UJI AKTIVITAS ENZIM SELULASE PADA KAPANG DARI PERAIRAN PULAU PARI KEPULAUAN SERIBU
MUHAMMAD ISMATULLAH JAY
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI KELAUTAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PERLIMPAHAN HAK CIPTA Saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Uji Aktivitas Enzim Selulase pada Kapang dari Perairan Pulau Pari Kepulauan Seribu adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir skripsi ini. Saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, September 2014
Muhammad Ismatullah Jay NIM C54090064
ABSTRAK MUHAMMAD ISMATULLAH JAY. Uji Aktivitas Enzim Selulase pada Kapang dari Perairan Pulau Pari, Kepulauan Seribu. Dibimbing oleh MUJIZAT KAWAROE dan ADRIANI SUNUDDIN. Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi kapang dari perairan Pulau Pari dan mengetahui aktivitas selulolitik kapang. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2013 sampai Mei 2014, bertempat di Laboratorium Surfactant and Bioenergy Research Center LPPM-IPB dan Laboratorium Bioprospeksi Kelautan, FPIK-IPB. Selulosa merupakan biopolimer yang jumlahnya paling melimpah di alam dan dihidrolisis oleh enzim selulase. Alat dan bahan pada penelitian ini diantaranya media CMC 1%, cawan petri, dan spektrofotometer. Semua sampel kapang diuji kualitatif untuk mengetahui indeks selulolitiknya. Pada uji kuantitatif, ketiga isolat memiliki nilai aktivitas tertinggi pada hari pertama, isolat dengan kode kapang A2, A7, dan A13 memiliki nilai aktivitas enzim selulase berturutturut 11,81X10-4 U/mL, 15,29X10-4 U/mL, dan 18,39X10-4 U/mL. Ketiga isolat tersebut teridentifikasi sebagai Aspergillus sp. Isolat kapang A7 memiliki aktivitas enzim selulase tertinggi pada pH 5 asetat dan suhu 30 °C dengan nilai 12,299x10-4 U/mL, sedangkan isolat dengan kode A13 optimum pada pH 6 asetat dan suhu 30 °C dengan nilai 12,407x10-4 U/mL. Kata kunci : enzim selulase, kapang, aktivitas selulolitik, Aspergillus
ABSTRACT MUHAMMAD ISMATULLAH JAY. Cellulase Activity of Molds Isolated from Surface Waters of Pari Island, Kepulauan Seribu. Under direction of MUJIZAT KAWAROE and ADRIANI SUNUDDIN. The purpose of this study was to identify the mold from Pari Island waters and knowing mold cellulolityc activity. This study was conducted in August 2013-May 2014, at the Laboratory Surfactant and Bioenergy Research Center LPPM-IPB and Laboratory of Marine Bioprospecting FPIK-IPB. Cellulose was the most abundant biopolymer in nature and hydrolysed by cellulase enzymes. Tools and materials used in this study were CMC 1%, petri dish, and spectrophotometer. All molds were tested qualitatively to determine cellulolytic index. In quantitative tests, three isolates had the highest activity values on the first day, with isolates code A2 (11,81X10-4 U/mL), A7 (15,29X10-4 U/mL) and A13 (18,39X10-4 U/mL) had a value of cellulase enzyme activity respectively. All three isolates were from the genus Aspergillus sp. Mold isolate A7 had the highest activity at pH values 5 acetate and at temperature of 30 °C with a value of 12,299x10-4 U/mL, whereas isolates A13 was optimum at pH 6 acetate and 30 °C with a value of 12,407x10-4 U/mL. Keywords : enzyme cellulose, molds, cellulolytic activity, Aspergillus
UJI AKTIVITAS ENZIM SELULASE PADA KAPANG DARI PERAIRAN PULAU PARI KEPULAUAN SERIBU
MUHAMMAD ISMATULLAH JAY
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Ilmu Kelautan pada Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI KELAUTAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2014
Judul Skripsi : Uji Aktivitas Enzim Selulase pada Kapang dari Perairan Pulau Pari Kepulauan Seribu Nama : Muhammad Ismatullah Jay NIM : C54090064
Disetujui oleh,
Dr Ir Mujizat Kawaroe, MSi Pembimbing I
Adriani Sunuddin, SPi MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Wayan Nurjaya, MSc Ketua Departemen
Tanggal lulus :
PRAKATA Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat serta hidayah-Nya sehingga peyusunan skripsi yang berjudul Uji Aktivitas Enzim Selulase pada Kapang dari Perairan Pulau Pari Kepulauan Seribu dapat diselesaikan. Skripsi disusun dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk menyelesaikan studi di Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam penulisan dan penyusunan skripsi ini, terutama kepada : 1. Ibu Dr. Ir. Mujizat Kawaroe, M.Si dan Ibu Adriani Sunuddin, S.Pi, M.Si, selaku pembimbing 2. Mamah, Bapa, Ica, serta seluruh keluarga. Atas segala doa, dukungan, kepercayaan dan kesabarannya. 3. Mang Ade, Bi Mira, terimakasih atas nasehat dan sarannya. 4. Mbak Indah, Mbak Tias, Mbak Odah, dan Mbak Dina dari Labolatorium Surfactan and Biological Research Center 5. Ka Berto, Mbak Afny, dan Bang Krisye atas bantuannya selama proses penelitian. 6. Crazier ITK46. Terimakasih atas doa dan dukungannya selama ini. 7. Semua pihak yang telah membantu dan tidak dapat disebutkan satu persatu. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2014
