL)
V2 =
Total volume larutan yang dibuat (µL)
N2 =
Konsentrasi larutan sampel (µg/mL)
Maka: 𝑉1 . 𝑁1 = 𝑉2 . 𝑁2 V1 x 50000 µg/mL = 10000 µL x 5000 µg/mL V1 =
10000 𝜇𝐿 ×5000 µg /mL 50000 µg /mL
V1 = 1000 µL + aquadest ad 10000 µL
96
Lampiran 14. Lanjutan
Sebanyak 1000 µL larutan induk 1 dipipet lalu diencerkan dengan penambahan aquadest hingga 10000 µL
50000 µg/mL (larutan induk 1) 1000 µL larutan induk 1 dipipet
+ aquadest sebanyak 10000 µL
5000 µg/mL (larutan induk 2)
Contoh perhitungan pengenceran dari larutan induk 2 - Pembuatan konsentrasi 200 µg/mL 𝑉1 . 𝑁1 = 𝑉2 . 𝑁2 V1 x 5000 µg/mL = 1500 µL x 200 µg/mL V1 =
1500 µ𝐿 × 200 µg /mL 5000 µg /mL
V1 = 60 µL
97
Lampiran 15.Lanjutan
Konsentrasi
Konsentrasi
Volume yang
Total volume
Larutan Induk
Larutan Sampel
Digunakan
Larutan yang Dibuat
(N1)
(N2)
(V1)
(V2)
( µg/mL )
( µg/mL )
(µL)
(µL)
200
60
100
30
50
15
25
37.5*
12.5
187.5*
6.25
93.8*
3.125
46.88*
5000
1500
Tabel 11. Hasil Perhitungan Konsentrasi Sampel (*) : Pengenceran dilakukan menggunakan konsentrasi 100 µg/mL sebagai larutan induk.
98
Lampiran 16.Perhitungan Konsentrasi Cisplatin
Larutan induk I
= 500 µg/mL (10 mg/20 mL) 50 µg /mL
Larutan induk II (50 µg/mL) =5000 𝜇𝐿 × 500 µg /mL = 500 𝜇𝐿 +aq. ad 5000 µL Volume Cisplatin yang akan dibuat tiap konsentrasi = 1000 µL Contoh perhitungan konsentrasi Cisplatin: - Pembuatan konsentrasi 3 µg/mL 𝑉1 . 𝑁1 = 𝑉2 . 𝑁2 V1 x 50 µg/mL = 1000 µL x 3 µg/mL V1 =
1000 𝜇𝐿 ×3 µg/mL 50 µg/mL
V1 = 60 µL + aquadest ad 1000 µL
Konsentrasi
Konsentrasi
Volume yang
Total volume
Larutan Induk
Larutan Sampel
Digunakan
Larutan yang Dibuat
(N1)
(N2)
(V1)
(V2)
(µg/mL)
(µg/mL)
(µL)
(µL)
1.5
30
3
60
4.5
90
6
120
7.5
150
18-9
180
50
1000
Tabel 12. Hasil Perhitungan Konsentrasi Cisplatin
99
Lampiran 17.Perhitungan Kepadatan Sel
Kepadatan
sel
dihitung
menggunakan
Haemocytometer
dengan
menghitung 25 bilik kecil pada Haemocytometer. Maka, 151 x 104 = 1.51 x 106 sel/mL Artinya: didalam 1 mL mengandung sel sebanyak 1.51 x 106 sel Syarat jumlah sel dalam setiap sumuran adalah 5 x 103 sel Maka: Σ sel x V sel yang diambil
= syarat sel/sumuranx V yang dibuat
1.51 x 106 sel/mL x V
= 5 x 103 sel/sumuran x 1000 µL V =
5 ×10 3 sel /sumuran ×1000 μL 1.51×10 6 sel /mL
= 3.31 µL sel HeLa/sumuran Jumlah sumuran yang digunakan adalah sebanyak 90 sumuran Maka: Σ sel/sumuran x Σ sumuran yang digunakan = 3.31 µL sel x 90 sumuran = 297.9 µL sel ≈ 298 µL sel Jumlah DMEM berserum =100 μL/sumuran x 90 sumuran = 9000 μL = 9 mL Maka didalam tabung conical steril berisi: 298 µL sel + DMEM berserum ad 9 mL Kemudian dipipetkan sebanyak 100 μL ke dalam masing-masing sumuran.
