Capillary Zone Electrophoresis, CZE
v ef ,i = m ef,i ⋅ E = m ef ,i ⋅
ELEKTROMIGRAČNÍ SEPARAČNÍ METODY
U L
ELEKTROOSMOTICKÝ TOK (ELEKTROOSMÓZA)
kV
elektroforetická rychlost : vef,i [m/s] elektroforetická pohyblivost : mef,i [m2/Vs]
1) Kapilární zónová elektroforéza (CZE) 2) Kapilární gelová elektroforéza (CGE) 3) Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC, MEKC) 4) Elektrochromatografie v naplněných kapilárách (EC, CEC) 5) Kapilární izoelektrické fokusování (CIEF, IEF) 6) Kapilární izotachoforéza (CITP, ITP)
Kapilára z křemenného skla (fused silica) s vnější vrstvou polyimidu vnitřní průměr : 50 , 75 nebo 100 μm vnější průměr : 375 μm
75 µm i.d. 375 µm o.d.
Fel,i = Qi ⋅ E
Ftr, i = − 6π ⋅η ⋅ ri ⋅ vi
Fel,i = Mi ⋅ a i
Fel,i = − Ftr,i
mef,i
Qi = 6π ⋅ η ⋅ ri
Iont ri [nm] rh [nm] mi [10-4 cm2/Vs] + Li 0,152 0,380 4,01 Na+ 0,186 0,316 5,19 K+ 0,227 0,272 7,92 Rb+ 0,248 0,268 8,06 Cs+ 0,265 0,268 8,00 ri iontový poloměr rh poloměr hydratovaného iontu mi limitní iontová pohyblivost Iont mi [10-4 cm2/Vs] NO2 -7,44 NO3-7,40 SO42-8,29 HSO42- -5,18 mi limitní iontová pohyblivost
EOF
anoda
katoda
+
-
von Smoluchovského rovnice:
εr ⋅εo ⋅ζ ⋅E η
v eof = m eof ⋅ E =
L = 0,5 m, U = 30 000 V, meof = 0,0005 cm2/Vs → veof = 3 mm/s POVRCHOVÝ NÁBOJ − O 2Si − OH + H2O ⇔ − O 2Si − O − + H3O + pK = 5,5 O - O- O - O- OSi Si Si Si Si
elektroforetická pohyblivost Využití dvou transportních jevů : 1. elektroforetická migrace iontů 2. elektroosmotický tok kapaliny ELEKTROFORETICKÁ MIGRACE
O O- ONaOH HCl O
aktuální iontová pohyblivost - při jisté koncentraci elektrolytů v roztoku, tj. při I > 0 6 5
2 -4
efektivní náboj iontu souvisí s iontovou sílou roztoku, která se projevuje retardačním a relaxačním efektem
H H H O O O
Si Si Si Si Si
meof [10 cm /Vs]
+ vef
O
Si Si Si Si Si
efektivní poloměr iontu souvisí s hydratační sférou iontu
iontová sféra
-
limitní iontová pohyblivost - při nekonečném zředění, tj. při I → 0
H
4 3 2 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
pH
Elektromigrační metody, C230P24
ELEKTRICKÁ DVOJVRSTVA
RYCHLOSTNÍ PROFIL −
− O − SiO2 H + H2O ⇔ − O − SiO2 + H3O
Φo
d
+
+
tlakem hnaná kapalina
zdroj vysokého napětí separační kapilára
+
+
Φd δ
+
_1 Φ
Φ
d
e
difúzní vrstva adsorbovaná vrstva
parabolický profil
rovina střihu
+
Φ = ζ (zeta potenciál) +
+
+
+
rychlost zóny: v poz,i = veof + vef ,i
elektrické pole
TEPLOTNÍ PROFIL
εr ⋅εo ⋅ζ m eof = η
Φ1
Jouleovo teplo : Q = P = U ⋅ J
parabolický logaritmické
rovina střihu ζ2 ζ1 ζ3
výstupní nádobka
CZE - SEPARAČNÍ MECHANISMUS
+
ZETA POTENCIÁL ( ζ )
Φ2
-
zapisovač
