THE EFFECT OF SEMBUNG (Blumeae Folium) ETANOLIC EXTRACT TO THE MACROPHAGE PHAGOCYTOSIS IN MALE MICE INFECTED BY Listeria monocytogenes

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK ETANOLIK DAUN SEMBUNG (Blumeae Folium) TERHADAP FAGOSITOSIS MAKROFAG PADA MENCIT JANTAN YANG DIINFEKSI DENGAN Listeria monocytogenes THE EFFECT OF SEMBUNG (Blumeae Folium) ETANOLIC EXTRACT TO THE MACROPHAGE PHAGOCYTOSIS IN MALE MICE INFECTED BY Listeria monocytogenes 1

Farida Munawaroh*, Sudarsono, Ag.Yuswanto1 Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta

ABSTRAK Daun sembung (Blumeae folium) dimanfaatkan oleh masyarakat Indonesia untuk mengatasi influenza, rematik, nyeri haid, haid tidak teratur, demam, asma, batuk, bronkhitis, perut kembung, diare, dan diabetes (Dalimartha, 1999). Penurunan sistem imun merupakan salah satu faktor yang dapat berdampak pada timbulnya kondisi “tidak nyaman” individu (Helman, 1984). Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efek daun sembung terhadao kemampuan fagositosis makrofag terhadap lateks; dalam kaitannya dengan peningkatan sistem pertahanan tubuh (sistem imun). Pada penelitian ini digunakan ekstrak daun sembung dengan 30% (v/v) etanol. Dosis yang digunakan 5 mg/kgbb, 10 mg/kgbb, dan 100 mg/kgbb. Ekstrak etanolik daun sembung yang digunakan memiliki berbagai parameter antara lain: a) kadar fenolik total sebesar 3,33 ± 0,085% (b/b) EAG dan b) aktivitas antioksidan dengan IC50: 59,384 mg/ml. Kontrol positif yang digunakan yaitu levamisol hidroklorida dosis 2,5 mg/kgbb dan ekstrak Echinacea . dosis 10 mg/kgbb. Kontrol normal dan kontrol pelarut yang digunakan yaitu larutan CMCNa 1,5% (b/v). Parameter peningkatan sistem imun didasarkan pada peningkatan kemampuan fagositosis makrofag terhadap lateks yang ditentukan seperti penelitian yang dilakukan oleh Leijh, dkk. (1986) pada mencit jantan galur Swiss yang diinfeksi dengan Listeria monocytogenes. Respon imun seluler ditandai dengan peningkatan kemampuan fagositosis makrofag berdasarkan peningkatan jumlah makrofag yang memfagositosis lateks dan peningkatan jumlah lateks yang difagositosis oleh makrofag. Hasil analisis data dengan ANOVA diketahui bahwa kemampuan fagositosis makrofag pada semua perlakuan lebih tinggi dan berbeda bermakna. Hal ini tidak menutup kemungkinan bahwa ekstrak etanolik daun sembung berpeluang sebagai imunstimulator. Kemampuan fagositosis makrofag pada pemberian ekstrak etanolik daun sembung dengan dosis 10 mg/kgbb tidak berbeda dengan kedua kontrol positif, sehingga ekstrak tersebut memiliki kemampuan yang sebanding dengan levamisol hidroklorida maupun Echinacea purpurea. Kata kunci : daun sembung (Blumeae folium.), fagositosis, makrofag, Listeria monocytogenes, mencit   ABSTRACT Sembung (Blumeae folium) is used by Indonesian people for uncomfortable condition. e.g. influenza, menstruation pain, fever, cough, asthma, bronchitis, stomach up set, diarrhea, and diabetes mellitus (Dalimartha, 1999). Many factor contribute of disease, one of them is decrease of immune system (Helman, 1984). This research was done to know the effect of sembung leaf extract in relation to the immune system. The extraction was done by ethanol 30% v/v. The dose were 5, 10, and 100 mg/kgBW. The total phenolic of the extract was 3,326 ± 0,0854% (b/b) EAG of phenolic concentration. IC50 of the antioxidant activity 59,384 mg/ml. Levamisole hidrochloride at the dose of 2,5 mg/kg and Echinacea purpurea [L.] Moench. dose 10 mg/kgBW were used as positive control. Normal control was CMCNa 1,5% (b/v). Increasing immune system in the relation of the activity of macrophage according to Leijh et al. metode (1986) in male Swiss mice with Listeria monocytogenes infections was used in this study. Cellular immune response was done to evaluate the increasing capability of macrophage phagocyte (the amount of latex that was phagocyted by macrophage). The evaluation data was analyzed by ANOVA. The sembung leaf extracted by Ethanol 30% v/v was capable to increase the macrophage activity. Key words: sembung leaf (Blumeae folium), phagocyte activity, macrophage, Listeria monocytogenes, mice * E-mail : [email protected]

