Protobiont (2017) Vol. 6 (3) : 83 - 88
Uji Antagonis Bakteri Rizosfer Potensial Proteolitik Terhadap Erwinia spp. dari Batang Tanaman Buah Naga (Hylocereus polyrhizus (Haw) Britt & Ros) Apriyani1, Rahmawati1, Mukarlina1 1
Program Studi Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Tanjungpura, Jl. Prof. Dr. H. Hadari Nawawi,Pontianak Email korespondensi:
[email protected]
Abstract Erwinia is one of the pathogenic bacterias that causes the rot disease in the stem of dragon fruit plant. The controlling of pathogen bacteria can be done by utilizing bacteria biological. The purpose of this study is to determine the potential proteolytic rhizosphere bacteria that is able in inhibiting bacterial members of the genus Erwinia spp. which is isolated from the stem of dragon fruit plant. The winter uses double test as the method to determine the ability of bacterial antagonist. Potential proteolytic rhizosphere bacteria are found in eight isolates belonging to the genus Erwinia (BN II and BN IV). The result of antagonistic test shows that TN I rhizosfere bacterial isolate of Erwinia BN II genus with inhibit zone diameter of 12,47 mm and BN IV isolate with a diameter of 11,91mm inhibition zone. Keywords: dragon fruit, proteolytic bacteria, Erwinia, antagonism. PENDAHULUAN Penyakit yang sering menyerang tanaman buah naga yaitu busuk yang menyerang bagian batang tanaman buah naga (Barthana et al., 2013; Helvetia et al., 2013). Penyakit busuk batang disebabkan oleh bakteri yang dapat menyebabkan kematian pada tanaman buah naga. Pengendalian penyakit pada tanaman buah naga dilakukan petani dengan cara memberikan pestisida dan membakar tanaman, namun pengendalian dengan cara tersebut memiliki dampak negatif bagi lingkungan (Mugiastuti et al., 2012; Saptayanti, 2013). Bakteri nonpatogen yang dapat digunakan sebagai agen pengendali hayati yaitu bakteri antagonis. . Mekanisme pengendalian yang dilakukan oleh bakteri antagonis yaitu dengan menghasilkan enzim salah satunya enzim protease. Bakteri yang menghasilkan enzim protease (proteolitik) umumnya dari anggota genus Bacillus, Pseudomonas, Proteus, Treptobacillus, Staphylococcus, dan Streptococcus (Schlegel, 1984 dalam Puspitasari et. al., 2012). Foldes et al. (2000) menyebutkan bakteri anggota genus Bacillus yang diisolasi dari rizosfer tanaman Serelaria mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen anggota spesies Erwinia carotovora. Berdasarkan hasil beberapa hasil penelitian tersebut dapat diketahui bahwa bakteri rizosfer yang diisolasi dari tanah mampu mengendalikan penyakit
busuk batang yang disebabkan oleh bakteri patogen pada tanaman. Belum ada informasi mengenai pengendalian penyakit busuk batang pada tanaman buah naga menggunakan bakteri rizosfer. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui bakteri rizosfer potensial proteolitik sebagai agen pengendali Erwinia spp. pada batang tanaman buah naga BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan selama 4 bulan yaitu dari November 2016 sampai Februari 2017. Pengambilan sampel dan pengukuran faktor lingkungan dilakukan di Perkebunan Nurseri tanaman buah naga yang terletak di Kabupaten Sambas. Karakterisasi, identifikasi dan uji antagonis dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Imu Pengetahuan Alam, Universitas Tanjungpura, Pontianak. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu sampel batang tanaman buah naga yang bergejala busuk, sampel tanah yang diambil di sekitar perakaran tanaman buah naga yang sehat, 83
Protobiont (2017) Vol. 6 (3) : 83 - 88