vstupní vzorek nádobka
rovný profil
stěna kapiláry
+
elektroosmoticky hnaná kapalina
-
stojící pohybující se
uzemněná elektroda
detektor
anoda
+
-+ -+ -+ -
CZE - PŘÍSTROJ
+
-+ -+ -+ -
+
zóna vzorku Vef,+ Vef,-
+
elektrické pole separační pufr
N N N
Veof
+ + +
všechny neutrální
Veof -
di do
-
Veof +Vef,- Veof +Vef,+ -
∆Tr ∆Ts
povrchový náboj roste koncentrace pufru roste
v eof > 0, v ef,+ > 0, v ef,- < 0
N -
negativně nabitá
N N
+
+
+
pozitivně nabitá
chlazení kapiláry : a) vzduchem b) kapalinou Elektromigrační metody, C230P24
SLABÉ ELEKTROLYTY (kyseliny) HA + H 2O ⇔ A − + H3O+
odezva detektoru
0.005
negativně nabitá látka
tmig,+
0.004 pozitivně nabitá látka
0.003
t eof
tmig,-
všechny neutrální látky
0.002
[A − ] −
[HA] + [A ]
=
10
m eff, HA = m A − ⋅
+
1 + 10
(pK a − pH)
Ka =
10− pK a − pK a
−
+ 10 −
[A ]
1
=
− pH
[A ] ⋅ [H3O ] [HA]
= mA− ⋅
[HA] + [A − ]
1 1 + 10(pK a − pH)
meff,HA efektivní elektroforetická pohyblivost mA- iontová pohyblivost
0.001
-4
VÍCESYTNÉ ELEKTROLYTY kyselina m-hydroxybenzoová pK1 = 4,06 mef,HA- = -3,36·10-4 cm2/Vs pK2 = 9,92 mef,A2- = -5,38·10-4 cm2/Vs distribuční diagram 1.2
molární zlomek , x(i)
ELEKTROFEROGRAM
-
3
4
0.4 0.2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
pH
[HA]>>[A ]
0
efektivní mobilita
-1
-4
migrační čas [min]
5
2
2
0.6
-
meff,HA [10 cm /Vs]
1
2-
[A ]
0.8
0.0
1
0
-
[HA ]
2
kys.benzoová pKa= 4,2 mA = -3,4·10 cm /Vs
0.000
[H2A]
1.0
[BH + ]
t mig, i l ⋅l = = d c U t mig, i ⋅ U lc
mef,i = m poz,i − meof mef,i =
6
8
10
12
BH+ + H 2O ⇔ B + H3O +
1 ld ⋅ lc l ⋅l 1 − d c = − t mig, i ⋅ U t eof ⋅ U t mig, i t eof
l ⋅l ⋅ d c U
mef,i > 0 pro kationty mef,i < 0 pro anionty mpoz,i > 0 pro oboje, pokud m ef ,i < m eof
[B] + [BH + ]
14
=
Ka =
+
[B] ⋅ [H 3O ] +
[BH ]
=
10− pH + 10− pK a [BH + ] +
[B] + [BH ]
1 + 10(pH − pK a )
= m BH + ⋅
-4
2
tyramin pKa= 9,5 mBH = 3,8·10 cm /Vs +
5
3 2
+
[BH ]>>[B]
1 0
+
[B]>>[BH ] -1
0
2
4
6
pH
8
10
-3 -4 -5 -6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1
1 1 + 10
meff,B efektivní elektroforetická pohyblivost mBH+ iontová pohyblivost
4
-2
pH
10− pH
m eff, B = m BH + ⋅
2
E
4
SLABÉ ELEKTROLYTY (zásady)
-4
m poz,i = meof + mef,i =
2
pH
ld
-1
2
0
l ⋅l t veof = eof = d c U t eof ⋅ U E lc vpoz, i
[A ]>>[HA]
-4
U lc
ld
meof =
0
-
-4
ld , lc , U , E =
meff, B [10 cm /Vs]
tmig,i , teof
1
-3
meff,s [10 cm /Vs]
POČÍTÁNÍ POHYBLIVOSTÍ
-2
12
14
(pH − pK a )
meff, s =
f 1 f ⋅ ∑ ci ⋅ m ef,i = ∑ xi ⋅ mef,i cs i =1 i =1
