POSTER-3 The Role of Mast Cells on Receptor Antigen Presenting Cell Expression After PROTEIN IMMUNOGEN Brucella abortus S-19 Injection Oleh :Budi Utomo1, Retno Bijanti2 1,2
Laboratorium Phatology Clinic Laboratory, Faculty of Veterinary Medicine Klinik Veteriner Airlangga University, Mulyorejo Kampus C UNAIR, Surabaya 60115 Telp: 031-5552785, Fax : 031-5993015 Abstract Brucellosis caused by Brucella spp is a major zoonotic disease. Brucella are facultativr intraseluler bacteria which develop mainly in the Reticulo Endothelial Syatem (RES) and occasionally in other target organs, such as joints and placenta, and can cause abortus in cattle. The major species involved in bovine brucellosis is Brucella abortus. In many parts of the world, vaccination of cattle is done by inoculation calves with Brucella abortus S-19 . In fact, the virulent and apparently unstable, creating the need for improved vaccines for addition, Brucella spp may ar may not provide cross protection against Brucella spp, hampering the acceleration of vaccine development. Serodiagnosis by conventional tests, which principally measure antibody to Smooth Lipopolysaccharide (S-LPS), does not permit a clear cut distinction between vaccinated and infected cattle. Thus, work actually performed in the field of bovine brucellosis identifies protective antigens and antigens useful for diagnosis. The purpose of the present study will to investigate by SDS-PAGE and Immunoblot analysis (WesternBlotting ) using the anti-OMP poliklonal antibody the potential usefulness of these Outer Membrane Proteins as diagnostic antigens. The result of the molecular weight of Outer Membrane Proteins (OMP) by using SDS-PAGE is 6,5 ; 20,1 ; 29,0 ; 66,0 ; 116,0 ; 205,0 kDa. In the next stage of the research characterization protein OMP is 13,4 ; 14,6 ; 37,2 ; 61,8 and 164,1 kDa ,by using the anti-OMP polyclonal antibody the potential usefulness of these OMPs as diagnostic antigens . Inlast step from protein OMP by using indirect ELISA , the OD are 0,325; 0,586; 0,975; 0,643; 0,598 and the highest OD is 0,975 ( protein OMP with molecule weight 37,2 kDa ). “Uji tantang” with protein OMP 37,2 kDa to Rabbit immunization, after three weight, take blood serum and by using indirect ELISA measured. The result is 0,968, so that the conclusion is the protein OMPs with molecule weight 37,2 kDa have potential as Kitt diagnostic. Key words: Zoonotic, SDS-Page, Western Blotting, Outer Membrane Pendahuluan Brucellosis adalah penyakit pada ternak yang bersifat zoonosis disebabkan oleh bakteri dari genus brucella . Pada sapi , domba dan kambing penyakit ini menyerang organ saluran reproduksi terutama plasenta sehingga menyebabkan keguguran , sehingga dikenal juga dengan sebutan penyakit “ Keluron Menular “, Contagious Abortion atau Epizootic Abortion. Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama, Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011 1
POSTER-3 Diagnosis yang tepat penyakit brucellosis sangat diperlukan untuk membantu upaya pencegahan dan penanggulangannya. Diagnosis terhadap penyakit brucellosis di lapangan selama ini hanya berdasarkan dari sejarah penyakit, tanda klinis dan perubahan pasca mati, sedangkan diagnosis di laboratorium dilakukan isolasi – identifikasi kuman penyebab dan uji serologis (Alton et al, 1988) Salah satu factor yang ikut mempengaruhi rendahnya proses vaksinasi terhadap penyakit Brucella adalah transisi penyakit dan pengaruh lingkungan dan ekspresi gene (environment effect and gene expression) (Widjajanto, 2007). Dari penelitian yang telah dilakukan oleh Ratnasari dkk (2004) diketahui bahwa antigen Brucella abortus S19 didapat dari Outer Membrane Protein diduga mempunyai sifat Immunogen. Peran protein immunogenic untuk dipakai dalam proses peningkatan antibody dan penyuntikkan Outer Membrane Protein Brucella abortus S-19 adalah sangat penting dan tidak lepas pula mengetahui peran Mast Cells yang mempunyai fungsi sebagai komponen selluler dari sistim imun (Bellanti, 1993 ). Pentingnya mengtahui peran Mast Cells yang mempunyai fungsi sebagai komponen seluler dari sistim imun , distribusinya perivaskuler dan tersebar pada berbegai daerah “ part of entery” (Bellanti, 1993 ). Sebagai sel imun , Mast cells memiliki berbagai kemampuan sebagaimana yang dimiliki oleh netrofil dan makrofag , selain itu Mast Cells masih mempunyai kelebihan dalam hal ber umur panjang dan memiliki reseptor untuk Ig E . Reaksi Mast Cells setempat dan berbagai sel imun lainnya merupakan “ first layer defense mechanism “ yang penting (Widjajanto, 2004 ). Granula Mast Cells bersama dengan granula dan eosinofil serta berbagai mediator yang dilepaskan oleh makrofag dan netrofil merupakan komponen “innate” .Limfosit T dan limfosit B serta IgG dan IgE merupakan komponen imun spesifik yang memandu aktifitas “sistim Innate “ (Ratnasari dkk , 2004) . Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan Mast Cells dengan ekspresi reseptor Antigen Presenting Cells (APC) setelah injeksi Outer Membrane Protein immunogen Brucella abortus S-19. Penting untuk mengetahui mekanisme antara Mast Cells dengan Antigen Brucella abortus S-19 setelah injeksi Outer Membrane Protein immunogen ,karena peran keduanya sangat mempengaruhi kualitas peran dari protein yang imunogenik- antigenic dan nantinya sangat mempengaruhi pula kualitas vaksin.