akuades, alkohol 70% dan 96%, H2O2 1%, larutan desinfektan, media Gelatin, media Motility Indole Ornithine, media Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), media Simmons Citrat Agar, media Trytic Sugar Iron Agar (TSIA), media Urease, parafin cair, pewarna gram (larutan Crystal violet 1%, Lugol’s Iodine 1% dan Safranin 1%), Reagen Kovac’s, Skim Milk dan Starch. Prosedur Penelitian Isolasi Bakteri Batang Bergejala Busuk dan Bakteri Rizosfer Pada Tanaman Buah Naga Isolasi bakteri dari batang yang bergejala busuk dilakukan dengan metode tanam langsung yaitu bagian batang buah naga yang bergejala busuk disterilisasi dengan mencuci bagian batang tersebut menggunakan desinfektan sodium hipoklorit 0,5% selama 30 detik (Okori et al., 2003 dalam Addy, 2008). selanjutnya direndam dalam akuades steril sebanyak dua kali, masing-masing selama 2 menit, kemudian dipotong sebanyak tiga bagian dengan ukuran ± 1x1 cm. Potongan batang tersebut ditanam pada media NA dalam satu cawan petri dan dilakukan pengulangan sebanyak dua kali, lalu diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37ºC (Handoko et al., 2014). Isolasi bakteri rizosfer dilakukan dengan metode pengenceran dengan seri pengenceran 10-1 hingga 10-4. Sebanyak 0,1 ml larutan suspensi dari seri pengenceran 10-3 dan 10-4 diambil dan dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian ditambahkan 20 ml media NA dan dihomogenkan. Setiap seri pengenceran dilakukan duplo dan diinkubasikan di inkubator pada suhu 37º C (Munif & Awaludin, 2011). Uji Protease Kemampuan bakteri rizosfer dalam menghasilkan enzim protease dapat diketahui dengan melakukan inokulasi bakteri pada media Skim Milk. Isolat bakteri yang telah di rekultur kemudian dibiakkan pada mediu Skim Milk yang telah beku pada cawan petri dengan membuat lingkaran berdiameter ± 1 cm. Biakan bakteri selanjutnya diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37ºC. Setelah 24 jam diukur diameter zona bening yang terdapat di sekitar koloni bakteri menggunakan jangka sorong digital (Badriyah & Ardyati, 2013). Selanjutnya isolat yang menghasilkan zona bening pada uji protease digunakan dalam uji antagonis.
Uji Antagonis Uji ganda dilakukan dengan cara pembuatan suspensi isolat bakteri patogen dan bakteri antagonis yaitu diambil beberapa ose isolat bakteri yang sebelumnya telah direkultur dan diinkubasi selama 24 jam, kemudian dimasukkan ke dalam akuades steril dan dihomogenkan. Suspensi bakteri yang telah dihomogenkan disesuaikan kekeruhannya dengan larutan standar sampai 1 Mc. Farland (Nuria, 2010; Sakinah dan Enny, 2014). Media NA dituang sebanyak ± 20 ml dan didinginkan, kemudian suspensi bakteri patogen diambil dengan menggunakan cotton stik dan di swep pada permukaaan media NA yang telah beku sampai merata. Potongan kertas saring steril dengan diameter ± 0,5 cm direndam ke dalam suspensi bakteri rizosfer dan dikeringkan. Selanjutnya potongan kertas saring diletakkan di tengah cawan petri yang telah berisi bakteri patogen (Gambar 1), kemudian diinkubasi selama 24 jam (Kumar et al., 2014; Nawawi, 2001).
Gambar 1. Penempatan Kertas Saring yang telah berisi Bakteri Antagonis (A) dan Cawan Petri yang telah berisi Bakteri Patogen (B) (Kumar et al., 2014)
Analisis Data Data pengukuran diameter zona hambat uji antagonis (Gambar 1) dihitung menggunakan rumus rata-rata. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Seleksi Isolat Bakteri Rizosfer Potensial Proteolitik dari Tanah Tanaman Buah Naga Kemampuan bakteri rizosfer dalam menghasilkan enzim protease dapat dilihat pada kemampuan bakteri dalam menghasilkan zona bening pada media Skim Milk (Gambar 2). Beberapa isolat bakteri mampu menghasilkan zona bening, namun beberapa isolat ada yang tidak dapat menghasilkan zona bening.
