TOKSISITAS DAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN POHON PENGHASIL GAHARU HASIL INOKULASI
KARTIKA SARI DEWI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini menyatakan skripsi yang berjudul Toksisitas dan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Pohon Penghasil Gaharu Hasil Inokulasi adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada Perguruan Tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Juni 2013 Kartika Sari Dewi NIM G44080063
ABSTRAK KARTIKA SARI DEWI. Toksisitas dan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Pohon Penghasil Gaharu Hasil Inokulasi. Dibimbing oleh DUDI TOHIR dan ERDY SANTOSO. Daun gaharu diduga mengandung senyawa metabolit sekunder yang tinggi sebagai respons terhadap infeksi jamur pada pohon penghasil gaharu. Penelitian ini bertujuan menentukan kandungan fitokimia, toksisitas, dan aktivitas antioksidan daun pohon penghasil gaharu jenis Aquilaria microcarpa dan A.malaccensis dengan dan tanpa inokulasi oleh jamur. Daun gaharu diekstraksi menggunakan pelarut metanol. Uji fitokimia pada ekstrak kasar yang diperoleh menunjukkan keberadaan tanin, steroid, fenol, dan flavonoid. Uji toksisitas dengan menggunakan larva udang menunjukkan bahwa semua sampel berpotensi sebagai bahan aktif, namun hanya daun muda A. microcarpa hasil inokulasi jamur asal Papua dan Gorontalo yang berpotensi antikanker dengan nilai LC 50 < 30 μg/mL. Aktivitas penangkalan radikal bebas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil oleh ekstrak menunjukkan aktivitas antioksidan yang tinggi dengan nilai IC50 < 200 μg/mL. Aktivitas tertinggi ditunjukkan oleh daun muda A. microcarpa hasil inokulasi jamur asal Timor dan daun tua A. malaccensis tanpa inokulasi. Kata kunci: antioksidan, Aquilaria microcarpa, Aquilaria malaccensis, daun gaharu, toksisitas.
ABSTRACT KARTIKA SARI DEWI. Toxicity and Antioxidant Activity of Inoculated Gaharu-Producing Trees’ Leave Extract. Supervised by DUDI TOHIR and ERDY SANTOSO. Gaharu leaves are expected to contain many secondary metabolic compounds as a response against fungal infection on gaharu-producing trees. This study aimed to determine the phytochemical components, cytotoxic and antioxidant activities of Aquilaria microcarpa and A. malaccensis leaves with and without fungal inoculation. Gaharu leaves were extracted by using methanol. The phytochemical assay of the crude extract revealed the presence of tannins, steroids, phenols, and flavonoids. The toxicity evaluation with brine shrimp showed that all samples were potencial as active ingredient, but only the juvenile leaves of A. microcarpa inoculated by fungi from Papua and Gorontalo had the potency as anticancer due to their LC50 value < 30 μg/mL. Free radical scavenging activity of the extracts against 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl showed strong antioxidant activities with IC50 value of < 200 μg/mL. The highest antioxidant activity was exhibited by juvenile leaves of A.microcarpa inoculated by fungi from Timor and uninoculated mature leaves of A. malaccensis. Key words: antioxidants, Aquilaria microcarpa, Aquilaria malaccensis, gaharu leaves, toxicity.
TOKSISITAS DAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN POHON PENGHASIL GAHARU HASIL INOKULASI
KARTIKA SARI DEWI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
Judul Skripsi : Toksisitas dan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Pohon Penghasil Gaharu Hasil Inokulasi Nama : Kartika Sari Dewi NIM : G44080063
Disetujui oleh
Drs Dudi Tohir, MS Pembimbing I
Dr Erdy Santoso, MS Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah yang berjudul “Toksisitas dan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Penghasil Gaharu Hasil Inokulasi” berhasil diselesaikan. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan pada bulan Juni 2012 hingga Maret 2013 di Laboratorium Kimia Organik, Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Drs Dudi Tohir, MS selaku pembimbing I dan Bapak Dr Erdy Santoso, MS selaku pembimbing II, serta Bapak Dr Ir Maman Turjaman, DEA yang telah banyak memberi saran, bimbingan, dan dukungan. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Budi Arifin, MSi dan Bapak Drs Muhammad Farid, MSi atas segala diskusi dan saran yang berkaitan dengan penelitian. Terima kasih juga kepada Bapak Sabur, Ibu Yenni Karmila atas bantuannya selama penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Ibu, Arif, Indra, Dian, Amin, Ami, Rifai, Taufik, Nenah dan teman-teman kimia 45 atas tambahan ilmu dan semangatnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2013 Kartika Sari Dewi
DAFTAR ISI DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Metode HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Kasar Kandungan Fitokimia Ekstrak Kasar Toksisitas Ekstrak Kasar Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kasar SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN
vii vii 1 2 2 2 5 5 6 6 8 9 9 9 10 12
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5 6
Aquilaria microcarpa daun muda (a), daun sedang (b), dan daun tua (c) Diagram persentase kadar air dan rendemen ekstrak kasar daun gaharu Diagram nilai LC50 ekstrak kasar daun gaharu Reaksi penangkapan H oleh DPPH Larutan sampel dan DPPH setelah diinkubasi Diagram nilai IC50 ekstrak kasar daun gaharu
3 5 7 8 8 9
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7
Bagan alir lingkup kerja penelitian Nama jenis dan pengodean sampel Kadar air simplisia daun Rendemen ekstrak kasar sampel Hasil uji fitokimia ekstrak kasar sampel Hasil uji toksisitas ekstrak kasar sampel Hasil uji antioksidan ekstrak kasar sampel
12 13 14 16 17 18 23
PENDAHULUAN Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang tidak stabil dan sangat reaktif karena mengandung satu atau lebih elektron tidak berpasangan pada orbital terluarnya (Andayani et al. 2008). Efek yang ditimbulkan oleh radikal bebas di dalam tubuh meliputi kerusakan RNA, DNA, protein, dan lipid (Saleh et al. 2010), kemunduran fungsi sel tubuh, radang, katarak, jantung, kanker, dan aterosklerosis (Kuncahyo dan Sunardi 2007). Tubuh manusia dapat terlindungi dari kerusakan-kerusakan akibat radikal bebas tersebut dengan sistem pertahanan kompleks yang disebut antioksidan (Aris et al. 2007). Pohon penghasil gaharu, disebut juga agarwood, eaglewood, atau karas, termasuk ke dalam divisi Termathophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Dicotyledonae, ordo Myrtales, famili Thymeleacae, serta genus Aquilaria dan Gyrinops (Tarigan 2004). Gaharu merupakan komoditas hasil hutan bukan kayu yang terbentuk melalui proses patologis yang unik akibat respons terhadap infeksi jamur pada pohon pembentuk gaharu (Santoso et al. 2007). Gaharu berupa resin, berbentuk gumpalan padat berwarna cokelat kehitaman sampai hitam, dan berbau harum, terdapat pada bagian kayu atau akar tanaman pohon inang. Gubal gaharu memiliki nilai ekonomi tinggi dan banyak digunakan sebagai bahan dasar minyak wangi, dupa, dan obat tradisional di Asia Timur (Yagura et al. 2005). Gaharu mengandung senyawa fitoaleksin yang merupakan metabolit sekunder dari pohon penghasil gaharu sebagai mekanisme pertahanannya terhadap infeksi. Pohon gaharu sehat tidak pernah memproduksi seskuiterpenoid sebagai metabolit sekunder yang beraroma harum (Novriyanti 2009). Gubal kayu yang merupakan tempat pembentukan gaharu diketahui mengandung senyawa agarofuran, agarospirol, jinkohol, jinkohon-eremol, kusunol, dihidrokaranon, dan kromon (Siran 2010). Berdasarkan penelitian sebelumnya, senyawa aktif pada gubal gaharu dapat mengurangi hipersensitivitas (Kim et al. 1997), menekan sistem saraf pusat sebagai antidepresan (Okugawa et al. 1996: Kim et al. 1997), serta berkhasiat antipiretik, antiradang (Zhou et al. 2008), antimikrob (Dash et al. 2008), dan antioksidan (Mega dan Swastini 2010). Tingginya harga jual gaharu menyebabkan perburuan gaharu besar-besaran yang mengakibatkan semakin langkanya pohon penghasil gaharu. Aquilaria malaccensis, salah satu tumbuhan penghasil gaharu terbaik yang banyak tumbuh di Kalimantan, telah dimasukkan ke dalam Appendix II CITES sejak tahun 2004 sebagai tumbuhan yang terancam punah sehingga dalam penebangan dan perdagangannya perlu dibatasi (CITES 2004). Prospek untuk memulihkan produksi gaharu kembali terbuka dengan ditemukannya teknologi inokulasi yang mampu merekayasa produksi gaharu. Dengan teknologi ini, produksi gaharu dapat direncanakan dan dipercepat melalui induksi jamur pembentuk gaharu pada batang pohon penghasil gaharu (Siran 2010). Selain gubal gaharu, penelitian berkembang pada daun gaharu karena diduga mengandung senyawa metabolit sekunder yang lebih tinggi akibat meningkatnya proses metabolisme pohon gaharu yang terinfeksi jamur. Melalui proses metabolisme, senyawa-senyawa tersebut terdistribusi ke bagian pohon lain