Muhammad Ismatullah Jay
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
ii
PENDAHULUAN
1
Latar belakang
1
Tujuan penelitian
1
METODE
2
Waktu dan lokasi penelitian
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Penelitian
2
Persiapan inokulum
2
Uji aktivitas selulase secara kualitatif
2
Identifikasi kapang
2
Penentuan waktu produksi enzim selulase
3
Produksi enzim kasar
4
Karakterisasi enzim selulase
4
Derajat keasaman (pH)
4
Suhu
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Aktivitas selulase kualitatif pada beberapa isolat
4
Identifikasi Kapang
5
Waktu produksi enzim selulase
5
Karakterisasi enzim selulase
7
SIMPULAN DAN SARAN
8
Simpulan
8
Saran
9
DAFTAR PUSTAKA
9
DAFTAR GAMBAR 1 Nilai indeks selulotik kapang 2 Kurva pertumbuhan isolat kapang 3 Kurva aktivitas enzim selulase 4 Aktivitas enzim selulase kapang A7 dan A13 pada pH yang berbeda 5 Aktivitas enzim selulase kapang A7 dan A13 pada suhu yang berbeda
5 6 7 7 8
DAFTAR LAMPIRAN 1 Kurva standar glukosa 2 Tabel nilai indeks selulolitik kapang 3 Dokumentasi penelitian 4 Komposisi media CMC 1% dalam 1 liter air laut steril 5 Komposisi reagen DNS (Dinitrosalisilat) 6 Pengamatan pertumbuhan kapang 7 Hasil uji aktivitas selulase kapang
11 12 13 14 14 14 15
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Selulosa merupakan biopolimer yang paling melimpah di alam. Selulosa merupakan polimer glukosa tak bercabang yang terdiri atas unit-unit D-glukosa yang dihubungkan oleh ikatan 𝛽 -1,4-glikosidik membentuk molekul selobiosa. Ikatan hidrogen dan van derwaals menghubungkan selulosa yang berbentuk rantai (Perez et al. 2002). Selulosa yang terdapat di alam terdegradasi secara alami oleh serangga, cacing tanah, kapang dan bakteri. Pendegradasi selulosa yang umum ditemukan adalah kapang (Arief 2009). Kapang merupakan mikroorganisme dari kingdom fungi yang membentuk hifa dan termasuk jenis jamur multiseluler yang bersifat aktif karena mampu memecah bahan-bahan organik kompleks menjadi bahan yang lebih sederhana. Salah satu penghidrolisis selulosa adalah enzim selulase yang dihasilkan oleh kapang. Hidrolisis merupakan proses perombakan rantai selulosa, protein dan molekul lainnya menjadi asam amino dan gula sederhana atau glukosa (Demers et al. 2009). Hidrolisis dapat dilakukan dengan menggunakan asam dan secara enzimatik. Hidrolisis dengan menggunakan asam menggunakan energi yang besar, sehingga biaya yang dikeluarkan relatif mahal. Selain itu, hidrolisis menggunakan asam dapat mengakibatkan degradasi produk monosakarida yang dihasilkan, sehingga produk yang dihasilkan lebih rendah. Hidrolisis secara enzimatik akan berjalan spesifik dan efisien, sehingga produk yang dihasilkan lebih tinggi dan menghasilkan produk monosakarida dengan biaya produksi rendah (Rahmandini 2012). Gula pereduksi seperti glukosa sebagai hasil pengurai limbah selulosa mempunyai prospek bioteknologi yang besar karena dapat dikembangkan ke arah industri bioetanol (Gilbert dan Hazlewood 1993). Bioetanol merupakan salah satu bentuk energi yang terbarukan, bersifat ramah lingkungan dan memiliki efisiensi energi yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan minyak bumi. Enzim selulase adalah suatu sistem enzim yang terdiri atasa tiga tipe enzim yaitu kompleks endo-β-1,4-glukanase, kompleks ekso-β-1,4-glukanase, dan β-1,4glukosidase atau selobiase (Crueger dan Crueger 1984). Kapang penghasil enzim selulase akan menghidrolisis selulosa di alam menjadi bentuk yang lebih sederhana. Penelitian mengenai enzim selulase dari kapang sebagai penghidrolisis selulosa telah banyak dilakukan. Kapang diketahui memiliki aktivitas selulase pada substrat Carboxymethyl Cellulose (CMC) (Arief 2009). Di Indonesia, selulosa sebagai sumber energi terbarukan baru sampai tahap penelitian. Potensinya yang sangat besar mendorong pemanfaatan selulosa sebagai sumber energi masa depan menggantikan sumber bahan bakar fosil. Langkah awal itu membutuhkan enzim perombak selulosa. Oleh karena itu penelitian tentang mikroorganisme yang mampu mendegradasi selulosa perlu dilakukan.
