Tudományos Diákköri Dolgozat
Ozohanics Oliver
Tömegspektrométeres adatgyűjtőrendszer fejlesztése és alkalmazásai
Témavezető: dr. Frigyes Dávid Általános és Szervetlen Kémiai Tanszék
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2005.
TARTALOM JEGYZÉK: Munkám motivációja.................................................................................................................. 3 Bevezetés.................................................................................................................................... 4 A tömegspektrométer felépítése............................................................................................. 4 1. A vákuumrendszer.......................................................................................................... 5 2. Mintabeviteli rendszer.................................................................................................... 6 3. Az ionforrások................................................................................................................ 7 3.1 Az EI forrás .............................................................................................................. 8 3.2 A FAB ...................................................................................................................... 9 3.3 A MALDI............................................................................................................... 10 3.4 Az Electrospray technika ....................................................................................... 10 4. Az analizátor ................................................................................................................ 11 4.1 A mágneses analizátor............................................................................................ 11 4.2 Egyéb analizátortípusok ......................................................................................... 13 5. A detektor..................................................................................................................... 14 6. Az adatgyűjtőrendszer.................................................................................................. 14 7. A tömegspektrum ......................................................................................................... 16 A KRATOS MS-80 tömegspektrométer jellemzése ............................................................ 17 Rendelkezésre álló hardware/software................................................................................. 17 1. Az adatgyűjtő-kártya .................................................................................................... 17 2. A LabView rövid ismertetése....................................................................................... 19 Vizsgált anyagok .................................................................................................................. 21 A tömegspektrometriai vizsgálatok irodalmi előzményei.................................................... 22 Célkitűzések ......................................................................................................................... 24 Adatgyűtőrendszer fejlesztése.................................................................................................. 25 A felhasználói felület ........................................................................................................... 28 A blokkdiagram.................................................................................................................... 31 Tömegspektrometriai vizsgálatok ............................................................................................ 33 Kalkonok .............................................................................................................................. 34 Pirazolinok ........................................................................................................................... 37 Pirazolok............................................................................................................................... 41 Az eredmények összefoglalása................................................................................................. 46 További tervek.......................................................................................................................... 47 Köszönetnyilvánítás ................................................................................................................. 48 Röviditésjegyzék ...................................................................................................................... 49 Irodalomjegyzék....................................................................................................................... 50
2
Munkám motivációja Előző diákköri dolgozatomban 1 , ferrocéntartalmú kalkon, pirazol és pirazolin típusú vegyületeket állítottam elő. A vegyületek tömegspektrometriás vizsgálata révén kerültem kapcsolatba az ELTE Kémiai Intézet Tömegspektrometriai Laboratóriumával. A laboratórium KRATOS MS-80 típusú tömegspektrométerének adatgyűjtőrendszere meghibásodott, így bekapcsolódtam az új adatgyűjtőrendszer fejlesztésébe. Jelen dolgozatomban beszámolok egy tömegspekrométeres adatgyűjtőrendszer fejlesztéséről és ennek alkalmazásáról az előállított vegyületek vizsgálatában. A dolgozatomban először egy tömegspektrométer felépítésével foglalkozom, majd jellemzem a munkám tárgyát képező berendezést és programozási nyelvet. Röviden összefoglalom a vizsgált anyagokat is. A munkám ismertetését az adatgyűjtőrendszer fejlesztésével kezdem, ezt követi az anyagok tömegspektrometriai vizsgálatának eredménye és az eredmények diszkussziója. A tárgyalást az eredmények összefoglalásával és a munka további céljainak ismertetésével zárom. A dolgozat végén mellékelek egy rövidítés- és jelölésjegyzéket, a leírtak áttekintésének megkönnyítésére.
3
Bevezetés A tömegspektrometria napjainkban egyre több területen jól használható módszer ismeretlen anyagok azonosítására és szerkezetvizsgálatra. A felhasználási területek között szerepel többek között a rovarirtó szerek azonosítása víz- és levegőmintákban, szteroidok kimutatása sportolók vérében vagy éppen ppq mennyiségű fémek vízbeli kimutatása. Hasznosnak bizonyult
14
C izotópos kormeghatározások elvégzésére, űrszondákon az élet nyomainak
felderítésére, esetleg izotópok tömegének 70 ppt pontosságú megállapítására.
A tömegspektrométer felépítése A tömegspektrométer egy olyan berendezés amelyben, egyedi folyamatban izolált gázfázisú ionokat állítunk elő, ezeket tömeg/töltés szerint analizáljuk, majd detektáljuk2: így kapjuk a tömegspektrumot. Egy tömegspektrométer felépítése a következő ábrán látható:
Ionforrás
Analizátor
Iondetektor
(Gázfázisú ionok)
Vákuumrendszer
Mintabeeresztés
Adatfeldolgozórendszer
1. ábra: Tömegspektrométer vázlatos felépítése
4
1. A vákuumrendszer3 A készülék egyik fontos része a vákuumrendszer. Ez alatt azoknak a komponenseknek az összességét értjük, ami a berendezésben alacsony nyomás létrehozásához és fenntartásához szükséges; tartalmazza nemcsak a különböző szivattyúkat, a szelepeket, nyomásmérő és szabályzó egységeket, de minden olyan részt, amelyben ionokkal dolgozunk – ionforrástól a detektorig. Minden tömegspektrométerben nagyvákuumban működik az analizátor és a detektor. A mintabevitel és az ionforrás a tömegspektrométer típusától függően nagyvákuum, elővákuum vagy atmoszférikus nyomáson van. Mi is az a vákuum? A gyakorlat szempontjából minden olyan tér, amelynek nyomása kisebb, mint a környezeté. Elméleti megfogalmazásban a vákuum olyan tér, amelyben a közepes szabad úthossz nagyobb, mint az edény karakterisztikus mérete. A vákuumrendszerre szükségünk van, hogy minimalizáljuk az ionok közötti ütközéseket, hiszen egy ütközés által az ionok reagálhatnak, vagy energiát cserélhetnek környezetükkel. Az ionok élettartalmának viszont elég hosszúnak kell lennie, hogy detektálni tudjuk őket. A rendszer egy elővákuum és egy nagyvákuum részből áll. Az elővákuum nyomástartománya 1000–10-3 mbar; általában a nagyvákuum előállításához használt berendezések igényelik. Elővákuumot legtöbbször rotációs szivattyú használatával állítanak elő. A nagyvákuum jellemzői hogy a részecskék (molekulák, ionok, atomok) keveset ütköznek, kicsi a hővezetés, a termikus egyensúly beállta csak lassan, hősugárzáson keresztül valósul meg, valamint molekuláris áramlási viszonyok lépnek fel. Csak unimolekuláris reakciók játszódnak le. Nyomástartománya 10-4–10-8 mbar és ilyen nyomások eléréséhez több szivattyútípust használhatunk. Elterjedtek a turbomolekuláris és a diffúziós szivattyúk, de bizonyos készülékekben (ICR) szükség van még alacsonyabb nyomásra ezért, az előzők valamelyikéhez krioszivattyú is társulhat.
5
2. ábra: Vákuumrendszer felépítése
2. Mintabeviteli rendszer Ahhoz hogy mérni tudjunk egy anyagot, gázfázisú ionokat kell előállítani belőle. A mintát valamilyen módon atomizáljuk (ezt a kifejezést a tömegspektrometriás szleng a minta eloszlatására használja, természetesen nincs szó a minta szabad atomokra bontásáról), majd ionizáljuk, vagy egy lépésben állítunk elő ionokat belőle. Atomizálást elérhetünk úgy is, hogy a mintát elpárologtatjuk. Ebben nagy szerepet játszik a vákuum ugyanis, egy nagyságrend nyomáscsökkenés durván 20°C forráspont-csökkenésnek felel meg. A minta bevitelének és ionizációjának módja a minta fizikai-kémiai tulajdonságaitól és a mátrixtól függ. Több mintabeviteli eljárást4 is kidolgoztak tömegspektrometriás használatra. Ha a minta elég könnyen elpárolog, termikus stabilitása nagy, eljárások sora áll rendelkezésre. A gázok és nagy gőznyomású minták általában melegítés nélkül az ionforrásba kerülnek, míg szilárd és folyadékminta esetén fűtéssel növelik a gőznyomást. Ha a minta termikusan nem elég stabil vagy nincs lehetőség elpárologtatására, akkor a minta eloszlatását és az ionizálást egy lépésben végezhetjük. Ilyen módszerekről az ionforrások között lesz szó. Röviden ismertetni szeretnék néhány technikát, elsőként a direkt mintabeeresztést. Direkt mintabeeresztéskor a szilárd mintát egy fűtött mintatartó végére visszük fel a lehető legkisebb mennyiségben, majd a mintát az ionforrásba juttatjuk, ahol az elpárolog. Ezt az eljárást használhatjuk olyan szilárd minták vizsgálatára is, amelyek légköri nyomáson elbomlanának forráspontjuk elérése előtt. A minta vákuumban van, nem kap nagy hőterhelést, így kíméletesebb az elpárologtatás.
6
3. ábra: Direkt mintabeeresztés
A módszer nagy hátránya, hogy nem minden vegyület párologtatható el. Ilyenek többek között a fehérjék, de ide sorolható a legtöbb 1000 feletti moltömeggel rendelkező vegyület, valamint a sok hidrogénkötést tartalmazó vagy sószerű vegyületek, mint például az arginin. Más mintabeviteli eljárások a kapcsolt technikák között keresendők. Gázkromatográftömegspektrométer (GC-MS) esetén a mintát a gázkromatográf segítségével juttatják az ionforrásba. A HPLC/LC-MS használata az utóbbi évtizedben terjedt el, mivel a folyadékminták ionizálásához szükséges módszerek régebben nem álltak rendelkezésünkre.
