5
TINJAUAN PUSTAKA
Hubungan Struktur dan Aktivitas UK-3A Senyawa UK-3A termasuk ke dalam golongan senyawa antibiotik yang diisolasi dari miselium Streptomyces sp. 517-02 oleh Ueki et al. (1997a). Senyawa ini diisolasi dalam bentuk kristal tidak berwarna dengan konfigurasi absolut (+)-(2R, 3R, 4S, 7S, 8R). Struktur senyawa UK-3A ini memiliki kemiripan dengan senyawa antimisin A3 . Antimisin A3 yang diisolasi dari miselium Streptomyces sp. K01-0031 (Shiomi et al. 2005) memiliki aktivitas sebagai antibiotik dan digunakan sebagai insektisida. Senyawa UK-3A juga memiliki kesamaan struktur dengan senyawa UK2A, yaitu memiliki gugus hidroksil, amida, dan dilakton cincin beranggota 9, tetapi senyawa UK-3A tidak memiliki gugus metoksi pada cincin piridin. Berdasarkan penelitian terhadap senyawa UK-3A, diketahui bahwa tidak adanya gugus metoksi pada cincin piridin dapat meningkatkan aktivitasnya sebagai antikanker. UK-3A mempunyai sruktur yang hampir sama dengan struktur UK-2A (Gambar 5). Struktur UK-2A dan UK-3A hanya berbeda pada gugus metoksi yang terikat pada cincin pikolinat sehingga UK-3A dielusidasi sebagai demetoksi UK-2A (Shimano et al. 1998). Struktur senyawa UK-3A juga mempunyai kemiripan dengan struktur senyawa antibiotik yang sudah ditemukan sebelumnya, yaitu antimisin A 3 yang diisolasi dari Streptomyces sp. K01-0031 (Shiomi et al. 2005). Antimisin A3 diketahui sebagai antibiotik dan juga mempunyai aktivitas yang tinggi dalam menghambat pertumbuhan sel kanker. Antimisin A 3 dapat menginduksi apoptosis sel leukemia HL-60. Bc12 terdapat dalam 90% sel kanker usus, 80% B-sel limfomas, dan 70% sel kanker payudara (Liu et al. 2003).
6
Gambar 5 Struktur senyawa antimisin A 3 dan senyawa UK 2A dan UK 3A (Ueki 1997a) Sintesis senyawa analog UK-3A dilakukan dengan mempelajari korelasi antara struktur dan aktivitas hayatinya, yang dapat diperoleh dari data metilasi dan hidrolisis senyawa UK-2A yang mempunyai struktur dan aktivitas hampir sama dengan senyawa UK-3A. Kajian hubungan struktur dan aktivitas hayati senyawa UK2A, UK-3A, dan turunannya bertujuan mendapatkan informasi mengenai gugusgugus yang berperan dalam aktivitas hayati. Dari hasil yang diperoleh diharapkan dapat disintesis senyawa analog yang lebih sederhana dan mempunyai aktivitas tinggi (Hanafi et al. 1999). Metilasi senyawa UK-2A dengan diazometana akan menghasilkan senyawa UK-2(OMe) dan UK-2(NMe) yang mengakibatkan hilangnya aktivitas hayati. Hal ini menunjukkan bahwa gugus hidroksil pada cincin piridin dan NH (amida) merupakan gugus yang aktif. Senyawa UK-3A tidak mempunyai gugus metoksi, tetapi tidak mengakibatkan hilangnya aktivitas antibakteri, bahkan meningkatkan kemampuan menghambat pertumbuhan sel kanker. Hidrolisis senyawa UK-2A menggunakan HCl kering dan metanol menghasilkan senyawa yang tidak menunjukkan aktivitas hayati.
