Tézisek
Koraszülöttek, újszülöttek tüdo és agykárosodásának etiológiájára valamint pathogenezisére irányuló vizsgálatok
Írta: Dr. Hargitai Beáta egyetemi tanársegéd
Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar I.Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkukató Intézet BUDAPEST, 2004
1. Bevezetés A szülészeti gyakorlatban és a perinatális intenzív ellátásban mutatkozó fejlodés jelentos változást hozott a szülés alatti (sub partu) hypoxiás károsodás (acut perinatális asphyxia) gyakoriságában, az ilyen események elofordulása jelentosen ritkult. Összességében azonban az újszülötteket érinto hypoxiás- ischaemiás agykárosodások (Hypoxiás-Ischaemiás Encephalopathia, HIE) valamint az agyi eredetu gyermekbénulások (Cerebral Palsy, CP) száma nem csökkent a legfejlettebb egészségügyi ellátást biztosító országokban sem, továbbra is nagy kihívást jelentve a neonatológusoknak, gyermekneurológusoknak, de az egész társadalomnak. A HIE epidemiológiája, okainak feltárása, pathomechanizmusának felderítése a perinatális tudományágak egyik leggyakoribb kutatási témája. Ismertté vált, hogy az agykárosodást eltéro térbeli mintázat jellemzi az érett újszülöttekben és a koraszülöttekben, a szövetpusztulás mértéke pedig függ a szöveti érettség fokától, valamint a károsító hatás jellegétol (elhúzódó szöveti hypoxia versus hypotonia). Megfigyelheto, hogy a pusztuló sejtek egy része a programozott sejthalál legismertebb formájának, az apoptózisnak a morfológiai jellemzoit mutatja. Az apoptózis számos fiziológiás folyamatban aktív szerepet játszik az embryonális és magzati fejlodés során, azonban a koraszülött újszülöttek szöveteit éro fizikai és kémiai hatások is (hypoxia, hypotonia, mesterséges lélegeztetés okozta volu-és barotrauma, steroid és más gyógyszerek) beindíthatják a programozott sejthalál folyamatát, következményes szövetkárosodást okozva. Az apoptózis jelenség elofordulását, morphológiáját és a pathomechanizmusban játszott szerepét vizsgáltuk koraszülött újszülöttek tüdo, vese, máj, és agyszövetében 1996 és 2000 között, az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben. Sokat változott az utóbbi két évtizedben az újszülöttek hypoxiás agykárosodásának és az agyi eredetu bénulás etiológiájának megítélése. Míg mintegy húsz évvel ezelott foként a perinatális acut asphyxiát tették felelossé a súlyos szövodményekért, a nemrégiben megjelent közlemények szerint az esetek dönto többségében, 80-90 %-ban a terhesség során korábban jelentkezo, krónikus intrauterin hypoxia áll a háttérben. Az intrauterin károsító hatás jellegének, intenzitásának, idopontjának és tartamának vizsgálatára, becslésére ad lehetoséget a placenta patológiai feldolgozása. Számos olyan morfológiai eltérést, kórképet írtak le a placentában, melyek szoros összefüggést mutattak az újszülöttek súlyos neurológiai károsodásával és az agyi eredetu bénulással. Ezek közül kiemelendo a magzati chorion ér és/vagy törzsboholy ér thrombosis, súlyos chorioamnionitis, monochoriális placentáció során kialakuló iker- iker transzfúzió az ikerpár egyik tagjának második trimesterbeli elhalásával. Egy nemrégiben ismertetett hypothesis szerint az ikerpár egyik tagjának a terhesség korai szakaszában történo elvesztése (Vanishing Twin jelenség, VT jelenség) is eredményezhet súlyos központi idegrendszeri károsodásokat az ikerpár túlélo tagjában. A placenta patológia és az újszülöttek súlyos, hypoxiás eredetu neurológiai károsodása valamint agyi eredetu bénulása közötti összefüggés vizsgálatára, valamint a VT jelenség etiológiai szerepének kutatására nyílt lehetoségem 2000 és 2002 között a Bristoli Egyetem St. Michael Kórház Patológiai osztályán, az Avon Longitudinal Study of Parents and Children ( The ALSPAC study) program keretében.
2. Célkituzések Az apoptózis morfológiai vizsgálata koraszülött újszülöttek szerveiben 1996 és 2000 között az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben koraszülött újszülöttek szerve inek diagnosztikus szövettani vizsgálatát végeztük, melynek során több 2
károsodott szervben is megfigyeltük meg az apoptózis morfológiai jeleit. Feltételeztük, hogy a lélegeztetésre szoruló koraszülöttekben, a bronchopulmonális dysplasia acut- subacut stádiumának túlélése és a krónikus tüdobetegség kialakulása során, az epitheliális sejtek pusztulásában az apoptózis szerepet játszhat. Hasonlóképpen, a vese tubulus hámsejtjeinek károsodásában, a számos gyógyszer hatásának és hypoxiának kitett májban, valamint a koraszülöttekben igen gyakori, periventrikuláris régiót és germinális réteget érinto kórképekben is vizsgálni kívántuk a sejtelhalás mechanizmusát. Az apoptotikus sejtek kimutatása mellett célunk volt a jelenség gyakoriságának felmérése is, hogy megtudjuk, az egyes kórképekben milyen mértékben játszhat szerepet a programozott sejthalál. Négy eset kapcsán végzett megfigyeléseink alapján leírtuk, hogy az apoptózis megfigyelheto a koraszülöttek hypoxiás agykárosodásában, s további vizsgálatokat terveztünk, nagyobb számú anyagon, az apoptózis gyakoriságának, lokalizációjának és esetleges etiológiai szerepének pontosabb megismerése céljából. A placenta pathológia és a hypoxiás-ischaemiás agykárosodás összefüggésének vizsgálata Az ALSPAC tanulmány keretében végzett munkánk célja az újszülöttekben eloforduló hypoxyás- ischaemiás agykárosodás prenatális etiológiai faktorainak pontosabb megismerése, megértése volt, a placenta morfológiai vizsgálata segítségével. Célunk volt, hogy felderítsük, melyek azok a placentális elváltozások, amelyek szoros összefüggést mutatnak az újszülöttek súlyos neurológiai károsodásával, melyek azok, amelyek gyakrabban fordulnak elo, de nem mutatnak szignifikáns különbséget a kontroll esetekhez viszonyítva. Fontosnak tartottuk meghatározni, melyek azok a morfológiai eltérések, amelyek azonos gyakorisággal fordulnak elo a kóros és a kontroll esetekben, mert ezek klinikai jelentoséggel nem bírhatnak, tehát normál variánsoknak tarthatók. A tanulmány egyik igen érdekes célja volt Pharoah és mtsa. nemrégiben közölt elméletének az ún. Vanishing twin hypothesisnek a vizsgálata, mely azt sugallja, hogy az agyi eredetu bénulás hátterében, sok esetben, egy elso trimeszterbeli embryo/ magzatvesztéssel járó, egyébként fel nem ismert ikerterhesség áll. Ehhez a tanulmányhoz elozetesen szükséges volt a vanishing twin (VT) jelenség morfológiai kritériumainak meghatározása, emellett vizsgálni kívántuk azt is, hogy a placentában milyen egyéb, kóros elváltozások társulhatnak a VT jelenséghez. További céljaink között szerepelt annak megfigyelése, hogy az egyes placentális elváltozások milyen viszonyban vannak egymással, vannak-e közöttük olyanok amelyek gyakran fordulnak elo együttesen.