terutama daun. Hal ini menyebabkan daun gaharu memiliki potensi sebagai antioksidan. Menurut Huda et al. (2009), ekstrak daun gaharu (Aquilaria malaccensis) mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, flavonoid, terpenoid, steroid, dan saponin serta berpotensi sebagai antioksidan dengan nilai konsentrasi penghambatan (IC50) sebesar 800, 160, 140, dan 30 µg/mL berturut-turut untuk pelarut n-heksana, diklorometana, etil asetat, dan metanol. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan menguji kandungan fitokimia, toksisitas, dan aktivitas antioksidan daun pohon penghasil gaharu jenis Aquilaria microcarpa dan A. malaccensis tanpa inokulasi dan setelah diinokulasi dengan beberapa jenis jamur. Bagan alir penelitian ditunjukkan pada Lampiran 1.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan antara lain daun gaharu dari pohon berumur 17 tahun jenis A. microcarpa tanpa inokulasi dan hasil inokulasi jamur (isolat asal Papua, Jambi, Gorontalo, dan Timor) pada tahun 2009, daun gaharu dari pohon A. malaccensis tanpa inokulasi dan hasil inokulasi jamur (Fusarium sp.), 2,2-difenil1-pikrilhidrazil (DPPH), metanol, Tween 80, larva udang, kuersetin, HCl pekat, namil alkohol, pereaksi Lieberman-Buchard, kloroform-amonia, H2SO4 2 M, pereaksi Mayer, Dragendorf, Wagner, serbuk Mg, pereaksi FeCl3 1%, dan NaOH 10%. Alat yang digunakan antara lain penguap putar, labu ukur, pelat tetes, mikropipet, dan spektrofotometer ultraviolet-tampak (UV-Vis) berkas ganda (Pharma Spec 1700 Shimadzu). Metode Penelitian ini terdiri atas tahap pengambilan sampel, preparasi sampel, ekstraksi maserasi dengan pelarut metanol, uji fitokimia (Harborne 1987), uji toksisitas dengan metode uji letalitas larva udang (BSLT), dan uji antioksidan dengan metode DPPH. Pengambilan Sampel Pengambilan sampel dilakukan di 2 lokasi yaitu KHDTK Carita, Banten (6° 28´ LS; 105° 85´ BB) dan Hutan Gunung Ciapus, Bogor (6° 36´ LS, 106° 47´ BB). Daun gaharu yang akan digunakan dalam penelitian berasal dari pohon jenis A. microcarpa (tanpa dan hasil inokulasi) yang diambil di Carita dan A. malaccensis (tanpa dan hasil inokulasi) yang diambil di Ciapus. Proses pengambilan sampel cukup sederhana. Daun yang diambil disortasi menjadi daun muda, sedang, dan tua. Daun muda adalah pucuk sampai beberapa tangkai daun setelahnya yang daunnya masih bertekstur halus, tidak kaku, dan berwarna hijau muda mengilat. Daun sedang adalah beberapa tangkai daun setelah daun muda yang bertekstur halus, agak kaku, dan berwarna hijau muda. Daun tua
3
adalah beberapa tangkai setelah daun sedang sampai ujung dahan yang daunnya bertekstur kasar, sangat kaku, dan berwarna hijau tua. Setelah disortasi, sampel kemudian diberi kode berupa deret 3 huruf yang menunjukkan identitas sampel tersebut. Huruf pertama menunjukkan jenis pohon. Daun dari pohon jenis A. microcarpa diberi kode A, sedangkan daun dari jenis A. malaccensis diberi kode B. Huruf kedua menunjukkan asal jamur/inokulat. Pada jenis A. microcarpa, pohon tanpa inokulasi (kontrol) diberi kode K, sedangkan pohon hasil inokulasi jamur asal Papua diberi kode P, Jambi diberi kode J, Gorontalo diberi kode G, dan Timor diberi kode T. Pada jenis A. malaccensis, pohon tanpa inokulasi (kontrol) diberi kode K, sedangkan pohon hasil inokulasi jamur diberi kode I. Huruf ketiga menunjukkan jenis daun. Daun muda diberi kode M, daun sedang S, daun daun tua T (Gambar 1). Pengodean sampel lebih jelas dapat dilihat pada Lampiran 2.
a
b
c
Gambar 1 Aquilaria microcarpa daun muda (a), sedang (b), dan tua (c). Preparasi Sampel Sampel dikeringkan hingga kadar air kurang dari 10% di dalam oven bersuhu tidak lebih dari 50 oC. Setelah itu, digiling hingga menjadi serbuk yang selanjutnya disebut simplisia. Ekstraksi Simplisia daun gaharu ditimbang masing-masing 60 g lalu dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer. Metanol ditambahkan dengan nisbah simplisia-metanol (1:13) dan maserasi dilakukan selama 3×24 jam. Filtrat disaring, dikumpulkan, lalu dipekatkan dengan penguap putar dan ditentukan rendemennya. Penentuan Kadar Air (AOAC 950.46 (B) 2005) Setiap simplisia ditimbang sebanyak 1 g kemudian dimasukkan ke dalam cawan porselen yang telah dipanaskan sebelumnya di dalam oven bersuhu 105 oC selama 30 menit sampai bobotnya konstan. Cawan berisi sampel dipanaskan di dalam oven bersuhu 105 oC selama 3 jam lalu didinginkan di dalam eksikator dan ditimbang. Pemanasan diulangi hingga diperoleh bobot konstan. Kadar air contoh ditentukan dengan persamaan Kadar air (%) =
Keterangan: A = bobot contoh basah (g) B = bobot contoh kering (g)
× 100%
4
Uji Fitokimia (Harborne 1987) Uji alkaloid dilakukan dengan mencampurkan 0.25 g ekstrak kasar daun dengan 2.5 mL kloroform-amonia kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh ditambah H2SO4 2 M beberapa tetes, kemudian dikocok sehingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam (tidak berwarna) dibagi 3 ke dalam tabung reaksi, berturutturut ditambahkan beberapa tetes pereaksi Mayer, Wagner, dan Dragendorf. Uji positif alkaloid apabila berturut-turut terbentuk endapan putih, cokelat , dan merah jingga. Uji triterpenoid dan steroid dilakukan dengan mencampurkan 0.1 g ekstrak kasar daun dengan 5 mL etanol kemudian dipanaskan pada 50 °C dan disaring. Filtrat diuapkan hingga kering kemudian dilarutkan dengan eter. Lapisan eter diteteskan di atas pelat tetes, dikeringudarakan, lalu ditambahkan pereaksi Lieberman-Buchard. Uji positif triterpenoid jika terbentuk warna merah, dan positif steroid jika terbentuk warna hijau atau biru. Uji saponin dan tanin dilakukan dengan mencampurkan 0.1 g ekstrak kasar daun dengan 10 mL akuades kemudian dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit. Larutan disaring dan dibagi 2. Sebagian filtrat didinginkan lalu dikocok hingga berbusa. Hasil uji positif saponin jika busa tidak menghilang setelah 10 menit. Sebagian lagi ditambahkan larutan FeCl3 1%. Hasil uji positif tanin ditandai dengan terbentuknya warna biru tua atau hijau kehitaman. Uji fenol dan flavonoid dilakukan dengan mencampurkan 0.1 g ekstrak kasar daun dengan 15 mL air kemudian dididihkan selama 2 menit dan disaring. Untuk uji fenol, 5 mL filtrat ditambahkan NaOH 10% beberapa tetes. Terbentuknya warna merah menunjukkan adanya senyawa fenolik. Untuk uji flavonoid, 5 mL filtrat dibagi ke dalam 3 tabung reaksi lalu setiap tabung ditambahkan 0.1 g serbuk Mg, 1 mL alkohol klorhidrat (campuran HCl 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama), dan 5 mL amil alkohol. Tabung dikocok kuat. Hasil uji positif flavonoid ditunjukkan oleh terbentuknya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol. Uji Toksisitas Sebanyak ±100 mg telur udang ditetaskan dengan cara dimasukkan ke dalam wadah berisi air laut yang diberi suplai udara menggunakan aerator selama 48 jam. Sementara itu, larutan uji dibuat dengan melarutkan ekstrak kasar daun dengan air laut dan ditambahkan 2 tetes Tween 80 kemudian ditambahkan air laut kembali hingga konsentrasinya 2000 ppm (larutan stok). Ke dalam tabung vial masing-masing dimasukkan 10 ekor larva udang lalu ditambahkan larutan uji dengan konsentrasi 0–500 ppm hingga volumenya 2 mL. Perlakuan dilakukan 2 kali ulangan. Larva udang kemudian diinkubasi selama 24 jam. Jumlah larva yang mati dihitung dan direratakan dari 2 kali ulangan yang dilakukan. Logaritma konsentrasi larutan ekstrak kasar daun sebagai sumbu x dan nilai probit persentase kematian larva udang sebagai sumbu y dialurkan ke dalam kurva. Nilai konsentrasi mematikan 50% (LC50) ditentukan dari persamaan garis yang diperoleh. Uji Antioksidan Sebanyak 5.0 mg DPPH dilarutkan dengan metanol dalam labu takar 100 mL sehingga konsentrasinya 126.80 µM. Sampel ekstrak kasar daun dengan