3. Az ionforrások5 Az ionforrásokban az ionizáció módja elektron eltávolítása vagy töltésaddíció – leggyakoribb a H+ addíció. Az ionizáció során a mintának átadott energia szerint megkülönböztetünk „lágy” és „kemény” ionizációs eljárásokat. A módszerek különböznek a minta halmazállapotában is. Léteznek gázfázisú mintát igénylő módszerek, deszorpciós technikák és spray eljárások. Gázfázisú – elpárologtatott – mintából több ionforrás típussal is tudunk ionokat előállítani. Vannak, amelyek nagyvákuumot igényelnek, mások elővákuum körülmények között használhatók. Nagyvákuumban izolált molekuláris viszonyok között jönnek létre az ionok. Ilyen körülményeket igényel az úgynevezett elektronütközéses ionforrás, továbbiakban EI (Electron Impact). Elővákuumban ion–molekula reakciók is lejátszódhatnak és a termikus egyensúly gyorsan beáll.
7
A deszorpciós technikákban egy primer részecskenyaláb használatával kondenzált fázisú anyagot egy lépésben ionizálnak, így nincs szükség a minta külön elpárologtatására. Ezek közül a fontosabbak a „gyorsatom–bombázás”, röviden FAB (Fast Atom Bombardment), és a mátrixszal elősegített lézeres deszorpciós ionizáció, a MALDI (Matrix-assisted Laser Desorption ionization). A spray ionizációs eljárások atmoszférikus nyomáson működnek. Az oldott mintát különböző módszerekkel porlasztják és a finom eloszlású cseppeket ionizálják. Egyik gyakran nagynyomású folyadékkromatográfiához (HPLC - High Pressure Liquid Chromtography) kapcsolt technika az electrospray ionizáció, röviden ESI (Electrospray ionization).
3.1 Az EI forrás Az elektronütközéses ionizáció az egyik legelterjedtebb tömegspektrométeres ionizációs módszer. Lényege hogy az ionok gyors elektronok és minta molekulák ütközése által jönnek létre az alábbi folyamatban: M (g) + e– → M+˙ + 2e– Az ionoknak olyan az energia-eloszlása hogy lesz olyan molekula, amely molekulaionként hagyja el a forrást, mások különböző unimolekuláris folyamatokban vesznek részt, fragmensionként távozva. A módszer jól működik gázfázisú (pl. elpárologtatott vagy gázkromatografált) minta esetén. Az
így
kapott
spektrumok
jól
reprodukálhatók,
ezért
elterjedten
használják
spektrumkönyvtárak létrehozására. A nagy gerjesztési energia azonban nagy mértékű fragmentációhoz vezet, ami strukturális információt hordoz, de sok esetben a molekulaion nem megfigyelhető.
8
eV=70 V +
lencserendszer M +
É
anód
D
e -
Ikatód
minta
+ Urepeller
4. ábra Az EI forrás felépítése
A fenti ábrán egy EI forrás felépítése látható. A katód egy fűtött fémszál (W), amelyből kilépő elektronokat általában 70 V potenciállal gyorsítjuk. A minta gázfázisú molekulái az elektronnyaláb útjába kerülnek. Az elektronok a molekulákkal ütközve elektronokat ütnek ki a molekulákból. Az eredeti 70 eV-ból 0-10 eV használódik fel a minta ionizálására, általában egyszeres töltésű kationokat eredményezve, a gerjesztési energia néhány eV, a „maradék” energia elsősorban az elektronok energiájaként távozik. Szerves molekulákból mindig gyökionokat kapunk. Az
elektronütközéses
ionizáció
hatáskeresztmetszetét
(valószínűségét)
az
energia
függvényében maximumgörbe írja le. Azt mondhatjuk, hogy a legtöbb vegyület esetén a maximum 70 és 100 eV között található, ezért optimális a 70 eV elektron energia. Elméleti számítások a várható spektrumot illetően meglehetősen nehezek. Az ionok energiaeloszlása nem pontosan ismert. A spektrum elméleti becsléséhez számtalan párhuzamos és konszekutív reakció termodinamikai és kinetikus viszonyait kellene figyelembe venni, ami jelenleg nem rutinszerű. A spektrum tapasztalati szabályok alapján azonban általában jól magyarázható.
3.2 A FAB A módszer előnye, hogy egy lépésben állít elő gázfázisú ionokat folyékony vagy szilárd mintákból. A minta felületre felvitt, mátrixban oldott szerves anyag. Egy nemesgázatomnyalábot irányítanak a mintára. A nagy energiájú ütközés révén a molekulák kiszakadnak a kondenzált fázisból és ionizálódnak. A FAB egy lágy ionizációs módszer; jellemzően 9
kismértékű fragmentálódás megy végbe. Általában protonált molekulaion [M+H]+ jelenik meg. Ez a módszer jól működik pár ezres molekulatömegig. Mivel a mátrixban oldott molekulák kis hőterhelésnek vannak kitéve, termikusan instabil vegyületek vizsgálatára is jól alkalmazható.
3.3 A MALDI A MALDI – mátrixszal elősegített lézeres deszorpciós ionizáció – gyakran használatos természetes és mesterséges polimerek, proteinek vizsgálatára 200 000 Da moltömegig. Ez a technika lézerimpulzust használ a minta atomizálására és ionizálására. A mintát szilárd mátrixban viszik a spektrométerbe. A mátrix – tipikusan karbonsav – elnyeli a lézerfényt, majd ionizálja a mintát. Ezzel a lágy ionizációs módszerrel nincs, vagy nagyon kicsi a fragmentáció. A spektrumban leggyakrabban [M+H]+, esetleg [2M+H]+, [M+2H]2+ ion látható.
3.4 Az Electrospray technika
5. ábra Electrospray ionforrás működése, nagyított kapilláris és folyadékcseppek
Az ESI módszer poláros vegyületek vizsgálatára alkalmas. Elterjedését az LC/MS-ek sikerének köszönheti. Gyakran használják peptidek és fehérjék vizsgálatára. A megfelelő oldószerben oldott mintát vákuumban elporlasztják. A fém kapilláris végére nagy feszültséget kapcsolnak. A folyadékcseppek felülete a térerősségnek köszönhetően feltöltődik. A párolgás miatt a cseppek felülete egyre kisebb lesz és egy idő után a Coulomb-taszítás nagyobb lesz, mint a cseppet összetartó felületi feszültség. Ennek következtében az szétrobban és többszörösen töltött, ionizált molekulák (tipikusan [M+nH]n+) kerülnek a gáztérbe. A
10
többszörös töltésnek köszönhetően a spektrumban az ionok kisebb m/z-nél láthatók, mint a molekulatömegük.
4. Az analizátor Miután a forrásban ionok képződtek, ezeket a repeller egy gyorsító feszültséggel kilöki a forrásból a lencserendszer felé. Az analizátor a lencserendszer után található, melynek feladata az ionok tömeg/töltés szerinti elválasztása. Több analizátortípus létezik, amelyek eltérő a felbontásuk, pásztázási sebességük, tömegtartományuk és hatékonyságuk. A relatív felbontás úgy definiálható, mint az a legnagyobb tömeg, ami még eltválasztható az eggyel nagyobbtól. Ez megadható az M/∆M hányadossal. Az „egységnyi felbontás” azt jelenti, hogy a teljes tömegtartományban meg tudjuk különböztetni az egész tömegeket. A pásztázási sebesség az az idő, ami alatt egy teljes tömegspektrumot fel tudunk venni, vagy a mérni kívánt tömegtartományt végig- pásztáztuk. Ez megadja az analízis időigényét, ami kapcsolt technikák esetén fontos. I ∆Μ
5% m/z
M
6. ábra Relatív felbontás
A következő analizátortípusokat különböztetjük meg: – nyaláb-típusú analizátorok: mágneses szektor, kvadrupól analizátorok – csapdázó analizátorok: kvadrupól ioncsapda, FT-ICR analizátorok – repülésiidő-analizátorok (TOF - Time of Flight).
4.1 A mágneses analizátor Az első mágneses analizátor Thomson nevéhez fűződik. Ezzel impulzusuk szerint tudta elválasztani a részecskéket.
11
A mágneses analizátor 6 a nyaláb típusú analizátorok családjába tartozik. Egy mágneses szektorból vagy kétszeres fókuszálású kivitel esetén egy mágneses szektorból és egy elektrosztatikus analizátorból áll. A mágnes előtt az ionokra egy U feszültségű gyorsítótér hat, ami az ionokat m/z-nek megfelelően gyorsítja. A mágneses szektorba belépő ionokra eltérítő erő hat: F = q(v×B). A különböző sebességgel rendelkező ionok más és más körpályára állnak, ahogy ez a következő képletből is látszik (r a körpálya sugara):
m B 2 er 2 = z 2U Változtatjuk a B mágneses indukciót, így mindig egy adott m/z-vel rendelkező ionok állnak olyan körpályára, hogy a kilépőrésen keresztül távozzanak. A mágneses szektor megfelelő tervezés esetén az egy pontból különböző irányba induló ionokat összegyűjti, ezek a kilépőrésnél találkoznak, vagyis szögfókuszálást végez. Probléma azonban, hogy különböző energiájú, de azonos m/z-vel rendelkező ionok, különböző B esetén lépnek ki a mágnesből. Ennek a kiküszöbölésére a mágnes elé vagy után, egyenes geometriájú illetve fordított geometriájú készüléknél, egy elektrosztatikus analizátort raknak, így egy kétszeres fókuszálású mágneses analizátort kapunk. Az elektrosztatikus analizátor energiafókuszálást végez, ezzel kiküszöbölve az ionok energiaszórását. Egy ilyen analizátorral a relatív felbontás M/∆M > 50 000, tömegtartomány néhány ezer Da.