2 Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi kapang dari perairan Pulau Pari dan mengetahui aktivitas selulolitiknya. METODOLOGI Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2013 sampai Mei 2014, bertempat di Laboratorium Surfactant and Bioenergy Research Center (SBRC) LPPM-IPB dan Laboratorium Bioprospektif Kelautan, Bagian Hidrobiologi Laut Departemen ITK, FPIK-IPB. Bahan Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah air laut steril, media Potato Dextrose Agar (PDA), CMC 1%, alkohol, Red Congo 0.1%, isolat kapang, reagen DNS (dinitrosalisillat). Alat Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah cutter/pisau, tabung erlemeyer, pinset streril, cawan petri, jarum ose, autoklaf, inkubator, penanggas goyang, sentifuge, spektrofotometer, shaker, water bath, laminar airflow, vortexs.
Prosedur Penelitian Persiapan inokulum Inokulum kapang diperoleh dari Laboratorium SBRC dan diperbanyak pada media PDA, setelah itu dibiakan pada media CMC. Uji aktivitas selulase secara kualitatif Uji aktivitas selulase secara kualitatif dilakukan untuk mengetahui mana saja kapang yang memiliki aktivitas selulase. Hal ini dapat dilihat dari zona bening yang terbentuk pada kapang yang ditetesi cairan merah kongo 0,1%. Kapang yang diuji kualitatif ditumbuhkan pada media CMC 1% dan diinkubasi selama 5 hari pada suhu ruang. Sebanyak 15 ml merah kongo ditetesi pada kapang, kemudian didiamkan selama 15-30 menit untuk mengetahui zona bening yang terbentuk. Selanjutnya dilakukan pengukuran diameter zona bening dan koloni kapang. Indeks selulotik atau aktivitas selulase (IAS) diperoleh dengan menggunakan rumus sebagai berikut (Kader dan Oman 1998) : Indeks Selulotik =
diameter zona bening (mm )−diameter koloni (mm ) diameter koloni (mm )
…..(1)
3 Identifikasi kapang Kapang yang memiliki aktivitas diidentifikasi sampai tingkat genus dengan menggunakan mikroskop berdasarkan panduan Gandjar et. al.(1999). Penentuan waktu produksi enzim selulase Setelah diketahui isolat kapang dengan aktivitas selulase tertinggi, maka isolat tersebut dibiakkan pada media PDL sebanyak 50 mL. Isolat yang terpilih kemudian diinkubasi pada mesin penanggas goyang dengan kecepatan agitasi 150 rpm. Pengambilan sampel dilakukan tiap 24 jam selama 7 hari untuk menghitung kepadatan spora. Setelah itu dibuat kurva pertumbuhan kapang untuk mengetahui waktu penuangan inokulum yang terbaik pada media produksi. Waktu optimum didapat dengan menggunakan metode CMCase. Metode CMCase dalam pegujian aktivitas enzim didefinisikan sebagai 1 µmol glukosa yang dihasilkan dari degradasi substrat CMC tiap menit (Wahyuningtyas et al. 2013). Setelah didapat masa inkubasi optimum, dilakukan inkubasi di media cair CMC 1%. Sebanyak 10 mL kaldu nutrien yang telah mengalami masa inkubasi optimum dituang ke dalam media cair CMC 1% sebanyak 90 mL dan diinkubasi pada mesin water bath dengan suhu 50 °C. Sebanyak 3 ml filtrat dari tiap-tiap sampel diambil tiap harinya kemudian diambil ekstrak kasar enzimnya. Ekstrak kasar enzim diperoleh dengan mensentrifugasi substrat hasil kultur pada kecepatan 4000 g selama 15 menit dalam suhu ruang. Kemudian diambil supernatannya sebanyak 1 mL. Aktivitas selulase harian didapatkan dengan menggunakan metode Miller (1959) dengan mencampurkan supernatan yang ditambah larutan DNS sebanyak 3 ml. Kemudian dikocok menggunakan vortex. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu 100 ° C selama 25 menit. Setelah larutan didinginkan, ukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.Produksi enzim ditetapkan berdasarkan aktivitas tertinggi pada masa inkubasi. Aktivitas selulase dinyatakan dalam satuan internasional yaitu U/mL. Kadar glukosa yang dihasilkan dari hidrolisis selulosa dengan enzim selulase berdasarkan absorbansi pada panjang gelombang 575 nm. Absorbansi = ((As-Ab)-(Ak-Ab))…..(2) dimana :
As = Absorbansi sampel Ab = Absorbansi blanko Ak = Absorbansi kontrol
Nilai absorbansi yang diperoleh kemudian dimasukan ke dalam persamaan yang diperoleh dari kurva standar glukosa (Lampiran 1). Kemudian, aktivitas selulase dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut (Irawan et al. 2008). Aktivitas selulase (U/mL) = dimana :
V t BM
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 𝑋 1000 𝑣𝑥𝑡𝑥𝐵𝑀
= volume enzim (1 mL) = waktu inkubasi (30 menit) = berat molekul glukosa (180 Dalton)
…..(3)
4 Produksi enzim kasar Produksi enzim selulase dilakukan berdasarkan prosedur dan waktu inkubasi yang telah diketahui aktivitas selulase tertinggi dan waktu inkubasi yang telah diketahui aktivitas selulase tertinggi pada kurva aktivitas selulase yang dihasilkan. Media pertumbuhan produksi diinkubasi pada suhu 50 °C di dalam penanggas goyang dengan kecepatan agitasi 150 rpm, kemudian enzim selulase dipanen selama waktu produksi tertinggi yang telah didapatkan sebelumnya. Kultur sel pada media produksi yang mengandung enzim selulase ekstrakseluler di sentifugasi pada kecepatan 10.000 g selama 15 menit untuk memisahkan larutan enzim. Supernatan hasil sentrifugasi kemudian disimpan pada suhu 10 °C sebagai ekstrak enzim kasar. Karakterisasi enzim selulase Derajat keasaman (pH) Media yang mendukung aktivitas selulase tertinggi, diuji dengan cara mencampurkan isolat dengan beberapa nilai pH yang berbeda. Sebanyak 0,2 mL enzim direaksikan dengan 1,8 mL substrat. Substrat didapat dengan mencampurkan CMC ke dalam pH yang berbeda. pH yang digunakan adalah pH 3,4,5,6,7,8,9. Masing-masing isolat kapang diinkubasi pada suhu 30 °C selama 30 menit. Aktivitas enzim selulase diukur sesuai dengan prosedur pengujian sebelumnya. Suhu Isolat kapang dengan aktivitas selulase tertinggi juga diuji pada suhu yang berbeda-beda. Hal ini didapat dengan cara mereaksikan 0.2 mL enzim dengan 1,8 mL substrat. Substrat dibuat dengan mencampurkan CMC kedalam buffer dengan nilai aktivitas tertinggi. Pengukuran dilakukan pada suhu 30 - 90 °C dengan selang 10 °C selama 30 menit waktu inkubasi. Aktivitas enzim selulase diukur sesuai dengan prosedur pengujian sebelumnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN Aktivitas selulase kualitatif pada beberapa isolat Sebanyak 16 isolat dengan kode yang berbeda diinkubasi selama 7 hari pada media CMC 1% dan diberikan pewarna merah kongo 0,1% untuk mengetahui zona bening yang dapat mendegradasi selulosa. Sebanyak 3 dari 16 kapang yang ditetesi indikator merah kongo diketahui memiliki zona bening (Lampiran 2). Tiga isolat tersebut dengan kode A2, A7, dan A13 dipilih untuk dilakukan uji selanjutnya (Gambar 1).