konsentrasi 10, 20, 30, 40, 50, dan 60 ppm serta larutan kuersetin sebagai standar dengan konsentrasi 0, 1, 2, 3, 4, dan 5 ppm juga disiapkan dengan pelarut metanol dalam labu takar 10 mL. Sampel dan standar masing-masing dimasukkan sebanyak 4 mL ke dalam tabung reaksi. Blangko, yaitu 4 mL metanol juga dipipet ke dalam tabung reaksi. Larutan DPPH 126.80 µM ditambahkan sebanyak 2 mL ke dalam setiap tabung tepat sebelum campuran diinkubasi pada suhu inkubasi 37 °C selama 30 menit. Campuran diukur absorbansnya pada panjang gelombang 517 nm. Nilai konsentrasi penghambatan 50% (IC50) dihitung dari persentase aktivitas penghambatan radikal DPPH dan logaritma konsentrasi sampel dan standar. Uji antioksidan dilakukan di Laboratorium Bersama, Departeman Kimia, Institut Pertanian Bogor.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Kasar
Persentase (%)
Kadar air menunjukkan jumlah air yang terikat secara fisis pada sampel. Simplisia daun gaharu dikeringkan pada suhu tidak lebih dari 50 °C sebelum ditentukan kadar airnya. Penentuan kadar air berguna untuk menduga keawetan atau ketahanan sampel dalam penyimpanan serta untuk mengoreksi rendemen yang dihasilkan. Kadar air simplisia bahan alam biasanya harus lebih rendah dari 10% agar bakteri atau jamur tidak tumbuh sehingga simplisia dapat disimpan dalam waktu yang lama (Winarno 1992). Gambar 2 memperlihatkan bahwa kadar air tertinggi terdapat pada sampel AKS dan rendemen terendah diperoleh dari sampel ATT, sedangkan rendemen tertinggi diperoleh dari sampel APT. Secara keseluruhan, simplisia daun gaharu memiliki kadar air 11.90–18.01% (Lampiran 3) sehingga dapat digunakan, tetapi tidak tahan lama disimpan. Sementara itu, rendemen yang diperoleh berkisar 3.37–11.20% (Lampiran 4). Keragaman rendemen disebabkan oleh perbedaan sampel, kondisi ekstraksi, penyaringan, dan pemekatan. 20.00 18.00 16.00 14.00 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00
Kadar air Rendemen
AKM AKT APS AJM AJT AGS ATM ATT BKS BIM BIT Sampel
Gambar 2 Diagram persentase kadar air dan rendemen ekstrak kasar daun gaharu
6
Rendemen ekstrak kasar daun gaharu diperoleh dari proses maserasi dalam pelarut metanol. Daun gaharu sebelumnya digiling terlebih dahulu untuk memperluas permukaan sampel yang kontak dengan pelarut. Menurut Huda et al. (2009), pelarut metanol memberikan rendemen yang lebih tinggi dan nilai IC50 yang lebih rendah dibandingkan dengan n-heksana, diklorometana, dan etil asetat. Metanol mampu mengekstraksi senyawa polar dan nonpolar karena tetapan dielektriknya besar. Selain itu, metanol mudah diuapkan dan harganya relatif murah. Kandungan Fitokimia Ekstrak Kasar Berdasarkan hasil uji, seluruh ekstrak kasar metanol daun gaharu mengandung tanin, steroid, fenol, dan flavonoid (Lampiran 5). Tanin, fenol, dan flavonoid memiliki gugus fungsi fenol yang biasanya aktif sebagai antioksidan. Intensitas warna tanin, steroid, fenol, dan flavonoid tidak begitu berbeda pada ekstrak gaharu kontrol dan hasil inokulasi. Saponin dan alkaloid tidak terdeteksi oleh uji fitokimia. Hal ini dimungkinkan karena sedikit atau tidak adanya kandungan kedua senyawa tersebut. Triterpenoid ataupun seskuiterpenoid juga tidak terdeteksi pada uji fitokimia meskipun senyawa tersebut merupakan penciri dari terbentuknya gaharu. Di sisi lain, menurut Huda et al. (2009), ekstrak daun gaharu (A. malaccensis) mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, flavonoid, terpenoid, steroid, dan saponin. Hal ini dapat disebabkan oleh persebaran metabolit sekunder yang tidak merata pada seluruh daun. Toksisitas Ekstrak Kasar Senyawa bioaktif hampir selalu bersifat toksik pada dosis tinggi. Oleh karena itu, daya bunuh in vivo (toksisitas) senyawa terhadap suatu organisme hewan dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang mempunyai bioaktivitas dan juga memantau fraksi bioaktif selama fraksinasi dan pemurnian (Juniarti et al. 2009). Uji toksisitas dalam penelitian ini menggunakan metode BSLT dengan larva udang (Artemia salina Leach.) sebagai bioindikator. Metode ini praktis dan murah karena telur udang A. salina dapat dengan mudah diperoleh dan dapat disimpan bertahun-tahun dalam keadaan kering (McLaughlin et al. 1998). Uji toksisitas dilakukan dengan menghitung konsentrasi toksikan (ekstrak metabolit sekunder) yang dapat mematikan 50% dari populasi awal hewan uji, yaitu larva udang selama 24 jam (LC50). Respons hewan uji terhadap toksikan selalu binomial (mati/tidak mati) dan hubungan antara respons dan konsentrasi toksikan selalu berbentuk sigmoid. Analisis probit digunakan untuk mengubah bentuk kurva sigmoid ini ke bentuk linear agar mudah dianalisis (Finney 1971). Metode analisis probit dilakukan secara manual. Tingkat toksisitas terhadap A. salina dengan nilai LC50 dibedakan menjadi toksik (LC50 < 1000 μg/mL) dan tidak toksik (LC50 > 1000 μg/mL) (Meyer et al. 1982). Menurut Ariffin et al. (2009), kriteria sitotoksisitas untuk ekstrak kasar seperti yang telah ditetapkan oleh National Cancer Institute (NCI) ialah nilai LC50 berpotensi sebagai antikanker jika < 30 μg/mL.
7
Perhitungan LC50 dapat dilihat pada Lampiran 6 dan diagram nilai LC50 dari setiap ekstrak dapat dilihat pada Gambar 3. Berdasarkan hasil uji toksisitas, seluruh sampel kecuali APM dan AGM memiliki nilai LC50 > 30 μg/mL. Hal tersebut menunjukkan bahwa seluruh sampel bersifat toksik, tetapi hanya APM dan AGM yang berpotensi sebagai antikanker. 300
Daun muda (M) Daun sedang (S) Daun tua (T)
250
LC50 (µg/mL)
200
150 100 50 0 AK
AP
AJ
AG
AT
BK
BI
Sampel Gambar 3 Diagram nilai LC50 ekstrak kasar daun gaharu Secara umum, nilai LC50 sampel daun A. malaccensis lebih rendah sehingga dapat dikatakan lebih toksik dibandingkan dengan A. microcarpa. Sampel A. microcarpa setelah diinokulasi juga cenderung lebih toksik daripada sebelum diinokulasi. Sebaliknya pada A. malaccensis, sampel sebelum diinokulasi jauh lebih toksik daripada setelah diinokulasi. Sampel AKT lebih toksik dibandingkan dengan AKM dan AKS, demikian pula sampel BKT lebih toksik daripada sampel BKM dan BKS. Hal ini menunjukkan bahwa sebelum diinokulasi, toksisitas cenderung meningkat seiring bertambahnya umur daun. Berbeda dengan sampel setelah diinokulasi, daun muda cenderung lebih toksik, kecuali pada sampel AJM dan BIM. Perbedaan toksisitas antara A.microcarpa dan A. malaccensis tidak hanya disebabkan oleh perbedaan jenis pohon, tetapi juga oleh perbedaan lokasi tumbuh pohon. Lokasi pengambilan sampel di Carita memiliki topografi bergelombang sampai bergunung. Curah hujan tahunan sekitar 3.959 mm. Suhu minimum 26 °C dan maksimum 32 °C. Kelembapan udara rata-rata berkisar antara 77% dan 85%. Lokasi pengambilan sampel di Ciapus juga memiliki topografi bergelombang sampai bergunung, tetapi curah hujan tahunan lebih rendah (sekitar 3600 mm), demikian pula suhu udara (24–30 °C). Kelembapan udara rata-rata berkisar antara 80% dan 90% (Pratiwi 2009). Suhu dan kelembapan lokasi tumbuh pohon, keterbukaan tajuk, virulensi inokulan yang digunakan, jarak antartitik lubang, dan faktor-faktor lain pada saat inokulasi juga dapat memengaruhi kecocokan jamur (isolat) dengan pohon inang (Siran 2010). Faktor yang memengaruhi kecocokan dalam inokulasi juga memengaruhi tidak meratanya proses metabolisme dari pohon yang terinfeksi sehingga metabolit sekunder yang tersebar antardaun tidak sama.