7. ábra Kétszeres fókuszálású mágneses analizátor felépítése
12
A tömegspektrométerben metastabil ionok is keletkeznek. Ezek olyan ionok, amelyek nem a forrásban bomlanak el. Ha valamelyik analizátorban bomlanak el, a spektrumban nem látjuk őket (elkenődve beleolvadnak a háttérzajba), de ha a két analizátor közötti térmentes tartományban, akkor általában kis intenzitású, elkenődött csúcsként jelennek meg. Ebben az esetben, a spektrumban jól meghatározott m/z-nél jelentkeznek, amit az alábbi képlettel közelíthetünk:
m* =
mleányion
2
manyaion
A metastabil ionokat felhasználhatjuk fragmentációs lépések bizonyítására.
4.2 Egyéb analizátortípusok A kvadrupól analizátorok négy, egymással párhuzamos, körkeresztmetszetű elektródból állnak. A két-két szemben lévőt azonos, egymással ellentett potenciálra kapcsolják. A potenciált egy egyenfeszültség és egy rádiófrekvenciás jel összege adja. A két feszültség megfelelő megválasztása azt eredményezi, hogy csak egy adott m/z-vel rendelkező ion juthat át. A két feszültségkomponens megfelelő hangolásával felvehető a tömegspektrum. Ezek az analizátorok olcsóbbak, mint a mágneses társaik, de rendszerint csak pár ezer m/z-ig használhatók (tipikusan 1000 m/z) és egységnyi felbontással jellemezhetők.
8. ábra: A kvadrupól felépítése
A repülésidő-analizátorok a szerint választják szét az ionokat, hogy mennyi időt töltenek el az analizátorban. Az ionokat elektromos térrel gyorsítják, ekkor a tömeg/töltés szerinti sebességre tesznek szert. Különböző sebességű ionok különböző ideig tartózkodnak az analizátorban. Az ilyen analizátorok előnye a nagyon nagy („végtelen”) tömegtartomány, jó felbontás és gyors működés; hátrány a magas ár.
13
5. A detektor A tömegspektrométerben a detektorba jutó ionok viszonylag kis áramot váltanak ki, amelyet közvetlenül nem tudunk megfelelő pontossággal mérni. Ezért szükséges olyan berendezés használata, amely erre a kis áramra is érzékenyen reagál. A követelmény a detektorokkal szemben a nagy érzékenység, a kis zaj és a linearitás. Az érzékenység az áram-erősítéssel függ össze: 106 – 107 erősítésre van szükség, hogy kevés iont is detektálni tudjunk. Több detektortípust fejlesztettek ki az idők során. Ezek az ionokat a töltésük alapján detektálják. A Faraday-cella egy olyan detektortípus, amely lineáris, de érzékenysége viszonylag kicsi, ezért nagy ionáram esetén használható. Legegyszerűbb esetben egy fémlapból áll, ami 1010Ω ellenállással földpotenciálhoz van kapcsolva. Működése azon alapszik, hogy az ionok a cella falába csapódva áramot eredményeznek, így az eredő áram arányos lesz a becsapódott ionok (töltések) mennyiségével. Az elektronsokszorozó sok egymás után elhelyezett fémlemezből, úgynevezett dinódákból áll. Ezekre egyre növekvő pozitív potenciált kapcsolunk. Az első dinódára becsapódó ionok több elektront kilöknek belőle, amely elektronok a következő dinódába csapódnak és exponenciálisan növekvő elektronáramot eredményeznek. Nagy erősítést lehet velük elérni, ám a folyamatos ionbecsapódások könnyen elszennyezhetik az első dinódát, amit ezért úgy alakítanak ki, hogy könnyen cserélhető legyen. A csatorna-elektronsokszorozó (channeltron) hasonló elven működik, mint a dinódás elektronsokszorozó. Lényegében egy kis méretű kerámia cső, melynek falára félvezető réteget párologtattak fel. 6-7 nagyságrendű erősítési faktorral rendelkeznek, de linearitásuk rosszabb, mint a dinódás detektoroké. A Microchannel Plate (MCP) tulajdonképpen egy channeltron mátrix, amellyel helyfüggően detektálhatjuk az ionokat.
6. Az adatgyűjtőrendszer A tömegspektrométer a spektrumokat időben folytonosan változó feszültségjelként állítja elő. Ahhoz hogy ezt egy számítógép kezelni tudja, digitalizálni kell, vagyis a feszültséget digitális értékekké kell átalakítani. Ennek a feladatnak az elvégzésére analóg-digitális (A/D) átalakítókat használunk. Ez úgy működik, hogy a bemenő jelből jól megszabott időközönként
14
mintát vesz, és ezt átalakítja egy kódsorozattá. Az analóg jelek digitalizálása során a cél az, hogy egy analóg értéket a lehetőségek szerint egyértelműen azonosítsunk egy bináris kódsorozattal. Ahhoz hogy ez teljesüljön, az eredeti jelből a mintavétel megfelelő gyorsan kell, hogy történjen. Ezt a mintavételi sebességet szabja meg a Shanon-Nyquist-tétel, amely kimondja, hogy a tökéletes visszaállíthatósághoz egy jelből legalább a benne előforduló legnagyobb frekvencia kétszeresével kell mintát venni. A gyakorlatban impulzusszerű jelek esetén (amilyen a tömegspektrum is) elvárjuk, hogy legalább 3-5 mintavétel jusson egy csúcsra. A digitális technikában egy szám ábrázolása bináris számként, adott szóhosszal (adott számú bittel) történik. Egy A/D átalakító felbontása is attól függ, hogy a folytonos feszültségjelet hány diszkrét értékre tudja átváltani. Ezt általában bitekben fejezik ki. Például egy 8 bites átalakító 28=256 különböző szinté alakítja a bemenő jelet. A bitszám (n) és a teljes feszültségtartomány (UMAX) ismeretében tehát kifejezhető az a legkisebb feszültségkülönbség (ULSB – Least significant bit- legkevésbé szignifikáns bit), amit az átalakító még észlelni tud:
U LSB =
U MAX 2n
Analóg
Digitális
feszültség
értékek
Idõ(folyamatos)
Idõ(diszkrét)
9. ábra: Digitalizálás
Digitalizálás után egy tömegspektrum felvétele történhet kétféle módon: vagy minden rendelkezésünkre álló adatot elmentünk-ilyenkor ún. profil spektrumot kapunk, vagy először feldolgozzuk az adatokat, és csak az így kapott spektrumot mentjük el. A feldolgozást általában számítógépes programok végzik és több lépésből áll.
15
Legelőször meg kell határozni egy nulla szintet vagy alapvonalat, aminek ismeretében majd ki tudjuk számítani az egyes csúcsok integrálját. A nulla szint megfelelő megválasztása matematikailag meglehetősen bonyolult. Míg egy ember szemmel könnyen megállapítja azt a szintet, ami alatti értékeket zajnak tekint, számítógéppel ez már nehezebb. Vigyázni kell, hogy a szint ne legyen se túl magas (ekkor ui. tényleges csúcsokat is zajnak értelmezünk), se túl alacsony (ekkor viszont a zajt is csúcsként értelmezhetjük). Csúcsnak azt tekintjük, ami egy bizonyos számú pontot tartalmaz az alapvonal felett. Ezek után meghatározzuk a csúcsok súlypontját; ez adja majd meg a csúcs helyét a spektrumban. A csúcsok integrálját is kiszámítjuk, azokat a pontokat figyelembe véve, amelyek a nulla szint felett vannak. A súlypontot és az integrált minden csúcsra kiszámítva megkapjuk a centroid (centroid = súlypont) spektrumot. A spektrumot centroid – csúcsintegrál párokként mentjük el, kihagyva az alapvonal alatt lévő pontokat. Az előzőekben elmondottakból látszik hogy a profil spektrum információgazdagabb, ugyanakkor egy centroid spektrum tárigénye töredéke a profil spektrum tárigényének. A fenti elvek gyakorlati alkalmazását nagymértékben nehezíti, hogy a jeleket – mint minden elektromos jelet – több-kevesebb zaj terheli. Ezt megszüntetni nem, csak csökkenteni lehet. A zajcsökkentés néhány fontos eleme: Minél kevesebb lógó vezeték legyen a rendszerben, hogy a külső zajforrásokat feleslegesen ne tápláljuk a berendezésbe. A bemenetek lehetőleg differenciálisak legyenek, vagyis két feszültség különbségeként adódó jelet mérjünk, ekkor ui. a két vezetéken jelentkező zaj egymás hatását gyengíti.
7. A tömegspektrum A tömegspektrum7 egy olyan grafikon, amelyen az abszcisszán a tömeg/töltés értékek atomi egységekben,
az
ordinátán
pedig
az
intenzitások
találhatók.
Elpárologtatásnál
a
tömegspektrum kiegészítői az úgynevezett összionáram (Total Ion Current – TIC) és az ionkromatogram (Ion Chromatogram – IC) is. A TIC tartalmazza az ionáram változását az idő függvényében, így ez alapján láthatjuk, mikor párolog el egy anyag vagy komponens és megfelelő
sebességű
elpárologtatásnál
különböző
komponensek
szétválaszthatók/azonosíthatók Az IC egyes ionok időbeli intenzitásváltozását adja meg. Azonos anyaghoz tartozó ionok IC görbéjének lefutása azonos.