LATAR BELAKANG MASALAH Saat terjadi penurunan sistem pertahanan tubuh, maka zat asing dari luar tubuh (xenobiotik) maupun dari dalam tubuh sendiri dapat berdampak pada timbulnya kondisi “tidak nya-man” individu. (Helman, 1984). Sel yang berperan dalam respon imun alamiah terdiri dari sel fagosit (makrofag dan neutrofil) dan sel NK (natural killer). Respons makrofag terhadap mikroba hampir sama cepatnya dengan neutrofil, tetapi makrofag lebih lama hidup daripada neutrofil. Fagositosis makrofag juga lebih aktif dalam menghadapi patogen seperti mikroorganisme maupun antigen lain bahkan sel atau jaringan sendiri yang mengalami kerusakan atau mati, sehingga makrofag dapat dikategorikan sebagai sel efektor utama pada respon imun alamiah (Abbas dkk., 2000). Blumea balsamifera [L.] DC. atau sembung telah digunakan oleh masyarakat Indonesia untuk mengatasi influenza, rematik, nyeri haid, haid tidak teratur, demam, asma, batuk, bronkitis, perut kembung, diare, perut mulas, sariawan, dan diabetes (Dalimartha, 1999). Sembung berasa pedas, sedikit pahit, hangat dan baunya seperti rempah. Metabolit yang terkandung di dalam daun sembung secara umum berupa minyak atsiri dengan komponen bor-neol, kamfora, floroasetofenon dimetil eter, seskuiterpenlakton, diterpen, triterpen, sterol, paraffin, saponin, golongan fenolik turunan asam sinamat (Hegnauer, 1963). Peneliti lain menemukan seskuiterpen dalam bentuk ester, flavonoid, icthyo-thereol acetate, cryptomerediol, lutein dan betakaroten (Anonim, 2003; Osaki dkk., 2005; Nessa dkk., 2005; Ragasa dkk., 2005). Selain itu ditemukan blumeatin (5,3',5'-trihydroxy-7methoxy-dihydro-flavone), suatu golongan flavonoid yang berefek sebagai hepatoprotektor (Xu SB dkk., 1993). Hasil penelitian pada golongan flavonoid, telah ditemukan bahwa dihidro flavonol dapat bermanfaat terhadap penyakit kanker (Hiroo dkk., 2006). Flavonoid dapat berfungsi sebagai imunomodulator, selain alkaloid, tanin, dan

saponin (Kenny dkk., 1990; Middleton dkk., 2000; Sangat dkk., 2000, Raj narayana dkk., 2001 cit. Akrom, 2004). Imunitas juga dapat ditingkatkan oleh beberapa senyawa yang berefek sebagai antioksidan seperti senyawa fenolik atau polifenol. Senyawa fenolik maupun polifenol diketahui dapat berefek pada peningkatan kemampuan fagositosis makrofag peritoneum pada mencit Balb/c (Wahyuniari 2006). Listeria monocytogenes dapat digunakan sebagai model dalam penelitian respon imun karena telah diketahui sifatsifatnya dengan baik. Listeria monocytogenes dapat hidup di dalam makrofag dan dapat menghindari mekanisme bakterisidal makrofag. Makrofag sendiri merupakan sel efektor uta ma terhadap organisme ini (Pudjonarko dkk., 2004). Karakteristik bakteri intraseluler fakultatif adalah kemam puannya untuk bertahan dan melakukan replikasi dalam sel fagosit. Respon imun yang utama adalah imunitas yang diperantarai sel (cell mediated immunity) dan eliminasinya memerlukan mekanisme imunitas seluler. Dua efektor imuntas yang diperantarai sel adalah makrofag teraktivasi dan CTLs. Listeria monocytogenes menghasilkan protein hemolisin yang menyebabkan bakteri dapat keluar dari fagolisosom menuju sitoplasma. Dalam sitoplasma bakteri terhindar dari mekanisme mikrobisidal makrofag sehingga CTLs CD8 akan teraktivasi. CTLs memproduksi IFN-γ yang dapat membunuh makrofag yang mengandung bakteri dalam sitoplasmanya (Abbas, dkk., 2000). METODOLOGI PENELITIAN Daun sembung (Blumeae folium) diambil secara acak dari Desa Jatipuro, Wonogiri, Jawa Tengah; sampel petinggal di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi UGM. Simplisia dibuat menjadi serbuk dengan derajat halus tertentu. Penentuan karakteristika bahan uji meliputi : 1) daun: a) pengukuran dimensi daun, b) pemeriksaan organo leptis, c) makroskopis dan d) mikros-kopis daun sembung. 2) ekstrak: a) kadar total fenolik, b) potensi anti