7
Hal ini membuktikan bahwa dilakton cincin beranggota-9 merupakan gugus aktif yang bersifat lipofilik (Hanafi et al. 1996). Struktur senyawa UK-3A memiliki gugus hidroksil (-OH), dan amida (CONH) yang merupakan gugus aktif yang mempunyai aktivitas yang cukup tinggi sebagai antibakteri dan antikanker. Aktivitas yang tinggi juga ditunjukkan oleh gugus dilakton atau ester yang merupakan gugus yang bersifat lipofilik (Hanafi et al. 1996). Berdasarkan hal tersebut, khususnya hubungan antara struktur kimia dan aktivitas hayati, maka dirancang strategi untuk mensintesis senyawa-senyawa analog UK-3A dengan cara meragamkan posisi dan jenis gugus -OH pada cincin aromatik dan gugus dilakton pada senyawa UK-3A, dengan harapan akan diperoleh senyawa baru dengan bahan dasar yang cukup murah, tetapi memiliki aktivitas yang lebih tinggi dan tidak menimbulkan efek samping (Hanafi & Thelma 1998).
Sintesis Senyawa Analog UK-3A Telah dilaporkan bahwa senyawa UK-3A mempunyai aktivitas sebagai antimikrob, antifungal, dan sitotoksik terhadap beberapa sel kanker, seperti aktivitas yang ditunjukkan oleh senyawa antimisin A3 (Shimano et al. 1998). Aktivitas sitotoksik yang ditunjukkan oleh senyawa UK-3A dengan IC 50 sebesar 38 merupakan senyawa yang kurang aktif (IC 50 > 10 µg/mL) sehingga perlu dilakukan sintesis senyawa analog UK-3A yang diharapkan memiliki aktivitas yang lebih baik (Pan et al. 2009). Sintesis senyawa UK-3A dilakukan dengan memodifikasi atau memanipulasi struktur molekul senyawa UK-3A. Modifikasi struktur molekul ini bertujuan mendapatkan senyawa baru yang mempunyai aktivitas lebih tinggi, masa kerja lebih panjang, tingkat kenyamanan lebih besar, efek samping rendah, selektif, dan lebih stabil (Siswandono & Soekardjo 2000). Topliss (Patrick 2005) mengembangkan petunjuk nonmatematis, nonstatistik, dan nonkomputer, yaitu dengan menggunakan prinsip pendekatan hubungan struktur dalam modifikasi struktur induk suatu molekul yang sudah diketahui aktivitasnya. Hal ini dilakukan sebagai upaya untuk mengoptimumkan aktivitas zat dengan efisien.
8
Modifikasi molekul menurut pendekatan Topliss adalah dengan memasukkan gugusgugus yang bersifat lipofilik, elektronik, dan sterik tertentu pada posisi yang tertentu pada suatu molekul induk, dengan ramalan akan menghasilkan senyawa yang memberikan aktivitas yang lebih tinggi, sama, atau lebih rendah dibanding aktivitas senyawa induk, kemudian dicari jalur sintesis yang paling menguntungkan. Sintesis senyawa analog UK-3A dicoba dilakukan dengan mengubah gugus dilakton rantai tertutup menjadi rantai terbuka dengan gugus yang mengandung rantai yang memiliki panjang yang berbeda-beda. Ragam tersebut diharapkan akan memberikan informasi mengenai gugus yang berperan dalam meningkatkan aktivitas senyawa analog UK-3A. Perbedaan sifat lipofilik senyawa diharapkan dapat berpengaruh pada aktivitas hayatinya (Hanafi et al. 1999). Pembukaan cincin dilakton diharapkan dapat mempertinggi aktivitas senyawa ini. Reaksi pembukaan cincin pada UK-2A telah menghasilkan senyawa dengan aktivitas yang cukup tinggi (Usuki et al. 2006). Tahapan reaksi sintesis senyawa analog UK-3A dapat dilihat pada Gambar 6. N OH O