8
Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kasar Radikal bebas merupakan senyawa yang sangat reaktif dan tidak stabil yang dihasilkan di dalam tubuh selama proses metabolisme atau berasal dari lingkungan luar (Saleh et al. 2010). Antioksidan bekerja mempertahankan oksidan pada jumlah yang optimum dan mereduksi radikal bebas serta menghentikan pembentukannya sebelum merusak sel-sel dalam tubuh (Aris et al. 2007). Metode DPPH banyak digunakan untuk uji aktivitas antioksidan karena memiliki beberapa keunggulan, di antaranya mudah, sederhana, cepat, peka, dan hanya membutuhkan sedikit sampel (Koleva et al. 2002). Senyawa DPPH merupakan radikal bebas yang stabil karena adanya delokalisasi elektron gasal pada molekul secara keseluruhan. Saat larutan DPPH bercampur dengan suatu zat yang dapat mendonorkan atom hidrogen, DPPH akan tereduksi (Gambar 4) yang ditunjukkan dengan hilangnya warna violet (kadang-kadang berwarna kuning pucat yang berasal dari keberadaan gugus pikril) (Molyneux 2004). Penurunan intensitas warna DPPH dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 4 Reaksi penangkapan H oleh DPPH (Szabro et al. 2007)
Keterangan: a. Larutan sampel 10 µg/mL + DPPH b. Larutan sampel 20 µg/mL + DPPH c. Larutan sampel 30 µg/mL + DPPH d. Larutan sampel 40 µg/mL + DPPH e. Larutan sampel 50 µg/mL + DPPH f. Larutan sampel 60 µg/mL + DPPH
a
b
c d
e
f
Gambar 5 Larutan sampel dan DPPH setelah diinkubasi Nilai IC50 menunjukkan besarnya konsentrasi suatu senyawa yang dapat memerangkap radikal bebas sebesar 50%. Menurut Hanani et al. (2005), suatu senyawa dikatakan memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi bila nilai IC 50-nya kurang dari 200 µg/mL. Semakin rendah nilai IC50 ekstrak, keefektifannya sebagai penangkap radikal akan lebih baik (aktivitas antioksidan tinggi). Perhitungan IC50 dapat dilihat pada Lampiran 7 dan diagram nilai IC50 dari setiap ekstrak ditunjukkan pada Gambar 6. Berdasarkan hasil uji antioksidan, semua sampel memiliki nilai IC50 < 200 μg/mL. Hal tersebut menunjukkan
seluruh sampel memiliki aktivitas antioksidan yang baik. Namun, aktivitas tersebut belum sebaik standar kuersetin yang memiliki nilai IC50 2.91 μg/mL. 60
Daun muda (M) Daun sedang (S) Daun tua (T)
IC50 (µg/mL)
50 40 30 20 10
0 AK
AP
AJ
AG
AT
BK
BI
Sampel Gambar 6 Diagram nilai IC50 ekstrak kasar daun gaharu Aktivitas antioksidan yang sangat baik pada sampel A. microcarpa ditunjukkan oleh sampel hasil inokulasi jamur asal Gorontalo dan asal Timor dengan nilai IC50 terkecil ialah 13.51 μg/mL pada sampel ATM. Sementara pada sampel A. malaccensis, aktivitas antioksidan yang sangat baik ditunjukkan oleh sampel tanpa inokulasi, yaitu BKT dengan nilai IC50 10.69 μg/mL. Secara keseluruhan, perbedaan aktivitas antarsampel tidak terlalu jauh. Nilai IC 50 yang tidak terlalu jauh berbeda antara daun gaharu kontrol dan hasil inokulasi menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan sampel tidak dipengaruhi oleh jenis daun dan inokulasi pohon penghasil gaharu.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Semua ekstrak kasar metanol daun gaharu yang diujikan mengandung tanin, steroid, fenol, dan flavonoid. Semua sampel tersebut juga bersifat toksik dan memiliki aktivitas antioksidan yang baik. Sampel daun A. microcarpa muda setelah diinokulasi lebih toksik daripada sampel lain, dengan sampel yang diinokulasi dengan jamur asal Papua dan Gorontalo berpotensi sebagai antikanker karena memiliki nilai LC50 < 30 μg/mL. Aktivitas antioksidan terbaik ditunjukkan oleh sampel A. malaccensis tanpa inokulasi, dengan nilai IC50 terhadap radikal DPPH 10.69 μg/mL. Aktivitas antioksidan sampel tidak dipengaruhi oleh jenis daun dan inokulasi pohon penghasil gaharu. Saran Penelitian lebih lanjut dapat dilakukan untuk pengembangan produksi daun gaharu sebagai teh. Fraksionasi lebih lanjut dan analisis kualitatif serta kuantitatif komponen-komponen diperlukan untuk menentukan senyawa murni yang
berpotensi sebagai antikanker pada sampel APM dan AGM, serta sebagai antioksidan pada sampel AGS, AGT, ATM, BKS, dan BKT.
DAFTAR PUSTAKA [AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2005. Official Methods of Analysis. Washington: AOAC International. Andayani R, Lisawati Y, Maimunah. 2008. Penentuan aktivitas antioksidan, kadar fenolat total dan likopen pada buah tomat (Solanum lycopersicum L). J Sains Teknol Farm. 13:1-9. Ariffin SHZ, Haryani WH, Omar W, Ariffin ZZ, Safian MF, Senafi S, Wahab RMA. 2009. Intrinsic anticarcinogenic effects of Piper sarmentosum ethanolic extract on a human hepatoma cell line. Cancer Cell Int Primary Res. 9(6):1-9.Open Access Aris SRS, Mustafa S, Ahmat N, Jaafar FM, Ahmad R et al. 2007. Phenolic content and antioxidant activity of fruits of Ficus deltoidea var Angustifolia sp. Malay J Anal Sci. 13:146-150. [CITES] Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Flora and Fauna. 2004. Amendments to Appendices I and II of CITES. Sydney (AU): CITES. Dash M, Patra JK, Panda PP. 2008. Phytochemical and antimicrobial screening of extracts of Aquilaria agallocha Roxb. African J Biotechnol. 7:3531-3534. Finney DJ. 1971. Probit Analysis. Ed ke-3. Cambridge (GB): Cambridge Univ Pr. Hanani E, Abdul M, Ryany S. 2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam Callyspongia sp dari Kepulauan Seribu. Maj Ilmu Kefarmasian. 2:127-133. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah; Niksolihin S, editor. Bandung: ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methods. Huda AWN, Munira MAS, Fitrya SD, Salmah M. 2009. Antioxidant activity of Aquilaria malaccensis (Thymelaeaceae) leaves. Pharmacognosy Res. 1:270273. Juniarti, Osmeli D, Yuhernita. 2009. Kandungan senyawa kimia, uji toksisitas (brine shrimp lethality test) dan antioksidan (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) dari ekstrak daun saga (Abrus precatorius L.). Makara Sains. 13(1):50-54. Kim YC, Lee EH, Lee YM, Kim HK, Song BK, Lee EJ et al. 1997. Effect of the aqueous extract of Aquilaria agallocha stems on the immediate hypersensitivity reactions. J Ethnopharmacol. 58:31-38. Koleva I, van Beek T, Linnssen JPH, de Groot A, Evstarieva LN. 2002. Screening of plant extracts for antioxidant activity: a comparative study on three testing methods. Phytochem Anal. 13:494-500. Kuncahyo I, Sunardi. 2007. Uji aktivitas antioksidan ekstrak belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L) terhadap 1,1-diphenyl-2-picrylhidrazyl (DPPH). Di dalam: Seminar Nasional Teknologi (SNT 2007); 2007 Nov 24; Yogyakarta, Indonesia. Yogyakarta (ID): Program Diploma Teknologi Farmasi, Fakultas Teknik, Universitas Setia Budi.
