TESIS
PEMBERIAN OZON MEDIS MAYOR ( MAJOR AUTO HAEMOTHERAPY ) MENURUNKAN KADAR TOTAL RADIKAL BEBAS DAN MDA PADA PEROKOK BERAT
HENTI WIDOWATI
PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2010
TESIS
PEMBERIAN OZON MEDIS MAYOR ( MAJOR AUTO HAEMOTHERAPY ) MENURUNKAN KADAR TOTAL RADIKAL BEBAS DAN MDA PADA PEROKOK BERAT
HENTI WIDOWATI NIM : 0790761032
PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2010
TESIS
PEMBERIAN OZON MEDIS MAYOR ( MAJOR AUTO HAEMOTHERAPY ) MENURUNKAN KADAR TOTAL RADIKAL BEBAS DAN MDA PADA PEROKOK BERAT
Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister Pada Program Magister Program Studi Ilmu Kedokteran Biomedik Kekhususan Anti Aging Medicine Program Pascasarjana Universitas Udayana
HENTI WIDOWATI NIM : 0790761032
PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR
2010 Lembar Pengesahan
TESIS INI TELAH DISETUJUI PADA TANGGAL 29 Oktober 2010
Pembimbing I
Pembimbing II
Prof.Dr.dr.Wimpie Pangkahila,
dr. S Winata, MSc
Sp.And.FAACS
NIP : 130264497
NIP : 194612131971071001
Mengetahui, Ketua Program Studi Ilmu Biomedik Kekhususan Anti-Aging Medicine Program Pasca Sarjana Universitas Udayana
Direktur Program Pasca sarjana Universitas Udayana
Prof. Dr.dr.Wimpie Pangkahila, Sp.And.FAACS NIP : 194612131971071001
Prof. Dr. dr. A.A.Raka Sudewi, Sp. S (K) NIP : 195902151985102001
Tesis Ini Telah Diuji dan Dinilai Oleh Panitia Penguji pada Program Pascasarjana Universitas Udayana Pada Tanggal 29 Oktober 2010
Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana, No : 1753/H14.4/HK/2010
Ketua
: Prof. Dr. dr. Wimpie Pangkahila, Sp.And.FAACS
Anggota
:
1. Prof. Dr.dr.Alex Pangkahila, M.Sc.,Sp.And.
2. Prof. dr. N. Agus Bagiada, Sp. BIOK. 3. Prof. Dr. dr. N. Adiputra, MOH 4. dr. S Winata, MSc
UCAPAN TERIMA KASIH Pertama-tama perkenankanlah penulis memanjatkan puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena hanya atas karunia-Nya tesis yang berjudul “Pemberian Ozon Medis Mayor (Major Auto Haemotherapy) Menurunkan Kadar Total Radikal Bebas Dan MDA Pada Perokok Berat” dapat diselesaikan dalam rangka menyelesaikan pendidikan di Program Pascasarjana pada Program Studi Ilmu Kedokteran Biomedik Universitas Udayana. Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan rasa hormat, penghargaan dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Prof. Dr. dr. Wimpie Pangkahila, Sp.And, FAACS selaku ketua Program Studi Ilmu Kedokteran Biomedik Universitas Udayana dan pembimbing I yang telah memberikan banyak sekali masukan dan bimbingan kepada penulis selama penyusunan tesis ini. 2. dr. S Winata, MSc, selaku pembimbing II, yang telah banyak memberikan bimbingan dan masukan kepada penulis selama penyusunan tesis ini.
3. Prof. Dr. dr. J Alex Pangkahila, M.Sc., Sp.And., selaku pembimbing akademik dan penguji yang telah banyak memberikan dorongan, semangat, bimbingan dan masukan kepada penulis selama penyusunan tesis ini. 4. Prof. dr. N. Agus Bagiada, Sp. BIOK. selaku penguji yang dengan sangat bersemangat membimbing dan banyak member masukan kepada penulis selama penyusunan tesis ini. 5. Prof. Dr. dr. N. Adiputra, MOH selaku penguji yang telah banyak memberikan bimbingan dan masukan kepada penulis selama penyusunan tesis ini. Penulis juga sangat
berterima kasih kepada semua pihak yang telah ikut
membantu dalam pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini, semoga Tuhan Yang Maha Esa senantiasa melimpahkan berkat dan rahmat-Nya kepada mereka semua.