O OH
H 2N
ROH / p-TsOH benzena,
OH
110 oC,
N
R O
24 jamH 2N
OH O DMAP
H N OH
DCC/py,55oC, 24 jam OH
OH
O
R O
O
PSME
RCOOH DMAP
DCC / py, 55oC, 24 jam
N
O H N O
PSMPE R 1= -CH3 R2= C4H 9COPSMBE, R 1= -CH3 R2= C3H 9CO-
OH
O
R2
R1 O
O
3-hidroksipoklinil-serin-metil-butananoil-ester (PSMBE) dan 3-hidroksipoklinil-serin-metil-pentananoil-ester (PSMPE)
Gambar 6 Reaksi sintesis senyawa analog UK-3A (Marlupi 2007)
9
Reaksi yang terjadi dalam sintesis senyawa analog UK-3A adalah reaksi esterifikasi dan amidasi. Metode umum untuk sintesis ester adalah dengan mereaksikan alkohol dengan suatu asam karboksilat. Reaksi ini merupakan reaksi reversibel dan berlangsung lambat. Agar reaksi berjalan satu arah dan lebih cepat digunakan katalis asam. Agar menjadi sempurna, reaksi dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan menggunakan alkohol berlebih dan cara yang kedua dengan memisahkan air yang terbentuk agar tidak terjadi reaksi sebaliknya. Katalis yang biasa digunakan dalam reaksi esterifikasi adalah asam sulfonat dan asam klorida. Selain itu juga dapat digunakan asam p-toluena sulfonat (p-TsOH), karbonil diimidazol (CDI), disikloheksilkarbodiimida (DCC), dan dimetil amino piridin (DMAP) (Carey & Sundberg 2007). RCOOH
+
R'OH
H
R-COOR'
+
H2O
Disikloheksilkarbodiimida (DCC) adalah suatu aktivator dalam reaksi pembentukan ester yang dapat mengubah asam karboksilat menjadi senyawa pengalkilasi yang reaktif. Bagian terpenting dari DCC adalah gugus imida yang memiliki atom karbon pusat yang kekurangan elektron setelah bereaksi dengan proton dari asam karboksilat sehingga dapat diserang oleh suatu agen nukleofilik dan membentuk spesies asilisourea. Gugus asilisourea ini sangat reaktif karena ikatan antara asil dengan oksigen dapat mengubah ikatan rangkap karbon dan nitrogen dari isourea menjadi suatu gugus karbonil yang lebih stabil. Oleh karena itu pada akhir reaksi akan terbentuk ester dan DCU (disikloheksilurea) sebagai hasil samping penggunaan DCC (March 1992). Mekanisme reaksi dengan aktivator DCC dapat dilihat pada Gambar 7.
10
O R
C
+
O
O
C6H11
H N
C
N
R
C6H11 -
+
O
C
C6H11
HN
C+
N
C6H11
Disikloheksilkarbodiimida (DCC) O
O NC6H 11
O
+ R
O
C
H+
R'OH
R
C
CNHC6H11
OR' + C6H11
ester
H N
C
H N
C6H 11
Disikloheksilurea (DCU)
Gambar 7 Mekanisme reaksi dengan aktivator DCC (March 1992)
DMAP (4-N,N-dimetilaminopiridin) merupakan suatu katalis nukleofil yang memiliki efek yang cukup kuat. Gugus dimetilamino berfungsi sebagai suatu substituen donor elektron yang meningkatkan sifat basa dari nitrogen piridin (Carey & Sundberg 2007). Katalis DMAP dapat dikombinasikan dengan aktivator DCC menghasilkan metode yang berguna untuk meragamkan asam karboksilat agar dapat bereaksi dengan alkohol untuk menghasilkan ester. Mekanisme reaksi pembentukan ester yang dikatalis DMAP dapat dilihat pada Gambar 8. H3C H3C
.. N
CH3
H3C
+ N
CH3
H 3C
R C
+ N
CH3
+ N
CH3
O
O C .. N -
N ..
O .. N -
R
O R
C
N O
C
O
-
R H3C
+ N
H3C
CH3
CH3
H3C
N
.. N
CH3
O O
O
CR
RCOR' N
N
N ..