cara
100
Lampiran 18.Skema Pemetaan Pada Sumuran 96
Keterangan Gambar: Kontrol (-) Sumuran A1, 2, 3
: suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.4%
Sumuran A4, 5, 6
: suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.2%
Sumuran A7, 8, 9
: suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.1%
Sumuran A10, 11, 12
: suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.05%
Sumuran B1,C1,D1
: suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.025%
Sumuran E1,F1,G1
: suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.0125%
Sumuran B12,C12,D12 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.00625% Sumuran E12,F12,G12 : 200 µL DMEM berserum Sumuran H1, 2, 3, 4, 5, 6 : suspensi sel + DMEM berserum (blanko) Kontrol (+) Sumuran B9, 10, 11
: suspensi sel + cisplatin konsentrasi 1.5 µg/mL
Sumuran C9, 10, 11
: suspensi sel + cisplatin konsentrasi 3 µg/mL
Sumuran D9, 10, 11
: suspensi sel + cisplatin konsentrasi 4.5 µg/mL
101
Lanjutan
Sumuran E9, 10, 11
: suspensi sel + cisplatin konsentrasi 6 µg/mL
Sumuran F9, 10, 11
: suspensi sel + cisplatin konsentrasi 7.5 µg/mL
Sumuran G9, 10, 11
: suspensi sel + cisplatin konsentrasi 9 µg/mL
Sampel (Katekin + Eugenol) Sumuran E2, F2,G2
: suspensi sel+ sampel konsentrasi 3.125 µg/mL
Sumuran E3,F3,G3
: suspensi sel+ sampel konsentrasi 6.25 µg/mL
Sumuran E4, F4,G4
: suspensi sel+ sampel konsentrasi 12.5 µg/mL
Sumuran E5, F5,G5
: suspensi sel + sampel konsentrasi 25 µg/mL
Sumuran E6, F6,G6
: suspensi sel + sampel konsentrasi 50 µg/mL
Sumuran E7, F7,G7
: suspensi sel + sampel konsentrasi 100 µg/mL
Sumuran E8, F8,G8
: suspensi sel + sampel konsentrasi 200 µg/mL
102
Lampiran 19. Perhitungan dan Grafik IC50 campuran katekin gambir dan Eugenol terhadap HeLa Cell Line
Campuran Katekin
DMSO
Gambir dan Eugenol
Kons (%)
Kons
Data
𝑥
(µg/
Data
𝑥
%
%
Log
Hidup Inhibisi Kons
Probit
mL) 24 Jam 0.00625 0.497 0.427 0.420 0.463 3.125 0.547 0.397 0.347 0.430 92.87
7.13
0.495
3.5316
0.0125
0.438 0.487 0.491 0.472
6.25
0.420 0.403 0.390 0.404 85.59
14.41
0.796
3.9375
0.025
0.425 0.499 0.507 0.477
12.5
0.442 0.437 0.327 0.402 84.28
15.72
1.097
3.9931
0.05
0.471 0.469 0.457 0.464
25
0.400 0.343 0.314 0.352 74.55
25.45
1.398
4.3380
0.1
0.429 0.467 0.478 0.458
50
0.348 0.324 0.331 0.334 72.93
27.07
1.669
4.3872
0.2
0.446 0.453 0.454 0.451
100
0.346 0.310 0.285 0.314 69.62
30.38
2
4.4842
0.4
0.427 0.461 0.456 0.448
200
0.317 0.262 0.148 0.242 54.02
45.98
2.301
4.8970
0.00625 0.366 0.304 0.403 0.358 3.125 0.391 0.360 0.208 0.320 89.39
10.61
0.495
3.7519
0.0125