16
A KRATOS MS-80 tömegspektrométer jellemzése Laboratóriumunkban egy KRATOS MS-80 tömegspektrométer található. Ez a típus egy kétszeres fókuszálású mágneses analizátorral felszerelt készülék. A mintaadagolás történhet direkt mintabeeresztéssel vagy kapcsolt gázkromatográfon keresztül. Több ionforrással is használható: elektronütközéses forrás, kémiai ionizáció vagy gyorsatombombázás. Mi csak az EI forrást használjuk direkt mintabeeresztéssel. Tömegtartománya 4000 m/z-ig terjed, 1020000-es felbontással jellemezhető. Detektora diszkrét dinódás elektronsokszorozó. Eredetileg nem számítógépes adatgyűjtőrendszerrel való együttműködésre tervezték, hanem UV oszcillográffal történő spektrumfelvételre. Minden mérés oszcilloszkópon követhető. Később a KRATOS cég gyártott hozzá adatgyűjtőrendszert, ez azonban már régen nem működött, az utóbbi évben egy általános tömegspektrométeres rendszert használtak a laboratóriumban, azonban ez is elromlott. A berendezés teljes spektrum felvételére és egy-egy csúcs nagyfelbontású pontos tömegmérésére használható. Tömegspektrum felvételekor a mágneses indukciót változtatjuk időben exponenciálisan, csökkenő tömegszámok felé, ezzel a tömegcsúcsok szélessége nagyjából azonos a teljes tömegtartományban. A pásztázási sebesség viszonylag nagy, maximális értéke 0,2 s/dekád (az m/z érték ennyi idő alatt csökken a tizedrészére). A szkenek indítása történhet manuálisan, egy külső elektromos jelre, vagy automatikusan ismétlődve. Pontos tömegméréskor a mágneses indukció értéke rögzített, csak az iongyorsító-feszültséget változtatjuk az eredeti érték (4 kV) 100-40000 ppm-es környezetében. A tömegspektrométer egy, az elektromágnes indukciójával arányos analóg jelet (B), továbbá három, az észlelt ionok mennyiségével arányos jelet (I, 10xI, 100xI) szolgáltat. A B jel 0-tól 10 V-ig terjedhet; az ionjelek -6–+6 V között mozognak.
Rendelkezésre álló hardware/software 1. Az adatgyűjtő-kártya A National Instruments által gyártott, NI PCI-6014 kódjelzésű eszközt használtuk a tömegspektrométerrel történő kommunikációra. Ez 16 csatornás analóg bemenettel, két analóg kimenettel és 8 digitális bemenet/kimenettel rendelkező PCI csatolófelületű
17
számítógépes bővítőkártya. Az analóg bemenetek 16 bit felbontással és maximum 200 000 minta/s mintavételezési sebességgel rendelkeznek. Az analóg kimenetek úgyszintén 16 bitesek, 10000 minta/s mintavételezési sebességgel. A digitális I/O csatornákhoz 24 bites időalap párosul. Az eszközön csak digitális trigger van, ez azt jelenti, hogy a mérést csak külön digitális jellel (felfutó vagy lefutó éllel) lehet indítani, a mért jel adott szintjével (ez lenne az analóg triggerelés) nem.
10. ábra: NI PCI-6014 felépítése / blokkdiagram
A kártya blokkdiagramját a 10. ábra mutatja. Az analóg bemeneti rész a bal felső sarokban található. 16 analóg bemenet van, differenciális mérés esetén 2-2 bemenet alkot egy csatornát (+ ill. – előjellel), így 8 csatornát tudunk mérni. Mivel a kártya csak egy A/D átalakítóval rendelkezik, a csatornák számától függ az egyes csatornán elérhető mintavételi sebesség, az egy csatornán elérhető legnagyobb érték a már említett maximum és a csatornák számának hányadosa. Az analóg multiplexer (Analog Mode Multiplexer) időben egymás után mintavételezi a bemeneti csatornákat. A multiplexer után változtatható erősítésű műszererősítő található (PGIA – Programmable Gain Instrumentation Amplifier). Ez pontosan az érkező jelek különbségét méri. A PGIA kimenete jut a digitalizáló egység bemenetére. A feszültségarányos bináris kód egy memóriaegységbe kerül (FIFO=First-infirst-out: először be–először ki memória), majd a belső adatbuszra. Az adatbuszról a jelek a
18
PCI illesztőn keresztül jutnak a számítógép memóriájába. Külső triggerelés a PFI vonalakon keresztül lehetséges, melyek az ábra bal oldalán, középen láthatók.
2. A LabView rövid ismertetése A LabView egy negyedik generációs grafikus programozási nyelv, amit a National Instruments fejlesztett ki 1986-ban. Ezt a nyelvet elterjedten használják mérési feladatok elvégzésére és hardware közeli programozásra. A könnyen használható grafikus felület miatt ideális választás, programozásban kevésbé jártas kutatók számára. A felhasználási területei többek között a gyári terméktesztelés és minden olyan eset, amikor valamilyen készülék felügyeletére vagy vezérlésére van szükség. Az eszközökkel való kommunikáció egyszerűen megvalósítható a mellékelt meghajtók segítségével. LabView-ban a programozás egy ikonkészlet segítségével történik. Ezek az ikonok jelölik a LabView grafikus objektumokat, melyek a felhasználói felületén jeleníthetők meg, és függvényeket. Egy LabView program két részből áll: az előlapból és a blokkdiagramból, melyek külön ablakban szerkeszthetők. Az előlapon találhatjuk a gombokat, kijelzőket, adatbeviteli mezőket, melyek nagyon hasonlítanak az igazi műszerek kinézetére. Ez az, amiért egy LabView programot VI-nak hívnak (Virtual Instrument = virtuális mérőeszköz).
11. ábra: LabView függvények
19
12. ábra: LabView VI előlap
Példaként be szeretnék mutatni egy egyszerű LabView programot, amely előlapja a fenti ábrán látható. Ez a program egy jelet állít elő a bemeneti paraméterek függvényében, melyeket az ábra bal oldalán látható beviteli mezőkben tudunk megadni. A jobboldalon látható „Waveform” feliratú objektum egy kijelző, amely a generált jelet mutatja, akárcsak egy oszcilloszkóp kijelzője. Egy program futtatásához a menü alatt található fehér nyílra kell kattintani. Jellegzetes tartozéka a LabView programoknak a „Stop” gomb, amelyre kattintás esetén a VI-ok végrehajtása befejeződik.
13. ábra: LabView VI blokkdiagram
A 13. ábra mutatja az előbb említett program blokkdiagramját. A különböző ikonok egy része az előlapon látható elemeket jelölik, így ugyanazt a feliratot kapják. Az ábra közepén látható ikon egy beépített LabView „sub-vi”-t jelöl. Ez tartalmazza azt a kódot, amely a jelet generálja.
20
Vizsgált anyagok Az előző dolgozatomban1 leírtam számos ferrocénszármazékot. Három családba tartozó vegyületekkel foglalkoztam: ferrocenil-pirazolok, -pirazolinok és -kalkonok. A „kalkon” kifejezést egy egész vegyületcsalád megnevezésére használják; jellemző rájuk, hogy a molekulában 1, 3-diaril-prop-2-en-1-on-molekularészlet található. Több olyan vegyületet is megvizsgáltam, amelyet az Általános és Szervetlen Kémiai Tanszéken működő MTA Szerkezeti Kémiai Kutatócsoportban állítottak elő. Az alábbi táblázatokban összefoglalom a vizsgált vegyületeket. Fc a ferrocenil, az Ac az acetil, a Ph a fenil csoportot jelöli. A „Glü” jelöli a glüko-piranózt, a „GlüAc” pedig a tetraacetil-glükopiranózt. A szubsztituált fenilgyűrű minden esetben para helyzetben kapcsolódik a molekula többi részéhez.
R2
R2 H
N
R1
N
R1
R3
N N
R1
R2 H
R3 Pirazolin
Pirazol
O
Kalkon
1. Táblázat: A vizsgált anyagok Pirazolinok és pirazolok R1 R2 R3 pirazolin Fc Ph Ph x Fc Ph C6H4-NO2 x Fc Ph Ac x Fc C6H4-OGlüAc Ac x Fc C6H4-OGlüAc Ph x Fc Ph H x Fc C6H4-OAc Ph Fc C6H4-OGlüAc Me x C6H4-OGlüAc Fc Me x Kalkonok R1 Fc Fc C6H4-OAc Fc C6H4-OH Fc Fc Fc
R2 Ph C6H4-OAc Fc C6H4-OH Fc C6H4-OGlüAc C6H4-OGlü C6H4-NH2
21
pirazol x x x x x x x
A tömegspektrometriai vizsgálatok irodalmi előzményei A ferrocéntartalmú kalkonok eddigi tömegspektrometriás vizsgálata nem különösebben kiterjedt. Nesmeyanov és munkatársai elektronütközéses tömegspektrumokat vettek fel néhány ilyen típusú vegyületről 8 . Munkájuk során olyan ferrocenil-kalkonokat vizsgáltak, ahol a másik szubsztituens fenil, p-Br-fenil vagy p-metoxi-fenil. Ezek közül az R1=Fc, R2=Ph a jelen munkámban is szerepel. Az általuk talált főbb fragmensek és vesztések: a molekulaion minden vegyület esetén megjelenik. Látható továbbá ciklopentadienil vesztés, valamint CpFe+ és Fe+ megjelenése is. Az általuk felvett spektrumokban nem jellemző az Fc-C+=CH, hanem az FcH+ ion megjelenése. 2. Táblázat: Nesmeyanov és tsai. átlal vizsgált vegyületek R1 Fc Fc Fc Ph C6H4-OMe C6H4-Br
R2 Ph C6H4-OMe C6H4-Br Fc Fc Fc
Mendez 9 , ill. Maynadié 10 és munkatársai szempontunkból kevésbé érdekes vizsgálatokat közöltek: ezekben FAB módszerrel mért molekulatömeget használtak ilyen vegyületek azonosítására. A ferrocéntartalmú pirazolinokról Nesmeyanov és munkatársai közöltek értékes munkát11. Az általuk tárgyalt vegyületekre jellemző ionok: az [M-H]+ és [M-H2]+ néhány esetben megjelenik (18 vegyület közül [M-H2]+ 6 esetben), de 10% körüli intenzitással. Jellemző a ciklopentadienil vesztés, valamint az FcCN+ megjelenése. Tudomásom szerint ferrocéntartalmú pirazolokról eddig nem jelent meg tömegspektrometriai munka. A
vizsgált
vegyületekhez
távolabbról
kapcsolódó
anyagok
ferrocéntartalmú vegyületeket rendkívül kiterjedten vizsgálták
közül 12
a
szubsztituált
. Az alapvegyület
fragmentációja rendkívül egyszerű: intenzív molekulaion mellett a ciklopentadienil (Cp) ligandumok egymás utáni elvesztéséből áll, más típusú ionok (pl. FeC3H3+[m/z=95],
22
FeC3H2+[m/z=94], FeC2H+[m/z=81]) intenzitása kicsi. A szubsztituált vegyületekre is elsősorban a szubsztituált Cp-gyűrű kilépése jellemző, de acetilénvesztések, sőt speciális átrendeződési reakciók is fellépnek, pl.