3. Anyagok és módszerek 3.1. Az apoptózis kimutatása koraszülöttek szerveiben, különös tekintettel a központi idegrendszer elváltozásaira Az apoptózis kimutatásával kapcsolatos vizsgálatainkat 1996 és 2000 között, koraszülött újszülöttek különbözo szerveiben, az I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben végeztük. 3.1.1. Vizsgálati anyag I. Elso vizsgálat sorozatunkhoz 24 koraszülött újszülött (24-36 terhességi hét) anyagát választottuk ki, ahol a halál közvetlen oka légzési elégtelenség vagy agykamrai vérzés volt. A legrövidebb túlélési ido 10 óra, a leghosszabb 27 hét volt. Valamennyi újszülött neonatális intenzív terápiás centrumba (SE I. Sz. Szülészeti Klinika és SE II. Sz. Gyerek Klinika) került megszületése után és gépi lélegeztetésben részesült. Valamennyi koraszülött esetében dokumentálták az IRDS klinikai és radiológiai tüneteit, a tüdok rutin posztmortális szövettani
3
vizsgálata során pedig minden esetben hyalin membrán betegség vagy bronchopulmonális dysplasia különbözo stádiumainak jelei mutatkoztak. A klinikai adatokat az „Eredmények” fejezetben közölt táblázatokban foglaltuk össze (1., 2., 3. Táblázat). A klinikai adatok gyujtésében és értékelésében Dr. Hajdú Júlia, Dr. Harmath Ágnes az I. Szülészeti és Nogyógyászati Klinika és Dr. Pataki Margit a II. Gyerek Klinika neonatológusai vettek részt. 3.1.2. Patológiai feldolgozás és apoptózis kimutatása I. A posztmortális vizsgálatra a SE I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben került sor, meghatározott protokoll szerint, 1993 és 1999 között. Minden esetben szövettani mintavételre került sor a tüdokön kívül a májból és mindkét vesébol. Az agy esetén az oldalkamra falából, valamint a makroszkóposan azonosítható elváltozásokból történt kimetszés szövettani vizsgálatra. A szöveteket 10 %-os formalinban fixáltuk, majd szokásos módon paraffinba ágyaztuk. 5 µm vastag sorozatmetszeteket készítettünk Superfrost-Plus lemezre (Menzel-Glaser, Freiburg, Germany), és a deparaffinált metszeteket hematoxylineosinnal (HE) festettük. Minden metszési magasságból félretettünk egy-egy metszetet TUNEL (Terminal deoxynucleotidil transferase- mediated nick end- labelling) reakció céljára. A TUNEL reakció az apoptózis kimutatására szolgáló módszer, melynek során a fragmentálódott DNS törvégeket deoxynucleotidokkal jelöljük, majd egy elohívó rendszer segítségével a beépült deoxynucleotidokat detektáljuk. Eloször a HE festett metszeteket vizsgáltuk meg, s a legalkalmasabbnak mutatkozókat kiválasztottuk, szervenként két metszetet. Az ezekkel közel azonos síkból készült lemezeken végeztük el a TUNEL reakciót (ApopDETEK Cell Death Assay System; Enzo, New York, U.S.A. A beépült deoxynucleotidok detektálására torma peroxidáz-diaminobenzidin in situ detektáló rendszert használtunk (Simply Sensitive Horseradish Peroxidase-DAB In Situ Detection System; Enzo, New York, U.S.A.). 3.1.3. Értékelés I. A pozitív reakció t adó, apoptotikus sejtek arányát értékeltük az alveoláris és bronchioláris hámban, vesetubulus hámsejtekben, a neuronokban és gliasejtekben illetve a germinális matrix sejtjeiben, és a hepatocytákban. A tüdoben és a vesében kifejezett apoptotikus aktivitásként értékeltük (++), ha a terminális légút vagy a vesetubulus sejtjeinek 30%-a, vagy több mint 30%-a pozitív reakciót adott. Enyhe aktivitáson (+) az ez alatti értékeket értettük, míg pozitív reakció hiányában nem beszélhetünk aktivitásról (-). Az agyban, és a májban 10 különbözo látótérben számoltuk a pozitív reakciót adó sejteket, x20 objektívet használva. Kifejezett apoptotikus aktivitáson (++) azt értettük, ha x 20 látóterenként átlagosan több mint 10 sejt mutatott pozitivitást. 5-10 sejt esetén enyhe aktivitásról (+) beszéltünk. Kevesebb mint 5 pozitív sejt igen alacsony aktivitást illetve a tényleges aktivitás hiányát jelentette (- ), az elore meghatározott, semiquantitativ értékelési rendszerünkben. Az eredmények feldolgozása után érdemesnek tartottuk a koraszülöttek agykárosodásának további vizsgálatát. 3.1.4. Vizsgálati anyag II. A második vizsgálat sorozatunkat is az I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben végeztük 1998-2000 között. 12 koraszülött (24-34 terhességi hét) posztmortális vizsgálatának anyagát használtuk fel. A koraszülött újszülötteket az I. Sz. Szülészeti Klinika Neonatális Intenzív Centrumában kezelték, valamennyien mesterséges lélegeztetésben részesültek és klinikailag diagnosztizált IRDS-ben szenvedtek. Hypoxiás-ischaemiás encephalopathia klinikai tünetei nyolc esetben manifesztálódtak, egy esetben kóros koponya ultrahang lelet keltette neurológiai károsodás gyanúját, három esetben a betegeknél neurológiai tüneteket nem dokumentáltak, azonban a posztmortális vizsgálat igazolta az agykárosodást. A koraszülöttek kliniko-patológiai adatait a 4. Táblázatban foglaltuk össze az
4
„Eredmények” fejezetben. A klinikai adatok gyujtésében és elemzésében Dr. Hajdú Júlia és Dr. Cziniel Mónika nyújtott segítséget. 3.1.5. Patológiai feldolgozás és apoptózis kimutatása II. A posztmortális vizsgálatra minden esetben 24 órán belül sor került, hogy kiküszöböljük az autolysis okozta mutermékek kialakulását. Az agy makroszkópos vizsgálata és a kimetszések készítésekor felhasználtuk a koponya ultrahang során készült részletes leírást, mely a gócos elváltozások helyét pontosan behatárolta. Ezen területekbol, valamint az elváltozással szimmetrikus ép területbol készítettünk blockokat. Emellett reprezentatív kimetszéseket készítettünk, melyek tartalmazták az oldal kamra falát a germinális matrix-szal, a periventriculáris fehérállományt és a felette elhelyezkedo kéregállományt. A szöveteket az elso vizsgálatnál leírtakhoz hasonlóan kezeltük és esetenként 2-4 területrol, 3-3 sorozat metszetet készítettünk elo, HE festésre, Nissl festésre és TUNEL reakcióra. A TUNEL reakció elvégzéséhez a neurogén sejtek apoptózisának kimutatására javasolt NeuroTACS Kit állt a rendelkezésünkre (NeuroTACS II In Situ Apoptosis Detection Kit RandD Systems Inc., Minneapolis, U.S.A.) A kit tartalmazott egy permeabilizáló reagenst, mely finoman, a sejt struktúra megorzése mellett tette átjárhatóvá a sejtmembránokat. Emellett, a kit fejlesztésénél tekintettel voltak az agyszövet esetén adódó általános problémákra, mint pl. törékenység, eros háttér reakció, gyenge háttér festodés a legtöbb szokványos festékkel. A kithez technikai pozitív kontroll is tartozott. Negatív kontrollként a makroszkópos és mikroszkópos elváltozást nem mutató területbol készült kimetszéseket használtuk, illetve a kamrafalból készült metszeteken belül a homolaterális temporo-parietális cortex területét belso negatív kontrollnak tekintettük. 3.1.6. Értékelés II. A metszetek értékelését két független vizsgáló végezte (Dr. Sergi, Consolato, University of Bristol és Dr. Hargitai Beáta, SE I. Patológiai Intézet), eltéro eredmény esetén a vizsgálók közös véleményt alkottak. 10 random módon választott x20 objektivvel vizsgált mezoben a pozitív reakciót mutató sejteket számoltuk. Az apoptotikus aktivitást 15 pozitív sejt/mezo felett erosnek, 10-15 sejt/mezo esetén mérsékeltnek, 10 sejt/mezo alatt enyhének tartottuk. Az elozo vizsgálatunkhoz képest szigorúbb kritériumok bevezetését a specifikus kit alkalmazása miatt tartottuk indokoltnak.
3.2. A placenta patológia és az agyi eredetu gyermekbénulás összefüggésének vizsgálata, különös tekintettel a vanishing twin jelenség etiológiai szerepére 3.2.1. Az ALSPAC Tanulmány A placenta patológiájának klinkai összefüggéseivel foglalkozó vizsgálatainkat 2000 október és 2002 október között végeztük a St. Mic hael’s Hospital Paediatric Pathology Dep. osztályán, mely a University of Bristol Medical Faculty oktatókórháza. Munkánk egy kiterjedt WHO tanulmány keretében jöhetett létre, melynek elindításáról 1985-ben döntöttek és ELSPAC (Europian Longitudinal Study of Pregnancy and Chidhood) néven vált ismertté. Az ELSPAC egyik centruma a bristoli egyetemen jött létre „The ALSPAC Study” (Avon Longitudinal Study of Parents and Children) vagy másként „Children of the Nineties” (Gyermekek a kilencvenes években) elnevezéssel. Mintegy 12000 gyermek vett részt a tanulmányban, akiknek adatait fogantatástól kezdve, napjainkig gyujtik, ma a résztvevok 1213 évesek, követésüket serdülokorig folytatják. A szülokkel kapcsolatos adatokat is rögzítették, tárolják. Az adatok –egyebek között- a genotypusról, szülészeti szurovizsgálatokról, orvosi beavatkozásról, gyógyszerelésrol, szülés módjáról, szövodményeirol, életmódbeli tényezokrol, mint pl. cardiovasculáris rizikó faktorokról, 5