84
Protobiont (2017) Vol. 6 (3) : 83 - 88
Gambar 2. Zona Bening yang dihasilkan oleh Bakteri Rizosfer dari Hasil Uji Protease
Aktivitas bakteri proteolitik ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening pada media uji Kemampuan bakteri dalam menghasilkan zona bening dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Pengukuran Zona Bening Kemampuan Protease Pada Bakteri Rizosfer Kode Isolat TN I TN II TN III TN IV TN V TN VI TN VII TN VIII TN IX TN X TN XI TN XII
Diameter Zona Bening (mm) 19,17 15,93 0 20,57 75,38 54,16 0 19,77 0 0 19,89 23,78
Hasil uji menunjukkan tidak semua bakteri mampu menghasilkan zona hambat (Tabel 2). Isolat yang memiliki penghambatan terbesar yaitu isolat TN II. Tabel 2. Diameter Zona Hambat Hasil Uji Antagonis Bakteri Rizosfer Potensial Proteolitik Terhadap Bakteri Anggota Genus Erwinia Kode Isolat
TN I TN II TN IV TN V TN VI TN VIII TN XI TN XII
Rata-Rata Diameter Zona Hambat (mm) Bakteri Patogen Erwinia (BN II) Erwinia (BN IV) 0 9,98 12,47 11,91 6,96 8,20 0 5,24 0 0 0 0 0 0 0 0
Pembahasan Bakteri patogen yang digunakan dalam uji antagonis yaitu bakteri dengan kode isolat BN II dan BN IV yang merupakan bakteri anggota genus Erwinia spp. Bakteri rizosfer yang digunakan sebagai bakteri antagonis yaitu bakteri hasil seleksi pada uji protease yang menunjukkan bakteri memiliki kemampuan menghasilkan enzim protease. Isolat bakteri rizosfer yang digunakan yaitu kode isolat TN I, TN II, TN IV, TN V, TN VI, TN VIII, TN XI, dan TN XII. Uji Antagonis Bakteri Rizosfer Potensial Proteolitik Terhadap Bakteri Erwinia spp. Isolat bakteri rizosfer potensial proteolitik yang telah di dapat kemudian d uji antagonis terhadap bakteri Erwinia spp. Kemampuan penghambatan bakteri dapat dilahat dari rata-rata diameter zona hambat yang terbentuk (Tabel 2).
Bakteri Rizosfer Potensial Proteolitik dari Tanah Tanaman Buah Naga Kemampuan bakteri dalam menghasilkan enzim protease dapat dilihat dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni bakteri pada media. Beberapa isolat yang mampu menghasilkan enzim protease yaitu isolat dengan kode TN I, TN II, TN IV, TN V, TN VI, TN VIII, TN XI, dan TN XII. Zona bening yang dihasilkan oleh bakteri pada media merupakan hasil hidrolisis substrat protein oleh enzim protease yang dihasilkan oleh bakteri. Media Skim Milk mengandung pepton dan susu skim sebagai sumber karbon utama dalam metabolisme bakteri (Yuniati et al., 2015). Menurut Putri (2012) bakteri mampu menghancurkan protein yang terdapat di luar tubuhnya dan menggunakan hasil produk enzimatis tersebut sebagai sumber karbon dan nitrogen. Melliawati et al. (2015) menyebutkan 85
Protobiont (2017) Vol. 6 (3) : 83 - 88