+
O
CH3 Fe
+
O
+ CH3
Fe
CH3
Fe
A molekulaion általában nagyon intenzív, egyszerű molekulákban ez a bázision. Kivételek ott lépnek fel, amikor a szubsztituens nagyon erősen fragmentáció-irányító (pl. telített szénatomhoz kapcsolódó OH-csoportot tartalmaz). A különböző szubsztituált pirazolok tömegspektrumát is alaposan vizsgálták 13 . Ezek molekulaionja is intenzív. A váz fragmentációját túlnyomórészt meg lehet magyarázni H-, HCN- N2-, ill. C2H2-vesztések egymásutánjával. Ha a szubsztituens fragmentáció irányító hatása jelentős, akkor az erre jellemző fragmentációs folyamatok is megjelennek (pl. nitrovegyületnél 16-, 30-, 46-vesztés, acetil-szubsztitúciónál 42- vagy 43-vesztés, ill. m/z=43as ion).
23
Célkitűzések Célom volt egy olyan tömegspektrometriás adatgyűjtőrendszer fejlesztése, amely egyszerűen adaptálható tetszőleges rendszerhez, mivel általában az adatgyűjtő rendszer romlik el először. Ennek a rendszernek kényelmesen kezelhetőnek kell lennie, hogy rutin feladatok elvégzésére alkalmas legyen: napi 10-15 minta mérését el lehessen végezni. Feltétel továbbá az egyszerű kalibráció és más rendszerekkel való kompatibilitás. Ennek érdekében lehetséges kell legyen az adatok számos formátumban történő mentése. További cél volt, hogy a korábban előállított vegyületek szisztematikus tömegspektrometriai vizsgálatát elvégezzem. Ez azért fontos, hogy a későbbiekben új vegyületek azonosításánál az NMR méréseket tömegspektrometriás mérésekkel lehessen alátámasztani, valamint olyan minták is vizsgálhatók legyenek, amelyek esetében az NMR nem ad használható információt (szennyezett és kismennyiségű (<1 mg) minták). A szisztematikus vizsgálatok alapján spektrális szabályszerűségeket kívántam felállítani, ami lehetővé teheti ismeretlen minták esetén azonos tömegű, de eltérő szerkezetű vegyületek megkülönböztetését (pl. fordított R1/R2 szubsztituens-sorrend a pirazol-, ill. pirazolinvegyületekben).
24
Adatgyűjtőrendszer fejlesztése Az adatgyűjtőrendszer fejlesztésének első lépése a tömegspektrométer és a számítógép közötti kapcsolat felépítése. A KRATOS MS-80 tömegspektrométer kimenő jelei a mágneses indukcióval arányos B, továbbá az ionjelek I, 10xI és 100xI. Ezek a jelek bipolárisak, mivel eredetileg tükrös galvanométerrel való használatra tervezték a tömegspektrométert. Azért ezeket a jeleket használjuk, mert túlfeszültség ellen védve vannak, viszont az adatgyűjtőkártya bemeneteinek nincs védelme. Szükségünk van továbbá egy időzítő jelre, amit az oszcilloszkópról veszünk. Ezeket az adatgyűjtőkártya megfelelő bemeneteire kapcsoljuk. A továbbiakban a programunk feladata e jelek kezelése és az adatok mentése. A mérés úgy történik, hogy a spektrométer időben ismétlődően, automatikusan végigpásztázza a beállított tömegtartományt. A pásztázás sebességét 1 vagy 3 másodperc/dekádnak választjuk. Az első, spektrum felvételére már alkalmas megoldás egy egyszerűsített program volt, amely az adatokat szkenenként (pásztázásonként) egy-egy szöveges fájlba írta ki. Ez azt jelentette, hogy minden adatpontot tárolunk (úgynevezett „raw”=nyers spektrumot), de nagy hátránya ennek a megoldásnak, hogy óriási tárigénye volt. A mintavételi frekvenciát 5 kHz-nek választva 1 s/dekádban is jó minőségű spektrumot lehet felvenni. Így egy szken adatai, ha csak a B-t, az ebből számított tömegszámokat és az egyszeres ionjelet (I) írjuk ki, 0,75 MB helyet foglal; egy átlagos mérés legalább 100 szkenből áll, tehát legalább 75 MB a tárigénye. Nem állt rendelkezésünkre megfelelő tömegspektrometriai program ennek a nagy adatmennyiségnek a kezelésére, ezért az adatokat az Origin nevű tudományos programmal dolgoztuk fel. Egy ilyen spektrumot mutat a 14. ábra. Jól látható, hogy a spektrum a csúcsfeliratok kuszasága miatt nehezen értékelhető.
25
/V ION
U
429
4
2 9 5 .9
2
2 7 .6 3 1 .7 44 23
7 7 .3
2 8 0 .9 224 3 8 5 .9 1 9 32. 16 3 . 12 32 95 3 . 9 3 6 9 .9 1 3 3 . 3 2 6 6 . 9 3 0 93 .2936 4. 931 5. 85 . 9 3 9 5 4 8 16 .1274711.528. .252122.91008672.. 112 2 1 2113.134 4. 31 . 91 4
0 0
200
m /z (a to m i e g y s é g )
400
K S 3 :0 5 0 5 0 6 0 2
14. ábra: Originnel készített tömegspektrum
A
készülék
kalibrációja
is
nehézkes
volt.
Előnye
az
ilyen
formában
történő
adatfeldolgozásnak, hogy a kétszeres töltésű és a metastabil ionok is felismerhetők a spektrumban. Erre példák a következő ábrákon láthatók. Az alábbi ábrán két intenzív csúcs látszik, 202,1 és 209,5 tömegszámnál. Ezek a 404, illetve 419-es tömegű, kétszeres töltésű
U
ION
/V
ionok.
0.2
202 .1
209 .5
202 .6
201 .5 2 0 200 1 .6
203 .1
209
210 .1 210 .6
0.0 200
208
m/z (atomi egység)
15. ábra: Kétszeres töltésű ionok
A 16. ábra két metastabil iont mutat, melyek közűl a 266,76-nál található bizonyíték a 296-os fragmensből történő metilvesztésre (266,76≈ 2812/296).
26
U ION / V
2 9 4 .9
M e ta s ta b il io n o k 263 299 0 .0 3
2 6 4 .92 6 7 .9 264
2 7 9 .9
2 8 3 .9
0 .0 0 270
280
290
300
K S 3 :0 5 0 5 0 6 0 2
m /z (a to m i e g y s é g )
16. ábra: Metastabil ionok
A spektrumok feldolgozását akartam megkönnyíteni, ehhez az adatokat olyan formában kell elmenteni, hogy a legtöbb tömegspektrometriai adatfeldolgozó program be tudja olvasni. Elterjedten használják a JCAMP-DX fájlformátumot (JCAMP Chemical Spectroscopic Data Exchange Format, továbbiakban JDX), ezért mi is ezt választottuk. Ebben a formátumban csak olyan adatpontokat mentünk el, amelyek a spektrumban valamelyik cúcshoz tartoznak, így töredékére csökken a tárigény. Egy mérés adatai legtöbbször kevesebb, mint 1 MB helyet foglalnak. Az ilyen fájlformátumban felvett spektrumok előnye, hogy olvashatóbb spektrumok készítésére van lehetőség. A 14. ábrán bemutatott Originnel készített spektrum JDX változatát mutatja a 17. ábra. 429
100%
296
281 194 42 20
40
63 77 90 60
80
100
133 120
140
385
224
175 160
180
411 200
220
240
260
280
R3: 24172 13% m( 53-65) f8419.jdx * KS3/Túrós Gyuri
300
320
17. ábra: JDX fájlformátumban feldogozott spektrum
27
340
360
380
400
420
440
A felhasználói felület A program felhasználói felületét a 18. ábra mutatja. Három grafikus kijelző segít a mérés követésében. Az ábra jobboldalán találhatók a „Centroid” és a „Profile” feliratú kijelző, melyek a centroid, illetve raw spektrumot mutatják. Mindkettő felett található egy-egy gomb, amivel be, illetve ki lehet kapcsolni az általuk megjelenített adatok mentését. Ily módon centroid, illetve raw spektrumot is tudunk menteni egyszerre. Kihasználjuk mindkét formátum előnyeit, ugyanis csak akkor mentünk raw formátumban, ha a spektrum jó minőségű. A bal felső sarokban található táblázat az aktuális spektrumban azonosított csúcsok centroidját és azok intenzitását mutatja. Alatta találhatók a „threshold” és „width” mezők, amelyekben megadható paraméterek alapján azonosítja a számítógép a csúcsokat. A „threshold” paraméter az adatgyűjtő rendszerek tárgyalásánál ismertetett nulla szintet jelenti, míg a „width” a csúcs minimális szélességét adja meg. Az ábrán, a „B” feliratú kijelző alatt található mezőkben, a felhasználó megadhatja milyen módon szűrjük a B jelet; a „filter type” mező a szűrő típusát adja meg és ennek függvényében használhatjuk a „low cutoff” (alsó határfrekvancia) és „high cutoff” (felső határfrekvancia) mezőket. A csúcskeresést és a szűrést részletesebben a blokkdiagram szakaszban tárgyaljuk.