szociális helyzetrol, viselkedési attitüdökrol, a gyermek fizikai és szellemi fejlodésérol nyújtanak információt. A tanulmány részletes módszertanát, az összegyujtött adatokra vonatkozó információkat, a rendkívül gondosan biztosított etikai hátteret, az adatok biztonságos tárolását és bizalmas kezelését a szervezok rendszeresen ismertetik közleményeikben . A munkánkhoz szüksége etikai engedélyt a Research Ethics Comittee, United Bristol Healthcare NHS Trust bocsátotta ki. Valamennyi biológiai minta és placenta vizsgálata szüloi beleegyezési nyilatkozat birtokában történt. 3.2.2. Vizsgálati anyag A vizsgálatra kerülo méhlepényeket a Bristol Placenta Bankból választották, ahol kb. 12 500, az Avon megyei populációt reprezentáló speciment tárolnak, melyeket 1991 április és 1992 december között gyujtöttek össze. Az anyagokat formalinban fixálva tartják, számozott tárolókban. A specimen száma és a szülok vagy a gyermek klinikai adatai közötti kapcsolat csak az ALSPAC bizonyos statisztikus munkatársai számára hozzáférheto, adatvédelmi okokból. A vanishing twin jelenségre irányuló vizsgálatokra 49 méhlepény állt rendelkezésre, ahol az anya „igen” választ adott a kérdoív azon kérdésére, hogy „ A terhessége folyamán állapítottak-e meg önnél ikerterhességet?”, azonban csak egy gyermeket hoztak világra. Valamennyi index placentáho z két kontrollt választottak (98 kontroll), melyek terhességi korra, anyai életkorra és nemre nézve egyeztetve voltak. Az AB és placenta patológia közötti összefüggés vizsgálatára 21 méhlepény állt rendelkezésre, ahol 12 gyermeknél súlyos, 9 gyermeknél enyhébb formájú agyi bénulást diagnosztizáltak a születés utáni négy héten belül. Minden esethez három kontroll placentát rendeltek (63 kontroll), melyek terhességi korra, anyai életkorra és nemre egyeztetve voltak. A két tanulmány részére kiválasztott anyag egyszerre került vizsgálatra, a klinikai adatok a vizsgálónak nem álltak rendelkezésére, a patológiai feldolgozás tehát vakon történt. 3.2.3. Patológiai feldolgozás Az index és kontroll placentákat egy patológus (Dr. Hargitai Beáta) vizsgálta, majd az anyag 10%-át egy független vizsgáló (Prof. Jeremy Berry) újravizsgálta. A két vizsgálat eredménye között statisztikai különbség nem volt kimutatható. A makroszkópos és mikroszkópos elváltozások esetén az irodalomban rendelkezésre álló, legújabb definíciókat használtuk , néhány elváltozás esetén általunk lefektetett kritériumokat alkalmaztunk, ezeket a Függelék c. alfejezetben részletezzük. A makroszkópos vizsgálat elso lépéseként valamennyi placentát röntgen vizsgálatnak vetettük alá, Faxitron X-ray Cabinet készülékben, a filmeken tanulmányoztuk a kalcifikáció jelenlétét, eloszlását, súlyosságát, valamint magzati szkeletális elemek után kutattunk. Ezután a formalin fixált placentákat egyenként vizsgáltuk, tömegét, kiterjedését (szélesség, hosszúság, átlagos vastagság) megmértük. Leírtuk az esetleges alaki rendellenességeket, a magzati vagy anyai felszínen látható elváltozásokat. A köldökzsinór hosszát, átmérojét, a metszlapján látható erek számát, a csavarulatok gyakoriságát, irányát, a köldökzsinór gócos eltéréseit megfigyeltük és rögzítettük. A magzatmembrán tapadását, színét, s subchorionális felszínes elváltozásokat, a magzati erek makroszkópos eltéréseit is vizsgáltuk. A placentát 1cm-es szeletekre vágtuk és leírtuk a metszlapokon eloforduló esetleges eltéréseket. Az így nyert adatokat egy általunk tervezett és elore elkészített „Makroszkópos vizsgálati adatlap”-on rögzítettük. Minden placentából szövettani blockot készítettünk standard protokoll szerint. Esetenként legalább 8 block került feldolgozásra. A szövettani feldolgozás szokványos módon történt, dehydrálás, paraffinba ágyazás, 5µm-es metszetek készítése, dehydrálás után HE festésre került sor. Egyes esetekben kórokozó kimutatására PAS reakciót, vas tartalmú
6
pigmentáció azonosítására Berlini-kék festést, ér rendellenességek vizsgálatára Elastica-Van Gieson festést alkalmaztunk. A mikroszkópos vizsgálat folyamán 52 entitást vizsgáltunk, melyek között szerepeltek olyan eltérések melyeket korábban az irodalomban már összefüggésbe hoztak súlyos vagy kevésbé súlyos klinikai következményekkel, de vizsgáltunk olyanokat is melyekrol addig még nem készült ilyen jellegu tanulmány. A mikroszkópos vizsgálat eredményét a „Mikroszkópos vizsgálati adatlapon” rögzítettük. Az egyes metszeteket egyenként értékeltük, majd a talált eltéréseket egy adott entitásra vonatkoztatva összegeztük. A makroszkópos és mikroszkópos vizsgálatok eredményeit egy Microsoft Access adatbázisban rögzítettük. 3.2.4. Statisztikai feldolgozás A patológiai és klinikai adatok egyeztetése egy harmadik személy által történt, egy számítógépes protokoll segítségével, anonim módon, megszüntetve minden linket az eredeti adatbázissal. Az adatok elemzése Stata (6.0 Windows) program segítségével történt. Fisher Exact tesztet használtunk annak eldöntésére, hogy az egyes patológiás entitások gyakrabban jelentkeznek-e az index placentákban (univaribilis asszociáció). Az index és kontroll placenták összehasonlítására kondicionális logisztikus regressziós modellt alkalmaztunk, az odds ratio-t (OR) és a 95%-os konfidencia tartományokat (CI) kiszámítottuk. A kontinuus parametrikus adatok elemzésére (pl. placenta tömeg, köldökzsinór átméro) Student-t próbát, míg a nem-parametrikus változókra (placenta hossz, szélesség, vastagság) Mann Whitney U tesztet használtunk. Azokat az összefüggéseket, ahol az eltérést az index és kontroll között 2.0-nél magasabb OR jellemezte, klinikai fontosságúnak tartottuk. Szignifikáns különbséget a p<0,05 érték esetén állapítottunk meg.
4. Eredmények 4.1. Az apoptózis kimutatása koraszülöttek szerveiben, különös tekintettel a központi idegrendszer elváltozásaira 4.1.1. Apoptózis koraszülöttek tüdo szövetében 24 koraszülött (24-37 terhességi hét) tüdejébol származó, reprezentatív mintát vizsgáltuk, a születési súly 600-2000 g között változott, a túlélési ido 10 óra-27 hét között volt. Valamennyien klinikailag diagnosztizált IRDS-ben szenvedtek. A mesterséges lélegeztetésre, neonatális infekcióra, gyógyszeres kezelésre vonatkozó adatokat és az apoptotikus aktivitás mértékét az 1. Táblázatban foglaltuk össze. 9 esetben kifejezett apoptotikus aktivitást találtunk, további nyolc esetben enyhe formában, de megfigyelheto volt az aktivitás emelkedése. 7 esetben az apoptotikus aktivitás nem emelkedett. A eros intenzitású reakció volt megfigyelheto a tág alveolusok valamint bronchiolusok hámsejtjeiben. Az apoptózis a BPD II., III., és IV. stádiumában volt megfigyelheto, az akut exudativ szakban csak elvétve, vagy egyáltalán nem láttunk pozitivitást hámsejtekben.
7
1. Táblázat Apoptózis mesterségesen lélegeztetett koraszülöttek tüdejében Eset Terhességi Születési Élettartam Lélegeztetés Surfactans No
hét
súly (g)
(óra/nap/hét)
tartama
7.
25
680
10 óra
10 óra
igen
13.
24
800
16 óra
16 óra
18.
24
640
3 nap
20.
26
780
21.
29
1200
Infekció/ szepszis
CNS
BPD
Apoptotikus
szövodmény stádium
aktivitás (tüdo)
nem
IVH III-IV.
I.
Tüdo -
igen
nem
SAH
I.
Tüdo -
3 nap
igen
nem
IVH IV.
I.
Tüdo -
4 nap
4 nap
igen
nem
IVH III.
I.
Tüdo -
4 nap
4 nap
igen
PNE, S
IVH IV,
I.
Tüdo -
PVL 22.
24
700
4 nap
4 nap
igen
PNE
IVH, PVL
I.
Tüdo -
24.
32
1750
4 nap
4 nap
nem
S
IVH III.-IV.
I.
Tüdo -
19.
26
710
8 nap
8 nap
nem
PNE
IVH IV.
II.
Tüdo +
23.
28
800
5 nap
5 nap
igen
nem
IVH, PVL
II.
Tüdo ++
12.
27
1000
11 nap
11 nap
igen
PNE
IVH IV.
II.-III.
Tüdo ++
15.
28
1180
11 nap
11 nap
igen
S
IVH III.-IV.
II.-III.
Tüdo ++
PVL 1.
31
1200
14 nap
14 nap
igen
nem
IVH III-IV.
III.
Tüdo +
2.
37
2000
22 nap
22 nap
nem
PNE
agy oedema
III.
Tüdo +
5.
24
600
3 hét
3 hét
igen
BI
IVH II-III.
III
Tüdo +
9.
32
1180
22 nap
22 nap
igen
PNE
IVH, PVL
III.
Tüdo ++
10.
36
2700
18 nap
18 nap
nem
S
agy oedema
III.
Tüdo +
Eset
Terhességi
Születési
Élettartam
Lélegeztetés
Surfactans
Infekció/
No
hét
súly (g)
(óra/nap/hét)
tartama
14.
32
1460
12 nap
12 nap
igen
PNE
SAH
III.
Tüdo ++
16.
29
1230
12 nap
12 nap
igen
PNE
IVH III.-IV.
III.
Tüdo ++
3.
29
820
11 hét
4 hét
nem
PNE
PVL
IV.
Tüdo ++
4.
26
800
8 hét
8 hét
nem
PNE, S
IVH II-III.
IV.
Tüdo +
6.
24
920
15 hét
15 hét
igen
IUI
IVH III-IV.
IV.
Tüdo +
8.
33
1250
27 hét
20 hét
igen
S
PVL
IV.
Tüdo ++
11.
30
1210
50 hét
50 hét
igen
S
agy oedema
IV.
Tüdo +
17.
23
800
25 hét
25 hét
nem
S,
agy tályog
IV.