0.250 0.484 0.597 0.444
6.25
0.350 0.312 0.287 0.316 71.17
28.83
0.796
4.4408
0.025
0.529 0.480 0.272 0.427
12.5
0.300 0.296 0.288 0.295 70.53
29.47
1.097
4.4583
0.05
0.456 0.332 0.307 0.365
25
0.346 0.156 0.239 0.247 67.67
32.33
1.398
4.5407
0.1
0.327 0.332 0.326 0.328
50
0.234 0.209 0.205 0.216 65.85
34.15
1.669
4.5903
0.2
0.343 0.321 0.341 0.335
100
0.218 0.180 0.161 0.186 55.52
44.48
2
4.8592
0.4
0.314 0.349 0.330 0.331
200
0.200 0.162 0.130 0.164 49.55
50.45
2.301
5.0100
0.00625 0.285 0.275 0.487 0.349 3.125 0.320 0.293 0.269 0.294 84.24
15.76
0.495
3.9931
0.0125
0.340 0.297 0.266 0.301
6.25
0.257 0.195 0.187 0.213 70.76
29.24
0.796
4.4524
0.025
0.247 0.364 0.232 0.281
12.5
0.260 0.171 0.145 0.192 68.33
31.67
1.097
4.5230
0.05
0.253 0.261 0.275 0.263
25
0.172 0.170 0.150 0.164 62.36
37.64
1.398
4.6840
0.1
0.274 0.246 0.257 0.259
50
0.150 0.141 0.132 0.141 54.45
45.55
1.669
4.8870
0.2
0.282 0.228 0.243 0.251
100
0.201 0.095 0.067 0.121 48.21
51.79
2
5.0426
0.4
0.231 0.242 0.226 0.247
200
0.139 0.092 0.044 0.092 38.17
61.83
2.301
5.3002
48 Jam
7 2 Jam
Tabel 13. Data Hasil Efek Antiproliferatif Eugenol dengan Katekin terhadap Sel HeLa dalam Interval Waktu Inkubasi
103
Contoh perhitungan % Inhibisi dan % Hidup Konsentrasi 3.125 µg/mL Pada 24 Jam: %Inhibisi =
%Hidup
AbsDMSO − AbsSampel × 100% AbsDMSO
=
0.463−0.430
=
7.13%
0.463
× 100%
= 100% - 7.13% = 92.87%
D. Perhitungan IC50 Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol Pada Waktu Inkubasi 24 Jam a = 3.298
Maka:
y = a + bx
b = 0.662
y = 3.298 + 0.662x
r = 0.973
5 = 3.298 + 0.662x x = 2.571 IC50 = Antilog x = Antilog 2.571 = 372.4 µg/mL
E. Perhitungan IC50 Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol Pada Waktu Inkubasi 48 Jam a = 3.735
Maka:
y = a + bx
b = 0.562
y = 3.735 + 0.562x
r = 0.914
5 = 3.735 + 0.562x x = 2.251 IC50 = Antilog x = Antilog 2.251 = 178.24 µg/mL
104
F. Perhitungan IC50 Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol Pada Waktu Inkubasi 72 Jam a = 3.791
Maka:
y = a + bx
b = 0.648
y = 3.791 + 0.648x
r = 0.983
5 = 3.791 + 0.648x x = 1.866 IC50 = Antilog x = Antilog 1.866 = 73.45 µg/mL
105
Lampiran 20. Perhitungan dan Grafik IC50 Cisplatin terhadap HeLa Cell Line Medium dan Sel
Cisplatin Konsentrasi
Data
(µg/mL)
%
%
Log
𝑋
Hidup
Inhibisi
konsentrasi
Probit
24 Jam
1.5
0.387
0.264
0.256
0.302
63.05
36.95
0.176
4.6681
0.423
3
0.279
0.373
0.241
0.279
58.25
41.75
0.447
4.7930
0.451
4.5
0.234
0.258
0.255
0.378
51.98
48.02
0.653
4.9408
0.563
6
0.273
0.182
0.219
0.225
46.97
53.03
0.778
5.0753
𝑥=
7.5
0.256
0.194
0.140
0.197
