i
KARYA ILMIAH ii
KARYA ILMIAH
TINJAUAN KEAMANANAN EFFECTIVE MICROORGANISM-4 (EM4) YANG DIBERIKAN PADA TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus) SECARA PER ORAL
I MADE MERDANA I WAYAN SUDIRA
OLEH NIP. 197907072005011001 NIP. 196902281997031003
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016
iii
TINJAUAN KEAMANANAN EFFECTIVE MICROORGANISM-4 (EM4) YANG DIBERIKAN PADA TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus) SECARA PER ORAL
OLEH : I MADE MERDANA NIP. 197907072005011001 I WAYAN SUDIRA NIP. 196902281997031003
MENGESAHKAN/MENGETAHUI KEPALA LABORATORIUM FARMAKOLOGI VETERINER
Dr. Drh. I WAYAN SUDIRA, M.Si NIP. 19690228 199703 1003
iv
RINGKASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
aspek keamanan Effective
Microorganism-4 (EM4®) yang diberikan pada tikus putih (Rattus novergicus) secara per oral dengan mengamati gambaran histopatologi organ usus, hati dan ginjal. Menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 5 jenis perlakuan dan 5 kali ulangan 25 ekor tikus dibagi menjadi 5 kelompok. Perlakuan EM4® per oral dengan dosis bertingkat secara berurutan yaitu; kelompok kontrol (K), perlakuan (EM4A, EM4B, EM4C dan EM4D) : 1 ml aquadest tanpa pemberian EM4®; 0,25 ml; 0,5 ml; 1 ml dan 2 ml EM4® per ekor setiap hari. Setelah 28 hari perlakuan tikus dieutanasi dan dinekropsi. Pembuatan preparat histopatologi usus, hati dan ginjal dengan pewarnaan HE metode Harris (Humason, 1972). Berdasarkan pengamatan histopatologi usus, hati dan ginjal diperoleh hasil bahwa tidak terdapat perbedaan gambaran struktur histologis antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan. Tidak ditemukan adanya perubahan yang menunjukkan degenerasi, hiperemi, nekrosis, peradangan ataupun kejadian toksisitas. Hasil ini menunjukkan bahwa probiotik EM4® tidak menggangu aktivitas ataupun kerja dari organ-organ tersebut dan tidak menimbulkan toksisitas pada struktur jaringan usus, hati dan ginjal. Hasil penelitian ini menunjukkan kemampuan probiotik EM4® dalam mengembalikan keseimbangan rasio antara bakteri patogen dan nonpatogen saluran pencernaan dengan cara menekan pertumbuhan mikroorganisme patogen sehingga jumlah bakteri non patogen meningkat dengan cepat. Mekanisme kerja probiotik dalam kompetisi dengan membentuk koloni dan melakukan perlekatan (adhesion) pada sel-sel enterosit, sehingga berefek pada meningkatnya barier mukosa usus. Kemampuan bakteri asam laktat dalam EM4® untuk memproduksi senyawa bioaktif yaitu asam laktat dan senyawa antibiotika juga mampu menekan pertumbuhan mikroorganisme patogen. Kondisi ini membuat saluran cerna menjadi lebih sehat sehingga penyerapan sari-sari makanan menjadi lebih baik dan performa hewan coba akan meningkat secara umum. Kesiimpulan yang dapat dikemukakan dari penelitian ini bahwa pemberian probiotik EM4® secara per oral tidak berpengaruh terhadap gambaran histopatologi
v
usus, ginjal dan hati. Saran yang dapat disampaikan berdasarkan hasil penelitian ini perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan dosis EM4® yang lebih tinggi dan dalam waktu yang lebih lama. Hasil ini juga menunjukkan bahwa EM4® tidak berbahaya diberikan pada hewan ternak.
vi
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa / Tuhan yang Maha Esa karena atas anugrah Nya, sehingga penelitian yang berjudul Tinjauan Keamanan Effective Microorganism-4 (EM4) Yang Diberikan Pada Tikus Putih (Rattus norvegicus) Secara Per Oral ini dapat terselesaikan dengan baik. Penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada bapak Dr. Drh I Wayan Sudira, M.Si selaku pembimbing yang dengan penuh kesabaran dan tidak pernah kenal lelah dalam memberikan dorongan dan sumbangan pemikiran. Penulis sangat menyadari akan keterbatasan kemampuan yang dimiliki sehingga menjadikan karya ilmiah ini masih jauh dari sempurna. Untuk itu penulis pada kesempatan ini menyampaikan permohonan maaf dan mengharapkan masukan untuk kesempurnaan penulisan berikutnya. Akhir kata penulis mengharapkan semoga penelitian ini dapat memberikan manfaat untuk kemajuan ilmu pengetahuan khususnya pada bidang kesehatan dan kedokteran hewan.
Denpasar, Januari 2016 Peneliti,
I Made Merdana
vii
DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM ................................................................................................... i LEMBAR PENGESAHAN ....................................................................................... ii RINGKASAN............................................................................................................ iii KATA PENGANTAR ............................................................................................... v DAFTAR ISI ............................................................................................................. vi DAFTAR TABEL ..................................................................................................... vii DAFTAR GAMBAR ................................................................................................. viii BAB I PENDAHULUAN ........................................................................................ 1 1.1 Latar Belakang ...................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ................................................................................. 3 1.3 Tujuan Penelitian ................................................................................... 3 1.4 Manfaat Penelitian . ................................................................................ 3 BAB II KAJIAN PUSTAKA ................................................................................... 4 2.1 Tinjauan Umum Tentang Probiotik ....................................................... 4 2.2 Effective Microorganis-4 (EM4) ............................................................ 5 2.3 Usus ........................................................................................................ 7 2.4 Hati ......................................................................................................... 8 2.5 Ginjal ...................................................................................................... 9 BAB III METODE PENELITIAN ............................................................................ 11 3.1 Rancangan Penelitian .............................................................................. 11 3.2 Variabel Penelitian .................................................................................. 11 3.3 Bahan Penelitian ...................................................................................... 12 3.4 Instrumen Penelitian ................................................................................ 12 3.5 Prosedur penelitian .................................................................................. 12 3.5.1 Pemberian EM4® ............................................................................ 13 3.5.2 Pengambilan sampel ....................................................................... 13 3.5.3 Pembuatan preparat histopatologi .................................................. 13 3.7 Lokasi dan Waktu Penelitian ................................................................... 15 3.7 Analisis Data ........................................................................................... 15 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................... 16 4.1 Pemeriksaan Histopatologi Usus ............................................................. 16 4.2 Pemeriksaan Histopatologi Hati .............................................................. 17 4.3 Pemeriksaan Histopatologi Ginjal ........................................................... 19 4.4 Pembahasan ............................................................................................. 20 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .................................................................... 25 5.1 Kesimpulan ............................................................................................. 25 5.2 Saran ....................................................................................................... 25 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................ 26