5
0.35 Indeks selulolitik
Nilai indeks selulolitik
0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 A2
A7
A13
Kode kapang Gambar 1 Nilai indeks selulolitik kapang Isolat dengan kode A2, A7, dan A13 berturut-turut memiliki nilai indeks selulolitik 0.32, 0.3, dan 0.19. Ketiga isolat tersebut memiliki kemampuan untuk menguraikan substrat CMC 1%. Hal ini dikarenakan ketiga kapang tersebut memiliki zona bening setelah ditetesi pewarna merah kongo. Zona bening menunjukkan bahwa selulosa di zona tersebut mengeluarkan enzim ekstraseluler dan telah terurai menjadi unit-unit yang lebih sederhana. Besar kecilnya zona bening yang dihasilkan dipengaruhi oleh konsentrasi CMC dan agar-agar yang digunakan. Semakin banyak CMC dan agar-agar yang diberikan maka pori-pori media yang dihasilkan akan semakin mengecil, sehingga enzim yang disekresikan akan terhambat proses degradasinya dan sulit melewati pori-pori tersebut (Hankin dan Anagostakis 1997). Identifikasi kapang Setelah diuji secara kualitatif 3 dari 16 kapang yang memiliki nilai tertinggi akan dipilih untuk selanjutnya diidentifikasi hingga tingkat genus. Ketiga kapang tersebut adalah kapang dengan kode A2, A7, dan A13, dengan genus yang sama yaitu Aspergillus sp. Waktu produksi enzim selulase Pengukuran kepadatan sel dilakukan untuk mengetahui waktu dengan jumlah spora terbanyak pada kapang, dilihat dengan menggunakan mikroskop selama 7 hari (Gambar 2). Kapang yang diinokulasikan pada suatu media mulamula akan mengalami fase adaptasi. Tujuannya untuk menyesuaikan diri dengan media dan kondisi lingkungan sekitarnya. Pada Gambar 2, fase ini terlihat pada hari ke-1 untuk tiap isolat dan belum terjadi pembelahan sel karena enzim belum disintesa. Fase pembelahan sel terjadi pada hari ke-2, yang merupakan fase
6
Kepadatan sel (sel/mL) x 104
pertumbuhan awal. Pada fase ini, kecepatan sel dalam membelah diri masih rendah karena sel masih menyesuaikan diri dengan lingkungan. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
A2 A7 A13
1
2
3
4 Hari ke-
5
6
7
Gambar 2 Kurva pertumbuhan isolat kapang Ketiga isolat A2, A7, dan A13 memiliki spora terpadat pada hari ke-3. Fase ini disebut sebagai fase logaritmik. Fase logaritmik merupakan fase yang memiliki waktu reproduksi yang cepat (Madigan et al. 2009). Fase ini dapat terlihat dari jumlah sel yang paling banyak dari ketiga kapang tersebut berada pada hari ke-3 (Gambar 2). Kapang yang memiliki kepadatan tertinggi adalah kapang dengan kode A13 dengan jumlah sel tertinggi sebanyak 89,6x 104 sel/mL dan kapang dengan kode A2 dan A7 berturut-turut memiliki jumlah sel tertinggi 32 x 104 sel/mL dan 25,6 x 104 sel/mL. Waktu pertumbuhan kapang pada fase logaritmik digunakan untuk waktu penuangan media inokulum ke media produksi. Tujuannya agar isolat yang dituangkan tidak membutuhkan waktu yang lama untuk beradaptasi dengan media produksi sehingga produksi enzim pada media produksi lebih cepat. Ketiga kapang mengalami fase stationer setelah kapang mengalami pertumbuhan tertinggi dan tidak terjadi lagi penambahan spora. Hal ini dikarenakan pengurangan nutrien esensial dalam media dan adanya akumulasi bahan-bahan terbuang pada media pertumbuhan (Madigan et al. 2009). Jika masa inkubasi dilanjutkan maka jumlah sel hidup akan berkurang serta adanya lisis atau pecahnya sel yang menyebabkan penurunan massa sel. Selanjutnya isolat tersebut menuju fase kematian, karena jumlah spora yang tersedia semakin berkurang. Fase ini bisa terlihat setelah ketiga isolat melewati hari ke-4 hingga hari ke-7 (Gambar 2). Ini sesuai dengan penelitian Meryandini et. al.(2009) setelah mengalami pertumbuhan dengan kepadatan sel tertinggi, jumlah kepadatan sel pada mikroba akan menurun. Waktu untuk produksi enzim selulase didapat dengan menghitung nilai aktivitas enzim setiap harinya selama 5 hari dengan selang waktu 24 jam. Nilai aktivitas selulase didapat dengan mencampurkan enzim dengan larutan DNS. Nilai aktivitas tertinggi merupakan waktu optimum
7 untuk memproduksi enzim selulase. Ketiga isolat dengan kode kapang A2, A7, dan A13 memiliki nilai aktivitas tertinggi pada hari ke-1. Nilai aktivitas enzim selulase yang dimiliki ketiga isolat bervariasi. Nilai aktivitas enzim yang tertinggi dimiliki oleh isolat dengan kode A13, dengan nilai 18,39X10-4 U/mL. Isolat dengan kode A2 dan A7 memiliki nilai aktivitas enzim tertinggi berturut-turut 11,81X10-4 U/mL dan 15,29X10-4 U/mL. Setelah mencapai waktu dengan aktivitas tertinggi, nilai aktivitas enzim selulase tiap isolat mengalami penurunan. Hal ini dikarenakan keberadaan glukosa dalam waktu tertentu dan ketersediaan substrat yang semakinberkurang sehingga terjadinya penurunan nilai aktivitas enzim selulase. Isolat dengan kode A7 dan A13 dipilih untuk diuji lebih lanjut karena memiliki nilai aktivitas enzim selulase yang lebih tinggi (Gambar 3).