28
18. ábra: Programom felhasználói felülete
A felhasználói felületen megadhatjuk a spektrumok elmentési könyvtárát és fájlnevét, valamint a JDX formátumban való mentés esetén egy tetszőleges címet, ami alapján később egyszerűen azonosítható a mért minta, rendszerint a beküldő neve és a minta jele. Erre szolgálnak a „Path” - elérési út, vagyis a könyvtár -, a „Filename” – a fájlnév – és a „Title”, azaz a cím mezők. Ehhez a program verzióhoz egy kalibráló ablak is tartozik, amelyet az alábbi ábrán látható „Show Calibration Window” feliratú gombbal jeleníthetünk meg. A felhasználói felületen a „Profile” feliratú kijelző alatt megtalálható még a kalibráló koefficiensek beolvasását szolgáló „Coeff read” gomb is.
29
19. ábra: A kalibráló ablak
A „A kalibráló ablak” feliratú ábrán alul látható a „Coeff File Path” mező, ahol megadhatjuk, hogy hová mentse el a program a kiszámított koefficienseket. A kalibráló ablakban jobboldalon található „Update DATA” gomb kétállapotú: lenyomott állapotban frissíti a megjelenő spektrumot, felengedett állapotban viszont a spektrum nem frissül, a csúcsok helye és alakja nem változik, így alkalmas a beállított kalibráció rögzítésére. Tehát kalibrálni csak akkor lehet, ha az „Update DATA” gomb felengedett állapotban van. Három csúcsra tudunk kalibrálni, ezek között fülekkel választhatunk (ld. közvetlenül a grafikon fölött). Ez azt jelenti, hogy három spektrumon kiválaszthatunk egy-egy csúcsot, kinagyítjuk, majd a kurzort beállítjuk a csúcs közepére. A spektrum alatt található „Peak Expected Location” feliratú mező, ahová a csúcs várt helyét kell beírni. Ha mindhárom csúcs helyét beállítottuk, a „Peaks Locked” gomb megnyomásával a program elvégzi a kalibrációt és átadja a koefficiensek értékeit a főprogramnak. Az „Update DATA” gomb megnyomásával a spektrum frissül, ábrázolásához a program az új koefficienseket használja. Így ellenőrizhető, hogy a kiválasztott csúcsok a megfelelő helyen vannak-e. Amennyiben igen, kiléphetünk az „Exit SUB” gombbal, visszatérve a fő felhasználói felülethez. Nemleges válasz esetén újra kalibrálhatunk, a már ismert módon.
30
A blokkdiagram RAW Kimeneti szûrõ
Profile kijelzõ
RAW Fájl Felhasználói engedély
Ion jel
MS
10x, 100x
Kompozit ion jel
Csúcskeresés
B
Szûrés
B
m/z = f(B)
m/z
Paraméterek
Centroid kijelzõ JDX Kimeneti szûrõ
Rendezett csúcs tömb
JDX Fájl
Felhasználói engedély
Kalibráló rendszer
20. ábra: A program vázlatos felépítése
A LabView nyelvben, a programok futásakor a szerint hajtódnak végre a műveletek, hogy merre áramolnak az adatok. Az fenti ábrán szereplő nyilak is az adatáramlást jelenítik meg. A tömegspektrométer felől érkező jeleket két csoportra bontjuk: ionjelek és a mágneses indukcióval arányos B jel. Kezdetben megpróbáltuk felhasználni a tízszeres és százszoros ionjelet a dinamikus tartomány növelésére, de mint kísérleteinkből kiderült, a zaj is arányosan növekedett a jel intenzitásával. Ez alapján elmondhatjuk, hogy a zaj nem külső forrásból származik, hanem a tömegspektrométerből, ezért a későbbiekben csak az egyszeres ionjelet használtuk. Ahhoz, hogy a kapott jelekből tömegspektrumot kapjunk, a B jel értékeit át kell alakítani tömegszámmá. Még mielőtt ezt megtennénk, egy szűrést alkalmazunk. Ezzel a célunk az esetleges nagyfrekvenciás zaj eltávolítása, és ezáltal a mérések reprodukálhatóságának növelése. Ehhez egy Bessel aluláteresztő szűrőt használunk, melynek paramétereit a felhasználó módosíthatja. A szűrés után következik a B m/z értékekké való átalakítása. Munkánk során kiderült, hogy az exponenciálisan lecsengő B jelet jól lehet közelíteni egy négyzetes függvénnyel, így a konverziós függvény a következő alakban írható fel: m / z = x*B2+ y*B+z
ahol x, y, z a kalibrációs koefficiensek, B pedig a mágneses indukcióval arányos feszültségérték. A koefficiensek meghatározására szolgál a kalibráló rendszer.
31
Paraméterek
Spektrumok
Ion
kijelzõi
jel
x
B1 m/z-B átalakítás
B
B2
Paraméter illesztés
2
3
Paraméter tömb
Fájl
m/z3
1
y z
B3 m/z2
m/z
m/z1
Fõprogram
Csúcsok várt helye
Csúcsok, m/z
Felhasználó
21. ábra: A kalibráló rendszer működése
A 21. ábra mutatja a kalibráló rendszer működését. A főprogramtól kapott ionjel és tömegszám-adatok (m/z) alapján a program kijelzi a spektrumokat. B és m/z alapján, a felhasználó által a spektrumokon kijelölt pontoknak megfelelő B értéket kiszámolja, majd a pontos tömegszám ismeretében ezekre egy másodrendű polinomot illeszt. Az így kapott paramétereket egy tömbbe foglalja, amit a főprogramnak visszaad, valamint fájlba is kiír. A felhasználó végezhet újabb kalibrálást vagy visszatérhet a főprogramba. A B jel m/z értékekké történő átalakítása után, a főprogramban következik a spektrum csúcsainak az azonosítása és tömbbe való kiírása. Annak ellenére, hogy a LabView beépített csúcskereső függvénnyel rendelkezik, a feladat megoldása közel sem volt egyszerű. A csúcskereső függvény a megfelelő tömegszámok helyett, a csúcs indexét adja vissza, ráadásul gyakran tört indexeket. Ezen indexek megfeleltetése a tömegszám skálával egy saját fejlesztésű függvénnyel történik. Az adatok mentése két formában történhet: RAW vagy JDX fájlként. A JDX kimeneti szűrő, úgyszintén saját fejlesztés, a spektrumokat tömegszám-intenzitás formában menti el. A régi programverzióval készült spektrumok feldolgozását megkönnyítendő, a JDX szűrő felhasználásával egy fájl konverziós programot is készítettem, ami a RAW formátumban felvett spektrumokat alakítja JDX fájlokká.
32
Tömegspektrometriai vizsgálatok A továbbiakban szó lesz többek között, az előző diákköri dolgozatomban leírt vegyületek tömegspektrometriai vizsgálatáról. Ezen vegyületeken kívül az újonnan előállított vegyületek vizsgálata is témája jelen dolgozatomnak. Direkt mintaadagolást használtam a vegyületek bevitelére a spektrométerbe. A tárgyalás alapját képező spektrumok EI forrást használva készültek és a legnagyobb intenzitású csúcsra (báziscsúcs) normáltak, ennek intenzitását tekintve 100-nak. A vizsgálatok elvégzéséhez a korábban leírt KRATOS MS-80 típusú tömegspektrométert használtam. Az anyagot kvarc bot végén juttattam a spektrométerbe, a mintatartó fűtése nélkül. A forrás hőmérséklete 200-240°C között változott, a mintát csak hősugárzás fűtötte. A méréseket a leírt, saját fejlesztésű adatgyűjtőrendszerrel végeztem. Kalibráláshoz pba-t (perfluor – tributilamint) használtam referenciának, a spektrumából az 502, 219, 69-es csúcsokat választva az új paraméterek megállapítására (ld. kalibráció). A mérések során a legintenzívebb spektrumokról RAW formátumban is készült mentés. Néhány vegyületet az EGIS Gyógyszergyár Rt. által a Kémiai Intézet Tömegspektrometriai Laboratóriumának ajándékozott FISONS TRIO 1000 spektrométeren mértem. A mérés körülményei: az anyag bevitele programozottan fűthető kvarcboton, az ionforrás hőmérséklete 200-230°C. A mintaadagoló fűtési programja: 2 percig 50°C, utána forráshőmérsékletig percenként 25°-al emelkedik a hőmérséklet. A mérési program: 0,4 - 0,5 s/pásztázás, 0,2 másodperc pásztázások közötti idő. A kalibráló anyag itt is pba, az adatgyűjtőrendszer a Masslab nevű program. A következő oldalakon az általam vizsgált vegyületek spektrumai láthatók. A tárgyalást a kalkonokkal kezdem, majd a pirazolinok és pirazolok következnek. A „Glü” jelöli a glükopiranózt, a „GlüAc” pedig a tetraacetil-glükopiranózt. Minden bemutatott spektrumon feltüntettem a hozzá tartozó vegyület képletét. Az egyes családokba tartozó vegyületek fragmentációját a spektrumok után tárgyalom.