viii
DAFTAR TABEL
4.1 Tabel Rancangan Penelitian .............................................................................. 11
ix
DAFTAR GAMBAR
3.1
Kerangka Konsep Penelitian .......................................................................... 19
4.1.a Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok kontrol .......................... 16 4.1.b Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4A............................ 17 4.1.c Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4B ............................ 17 4.1.d Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4C ............................ 17 4.1.e Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4D ............................ 17 4.2.a Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok kontrol ........................... 18 4.2.b Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4A ............................. 18 4.2.c Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4B ............................. 18 4.2.d Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4C ............................. 18 4.2.e Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4D ............................. 18 4.3.a Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok kontrol ........................ 19 4.3.b Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok EM4A .......................... 19 4.3.c Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok EM4B .......................... 19 4.3.d Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok EM4C .......................... 20 4.3.e Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok EM4D .......................... 20
x
BAB I PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang Mikroorganisme sebagai agen bioteknologi telah dikembangkan secara luas,
salah satunya sebagai probiotik (Wididana, 1996). Penggunaan probiotik atau disebut dengan effective microorganism (EM) mampu meningkatkan performa berbagai hewan ternak secara umum (Suwidjayana dan Bidura, 2000; Daud et al., 2007). Telah diteliti pemberian EM yang disuplementasi pada ransum menyebabkan pertambahan berat badan itik pedaging (Suwidjayana dan Bidura, 2000) serta meningkatkan jumlah dan bobot telur pada itik gembala (Purnomo dan Julaeha, 2006). Pada ayam pedaging yang diberikan kombinasi prebiotik dan probiotik selama enam minggu menunjukkan penurunan kadar lemak karkas dan kadar kolesterol serum darah (Daud et al., 2007). Pemanfaatan EM untuk pengembangan teknologi pakan ternak dari limbah pertanian semakin berkembang pesat. Pada ternak ruminansia, EM mampu meningkatkan daya cerna rumen terhadap ransum berserat tinggi, secara langsung akan berpengaruh terhadap pertambahan bobot badan sapi (Wina, 2005). Probiotik dijadikan alternatif pengganti antibiotika sebagai growth factor. Pada budidaya perairan, penggunaan bakteri EM strain K-7 mampu meningkatkan daya hidup larva kepiting bakau (Rusdi et al., 2005). Konsep probiotik dipopulerkan oleh Fuller (1992), sebagai mikroorganisme hidup menguntungkan yang dimasukkan ke dalam tubuh manusia atau hewan secara oral. Mikroba hidup itu diharapkan mampu memberikan pengaruh positif terhadap
xi 1
kesehatan manusia atau hewan dengan cara mengembalikan keseimbangan rasio antara bakteri patogen dan nonpatogen saluran pencernaan. Salah satu probiotik yang dipasarkan secara komersial yaitu Effective Microorganism-4 (EM4®) produksi PT. Songgolangit Persada. Effective Microorganism-4 mengandung kombinasi bakteri fotosintetik, bakteri asam laktat, Yeast dan Actinomyces (Wididana et al., 1996). Effective Microorganisms-4® bekerja memanipulasi proses pencernaan di dalam saluran pencernaan hewan ternak melalui peningkatan aktivitas enzim-enzim pencernaan. Lactobacillus dapat memfermentasi glikosida, pati, dan hemiselulosa dalam ransum menjadi asam laktat dan senyawa antimikroba (Oktaviani, 2004). Kedua komponen bioaktif tersebut mampu menekan pertumbuhan bakteri patogen sehingga memberikan kesempatan kompetisi yang maksimal bagi pertumbuhan bakteri non pathogen (Ouwehand, 1998). Monosakarida, asam laktat, asam lemak atsiri, gliserol dan asam amino hasil pencernaan diabsorpsi memasuki sirkulasi darah melalui mekanisme transport aktif saluran pencernaan untuk selanjutnya dibawa ke hati. Di dalam hati asam laktat diubah menjadi glukosa melalui proses glukoneogenesis (Susila et al., 1998). Hati merupakan
organ
tubuh
yang penting dalam menjaga
dan menentukan derajat
kesehatan hewan. Residu dari proses biotransformasi hati dan metabolitnya akan diekskresikan melalui ginjal. Kondisi metabolit yang mengalami perubahan menjadi garam organik yang mudah larut berpengaruh terhadap berubahnya pH urine, kandungan amoniak dan kerja ginjal (Harper et al., 1987 dan Mustchler, 1991). Kendati telah banyak dilaporkan aplikasi langsung probiotik pada ternak di lapangan dengan hasil yang positif, akan tetapi masih sangat minim informasi mengenai aspek farmakodinamika dari konsekuensi pemberian EM4® terhadap keamanan organ-
xii
organ vital seperti usus, hati dan ginjal. Dengan demikian ini menjadi suatu peluang penelitian yang menarik untuk mengetahui dinamika dari EM4® pada hewan coba dalam keadaan sehat atau normal. Perubahan ke arah patologis pada organ usus, hati dan ginjal dapat dilihat dari gambaran histopatologis berupa gambaran degenerasi, hiperemi dan atau nekrosis.
1.2
Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang tersebut dapat dirumuskan permasalahan apakah
pemberian EM4® per oral berpengaruh terhadap gambaran histopatologi usus, hati dan ginjal tikus putih (Rattus norvegicus) ?
1.3
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perubahan gambaran histopatologi
usus, hati dan ginjal tikus putih (Rattus norvegicus) setelah pemberian EM4® secara per oral.
1.4
Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat : 1. Memberikan kontribusi informasi mengenai aspek farmakodinamika dari pemberian probiotik EM4® per oral pada tikus putih (Rattus norvegicus) dari gambaran histopatologi usus, hati dan ginjal.
xiii
2. Membuktikan bahwa EM4® yang diberikan mampu meningkatkan performa ternak juga baik terhadap organ-organ dalam dari tikus seperti usus, hati dan ginjal.
xiv
BAB II KAJIAN PUSTAKA
2.1
Tinjauan Umum Tentang Probiotik Probiotik didefinisikan sebagai mikroorganisme hidup baik dalam bentuk
tunggal maupun campuran yang disuplementasikan pada bahan pangan dengan tujuan untuk memberikan efek menguntungkan bagi kesehatan saluran pencernaan pada manusia atau hewan. Efek kesehatan yang ditimbulkan setelah mengkonsumsi bahan mengandung probiotik dapat diartikan sebagai efek dari probiotik. Peran penting probiotik dalam memperbaiki keadaan saluran dan sistem pencernaan ternak dengan menjaga kesimbangan mikroflora usus sehingga aktivitas enzim sistem pencernaan berlangsung lebih stabil dan proses pencernaan sari-sari makanan akan berlangsung lebih optimal (Fuller, 1992). Konsep probiotik pertama kali berkembang berawal dari teori putrefactive yang dikemukakan oleh Elie Metchnikoff pada tahun 1908. Menurutnya dalam kondisi sehat keseimbangan mikroflora saluran pencernaan manusia dan hewan resisten terhadap aktivitas bakteri patogen. Secara perlahan proses pembusukan (putrefaksi) oleh bakteri patogen di dalam usus besar menghasilkan senyawa beracun dan bila terjadi infeksi pada usus toksin dapat memasuki peredaran darah dan disebut sebagai proses auotointoksikasi. Metchnikoff berhasil mengisolasi Lactobacillus dari susu fermentasi yang dikonsumsi oleh warga suku pegunungan di Bulgaria dan diyakini meningkatkan kesehatan tubuh dan menyebabkan umur panjang (Klaenhammer, 2001).