41.13
58.87
0.875
5.2250
0.479
9
0.230
0.071
0.159
0.166
34.66
65.34
0.954
5.3934
48 Jam
1.5
0.338
0.303
0.247
0.296
57.70
42.30
0.176
4.8058
0.482
3
0.232
0.219
0.321
0.257
50.1
49.90
0.447
4.9975
0.521
4.5
0.217
0.224
0.300
0.247
48.15
51.85
0.653
5.0476
0.536
6
0.220
0.217
0.215
0.217
42.30
57.70
0.778
5.1942
𝑥=
7.5
0.161
0.210
0.166
0.179
34.88
65.12
0.875
5.3880
0.513
9
0.128
0.140
0.090
0.119
23.2
76.80
0.954
5.7323
72 Jam
1.5
0.204
0.288
0.272
0.255
47.05
52.95
0.176
5.0753
0.557
3
0.261
0.160
0.223
0.215
39.67
60.33
0.447
5.2611
0.528
4.5
0.192
0.221
0.181
0.198
36.53
63.47
0.653
5.3451
0.541
6
0.167
0.141
0.123
0.144
29.89
70.11
0.778
5.5273
𝑥=
7.5
0.105
0.096
0.103
0.101
18.63
81.37
0.875
5.8927
0.542
9
0.081
0.085
0.094
0.087
16.05
83.95
0.954
5.9945
Tabel 14. Data Hasil Efek Antiproliferatif Cisplatin terhadap Sel HeLa dalam Interval Waktu Inkubasi Contoh perhitungan % Inhibisi dan % Hidup Konsentrasi 1.5 µg/mL Pada 24 Jam: %Inhibisi =
=
AbsBlanko − AbsCisplatin × 100% AbsBlanko
0.479−0.302 0.479
× 100% = 36.95%
%Hidup = 100% - 36.95%= 63.05%
106
G. Perhitungan IC50 Cisplatin Pada Waktu Inkubasi 24 Jam a = 4.429
Maka:
y = a + bx
b = 0.900
y = 4.429 + 0.900x
r = 0.957
5 = 4.429 + 0.900x x = 0.634 IC50 = Antilog x = Antilog 0.634 = 4.305 µg/mL
H. Perhitungan IC50 Cisplatin Pada Waktu Inkubasi 48 Jam a = 4.525
Maka:
y = a + bx
b = 1.026
y = 4.525 + 1.026x
r = 0.900
5 = 4.525 + 1.026x x = 0.463 IC50 = Antilog x = Antilog 0.463 = 2.904 µg/mL
I.
Perhitungan IC50 Cisplatin Pada Waktu Inkubasi 72 Jam a = 4.753
Maka:
y = a + bx
b = 1.169
y = 4.753 + 1.169x
r = 0.927
5 = 4.753 + 1.169x x = 0.211 IC50 = Antilog x = Antilog 0.211 = 1.626 µg/mL
107
Lampiran 21. Haemocytometer
Gambar 11. Alat Haemocytometer
Gambar 12. Pemetaan Haemocytometer
108
Lampiran 22.Alat dan Bahan yang Digunakan Dalam Penelitian
A. Alat
Gambar 13. Biology Safety Cabinet
Gambar 14. Inkubator CO2
Gambar 15. Autoklaf
Gambar 17. Micropipet
Gambar 18. Sentrifuge
Gambar 19. ELISA reader
Gambar 21. Spektrometer UV
Gambar 22. Microwell Plate 96
Gambar 16. Mikroskop Inverteed
Gambar 20. T-flask
109
B. Bahan
Gambar 23. Medium DMEM
Gambar 27. Tripan Blue
Gambar 24. DMSO
Gambar 28. TRYPSIN EDTA
Gambar 25. Fetal Bovine Serum
Gambar 29. Phosphate Buffer Saline
Gambar 26. MTT
Gambar 30. Sodium Dodecyl Sulfate
110
Lampiran 23. Deskripsi Medium DMEM DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Media PRODUCT DESCRIPTION A basal medium consisting of vitamins, amino acids, salts, glucose and a pH indicator. It contains no proteins or growth promoting agents. BRANDSIGMA® D5796 [1x] g/L