33
Kalkonok 100%
267 O
O
H
O H3C
H
374
Fe
332
121
42 56 20
40
60
80
181
153
89 100
120
140
160
213
180
200
220
237 240
303 260
280
300
320
340
360
380
R3: 84556 23% m( 10-13) f8419.jdx * MV-228 74%
374
H
332
O
O
O H3C
H
Fe
267 121 56 78 40
60
80
100
120
186
153
129
94
140
160
213
180
200
220
239 240
303 260
280
300
320
340
360
380
R3: 11048 18% m( 25-28) f8419.jdx * MV-239
100%
267
O
OGlüAc
H
332
H
374
Fe 662
109
169
56 50
213 100
150
200
303 250
300
R3: 112087 10% m( 69-76) f8419.jdx * MV-218
416 350
34
400
560
458 450
500
550
602 600
650
267
54% O
332
OGlü
H
H
Fe
358 121
89 40
60
80
100
181
120 140
160
213 237
180
200 220
419
380 400
420
494
448
*10
303
240
R3: 17369 25% m( 117-129) f8419.jdx * MV-221
388
260 280
300 320 340
360
440
460 480
500
267
100% O
OH
H
332
H
Fe
44 40
121
56
60
145
89 80
100
120
140
165 181 160
214
180
200
220
237 240
286 260
280
303 300
320
R3: 10391 22% m( 180-184) f8419.jdx * MV-227
93%
332
H
OH
O
H
Fe
267
121 56 40
60
80
149
129
91 100
120
140
166 160
194 180
R3: 10074 23% m( 64-67) f8419.jdx * MVFc-279
35
200
213 220
239 240
303 260
280
300
320
20%
266
O
NH2
H H
331
Fe
44 65 56 40
60
83
80
180
120 100
152 165
120
140
160
R3: 19535 41% m( 171-178) f8419.jdx * MV-Fc-266/A/1
212 180
200
238
220
240
302 260
280
300
320
A 22. ábra mutatja a ferrocenil-kalkonok általános fragmentációs sémáját. A molekulaion minden vegyületnél megfigyelhető volt, de tetraacetil-glükopiranóz tartalmú anyagok esetén csak kis intenzitással. Az ábrán látható X vesztés jellemző a fenil gyűrűn lévő szubsztituensre. Peracetilezett glükózt tartalmazó vegyület esetén a 288 (acetilvándorlás a fenolos oxigénre, majd ebből ketén vesztés, amit metastabil ion is bizonyít) és 330 vesztés, a glükopiranózra a 162 vesztés jellemző. O-acetil vegyületek ketén (-42) vesztést mutatnak, amelyet a spektrumban megjelenő metastabil ion is alátámaszt. H
R2
R1
O
H
-X, a fenilgyûrûn lévõ funkciós csoporttól függ
R 1'
CH+ 2
-65 -30
-29
R 2'
-28
-56 -26 A feltüntetett ionok és vesztések megjelennek a spektrumban
22. ábra: Kalkonok fragmentációja
36
O+
Amin- és hidroxil-csoportot tartalmazó vegyületeknél a további fragmentációs folyamatok közvetlenül a molekulaionból jelentkeznek. Az ábrán feltüntetett R1’ és R2’ a megfelelő R csoportokból visszamaradó részt jelöli, a már említett vesztések után (pl. –C6H4-OAc-ból ketén vesztés után –C6H4-OH lesz). Jellemző a ferrocenil kalkonokra a 65-ös vesztés, ami egy ciklopentadienilnek felel meg, és a legtöbb esetben metastabil ionként is megjelenik. A fragmentáció 30-as tömegű fragmens vesztésével folytatódik, majd Fe vesztést látunk (-56). Ha R1 ferrocenil, a spektrumra a 181-es fragmension megjelenése jellemző, ha R2 ferrocenil 186-os csúcsot láthatunk. A ferrocenil csoport helyzetére jellemző még a 237/239 csúcsok aránya, R1 = Fc esetén a 237-es, míg R2 = Fc esetén a 239-es csúcs intenzivebb.
Pirazolinok 90%
404
N N
Fe
186
121 56
40
60
77 91 80
133 100
120
140
235
202
153 160
212
180
200
220
R3: 18041 16% m( 242-254) f8419.jdx * MV-FC-251
37
240
314
289 260
280
339 374
300
320
340
360
380
400
100%
372
N N
307
Fe O
163
CH3
269
121
204
56 43
179
79 91 103
40
60
80
100
120
140
160
180
248
212 200
220
240
329
278 260
280
300
320
354 340
360
R3: 19797 13% m( 133-135) f8419.jdx * MV-JO-14/A
419
41%
N N
Fe
O
N
-
+
O
451 103
56 40
60
80
100
121 168 120
140
160
186
180
212
200
220
250 240
R3: 13781 30% m( 90-101) f8419.jdx * MV-JO-250
354 314
269
260
280
300
320
340
360
380
400
420
100%
440
330
N N H
Fe
186 212
121 56 77 20
40
60
80
134
91 106 100
120
140
R3: 81018 19% m( 23-31) f8419.jdx * JO-41/A
161 160
227
178 180
38
248 200
220
240
265 260
300 280
300
320
340
100%
OGlüAc
N N
Fe O
163
109
204
60 50
100
150
430
365
200
250
300
400
450
OGlüAc
43%
500
674
616
480 514
350
R3: 82027 14% m( 3-7) f8419.jdx * MV-JO-217
718
388
323
269
CH3
550
600
650
700
462 420
N N
Fe
496
750 538
98
*10
186 303
50
100
150
200
649 680
250
300
355 350
400
R3: 11601 24% m( 78-91) f8419.jdx * MV-JO-17/A/2
39
450
500
550
600
650
700
750
MV -J O-2 84 / A 05093009 738 (8.638) Cm (693: 776) 43 100
x 16
Scan EI+ 9.17e3
OGlüAc
N N
Fe
H3C
360
690
%
169
109
186
28 44
121
97 29 45 56
358
127
85 98
691
361
81 139
212 187
145
688 386
227
239 266
0
293
357
316
388 412 446
384
544
456 461 486
556
570 589
630 638
672
692 m /z
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
MV -J O-284/ B .Zsoldosné
600
650
OGlüAc
05093010 727 (8.511) Cm (700: 761) 43 100
S can E I+ 2.38e4
N
CH3
N
Fe %
109 121
360
169 28 29
127 44 56 60
81
358
97
85 98
690
211 139
165
691
186 227
251
361
293 267 268 294 331 357
362
388
402
0 50
100
150
200
250
300
350
40
400
414 444 450
472 486 503 500
536 558 572 588 597 550
600
630 637 650
688 692 686 m /z
A ferrocenil-pirazolinok esetében nem adaható meg egy általános fragmentációs séma. Ezen vegyületek spektrumában megtalálható az Fc-CH=N+ ion (m/z = 212), valamint a R-C6H4CΞN vesztés, ahol az R a 3-as helyzetben lévő fenil-csoport szubsztituensét jelöli. A spektrumban látható még a 186-os ion is, ami FcH+-nak, valamint a 121-es, ami CpFe+-nak felel meg. Gyakori a 65 vesztés, de 121 vesztést nem látunk. A ferrocenil helyzetének megkülönböztetésére alkalmas a 212-es csúcs, valamint a 237/239 csúcsok aránya. 5ferrocenil vegyületek esetén 212-es iont látunk és a 237-es csúcs az intenzívebb, míg 3ferrocenil vegyületeknél 211-es iont látunk a spektrumban, és a 239-es csúcs az intenzívebb. A glikozilezett vegyületeknél a 288 és 330 vesztés megfigyelhető, N-acetil esetén 43 vesztést látunk. Ferrocenil-pirazolinok esetén a vegyületek többségére jellemző, hogy a spektrumban a molekulaionból 2 vesztést látunk. A tömegspektrometriában nehezen magyarázható ez a fragmentáció és az [M-2 ]+ ionkromatogramjának lefutása eltér a molekulaionétól. A fragmentáció magyarázata további vizsgálatokat igényel.