X10-4
26 24
Aktivitas Enzim Selulase ( U/mL)
22 20
A2
18
A13
16
A7
14 12 10 0
1
2 3 4 Hari keGambar 3 Kurva aktivitas enzim selulase
5
Karakterisasi enzim selulase Derajat keasaman (pH) Salah satu parameter yang berpengaruh terhadap aktivitas enzim adalah pH (Yin et al. 2010). Perhitungan aktivitas enzim dengan karakteristik pH dihitung menggunakan buffer pH 3-9. Pengaruh pH pada aktivitas enzim terlihat dari perbedaan nilai yang didapat saat pengujian dengan menggunakan pH yang berbeda (Gambar 4).
8
Aktivitas Enzim Selulase (U/mL) X10-4
13 12.8
A7 A13
12.6 12.4 12.2 12 11.8 11.6 11.4
9 tris HCL
8 tris HCL
7 tris HCL
7 fosfat
6 fosfat
5 fosfat
5 asetat
4 asetat
3 asetat
Buffer pH Gambar 4 Aktivitas enzim selulase kapang A7 dan A13 pada pH yang berbeda Aktivitas enzim selulase pada isolat dengan kode A7 memiliki nilai aktivitas tertinggi pada pH 5 asetat dengan nilai aktivitas enzim sebesar 12,623x10-4 U/mL. Aktivitas enzim selulase pada isolat dengan kode A13 optimum pada buffer pH 6 fosfat dengan nilai aktivitas enzim 12,37x10-4 U/mL (Gambar 4). Suhu Salah satu faktor yang menyebabkan perubahan aktivitas enzim adalah suhu. Hal ini ditunjukkan oleh adanya perbedaan nilai aktivitas enzim pada suhu yang berbeda. Aktivitas enzim isolat dengan kode A7 dan A13 mencapai nilai tertinggi pada suhu 30 °C. Nilai aktivitas enzim isolat A7 dan A13 berturut-turut adalah 12,299x10-4 U/mL dan 12,407x10-4 U/mL (Gambar 5). Nilai aktivitas enzim selulase menurun saat diuji pada suhu diatas 30 °C. Suhu yang sesuai untuk memproduksi enzim adalah 30 °C. Setelah itu nilai aktivitas enzimnya menurun seiring dengan meningkatnya suhu. Ketika mencapai suhu dengan nilai aktivitas tertinggi, kecepatan reaksi enzim naik karena energi kinetik bertambah. Bertambahnya energi kinetik akan mempercepat gerak vibrasi, translasi, dan rotasi baik enzim maupun substrat (Meryandini et.al 2009). Turunnya aktivitas enzim akibat panas menyebabkan putusnya sebagian besar ikatan yang kurang kuat pada strutktur protein enzim (Rahmandini 2012).