Component Inorganic Salts Calcium Chloride Ferric Nitrate • 9H2O Magnesium Sulfate (anhydrous) Potassium Chloride Sodium Bicarbonate Sodium Chloride Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous) Amino Acids L-Arginine • HCl L-Cystine • 2HCl L-Glutamine Glycine L-Histidine • HCl • H2O L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine • HCl L-Methionine L-Phenylalanine L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine • 2Na • 2H2O L-Valine Vitamins Choline Chloride Folic Acid myo-Inositol Niacinamide D-Pantothenic Acid (hemicalcium) Pyridoxal • HCl Pyridoxine • HCl Riboflavin Thiamine • HCl Other D-Glucose HEPES Phenol Red • Na Pyruvic Acid • Na Add Glucose L-Glutamine Sodium Bicarbonate
0.2 0.0001 0.09767 0.4 3.7 6.4 0.109 0.084 0.0626 0.584 0.03 0.042 0.105 0.105 0.146 0.03 0.066 0.042 0.095 0.016 0.10379 0.094 0.004 0.004 0.0072 0.004 0.004 — 0.004 0.0004 0.004 4.5 — 0.0159 — — — —
111
Lampiran 24.Transformasi Persen – Probit
%
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0
0.0
1.0098
2.1218
2.2522
2.3479
2.4242
2.4879
2.5427
2.5914
2.6344
1
2.6737
2.7096
2.7429
2.7738
2.8027
2.8299
2.8556
2.8799
2.3031
2.9251
2
2.9463
2.9665
2.9859
3.0646
3.0226
3.0400
3.0569
3.0732
3.0896
3.1043
3
3.1192
3.1337
3.1478
3.1616
3.1750
3.1881
3.2009
3.2134
3.2256
3.2376
4
3.2493
3.2608
3.2721
3.2831
3.2940
3.3046
3.3151
3.3253
3.3354
3.3454
5
3.3351
3.3648
3.3742
3.3836
3.3028
3.4018
3.4107
3.4105
3.4282
3.4368
6
3.4452
3.4536
3.4618
3.4699
3.4780
3.4850
3.4037
3.5015
3.5091
3.5167
7
3.5242
3.5316
3.5380
3.5462
3.5534
3.5605
3.5675
3.5745
3.5813
3.5882
8
3.5949
3.6016
3.6083
3.6148
3.6213
3.0278
3.0342
3.6405
3.6408
3.0531
9
3.6692
3.6654
3.6715
3.6775
3.6835
3.6894
3.6053
3.7012
3.7070
3.7127
10
3.7184
3.7241
3.7298
3.7354
3.7409
3.7464
3.7519
3.7574
3.7028
3.7681
11
3.7735
3.7784
3.7840
3.7893
3.7945
3.7996
3.8048
3.8099
3.8150
3.8200
12
3.8250
3.8300
3.8350
3.8399
3.8448
3.8497
3.8545
3.8503
3.8641
3.8089
13
3.8736
3.8783
3.8830
3.8877
3.8923
3.8069
3.9015
3.9061
3.9107
3.9152
14
3.9197
3.9242
3.9286
3.9331
3.9375
3.0419
3.9463
3.9506
3.9550
3.9593
15
3.9636
3.9678
3.9721
3.9763
3.8900
3.0848
3.0890
3.9931
3.9973
4.0014
16
4.0055
4.0096
4.0137
4.0178
4.0218
4.0259
4.0299
4.0339
4.0379
4.0410
17
4.0458
4.0408
4.0537
4.0576
4.001 5
4.0654
4.0693
4.0731
4.0770
4.0808
18
4.0846
4.0884
4.0922
4.0960
4.0998
4.1035
4.1073
4.1110
4.1147
4.1184
19
4.1221
4.1258
4.1295
4.1331
4.1367
4.1404
4.1440
4.1476
4.1512
4.1548
20
4.1684
4.1019
4.1035
4.1690