Materi dan metode Pembiakan Kuman Brucella abortus S-19 Pembiakan Kuman Brucella abortus S -19 dibiakkan pada media Potato Agar (PA), yang ditempatkan pada botol-botol roux diinkubasikan pada suhu 37 derajat Celcius selama dua hari. Kemudian koloni kuman Brucella abortus yang larut dalam larutan stabilizer dipanen ke dalam tabung . Kemudian larutan disaring dengan kain kasa steril, lalu ambil sebanyak 2 cc masukkan kedalam tabung eppendorf. Pembuatan protein Membran Luar (OMP) Supernatant hasil biakan kuman Brucella abortus S-19 masukkan ke dalam tabung sonikasi dengan ditambahkan larutan Phosphate Buffer Solution (PBS) . Sentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 20 menit, supernatant hasil sentrifus di sonikasi Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama, Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011 2
POSTER-3 dengan alat Ultrasonic homogenizer frekwensi 25 kHz selama 3 X 3 menit ( 3 kali sonikasi setiap sonikasi lamanya 3 menit dan setiap 3 menit sonikasi dihentikan selama 1 menit). Selama proses sonikasi, tabung sonikasi tempat sampel kuman Brucella abortus dimasukkan dalam wadah yang berisi air es (es batu) dan garam, lalu sentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 20 menit, ambil supernatant dan masukkan dalam microcup (supernatant inilah yang kita sebut sebagai protein membrane luar (OMP). Analisis Protein dengan Teknik SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polycrilamid Gel Electrophoresis) Teknik ini dilakukan untuk menentukan berat molekul protein Brucella abortus S-19. Pada teknik ini menggunakan larutan separating gel 12,5% dan larutan stacking gel 15% (Rantam, 2003). Hasil gel yang telah menunjukkan adanya band protein. Perhitungan berat molekul dilakukan dengan perbandingan band protein yang dimaksud dengan standar yaitu marker protein (Color Burst Electroforesis Marker, No. C.4105) (Rantam.,2003 ). Pembuatan Antibodi Poliklonal terhadap Brucella abortus S-19 Pembuatan antibody poliklonal terhadap Brucella abortus S-19 dibuat dengan cara menyuntikkan protein OMP Brucella abortus S-19 dengan dosis ½ dari dosis sapi yaitu nerkisar 20 sampai 60 X 10 pangkat Sembilan/ 0,5 ml pada kelinci jantan melalui subkutan. Booster dilakukan dengan mencampurkan protein membrane luar (OMP) Brucella abortus S-19 dengan Complete Freund’s Adjuvant (CFA), booster pertama dilakukan dua minggu setelah imunisasi. Booster kedua dilakukan dengan interval 10 hari dengan menginjeksi campuran protein membrane luar (OMP) . Karakteristik Protein Membran Luar (OMP) Brucella abortus S-19 dengan Teknik Western Blotting Gel dari hasil SDS –PAGE yang mengandung protein yang terpisah berdasarkan berat molekulnya dilepas dari glass plate dan diletakkan diatas lima kertas Whatmann yang telah di susun dan dipotong dengan ukuran 10 X 12 cm yang telah dibasahi dengan Buffer Transblot dan ratakan sehingga tidak ada udara dibawah gel, kemudian letakkan lima kertas whatmann diatas membrane nitroselulose terlihat ada pitanya (Band) sebagai dokumen. Uji antigenitas dengan Indirect ELISA Prinsip dari teknik Indirect ELISA yaitu mereaksikan antigen sampel dengan antibody yang dilabel enzim . Kompleks antigen dengan antibody yang dilabel enzim kemudian dipisahkan dengan antigen dan antibody yang bebas , lalu di inkubasi dengan substrat kromogenik yang semula tidak berwarna , tetapi kemudian menjadi berwarna apabila di hidrolisa oleh enzim , intensitas warna yang terbentuk dapat di ukur dan merupakan parameter untuk antigen yang di uji ( Rantam, 2003). Antibody poliklonal protein OMP berat molekul spesifik dengan Uji Tantang Imunisasi protein dengan berat molekul protein OMP spesifik di suntikkan ke hewan coba kelinci , ambil serum ( antibody anti OMP murni / hasil elusi ). Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama, Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011 3
POSTER-3 Uji antigenitas dengan teknik indirect ELISA Uji antigenitas protein OMP dengan berat molekul yang spesifik berat molekul pada uji ELISA dengan OD tertinggi. Bila terbukti terjadi ikatan antigen antibody dengan protein OMP berat molekul spesifik , maka berarti protein Outer Membrane Protein Brucella abortus S-19 mempunyai potensi immunogenic sehingga protein OMP tersebut dapat dipakai sebagai bahan Kitt Diagnostik / vaksin .