xv 4
Komposisi probiotik dapat bentuk kultur mikroba sediaan tunggal atau campuran, yang terdiri dari bakteri Gram positif, bakteri Gram negatif, Yeast dan Actinomyces yang memberikan keuntungan bagi tubuh. Species bakteri yang sering digunakan yaitu Lactobacillus sp., Leuconostoc sp., Bifidobacterium sp.dan Streptococcus lactis dan Streptococcus thermophillus. Dari spesies Yeast yang sangat terkenal yaitu Saccharomyces cerevissidae dan dari spesies jamur meliputi Aspergillus niger dan Aspergillus oryzae (Fuller, 1992).
2.2
Effective Microorganisms-4 (EM4®) Teknologi Effective Microorganism atau yang lebih dikenal teknologi EM telah
diterapkan dan dikembangkan hampir di seluruh dunia. Prof. Teruo Higa adalah orang pertama mengembangkan teknologi EM dari University of the Ryakyus, Okinawa, Jepang di era tahun 1980-an. Teknologi EM masuk ke Indonesia tahun 1990-an dikembangkan oleh Indonesian Kyusei Forming Societies (IKNFS) (Wididana et al., 1996). Effective Microorganisms-4 (EM4®) produksi PT. Songgolangit Persada mengandung
campuran
mikroorganisme
fermentasi,
bakteri
fotosintetik
(Rhodopseudomonas sp.), bakteri asam laktat (Lactobacillus sp.), Yeast (Saccharomyces sp.) dan Actinomyces (Wididana et al., 1996). Probiotik EM4 yang ditujukan untuk ternak antara lain mengandung : Lactobacillae, bakteri pengurai fosfat, bakteri fotosintetik, Yeast dan Actinomyces. Probiotik EM4 dapat berperan
memanipulasi
proses pencernaan di dalam saluran pencernaan hewan dan ternak melalui peningkatan aktivitas enzim-enzim pencernaan (Chiang dan Hsieh, 1996).
xvi
Bakteri asam laktat (BAL) yang terkandung dalam EM4 mampu memproduksi komponen bioaktif yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Komponen tersebut adalah produk keasaman dan metabolit antimikroba. Keasaman ini diakibatkan oleh produksi asam laktat yang tinggi sehingga mampu menurunkan pH dengan cepat menjadi pH 3-5, sehingga bakteri patogen tidak mampu untuk beradaptasi. (Axelsson, 1998 dan Oktaviani, 2004). Senyawa antimikroba yang dihasilkan antara lain hidrogen peroksida, reuterine, bakteriosin, aldehid, keton, alkohol dan diasetil. Contoh Lactobacillus plantarum memproduksi hidrogen peroksida sebagai antiseptik juga mempunyai kemampuan memproduksi bakteriosin sebagai antibiotika (Jenie dan Rini, 1995; Ouwehand, 1998). Dengan demikian akan memberikan peluang bagi pertumbuhan mikroorganisme yang menguntungkan untuk berkembang lebih banyak, sehingga dapat meningkatkan pertumbuhan hewan ternak. Yeast yang terkandung dalam EM4 berperan sebagai sumber vitamin B kompleks. Seperti telah diketahui bahwa vitamin B kompleks berfungsi untuk meningkatkan nafsu makan hewan ternak (Sukaryani, 1997). Kandungan ß-D glukan dari dinding Yeast telah banyak dilaporkan berperan sebagai imunostimulan (Ahmad, 2005). Yeast juga bekerja sebagai fermenter bahan-bahan organik di dalam saluran pencernaan menjadi asam-asam amino serta gula-gula sederhana dalam bentuk terlarut sehingga lebih mudah diabsorpsi (Higa dan Parr, 1994). Penambahan probiotik EM4 dalam ransum dapat menurunkan kadar kolesterol dan low density lipoprotein (LDL), sebaliknya dapat meningkatkan high density lipoprotein (HDL) dalam darah. Low density lipoprotein (LDL) berkaitan erat dengan sejumlah kadar kolesterol dalam sirkulasi darah, dimana semakin tinggi kadar kolesterol semakin tinggi juga LDL-nya
xvii
(Suwidjayana et al., 1997). Dalam proses fermentasi glikosida, pati, dan hemiselulosa ransum dihasilkan asam laktat dan asam lemak atsiri yang kemudian memasuki sirkulasi darah melalui proses absorpsi saluran pencernaan untuk selanjutnya dibawa ke hati (Mustchler, 1991 dan Susila et al., 1998).
2.3
Usus Usus atau intestine adalah bagian dari sistem pencernaan yang bermula dari
kaudal lambung hingga anus. Pada usus terdiri dua bagian yaitu : usus halus dan usus besar (kolon). Pada usus halus terbagi lagi menjadi duodenum, jejunum dan ileum sedangkan usus besar terbagi menjadi cecum, kolon dan rektum. Tahap akhir dari proses pencernaan makanan terjadi di bagian usus dengan bantuan bermacam-macam enzim. Enzim-enzim yang terdapat pada usus halus dapat memecah karbohidrat menjadi monosakarida, lemak menjadi asam-asam lemak dan gliserol, serta protein menjadi asam-asam amino. Setelah menjadi molekul-molekul berukuran kecil barulah dapat diabsorbsi ke dalam peredaran darah (Travis, 2003). Pada sistem saluran pencernaan sebenarnya berlangsung beragam fungsi metabolisme dalam menjaga keseimbangan tubuh sehingga tetap dalam keadaan sehat. Dalam hal ini mencakup peran mikroba yang menghuni saluran pencernaan tersebut, khususnya peran mikroba yang menguntungkan (Travis, 2003; Hall, 2006). Pada waktu lahir usus bersifat steril, tetapi jasad renik segera masuk bersama dengan makanan. Pada anak hewan yang disusui, usus banyak mengandung streptococcus asam laktat dan laktobaksil. Dengan berkembangnya pola dan kebiasaan makan ketika beranjak dewasa, flora usus berubah. Pada usus terdapat banyak bakteri,
xviii
pada duodenum terdapat 103-106 bakteri/g isi lambung; dalam jejunum dan ileum terdapat 105-108 bakteri/g isi lambung; dan dalam sekum dan kolon terdapat 108-1010 bakteri/g. Pada usus halus bagian atas terutama terdapat laktobaksil dan enterococcus, tetapi pada ileum bagian bawah dan sekum, floranya merupakan flora tinja (Jawetz et al., 1995).