4.1726
4.1761
4.1796
4.1831
4.1866
4.1901
21
4.1936
4 1970
4.2005
4.2039
4.2074
4,2108
4.2142
4.2176
4.2210
4.2244
22
4.2278
4.2312
4.2345
4.2379
4.2412
4.2446
4.2479
4.2512
4.2546
4.2579
23
4.2612
4.2644
4.2677
4.2710
4.2743
4.2775
4.2808
4.2840
4.2872
4.2905
24
4.2937
4.2969
4.3001
4.3033
4.3065
4.3097
4.3129
4.3160
4.3192
4.3224
112
Lampiran 25.Lanjutan
%
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
25
4 3255
4.3287
4.3318
4.3349
4.3380
4.3412
4.3443
4.3474
4.3505
4.3536
26
4.3567
4.3597
4.3628
4.3659
4.3689
4.3720
4.3750
4.3781
4.3811
4.3842
27
4.3872
4.3902
4.3932
4.3962
4.3992
4.4022
4.4052
4.4082
4.4112
4.4142
28
4.4172
4.4201
4.4231
4.4260
4.4290
4.4319
4.4349
4.4378
4.4408
4.4437
29
4.4466
4.4405
4.4524
4.4554
4.4583
4.4612
4.4041
4.4670
4.4698
4.4727
30
4.4756
4.4785
4.4813
4.4842
4.4871
4.4899
4.4928
4.4956
4.4985
4.5013
31
4.5041
4.5070
4.5098
4.5126
4.5155
4.5183
4.5211
4.5230
4.5267
4.5295
32
4.5323
4.5351
4.5370
4.5407
4.5435
4.5462
4.5490
4.5518
4.5546
4.5573
33
4 .5601
4.5628
4.5656
4.5684
4.5711
4.5739
4.5766
4.5793
4.5821
4.5848
34
4.5875
4.5903
4.5930
4.5957
4.6984
4.6011
4.6039
4.0066
4.6093
4.6120
35
4.6147
4.6174
4.6201
4.6228
4.6255
4.6281
4.6308
4.6335
4.6362
4.6389
36
4.6415
4.6442
4.6469
4.6495
4.6522
4.6549
4.6575
4.6602
4.6628
4.6655
37
4.6681
4.0708
4.6734
4.6761
4.0787
4.0814
4.0840
4.0806
4.6893
4.6919
38
4.6945
4.6971
4.6998
4.7024
4.7050
4.7078
4.7102
4.7120
4.7155
4.7181
39
4.7207
4.7233
4.7259
4.7285
4.7311
4.7337
4.7363
4.7389
4.7415
4.7441
40
4.7467
4.7402
4.7518
4.7544
4.7570
4.7696
4.7622
4.7647
4.7673
4.7699
41
4.7725
4.7750
4.7776
4.7802
4.7827
4.7853
4.7870
4.7904
4.7930
4.7955
42
4.7981
4.8007
4.8032
4.8058
4.8083
4.8109
4.8134
4.8160
4.8185
4.8211
41
4.8230
4.8202
4.8287
4.8313
4.8338
4.8363
4.8389
4.8414
4.8440
4.8465
44
4.8490
4.8516
4.8541
4.8566
4.8592
4.8617
4.8642
4.8668
4.8093
4.8718
45
4.8743
4.8769
4.8704
4 8819
4.8844
4.8870
4.8805
4.8920
4.8945
4.8970
46
4.8996
4.9021
4.9046
4.9971
4.9996
4.9122
4.9147
4.9172
4.9197
4.0222
47
4.9247
4.9272
4.9298
4.9323
4.9318
4.9373
4.9308
4.9423
4.9448
4.9473
48
4.9408
4.0524
4.9549
4.9574
4.9599
4.9624
4.9649
4.9674
4.9699
4.9724
49
4.9740
4.9774
4.9799
4.9825
4.9850
4.0876
4.9900
4.9925
4.9950
4.9975
113
Lampiran 25.Lanjutan
%
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
50
5.0000
5.0025
5.0050
5.0075
5.0100
5.0125
5.1050
5.0175
5.0201
5.0226
51
5.0251
5.0276
5.0301
5.0326
5.0351
5.0376
5.0401
5.0426
5.0451
5.0476
52
5.0502
5.0527
5.0552
5.0577
5.0602
5.0627
5.0652
5.0677
5.0702
5.0728
53
5.0753