PUFRY tetraboritan sodný, Na2B4O7, pKa = 9,2 kyselina fosforečná, fosforečnan, pKa = 2,1, mi = -3,4 kyselina fosforečná, fosforečnan, pKa = 7,2,mi = -5,8 kyselina fosforečná, fosforečnan, pKa = 12,7, mi = -7,1 kyselina octová, octan, CH3COOH, pKa = 4,8, mi = -4,2 kyselina citronová, citrat, C6H8O7, pKa = 3,1, mi = -3,1 kyselina citronová, citrat, C6H8O7, pKa = 4,8, mi = -5,4 kyselina citronová, citrat, C6H8O7, pKa = 6,4, mi = -7,0 MES, O(CH2CH2)2N-(CH2)2-SO3H, pKa = 6,1, mi = -2,7 MOPS, O(CH2CH2)2N-(CH2)3-SO3H, pKa = 7,2, mi = -2,4 TRIS, (HOCH2)3C-NH2, pKa = 8,1, mi = 2,9 CHES, CH2(CH2CH2)2CH-NH-(CH2)2-SO3H, pKa = 9,5 CAPS, CH2(CH2CH2)2CH-NH-(CH2)3-SO3H, pKa = 10,4 mi [10-4 cm2/Vs] iontová mobilita Elektromigrační metody, C230P24
VLIV KONCENTRACE PUFRU
ekvivalentová vodivost :
1 tyramin, 2 thiomočovina, 3 uracil, 4 m-nitrofenol, 5 kyselina benzoová, 6 o-nitrofenol
Λeqv, BY =
1
2
3
4
56
Λeqv,i
Absorbance
20 mM
ΛBY Λ = BY = F ⋅ ( m ef, B + m ef,Y ) z B ⋅ b zY ⋅ y
w t,i =
f 1 f ⋅ ∑ ci ⋅ m ef,i = ∑ xi ⋅ mef,i cs i =1 i =1
5 mM
0
1
Na2B4O7 20mM 10mM 5mM 2,5mM
3 4 5 Migration Time [min]
meof[cm2/Vs] 8,08·10-4 8,33·10-4 8,90·10-4 9,74·10-4
6
7
R5,6 2,24 1,49 0,85 0
VODIVOST ELEKTROLYTU a MOBILITA J ⋅ lc j specifická vodivost : κ = = [ Ω − 1m − 1 ] A⋅U E κ j molární vodivost : Λ = = [m 2 Ω −1 mol −1 ] c E ⋅c
N=
ld H
R1,2 =
rozmývání zón difúzí : σ 2L,i = 2 ⋅ D i ⋅ t mig, i Hi =
σ 2L,i
=
ld
t 2mig, i
BY = (Bz B ) b (Y z Y ) y
jB = z B ⋅ F ⋅ b ⋅ cBY ⋅ vef, B = z B ⋅ F ⋅ b ⋅ cBY ⋅ m ef,B ⋅ E
celkové H:
jBY = jB + jY = F ⋅ c BY ⋅ E ⋅ z Y ⋅ y ⋅ ( m ef, B + m ef,Y )
zY ⋅ y = z B ⋅ b
ld
=
2 ⋅ Di 2 ⋅ Di = v poz,i (m eff, i + m eof ) ⋅ E
ld ld = vpoz, i (meff,i + m eof ) ⋅ E 4 ⋅ ld N ⋅ (meff,i + m eof ) ⋅ E m eff,1 − m eff,2 N ⋅ 2 (m eff,1 + m eof ) + (m eff,2 + m eof )
w 2t
= 5,54 ⋅
R1,2 =
R1,2 =
m eff,1 + m eff,2 2
+ m eof
N Δm ⋅ 4 m poz 1 4 2 1 4 2
⋅Δm ⋅
E ⋅ ld D ⋅ m poz
⋅ Δm ⋅
E ⋅ ld D ⋅ (meff + m eof )
DÁVKOVÁNÍ VZORKU
z elektroferogramu :
l Hi = d Ni
jY = zY ⋅ F ⋅ y ⋅ cBY ⋅ vef,Y = z y ⋅ F ⋅ y ⋅ cBY ⋅ mef,Y ⋅ E
2 ⋅ D i ⋅ t mig, i
l l ⋅E Ni = d = d ⋅ (meff, i + meof ) Hi 2 ⋅ Di
Ni = 16 ⋅
w t,1 + w t,2
m poz = m eff + m eof =
σ 2L = H ⋅ l d 2
R1,2 =
2 ⋅ (t mig,2 − t mig,1 )
Δm = meff,1 − m eff,2
ÚČINNOST SEPARACE 2,5 mM
R1,2 =
t mig, i =
Λ = i = F ⋅ mef,i zi
meff, s =
10 mM
ROZLIŠENÍ
t 2mig, i w 2t,1/2
elektrokinetické hydrodynamické +
veof vef,+
stlačený vzduch
H = Hdávkování + Hdifúze + Hadsorpce + HJouleovo teplo + Helektrokinetická disperse + Hdetekce
vzorek
vef,-
vzorek
molární vodivost : ΛBY =
jBY = F ⋅ z B ⋅ b ⋅ ( mef, B + m ef,Y ) E ⋅ cBY Elektromigrační metody, C230P24
DETEKCE v CZE
CZE ANORGANICKÝCH ANIONTŮ
CZE HERBICIDŮ