H R
C R
O
ion N-asilpiridinium
O
C
R'
+
OR'
4-N,N-dimetilaminopiridin (DMAP)
O-
Gambar 8 Mekanisme reaksi pembentukan ester dengan katalis DMAP (Carey & Sundberg 2007)
11
Perkembangan Sintesis Senyawa Analog UK-3A Modifikasi struktur yang telah banyak digunakan dalam sintesis senyawa analog UK-3A dan UK-2A adalah dengan mengubah gugus dilakton cincin beranggota-9 menjadi rantai terbuka dan meragamkan panjang rantai alifatik. Perbedaan gugus aktif akan mempengaruhi aktivitas yang ada pada suatu senyawa. Hal ini telah diteliti, yaitu dengan mempelajari perbedaan aktivitas pada senyawa UK-2A dan UK-3A (Ueki et al. 1997b). Sintesis senyawa analog UK-3A, yaitu senyawa 3-hidroksipikolinil metil fenilpropionil serin ester, telah dilakukan pada tahun 1995. Sintesis ini dilakukan dengan mereaksikan 3-hidroksipikolinil serin ester dengan asam propionat. Hasil uji aktivitas senyawa 3-hidroksipikolinil metil fenilpropionil serin ester terhadap sel kanker menunjukkan adanya kemampuan menghambat pertumbuhan sel kanker pada konsentrasi 43-90 µg/mL (Hanafi 1995). Mekanisme reaksi sintesisnya dapat dilihat pada Gambar 9. N
N H N OH OH
PHCH 2CH 2COOH
O OH
DCC/DMAP, CH2Cl
O O
O H N
3-hidroksipikolinil-metil-serin-ester
O O
OMe
OMe
3-hidroksipikolinil-metil-fenilpropionil-serin-ester
Gambar 9 Reaksi sintesis 3-hidroksipikolinil metil fenil propionil serin ester (Hanafi 1995) Agar pembentukan senyawa analog UK-3A menghasilkan rendemen yang tinggi, maka dilakukan optimasi. Optimasi dilakukan dengan cara meragamkan penggunaan katalis dan aktivator. Selain itu juga dilakukan ragam kondisi reaksi, yaitu suhu dan waktu reaksi (Hanafi et al. 1997b). Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A juga telah diuji terhadap beberapa sel kanker, di antaranya oleh Ueki et al. (1997). Hasil uji sitotoksisitas senyawa UK-3A pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1.
12
Tabel 1 Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A, UK-2A, dan antimisin A3 dinyatakan dalam IC 50 (µg/mL) (Ueki et al. 1997a) IC 50 Sel Uji (µg/mL)
Senyawa
P-388 38 100 0,015
UK-3A UK-2A Antimisin A 3
B-16 18 100 0,02
KB 20 17 0,063
COLO201 45 35 0,018
3T3 100 100 15
IC 50 = Inhibition Concentration
Pada tahun 2008 mulai dilakukan sintesis analog UK-3A dengan menghilangkan satu gugus lakton pada senyawa 3-hidroksipikolinil oktilamida (POA), kemudian dilihat pengaruhnya pada nilai e-docking dan diuji aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker (Hanafi 2008). Beberapa senyawa analog UK-3A yang berhasil disintesis mempunyai struktur inti pada Gambar 10. Perbedaan nilai log P dan nilai e-docking serta diuji aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukimia murin P-388 dirangkum pada Tabel 2.