5.0778
5.0803
5.0828
5.0853
5.0878
5.0904
5.0929
5.0954
5.0279
54
5.1004
5.1036
5.1055
5.1080
5.1105
5.1196
5.1156
5.1181
5.1206
5.1231
55
5.1257
5.1282
5.1307
5.1332
5.1313
5.1383
5.1408
5.1434
5.1459
5.1484
56
5.1510
5.1535
5.1560
5.1586
5.1614
5.1637
5.1662
5.1687
5.1713
5.1738
57
5.1764
5.1789
5.1815
5.1840
5.1866
5.1801
5.1917
5.1942
5.1968
5.1993
58
5.2019
5.2045
5.2070
5.2096
5.2121
5.2147
5.2173
5.2198
5.2224
5.2250
59
5.2275
5.2301
5.2327
5.2353
5.2378
5.2404
5.2430
5.2468
5.2482
5.2508
60
5.2533
5.3359
5.2585
5.2611
5.2637
5.2663
5.2689
5.2715
5.2741
5.2767
61
5.2793
5.3819
5.2845
5.2871
5.2808
5.2024
5.2050
5.2976
5.3002
5.3029
62
5.3055
5.3081
5.3107
5.3134
5.3160
5.3186
5.3213
5.3239
5.3266
5.3202
63
5.3319
5.3345
5.3372
5.3398
5.3425
5.3451
5.3478
5.3505
5.3531
5.3658
64
5.3585
5.3811
5.3638
5.3665
5.3692
5.3719
5.3745
5.3772
5.3799
5.3826
65
5.3853
5.3880
5.8007
5.3934
5.3961
5.3980
5.4016
5.4043
5.4070
5.4097
66
5.4125
5.4152
5.4170
5.4207
5.4234
5.4261
5.4289
5.4316
5.4344
5.4372
61
5.4399
5.4427
5.4454
5.4482
5.4510
5.4538
5.4565
5.4593
5.4621
5.4649
68
5.4677
5.4705
5.4733
5.4761
5.4780
5.4817
5.4845
5.4874
5.4002
5.4930
69
5.4959
5.4987
5.5015
5.5044
5.5072
5.5101
5.5129
5.5158
5.5187
5.3215
70
5.5244
5.3273
5.5302
5.5830
5.5350
5.5388
5.5417
5.5446
5.5476
5.6505
71
5.5534
5.5503
5.3502
5.5622
5.5651
5.5681
5.5710
5.5740
5.5760
5.5799
72
5.5828
5.5858
5.0888
5.5918
5.5948
5.5978
5.0003
5.0038
5.0008
5.6098
73
5.6128
5.6158
5.0189
5.6219
5.6250
5.6280
5.6311
5.0341
5.6372
5.6403
74
5.6435
5.6464
5.0405
5.6926
5.6557
5.6588
5.6620
5.6651
5.6682
5.6713
114
Lampiran 25.Lanjutan
%
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
75
5.6745
5.6776
5.0808
5.6840
5.6871
5.6903
5.6935
5.6967
5.6998
5.7031
76
5.7083
5.7095
5.7128
5.7160
5.7102
5.7225
5.7257
5.7200
5.7323
5.7356
77
5.7388
5.7424
5.7454
5.7488
5.7521
5.7554
5.7508
5.7621
5.7699
5.7688
78
5.7722
5.7756
5.7796
5.7824
5.7858
5.7892
5.7926
5.7961
5.7995
6.8030
79
5.8834
5.8299
5.8134
5.8169
5.8204
5.8239
5.8274
5.8310
5.8215
6.0381
80
5.8416
5.5452
5.8188
5.8524
5.8560
5.8596
5.8633
5.8669
5.8705
6.8742
8I
5.8779
5.8516
5.8853
5.8890
5.8927
5.8905
5.9002
5.9040
5.9078
5.9116
82
5.9154
5.9192
5.9230
5.9269
5.9307
5.9346
5.9386
5.9424
5.9463
5.9502
83
5.9542
5.9581
5.9624
5.9661
5.9701
5.9741
5.9782
5.9822
5.6863
5.9904
84
5.9945
5.9986
6.0027
6.0069
6.0110
6.0152
6.0194
6.0237
6.0279
6.0222
85
6.0364
6.0407
6.0450
6.0494
6.0537
6.0581
6.0625
6.0069
6.0714
6.0758
86
6.0803
6.0818
6.0893
6.0939
6.0985
6.1031
6.1077
6.1123
6.1170