9
Aktivitas ezim selulase(U/mL) X10-4
12.5 12.4
A7
12.3
A13
12.2 12.1 12 11.9 11.8 11.7 11.6 11.5 30
40
50
60
70
80
90
Suhu Gambar 5 Aktivitas enzim selulase kapang A7 dan A13 pada suhu yang berbeda
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan Dari perairan Pulau Pari diperoleh isolasi kapang dengan kode A2, A7, dan A13 bergenus Aspergillus sp. yang memiliki nilai indeks selulolitik berturut-turut 0.32 , 0.3, dan 0.19. Pada uji kuantitatif, ketiga isolat memiliki nilai aktivitas enzim selulase optimumpadaharipertama, secara berurutan nilai tersebut untk kapang A2, A7, dan A13 adalah 11,81X10-4 U/mL, 15,29X10-4 U/mL, dan 18,39X10-4 U/mL. Kedua isolat memiliki aktivitas enzim tertinggi pada suhu 30 °C dengan nilai pH yang berbeda. Yaitu pH 5 asetat dan buffer pH 6 fosfat. Saran Isolat yang diuji aktivitas selulase pada pH dan suhu yang berbeda, memiliki nilai aktivitas enzim yang bervariasi. Penelitian selanjutnya lebih baik difokuskan pada nilai aktivitas enzim optimum karena memiliki standar deviasi yang terkecil. Selain itu, perlu diperhatikan komposisi pembuatan media terutama media CMC 1%. Perbedaan komposisi akan mempengaruhi kepadatan substrat, semakin padat substrat maka kapang akan sulit untuk mendegradasi substrat tersebut.
10
DAFTAR PUSTAKA Arief M.Z. 2009. Aktivitas Selulolitik Beberapa Kapang. [skripsi]. Biologi. Institut Pertanian Bogor. Crueger W., dan Crueger A. 1984. Biotechnology of Cellulosic Biomass for the Production of Second Generation Biofuels. Di dalam : Brock TD, editor. A Textbook of Industrial Microbiology. Sunderland: Minuaer Associates: Worcester Polytechnic Institute. Demers A, Doane R., Guzman S., dan Pagano R 2009. Enzymatic Hydrolysis of Cellulosic Biomass for the Ptoduction of Second Generation Biofuels. Worcester Polytechnic Institute. Gandjar I, R.A. Samson, K. van den Tweel-Vermeulen, A. Oetari dan I. Santoso. 1999. Pengenalan Kapang Tropik Umum. Jakarta: Yayasan Obor Indonesia. Gilbert HJ, dan Hazlewood. 1993. Bacterial cellulases and xylanases. J Gen Microbiol 139: 187-194. Hankin L, dan Anagostakis SL. 1997. Solid media containing carboxymethyl cellulose to detect Cx cellulase activity of microorganisms. J Gen Microbiol 98: 109-115. Irawan B, Sutihat, dan Sumardi. 2008. Uji aktivitas selulase dan lipase pada mikrofungi selama proses dekomposisi limbah cair kelapa sawit dengan pengujian kultur murni. Prosiding Seminar Hasil Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat. Lampung. Universitas Lampung. Hlm 284-291. Kader AJ, dan Omar O. 1998. Isolation of Cellulotic Fungi from Sayap-Kinabalu Park, Sabah. Serawak. J Biodiversity Bio-Century (ARBEC): 1-6. Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, dan Clark DP. 2009. Brock Biology of Microorganisms. Ed ke-12. Prentice-hall Interntional (UK) limited. Hlm 991. Meryandini A, Widosari W, Besty Maranatha, Sunarti TC, Rachmania N, dan Satria H. 2009. Bakteri Selulolitik dan Karakterisasi Enzimnya. [laporan]. Biologi. Institut Pertanian Bogor. Miller GL. 1959. Use of Dinitrosalicyclyc Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31: 426-428. Perez J, Munoz-Dorado J, Rubia T, dan Martinez J. 2002. Biodegradation and Biological Treatments of Cellulose, Hemicellulose, And Lignin. J. Int.Microbiol. 5:53-63. Poernomo AT, dan Djoko DA. 2003. Uji aktivitas enzim proteolitik ekstrak kasar Bacillus subtilis FNCC 0059 hasil fermentasi curah. Majalah Farmasi 3:103-107. Rahmandini I. 2012. Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Bakteri yang Diisolasi dari Limbah Rumput Laut. [tesis]. Institut Pertanian Bogor. Teather RM, dan Wood PJ. 1982. Use of Congo Red-Polysaccharide Interactions in Enumeration and Characterization of Celluloytic Bacteria From The Bovine Rumen. Appl. Environ. Microbiol.43: 777-780. Wahyuningtyas P, Argo BD, dan Nugroho WA. 2013. Studi Pembuatan Enzim Selulase dari Mikrofungi Trichoderma reesei dengan Substrat Jerami Padi