2.4
Hati Hati merupakan organ dalam terbesar, dan merupakan kelenjar terbesar pada
tubuh. Hati terletak di dalam rongga abdomen, terdiri dari lobus kanan dan lobus kiri (Ressang, 1984). Setiap lobus hati dibagi menjadi struktur yang dinamakan lobulus. Setiap lobulus merupakan bentuk heksagonal, terdiri atas Lempeng-Lempeng sel hati berbentuk kubus yang tersusun radial mengelilingi vena centralis dan di antara sel-sel hati tersebut terdapat kapiler-kapiler atau sinusoid. Sinusoid hati adalah saluran darah yang berliku-liku dan melebar, dengan diameter tidak teratur dilapisi sel endotel bertingkat tidak utuh ,yang dipisahkan dari hepatosit di bawahnya oleh ruang perisinusoidal (Price dan Wilson, 1984). Fungsi hati memegang peranan sangat vital yaitu fungsi sirkulasi, fungsi metabolisme, fungsi sekresi dan ekskresi, fungsi hematologi serta fungsi proteksi dan detoksifikasi. Fungsi sirkulsi hati berperan sebagai organ reservoir darah. Hati mempunyai sistem peredaran darah yang amat baik, yaitu dengan adanya sinusoid hepatik. Fungsi metabolisme dimana pada hati terjadi proses biotransformasi sari makanan seperti karbohidrat, lemak, protein, vitamin dan mineral yang sangat penting sebagai sumber energi bagi tubuh dan prekursor enzim-enzim. Fungsi hati untuk
xix
mengsekresi dan ekskresi empedu mempunyai beberapa manfaat yang penting bagi tubuh yaitu empedu membantu pencernaan lemak makanan dan eksresi zat-zat lain yang tidak berguna bagi tubuh. Fungsi hematologik hati berfungsi pada produksi fibrinogen, trombosit, heparin dan destruksi eritrosit pada orang dewasa. Pemecahan eritrosit menjadi komponen-komponennya juga terjadi di hati. Fungsi hati sebagai proteksi dan detoksifikasi dikerjakan oleh sel-sel Kupfer yang mempunyai kemampuan untuk fagositosis. Sel Kupfer merupakan alat penyaring terhadap kuman-kuman atau benda asing yang masuk ke dalam hati lewat darah vena porta. Kerusakan hepar dapat diakibatkan konsumsi kronik alkhohol, kegemukan yang berlebihan, diet yang tidak tepat, masuknya obat atau zat berbahaya ke dalam tubuh, dapat juga karena infeksi. Hal tersebut mengakibatkan kerusakan pada pembuluh darah yang berefek terhadap kerusakan sel-sel hati (Ressang, 1984).
2.5
Ginjal Ginjal merupakan organ besar berbentuk seperti kacang, yang terletak di bagian
retroperitoneal pada dinding posterior tubuh. Ginjal sebelah kanan lebih rendah dibandingkan ginjal kiri karena tertekan ke bawah oleh hati (Price dan Wilson, 1995). Ginjal secara anatomis dibagi menjadi bagian korteks di sebelah luar yang mengandung semua kapiler glomerulus dan sebagian segmen tubulus pendek dan bagian medula di sebelah dalam tempat sebagian besar segmen berada. Berat ginjal normal 0,5 % dari berat tubuh hewan (Harison, 2000). Fungsi utama dari ginjal adalah berperan dalam pengaturan volume dan kimia darah. Ginjal melakukan fungsi vital ini dengan cara mengeksresikan zat terlarut dan air
xx
secara selektif. Selain itu ginjal juga berperan penting dalam mempertahankan keseimbangan
asam-basa.
Sebagian
besar
proses
metabolisme
dalam
tubuh
menghasilkan asam, hanya ginjal yang mampu mengeliminasi asam-asam yang tidak mudah menguap. Yang lebih penting lagi, ginjal memiliki tugas penting untuk menyerap ulang sejumlah besar bikarbonat basa yang difiltrasi secara bebas di glomerulus. Tanpa fungsi ini dapat terjadi pH darah yang rendah yang berakibat kematian (Price dan Wilson, 1995). Hampir tiap substansi kimia berpengaruh pada kerja ginjal, sehingga jika bekerja cukup berat maka akan mengakibatkan degenerasi parenkimatosa pada kortek ginjal. Ginjal sedikit membesar serta kortek membengkak. Secara mikroskopis epitel pada tubulus konvulatus bengkak dan pada tubulus ditemukan adanya eksudat albuminosa. Penelitian lain mengatakan bahwa berbagai bahan atau substansi kimia tersebut dapat menimbulkan degenerasi albuminosa, degenerasi melemak dan nekrosis dari sel-sel epitel tubulus (Jubb et al.,1985).
xxi
BAB III METODE PENELITIAN
3.1
Rancangan Penelitian Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 5 jenis
perlakuan dan dengan 5 kali ulangan, dimana sebanyak 25 ekor tikus secara acak dibagi menjadi 5 kelompok. Perlakuan EM4® per oral dengan dosis bertingkat disajikan pada skema rancangan penelitian Tabel 3.1. Perlakuan dengan menggunakan bantuan sonde, diberikan satu kali setiap hari selama 28 hari. Tabel 3.1. Tabel Rancangan Penelitian
Kontrol
Dosis Pemberian (per ekor) 1 ml aquadest
Jumlah Ulangan (ekor) 5
EM4A
0,25 ml EM4®
5
EM4B
0,50 ml EM4®
5
EM4C
1,00 ml EM4®
5
EM4D
2,00 ml EM4®
5
Perlakuan
25
Total
3.2
Variabel Penelitian Variabel bebas pada penelitian ini adalah dosis EM4®. Variabel yang
dikendalikan yaitu hewan coba, umur, strain, berat badan, pakan dan minum, kandang, peralatan yang digunakan serta lama perlakuan. Variabel tergantung yang diamati pada penelitian ini yaitu gambaran histopatologi usus, hati dan ginjal.
xxii 11
3.3
Bahan Penelitian Bahan yang dipergunakan dalam penelitian ini yaitu Effective Microorganisme-4
(EM4®) produksi PT. Songgolangit Persada. Hewan coba yang digunakan adalah tikus putih (Rattus novergicus) umur 3 bulan dengan berat badan rerata 200 gram. Pakan yang diberikan produksi PT. Charoen Pokphand Indonesia dengan kode pakan 551 yang memiliki komposisi air max 13%, protein kasar 19,5%, lemak kasar 4%, serat kasar max 6%, abu max 8%, kalsium 0,9% dan fosfor 0,7%. Minuman diberikan air bersih secara ad libitum. Berbagai bahan dan alat yang digunakan sebelum pemeriksaan sampel meliputi kandang tikus, sonde dengan desain khusus, timbangan, pot plastik, box plastik, spuite 3 ml, gunting bedah, pinset, sarung tangan, aquades, tissue, kapas, alkohol 70% dan ether.