zona bening yang terbentuk di sekitar koloni bakteri pada media Skim Milk menunjukkan kemampuan bakteri dalam menghasilkan sebuah enzim. Besar zona bening yang dihasilkan oleh bakteri menunjukkan besarnya potensi bakteri dalam menghasilkan enzim protease. Bakteri Rizosfer Potensial Proteolitik terhadap Bakteri Erwinia Berdasarkan hasil yang didapat menunjukkan bahwa bakteri rizosfer potensial proteolitik mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen isolat anggota genus Erwinia (BN II) yaitu bakteri isolat TN II dengan besar diameter zona hambat 12,47 mm dan bakteri isolat TN IV dengan diameter 6,96 mm. Bakteri rizosfer potensial proteolitik yang mampu menghambat bakteri isolat anggota genus Erwinia (BN IV) yaitu bakteri isolat TN I, TN II, TN IV dan TN V. Kemampuan terbesar penghambatan dilakukan oleh bakteri isolat TN II dengan diameter zona hambat sebesar 11,91 mm (Tabel 2). Perbedaan kemampuan zona hambat pada kedua bakteri ini dikarenakan isolat bakteri memiliki kemampuan yang berbeda-beda dalam melawan bakteri patogen anggota genus Erwinia. Zona hambat terbentuk karena adanya zat antibiosis dan protease yang dihasilkan oleh bakteri antagonis yang merupakan salah satu mekanisme penghambatan terhadap bakteri patogen. Hasil penelitian Saputra et al. (2015) menunjukkan bahwa bakteri ang`gota spesies Bacillus sp. mampu menghasilkan zona hambat terhadap bakteri R. Solanacearum dalam uji antagonis in vitro. Enzim protease yang dihasilkan oleh bakteri rizosfer memiliki peranan dalam menghambat bakteri patogen. Hasil penelitian Agustono et al. (2012) menyebutkan bakteri anggota spesies Bacillus dan Pseudomonas menghasilkan protease sebagai salah satu substansi antibakteri yang dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen. Hamzah et al. (2009) menyebutkan protease dan antibiotik diproduksi bersamaan yang dapat dilihat dari zona hambat yang terbentuk, hal ini mungkin dikarenakan metabolisme yang dihasilkan oleh bakteri dari hasil fermentasi nutrisi. Menurut EPA (1997) dalam Supriadi (2006) bakteri anggota spesies B. subtilis dapat menghasilkan beberapa senyawa antibiotik yaitu basitrasin, basilin, basilomisin B, difisidin, oksidifisidin, dan subtilisin. Bakteri anggota spesies P. fluorescens melakukan mekanisme antagonis dengan cara menghasilkan beberapa senyawa yaitu pyoluteorin dan pyrrolnitrin yang bersifat toksik terhadap
patogen (Addy, 2007 dalam Diarta et al., 2016). Menurut Olivera et al. (2006) dalam Javandira et al. (2013) senyawa antibiotika merusak dinding sel bakteri anggota genus Erwinia sehingga cairan yang ada di dalam sel akan berkurang dan mengalami plasmolisis. Hal tersebut menyebabkan proses metabolisme sel bakteri akan berhenti dan sel akan mati. Bakteri isolat TN IV dan TN VIII memiliki kemampuan menghambat bakteri isolat anggota genus Erwinia (BN IV) tetapi tidak dapat menghambat bakteri isolat anggota genus Erwinia (BN II), sedangkan bakteri isolat TN V mampu menghambat bakteri isolat anggota genus Erwinia (BN I) dan tidak dapat menghambat bakteri isolat anggota genus Erwinia (BN IV). Hal ini diduga disebabkan bakteri patogen memiliki perlawanan terhadap penghambatan bakteri antagonis sehingga mekanisme yang dilakukan bakteri antagonis tidak berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri patogen. Tasnim et al. (2013) menyebutkan bakteri anggota genus Erwinia mampu melawan antibiotik yang dihasilkan oleh bakteri antagonis dikarenakan bakteri anggota genus Erwinia mampu mengantisipasi dengancara menghasilkan senyawa yang dapat mendegradasi antibiotik. Kemampuan