Tüdo ++
szepszis
CNS
BPD
Apoptotikus
szövodmény stádium
aktivitás (tüdo)
Candida tropicalis (++): kifejezett apoptotikus aktivitás, (+): enyhe apoptotikus aktivitás, (-): apoptotikus aktivitás emelkedése nem észlelheto Rövidítések: PNE: bronchopneumonia, S: szepszis, BI: bakteriális infekció, IUI: intrauterin infekció, IVH: intraventrikuláris vérzés (intraventricular haemorrhage), PVL: periventrikuláris leukomalácia, CNS: központi idegrendszer (central nervous system), BPD: bronchopulmonális dysplasia, SAH: subarachnoideális vérzés (subarachnoideal haemorrhage)
9
4.1.2. Apoptózis koraszülöttek agyszövetében Elso vizsgálatunk során 4 esetben végeztünk TUNEL reakciót a periventrikuláris régióból származó agyszöveten. Valamennyi esetben makroszkóposan azonosított intraventrikuláris vérzés és periventrikuláris leukomalácia állt fenn. 3 esetben kifejezett aktivitást véleményeztünk a germinális matrix és a periventrikuláris regio neuro- glia sejtjeiben, 1 esetben enyhe aktivitást találtunk. A klinikai adatokat és a vizsgálat eredményeit a 2. Táblázat tartalmazza. Második vizsgálatunk alkalmával, 12 koraszülött anyagá n, a beteganyag lineáris regressziós analízisét is elvégeztük, mely bizonyította, hogy homogén csoportról van szó. (1.Ábra)
1. Ábra A születési súly- terhességi hét legjobban illeszkedo regressziós görbéjének P értéke 0,0001 és r2 = 0,7930 A klinikai adatokat és az apoptotikus aktivitásra vonatkozó eredményeinket a 4. Táblázat tartalmazza. A 12-bol kilenc esetben (75%) a halál az elso héten belül következett be. Posztmortális vizsgálat során 8 esetben találtunk intraventrikuláris vérzést (66,7%) 2 esetben germinális matrix vérzést (16,7%) és 8 esetben volt jelen periventrikuláris leukomalácia (66,7%). A vizsgálandó terület kiválasztása elozetes ultrahang vizsgálat segítségével történt, esetenként több metszetet vizsgáltunk és nagyobb specificitású kit állt rendelkezésünkre, ezért az aktivitást jellemzo határértékeket szigorúbban állapítottuk meg, mint az elso vizsgálat alkalmával. Négy esetben (9.-12. eset) enyhe, egy esetben mérsékelt (1. eset) aktivitást észleltünk. A többi esetben (2.-8.) elszórtan 1-1 sejt mutatott pozitivitást a germinális matrix területén. A normál struktúrát mutató területeken és a kéregállományban a pozitív reakciót adó sejtek száma nagyon alacsony volt, sehol sem haladta meg az 5 sejt/ x20 látótér értéket. A periventrikuláris nekrotikus gócokban pozitivitás nem volt észlelheto. 4.1.3. Apoptózis a koraszülöttek vese és máj szövetében A vesét 7 esetben, a májat 4 esetben vizsgáltuk. A vizsgálat eredményeit a 3. Táblázat foglalja össze. Három esetben a vesefunkció beszukülése (23., 2., 9.), egy esetben (8.) hematuria volt klinikailag megfigyelheto, utóbbi esetben CMV nephritis szöveti jeleit láttuk. Egy esetben (9.) kifejezett, négy esetben (2., 8., 19., 23) mérsékelt apoptotikus aktivitás volt megfigyelheto a proximális és distális vesetubulusok hámsejtjeiben. Két esetben nem észleltünk aktivitást. A 2. esetben, a májban centrolobuláris zsíros degeneráció volt megfigyelheto, ugyanezen területen kifejezett apoptotikus aktivitás volt megfigyelheto (átlagosan 13,3 pozitív sejt/ x20 látótér). Három további esetben nem észleltünk aktivitást.
2. Táblázat Apoptózis mesterségesen lélegeztetet koraszülöttek agyszövetében Eset No 18.
Terhességi hét 24
Születési súly (g) 640
Élettartam (óra/nap/hét) 3 nap
Lélegeztetés tartama 3 nap
Surfactans
21.
29
1200
4 nap
4 nap
nem
PNE, S
9.
32
1180
22 nap
22 nap
igen
PNE
IVH IV, PVL IVH, PVL
8.
33
1250
27 hét
20 hét
igen
S
PVL
igen
Infekció/ CNS Apoptotikus szepszis szövodmény aktivitás nem IVH IV. Agy ++ Agy + Agy ++ Agy ++
(++): kifejezett apoptotikus aktivitás, (+): enyhe apoptotikus aktivitás, (-): apoptotikus aktivitás emelkedése nem észlelheto (Rövidítések: PNE: bronchopneumonia, S: szepszis, IVH: intraventrikuláris veérzés (intraventricular haemorrhage), PVL: periventrikuláris leukomalácia, CNS: központi idegrendszer (central nervous system)
11
3. Táblázat Apoptózis mesterségesen lélegeztetett koraszülöttek vese és máj szövetében Eset No
Terhességi hét
Születési Súly (g)
Élettartam (óra/nap/hét)
Lélegeztetés tartama
Surfactans
Infekció/ Veseszepszis funkció zavar nem nem
18.
24
640
3 nap
3 nap
igen
21.
29
1200
4 nap
4 nap
nem
PNE, S
nem
máj– vese –
19.
26
710
8 nap
8 nap
nem
PNE
nem
vese+
23.
28
800
5 nap
5 nap
igen
nem
oliguria
vese+
2.
37
2000
22 nap
22 nap
nem
PNE
oligo-anuria vese+ máj++
9.
32
1180
22 nap
22 nap
igen
PNE
oligo-anuria agy++ vese++
8.
33
1250
27 hét
20 hét
igen
S
hematuria
11.
30
1210
50 nap
50 nap
igen
S
nem
(++): kifejezett apoptotikus aktivitás, (+): enyhe apoptotikus aktivitás, (-): apoptotikus aktivitás nem emelkedett (Rövidítések: PNE: bronchopneumonia, S: szepszis)
12
Apoptotikus aktivitás máj- vese-
agy++ vese+ máj-
4. Táblázat Eset No 1 2 3
TH
ÉT
24 27 25
59 ó 108 ó 64 ó
4 5 6
26 24 29
6n 42 ó 80 ó
7
32
23 n
8 9
25 35
115 ó 14 ó
10
33
20 h
11
26
4n
12
24
34 n
Koponya ultrahang N/A N/A N/A
Neurológiai Infekció tünet Nem IU Nem Nem Nagyon gyenge Nem mozgás PVL Görcsök Nem N/A Görcsök Nem Kóros áramlás, Gyenge reflexek, IU P PVL görcsök IVH III, PVL Gyenge reflexek, IU P, görcsök bakteriális szepszis IVH IV Görcsök IU P N/A Nem Mycotikus szepszis Kóros áramlás, Gyenge reflexek, CMV P IVH I görcsök, izomtónus fokozódás Kóros áramlás Nem IU P, bakteriális szepszis IVH IV, HC, Súlyos görcsök, IU P PVL eszméletvesztés bakteriális szepszis
AT
Patologia
APO
75 127 115
IVH IV PVL IVH III
++ -
123 IVH I, PVL 90 IVH III 165 IVH III, GMH, PVL 240 IVH IV, HC, PVL
-
80 410
IVH IV PVL
+
195
PVL
+
98
GMH, PVL
+
125
IVH IV, PVL
+
Rövidítések: TH: terhességi hét, ÉT: élettartam (ó: óra , n: nap, h: hét ), AT: agy tömeg (g), APO: apoptotikus aktivitás (++: mérsékelt +: enyhe, - : nem emelkedett), PVL: periventrikuláris leukomalácia, IVH: intraventrikuláris vérzés (intraventricular haemorrhage, grading I-IV), GMH: germinális matrix vérzés, IU: intrauterin, P: pneumonia, CMV: cytomegalovirus, N/A: nem áll rendelkezésre .
13
-
4.2. A Vanishing Twin jelenség etiológiai szerepének vizsgálata az újszülöttek neurológiai károsodásában és az agyi eredetu gyermekbénulásban Az index esetek és a kontrollok között nem volt szignifikáns eltérés a születési súly, gesztációs hetek száma, a nem, az anyai életkor és paritás tekintetében. 4.2.1. A makroszkópos vizsgálat eredménye Egy index esetben találtunk embryonális maradványokat radiológiai és makroszkópos vizsgálat során, a kontroll csoportban embryonális maradvány egyetlen placentában sem volt észlelheto. Perifériás (marginális vagy laterális) köldökzsinór tapadás (71,4% versus 51%; 35 versus 50; p=0,02) és subchorionális cysta (6,1% versus 0%; 3 versus 0; p=0,04) szignifikánsan gyakrabban fordult elo a VT placentákban, mint a kontrollokban. Nagy subchorionális thrombus (OR= 2,8 95% CI=[0,8, 10,1]) gyakrabban volt megfigyelheto a VT placentákban, azonban a különbség nem ért el statisztikailag szignifikáns szintet. Egy VT placentában arteria umbilicalis singularis fordult elo, a kontrollokban nem figyeltünk meg ilyen eltérést. Bár a circummarginális membrántapadás gyakoribb volt a VT placentákban (28% versus 14,9%; 14 versus 14; p=0,05) placenta circumvallata csak a kontroll csoportban fordult elo (0 versus 4). Nem volt statisztikailag értékelheto különbség a szabálytalan alak, járulékos lebeny (placenta succenturiata), velamentózus köldökzsinór tapadás, köldökzsinór tekeredés iránya és intenzitása, retroplacentális vérömleny jelenléte, intervillózus thrombus és infarctus elofordulása között az esetekben és kontrollokban. A centrális és marginális fibrin plakkok, valamint a membránban elhelyezkedo fibrin plakkok hasonló gyakorisággal fordultak elo mindkét csoportban. 4.2.2. A mikroszkópos vizsgálat eredménye A szövettani elváltozások prevalenciája nem mutatott szignifikáns (p=0,05) különbséget az index és kontroll placentákban. A makroszkóposan is észlelten kívül, további embryonális maradványt szövettani vizsgálattal sem azonosítottunk, embryonális szövetrészletet a placentális és membrán plakkok, valamint subchorionális cysták nem tartalmaztak. Extenzív avasculáris villus képzodés (8.2% versus 2%; 4 versus 2; OR=4.0 95% CI=[0.7, 21.9]), gócos és multiplex magzati törzsboholy ér thrombosis (18.4% versus 9.2%; 9 versus 9; OR=2.4 [0.8, 6.9] és 6.1% versus 2%; 3 versus 2; OR=3.0 [0.5, 17.9]), súlyos bazális és parenchymás krónikus villitis (18.4% versus 9.2%; 9 versus 1; OR=2.3 [0.8, 6.3] és 8.2% versus 4.1%; 4 versus 4; OR=2.3 [0.5, 9.8]), grade 2 krónikus deciduitis (10.2% versus 5.1%; 5 versus 5; OR=2.8 [0.7, 11.3]) és grade 3 anyai chorioamnionitis (4.1% versus 1%; 2 versus 1; OR=4.0 [0.4, 44.1]) gyakrabban fordult elo VT placentákban, mint kontrollokban. A különbség nem volt szignifikáns, azonban az OR> 2 esetén az eltérést említésre méltónak találtuk. A további szövettani elváltozások hasonló gyakoriságban fordultak elo mindkét csoportban. 4.2.3. Multiplex léziók vizsgálata Vizsgáltuk, hogy együttesen jelentkezo placentális elváltozások, multiplex léziók, milyen összefüggést mutat a vanishing twin jelenséggel. A következo kilenc elváltozást választottuk: syncitiális csomók számának jelentos emelkedése, magzati törzsboholy ér thrombosis, grade 3-4 intervillózus fibrin depozíció, magvas vörösvértestek számának emelkedése, grade 2 és 3 krónikus parenchymás villitis, meconium pigmentált macrophágok jelenléte, centrális
lokalizációjú infarctus, centrális makroszkóposan észlelt intervillózus fibrin depozíció és nagy subchorionikus thrombus. Két vagy több elváltozás együttes jelenléte szignifikánsan gyakoribb volt a VT placentákban, mint a kontrollokban (26% versus 12,2%; p=0,04, OR=2,6; 95% CI=[1,1-6,2]).