3.4
Instrumen Penelitian Instrumen yang dipergunakan pada penelitian yaitu seperangkat alat nekropsi
yaitu pisau bedah, gunting bedah dan pinset. Seperangkat alat untuk pemeriksaan histopatologi usus, hati dan ginjal. Pembuatan preparat histopatologi (tissue processing) sesuai metode Humason (1972).
3.5
Prosedur Penelitian Effective Microorganisms yang digunakan EM4® produksi PT. Songgolangit
Persada kemasan 1 liter yang mengandung kombinasi bakteri fotosintetik, bakteri asam laktat, Yeast dan Actinomyces. Uji Viabilitas dengan menumbuhkan EM4® pada media NA dan didapatkan jumlah bakteri hidup 29,7 x 107 cfu/ml.
xxiii
3.5.1 Pemberian EM4® Persiapan hewan coba dengan mengadaptasikan tikus pada kandang percobaan selama 7 hari dan dilanjutkan dengan adaptasi pengenalan sonde dengan diberikan aquadest selama 7 hari. Effective Microorganism-4 diberikan secara per oral satu kali setiap hari selama 28 hari. Dosis bertingkat yang diberikan sebagai berikut: kelompok kontrol = tanpa pemberian EM4® tetapi diberikan 1 ml aquadest per ekor, kelompok EM4A = diberikan dosis 0,25 ml EM4® per ekor, kelompok EM4B = diberikan dosis 0,5 ml EM4® per ekor, kelompok EM4C = diberikan dosis 1 ml EM4® per ekor, kelompok EM4D = diberikan dosis 2 ml EM4® per ekor. Pakan diberikan pagi dan sore hari, 10 gram per ekor tikus setiap pemberian dan air minum diberikan ad libitum. 3.5.2 Pengambilan Sampel Sebelum dilakukan nekropsi sesuai metode Hussein (2008), tikus terlebih dahulu dieuthanasia dengan menggunakan ether di dalam box plastik. Nekropsi dilakukan sesuai prosedur nekropsi pada mamalia. Setelah dilakukan nekropsi selanjutnya organ usus, hati dan ginjal diambil dan dimasukkan ke dalam pot plastik yang telah berisi buffer formalin 10%, selanjutnya dibuat preparat histopatologi dengan pewarnaan HE metode Harris (Humason, 1972). 3.5.3 Pembuatan preparat histopatologi Proses pembuatan preparat histopatologi dengan tahap tissue processing sesuai metode Humason (1972). Sampel usus, hati dan ginjal yang telah direndam di dalam Neutral Buffered Formalin (NBF) 10% dipindahkan direndam secara bertingkat ke dalam alkohol 70% selama 2 jam, alkohol 80% I selama 1 jam, alkohol 80% II selama
xxiv
1 jam, alkohol 90% selama 2 jam dan alkohol 96% selama 2 jam. Kemudian dilanjutkan tahap clearing dengan merendam organ ke dalam alkohol absolute I dan absolute II masing-masing selama 2 jam. Tahap selanjutnya sampel organ tersebut dimasukkan ke dalam paraffin I dan paraffin II masing-masing selama 2 jam (dicetak menggunakan sepasang plat “L”). Perendaman paraffin digunakan sebagai zat penunjang untuk mempermudah pekerjaan pada saat pemotongan jaringan menggunakan mikrotom dengan ketebalan 4-5 µm. Prosedur pewarnaan Harris Hematoxylin dan Eosin adalah sebagai berikut : sampel organ yang telah menjalani Tissue Processing dan dipotong, dimasukkan ke dalam xylol I, II, dan III masing-masing selama 5 menit bertujuan untuk melarutkan paraffin yang masih ada di dalam jaringan (deparafinisasi). Dilanjutkan dengan perendaman secara berurutan ke dalam alkohol 100% sebanyak 2 kali masing-masing selama 5 menit, aquades selama 1 menit dan zat warna Harris-Hematoxylin selama 15 menit. Proses berikutnya dimasukkan ke dalam aquades selama 1 menit (digerakkan naik turun) bertujuan untuk pencucian zat warna, alkohol 1% sebanyak 7-10 celupan untuk melarutkan Hematoxylin yang ada di luar inti sel, aquades I selama 1 menit untuk menghentikan reaksi acid alcohol, aquades II selama1 menit untuk mengembalikan warna biru pada inti sel. Selanjutnya dimasukkan ke dalam alkohol 96% I, II dan alkohol 100% I,II masing-masing selama 3 menit (untuk menarik air dari dalam sel) serta ke dalam xylol IV dan V masing-masing selama 5 menit untuk menarik alkohol dari dalam sel. Terakhir dilakukan penutupan dengan cover glass (mounting) yang direkatkan dengan entellan. Preparat histologi yang sudah jadi kemudian diperiksa di bawah mikroskop (Humason, 1972).
xxv
Pemeriksaan preparat histologi dilakukan masing-masing pada 5 lapang pandang mikroskopik, pada pembesaran 10x40. Perubahan histopatologi usus akibat pemberian EM4® diamati berdasarkan ditemukan adanya degenerasi hidrofik, degenerasi melemak dan nekrosis pada usus. Perubahan ini merupakan tanda adanya keracunan (intoksikasi).
3.6 Lokasi dan Waktu Penelitian Tempat penelitian di Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Veteriner, Laboratorium Mikrobiologi Veteriner dan Laboratorium Patologi Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana selama 3 bulan.
3.7 Analisis Data Data hasil pemeriksaan histopatologi organ usus, hati dan ginjal tikus putih yang diberikan EM4® akan dianalisa dan disajikan secara deskriptif.
xxvi
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Pemeriksaan histopatologi usus Pemeriksaan dilakukan terhadap preparat histopatologi dari sampel organ usus
halus, hati dan ginjal dari 25 ekor tikus putih yang dipakai penelitian. Pengamatan dilakukan pada lima lapang pandang mikroskopik (HE. 10 x 40). Berdasarkan pemeriksaan histopatologi usus halus tidak ditemukan adanya perubahan struktur umum fili-fili usus, sel-sel epithel penyusun mukosa maupun lapisan-lapisan di bawahnya. Gambar histopatologi usus halus hasil penelitian masing-masing kelompok perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.1.a (K), b (EM4A), c (EM4B), d (EM4C) dan e (EM4D).