Pirazolok 100%
OGlüAc
420
750
N N
Fe
648
462 496 109
169 210
538 575
632 *10
355 270
50
100
150
200
250
300
350
400
R3: 61164 14% m( 22-24) f8419.jdx * MV-JO-17/B/2
41
450
500
550
600
650
700
750
404
100%
N N
Fe
66 80 40
60
80
103 100
121 120
153 140
180
160
180
235
202 200
220
339 254
240
R3: 22887 22% m( 26-30) f8419.jdx * MVFc/263
283 300
260
280
300
374 320
340
360
380
400
449
100%
N N
419
Fe
+
O
56
39 20
40
121
77
60
80
100 120
-
N
O
152
222
178
250
403
354
281
140 160 180 200 220 240 260 280 300 320
R3: 22357 19% m( 36-42) f8419.jdx * MV-JO-43/A//Zsoldosné
340 360 380 400 420 440 460
MV JO-4 4/A.Zs oldosné 05092106 541 (5.436) Cm (500: 573) 43 100
Scan EI+ 3.06e3
O O CH3
462
N N
Fe %
121 420 463
44
56 77
39 0 40
51 65 60
69
152
78 89 95 80
100
119 133 120
180
139
165 178 181
140
160
180
205 200
210 222 235 242 220
267
240
42
260
270
297 299 301 280
300
326 320
353 340
416
355 360
390 380
414 400
421 460 464
422
m/z 420
440
460
MV -JO-63/1x(2-4).Zsoldosné 05093011 273 (3.223) Cm (218: 294)
Scan EI+ 1.17e4
328
100
N N
Fe H3C
O
% 370
178 121
56
43
42 32
329
44 51
152 57
77 81
94 95
6576
115
176
133 141
164 166
179 180
197
0 40
60
80
100
120
140
160
371
263 234
180
207
215
200
232 239 241 261 264 289 298 271
220
240
326
299
260
280
300
300
325
330 352
320
354
368 372 m/z
340
360
MV JO-52/A/1.Zs oldosné 05092108 810 (9. 478) Cm (757: 858) 43 100
Scan EI+ 5.80e3
x 16
OGlüAc
44
N N
Fe
H3C
688
% 358
28
169
109 29
45
97
41 60 69 81 85
121
359 126 139
357 145 179
0 50
100
689
400
150
207 200
238 263 288 291 250
300
328 356 350
394
401
360
668
412 429
690
701
724 734
400
43
450
500
550
600
650
700
m/z 750
MV J O -5 2 /B /1 .Zs o ldosné 05092110 810 (9. 492) Cm (769: 852 ) 43 100
OGlüAc
Scan EI+ 2.78e4
358
N N
CH3
Fe
%
109
44 97 28 29
56
98
81 60
85
357
169 1 27 139 165 146
689
293 179
2 37
194 211
328 3 56
263 291 294
386 400 401 370 412 442 455
329
0 50
688
359 121
100
150
200
250
3 00
350
400
484
450
5 10 513 500
556 570 586 602 628 644 666 550
600
6 86 690 m /z
6 50
Az általam vizsgált ferrocenil-pirazolinok jellemző fragmentációját a 23. ábra mutatja. A molekulaion fragmentációjának első lépése az R2 és R3 szubsztituensektől függ. R3 = p-NO2fenil esetén intenzív NO (-30) vesztést látunk, N-acetil pirazol esetén ketén vesztés jellemző (-42). Az R2 szubsztituens függvényében, a fragmentáció indító lépése a következő: peracetilezett glikozidok esetén 330 vesztés jellemző, de megjelenik a kalkonoknál már látott 288 vesztés is; O-acetil vegyületek ketént (-42) veszítenek. R2
R1 N R3
N -X, a R2 és R3 szubsztituenstõl függ
-65 R1 '
CH
+
-56 -26
+
C R2 '
NH
-R2'CHN, kivéve R3 = Ac, Me
-29 A feltüntetett ionok és vesztések általában megjelennek a pirazolok spektrumában
23. ábra: A ferrocenil-pirazolok fragmentációja
44
Az ábrán feltüntetett R1’ és R2’ a megfelelő R csoportból visszamaradó részt jelöli, a már említett vesztések után. A spektrumban legtöbb esetben megfigyelhető Cp (-65) vesztés, majd ebből vas (-56) vesztés (úgy is értelmezhető, hogy 121 vesztés történt, ami CpFe-nak felel meg). A továbbiakban etil (-29) vagy acetilén (-26) vesztés figyelhető meg. A pirazolinokkal elentétben, a spektrumban nem jelenik meg a 186-os csúcs, így ezek egymástól megkülönböztethetők. Az R3-tól függően megjelenhet a spektrumban az R2’CHN összegképletű vesztés is. A ferrocenil-pirazolokra kis mértékű fragmentáció a jellemző. Az NMe vegyűletek közűl kisebb 5-ferrocenil pirazolok esetén, míg 3-ferrocenil pirazolok esetén nagyobb, és ugyanakkor a molekulaion is intenzívebb.
45
Az eredmények összefoglalása Munkám során célom volt egy olyan tömegspektrometriás adatgyűjtőrendszer fejlesztése, amely egyszerűen adaptálható tetszőleges rendszerhez, mivel általában az adatgyűjtőrendszer romlik el először. A fejlesztéshez a National Instruments LabView programját használtam, melynek segítségével sikerült írnom egy jól használható, rutin feladatokra alkalmas adatgyűjtő rendszert. Az új rendszer tulajdonságai: •
egyszerűen kezelhető
•
az egyszerű kalibrációhoz beépített kalibrációs alrendszert tartalmaz
•
a kompatibilitást más tömegspektrometriai programokkal a JDX fájlformátum használatával valósítja meg.
Megvizsgáltam 22 vegyületet, ezek közül 16-ot az általam fejlesztett rendszer segítségével. A vegyületek tömegspektrumait értelmeztem, megkeresve a hasonlóságokat az egy családba tartozó vegyületek között. Ezek alapján R1/R2 szubsztituens-sorrend a kalkon- ill. pirazolin vegyületek esetében meghatározható.
46
További tervek Következő célom a programhoz további kimeneti szűrők írása, ezáltal más programokkal való kompatibilitás növelése. Fontos számunkra, hogy a Masslab fájlformátumában is tudjunk elmenteni spektrumokat, így a két említett gépen ugyanazzal a programmal lehetne feldolgozni az adatokat. Ehhez szükséges a formátum pontos ismerete, aminek feltérképezése jelenleg is folyik. Szükség van még egy nagyfelbontású mérések (pontos tömegmérés) elvégzésére alkalmas programra is. Ez egészen más megoldásokat igényel. A mérést belső standard alkalmazásával végezzük, mágneses pásztázás helyett az ionok gyorsítófeszültségét változtatjuk. Egy ilyen program deszkamodellje már elkészült. Az anyagok vizsgálata terén behatóbban szeretném tanulmányozni a metastabil folyamatokat és minden anyaghoz pontos tömegmérést végeznék. A még azonosítatlan kis intenzitású fragmenseket pontos tömegméréssel esetleg azonosítani lehet.
47
Köszönetnyilvánítás Őszinte köszönetemet fejezem ki témavezetőmnek, dr. Frigyes Dávidnak a munkához adott értékes tanácsaiért és szakmai segítségéért, valamint türelméért. Köszönöm Zsoldosné dr. Mády Virágnak a vegyületek előállításában nyújtott segítségét és a rendelkezésemre bocsátott további anyagokat. Dr. Csonka Istvánnak köszönöm az adatgyűjtő kártyát és a LabView programot. (OTKA D38497 posztdoktori pályázat) Köszönet Újszászy Kálmánnak a munkámhoz adott segítségéért. Köszönetet mondok továbbá dr. Szepes László tanszékvezető úrnak.
48
Röviditésjegyzék GC-MS: gázkromatográf-tömegspektrométer HPLC: nagynyomású folyadékkromatográf LC-MS: flyadékkromatográf-tömegspektrométer FAB: gyorsatom-bombázásos ionforrás MALDI: mátrixszal elősegített lézeres deszorpciós ionizáció ESI: electrospray ionizáció (Electrospray ionization). EI: elektronütközéses ionizáció Da: dalton ICR: ion ciklotron-rezonancia FT-ICR: Fourier transzformációs ion ciklotron-rezonancia (tömegspektrométer) TOF: repülési idő analizátor m/z: tömeg/töltés MCP: Microchannel Plate A/D: analóg-digitális (átalakító) LSB: Least significant bit- legkevésbé szignifikáns bit TIC: totál ionáram IC: ionkromatogram PGIA: programozható erősítésű műszererősítő VI: LabView program (Virtual Instrument = virtuális mérőeszköz) Fc: ferrocenil csoport Cp: ciklopentadienil csoport Ac: acetil csoport Ph: fenil csoport Glü: glüko-piranóz GlüAc: tetraacetil-glükopiranóz JDX: JCAMP Chemical Spectroscopic Data Exchange Format fájlformátum RAW: nyersadatokat tartalmazó fájlformátum, tabulátorral tagolt szövegfájl
49
Irodalomjegyzék 1
Pásztor Judit, Ozohanics Oliver, „Új ferrocéntartalmú arilglikozidok és heterociklusok szintézise”, TDK dolgozat, témavezető: Zsoldosné Mády Virág, Budapest 2004 2 Újszászy K., Frigyes D., Tömegspektrometria, Egyetemi jegyzet, előkészületben 3 R.A.W. Johnstone, Back to basics, Micromass co., 2000 4 S.E. Van Bramer, An Introduction to Mass Spectrometry, http://science.widener.edu/~svanbram 5 Marvin L. Vestal, Methods of Ion Generation, Chem. Rev. 2001, 101, 361-375 6 Scott A. McLuckey* and J. Mitchell Wells, Mass Analysis at the Advent of the 21st Century, Chem. Rev. 2001, 101, 571-606 7 F.W. McLafferty, F. Tureček, Interpretation of Mass Spectra, University Science Books, Sausalito, California, 4th ed., 1993 8 A.N. Nesmeyanov, D.V. Zagorevskii, Y.S. Nekrasov, V.F. Sizoi, V.M. Postnov, A.M. Baran, E.I. Klimova Mass Spectrometry of π-complexes of transition metals 12. Ferrocenyl and cymantrenyl derivatives of chalcones, J. Organomet. Chem., 169, 77-81 (1979). 9 D.I. Méndez, T. Klimova, E. Klimova, S.O. Hernández, J.F. Perez, G.M. Martínez Synthesis of di- and monobromo(ferrocenylvinyl)cyclopropanes, J. Organomet. Chem., 689, 2503-2510 (2004). 10 J. Maynadié, B. Delavaux-Nicot, D. Lavabre, B. Donnadieu, J.C. Daran A. Sournia-Saquet, From Calcium Interaction to Calcium Electrochemical Detection by [(C5H5)Fe(C5H4COCH=CHC6H4NEt2)] and Its Two Novel Structurally Characterized Derivatives, Inorg. Chem., 43, 2064-2077 (2004). 11 A.N. Nesmeyanov, D.V. Zagorevskii, Y.S. Nekrasov, V.N. Postnov, A.M. Baran Mass-spectrometry of πcomplexes of transition metals 22. Fragmentations of Ferrocenyl-substituted pyrazolines-2 under electronimpact, J. Organomet. Chem., 201, 293-300 (1980). 12 ld. pl. M.R. Litzov, T.R. Spalding Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compounds, Elsevier, 1973; William Henderson, J. Scott McIndoe, Mass Spectrometry of Inorganic and Organometallic Compounds: Tools – Techniques – Tips, Wiley, 2005. 13 J. van Thuijl, K.J. Klebe, J.J. van Houte, The Mass Spectra of Some Pyrazole Compounds, Organic Mass Spectrometry, 3, 1549-1559 (1970).
50