oksidan, c) analisis kualitatif konstitu- en ekstrak dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Analisis Data Karakteristika simplisia meliputi organoleptis, makroskopis, mikroskopis, kadar senyawa golongan fenolik total dengan metode spektrofotometrik, dan potensi antioksidan dengan metode DPPH. Karakteristika daun sembung (suku Asteraceae) adalah keberadaan golongan seskuiterpen lakton yang dominan. Golongan seskuiterpen lakton berasa pahit (Hegnauer, 1963). Setelah dihitung purata dan simpangan baku, homogenitas dan distribusi data hasil fagositosis makrofag diuji dengan Kolmogorov-Smirnov. Jika data yang didapat merupakan data yang terdistribusi normal maka selanjutnya dianalisis dengan uji one way ANOVA taraf kepercayaan 95%, yang dilanjutkan dengan uji Tuckey. Perbedaan bermakna dari masing-masing kelompok dapat dilihat dari signifikansinya pada uji Tuckey, dimana kelompok yang berbeda bermakna memberikan signifikansi yang kurang dari 0,05 (P < 0,05), se dangkan pada kelompok yang perbedaannya tidak bermakna akan memberikan signifikansi lebih dari 0,05 (P > 0,05). Selain itu, pada ke lompok yang berbeda bermakna akan terdapat tanda * (bintang) di belakang nilai mean difference. ALAT DAN BAHAN Perangkat khromatografi lapisan tipis, spektrofotometer merek Genesis tipe 300. Daun sembung (Blumeae fo-lium) diambil dari Desa Jatipuro, Wonogiri, Jawa Tengah. Bakteri Listeria monocitogenes hidup dalam medium Trypticase Soy Agar (TSA) didapatkan dari BLK (Balai Laboratorium Kesehatan) Yogyakarta; serbuk kering ekstrak Echinacea dari PT. Java Plant Solo; dan levamisol hidroklorida (Ascamex® dari PT. Konimex, Pharmaceutical Laboratories Solo). Hewan uji: mencit jantan galur Swiss diperoleh dari laboratorium Ilmu Hayati Universitas Gadjah Mada. Bahan kimia: Folin Ciocalteau, DPPH. Pelarut : Untuk ekstraksi: Etanol

(berderajat teknis), sedangkan untuk fase gerak KLT berderajat pro análisis. Jalannya Penelitian Penyiapan bahan uji Daun sembung diambil secara acak. Penentuan karakteristika simplisia terdiri dari pengukuran di mensi daun, pemeriksaan organoleptis makroskopis, dan mikroskopis daun sembung. Simplisia dibuat menjadi serbuk dengan derajat halus tertentu. Sampel petinggal tersedia di Laboratorium Biologi Farmasi Fakultas Farmasi UGM Pembuatan ekstrak daun sembung Serbuk simplisia daun sembung dengan derajat halus 0,75, diekstraksi dengan 70% v/v etanol dalam air dengan metode digesti yang telah dimodifikasi. Sebanyak 50,01 gram serbuk daun dimasukkan ke dalam labu, kemudian ditambah 400,0 ml etanol 30%. Pada tahap pertama dilakukan pemanasan sampai dicapai suhu didih selama 30 menit, kemudian suhu diturunkan dan dijaga pada rentang 450-550C selama 2 jam (pengadukan dilakukan 1 kali setiap jam). Setelah proses ekstraksi selesai, dilakukan penyaringan dengan corong Buchner. Proses ekstraksi di atas dilakukan dengan replikasi 3 kali. Filtrat yang diperoleh dikumpulkan kemudian dipekatkan / diuapkan dengan alat penguap putar (rotavapor) dan dilakukan pengurangan tekanan sampai tidak timbul tetesan destilat. Penetapan parameter ekstrak daun sembung Penetapan parameter ekstrak daun sembung terdiri dari: penetapan kadar fenolik total dengan spektrofotometer setalah direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteau; penetapan aktivitas antioksidan dengan metode penangkapan radikal DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylradical (Deborah dkk., 2007); análisis konstituen ekstrak dengan Kromatografi Lapis Tipis. Kemampuan fagositosis ekstrak pada mencit Mencit jantan yang digunakan sebanyak 30 ekor dari galur Swiss, umur 6 dan 7 minggu, berat badan antara 25,03 ±