4.3. A placenta elváltozásai és az agyi eredetu gyermekbénulás összefüggéseinek vizsgálata 4.3.1. Makroszkópos és mikroszkópos vizsgálat eredménye Vanishing twin morfológiai jele (radiológiai, makroszkópos vagy hisztológiai) nem volt jelen sem az index, sem a kontroll esetekbol származó placentákban. Az esetleges VT marker elváltozások (subchorionikus cysta, marginális fibrin pakk) hasonló gyakorisággal fordultak elo az index és kontroll esetekben. A vizsgált makroszkópos és mikroszkópos entitások közül egy sem mutatott statisztikailag szignifikáns (p <0,05) összefüggést az agyi eredetu bénulással. Az infarctus, az avasculáris villusok, haemorrhágiás endovasculitis, a gócos és diffúz perivillózus fibrin depozíció, az ismeretlen eredetu krónikus villitis elofordulási gyakorisága hasonló volt az index esetekben és a kontrollokban. Hipotézisünkkel és az irodalmi adatokkal ellentétben, a multiplex magzati ér thrombosis, az extenzív avasculáris villus képzodés, a diffúz (grade 3) boholy oedema, valamint az akut chorioamnionitis nem volt gyakoribb az index placentákban. Meglepo eredménynek számít, hogy az akut chorioamnionitis intenzív magzati válasszal (grade 3 és stage 4 magzati szöveti reakció, stage 3 funisitis) gyakrabban fordult elo a kontroll csoportban. Csak a magzati törzsboholy ér thrombosis, (OR=2,1 P=0,3), az intimális fibrin párna képzodés (OR=6,8, P=0,06), az emelkedett magvas vörösvértest szám (OR=4,0, P=0,07), és a grade 3 krónikus parenchymás villitis (OR=3,0, P=0,3) valamint a pigmentált macrophágok jelenléte (OR=3,4, P=0,09) volt kissé gyakrabban megfigyelheto az index placentákban. Ezekben az esetekben, illetve bármely változó esetén, ha az OR> 2,0 volt, a különbséget említésre méltónak találtuk, bár a statisztikai szignifikancia szintjét nem érte el. 4.3.2. Multiplex elváltozások vizsgálata Két vagy több elváltozás együttes jelenlétének a gyakorisága nem mutatott szignifikáns különbséget az index és kontroll esetek között. 4.3.4. Különbözo súlyosságú tüneteket mutató betegcsoportok szétválasztása Elvégeztük a két különbözo súlyosságú neurológiai tüneteket mutató betegcsoport (12 súlyos és 9 enyhébb agyi eredetu bénulás és neurológiai károsodás) külön-külön analízisét is. Ez az elemzés sem mutatott ki szignifikáns összefüggést a vizsgált elváltozásokkal. Sok esetben azonban, a kis esetszám miatt nem lehetett az OR-t kiszámolni, így a statisztikai elemzés korlátozott értéku volt.
4.4. Az ismeretlen etiológiájú krónikus villitis (Villitis of Unknown Etiology, Villitis of Unknown Origin, VUO) és a magzati thrombotikus elváltozások összefüggésének vizsgálata A szövettani feldolgozás során megfigyeltük, hogy a VUO gyakran fordul elo gócos vagy multiplex magzati ér thrombosissal. Megvizsgáltuk, hogy az egyes thrombotikus eredetunek tartott magzati érelváltozások, valamint a törzsboholy ér thrombosis következményeként kialakuló avasculáris villus képzodés szignifikánsan gyakoribb-e VUO fennállása esetén. Az eredményeinket az 5. táblázatban foglaltuk össze. A standard incidencia arány analízist használtuk. Az avasculáris boholy képzodés és a magzati törzsboholy ér thrombosis
15
szignifikánsan gyakrabban fordult elo krónikus villitissel, mint anélkül (30,2% n=19/63 versus 10,1% n=20/198 OR 2,99; 99% CI=[1,43-6,23] és 23,8% n=15/63 versus 8,6% n=17/198 OR 2,77; 99% CI=[1,21-6,38]). A haemorrhagiás endovasculitis gyakorisága 1,58szor volt magasabb VUO esetén (4,8%; n=3/63 versus 3,03%; n=6/198). Intimális fibrin párna képzodés 12,7%-ban volt jelen VUO esetén, míg 9,6%-ban VUO nélkül. Utóbbi két összefüggés nem bizonyult statisztikailag szignifikánsnak. 5. Táblázat Kapcsolat az ismeretlen etiológiájú krónikus villitis (Villitis of Unknown Etiology, VUO) és a magzati erek thrombitikus léziói (avasculáris villus képzodés, gócos és multiplex magzati törzsboholy ér thrombosis, haemorrhagiás endovasculitis, intimális fibrin párna képzodés) között
Krónikus villitis (VUO) Igen Nem
OR [95% CI]
P (Fisher’s Exact test)
Avasculáris villus Igen Nem
31.1% (19) 68.9% (42)
11.2% (19) 88.8% (151)
3.6 [1.7, 7.4]
0.001
Magzati törzsboholy ér thr Igen Nem
23.0% (14) 77.0% (47)
8.2% (14) 91.8% (156)
3.3 [1.5, 7.5]
0.005
HEV Igen Nem
4.9% (3) 95.1% (58)
3.5% (6) 96.5% (164)
1.4 [0.3, 5.8]
0.7
Intimális fibrin párna Igen Nem
13.1% (8) 86.9% (53)
11.2% (19) 88.8% (151)
1.2 [0.5, 2.9]
0.7
VUO: ismeretlen eredetu krónikus villitis, HEV: haemorrhágiás endovasculitis, thr: thrombosis
16
5. Megbeszélés 5.1. Az apoptózis kimutatása koraszülöttek szerveiben, különös tekintettel a központi idegrendszer elváltozásaira Az utóbbi két évtizedben jelentos változás következett be a kis súlyú és igen kis súlyú koraszülöttek intenzív ellátásában, mely a túlélési arány folyamatos javulásával járt együtt. A légzorendszeri és központi idegrendszeri kórképek rövid és hosszabb távú morbiditási rátája azonban nem túl biztató, hosszú távú szövodményekkel, szervi funkcióromlással és rehospitalizálással kell számolni. Ismeretes, hogy a koraszülött újszülöttek vezeto haláloki tényezoi a légzorendszer és a központi idegrendszer elváltozásain alapuló kórképek, s ez a mi beteganyagunkra is jellemzo volt. A krónikus tüdobetegség és a bronchopulmonális dysplasia kialakulásának és progressziójának morfológiája és a BPD klasszikus patológiai stádiumainak jellemzoi jól ismertek. Mesterséges lélegeztetésre szoruló újszülöttek diffúz alveoláris károsodásának kiváltó okai között említheto a hypoxia, oxygén toxicitás, barotrauma, volutrauma, és fontos szerepet játszhatnak a virális vagy bakteriális antigének is. Adult típusú respiratorikus distress szindrómában (Adult Respiratory Distress Syndrome, ARDS) tett megfigyelések szerint a szövetkárosodás következményeként elpusztulnak az alveolust bélelo I. típusú pneumocyták, melyek a II. típusú pneumocyták differenciálódása során jönnek létre, ok maguk osztódásra, regenerációra nem képesek. Így, a károsodást követo egy héten belül a II. típusú pneumocyták regeneratorikus hyperplasiája figyelheto meg, mind számuk, mind átlagos volumenük növekszik. Bardales és mtsai. leírták, hogy a resolutio során a II. típusú pneumocyták többsége eltunik, részben I. típusú pneumocytává differenciálódnak, részben programozott sejthalál következtében eliminálódnak. Stahlman és mtsai. felvetették, hogy hasonló folyamat játszódik le a koraszülötteket érinto tüdo károsodás és regeneráció folyamán is. Az akut károsodás szakaszában, hyalin membrán betegségben, nem találtak TTF-1 (Thyroid Transcription Factor-1) pozitív, azaz II. típusú pneumocyta epitheliális sejteket az alveolusokban, míg a BPD-ben a regenerálódó alveolusokban megfigyelheto volt TTF-1 pozitív sejtek jelenléte. A lélegeztetett koraszülöttek tüdoszövetén végzett vizsgálatainkkal a programozott sejthalál morfológiai jeleit kívántuk azonosítani, az alveoláris epitheliális sejtekben. Az egyedfejlodés során az apoptózis térbeli és idobeni megjelenését valamint az ezzel kapcsolatos minoségi és mennyiségi változásokat demonstrálták Kresch és mtsai. Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a bronchopulmonális dysplasia korai és késoi szubakut szakaszában a terminális légutakat bélelo epitheliális sejtek mérsékelt – kifejezett apoptotikus aktivitást mutattak, s ez megfigyelheto volt a krónikus stádiumban is. Nem észleltünk emelkedett apoptotikus aktivitást a hyalin membrán betegség stádiumában. Nem végeztük el a terminális légutak hámsejtjeinek tipizálását, de az irodalomból ismert, hogy a hyalin membrán betegségben a TTF-1 pozitív sejtek nem találhatók meg, viszont a regenerálódás során proliferálnak, egy részük differenciálódik. Arra következtettünk, hogy a TTF-1 pozitív, II-es típusú pneumocyták egy hányada, hasonlóan az ARDS-ben leírtakhoz, programozott sejthalál útján eliminálódik. A regeneráció folyamatát és az apoptózis kialakulását befolyásolhatja a koraszülöttség állapotából és a terápiás beavatkozásokból következo számos tényezo. Ezek közül a hypoxia, oxygén toxycitás, steroid, superoxyd dis mutáz alacsony szintje, valamint a virális proteinek apoptózist indukáló hatása jól ismert, azonban a volutrauma, a surfactans, az
17
antenatális thyreotropin-releasing hormon profilaxis, a permissziv hypercapnia hatása az apoptózis kiváltásában még nem ismert. Az apoptózis megjelenését a koraszülöttek hypoxiás-ischaemiás agykárosodásaiban, két vizsgálat-sorozat folyamán tanulmányoztuk. Elsoként négy beteg anyagát vizsgáltuk, ahol valamennyi esetben intraventriculáris vérzés és periventriculáris leukomalácia klinikai és morfológiai jelei dokumentálhatóak voltak. Apop-Detek kit segítségével TUNEL-pozitív sejteket figyeltünk meg a periventriculáris károsodás környezetében és a germinális rétegben. Az eredmények alapján érdemesnek tartottuk a jelenséget alaposabb vizsgálatra. Második, prospectiv tanulmányunkban, 12 koraszülött anyaga állt rendelkezésre, ahol koponya ultrahang vizsgálat során a fehérállomány károsodás valamint a kamrai vérzés pontos helyét és kiterjedését folyamatosan dokumentálták, és a posztmortális vizsgálat során ezekbol a területekbol nyerhettünk szövetmintát vizsgálatainkhoz. A 12-bol mindössze öt esetben észleltünk enyhe (4/12) vagy mérsékelt (1/12) apoptotikus aktivitást Neurotacs kit segítsével. A TUNEL-pozitív sejteket a periventrikuláris mátrixban figyelhettük meg, ezzel szemben cortikálisan, a szürke magvakban és a periventrikuláris nekrotikus gócokban pozitivitást nem észleltünk. Utóbbi vizsgálatunk rámutatott, hogy az apoptózis szerepét nem szabad túlértékelnünk a koraszülöttek hypoxiás agykárosodásában, annak ellenére, hogy számos szerzo hangsúlyozza az apoptózis etiológiai szerepét a neonatális agykárosodásban. Chamnanvanakij és mtsai. intraventrikuláris vérzés és periventrikuláris leukomalácia esetében a sejthalál egyik fo útvonalaknak tartották az apoptózist, bár rámutattak, hogy a kiértékelésnél az apoptózis és nekrózis morfológiai elkülönítése nehézségekbe ütközik. Az érett újszülöttek hypoxiás károsodásában, valamint felnottkori agykárosodásban sokkal gyakoribb a pusztuló neuronokban a zsugorodott, eosinophil cytoplasma és a mag chromatolysise, piknózisa. Utóbbi elváltozások az apoptózisra jellegzetesek és igen agy számban láthatók pontosubiculáris károsodásban, mely leggyakrabban érett újszülöttek hypoxiás-ischaemiás encephalopathiájában figyelheto meg. Nemcsak az apoptotikus neuronok felismerése és azonosítása, de a vizsgálati anyag kiválasztása is befolyásolja a vizsgálat eredményét. A realtime ultrahang vizsgálat alkalmasnak bizonyult az agykamrai vérzés lokalizációjának és stádiumának megítélésére. Az ultrahangos vizsgálat eredményének felhasználásával nagymértékben pontosítható a kóros terület azonosítása a posztmortális vizsgálat során. Ugyancsak növeli a vizsgálatok megbízhatóságát, ha belso negatív kontrollként a megfelelo kontralaterális területet is feldolgozzuk és értékeljük. További anomáliák származhatnak a vizsgálati csoport genetikai variabilitásából, vagy az eltéro epidemiológiai tényezok fennállásából. Vizsgálataink során nem találtunk összefüggést az apoptózis aktivitása és a születési súly, terhesség tartama, túlélési ido és az agykamrai vérzés stádiuma között. Ugyanakkor megfigyeltük, hogy az öt emelkedett apoptotikus aktivitást mutató esetbol, négy koraszülöttben infekció tüneteit észlelték klinikailag, már a megszületést követo elso hét folyamán. Yoon ás mtsai. állatkísérleti modellben idéztek elo ascendáló intrauterin infekciót, ahol az intrauterin infekció szorosan asszociálódott az újszülött állatokban talált fehérállomány károsodással, és nyolc periventriculáris agykárosodást mutató esetbol ötben emelkedett apoptotikus aktivitást is detektáltak, elsosorban gliasejtekben. Az intrauterin infekció, chorioamnionitis és a fehérállomány károsodás kialakulása közötti láncszemet az inflammatorikus cytokinek képezhetik. Az interleukin-6, interleukin-1ß és a tumor nekrózis faktor-a koncentrációja a magzatvízben magasabbnak bizonyult azon terhességek esetén, ahol az újszülöttben fehérállomány károsodás alakult ki. A programozott sejthalál kialakulását dokumentálták humán perinatális agykárosodásban mind halvaszületés (Edwards ás mtsai.), mind perinatális elhalás (Scott és mtsai.) esetén. Nem tisztázott az, hogy az apoptózis obligát vagy fakultatív útvonalát képezi-e a sejtpusztulásnak a központi idegrendszer hypoxiás károsodásában. Feltételezheto, hogy az
18
oxydatív stressz, a bakteriális endotoxinok jelenléte és a hypoxia az ion gradiens összeomlásához, glutamát felszabaduláshoz, az excitatorikus aminosav receptorok stimulációjához és intracelluláris Ca2+ felhalmozódásához vezet. A kaszkád aktivációja apoptózishoz vezethet, de más útvonal is elérheto a sejtek számára. Valószínuleg, a programozott sejthalál és a szöveti nekrózis párhuzamosan zajló illetve egymással kölcsönhatásban álló folyamatok, egy adott sejtpopuláción belül egyszerre jelen lehetnek és egy bizonyos idotartamon belül a sejt számára mindkét útvonal elérheto. A magzati fejlettségérettség foka, a sejtek differenciációja, a károsító hatás intenzitása és a sejt energiakészlete dönto fontosságú tényezo lehet, és meghatározhatja, hogy a sejt apoptózis vagy nekrózis következtében pusztul el.