11
McLaughlin JL, Rogers LL, Anderson JE. 1998. The use of biological assays to evaluate botanicals. Drug Information J. 22:513-524. Mega IM, Swastini DA. 2010. Screening fitokimia dan aktivitas antiradikal bebas ekstrak metanol daun gaharu (Gyrinops versteegii). J Kim. 4(2):187-192. Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, McLaughlin JL et al. 1982. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Med. 45:31-34. Molyneux P. 2004. The use of stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for estimazing antioxidant activity. Songklanakarin J Sci Technol. 26:211219. Novriyanti E. 2009. Kajian kimia gaharu hasil inokulasi Fusarium sp. pada Aquilaria microcarpa. Di dalam: Pengembangan Teknologi Produksi Gaharu Berbasis Pemberdayaan Masyarakat Sekitar Hutan. Prosiding Workshop Gaharu; 2009 Apr 29; Bogor, Indonesia. Bogor (ID): Pusat Penelitian dan Pengembangan Hutan dan Konservasi Alam bekerja sama dengan ITTO PD 425/06 Rev.I(1). hlm 23-38. Okugawa H, Ueda R, Mutsumoto K, Kawanishi K, Kato A. 1996. Effect of jinkoh-eremol and agarospiral from agarwood on the central nervous system in mice. Planta Med. 62:2-6. Pratiwi. 2009. Karakteristik lahan habitat pohon penghasil gaharu di beberapa hutan tanaman di Jawa Barat. Di dalam: Pengembangan Teknologi Produksi Gaharu Berbasis Pemberdayaan Masyarakat Sekitar Hutan. Prosiding Workshop Gaharu; 2009 Apr 29; Bogor, Indonesia. Bogor (ID): Pusat Penelitian dan Pengembangan Hutan dan Konservasi Alam bekerja sama dengan ITTO PD 425/06 Rev.I(1). hlm 171-192. Saleh MA, Clark S, Woodard B, Deolu-Sobogun SA et al. 2010. Antioxidant and free radical scavenging activities of essential oils. Ethnicity and Disease. 20:S1 78-S1 82. Santoso E, Agustini L, Sitepu IR, Turjaman M. 2007. Efektivitas pembentukan gaharu dan komposisi senyawa resin gaharu pada Aquilaria spp. J. Penelitian Hutan dan Konservasi Alam. 4(6):543-551. Siran SA. 2010. Perkembangan pemanfaatan gaharu. Di dalam: Siran SA, Turjaman M, editor. Pengembangan Teknologi Produksi Gaharu Berbasis Pemberdayaan Masyarakat Sekitar Hutan. Bogor (ID): Pusat Penelitian dan Pengembangan Hutan dan Konservasi Alam. hlm 1-34.
Szabro MR, Iditoiu C, Chambre D, Lupea AX. 2007. Improved DPPH determination for antioxidant activity spectrophotometric assay. Chem Papers. 61(3):214-216. Tarigan K. 2004. Profil Pengusahaan (Budidaya) Gaharu. Jakarta (ID): Pusat Bina Penyuluhan Kehutanan, Departemen Kehutanan. Winarno FG. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta (ID): Gramedia. Yagura T, Shibayama N, Ito M, Kiuchi F, Honda G. 2005. Three novel diepoxy tetrahydrochromones from agarwood artificially produced by intentional wounding. Tetrahedron Lett. 46:4395-4398. Zhou M, Wang H, Suolangjiba, Kou J, Yu B. 2008. Antinociceptive and antiinflammatory activities of Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg. leaves extract. J Ethnopharmacol. 117:345-350.
12
Lampiran 1 Bagan alir lingkup kerja penelitian Daun gaharu segar (A. microcarpa, A. malaccensis) - Dikeringkan (50 °C, 3 hari) - Digiling
Penentuan kadar air
Simplisia
- Diekstraksi dengan metanol (3×24 jam) - Dipekatkan dengan penguap putar
Ekstrak kasar
Uji fitokimia - alkaloid - triterpenoid - steroid -
saponin tanin fenol flavonoid
Uji toksisitas (Metode BSLT)
LC50
Uji Antioksidan (Metode DPPH)
IC50
13
Lampiran 2 Nama jenis dan pengodean sampel Bahan yang digunakan adalah daun gaharu yang berasal dari pohon A. microcarpa (KHDTK Carita, Banten) dan A. malaccensis (Ciapus, Bogor) tanpa inokulasi dan dengan inokulasi. Nama Sampel
Inokulasi/Tanpa inokulasi Tanpa inokulasi jamur (kontrol) Inokulasi jamur asal Papua (forda cc 00512)
Aquilaria microcarpa
Inokulasi jamur asal Jambi (forda cc 00500) Inokulasi jamur asal Gorontalo (forda cc 00509) Inokulasi jamur asal Timor (forda cc 00515) Tanpa inokulasi jamur (kontrol)
Aquilaria malaccensis Inokulasi jamur
Bagian Daun Muda Sedang Tua Muda Sedang Tua Muda Sedang Tua Muda Sedang Tua Muda Sedang Tua Muda Sedang Tua Muda Sedang Tua
Kode Sampel AKM AKS AKT APM APS APT AJM AJS AJT AGM AGS AGT ATM ATS ATT BKM BKS BKT BIM BIS BIT
14
Lampiran 3 Kadar air simplisia daun A. microcarpa Sampel
AKM AKS AKT APM APS APT AJM AJS AJT AGM AGS AGT ATM ATS ATT
Ulangan
Bobot cawan kosong (g)
Bobot basah sampel (g)
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
15.2670 15.2673 26.7569 26.7575 17.1049 17.1052 22.8685 22.8689 22.7865 22.7866 22.6516 22.6518 23.2046 23.2048 22.7851 22.7853 22.9086 22.9089 22.8895 22.8897 23.5439 23.5442 22.6506 22.6508 18.4860 18.4862 22.8664 22.8665 16.4722 16.4724
1.0008 1.0006 1.0013 1.0010 1.0017 1.0020 1.0014 1.0009 1.0017 1.0016 1.0006 1.0004 1.0011 1.0009 1.0015 1.0011 1.0000 1.0002 1.0001 1.0004 1.0022 1.0020 1.0020 1.0018 1.0021 1.0021 1.0001 1.0001 1.0029 1.0022
Bobot cawan + sampel kering (g) 16.1218 16.1275 27.5725 27.5835 17.9599 17.9674 23.7284 23.7318 23.6500 23.6533 23.5073 23.5099 24.0576 24.0666 23.6546 23.6624 23.7531 23.7616 23.7412 23.7473 24.4066 24.4135 23.5265 23.5328 19.3360 19.3432 23.7179 23.7256 17.3494 17.3554
Bobot kering sampel (g)
Kadar air (%)
0.8548 0.8602 0.8156 0.8260 0.8550 0.8622 0.8599 0.8629 0.8635 0.8667 0.8557 0.8581 0.8530 0.8618 0.8695 0.8771 0.8445 0.8517 0.8576 0.8627 0.8693 0.8759 0.8500 0.8820 0.8500 0.8570 0.8515 0.8591 0.8772 0.8830
14.59 14.03 18.55 17.48 14.65 13.95 14.13 13.79 13.80 13.47 14.48 14.22 14.79 13.90 13.18 12.39 15.55 14.85 14.25 13.76 13.26 12.58 15.17 11.96 15.18 14.48 14.86 14.10 12.53 11.89
Rerata (%)
14.31 ± 0.39 18.01 ± 0.75 14.30 ± 0.49 13.96 ± 0.24 13.63 ± 0.23 14.35 ± 0.18 14.35 ± 0.63 12.78 ± 0.56 15.20 ± 0.50 14.01 ± 0.34 12.92 ± 0.48 13.56 ± 2.27 14.83 ± 0.49 14.48 ± 0.54 12.21 ± 0.45
15
lanjutan Lampiran 3 A. malaccensis Sampel
Ulangan
Bobot cawan kosong (g)
Bobot basah sampel (g)
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
23.5457 23.5458 17.1060 17.1061 26.7579 26.7580 22.9093 22.9094 18.4913 18.4914 23.2068 23.2069
1.0017 1.0014 1.0017 1.0018 1.0013 1.0014 1.0013 1.0014 1.0014 1.0007 1.0019 1.0018
BKM BKS BKT BIM BIS BIT
Bobot cawan + sampel kering (g) 24.4126 24.4179 17.9670 17.9719 27.6383 27.6420 23.7820 23.7855 19.3592 19.3625 24.0843 24.0876
Bobot kering sampel (g)
Kadar air (%)
0.8669 0.8721 0.8610 0.8658 0.8804 0.8840 0.8727 0.8761 0.8679 0.8711 0.8775 0.8807
13.46 12.91 14.05 13.58 12.07 11.72 12.84 12.51 13.33 12.95 12.42 12.09
Contoh perhitungan: Sampel AKM Bobot kering sampel = bobot ((cawan + sampel) – cawan kosong) = 16.1218 g – 15.2670 g = 0.8548 g Kadar air (%) =
bobot basah sampel – bobot kering sampel
bobot basah sampel 1.000 g – 0. g = 100 = 14.59% 1.000 g
̅ (%) = =
s=√
kadar air (ulangan 1 1 .