Diskusi Hasil elektroforesis Outer Membrane Protein Brucella abortus S-19 dengan SDSPage dari analisis karakterisasi protein maka diketahui berat molekul protein membrane luar (OMP) adalah sebagai berikut : 6,5 kDa; 20,1 kDa; 29,0 kDa; 66,0 kDa; 116,0 kDa; 205,0 kDa .
M
1
2
kDa 205,0 116,0
66,0
29,0
20,1
6,5
Gambar
1.
Profil protein OMP B.abortus S-19 dengan Page ( M=marker , dan nomer 1,2 = sampel OMP ).
teknik
SDS-
Hasil analisis berdasarkan berat molekulnya pada penelitian ini , maka isolate OMP B.abortus S-19 dapat dikatagorikan sebagai protein yang mempunyai kemampuan imunogenik, dan dapat merupakan protein yang imunogen seperti yang dikatakan oleh Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama, Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011 4
POSTER-3 Cloeckaert,et al (1992) bahwa protein imunogen yang efektif mempunyai berat molekul ( BM) lebih besar dari 10.000 Da. Kresno, 2000 dan Rantam, 2003 mengatakan bahwa Polycrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) merupakan standard metoda pengujian terhadap berat molekul protein , struktur subunit dan kemurnian protein . Karena protein merupakan molekul yang amphoteric dan mengandung kedua grup karboksil negative dan grup amino yang positif. Semenjak protein dikarakterisasi point isolectric akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda kedaerah elektrik. Selama PAGE protein dipisahkan seperti migrasi melalui matrik tiga dimensi dengan elektrik , maka matrik mempunyai dua fungsi yaitu memisahkan protein sesuai dengan ukuran , bentuk dan muatan listrik dan hal ini memerlukan pH buffer yang sesuai . Polyacrylamiide adalah matrik pilihan untuk memisahkan protein yang mempunyai range dengan berat molekulnya antara 500250.000 pada SDS-PAGE , protein di elektroforesis dalam ionic detergent sodium dodecyl sulfate (SDS). Deterjent akan mengikat residu hidropobik dan bagian belakang peptide dari protein , diperkirakan salah satu dari setiap asam amino,sehingga dapat membuka rantai peptide secara komplit . Dengan demikian protein SDS-Komplek migrasi melalui polyacrylamide tergantung dari berat molekul ,protein migrasi dengan cepat melalui pelarur ion melalui stacking gel kedalam separating gel. Protein terkonsentrasi pada garis yang tipis dan terlarut pada Band yang tipis , pada metoda SDS-PAGE setelah diwarnai akan terlihat Band dengan berat molekul yang besar Menurut Cloeckaert et al., (1992), OMP Brucella abortus dengan berat molekul protein sebesar 36-38 kDa sensitive untuk mendeteksi hewan yang terinfeksi kuman brucella . Hasil karakterisasi Outer Membrane Protein B.abortus S-19 dengan metode Western Blotting menunjukkan adanya protein yang dikenali oleh antibodinya, yaitu protein dengan berat molekul sebagai berikut : 13,4 kDa., 14,6 kDa., 37,2 kDa., 61,8 kDa ., 164,1 kDa. Hasil uji Western Blott dimana terjadi ikatan antara protein antigenic OMP dengan antibody anti OMP spesifik dan dapat dikembangkan lebih lanjut untuk mencari protein dengan berat molekul yang lebih spesifik dengan teknik elusi sebagai kitt diagnostic. Hal ini menurut Cloeckaert et al., (1992), bahwa protein OMP B.abortus S-19 dengan protein yang berat molekulnya 36- 38 kDa sensitive untuk mendeteksi hewan yang terinfeksi kuman brucella. Menurut Rantam (2003), mengatakan bahwa pada umumnya protein yang tidak dimurnikan mengandung banyak protein yag berbeda dan tidak spesifik . Untuk itu dalam mengukur single protein spesifik diperlukan uji biokimia. Metode Western-Blotting digunakan untuk mendeteksi berat molekul protein dari campuran antigen dan digunakan untuk membedakan kros reaksi diantara protein. Pada tahap sebelumnya dilakukan pemisahan protein dengan SDS-Page, kemudian ditransfer ke membrane nitroselulose yang