Keterangan gambar : A = Villi pada Tunika mukosa B = Tunika muskularis C = Ruang intervilus D = Serosa Tanda panah menunjukkan fi li usus (Gambar 4.1.b, c, d dan e)
A B C D
Gambar 4.1.a
Gambar 4.1.a. Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok Kontrol (tanpa diberi probiotik EM4®). Tampak struktur fili usus normal (HE. 10x40).
16 xxvii
Gambar 4.1.c
Gambar 4.1.b
Gambar 4.1.b. Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4A (pemberian probiotik EM4® dosis 0,25 ml) . Tampak struktur fili usus normal (HE. 10x40). Gambar 4.1.c. Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4A (pemberian probiotik EM4® dosis 0,50 ml) . Tampak struktur fili usus normal (HE. 10x40).
Gambar 4.1.d
Gambar 4.1.e
Gambar 4.1.d. Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4C (pemberian probiotik EM4® dosis 1 ml) . Tampak struktur fili usus normal (HE. 10x40). Gambar 4.1.e. Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4D (pemberian probiotik EM4® dosis 2 ml). Tampak struktur fili usus normal (HE. 10x40).
4.2
Pemeriksaan histopatologi hati Berdasarkan pemeriksaan histopatologi jaringan hati tidak ditemukan adanya
perubahan patologik baik berupa degenerasi hidrofik, degenerasi melemak maupun nekrosis. Gambar histopatologi hati masing-masing kelompok perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.2.a (K), b (EM4A), c (EM4B), d (EM4C) dan e (EM4D). Pengamatan dilakukan pada lima lapang pandang mikroskopik (HE. 10 x 40).
xxviii
C
B A
Keterangan gambar : A = Vena Portae B = Sinusoid C = Hepatosit Tanda panah menunjukkan vena porta pada Gambar 4.2.b, c, d dan e
Gambar 4.2.a
Gambar 4.2.a. Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok Kontrol (tanpa diberi probiotik EM4®). Struktur histopatologi hati tampak normal (HE. 10x40).
6 Gambar 4.2.c
Gambar 4.2.b
Gambar 4.2.b. Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4A (pemberian probiotik EM4® dosis 0,25 ml). Struktur histopatologi hati tampak normal. (HE.10x40). Gambar 4.2.c. Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4B (pemberian probiotik EM4® dosis 0,5 ml). Struktur histopatologi hati tampak normal. (HE.10x40).
Gambar 4.2.e
Gambar 4.2.d
Gambar 4.2.d. Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4C (pemberian probiotik EM4® dosis 1 ml). Struktur histopatologi hati tampak normal (HE. 10x40).
xxix
Gambar 4.2.e. Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4D (pemberian probiotik EM4® dosis 2 ml). Struktur histopatologi hati tampak normal (HE. 10x40). 4.3 Pemeriksaan histopatologi ginjal Berdasarkan pemeriksaan histopatologi jaringan ginjal tidak ditemukan adanya perubahan patologik berupa degenerasi hidrofik, degenerasi melemak maupun nekrosis. Gambar histopatologi ginjal masing-masing kelompok perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.3.a (K), b (EM4A), c (EM4B), d (EM4C) dan e (EM4D). Pengamatan dilakukan pada lima lapang pandang mikroskopik (HE.10 x40)
Keterangan gambar : Tanda panah menunjukkan Glomerulus (Gambar 4.3.a, b, c, d dan e)
Gambar 4.3.a
Gambar 4.3.a. Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok Kontrol (tanpa diberi EM4®). Tampak struktur Glomerulus dan Tubulus normal (HE. 10x40).
Gambar 4.3.c
Gambar 4.3.b
Gambar 4.3.b. Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok EM4A (pemberian probiotik EM4® dosis 0,25 ml). Tampak struktur normal (HE. 10x40). Gambar 4.3.c. Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok EM4B (pemberian probiotik EM4® dosis 0,50 ml). Tampak struktur normal (HE. 10x40).
xxx
Gambar 4.3.e
Gambar 4.3.d
Gambar 4.3.d. Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok EM4C (pemberian probiotik EM4® dosis 1 ml). Tampak struktur normal (HE. 10x40). Gambar 4.3.e. Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok EM4D (pemberian probiotik EM4® dosis 2 ml). Tampak struktur normal (HE. 10x40).
4.4
Pembahasan Seperti yang telah diketahui bahwa organ tubuh seperti usus, hati dan ginjal
memegang peran yang sangat vital dalam proses metabolisme tubuh. Fungsi yang dimiliki berbeda-beda dari masing-masing organ akan tetapi saling terkait dalam proses pemenuhan kebutuhan hidup. Pada usus halus berlangsung proses pencernaan tahap akhir dengan bantuan bermacam-macam enzim memecah karbohidrat menjadi monosakarida, lemak menjadi asam-asam lemak dan gliserol, serta protein menjadi asam-asam amino. Setelah menjadi molekul-molekul berukuran kecil barulah dapat diabsorbsi ke dalam peredaran darah (Travis, 2003; Hall 2006). Nutrisi berupa molekul monosakarida, asam-asam lemak, gliserol dan asam-asam amino yang terabsorbsi bersama peredaran darah dibawa ke hati (Mustchler, 1991). Di dalam hati asam laktat diubah menjadi glukosa melalui proses glukoneogenesis (Susila et al., 1998). Residu dari proses biotransformasi hati dan metabolitnya akan diekskresikan melalui ginjal, khususnya metabolit yang tidak mudah menguap. Reabsorpsi tubulus untuk kebanyakan metabolit berlangsung secara difusi pasif tergantung pada sifat kelarutan dan pKa-nya xxxi