2,41 gram. Mencit dibagi secara acak menjadi 6 kelompok, dengan masing–masing kelompok berjumlah 5 ekor. Seri dosis dibuat dengan melarutkan sejumlah x mg ekstrak daun sembung ditambahkan pelarut (larutan CMC Na 1,5% (b/v)) sebanyak y ml. CMC Na digunakan sebagai kontrol pelarut maupun kontrol normal. Kontrol positif berupa levamisol hidroklorida dosis 2,5 mg/kgbb/hari dan ekstrak Echinacea dosis 10 mg/kgbb/hari. Dosis pemberian ekstrak etanolik daun sembung 5, 10, dan 100 mg/kgbb/hari. Setiap hewan uji diberikan kira-kira 0,2 ml larutan perlakuan. Perlakuan pada masing-masing kelompok dilakukan selama 14 hari per oral . Sebanyak 0,2 ml bahan uji diberikan secara intragastrikum dengan kanula sebelum hewan coba diinfeksi kamudian dilanjutkan sampai akhir pengambilan data (hari ke-20). Pemberian antigen berupa bakteri Listeria monocytogenes hidup sebanyak 104 (LD50=2 X 105) tiap mencit dilakukan secara intra peritoneal pada hari ke – 15, dihitung sejak perlakuan pertama (Pudjadi dkk., 1996). Efek imunstimulan diamati pada hari ke-20 (dihitung dari hari pertama pemberian perlakuan). a. Isolasi makrofag Mencit dibunuh dengan diberikan narkose (kloroform). Mencit diletakkan dalam posisi telentang, kulit bagian perut dibuka dan dibersihkan dari selubung peritoneum dengan alkohol 70% (v/v) dan disuntikkan ± 10 ml RPMI (Sigma®) dingin ke rongga peritoneum. Kemudian didiamkan selama ± 3 menit sambil digoyang-goyang secara perlahan (agar makrofag yang menempel di rongga peritoneum dan di sekitar usus dapat terlepas dan tersuspensi dalam medium RPMI). Cairan peritoneal dikeluarkan dari rongga peritoneum dengan dilakukan penekanan organ dalam dengan 2 jari, kemudian cairan diaspirasi dengan tabung injeksi (Terumo®) (dipilih pada bagian yang tidak berlemak dan jauh dari usus). Aspirat dipusingkan pada 1.200 rpm, 40C selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian ditambahkan 3 ml ”medium RPMI komplit” (mengandung FBS (Gibco®)

10% v/v). Jumlah sel dihitung dengan hemositometer, kemudian diresuspensikan dengan medium komplit sehingga didapat suspensi sel dengan kepadatan 2,5x106/ml. Suspensi sel yang telah dihitung ditumbuhkan dalam plate 24 sumuran (NucN®) yang telah diberi coverslips (NucN®) bulat, setiap sumuran berisi 200 µl (5x105 sel). Sel diinkubasikan dalam inkubator CO2 5%, 370C (Heraeus®) selama 30 menit, kemudian ditambahkan medium komplit 1 ml / sumuran dan inkubasi dilanjutkan selama 2 jam. Sel dicuci dengan RPMI 2x kemudian ditambahkan medium komplit 1 ml / sumuran dan inkubasi dilanjutkan sampai 24 jam. b.

Fagositosis makrofag dengan latex beads Kemampuan fagositosis non spesifik dilakukan in vitro menurut Leijh dkk. (1986) dengan menggunakan latex beads diameter 3 µm (Sigma Chem. Co.). Lateks diresuspensikan dalam PBS (Sigma®) sehingga didapat konsentrasi 2,5x107/ml. Makrofag peritoneum yang dikultur sehari sebelumnya dicuci 2x dengan RPMI, tambahkan suspensi lateks 200 µl/sumuran dan diinkubasikan selama dalam inkubator CO2 5%, 370C selama 60 menit. Sel kemudian dicuci dengan PBS 3x untuk menghilangkan lateks yang tidak difagositosis. Setelah itu keringkan pada suhu ruangan dan difiksasi dengan metanol selama 30 detik. Selanjutnya metanol dibuang dan coverslips didiamkan sampai kering. Setelah kering, coverslips dipulas dengan Giemsa (Merck®) 20% (v/v) selama 30 menit. Dicuci dengan air suling, diangkat dari sumuran kultur dan dikeringkan pada suhu kamar (Wijayanti, 1996). Seratus sel makrofag diamati dan dihitung jumlah makrofag yang memfagositosis partikel lateks dan jumlah lateks yang difagositosis oleh makrofag. Pengamatan makrofag dilakukan dengan menggunakan mi kroskop cahaya (Olympus®) dengan perbesaran 400x (Wijayanti, 1996).

HASIL DAN PEMBAHASAN Daun segar bila diremas berbau aromatis, berasa sedikit pahit. Pada penampang lintang daun terlihat pada bagian epidermis atas maupun bawah banyak rambut daun yang halus seperti bulu (gambar 1). Rambut daun yang halus tersebut berperan sebagai pelindung alami sehingga perlu perhatian khusus pada tahap eliminasi cemaran bila dilakukan pencucian dengan air, karena keberadaan rambut halus tersebut dapat merupakan penghalang aliran air sampai permukaan daun.

Kadar air simplisia daun sembung berkisar antara 14,43 ± 0,49 % (v/b) dan kadar minyak atsiri sebesar 0,34 ± 0,06 % (v/b) (Lampiran 1, tabel I dan II). Ekstrak dibuat dengan metoda digesti (yang dimodifikasi) dengan etanol 30% (v/v) Golongan senyawa fenol total digunakan sebagai spesifikiasi ekstrak daun dan ditetapkan dengan metode spektrofotometrik. Bilangan gelombang yang digunakan 750 nm. Analisis kualitatif senyawa golongan fenolik dilakukan dengan pereaksi Folin-Ciocalteau (sebagai pembanding digunakan asam galat).