antagonis bakteri rizosfer potensial proteolitik didapatkan penghambatan dengan menghasilkan zona hambat terbesar pada isolat TN II. DAFTAR PUSTAKA Addy, HS, 2008, ‘Aktivitas Pseudomonas Pendar Flour dalam Mengendalikan Penyebab Penyakit Patik (Cercospora nicotianae) pada Tembakau’, Jurnal Pengendalian Hayati, vol. 1, no. 2, hal. 98-103. Agustono, Suprapto, H, & Muhajir, 2012,‘Strategi Bakteri Probiotik Untuk Menekan Pertumbuhan Bakteri Patogen didalam Pencernaan Kerapu Chromileptes altivelis dengan Memproduksi Beberapa Bakteri Substansi’, Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan, vol. 4, no. 2, hal. 199-205. Badriyah IB, & Ardyati, T, 2013, ‘Deteksi Aktivitas Proteolitik Isolat Bakteri Asal Ampas Tahu Pada Substrat Bekatul’, Jurnal Biotropika, vol. 1, no. 3, hal. 109-113. Barthana, N, Nasril, N, & Jumjunidang, 2013, ‘Deskripsi dan Tingkat Seranagn Penyakit Busuk Kuning pada Batang Tanman Buah Naga Merah (Hylocereus polyrhizus, L.) di Padang Pariaman, Sumatra Barat’, Jurnal Biologi Universitas Andalas, vol. 2, no. 3, hal. 222228. 86
Protobiont (2017) Vol. 6 (3) : 83 - 88
Diarta, IM, Javandira, C, & Widnyana, IK, 2016, ‘Antagonistik Bakteri Pseudomonas spp. terhadap Jamur Fusarium oxysporum Penyebab Penyakit Layu Tanaman Tomat’, Jurnal Bakti Saraswati, vol. 5, no. 1, hal. 7076. EPA,
1997, ‘Bacillus subtilis Final Risk Assessment’,http://www.epa.gov/oppt/biotec h/pubs/fra/fra009.htm.
Foldes, T, Banhegyi, I, Herpai, Z, Varga, L, & Szigeti, J, 2000, ‘Isolation of Bacillus Strains from the rhizosphere of Cereals and In Vitro Screening for Antagonism Against Phytopatogenic, Food-Borne Phatogenic and Spoilage MicroOrganisms’, Jurnal of Applied Microbiology, vol. 89, hal. 840-846. Hamzah,
HM, Ali, AHL, & Hassan, HG, 2009,’physiological Regulation of Protease and Antibiotics in Penicillium sp. Using Submerged and Soild State Fermentation Techniques’, Jurnal Of Engineering Science and Technology, vol. 4, no. 1, hal. 81-89.
Handoko, A, Abdul, LA, & Luqman, QA, 2014, ‘Karakteristik Penyakit Penting pada Pembiitan Tanaman Durian di Desa Plangkongan, Kabupaten Magentan dan Pengendalian Dengan Bakteri Antagonis secara In Vitro’, Jurnal HPT, vol. 2, no. 2, hal. 15-22. Helvetia, R, Nasril, N, & Jumjunidang, 2013, ‘Deskripsi dan Tingkat Serangan Penyakit Busuk Hitam pada Batang Tanman Buah Naga Merah (Hylocereus polyrhizus, L.) di Padang Pariaman, Sumatra Barat’, Jurnal Biologi Universitas Andalas, vol. 2, no. 3, hal. 214221. Javandira, C, Luqman, QA, & Abdul LA, 2013, ‘Pengendalian Busuk Lunak Umbi Kentang (Erwinia carotovora) dengan memanfaatkan Agensi Hayati Bacillus subtilis dan Pseudomonas flourescens’, Jurnal HPT, vol. 1, no. 1, hal. 90-97. Kumar, A, Shiv, KV, Ashis & Dhiraj, KC, 2014, ‘Biochemical and Molecular Characterization of Antagonistic Bacteria Against Yellow Blotch of Oyster Mushroom’, International Jurnal of Research in Engineering and Technology, vol. 3, no. 4, hal. 294-297. Melliawati, R, Djohan, AC, & Yopi, 2015, Seleksi Bakteri Asam Laktat Sebagai Penghasil Enzim Protease, Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon, vol. 1, no. 2, hal. 184-188.