5.2. A Vanishing Twin jelenség etiológiai szerepének vizsgálata az újszülöttek neurológiai károsodásában és az agyi eredetu gyermekbénulásban. A placenta elváltozásai és az agyi eredetu gyermekbénulás összefüggéseinek vizsgálata Az elso trimesterbeli magzati veszteség meglehetosen gyakori ikerterhességben, az ikerpár egyik tagjának korai elhalása után azonban a terhesség zavartalanul folytatódhat és a túlélo magzat jó eséllyel egészséges újszülöttként láthat napvilágot. Nemcsak a spontán fogant terhességekben, hanem az in vitro fertilizáció- embryo transzfer eredményeként kialakult ikerterhességekben is hasonló tapasztalatokról számol be az irodalom. Ezzel szemben ismert, hogy az ikerpár egyik tagjának második trimesterbeli elveszítése a túlélo iker súlyos agykárosodásával, agyi bénulás kialakulásával járhat. A károsodás pontos mechanizmusa nem ismert, de valószínusítheto, hogy az alapját a monochorionikus placentáció során gyakran megfigyelt ér anasztomozisok és az ezeken keresztül kialakuló iker- iker transzfúzió képezi. Az agykárosodás a túlélo ikerben annak köszönheto, hogy az ér anasztomozisok útján nagy mennyiségu vért veszít az elhalt iker érpályájába, s így a súlyos anaemia valamint a hypotensio hypoxiás-ischaemiás károsodást okoz. Az ér anasztomozisok már a terhesség 8.-9. hetében jelen vannak. Pharoah „Vanishing twin” hypotézise valamint mások megfigyelése, miszerint az elso trimesterbeli magzatveszteség a túlélo ikerben súlyos károsodásokat okozhat, magyarázható volna az anasztomozisokon kialakuló vérvesztéssel és következményes hypoxiával. A vanishing twin jelenség morfológiai jellemzoi és a placenta patológia össze függéseinek vizsgálatára egy epidemiológiai módszerek alapján kiválasztott minta állt rendelkezésünkre. A VT morfológiai kritériumai az irodalomban csak kevés közlemény tárgyát képezik, s a közölt esetek jelentos része in vitro fertilizáció (IVF) majd mesterséges embryo redukció következménye. Gavriil tanulmányában tíz IVF terhességbol származó placentát vizsgált, melybol öt esetben embryo redukciót hajtottak végre a terhesség 10-12. hetében, ezekben az esetekben az embryonális maradványok fellelhetoek voltak a placentákban. Ezzel szemben, a másik öt esetben, ahol spontán embryo vesztés történt a terhesség 8-11. hetében, a placenta vizsgálata során nem találtak embryonális szövetmaradványokat. Jauniaux közleményében kilenc esetbol egyben írtak le embryonális szövetet az érett placentában, a terhesség 8-12. hetében történt embryonális elhalás után. Saját anyagunkban, a részletes morfológiai vizsgálat eredményeként az elozetesen ikerterhesként azonosított, de csak egy gyermeket világra hozó csoport tagjainak (49) placentájában csak egy esetben sikerült egy 7-9 hetes embryo maradványait felfedezni. A kontroll esetekben (98) sehol sem azonosítottunk embryonális maradványt. A korábbi közlemények és saját megfigyeléseink alapján a vanishing twin jelenség morfológiai jeleként számon tartott fibrin plakkokat (placentában és membránokban), cystikus elváltozásokat behatóan tanulmányoztuk, radiológiai, makroszkópos és 19
mikroszkópos vizsgálattal. Mivel a különbözo lokalizációjú és kiterjedésu fibrin plakkok hasonló gyakorisággal fordultak elo az index és kontroll esetekben, és ezek mikroszkópos képe is azonos volt, arra a következtetésre jutottunk, hogy ezen elváltozások nem megfelelo indikátorai a VT jelenségnek. Önmagában a fibrin plakk nem fogadható el a VT bizonyítékaként, csak akkor, ha abban az organizálódott embryonális szövetmaradványok is jelen vannak. Ugyanakkor, az index placentákban szignifikánsan nagyobb volt a subchorionális cysták elofordulása, és nagyobb, körülírt subchorionikus thrombust is gyakrabban találtunk. Ez a lelet utalhat az ikerterhesség és a VT korai ultrahangos diagnosztikájának problémáira is. Ezek a patológiás elváltozások nagy differenciál diagnosztikai nehézséget okozhatnak, esetlegesen ikerterhességként interpretálhatja azokat a tapasztalt ultrahangos vizsgáló is. Az, hogy a feldolgozás során mindössze egy VT esetet tudtunk azonosítani, arra mutat rá, hogy a placenta patológiai feldolgozása a korai, spontán embryo vesztés detektálásának nem elég érzékeny módszere, mint ahogy ezt a korábban közölt tanulmányok is tanúsítják. Vizsgálataink során választ kerestünk arra a kérdésre is, hogy az embryonális szövetmaradványon és cystákon kívül, milyen egyéb elváltozások jellegzetesek a VT placentákra. A makroszkópos eltérések közül, a marginális köldökzsinór tapadás fordult elo szignifikánsan gyakrabban, hasonlóan az ismert irodalmi adatokhoz, ebben az értelemben a VT placenták hasonlóságot mutattak az érett ikerplacentákkal. A szövettani vizsgálat érdekes összefüggéseket tárt fel. A VT placentákban szignifikánsan gyakrabban fordultak elo multiplex elváltozások, azaz két vagy annál több lézió együttesen. A kombinált vagy multiplex léziók vizsgálatánál olyan entitásokat vizsgáltunk, melyekrol már ismert volt (Redline és mtsai.), hogy agyi bénulás vagy súlyos neurológiai károsodás kialakulásával összefüggésbe hozhatók. A magzati erekkel kapcsolatos thrombotikus- vasculopathiás eltérések (magzati törzsboholy ér thrombosis és magzati chorion ér thrombosis, haemorrhágiás endovasculitis), grade 3 vagy 4 ismeretlen eredetu basalis és parenchymás villitis (VUO) és a grade 3 anyai chorioamnionitis gyakrabban volt jelen a VT placentákban, mint a kontrollokban, bár a különbség a statisztikai szignifikancia szintjét nem érte el. Ennek ellenére figyelemre méltó, hogy a thrombotikus és inflammatorikus elváltozások ilyen gyakorisággal megjelentek az index csoportban, különösen annak ismeretében, hogy a VUO szoros összefüggést mutat intrauterin növekedési retardatióval, pre-eclampsiával, agyi eredetu bénulással. Ugyanakkor, Kraus, Redline és mások megfigyelései alapján, a magzati erek thrombotikus elváltozásairól újabban ismertté vált, hogy szignifikáns összefüggést mutatnak a magzat súlyos neurológiai károsodásával valamint agyi eredetu bénulással. A súlyos anyai chorioamnionitis nagyobb gyakorisága index anyagunkban, összhangban van Rodriguez-Gonzalez azon megfigyelésével, hogy a vanishing twin jelenség hajlamosít ido elotti burokrepedésre. Eredményeink felvetik annak lehetoségét, hogy hasonló patológiás folyamatok állnak a vanishing twin jelenség és az agyi eredetu bénulás hátterében. Ugyanakkor, további, prospektív tanulmányra lenne szükség annak tisztázására, hogy az inflammatorikus és thrombotikus elváltozások okai-e vagy következményei a vanishing twin jelenségnek. A vanishing twin hypotézis vizsgálatára alkalmas lenne, ha a korai ultrahangos vizsgálattal azonosított embryo vesztés esetén, a túlélo ikerben megszületés után keresnénk neurológiai eltérés jeleit. Egy másik lehetoség az, hogy neurológiai károsodásban, agyi bénulásban szenvedo gyermekek placentáját tanulmányozzuk, s keressük azokban a VT morfológiai jeleit. Az utóbbi módszert választva, 21, idegrendszeri károsodást szenvedett gyermek placentáját választottuk ki vizsgálatra. Mivel a VT jelenség jellegzetes makroszkópos jeleként leírt fibrin plakkok jelenlétét korábbi tanulmányunkban gyakran észleltük kontroll placentákban, ezért minden index esethez 3 egyeztetett kontrollt használtunk.
20
Részletes morfológiai vizsgálattal sem találtunk embryonális szövetmaradványokat, fetus papyraceust, petezsák maradványt sem az index sem a kontroll esetekben. A perifériás és a membránban elhelyezkedo fibrin plakkok hasonló gyakorisággal fordultak elo mindkét csoportban. Korábbi tanulmányok szerint (Bejar és mtsai., Burke és mtsai., Grafe és mtsai.), az agyi bénulással szignifikáns összefüggést mutató léziók a magzati erek elzáródása, a régi infraktus, a placenta abruptio, a chorioamnionitis és a funisitis, a meconium festenyzett membránok, és az ikerterhességben megjeleno éranastomozisok . Ugyanakkor, ezekhez a tanulmányokhoz nem állt rendelkezésre egészséges, élve született esetekbol származó, egyeztetett kontroll placenta. Egy újabb, retrospektív eset-kontroll tanulmányban Redline ás mtsai. kilenc, az agyi bénulással szoros összefüggést mutató elváltozást találtak érett újszülöttek esetén (meconium okozta magzati érfal nekrózis, súlyos, magzati válasszal járó chorioamnionitis, chorion ér thrombus, magvas vvt-k számának emelkedése, abruptióra utaló jelek, diffúz krónikus villitis, extenzív avasculáris villus képzodés, diffúz chorioamnionicus haemosiderosis és extenzív perivillózus fibrin depozíció), és két szignifikáns léziót (friss chorion ér thrombus és súlyos villus oedema) írtak le igen kis súlyú koraszülöttek esetén. Az általunk vizsgált anyagban diffúz chorioamnionikus haemosiderosis nem volt jelen, és a vizsgált léziók közül egy sem volt szignifikánsan gyakrabban jelen az index csoportban. A multiplex és focális magzati ér thrombosis, az intimális fibrin párna, a high-grade krónikus villitis, valamint a magvas vvtk-k emelkedett száma mutatott enyhe összefüggést az AB placentákkal, de ez a reláció nem érte el a statisztikai szignifikancia szintjét. Ugyanakkor, klinikai szempontból nem elhanyagolható ezen asszociációk jelenléte, mivel a thrombotikus magzati ér elváltozások szerepe ismert az irodalomból, a magvas vvt-k emelkedett száma krónikus hypoxia fennállására utal, a high grade ismeretlen eredetu krónikus villitis pedig kiterjedt boholy pusztulással jár. Az extenzív avasculáris villus képzodés, kiterjedt infarctusok, és az acut chorioamnionitisre vonatkozó eredményeink váratlanok és hipotézisünkkel ellentétesek voltak. Várakozásunkkal és az ismert irodalmi adatokkal ellentétben, a fenti elváltozások egyforma gyakorisággal fordultak elo az index és kontroll esetekben, vagy éppen a kontrollokban jelentek meg gyakrabban. Az irodalmi adatok meta-analízise során megerosítést nyert, hogy az akut chorioamnionitis az AB és a periventrikuláris leukomalácia rizikó faktorának tekintheto. A high grade magzati választ (elorehaladott funisitis) indukáló akut chorioamnionitis a neurológiai károsodással szignifikáns összefüggést mutatott, és nagy gyakorisággal társult magzati chorion ér thrombosissal Redline nested case-control tanulmányában. Ezzel ellentétben, a high grade és high stage magzati válasszal járó acut chorioamnionitis esetek a kontrollok között jelentek meg nagyobb gyakorisággal tanulmányunkban, egy esetben szövodményes magzati chorion ér thrombosissal kísérve. Ezek az eredmények nem támasztják alá a Vanishing twin hipotézist, és nem bizonyítják az akut chrorioamnionitis rizikó faktor szerepét, ugyanakkor nem is zárják ki azt. Mindössze négy elváltozás (multiplex és focális magzati ér thrombosis, az intimális fibrin párna, a high-grade krónikus villitis, valamint a magvas vvtk-k emelkedett száma) volt gyakrabban megfigyelheto a cerebrális paresisben szenvedo betegek placentájában. Feltételezheto, hogy a VT jelenség a neurológiai károsodásoknak csak kis hányadáért teheto felelossé, s ezt a csoportot az általunk vizsgált anyag nem reprezentálta. Ugyanakkor, figyelembe kell venni, hogy a placenta patológiás elváltozásai és a klinikai kép között sokszor nem találunk egyértelmu kapcsolatot. A placenta elváltozások klinikai jelentosége és a neurológiai károsodások kialakulásában játszott szerepe további, szélesköru, nagy számú anyagon, egyeztetett kontrollokkal végzett vizsgálatok segítségével tisztázható. A placentális elváltozások gyakoriságának elemzése során figyeltük meg, hogy a magzati ér thrombotikus elváltozásai rendszeresen kísérik az ismeretlen eredetu krónikus villitist és ez a
21
kapcsolat statisztikailag szignifikánsnak bizonyult. Az avasculáris boholy képzodés és a magzati törzsboholy ér thrombosis szignifikánsan gyakrabban fordult elo krónikus villitissel, mint anélkül. A haemorrhágiás endovasculitis gyakorisága 1,58-szor volt magasabb VUO esetén, intimális fibrin párna képzodés 12,7%-ban volt jelen VUO esetén, míg 9,6%-ban VUO nélkül. Utóbbi két összefüggés nem bizonyult statisztikailag szignifikánsnak. Feltételezheto, hogy a gyulladásban résztvevo sejtes elemek által termelt citokinek és thrombogén faktorok szerepet játszanak a jelenség kialakulásában, melynek további vizsgálata érdekes részletekre deríthetne fényt.