sehingga merperberat kerja ginjal. Hampir tiap substansi kimia berpengaruh pada kerja ginjal, sehingga besar kemungkinan potensi terjadinya degenerasi (Harper et al., 1987 dan Mustchler, 1991). Fakta pemberian EM4 sudah banyak dilaporkan mampu meningkatkan performa hewan ternak, akan tetapi pada penelitian ini ingin di tinjau apakah efek pemberian EM4 tersebut juga berpengaruh tidak baik terhadap organ-organ yang terlibat seperti usus, hati dan ginjal serta kemungkinan terjadinya toksisitas. Berdasarkan pengamatan histopatologi usus, hati dan ginjal diperoleh hasil bahwa tidak terdapat perbedaan gambaran struktur histologis antara kelompok kontrol (K) dengan kelompok perlakuan (EM4A, EM4B, EM4C dan EM4D) (seperti pada gambar 4.1. a, b, c, d, e; gambar 4.2. a, b, c, d, e dan gambar 4.3. a, b, c, d, e). Dari pengamatan histopatologi usus secara umum fili-fili usus dalam keadaan normal, tidak ditemukan adanya perubahan degenerasi melemak, degenerasi hidrofik maupun nekrosis sebagai tanda-tanda dari kejadian toksisitas. Tanda peradangan maupun infeksi juga tidak ada dengan tidak ditemukannya infiltrasi sel-sel radang maupun kerusakan pada fili-fili dan mukosa usus. Hasil pengamatan histopatologi hati tampak struktur hati dalam keadaan normal. Tidak ditemukan gambaran degenerasi, nekrosis, hiperemi maupun keberadaan sel-sel Kupfer di sekitar vena porta dan sinusoid hati sebagai tanda adanya peradangan atau infeksi. Pada
pengamatan histopatologi ginjal juga tidak
ditemukan perubahan yang menunjukkan degenerasi melemak, degenerasi hidrofik maupun nekrosis. Tidak ditemukan hiperemi maupun keberadaan infiltrasi sel radang berupa leukosit. Tidak ditemukan adanya kerusakan tubuli, deposit protein dan pada sel
xxxii
epithel tidak mengalami nekrosis fibrinoid seperti halnya pada kejadian infeksi atau terinduksi zat kimia. Hasil ini menunjukkan bahwa probiotik EM4® tidak menggangu aktivitas ataupun kerja dari organ-organ vital tersebut dan tidak menimbulkan toksisitas pada struktur jaringan usus, hati dan ginjal. EM4® mampu memberikan pengaruh positif terhadap kesehatan hewan dengan cara memperbaiki sifat-sifat yang dimiliki mikroba alami yang ada di dalam tubuh manusia atau hewan tersebut sehingga dapat mengembalikan keseimbangan rasio antara bakteri patogen dan nonpatogen saluran pencernaan, sehingga jumlah bakteri non patogen meningkat dengan cepat. Hasil ini sejalan dengan hasil penelitian yang dilaporkan oleh Zhou et al. (2000), bahwa pemberian probiotik strain Lactobacillus rhanosus HN001 (DR20TM), Lactobacillus acidiphilus HN017 dan Bifidobacterium lactis HN019 (DR10TM) pada mencit Balb/c selama delapan hari secara oral tidak menimbulkan efek pada kondisi kesehatan mencit. Tidak menimbulkan perubahan struktur morfologi sel-sel lymfonodus, hati, usus dan ginjal. Selain itu juga tidak ditemukan adanya bakteri yang tumbuh dari isolat darah yang ditanam pada media agar. Hasil ini ditunjang pula oleh penelitian Lara et al (2007), yang melaporkan bahwa pemberian probiotik Lactobacillus salivarius strain CECT5713 pada mencit Balb/c selama 28 hari secara intraperitoneal, didapatkan hasil bahwa tidak ditemukannya bakteri pada jaringan tymus, ginjal, jantung, hati dan usus. Secara patologi anatomi juga tidak ditemukan adanya perubahan pada organ-organ tersebut. Mekanisme kerja probiotik pada saluran pencernaan berkoloni dengan sel-sel enterosit dan tidak ikut serta dalam sistem sirkulasi darah. Dalam kompetisi mikroflora
xxxiii
menguntungkan akan semakin banyak membentuk koloni dan memungkinkan lebih banyak melakukan perlekatan (adhesion) pada sel-sel enterosit, sehingga berefek pada meningkatnya barier mukosa usus. Kolonisasi ini juga memperkecil peluang bakteri patogen untuk melakukan perlekatan dengan sel enterosit. Bakteri yang memperlihatkan kemampuan berkolonisasi kuat dengan sel-sel epithel usus manusia seperti L. casei, L. acidophillus, L. plantarum dan sejumlah besar Bifidobacteria (Ouwehand, 1998). Sesuai dengan hasil penelitian Sukrama (2009), bahwa protein adesin Bifidobacterium sp. dengan berat 51,74 kDa dapat menghambat adesi Salmonella typhi pada sel enterosit mencit tidak terjadi invasi oleh Salmonella typhi. Interaksi ini juga menginduksi pelepasan IL-6 dan IL-10, juga merangsang peningkatan aktivitas sel-sel penghasil IgA. Peran probiotik lainnya mampu memodulasi respon kekebalan tubuh dengan merangsang sekresi imunoglobulin A (IgA) pada mukosa usus sehingga berefek pada peningkatan kekebalan tubuh terhadap infeksi bakteri patogen dalam gastrointestinal (Klaenhammer, 2001). Kemampuan lain bakteri asam laktat seperti genus Lactobacillus dalam EM4® untuk memproduksi senyawa bioaktif yaitu asam laktat dan senyawa antibiotika akan menekan pertumbuhan mikroorganisme patogen. Sejalan dengan penelitian yang mengungkapkan asam laktat dengan cepat menyebabkan keasaman yang tinggi dengan menurunkan pH sampai pH 3-5 sehingga mampu menekan perkembangan bakteri patogen (Oktaviani, 2004). Senyawa antimikroba yang dihasilkan antara lain hidrogen peroksida, reuterine, bakteriosin, aldehid, keton, alkohol dan diasetil (Jenie dan Rini, 1995; Ouwehand, 1998).
xxxiv
Secara normal di dalam saluran pencernaan dihuni oleh mikroflora normal yang sering disebut dengan mikroorganisme komensal yang menguntungkan bagi kesehatan. Mikroflora di dalam saluran pencernaan secara umum dibedakan menjadi dua yaitu mikroflora transien dan mikroflora residen. Mikroflora transien terdiri atas organisme yang sangat beragam, bersifat patogen dan non patogen serta tidak mampu mempertahankan diri dari tekanan-tekanan kompetisi mikroorganisme lainnya. Sedangkan mikroflora residen adalah mikroorganisme yang bersifat non patogen dan mampu beraktivitas
mempertahankan dirinya
dari tekanan-tekanan kompetisi
mikroflora lain (Klaehammer, 2001), dan probiotik EM4® termasuk dalam mikroflora residen. Peningkatan jumlah bakteri non patogen yang menguntungkan akan memberikan suasana gastrointestinal lebih sehat sehingga mampu meningkatkan penyerapan nutrisi di dalam usus.
xxxv
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1
Kesimpulan Pemberian probiotik EM4® secara oral tidak berpengaruh terhadap gambaran
histopatologi usus, hati dan ginjal tikus putih (Rattus norvegicus).