N
N H N O
OH
O O
A
O
R1
H N
R2
C8H17 OH
O
B
Gambar 10 Struktur inti senyawa analog UK-3A
13
Tabel 2 Nilai log P, nilai e-docking, dan uji aktivitas antikanker terhadap sel kanker leukemia murin P388 Nama senyawa analog 3-hidroksipikolinil serin metil pentanoil ester (PSMPE) (Marlupi 2007) 3-hidroksipikolinil serin metil oktanoil ester (PSMOE) (Anita 2008) 3-hidroksipikolinil serin oktil heksanoil ester (PSOHE) (Zainuddin 2008) 3-hidroksipikolinil serin oktil oktanoil ester (PSOOE) (Darmawan 2008) 3-hidroksi-pikoliniloktilamid (POA) (Hanafi 2008)
Struktur Gugus
Nilai edocking
IC 50 P388 (µg/mL)
R1
R2
Nilai Log P
A
-CH 3
C 4 H 9 CO-
0,37
-9,70
39
A
-CH 3
C 7 H 15 CO-
1,56
-11,93
15,4
A
-C 8 H 17
C 5 H 11 CO-
3,56
-12,45
35
A
-C 8 H 17
C 7 H 15 CO-
4,35
-13,50
50
B
-
-
0,82
-10,16
13,2
Struktur inti
Senyawa analog UK-3A yang disintesis pada penelitian ini adalah senyawa 2hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (NSMOE) yang akan dilakukan melalui dua tahapan reaksi dan senyawa 2-hidroksinikotinil oktil amida (NOA) yang dilakukan melalui satu tahapan reaksi. Sintesis senyawa NSMOE dan NOA dipilih untuk melihat perbedaan posisi gugus hidroksil pada cincin aromatik (cincin nikotinat) terhadap aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukimia murin P-388 dan juga dilakukan uji aktivitas terhadap sel kanker payudara T47D. Penyakit kanker terjadi karena sel normal yang telah kehilangan sifat apoptosis, yaitu kemampuan untuk membunuh sel itu sendiri, sehingga sel terus bertambah. Hal ini terjadi karena adanya overekspresi pada enzim Bcl-xL yang merupakan enzim antiapoptosis. Oleh karena itu, salah satu mekanisme yang diharapkan pada senyawa obat antikanker adalah kemampuannya menghambat kerja enzim Bcl-xL tersebut (Enyedy et al. 2001). Pada penelitian ini juga ditentukan nilai e-docking yang
14
dilakukan secara in silico pada protein Bcl-xL yang
merupakan enzim
antiapoptosis.yang spesifik untuk kanker payudara (Espana et al. 2005). Nilai log P juga ditentukan untuk melihat pengaruh perbedaan nilai lipofilisitas/hidrofobisitas senyawa hasil sintesis pada uji aktivitas antikanker. Hasil nilai log P dan nilai edocking dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Nilai Log P dan e-docking senyawa target sintesis dan senyawa induk UK-3A Nama senyawa analog 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (NSMOE) 2-hidroksinikotinil oktil amin (NOA) UK-3A Antimisin A3 Artonin E
Log P 1,49 2,50 1,61 1,30
e-docking (kkal/mol) -11,45 -10,46 -11,65 -10,34 -10,26
E-docking adalah percobaan dengan menggunakan program komputer tertentu dan dalam penelitian ini digunakan program ArgusLab versi 4,0 yang menghasilkan energi bebas ikatan ∆G (
bind )
dalam satuan kkal/mol. Nilai log P didapatkan dengan
program Hyperchem pro 6,0.
Sel Kanker Leukimia Murin P-388 Leukimia murin P-388 merupakan salah satu jenis sel kanker leukemia yang sering digunakan dalam uji sitotoksisitas untuk mengetahui aktivitas suatu senyawa dalam menghambat pertumbuhan sel kanker. Sel kanker ini dikembangbiakkan dari sel tikus yang dikenai agen leukemia. Jenis sel leukimia lain yang sering digunakan adalah sel leukemia L1210 yang antara lain telah digunakan dalam uji sitotoksisitas kalanon menghasilkan nilai IC 50 sebesar 59,4 μg/mL (Chasani 2002). Sel Kanker Payudara T47D Kanker payudara sering ditemukan di seluruh dunia dengan insiden relatif tinggi, yaitu 20 % dari seluruh keganasan. Menurut WHO 8-9% wanita mengalami kanker payudara. Hal ini menjadikan kanker payudara sebagai jenis kanker yang paling banyak ditemui pada wanita. Setiap tahun lebih dari 250.000 kasus baru
15
kanker payudara terdiagnosis di Eropa dan kurang lebih 175.000 di Amerika Serikat (Jemal 2003). Kanker payudara memperlihatkan proliferasi keganasan sel epitel yang membatasi duktus atau lobus payudara. Kanker membutuhkan waktu 7 tahun untuk tumbuh dari satu sel menjadi massa yang cukup besar untuk dapat dipalpasi (kira-kira berdiameter 1 cm). Pada ukuran itu, sekitar 25% kanker payudara sudah mengalami metastasis (Price 2005). Sel T47D merupakan sel kanker yang mengekspresikan reseptor estrogen atau yang biasa disebut ER positif serta mengekspresikan p53 yang telah termutasi. Pada sel ini p53 mengalami missense mutation pada residu 194 (dalam zinc-binding 11 domain L2) sehingga p53 kehilangan fungsinya. Jika P53 tidak dapat memberi respons pada DNA, maka P53 akan mengurangi atau menghilangkan kemampuan dalam meregulasi siklus sel dan memacu apoptosis (Schafer et al. 2000). Sel T47D merupakan continuous cell line yang diisolasi dari jaringan tumor duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun. Continuous cell line sering dipakai dalam penelitian kanker secara in vitro karena mudah penanganannya, memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas, homogenitas yang tinggi, serta mudah diganti dengan stok beku jika terjadi kontaminasi (Burdall et al. 2003).