A

B

C (10x25)

D (10x40)

Gambar 1. Keterangan: A = bunga sembung; B=daun sembung; C=Ø lintang daun; D = stomata hRf

hRf

hRf 100

100

100

90

90

90

80 70 60

G F E D

50

80

F

80

F E

E 60

60

D

40

30

30

30

20

20

10

10

10 0

A

0

A

Fase gerak: 1) n-heksana 2) toluena : etil asetat:

C

C 40

B

D

50

50

40

20

Fase diam: Silika gel F254 G

70

70

C

Keterangan:

0

isopropanol

(6:3:1

v/v/v) B

: arah rambat A

A B C Gambar 2. Profil KLT setelah penyemprotan dengan 5% (v/v) asam sulfat pekat dalam etanol

A. Bercak konstituen setelah disemprot dengan 5% (v/v) asam sulfat pekat; B. Bercak konstituen setelah disemprot dengan 5% (v/v) asam sulfat pekat pada UV 254 nm; C. Bercak konstituen setelah disemprot dengan 5% (v/v) asam sulfat pekat dalam etanol pada UV 366 nm

Hasil analisis diketahui bahwa kadar senyawa fenolik total dalam ekstrak etanolik daun sembung berkisar 3,33 ± 0,085% (b/b) EAG. Aktivitas anti-oksidan ekstrak ditetapkan dengan metode penangkapan radikal DPPH (2,2’-difenil-1-pikril hidra-zil) dengan spektrofotometer pada bilangan gelombang 516 nm, diperoleh IC50 sebesar 59,384 mg/ml. Analisis kualitatif konstituen ekstrak dengan kromatografi lapisan tipis (KLT) terlihat adanya bercak yang meredam di bawah sinar 254 nm (A, C, D, E, F) dan berpendar pada sinar UV 366 nm (gambar 2). Pemendaran biru pada UV 366 nm (C, D, E, F, G) menandakan adanya golongan senyawa fenolik dengan ke rangka dasar C6-C3 (Harborne, 1987) yang tidak menutup kemungkinan turunan asam OH-sinamat, kumarin, isokumarin, kromon, lignan, dan flavonoid.

hRf

Data analisis kualitatif dengan metoda KLT terlihat bercak berwarna hitam pada titik totolan (gambar 3) sehingga dapat disimpulkan keberadaan golongan senyawa fenolik dan tidak menutup kemungkinan golongan polifenol. Polifenol adalah suatu polimer fenol dan kemungkinan berikatan dengan sakharida sehingga cenderung bersifat relatif polar sehingga tidak dapat terelusi oleh fasa gerak yang digunakan. Bercak coklat (B,C,D,E) dimungkinkan pula suatu golongan senyawa fenolik. Setelah penambahan HCl dan dilakukan pemanasan, warna larutan justru semakin gelap, sehingga dapat disimpulkan bahwa golongan polifenol dalam bentuk zat samak yang tidak terhidrolisis terdapat dalam ekstrak daun sembung, hal ini dikuatkan dengan rasa kelat di lidah.

Keterangan:

100

Fase diam: Silika gel F254

90

Fase gerak:

80 70

E

1) n-heksana 2) toluena : etil asetat: isopropanol (6:3:1

60

D 50 40

C

v/v/v)

B

: arah rambat

30 20 10 0

A

Gambar 3 . Profil Khromatogram setelah penyemprotan dengan FeCl3

       

   

A

B

C

D

E

F

Gambar 4. Perbandingan morfologi makrofag mencit setiap perlakuan Keterangan: A adalah mencit yang diberi CMC Na (kontrol pelarut) menunjukkan mofologi tidak teraktivasi; B, C, D, E dan F adalah mencit yang diberi perlakuan secara berurutan yaitu levamisol hidroklorida, ekstrak Echinacea , ekstrak daun sembung 5 mg/kgbb, 10 mg/kgbb, dan 100 mg/kgbb yang kesemuanya menunjukkan morfologi teraktivasi yakni dengan membentuk kaki semu maupun fagosom, dilihat dengan perbesaran 400x

Fagositosis makrofag Makrofag dari mencit Swiss yang diinfeksi dengan Listeria mono-cytogenes sebagian menunjukkan morfologi teraktivasi namun sebagian lagi menunjukkan morfologi tidak teraktivasi. Makrofag teraktivasi ditemukan pada kelompok yang diberi ekstrak Echinacea dan levamisol hidroklorida. Makrofag yang diisolasi dari kelompok kontrol pelarut (kontrol normal) yaitu larutan CMC Na 1,5% (b/v) tidak teraktivasi (gambar 4). Kemampuan fagositosis makrofag dapat dilihat dari jumlah makrofag yang mampu memfagositosis partikel lateks (tabel I). Hasil pengolahan data dengan ANOVA satu arah, diketahui bahwa nilai F hitung variabel kelompok sebesar 20,331 dan P = 0,0001. Hal ini berarti bahwa kelompok kontrol maupun perlakuan mempunyai