6. Fontosabb új eredmények és megállapítások 1. Morfológiai módszerek segítségével elsoként igazoltuk és publikáltuk az apoptózis jelenlétét koraszülött újszülöttek különbözo kórképeiben a tüdoben, az agyban, a májban és a vesében. 2. Az alvoláris-bronchioláris epitheliális sejtek apoptózisa lényeges szerepet játszik a koraszülöttek krónikus tüdobetegségének kialakulásában, de csak a bronchopulmonális dysplasia subacut és krónikus stádiumában, azt megelozoen az apoptotikus aktivitás nem emelkedett. 3. Koraszülöttek hypoxiás agykárosodásában, agykamrai vérzés és periventrikuláris leukomalácia mellett, enyhe vagy legfeljebb mérsékelt apoptotikus aktivitást észleltünk a germinális matrix sejtjeiben, tehát az apoptózis nem bír dönto jelentoséggel e kórképek kialakulásában. 4. A súlyos bakteriális infekcióban (bronchopneumonia, sepsis) szenvedo koraszülöttekben gyakoribb és intenzívebb volt az apoptotikus aktivitás az agy és tüdo szövetben. 5. A Vanishing twin jelenség vizsgálata során megállapítottuk, hogy az érett placenta morfológiai vizsgálata számos esetben nem elég érzékeny módszer a terhesség korai szakaszában elhalt embryo azonosítására. A VT morfológiai bizonyítékaként csak a placenta és a membránok radiológiai vizsgálata során kimutatott magzati részek, illetve a szövettani feldolgozás során azonosítható magzati szövetmaradványok fogadhatók el. 6. Vizsgálataink rámutattak, hogy a subchorionális vérzések és chorion cysták differenciál diagnosztikai problémát jelentenek az ikerterhesség megállapításában az ultrahangos vizsgálat során. 7. A Vanishing twin jelenség szoros összefüggést mutatott a köldökzsinór tapadási rendellenességével (marginális tapadás) és a placenta multiplex szöveti elváltozásaival. 8. Eredményeink nem támasztották alá a Vanishing twin hypotézist, tehát az ikerpár egyik tagjának korai elvesztése vagy nem játszik szerepet a túlélo iker központi idegrendszeri károsodásának kialakulásában, vagy az esetek csak igen kis hányadában teheto felelossé, amely a mi anyagunkban nem reprezentálódott. 9. A placentális elváltozások gyakoriságának elemzése során figyeltük meg, hogy a magzati ér thrombotikus elváltozásai rendszeresen kísérik az ismeretlen eredetu krónikus villitist és ez a kapcsolat statisztikailag szignifikánsnak bizonyult. Az avasculáris boholy képzodés és a magzati törzsboholy ér thrombosis szignifikánsan gyakrabban fordult elo krónikus villitissel, mint anélkül.
22
Irodalomjegyzék A témában megjelent publikációk jegyzéke ? Hargitai B., Szabo V., Hajdu J., Pataki M., Farid P., Papp Z., Szende B. Apoptosis in various organs of preterm infants: histopathologic study of lung, kidney, liver, and brain of ventilated infants. Pediatr Res. 2001. 50: 110-4 ? Hargitai B., Szabó V., Cziniel M., Hajdú J., Papp Z., Szende B., and Sergi C.: Human brain of preterm infants after hypoxic- ischaemic injuries: no evidence of a substantial role for apoptosis by using a fine-tuned ultrasound- guided neuropathological analysis. Brain and Dev 2004. 26: 30-36 ? Hargitai B., Marton T., Cox P.: BEST PRACTICE NO 178: Examination of the human placenta J Clin Path 2004. 57: 785-792 ?
Hargitai B., Marton T.: Perinatális Pathologia. Kopper L., Schaff Zs.(szerk.): Pathologia, Medicina, Budapest 2004.
Egyéb közlemények ? Szende B., Tímár F., Hargitai B.: Olive oil decreases liver damage in rats caused by carbon tetrachloride (CCl4 ). Exp Toxic Pathol 1994.46:355-59. ? Kendrey G., Szende B., Lapis K., Marton T., Hargitai B., Roe F.J.C., Lee P.N.: Misdiagnosis of lung cancer in a 2000 consecutive autopsy study in Budapest. Gen Diagn Pathol 1995/96.141:169-78. ? Rigó J. jr., Hajdú J., Hargitai B., Varga I., Hidvégi J.: A Ballantyne syndroma és a praeeclampsia kapcsolata.Magyar Noorvosok Lapja 1999.62:299-302. ? Marton T., Hargitai B., Patkós P., Csapó Zs., Szende B., Papp Z.: A fetopathologiai feldolgozás gyakorlata. Orv. Hetil. 1999.140:1411-16. ? Marton T., Hargitai B., Boze T., Tanko A., Csapo Z., Szende B., Papp Z.: Az elso trimeszterbeli vetélések morfológiai háttere. Orv. Hetil. 2003.144:1185-98. ? Magenheim R., Than N., Hargitai B., Rigó J. jr.: Harmadik trimeszterben diagnosztizált extrém magas alkalikus foszfatáz szérumszint szövõdménymentes terhességben. Magyar Noorvosok Lapja 2003. 66.297-300. ? Boronkai A., Than N.G., Magenheim R., Bellyei S., Szigeti A., Deres P., Hargitai B., Sumegi B., Papp Z., Rigo J. Jr.: Extremely high maternal alkaline phosphatase serum concentration with syncytiotrophoblastic origin J Clin Pathol 2005.58:72–76. ? Hargitai B., Csabai L., Bán Z., Hetényi I., Szucs I., Varga Sz., Papp Z.: Rare case of exomphalos complicated with umbilical cord teratoma in a fetus with trisomy 13. Fetal Diagn Ther. (elfogadva)
A témában megjelent idézheto absztraktok
23
? ? ? ?
Degrell P., Hargitai B., Szücs A., Szende B. (1999): Apoptosis in myocardial infarction and in myocardium of premature infants. Cardiologica Hungarica. Cardiological abstract, page 56 Hargitai B., Degrell P., Szabó V., Szende B. (1999): Apoptosis in various organs of preterm infants. 1999, Belfast, PPS meeting Hargitai B., Porter H.J., Golding J., Berry P.J. (2002): Association between fetal thrombopathic lesions and villitis of unknown origin. 2002, York, BRIPPA meeting Hargitai B., Porter H.J., Emond A., Golding J., Berry P.J. (2002): Cerebral palsy and vanishing twin phenomenon: histopathological study of placentas. 2002, Rome PPS meeting. Pediatr Dev Pathol. 2003.6:193.
Egyéb idézheto absztraktok ? ? ? ? ?
Marton T., Nagy B., Hargitai B., Tóth-Pál E., Csapó Zs., Papp Z. (1998): Neural tube defect and 677 T-C mutation of methylenetetrahydrofolate reductase in the Hungarian population. Clin. Exper. Pathol. 46:563. Csikós M., Kohalmi B., Hargitai B., Kárpáti S., Horváth A. (1999): Severly damaged amorphous components of skin elastic tissue in a congenital recessive cutis laxa, J Invest Dermatol 113: (3): 452 Marton T., Csabay L., Hajdú J., Hargitai B., Csapó Zs., Papp Z. (1999): Prenatally diagnosed umbilical haemangioma of an otherwise healty new born. Virchows Arch. 435:306. Hargitai B., Cesko I., Hajdú J., Marton T., Papp Z. (1999): Atrioventricular canal defect associated with trisomies others than trisomy 21. Virchows Arch. 435:305. Csikós M., Kohalmi B., Hargitai B., Kárpáti S., Horváth A. (2000): Angeborene recessive vererbte Cutis laxa mit ungewöhnlicher, schwerer Myopathie. Zeirschrift für Hautkrankheiten H+G 1: (75): 59
24