sesuai dan akhirnya di label dengan antibody dan di visualisasikan dengan pewarnaan . Fraksi-fraksi protein yang telah dipisahkan satu sama lain dengan probe antibody yang sesuai. Protein yang diikat pada membrane dapat mempertahankan antigenitasnya dengan muda direaksikan dengan antibody.Adanya pita tertentu pada blott menubjukkan antigen spesifik dalam sample atau antibody pada probe. Setelah dilakukan pengukuran nilai OD pada uji indirect ELISA terhadap antibody protein OMP dapat dilihat pada Table 1 dibawah ini : Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama, Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011 5
POSTER-3 Tabel 1. Hasil OD dengan teknik indirect ELISA protein OMP berbagai berat molekul Hal Sampel OMP Nilai OD
Hasil OD dengan teknik indrect ELISA protein OMP berbagai berat molekul 13,4 kDa 14,6 kDa 37,2 kDa 61,8 kDa 164,1 kDa 0,325 0,586 0,975 0,643 0,598
Kesimpulan Protein spesifik OMP yang mempunyai sifat imunogenik, setelah uji indirect ELISA maka OD tertinggi adalah protein OMP dengan berat molekul 37,2 kDa ( OD =0,975 ). Protein OMP dengan berat molekul 37,2 kDa setelah diimunisasikan pada kelinci(Uji tantang), dengan indirect ELISA OD = 0,968 sehingga mempunyai sifat imunogenik dapat di gunakan sebagai Kitt diagnostic. Hasil penelitian direkomendasikan bahwa Protein OMP dengan berat molekul 37,2 kDa selain dapat digunakan sebagai bahan Kitt Diagnostic dapat pula disarankan sebahai bahan pembuatan bahan vaksin yang poten. Ucapan Terima kasih. Terima kasih kami sampaikan kepada Direktorat Jenderal Perguruan Tinggi, Rektor Universitas Airlangga melalui Ketua Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat yang telah menyetujui untuk mendanai penelitian kami ini Daftar pustaka Alton,G.G., L.M.Jones and D.E.Pietiz. 1988. Laboratory Techniques in Brucellosis 3 rd Ed.WHO.Switzerland. Bellanti,J.A. 1993. Immunologi III. Diterjemahkan oleh Prof.Dr.A.Samik Wahab. Gajah Mada University Press. Yogyakareta .Hal.86-95, 173-188.
Cloeckaert,A., P.Kerhofs and J.N.Limet.1992. Antibody Response to Brucella Outer Membrane Proteins in Bovine Brucellosis: Immunoblot Analysis and Competitiv Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using Monoclonal Antibodies. Journal of Clinical Microbiology Dec. 1992. pp. 3168-3174. Kresno,S.B. 2000. Immunologi. Diagnosis dan Prosedur Laboratorium, Edisi ke tiga. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta.
Rantam,F.A. 2003. Metode Immunologi. Airlangga University Press. Surabaya.
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama, Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011 6
POSTER-3 Ratnasari,R., J.Rahmahani., T.Juniastutik dan Suwarno. 2004. Isolasi dan Karakterisasi lipopolisaccharida Brucella abortus S-19. Guna Pembuatan Antigen Dianostik untuk aplikasi Teknik ELISA. Laporan Penelitian Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. Surabaya. Widjajanto,E. 2004. Mast cell Induced Apoptosis of Limphoid Cells, Proposed Mechanism of Hemopoietic Stem Cells Depletion in Hypocelluler Marrow. Th 8th International Conggress of Asian Society of Clinical Pathology and Laboratory Medicine (ASCPLM). In Joint Meeting with The 1st Off-Shore Scientific Meeting of the College of Pathologist,Academy of Medicine Malaysia (Cpath-Amm) and the 5th National Conggress of the Indonesian Association of Clinical Pathologist (PDSPatklin).Selects Conventional Hall,Medan-Indonesia, November 29-December 02,2004. Widjajanto, E, 2007. Mast Cell, Fakta dan Potensinya Dalam Perspektif Laboratory Medicine.Disampaikan pada Saat Rapat Terbuka Senat Universitas Brawidjaja Malang, 2 April 2007.
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama, Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011 7