perbedaan jumlah makrofag. Perhitungan jumlah makrofag yang memfagositosis lateks berdasarkan uji Tukey dapat disimpulkan bahwa kontrol pelarut berbeda (p<0,05) terhadap semua kelompok perlakuan ekstrak daun sembung. Hal ini dapat digunakan sebagai suatu penanda bahwa daun sembung dapat berfungsi sebagai imunsimulan. Kemampuan fagositosis ma-krofag juga dapat ditunjukkan dari jumlah lateks yang dapat difagositosis oleh makrofag selain dari jumlah makrofag yang dapat memfagositosis partikel lateks (tabel II). Kedua pengamatan tersebut dilakukan untuk mengetahui kualitas dan kuantitas dari aktivasi makrofag. Perhitungan jumlah lateks yang difagositosis oleh 100 makrofag menggunakan uji ANOVA satu arah dengan tingkat kepercayaan 95% diperoleh nilai F hitung variabel kelompok sebesar 23,876 dan

p = 0,0001. Hal ini menunjukkan bahwa kelompok kontrol maupun perlakuan mempunyai perbedaan jumlah lateks. Analisis hasil perhitungan jumlah lateks yang difagositosis oleh 100 makrofag berdasarkan uji Tukey menunjukkan bahwa kontrol pelarut berbeda (p<0,05) terhadap semua kelompok ekstrak etanolik daun sem bung. Hal ini dapat diambil kesimpulan bahwa ekstrak etanolik daun sembung dapat berefek pada peningkatan jumlah lateks yang difagositosis oleh makrofag. Hasil penelitian ini tidak sesuai dengan penelitian Hasanah (2005), yang menunjukkan bahwa pada saat jumlah makrofag yang memfagositosis lateks setelah infeksi dengan Listeria

monocytogenes meningkat maka rerata jumlah partikel lateks yang difagositosis oleh tiap makrofag juga semakin banyak. Begitu pula dengan penelitian Wijayanti (1996) yang menyatakan bahwa peningkatan jumlah makrofag peritoneum mencit yang memfagosi tosis selama infeksi Plasmodium berghei adalah sebanding dengan jumlah partikel lateks yang di fagositosis. Dalam penelitian ini, perbedaan hasil pada makrofag yang memfagositosis lateks pada kelompok daun sembung dengan dosis pemberian 5 mg/kgbb dan 100 mg/kgbb tidak berbeda, begitu pula dengan rerata jumlah lateks yang difa- gositosis makrofag.

Tabel 1. Jumlah makrofag yang memfagositosis lateks Perlakuan CMC Na Levamisol hidroklorida Ekstrak Echinacea Ekstrak daun Sembung 5 mg/kgbb Ekstrak daun Sembung 10 mg/kgbb Ekstrak daun Sembung 100 mg/kgbb

Jumlah makrofag yang memfagositosis lateks/100 makrofag R1 R2 R3 R4 R5 X ± SD 31 22 29 21 29 26±4,56 51

62

51

64

50

55±6,80

59

57

59

56

53

56±2,49

48

34

50

48

53

46±7,33

53

47

59

48

45

50±5,64

51

40

44

45

39

43±4,76

  Tabel 2. Jumlah lateks yang difagositosis makrofag Jumlah lateks/100 makrofag Perlakuan R1 R2 R3 R4 R5 CMC Na 42 35 40 34 49 Levamisol 138 111 105 138 91 hidroklorida Ekstrak 107 103 115 126 116 Echinacea Ekstrak daun Sembung 62 72 89 55 78 5 mg/kgbb Ekstrak daun Sembung 101 93 89 91 92 10 mg/kgbb Ekstrak daun Sembung 88 77 82 117 78 100 mg/kgbb