6.1217
87
6.1264
6.1311
6.1359
6.1407
6.1455
6.1503
6.1552
6.1601
6.1050
6.1700
88
6.1750
6.1800
6.1856
6.1101
6.1952
6.2004
6.2055
6.2107
6.2160
6.2212
89
6.2205
6.2319
6.2372
6.2426
6.2481
6.2536
6.2591
6.2646
6.2702
6.2750
90
6.2816
6.2813
6.2936
6.2988
6.3047
6.3106
6.3165
6.3225
6.3285
6.3346
91
6.3408
6.3469
6.8532
6.3595
6.3658
6.3722
6.3787
6.3852
6.3917
6.3984
92
6.4031
6.4118
6.4187
6.4255
6.4325
6.4395
6.4466
6.4538
6.4611
6.4684
93
6.4758
6.4833
6.4909
6.4985
6.5063
6.5141
6.5220
6.5301
6.5382
6.5464
94
6.8548
6.5632
6.5718
6.5805
6.5893
6.5982
6.6078
6.6164
6.6258
6.6352
95
6.6449
6.6546
6.6646
6.6747
6.6849
6.6954
6.7060
6.7169
6.7279
6.7302
100
101
102
105
106
109
110
113
116
6.7507
6.7624
6.7784
6.7806
6.7991
6.8119
6.8260
6.8084
6.8522
6.8063
117
120
122
125
128
131
134
138
141
145
6.8808
6.8957
6.9110
6.9268
6.9431
6.9600
6.9774
6.9254
7.0141
7.0335
140
153
158
103
169
174
180
187
194
202
97 96
97
115
Lampiran 25.Lanjutan
%
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
98.0
7.6537
7.0556
7.0579
7.0660
7.0621
7.0612
7.0663
7.0684
7.9706
7.0727
98.1
7.6749
7.0770
7.0792
7.0814
7.0836
7.0858
7.0880
7 0992
7.0924
7.0947
98.2
7.0969
7.0992
7.1015
7.1038
7.1061
7.1084
7.1107
7.1130
7.1154
7.1177
98.3
7.1204
7.1224
7.1248
7.1272
7.1297
7.1321
7.1345
7.1370
7.1364
7.1419
98.4
7.1444
7.1469
7.1494
7.1520
7.1545
7.1571
7.1996
7.1622
7.1648
7.1675
98.5
7.1701
7.1727
7.1754
7.1781
7.1808
7.1835
7.1862
7.1890
7.1917
7.1945
98.6
7.1973
7.2001
7.2029
7.2058
7.2086
7.2115
7.2144
7.2173
7.2203
7.2232
98.7
7.2262
7.2292
7.2322
7.2353
7.2383
7.24 14
7.2445
7.2476
7.2508
7.2539
98.8
7.2374
7.2663
7.2636
7.2668
7.2701
7.2734
7.2768
7.2801
7.2835
7.2869
98.9
7.2904
7.2938
7.2973
7.3009
7.3044
7.3080
7.3116
7.3152
7.3189
7.3226
99.0
7.3263
7.3301
7.3339
7.3378
7.3416
7.3455
7.3495
7.3935
7.3575
7.3615
99.1
7.3656
7.3698
7.3739
7.3781
7.3824
7.3867
7.3911
7.3954
7.3099
7.4044
99.2
7.4059
7.4135
7.4181
7.4228
7.4276
7.4324
7.4372
7.4422
7.5474
7.4522
99.3
7. 4373
7.4624
7.4677
7.4730
7.4783
7.4838
7.4893
7.4040
7.5006
7.5063
99.4
7.5121
7.5181
7.5241
7.5302
7.5364
7.5427
7.5401
7.5550
7.5622
7.5690
99.5
7.5758
7.5828
7.5890
7.5972
7.6045
7.6121
7.6107
7.0276
7.6356
7.6437
99.6
7.6521
7.6606
7.6693
7.6783
7.0874
7.6968
7.7065
7.7104
7.7260
7.7370
99.7
7.7478
7.7589
7.7703
7.7822
7.7944
7.8070
7.8202
7.8338
7.8480
7.8027
99.8
7.8782
7.8043
7.9112
7.9299
7.9478
7.9677
7.9889
8.0115
8.0357
8.0618
99.9
8.0902
8.1214
8.1550
8.1847
8.2380
7.2905
8.3528
8.4316
8.5401
8.7190
Tabel 16. Transformasi Persen – Probit