5.2
Saran 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut penggunaan probiotik EM4® dengan dosis lebih tinggi dan waktu yang lebih lama dari 28 hari. 2. Probiotik EM4® tidak berbahaya diberikan pada hewan ternak untuk meningkatkan performa dan kesehatan hewan ternak.
xxxvi 25
DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, R.Z. 2005. Pemanfaatan Khamir Saccharomyces cerevisae untuk Ternak. Wartazoa Vol. 15 No. I. Hal : 49-55. Axelson, L.T. 1998. Lactic Acid Bacteria: Classification and Phisiology. In: S. Salminen and A. von Wright (Eds.) Lactic Acid Bacteria. Marcel Decker Inc., New York. Chiang, S.H. and Hsieh. 1995. Effect of Direct Feed Microorganisms on Broiler Growth Performance and Litter Ammonia Level. Asian-Aus.J.Anim.Sci. 8: 159-162. Daud, M., W.G. Pilliang dan I.P. Kompiang. 2007. Persentase dan Kualitaskas ayam Pedaging yang diberi Prebiotik dan Probiotik ke dalam Ransum. JITV. Vol. 12 No. 3. Hal: 167-174. Fuller, R. 1992. Probiotics: The scientific Basis. Chapman and Hall. London Hall, J.E. 2006. Commensal Bacteria of the GI Tract: Benefits of Probiotic Supplementation. The Nutrition Science. USA. Manatech. Harper, H.A., V.W. Rodewell, P.A. Moyes and D.K. Granner. 1987. Biokimia (Review Of Biochemistry). Edisi 20. Penrbit Buku Kedokteran EGC Jakarta. Higa, T and J.F. Parr. 1994. Beneficial and effective Microorganisms for Sustainable Agriculture and Enviroment. International Nature Farming Reseach Centre, Atami, Japan. 26 Harison. W. G. 2000. Pengantar Patologi Umum. Edisi Ketiga. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. 46
Humason, GL. 1972. Animal Tissue Techniques. 3rd. WH. Freeman and Co. Hussein, FN. 2008. Anesthesia and Euthanasia in Laboratory Animals. Workshop on the Care and Use of Lab An Res. Collaboration Fac. Vet. Med. Airlangga University and Fac. Vet. Med. UPM. Malaysia. Jawetz, Melnick and Adelberg. 1995. Medical Microbiology. 20/E. Jenie, S.L., dan S.E. Rini. 1995. Aktivitas Antimikroba dari Beberapa Species Lactobacillus terhadap Mikroba Patogen dan Perusak Makanan. Bul. Teknologi dan Industri Pangan. 7(2):46-51. Jubb, K. V. F., P. Carletonm., Kennedy. Dan N. V. Palmer. 1985. Pathology of The Domestic Animals. Academic Press INC. Orlando. Florida. Klaenhammer, T.R. 2001. Probiotics and Prebiotics. In : M. P. Doyle et al. Food Microbiology: Fundamental and Frontiers, 2nd Ed. ASM Press. Washington D.C. xxxvii
Lara, V., S. Sierra, M.P.D. Ropero, M. Olivares and J. Xaus. 2007. Safety Assesment of the Isolated Probiotic Lactobacillus salivarius CECT5713. Journal of Diary Science. http:jds.fass.org/cgi/content/full/90/8/3583. Tgl akses 22 September 2010. Mitsuoka, T. 1990. A Profile of Intestinal Bacteria. Yakult Honsha. Co. Ltd. Japan. Mustchler, E. 1991. Dinamika Obat. Terjemahan: M.B. Widianto dan A.S. Ranti. Penerbit ITB. Bandung. Oktaviani, D. 2004. Effektivitas Bakteriosin dari Lactobacillus plantarum terhadap Masa Simpan Filet Nila Merah pada Suhu Rendah. Skripsi. Unpad. Jatinangor. Ouwehand, A.C. 1998. Antimicrobial Component from Lactic Acid Bacteria. In: S. Salminen and A. von Wright (Eds.) Lactic Acid Bacteria. Marcel Decker Inc., New York. Purnomo, W. dan J. Julaeha. 2006. Pengaruh Pemberian EM Jamu Untuk Itik Gembala Terhadap Produksi dan Bobot Telur. Jurnal Penyuluhan Veteriner. Vol. 1, No. 2. Price, S. A. dan L. M. C. Wilson. 1995. Pathofisiology : Clinical Concept of Disease Process. Alih Bahasa Oleh Adji Dharma. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta. Ray, B. 2004. Fundamental Food Microbiology. 3rd Ed. CRC Press, Boca Raton, Florida. Ressang, A.A. 1984. Patologi Khusus Veteriner .Edisi Kedua . Percetakan Bali. Denpasar. Rusdi, I., Haryanti and R. Meliawati. 2005. Penggunaan Bakteri Probiotik pada Pemeliharaan Kepiting Bakau (Scylla paramamosain). Prosiding Seminar Iptek Kelautan, Hal: IKN 57-60. Sukaryani, S. 1997. Ragi, Bahan Makanan Ternak Alternatif Berprotein Tinggi. Poultry Indonesia. Nomor 205/Maret 1997, Hal. 15-16. Sukrama, I D.M. 2009. Protein Adesin Dinding Sel Bifidibacteria sp Berat 57,41 kDa Menghambat Adesi Salmonella typhi Pada Sel Mencit. Disertasi. Universitas Udayana. Susila, T.G.O., T.J. Putri., N.N.C. Kusumawati dan N.N. Siti. 1998. Penggunaan EM4 (Effective Microorganisms) sebagai Sumber Probiotik pada Ternak Babi yang diberi ransum Mengandung Limbah Hotel. Laporan Penelitian Berbagai Bidang Ilmu. Ditbinlitabmas. Dirjen Dikti, Fapet, Unud, Denpasar. Suwidjayana, I.N., T.G.B. Yadnya dan I.G.N.G. Bidura. 1997. Evaluasi Tingkat Pemberian Serat Kasar dalam Ransum dan EM4 Terhadap Efisiensi Penggunaan Pakan, Kadar Profil Lemak darah Ayam Broiler, Berat Karkas dan Sanitasi
xxxviii
Lingkungan. Laporan Penelitian BBI, Ditbinlitabmas, Dirjen Dikti, Fapet, Unud, Denpasar. Suwidjayana, I.N. dan I.G.N.G. Bidura. 2000. Khasiat Ragi Tape dan Effective Microorganism Menurunkan Kolesterol dan Lemak Karkas Itik. Laporan Penelitian: Proyek Pengkajian dan Penelitian Ilmu Pengetahuan Terapan, Dirjen Dikti, Departemen P dan K. Univ. Udayana. Travis, J. 2003. Gut Check : The Bacteria In Your Intestines are Wellcome Guest. Science News. 163(22):344-352. Wididana, G.N., S.K. Riyatmo, T. Higa. 1996. Teknologi Effective Microorganism. Koperasi Karyawan Departemen Kehutanan. Jakarta. Wina, E. 2005. Teknologi Pemanfaatan Mikroorganisme Dalam Pakan untuk Meningkatkan Produktivitas Ternak Rumunansia di Indonesia: Sebuah Review. Wartazoa Vol. 15, N0. 4, Hal: 173-186. Zhou, J., S.Q. Shu, K.J. Rutherfurd, J. Prasad, P.K. Gopal and H.S. Gill. 2000. Acute Oral Toxicity and Bacterial Translocation Studies on Potentially Probiotic Strains of Lactid Acid Bactertia. http://www.sciencedirect.com/science. Tanggal akses : 7 Juli 2010.
xxxix