Uji Toksisitas Letalitas Larva Udang Pada umumnya zat aktif pada konsentrasi yang tinggi bersifat toksik, oleh karena itu Meyer (1982) melakukan pendekatan untuk uji toksisitas dengan menggunakan hewan sederhana dan memilih Artemia salina (nauplius) sebagai hewan uji. Metode ini sering digunakan untuk penapisan awal terhadap senyawa aktif yang memiliki khasiat sebagai antitumor di dalam ekstrak tanaman karena mudah, cepat, murah, dan dapat dipercaya. Selain itu uji toksisitas menggunakan larva udang ini dapat juga digunakan pada analisis toksisitas pestisida, polutan, dan senyawa yang diduga memiliki efek sitotoksik. Besarnya aktivitas toksisitas terhadap larva udang laut dinyatakan dengan LC 50 (median lethal concentration), yaitu konsentrasi
16
senyawa uji (ppm) yang dapat menyebabkan kematian 50% organisme uji di bawah kondisi yang sesuai (McLaughlin et al. 1998).
Uji Sitotoksik Antikanker Suatu zat dikatakan bersifat sitotoksik apabila zat tersebut memiliki efek toksisitas atau beracun terhadap sel yang dapat menyebabkan kematian sel. Obatobatan kemoterapi seringkali bersifat toksik terhadap sel kanker yang tumbuh dengan cepat. Uji sitotoksisitas merupakan uji yang digunakan untuk mengevaluasi keamanan suatu senyawa yang akan digunakan sebagai bahan obat, kosmetik, zat tambahan makanan, dan pestisida dengan menggunakan kultur sel secara in vitro. Salah satu syarat uji sitotoksisitas adalah sistem uji tersebut harus menghasilkan kurva dosis respons yang reprodusibel dan dapat menggambarkan efek senyawa uji yang sama bila diberikan secara in vivo. Sistem uji sitotoksisitas ini merupakan uji kuantitatif dan kualitatif dengan cara menetapkan kematian sel (Freshney 1996). Secara in vitro, uji sitotoksisitas dilakukan untuk menentukan potensi sitotoksik senyawa-senyawa seperti produk-produk farmasi, kosmetik, dan obat-obat antikanker. Pengembangan metode in vitro sebagai alternatif pengganti pengujian menggunakan hewan uji mempunyai relevansi yang cukup baik yang bertujuan mendeteksi potensi ketoksikan suatu obat pada manusia. Toksisitas merupakan kejadian kompleks secara in vivo, di tempat terjadinya kerusakan sel akibat penggunaan obat antikanker yang bersifat sitotoksik atau karena efek-efek fisiologi seperti efek inflamasi, neurotoksisitas, dan juga efek-efek sistemik. Uji in vitro harus dapat menggambarkan efek senyawa uji yang sama bila diberikan secara in vivo. Respons sel terhadap agen-agen sitotoksik dipengaruhi oleh kerapatan sel (Freshney 1996).