11 Sebagai Katalis Hidrolitis Enzimatik pada Produksi Bioetanol. [laporan]. Institut Pertanian Bogor. Yin JL, Lin HH, dan Xiao. 2010. Purification and Characterization of A Cellulase from Bacillus subtilis YJ1. Journal of Marine Science and Tecnology.18(3): 446-471
12
LAMPIRAN Lampiran 1 Kurva standar glukosa Konsentrasi glukosa (ppm)
Nilai absorbansi
50 100 150 200 250 300
0.008 0.101 0.228 0.401 0.519 0.7
0.800 y = 0.002x - 0.166 R² = 0.990
0.700 0.600
Nilai absorbansi
0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0 -0.100
\
100
200 Konsentrasi (ppm)
300
400
13 Lampiran 2 Tabel nilai indeks selulolitik kapang
No.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Kode kapang
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A19
Diameter zona Diameter koloni (mm) bening (mm)
Nisbah zona bening (mm)
U1
U2
U3
10.33 13 10 13 15 15 11.33 23.33 13 20 10 12 12 17 15 10
10 15 10 11 14 15 13.33 22.67 12 20 10 11 14 16 16 10
10.7 15 11 11 14 16 12.33 22.33 13 23 13 13 15 16.67 17 11
Ratarata (mm)
U1
U2
U3
U1
U2
17
20
20
3.07
3.33 3.33 3.24
14
14.67 14.67
2.35
3.33 3.33 3.00
14
17
1.67
2.14 2
18
U3
Lampiran 3 Dokumentasi penelitian
Kapang A2 (kiri sebelum ditetesi red congo, kanan setelah ditetesi red congo)
Kapang A7 (kiri sebelum ditetesi red congo, kanan setelah ditetesi red congo)
1.94
14
Kapang A13 (kiri sebelum ditetesi red congo, kanan setelah ditetesi red congo)
Cold Sentrifuge Lampiran 4 Komposisi media CMC 1% dalam 1 liter air laut steril No
Bahan
Komposisi (Gram)
1 2 3 4 5 6 7 8
CMC MgSO47H2O KNO3 K2HPO4 FeSO47H2O CaCl22H2O Agar-agar Glukosa
10 0.2 0.75 0.5 0.02 0.04 15 1
9
Antibiotik
0.025
Lampiran 5 Komposisi reagen DNS (Dinitrosalisilat) No 1 2 3 4 5 6
Bahan Asam 3,5 dinitrosalisilat NaOH K-Na Tartarat Fenol Na-Metabisulfit HCL 0,1
15 Lampiran 6 Pengamatan pertumbuhan kapang Kepadatan sel (sel/mL) A2 A7 0 0 128000 96000 160000 224000 320000 256000 128000 160000 96000 96000 96000 96000 64000 0
Hari ke0 1 2 3 4 5 6 7
A13 0 704000 768000 896000 416000 288000 96000 64000
Lampiran 7 Hasil uji aktivitas selulase kapang A2
A7
Hari Konsentrasi Aktivitas keglukosa selulase (mg/mL) (U/mL)
A13
Konsentrasi Aktivitas glukosa selulase (mg/mL) (U/mL)
Konsentrasi Aktivitas glukosa selulase (mg/mL) (U/mL)
0
0,0059679
0,00110516 0,006057
0,0012226 0,0060214
0,001215
1
0,0063786
0,00118122 0,007575
0,0015290 0,0091107
0,001839
0,0059500
0,00110185 0,006718
0,0013560 0,0060036
0,001212
0,0063071
0,00116799 0,006593
0,0013308 0,0067893
0,001370
0,0062357
0,00115476 0,007021
0,0014173 0,0062179
0,001255
0,0059857
0,00110847 0,005825
0,0011758 0,0058786
0,001187
2 3 4 5
16
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 22 Agustus tahun 1991 di Bogor, Jawa Barat, putra pertama dari Bapak Jarkasih dan Ibu Euis Salbiah. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Tahun 2003 penulis lulus dari SDN Bangka 3 Bogor, tahun 2006 lulus dari SMPN 1 Bogor, tahun 2009 penulis lulus dari SMAN 3 Bogor, dan di tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Ujian Talenta Mandiri IPB (UTM). Penulis juga aktif dalam perlombaan karya ilmiah, salah satu lomba yang pernah diikuti oleh penulis adalah Pekan Kreativitas Mahasiswa dengan judul Efisiensi Mangrove Bruguiera gymnorrhiza untuk Diversifikasi Pangan Masyarakat Pesisir dan untuk Ketahanan Pangan Nasional. Dalam rangka penyelesaian studi, penulis melakukan penelitian dengan judul “UJI AKTIVITAS ENZIM SELULASE PADA KAPANG DARI PERAIRAN PULAU PARI KEPULAUAN SERIBU”.