1 .03 2
∑ n1 (
– ̅)2
n–1
100
ulangan 2)
n
= 14.31%
=√
∑ 21 (1 .
–
2–1
1 .31 )2
= 0.39
Rerata (%)
13.18 ± 0.39 13.81 ± 0.33 11.90 ± 0.25 12.68 ± 0.23 13.14 ± 0.27 12.25 ± 0.23
16
Lampiran 4 Rendemen ekstrak kasar sampel Bobot sampel awal (g) 60.10 60.07 60.10 60.05 60.08 60.05 60.04 60.06 60.07 60.08 60.14 60.08 60.04 60.06 60.08 60.10 40.11 40.08 40.06 40.10 60.15
Sampel AKM AKS AKT APM APS APT AJM AJS AJT AGM AGS AGT ATM ATS ATT BKM BKS BKT BIM BIS BIT
Kadar air (%) 14.31 18.01 14.30 13.96 13.63 14.35 14.35 12.78 15.20 14.01 12.92 13.56 14.83 14.48 12.21 13.18 13.81 11.90 12.68 13.14 12.25
Bobot ekstrak (g) 2.4495 2.9557 2.7886 2.5789 2.9740 5.7607 3.2193 1.9564 1.8891 2.7555 2.9323 4.5067 3.5430 2.8602 1.7750 4.9655 2.6460 1.9985 2.3424 2.2540 2.4500
Contoh perhitungan: Sampel AKM Rendemen (%) = =
bobot ekstrak bobot a al sampel 2. 0.10 g
= 4.76%
(1 –
g (1 – 0.
)
kadar air)
100
100
Rendemen (%) 4.76 6.00 5.41 4.99 5.73 11.20 6.26 3.73 3.71 5.33 5.60 8.68 6.93 5.57 3.37 9.52 7.65 5.66 6.70 6.47 4.64
17
Lampiran 5 Hasil uji fitokimia ekstrak kasar sampel A. microcarpa Sampel AKM AKS AKT APM APS APT AJM AJS AJT AGM AGS AGT ATM ATS ATT
Saponin -
Tanin + + + + + + + + + + + + + + +
Alkaloid -
Triterpenoid -
Steroid + + + + + + + + + + + + + + +
Fenol + + + + + + + + + + + + + + +
Flavonoid + + + + + + + + + + + + + + +
Tanin + + + + + +
Alkaloid -
Triterpenoid -
Steroid + + + + + +
Fenol + + + + + +
Flavonoid + + + + + +
A. microcarpa Sampel BKM BKS BKT BIM BIS BIT
Saponin -
Keterangan: – : Hasil negatif + : Hasil positif
Uji tanin
Uji steroid
Uji fenol
Uji flavonoid
18
Lampiran 6 Hasil uji toksisitas ekstrak kasar sampel A. microcarpa kontrol Konsentrasi (µg/mL) 0 10 50 100 200 300 400
Blangko Jumlah larva mati 1 0 LC50 Rerata
2 0 -
AKM Jumlah larva mati 1 0 1 2 4 5 8
2 0 1 2 3 4 7
%kematian 1 0 10 20 40 50 80
2 0 10 20 30 40 70
Nilai probit 1 2 3.72 3.72 4.17 4.17 4.75 4.48 5.00 4.75 5.84 5.52 228.55 307.95 268.24 ± 56.14
AKS Jumlah larva %kematian mati Ulangan 1 2 1 2 1 1 10 10 2 2 20 20 2 2 20 20 3 4 30 40 6 6 60 60 8 7 80 70
AKT Jumlah larva mati
Nilai probit 1 2 3.72 3.72 4.17 4.17 4.17 4.17 4.48 4.75 5.25 5.25 5.84 5.52 227.88 242.87 235.37 ± 10.60
1 1 2 4 6 7 9
2 1 2 4 6 8 8
%kematian 1 10 20 40 60 70 90
2 10 20 40 60 80 80
Nilai probit 1 2 3.72 3.72 4.17 4.17 4.75 4.75 5.25 5.25 5.52 5.84 6.28 5.84 111.68 115.74 113.71 ± 2.88
A. microcarpa papua Konsentrasi (µg/mL) 10 50 100 150 200 300 400
Jumlah larva mati 1 3 6 8 9 10 LC50 Rerata
2 2 7 8 8 10 -
APM % kematian 1 30 60 80 90 100 -
2 20 70 80 80 100 -
APS Nilai probit 1 2 4.48 4.17 5.25 5.52 5.84 5.84 6.28 5.84 8.09 8.09 24.81 28.12 26.47 ± 2.34
Jumlah larva mati
% kematian
1 0 1 1 1 7 10
1 0 10 10 10 70 100
2 0 0 1 3 6 10
Ulangan 2 0 0 10 30 60 100
APT Nilai probit 1 2 3.72 3.72 3.72 3.72 4.48 5.52 5.25 8.09 8.09 207.91 222.90 215.41 ± 10.60
Jumlah larva mati 1 1 2 3 3 7 8 10
2 0 1 4 3 8 7 9
% kematian 1 10 20 30 30 70 80 100
2 0 10 40 30 80 70 90
Nilai probit 1 2 3.72 4.17 3.72 4.48 4.75 4.48 4.48 5.52 5.84 5.84 5.52 8.09 6.28 88.92 148.72 118.82 ± 42.28
18
19
lanjutan Lampiran 6 A. microcarpa Jambi Konsentrasi (µg/mL) 10 50 100 150 200 300 400 500
Jumlah larva mati 1 0 1 5 7 9 LC50 Rerata
2 0 2 4 6 9 -
AJM % kematian 1 0 10 50 70 90 -
2 0 20 40 60 90 -
AJS Nilai probit 1 3.72 5.00 5.52 6.28 -
2 4.17 4.75 5.25 6.28 -
102.89 102.12 102.51 ± 0.54
Jumlah larva mati 1 1 1 2 7 8 9
2 1 1 1 6 8 9
% kematian 1 10 10 20 70 80 90
Ulangan 2 10 10 10 60 80 90
AJT Nilai probit 1 2 3.72 3.72 3.72 3.72 4.17 3.72 5.52 5.25 5.84 5.84 6.28 6.28 185.22 229.35 207.28 ± 31.20
Jumlah larva mati
0 3 6 9 -
0 5 7 10 -
% kematian
0 30 60 90 -
0 50 70 100 -
Nilai probit
4.48 5.00 5.25 5.52 6.28 8.09 73.44 57.10 65.27 ± 11.55
A. microcarpa gorontalo Konsentrasi (µg/mL) 10 50 100 150 200 300 400 500
Jumlah larva mati 1 4 5 10 LC50 Rerata
2 3 6 9 -
AGM % kematian 1 40 50 100 -
2 30 60 90 -
AGS Nilai probit 1 2 4.75 4.48 5.00 5.25 8.09 6.28 16.98 23.20 20.09 ± 4.40
Jumlah larva mati 1 1 1 3 5 9 -
2 0 1 2 4 8 -
% kematian 1 10 10 30 50 90 -
Ulangan 2 0 10 20 40 80 -
AGT Nilai probit 1 2 3.72 3.72 3.72 4.48 4.17 5.00 4.75 6.28 5.84 183.37 210.78 197.07 ± 19.38
Jumlah larva mati
1 0 1 3 8 9
0 1 1 4 8 10
% kematian
10 0 10 30 80 90
0 10 10 40 80 100
Nilai probit
3.72 3.72 3.72 3.72 4.48 4.75 5.84 5.84 6.28 8.09 240.33 237.46 238.90 ± 2.03
20
lanjutan Lampiran 6 A. microcarpa timor Konsentrasi (µg/mL) 10 50 100 200 300 400 500
Jumlah larva mati 1 2 4 8 9 LC50 Rerata
2 1 4 7 9 -
ATM % kematian 1 20 40 80 90 -
2 10 40 70 90 -
ATS Nilai probit 1 2 4.17 3.72 4.75 4.75 5.84 5.52 6.28 6.28 39.25 51.91 45.58 ± 8.95
Jumlah larva mati 1 0 5 7 7 8 9
2 0 6 8 7 8 9
% kematian 1 0 50 70 70 80 90
Ulangan 2 0 60 80 70 80 90
ATT Nilai probit 1 2 5.00 5.25 5.52 5.84 5.52 5.52 5.84 5.84 6.28 6.28 105.61 58.48 82.04 ± 33.33
Jumlah larva mati
1 2 3 3 6 8
2 2 3 4 5 9
% kematian
10 20 30 30 60 80
20 20 30 40 50 90
Nilai probit
3.72 4.17 4.17 4.17 4.48 4.48 4.48 4.75 5.25 5.00 5.84 6.28 332.51 256.05 294.28 ± 54.07
A. malaccensis kontrol Konsentrasi (µg/mL) 10 50 100 150 200 300 400
Jumlah larva mati 1 0 3 6 8 LC50 Rerata
2 0 2 5 9 -
BKM % kematian 1 0 30 60 80 -