X ± SD 40±6,04 116±20,84 113±8,90 71±13,46

93±4,60

88±16,56

    Kemampuan fagositosis makrofag terhadap lateks yang ditunjukkan dari jumlah makrofag yang memfagositosis lateks maupun dari jumlah lateks yang difagositosis oleh makrofag pada pemberian ekstrak daun sembung dengan dosis 10 mg/kgbb tidak berbeda dengan levamisol hidroklorida maupun ekstrak Echinacea. Hal tersebut dapat diartikan bahwa peningkatan kemampuan fagositosis makrofag ekstrak daun sembung dosis 10 mg/kgbb sebanding dengan kedua kontrol positif. Peningkatan jumlah lateks yang difagositosis ekstrak daun sembung dengan dosis 100 mg/kgbb sebanyak 120%, sedangkan peningkatan fagositosis makrofag ekstrak rimpang jahe merah dosis 100 mg/kgbb yang diteliti oleh Sari (2008) sebesar 200%. Jumlah lateks yang difagositosis makrofag ekstrak rimpang jahe emprit dengan dosis 100 mg/kgbb sebesar 32% (Mellawati, 2008). Hal ini dapat diartikan bahwa kemampuan peningkatan jumlah latek yang difagositosis oleh makrofag berturut-turut yaitu setelah pemberian:ekstrak rimpang jahe merah, ekstrak daun sembung, dan ekstrak rimpang jahe emprit. Kemampuan peningkatan jumlah makrofag yang memfagositosis lateks pada pemberian ekstrak daun sembung dengan dosis 100 mg/kgbb juga lebih besar daripada ekstrak rimpang jahe emprit dengan dosis pemberian 100 mg/kgbb (Mellawati, 2008). Pemberian ekstrak etanolik daun sembung dosis 100 mg/kgbb mampu meningkatkan 1. jumlah makrofag yang memfagositosis lateks sebesar 65,4%, sedangkan pemberian ekstrak rimpang jahe emprit dosis 100 mg/kgbb mampu meningkatkan jumlah makrofag yang memfagositosis lateks sebesar 26%. Hal ini dapat disimpulkan bahwa kemampuan peningkatan makrofag yang memfagositosis lateks pada ekstrak daun sembung lebih tinggi dari pada rimpang jahe emprit. Metabolit tumbuhan yang berperan dalam peningkatan respon imun adalah fenolik / flavonoid (Ratnaningsih dkk., 2004

cit Wahyu niari, 2006). Ekstrak etanolik daun sembung memiliki kadar fenolik total yang sebanding dengan kadar fenolik total ekstrak etanolik rimpang jahe merah dan rimpang jahe emprit. Kadar fenolik total ekstrak etanolik daun sembung sebesar 3,36 ± 0,084% (b/b) EAG, sedangkan kadar fenolik total ekstrak etanolik rimpang jahe merah sebesar 3,27 ± 0,55% (b/b) EAG dan kadar fenolik total ekstrak etanolik rimpang jahe emprit sebesar 3,55 ± 0,14% (b/b) EAG. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan senyawa fenolik/polifenol dalam meningkatkan fagositosis makrofag dapat dipengaruhi oleh jenis senyawa fenoliknya, maupun oleh komponen lain dalam ekstrak yang bersifat sinergis dengan fenolik/polifenol dalam meningkatkan respon imun. KESIMPULAN Pemberian ekstrak etanolik daun sembung dengan kadar fenolik total berkisar 3,33 ± 0,085% (b/b) EAG dan aktivitas antioksidan dengan IC50 sebesar 59,384 mg/ml dapat meningkatkan kemampuan fagositosis makrofag peritoneal pada mencit jantan yang diinfeksi dengan Listeria monocytogenes. Potensi imunstimulan ekstrak etanolik daun sembung dengan dosis pemberian 10mg/kgbb sebanding dengan imunstimulan sintetik (levamisol hidroklorida dosis 2,5 mg/kgbb) dan ekstrak Echinacea (suatu imunstimulan alami) pada dosis 10 mg/kgbb). UCAPAN TERIMA KASIH Pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1. PT Deltomed Laboratories yang telah membantu dalam pengadaan rimpang bahan uji 2. PT Java Plant yang telah membantu ekstrak kering Echinacea

DAFTAR PUSTAKA Abbas, A.K., Lichtman, A.H., & Pober, J.S., 2000, Cellular and Mole-cular Immunology, 4th ed , WB Saunders Co, Philadelphia

Akrom, 2004, Efek Ekstrak Etanol Herba Meniran (Phyllanthus niruri L.) terhadap Respon Imun Seluler Mencit Galur Swiss Jantan yang Diinfeksi Plasmodium Berghei: Studi Imunmodulator Fitokimia, Tesis, Program Pascasarjana Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Anonim, 2003, Sembung (Blumea balsamifera (L). DC.), www.PdPersi.co.id, 2 Maret 2007 Dalimartha, S.,1999, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia, Jilid 1, Trubus Agriwidya, Jakarta Deborah H. Markowicz Bastos 1,*, Luciane A. Saldanha 1, Rodrigo R. Catharino 2, Alexandra C. H. F. Sawaya 2, Ildenize B. S. Cunha 2, Patrícia O. Carvalho 3 and Marcos N. Eberlin 2007, Phenolic Antioxidants Identified by ESI-MS from Yerba Maté (Ilex paraguarien-sis) and Green Tea (Camelia sinensis) Extracts, Molecules, 12, 423-432 Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penentuan Cara Modern Meng-analisa Tumbuhan, Edisi II, ITB, Bandung Hasanah, N., 2005, Pengaruh Pemberian Ekstrak Metanol Pasak Bumi (Eucycoma longifolia Jack) pada Respon Imun Seluler terhadap Infeksi Listeria monocytogenes: Kajian Aktivitas Fagositosis dan Sekresi Nitric Oxide (NO) Makrofag Peritoneal Mencit, Tesis, Program Pascasarjana Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Hegnauer, R., 1963, Chemotaxonomie der Pflanzen, Band 3, hal. 447-544 Stuttgart Helman, C., 1984, Culture Health and Illness, John Wright & Son, Bristol Hiroo Hasegawa, Yasuaki Yamada, Kanki Komiyama, Masahiko Hayashi, Masami Ishibashi, Tatsushi Yoshida, Toshiyuki Sakai, Takashi Koyano, Toh-Seok Kam, Ken Murata, Kazuyu-ki Sugahara,