2. fluorimetrický detektor
kapilára : 75 μm i.d., 61 cm, 72 cm separační pufr : 5 mM K2CrO4 + 0,5 mM TTAB (pH = 8,0) separační napětí : -15 kV (15 μA) dávkování vzorku : 20 mBar / 6 s (≈ 13 nl) nepřímá fotometrická detekce při 254 nm
3. vodivostní detektor
píky :
kapilára : 50 μm i.d., 40 cm, 47 cm separační pufr : 20 mM fosforečnan (pH = 5,6) + 2 mM α-cyclodextrin separační napětí : 25 kV dávkování vzorku : 35 mBar / 4 s (≈ 4,5 nl) přímá UV fotometrická detekce při 200 nm
1. absorpční fotometrický detektor (UV, VIS) přímá a nepřímá detekce
4. amperometrický detektor
1. chloridy (18 mg/l; 0,2 ng ve 13 nl) 2. sírany (69 mg/l; 0,9 ng ve 13 nl) 3. dusitany (20 mg/l; 0,3 ng ve 13 nl) 4. dusičnany (19 mg/l; 0,2 ng ve 13 nl)
5. detektor s diodovým polem (DAD) 6. hmotnostní spektrometr jako detektor
píky: 1. 4-(2,4-dichlorfenoxy)máselná kyselina 2. 4-(4-chlor-2-metylfenoxy)máselná kyselina 3. 2-(2,4-dichlorfenoxy)propionová kyselina 4. 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina 5. 4-chlor-2-metylfenoxyoctová kyselina 6. 2-(2,4,5-trichlorfenoxy)propionova kys. 7. 2,4,5-trichlorfenoxyoctová kyselina
ANALYTICKÁ INFORMACE Z ELEKTROFEROGRAMU
1 2
RESULTS Peak RT(min) 1 3.422 2 4.203 3 7.115 4 7.942 5 8.072
Height 0.329 2.669 3.791 0.463 1.077
Area 0.633 8.885 9.256 1.156 2.949
W50% 0.029 0.054 0.039 0.042 0.044
CZE ANORGANICKÝCH KATIONTŮ
→ elektroforetická pohyblivost - druh látky
kapilára : 75 μm i.d., 51 cm, 51 cm separační pufr : 20 mM kyselina citronová + 10 mM LiOH (pH = 2,8) separační napětí : 30 kV (13 μA) dávkování vzorku : 10 mBar / 6 s (≈ 9 nl) vodivostní detekce
(metoda standardů)
píky :
kvalitativní informace : poloha píku – migrační čas
odezva detektoru
0.4
45 3,3
0.3
67
0.2
0.1
teof
0.0
0
1
2 3 4 5 migrační čas [min]
6
7
1. K+ (195 mg/l; 2 ng v 9 nl) 2. Na+ (115 mg/l; 1 ng v 9 nl)
kvantitativní informace : plocha píku → množství, koncentrace látky a) metoda kalibrační přímky b) metoda standardního přídavku c) metoda vnitřního standardu
Elektromigrační metody, C230P24
CZE ROPINIROLU A JEHO NEČISTOT kapilára : 50 μm i.d., 40 cm, 47 cm separační pufr : 100 mM Na2B4O7 + 30 mM MgSO4 (pH = 8,7) s 20% CH3CN separační napětí : 30 kV (33 μA) dávkování vzorku : 11 nl ( 2 mg/ml ) přímá UV fotometrická detekce při 254 nm 2.0
odezva detektoru
4
3
1.6
1.2
0.8
5
2
1
0.4
0.0
-0.4
6
7
1. 0,1% HNCH 2CH 2CH 3.HCl
N H
8
9 10 11 12 migrační čas [min] 2. 0,2%
4. 1,1%
14
3. N(CH 2CH2 CH 3)2.HCl
HCl.HN
O
N(CH 2CH2 CH3 )2.HCl
13
N H
O
N H
O
5. 0,3% N(CH 2CH2 CH 3)2.HCl
O
N H
O
N H
O
Elektromigrační metody, C230P24