Denpasar, Oktober 2010 Penulis,
dr. Henti widowati
ABSTRAK PEMBERIAN OZON MEDIS MAYOR ( MAJOR AUTO HAEMOTHERAPY) MENURUNKAN KADAR TOTAL RADIKAL BEBAS DAN MDA PADA PEROKOK BERAT
Kebiasaan merokok sudah menjadi kebiasaan yang sangat umum di masyarakat. Bahaya merokok terhadap kesehatan tubuh telah diteliti dan dibuktikan oleh banyak peneliti. Tingginya kadar radikal bebas dalam darah perokok berat dapat memicu timbulnya berbagai penyakit yang berbahaya bagi tubuh, seperti emfisema dan kanker paru-paru Radikal bebas dalam jumlah kecil dibutuhkan oleh tubuh sebagai signal messenger, namun bila jumlahnya berlebihan dapat memicu terjadinya stress oksidatif, dimana jumlah radikal bebas dalam tubuh melebihi kapasitas tubuh untuk menetralisirnya. Untuk menghindari berbagai penyakit yang timbul karena radikal bebas dibutuhkan asupan antioksidan dari luar tubuh yang dapat diperoleh dari makanan ataupun suplementasi vitamin. Dalam perkembangan ilmu kedokteran masa kini dikenal terapi yang berfungsi untuk mengaktifkan antioksidan endogen dalam tubuh. Terapi tersebut adalah terapi ozon medis yang menggunakan gas ozon yang di dapatkan dari pencampuran oksigen murni dan gas ozon dengan perbandingan 95% O2 dan 5% O3. Terapi ozon meningkatkan antioksidan internal dengan mengaktivasi Superoksid Dismutase, Glutathion peroksidase, serta Catalase. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui manfaat terapi ozon sebagai alternatif terapi dalam menurunkan kadar radikal bebas dan kerusakan oksidatif pada darah perokok berat, dengan cara mengaktifkan antioksidan endogen dalam tubuh.
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental mengunakan rancangan pre-test post-test control group design yang dilakukan pada laki-laki perokok berat berusia 30 tahun sampai 50 tahun. Prosedur penelitian adalah subyek terbagi menjadi 2 kelompok perlakuan dimana kelompok pertama berjumlah 8 orang mendapatkan terapi ozon sebanyak 10 kali dengan selang waktu 1 minggu, kelompok kedua berjumlah 8 orang merupakan kontrol yang mendapat terapi placebo injeksi 1 cc NaCl secara I.V., sebanyak 10 kali, dengan selang waktu 1 minggu. Pemilihan pemberian NaCl agar tidak mempengaruhi kenaikan kadar antioksidan dalam tubuh. Pemeriksaan kadar radikal bebas darah dilakukan pada kedua kelompok pada awal dan akhir penelitian dengan alat FORM untuk mendapatkan perbedaan kadar radikal bebas dalam darah sebelum dan setelah dilakukan penelitian. Pada kedua kelompok juga dilakukan pemeriksaan MDA. Hasil penelitian menunjukkan terjadinya penurunan kadar radikal bebas dalam darah pada kelompok yang diberi terapi ozon selama 10 minggu. Hasil penelitian dengan menggunakan uji perbandingan sesudah diberikan perlakuan (post test) antara kedua kelompok dengan uji t-independent, didapatkan bahwa rerata kadar radikal bebas dalam darah dengan alat FORM, kelompok kontrol adalah 419,75113,47, rerata kelompok terapi ozon adalah 311,0039,17, dengan uji t-independent didapatkan bahwa terjadi penurunan rerata radikal bebas dalam darah kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan 1 (P1) secara bermakna (p < 0,05). Disamping dengan menggunakan alat FORM untuk mengetahui radikal bebas dalam darah juga diukur kadar MDA. Pada akhir penelitian didapatkan rerata kadar MDA kelompok kontrol adalah 0,0460,006, rerata kelompok terapi ozon adalah 0,0380,005. Analisis kemaknaan dengan uji t-independent test menunjukkan bahwa terdapat perbedaan bermakna. ( p <0,05). Berdasarkan hasil penelitian, menunjukkan terjadinya penurunan bermakna rerata radikal bebas dalam darah baik yang diukur dengan nilai FORT maupun kadar MDA pada kelompok P1 yang diberi terapi ozon selama 10 minggu. Hal ini disebabkan karena terapi ozon dapat mengaktifkan antioksidan endogen dalam tubuh. Dari hasil penelitian didapatkan menurunnya kadar radikal bebas dalam darah perokok berat, yang di dukung oleh penurunan kadar MDA yang merupakan indikator penurunan kerusakan oksidatif pada sel tubuh sehingga akan mengurangi resiko terkena penyakit degeneratif seperti cardiovascular, cerebrovascular dan premature aging, sehingga akan didapatkan keadaan kesehatan dan kualitas hidup yang lebih baik.
Kata kunci : Terapi ozon, Perokok berat, radikal bebas, kerusakan oksidatif.