2 0 20 50 90 -
BKS Nilai probit 1 2 4.48 4.17 5.25 5.00 5.84 6.28 155.59 167.52 161.56 ± 8.43
Jumlah larva mati 1 1 5 6 7 9 -
2 2 6 5 7 9 -
% kematian 1 10 50 60 70 90 -
Ulangan 2 20 60 50 70 90 -
BKT Nilai probit 1 2 3.72 4.17 5.00 5.25 5.25 5.00 5.52 5.52 6.28 6.28 77.96 61.14 69.54 ± 11.90
Jumlah larva mati
0 5 5 7 9 -
1 5 6 6 8 -
% kematian
0 50 50 70 90 -
10 50 60 60 80 -
Nilai probit
3.72 5.00 5.00 5.00 5.25 5.52 5.25 6.28 5.84 64.96 67.16 66.06 ± 1.56
20
21
lanjutan Lampiran 6 A. malaccensis inokulasi Konsentrasi (µg/mL) 10 50 100 150 200 300 400
Jumlah larva mati 1 0 1 2 3 3 6 9 LC50 Rerata
2 0 1 1 3 4 8 10
BIM % kematian 1 0 10 20 30 30 60 90
2 0 10 10 30 40 80 100
BIS Nilai probit 1 2 3.72 3.72 4.17 3.72 4.48 4.48 4.48 4.75 5.25 5.84 6.28 8.09 206.96 153.56 180.26 ± 37.76
Jumlah larva mati 1 0 4 7 9 -
2 0 5 6 10 -
% kematian 1 0 40 70 90 -
Ulangan 2 0 50 60 100 -
BIT Nilai probit 1 2 4.75 5.00 5.52 5.25 6.28 8.09 62.18 58.70 60.44 ± 2.46
Jumlah larva mati
0 0 4 4 8 9 -
0 1 5 4 8 10 -
% kematian
0 0 40 40 80 90 -
0 10 50 40 80 100 -
Nilai probit
3.72 4.75 5.00 4.75 4.75 5.84 5.84 6.28 8.09 133.30 108.06 120.68 ± 17.85
22
Contoh perhitungan: Sampel AKM Ulangan 1 jumlah larva mati
%kematian =
jumlah larva uji
=
100
1 10
= 10% 7
Nilai Probit
6
5 4 3 y = 2.1244x - 0.0114 R² = 0.9228
2 1 0
1
1.5
2
2.5
3
log konsentrasi (µg/mL) Kurva hubungan nilai probit dan log konsentrasi sampel AKM Ulangan 1 Persamaan regresi linear: y = 2.1244x – 0.0114 LC50 diperoleh saat y = 5, oleh karena itu: 5
= 2.1244x – 0.0114
x
= (5 + 0.0114) / 2.1244
x
= 2.3590
log konsentrasi = 2.3590, maka nilai LC50 sebesar 228.55 μg/mL ̅ = =
LC 0 (Ulangan 1 n 30 . 2
s=√
∑
|
Ulangan 2)
= 268.24 μg/mL
̅|
=√
∑ 21 |22 .
-2
2-1
2
.2 |
= 56.14
22
23
Lampiran 7 Hasil uji antioksidan ekstrak kasar sampel A. microcarpa kontrol AKM Absorbans
Konsentrasi (µg/mL) Blangko 10 20 30 40 50 60
AKS % inhibisi
Absorbans
AKT % inhibisi
Absorbans
% inhibisi
Ulangan 1 0.3430 0.3000 0.2670 0.2330 0.1840 0.1660 0.1290 LC50 Rerata
2 0.3430 0.2780 0.2580 0.1990 0.1320 0.1110 0.0730
1 2 0.00 0.00 12.54 18.95 22.16 24.78 32.07 24.78 46.36 61.52 51.60 67.64 62.39 78.72 46.47 30.87 38.67 ± 11.03
1 0.3430 0.2800 0.2240 0.1850 0.1240 0.0980 0.0660
2 0.3430 0.2720 0.2000 0.1310 0.0780 0.0580 0.0390
1 2 0.00 0.00 18.37 20.70 34.69 41.69 46.06 61.81 63.85 77.26 71.43 83.09 80.76 88.63 27.86 22.02 24.94 ± 4.13
1 0.3430 0.3270 0.3030 0.2010 0.1970 0.1850 0.1710
2 0.3430 0.3260 0.3070 0.2090 0.1990 0.1900 0.1470
1 2 0.00 0.00 4.66 4.96 11.66 10.50 41.40 39.07 42.57 41.98 46.06 44.61 50.15 57.14 55.65 53.00 54.33 ± 1.87
A. microcarpa Papua APM Konsentrasi (µg/mL) Blangko 10 20 30 40 50 60
Absorbans
APS % inhibisi
Absorbans
APT % inhibisi
Absorbans
% inhibisi
Ulangan 1 0.4970 0.4210 0.3800 0.3300 0.2810 0.2600 0.2260 LC50 Rerata
2 0.4970 0.4130 0.3700 0.3140 0.2620 0.2030 0.1610
1 2 0.00 0.00 15.29 16.90 23.54 25.55 33.60 36.82 43.46 47.28 47.69 59.15 54.53 67.61 55.35 39.39 47.37 ± 11.29
1 0.4970 0.4170 0.3480 0.2410 0.1850 0.1670 0.1220
2 0.4970 0.4080 0.3170 0.2320 0.1530 0.1160 0.0780
1 2 0.00 0.00 16.10 17.91 29.98 36.22 51.51 53.32 62.78 69.22 66.40 76.66 75.45 84.31 29.62 25.40 27.51 ± 2.98
1 0.4970 0.4430 0.3520 0.2760 0.2610 0.1910 0.1540
2 0.4970 0.4320 0.3430 0.2740 0.2380 0.1660 0.1350
1 2 0.00 0.00 10.87 13.08 29.18 30.99 44.47 44.87 47.48 52.11 61.57 66.60 69.01 72.84 36.43 33.01 34.72 ± 2.42
lanjutan Lampiran 7 A. microcarpa Jambi AJM Konsentrasi (µg/mL) Blangko 10 20 30 40 50 60
Absorbans
AJS % inhibisi
AJT
Absorbans
% inhibisi
Absorbans
% inhibisi
Ulangan 1 0.4780 0.4230 0.3700 0.3140 0.2940 0.2680 0.2320 LC50 Rerata
2 0.4780 0.4130 0.3160 0.2910 0.2600 0.2450 0.1860
1 2 0.00 0.00 11.51 13.60 22.59 33.89 34.31 39.12 38.49 45.61 43.93 48.74 51.46 61.09 63.24 44.95 54.09 ± 12.94
1 0.4780 0.4250 0.3610 0.3020 0.2590 0.2480 0.2000
2 0.4780 0.4210 0.3560 0.2940 0.2310 0.1980 0.1450
1 2 0.00 0.00 11.09 11.92 24.48 25.52 36.82 38.49 45.82 51.67 48.12 58.58 58.16 69.67 48.85 37.69 43.27 ± 7.89
1 0.4780 0.4200 0.2880 0.2690 0.2400 0.2280 0.1770
2 0.4780 0.4130 0.2640 0.2560 0.2200 0.1960 0.1400
1 2 0.00 0.00 12.13 13.60 39.75 44.77 43.72 46.44 49.79 53.97 52.30 59.00 62.97 70.71 38.75 32.04 35.39 ± 4.75
A. microcarpa Gorontalo Konsentrasi (µg/mL) Blangko 10 20 30 40 50 60
AGM Absorbans
AGS % inhibisi
AGT
Absorbans
% inhibisi
Absorbans
% inhibisi
Ulangan 1 0.4780 0.3770 0.2960 0.2280 0.1790 0.1660 0.0930 LC50 Rerata
2 0.4780 0.3700 0.2910 0.2110 0.1550 0.1170 0.0670
1 2 0.00 0.00 21.13 22.59 38.08 39.12 52.30 55.86 62.55 67.57 65.27 75.52 80.54 85.98 26.95 24.03 25.49 ± 2.07
1 0.4780 0.3280 0.2370 0.1790 0.1110 0.0870 0.0640
2 0.4780 0.3220 0.2290 0.1610 0.0880 0.0650 0.0460
1 2 0.00 0.00 31.38 32.64 50.42 52.09 62.55 66.32 76.78 81.59 81.80 86.40 86.61 90.38 18.72 17.44 18.08 ± 0.90
1 0.4780 0.3250 0.1930 0.1080 0.0930 0.0480 0.0420
2 0.4780 0.2890 0.1770 0.0870 0.0690 0.0390 0.0370
1 2 0.00 0.00 32.01 39.54 59.62 62.97 77.41 81.80 80.54 85.56 89.96 91.84 91.21 92.26 15.67 12.98 14.33 ± 1.90
24
25
lanjutan Lampiran 7 A. microcarpa Timor ATM Absorbans
Konsentrasi (µg/mL) Blangko 10 20 30 40 50 60
ATS % inhibisi
ATT