Kazuto Tsuruda, Norihi-ko Akamatsu, Kunihiro Tsukasaki, Masato Masuda, Nobuyuki Takasu, and Shimeru Kamihira, 2006, Dihy-droflavonol BB1, an extract of natural plant Blumea balsamifera, abrogates TRAIL resistance in leukemia cells, Blood, 15 January 2006, Vol. 107, No. 2, pp. 679688 Kenny, M.T., Balistreri, F.J., Torney, H.L., 1990, Flavonoid Modulation of Mrine Neutrophil Cytokinesis, Immunopharmacol Immunotoxicol, 12, 3: 527-41 Leijh, P.J.C., Furtth, R.V. & Zwet, T.L.V., 1986, In Vitro Determination of Phagocytosis and Intracellular Killing by Polymorphonuclear and mono nuclear Phagocytes, In: Weir DM, Editor, Cellular Immunology, 2, 7485 Blackwell Scientific Publication, London Middleton, JR, E., Kandaswami, C., Theoharides, T.C., 2000, The Effect of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implication for Inflammation, Heart Diseaseand Cancer, Pharmacological Reviews; 52:673751 Mellawati, D., 2008, Pengaruh Pem-berian Ekstrak Etanolik Rimpang Jahe Emprit terhadap Fagositosis Makrofag Mencit Jantan yang Diinfeksi dengan Listeria monocytogenes, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Nessa, F., Ismail, Z., Kurupiah, S., & Mohamed, N., 2005, RP-HPLC Method for the Quantitative Analysis of Naturally Occurring Flavonoids in Leaves of Blumea balsamifera DC, J Chromatogr Sci., 43 (8), 416-20 Osaki, N., Koyano, T., Kowithaya-korn, T., Hayashi, M., Komiyama, K., & Ishibashi, M., 2005, Sesquiterpenoids and PlasminInhibitory Flavonoids from Blumea balsamifera, J Nat Prod, 68 (3), 447-9 Pudjadi, Fifin, L.R., Andrew, J., & Setiaraharja, K., 1996, Pengaruh Klorokuin terhadap Respons Proliferasi Limfosit dalam Limpa dari Mencit yang Disuntik Listeria monocytogenes, Majalah Kedokteran Diponegoro, 1 & 2, Semarang Pudjonarko, D., Susilaningsi, N., & Sukmaningtyas, H., 2004, Pengaruh Pemberian Minyak Ikan Kaya Omega-3 dan Vaksinasi BCG terhadap Daya Bunuh

Makrofag (Studi Eksperimental pada Mencit Tua Balb/c), M Med Indonesiana, 39 (I), 11-7 Ragasa, C.Y., Co, A.L., & Rideout, J.A., 2005, Antifungal Metabolites from Blumea balsa-mifera, Nat Prod Res., 19 (3), 231-7 Raj Narayana, K., Reddy, M.S., Chaluvadi, M.R., Krishna, D.R., 2001, Bioflavonoids Clasification Pharmacological, biochemical effects and Therape-utic Potential, Indian Journal of Pharmacology; 33: 2-16 Sangat, H.M., Zuhud, E.A.M., Damayanti, E.K., 2000, Kamus Penyakit dan Tumbuhan Obat Indonesia, 135, 3: 2069-2073 Sari, B.Y., 2008, Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanolik Rimpang Jahe Merah terhadap Fagositosis Makrofag Mencit Jantan yang Diinfeksi dengan Listeria monocytogenes, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Wahyuniari, I.A.I., 2006, Pengaruh Pemberian Minyak Buah Merah (Pandanus conoideus Lam) pada Respon Imun Seluler setelah Infeksi Listeria monocytogenes (Kajian Aktivitas Fagositosis ma-krofag Peritoneal dan Proliferasi Limfosit Limpa Mencit BALB/c), Tesis, Program Pascasarjana Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Wijayanti, M.A., 1996, Peranan Makrofag dalam Imunitas terhadap Infeksi Malaria: Kajian Kemampuan Fagositosis dan Sekresi Reactive Oxigen Intermediates Makrofag Peritoneum Mencit yang Diimunisasi dan tidak Di-imunisasi In Vitro, Tesis, Program Pascasarjana Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Xu SB, Chen WF, Liang HQ, Lin YC, Deng YJ, Long KH., 1993, Protective action of blumeatin against experimental liver injuries, Zhongguo Yao Li Xue Bao Jul; 14(4):376-8.[http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Entrez/query.fcgi?cmd =Retrieve&db=PubMed & listuids=8249641&dopt= Abstrac