Mugiastuti, E, Ruth, FR, & Prasmaji, S, 2012, Pemanfaatan Bacillus sp. dan Pseudomonas flourescens untuk Mengendalikan Penyakit Layu tomat Akibat Sinergi R. Solanacearum dan Meloidogyne sp., Prosiding Seminar Nasional, Pengembangan sumber Daya Pedesaan dan Kearifan Lokal Berkelanjutan II, hal. 72-77. Munif, A & Awaludin, H, 2011, Potensi Bakteri Endofit dan Rhizosfer dalam Meningkatkan Pertumbuhan Jagung, Seminar Nasional Serealia, Institut Pertanian Bogor, E-mail :
[email protected]. Nawawi, G, 2001, Pengukuran Jarak dan Sudut, Modul Program Keahlian Mekanisme Pertanian, Departemen Pendidikan Nasional, Direktorat Pendidikan Menengah Kejuruan, Jakarta. Nuria, MC, 2010, ‘Antibacterial Activities Jangkang (Homalocladium platycladum (F. Muell) Bailey) Leaves’, Jurnal Mediagro, vol. 2, no. 2, hal. 9-15. Olivera, FC, Geruza, RC, Amanda, SM, Andre, AS, & Adriano, B, 2006,’Bacteriocin Like Substance Inhibits Potato Soft Rot caused by Erwinia carotovora’, Canadian Journal of Microbiology, vol. 56, hal. 533-539. Puspitasari, FD, Shovitri, M, & Kuswytasari, DN, 2012, ‘Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Aerob Proteolitik dari Tangki Septik’, Jurnal Sains dan Seni ITS, vol. 1, no. 1, hal. 1-4. Sakinah, AL, & Enny, Z, 2014, ‘Resistensi Azotobacter terhadap HgCl2 yang Berpotensi Menghasilkan Enzim Merkuri Reduktase’, Jurnal Sains dan Seni Pomits, vol. 3, no. 2, hal. 84-86. Saptayanti, N, 2013, Menyimak Kasus Busuk Batang Buah Naga di Kepulauan Riau 2012, Direktorat Perlindungan Hortikultura Kementrian Pertanian, Http://ditin.hortikultura.pertanian.og.id, diakses pada tanggal 25-11-2015. Saputra, R, Arwiyanto, T, & Wibowo, A, 2015, Uji Aktivitas Antagonistik Beberapa Isolat Bacillus spp. Terhadap Penyakit Layu Bacteri (Ralstonia solanacearum) pada Beberapa VarietasTomat dan Identifikasinya, Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon, vo. 1, no, 5, hal, 1116-1122. Schlegel, HG, 1984, Mikrobiologi Umum, Yogyakarta, Gadjah Mada, University Press. Yogyakarta.
87
Protobiont (2017) Vol. 6 (3) : 83 - 88
Tasnim, S, Kuwari, R, & Astiti, NPA, 2013, ‘Efektivitas Daya Hambat Bakteri Streptomyces sp Terhadap Erwinia sp Penyebab Penyakit Busuk Rebah Pada Tanaman Lidah Buaya (Aloe barbadensis Mill)’, Jurnal Simbiosis, vol. 1, no. 1, hal. 21-27.
Yuniati, R, Nugroho, TT, & Puspita, F, 2015, ‘Uji Aktivitas Enzim Protease Dari Isolat Bacillus sp. Galur Lokal Riau’, Jurnal Jom Fmipa, vol. 1, no. 2, hal. 116-122.
88