Absorbans
% inhibisi
Absorbans
% inhibisi
Ulangan 1 0.4510 0.2360 0.2340 0.2110 0.1380 0.0760 0.0740 LC50 Rerata
2 0.4510 0.2110 0.1890 0.1610 0.0860 0.0490 0.0450
1 2 0.00 0.00 47.67 53.22 48.12 58.09 53.22 64.30 69.40 80.93 83.15 89.14 83.59 90.02 15.91 11.11 13.51 ± 3.40
1 0.4510 0.2870 0.2640 0.2090 0.1940 0.1810 0.1190
2 0.4510 0.2770 0.2610 0.1890 0.1380 0.0940 0.0810
1 2 0.00 0.00 36.36 38.58 41.46 42.13 53.66 58.09 56.98 69.40 59.87 79.16 73.61 82.04 24.72 19.40 22.06 ± 3.76
1 0.4510 0.3490 0.2570 0.1460 0.1370 0.0900 0.0820
2 0.4510 0.3230 0.2120 0.1330 0.0980 0.0610 0.0600
1 2 0.00 0.00 22.62 28.38 43.02 52.99 67.63 70.51 69.62 78.27 80.04 86.47 81.82 86.70 21.93 18.08 20.00 ± 2.72
A. malaccensis kontrol BKM Konsentrasi (µg/mL) Blangko 10 20 30 40 50 60
Absorbans
BKS % inhibisi
BKT
Absorbans
% inhibisi
Absorbans
% inhibisi
Ulangan 1 0.4510 0.4040 0.3820 0.2260 0.2200 0.1740 0.1490 LC50 Rerata
2 0.4510 0.3500 0.2990 0.1850 0.1380 0.1150 0.0660
1 2 0.00 0.00 10.42 22.39 15.30 33.70 49.89 58.98 51.22 69.40 61.42 74.50 66.96 85.37 37.21 24.42 30.81 ± 9.04
1 0.4280 0.3200 0.2030 0.1160 0.0800 0.0760 0.0360
2 0.4280 0.3200 0.2030 0.1130 0.0770 0.0680 0.0370
1 2 0.00 0.00 25.23 25.23 52.57 52.57 72.90 73.60 81.31 82.01 82.24 84.11 91.59 91.36 18.53 18.38 18.45 ± 0.10
1 0.4280 0.2430 0.1410 0.0620 0.0310 0.0280 0.0260
2 0.4280 0.2370 0.1170 0.0610 0.0310 0.0310 0.0270
1 2 0.00 0.00 43.22 44.63 67.06 72.66 85.51 85.75 92.76 92.76 93.46 92.76 93.93 93.69 11.26 10.13 10.69 ± 0.80
lanjutan Lampiran 7 A. malaccensis inokulasi BIM
Konsentrasi (µg/mL) Blangko 10 20 30 40 50 60
Absorbans
BIS % inhibisi
BIT
Absorbans
% inhibisi
Absorbans
% inhibisi
Ulangan 1 0.4510 0.4150 0.3380 0.2600 0.0950 0.0590 0.0440 LC50 Rerata
2 0.4510 0.3360 0.2410 0.1620 0.0800 0.0500 0.0380
1 2 0.00 0.00 7.98 25.50 25.06 46.56 42.35 64.08 78.94 82.26 86.92 88.91 90.24 91.57 27.00 19.70 23.35 ± 5.16
1 0.4280 0.3510 0.2600 0.1840 0.1390 0.0710 0.0510
2 0.4280 0.3470 0.2600 0.1850 0.1360 0.0710 0.0530
1 2 0.00 0.00 17.99 18.93 39.25 39.25 57.01 56.78 67.52 68.22 83.41 83.41 88.08 87.62 24.00 23.83 23.92 ± 0.12
1 0.4510 0.3390 0.2970 0.2260 0.1930 0.1110 0.0520
2 0.4510 0.3310 0.2920 0.2180 0.1830 0.0960 0.0460
1 2 0.00 0.00 24.83 26.61 34.15 35.25 49.89 51.66 57.21 59.42 75.39 78.71 88.47 89.80 25.91 24.57 25.24 ± 0.95
Standar kuersetin Konsentrasi (µg/mL) Blangko 1 2 3 4 5
Kuersetin Absorbansi % inhibisi Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 1 Ulangan 2 0.4510 0.4510 0.2880 0.2780 36.14 38.36 0.2790 0.2650 38.14 41.24 0.2440 0.2290 45.90 49.22 0.2190 0.1900 51.44 57.87 0.1730 0.1600 61.64 64.52 IC50 3.26 2.57 Rerata 2.91 ± 0.49
26
27
Contoh perhitungan: Standar kuersetin %inhibisi =
(absorbans blangko – absorbans standar) absorbans blangko
=
(0.
10 – 0.2 0) 0. 10
100
100
= 36.14% 70.00
ulangan 2 y = 16.215x + 34.718 R² = 0.8751
60.00
%inhibisi
50.00 40.00
ulangan 1 y = 14.8767x + 32.4074 R² = 0.8293
30.00 20.00
ulangan 1 ulangan 2
10.00 0.00 0
0.5
1
1.5
2
ln konsentrasi Kurva hubungan %inhibisi dan ln konsentrasi standar kuersetin Persamaan regresi linear: y = 14.8767x + 32.4074 IC50 diperoleh saat y = 50, oleh karena itu: 50 = 14.8767x + 32.4074 x
= (50 – 32.4074) / 14.8767 = 1.1826
ln konsentrasi = 1.1826, maka nilai IC50 sebesar 3.2 μg/mL
̅ =
IC 0 (Ulangan 1 n
= 2.91 μg/mL
=
s=√
Ulangan 2)
∑ n | n-1
– ̅|
=√
∑ 21 |3.2 2-1
– 2.
1|2
= 0.49
28
Sampel AKM %inhibisi =
(absorbans blangko – absorbans sampel)
100
absorbans blangko
=
(0.3 30 – 0.3000) 0.3 30
100
%inhibisi
= 12.54% 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00
ulangan 2 y = 34.8679x - 69.5894 R² = 0.9123
ulangan 1 ulangan 1 y = 27.6274x - 56.0568 R² = 0.9392 2
3
3
4
4
ulangan 2
5
ln konsentrasi
Kurva hubungan %inhibisi dan ln konsentrasi sampel AKM Persamaan regresi linear: y = 27.6274x – 56.0568 IC50 diperoleh saat y = 50, oleh karena itu: 50 = 27.6274x – 56.0568 x
= (50 + 56.0568) / 27.6274
= 3.8388 ln konsentrasi = 3.8388, maka nilai IC50 sebesar
.
μg/mL
IC 0 (Ulangan 1 Ulangan 2) n . 30. = = 38.67 μg/mL 2
̅ =
s=√
∑ n | -̅| n-1
=√
∑ 21 | . 2-1
-3 .
2
|
= 11.03
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor, pada tanggal 9 Juni 1990 dari pasangan Engkus Kusnadi dan Dedeh Warsih. Penulis merupakan anak pertama dari 2 bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan di SMAN 5 Bogor tahun 2008, kemudian melanjutkan pendidikan di Departemen Kimia, IPB. Selama kuliah, penulis berpartisipasi sebagai staf PKS Ikatan Mahasiswa Kimia (Imasika) Institut Pertanian Bogor tahun 2009/2010. Penulis melakukan praktik lapangan di PT Bayer Health Care Cimanggis Plant dengan judul laporan “Analisis Tiamina Monofosfat Klorida Dihidrat sebagai Bahan Baku dalam Pembuatan Tablet Suplemen” pada tahun 2011. Penulis juga pernah menjadi asisten praktikum Kimia Tingkat Persiapan Bersama IPB tahun 2009–2012, asisten Praktikum Kimia Organik Berbasis Kompetensi tahun ajaran 2010/2011, Kimia Pangan D3 Analisis Kimia IPB tahun ajaran 2010/2012, Kimia Bahan Alam Alih Jenis Kimia tahun ajaran 2011/2012, Kimia Organik Layanan ITP/Biokimia tahun ajaran 2011/2012, serta Kimia Organik D3 Analisis Kimia tahun ajaran 2011/2012.