ABSTRACT MAJOR AUTO HAEMOTHERAPY REDUCE TOTAL FREE RADICALS AND MDA IN HEAVY SMOKERS Smoking is a common habit in the community. The harmful effect of smoking to health has been studied and proven by many researchers. High levels of free radicals in the blood of active smokers can lead to various diseases, such as emphysema and lung cancer Free radicals in small amounts are needed by the body as a signal messenger, but in excessive amounts it leads to oxidative stress, where the amount of free radicals in the body exceeds the body's capacity to neutralize them. Therefore antioxidants intake from food or vitamin supplementation are required to prevent various diseases that arise because of free radicals. In recent development of medical science, there is therapy that is able to activate endogenous antioxidants in the body. This aforementioned therapy is medical ozone therapy that uses ozone gas by mixing pure oxygen and ozone gas with a ratio of 95% O 2 and 5% O 3. Ozone therapy enhances internal antioxidant by activating Superoxid Dismutase, Glutathione peroxidase, and Catalase. This study aim to determine the benefits of ozone therapy as an alternative therapy in reducing the concentration of free radicals and oxidative damage in the blood of heavy smokers by activating endogenous antioxidants in the body.
This experimental study with pre-test post-test control group design was performed in male heavy smokers of 30 years to 50 years. This study used subjects divided into 2 groups where the first group was 8 people treated with 10 times ozone therapy once weekly, the second group was 8 people as control that received placebo therapy with IV 1 cc NaCl injection, performed 10 times once weekly. The use of NaCl is because it does not affect an increase of antioxidant concentration in the body. Blood concentration of free radicals in both groups were evaluated at the beginning and end of the study with FORM tool to look for differences. MDA concentration was also performed in both groups. The results showed a decrease in blood levels of free radicals in the group given the major ozone 40 ug / ml for 10 weeks. Post-test comparison analysis by independent t-test found that the mean concentrations of free radicals in the control group was 419.75 113.47 and ozone therapy group was 311.00 39.17, with a significant decrease in the control group compared to group 1 (P1) (p <0.05). In addition to FORM tool used to evaluate free radicals concentration in blood, MDA concentration were also measured. At the end of the study it was found that the mean MDA concentrations of the control group was 0.046 0.006 and ozone therapy group was 0.038 0.005. Analysis by independent t-test showed there were significant differences (p <0.05). Based on the result of this research revealed a significant decrease in the mean value of free radicals in blood both measured by FORT tool and MDA concentration in P1 group ozone therapy. This is because ozone therapy can activate the endogenous antioxidants in the body. The decrease of free radicals concentration in the blood of heavy smokers, result in a decrease of oxidative damage that will further reduce the risk of degenerative diseases such as cardiovascular, cerebrovascular and premature aging. Finally, a state of health and a better quality of life will be achieved.
Keywords: ozone therapy, heavy smoking, free radicals, oxidative damage.
DAFTAR ISI SAMPUL DALAM ..................................................................................................i PRASYARAT GELAR ..........................................................................................ii LEMBAR PENGESAHAN ...................................................................................iii PENETAPAN PANITIA PENGUJI ......................................................................iv UCAPAN TERIMA KASIH ...................................................................................v ABSTRAK ............................................................................................................vii ABSTRACT ...........................................................................................................ix DAFTAR ISI ..........................................................................................................xi
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................xv BAB I PENDAHULUAN .....................................................................................1 1.1 Latar Belakang .....................................................................................1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................6 1.3 Tujuan Penelitian ..................................................................................6 1.3.1 Tujuan Umum .............................................................................6 1.3.2 Tujuan Khusus ...........................................................................6 1.4 Manfaat Penelitian ................................................................................7 BAB II TINJAUAN PUSTAKA ...........................................................................8 2.1 Rokok ....................................................................................................8 2.1.1 Definisi Rokok ............................................................................8 2.1.2 Efek Buruk Rokok ......................................................................8 2.1.3 Rokok Sebagai Sumber Radikal Bebas .......................................9 2.1.3.1 Kandungan Zat Beracun Dalam Rokok…………….......9 2.2 Radikal Bebas ……………………………………………………… 11 2.2.1 Definisi Radikal Bebas ………………………………….........11 2.2.2 Sumber Radikal Bebas ……………………………………….12 2.2.3 Tahapan Pembentukan Radikal Bebas ……………………….12 2.2.4 Sifat Radikal Bebas …………………………………………..13 2.2.4.1 Peroksidasi Lipid ……………………………………...14 2.2.5 Kerusakan Oksidatif oleh Oksidan Rokok Pada Molekul Biologik ………………………………………………………16
2.2.6 Pengukuran Radikal Bebas ………………………………......17 2.3 Antioksidan ………………………………………………………….19 2.3.1 Definisi Antioksidan ………………………………………….19 2.3.2 Jenis Antioksidan ……………………………………………..19 2.3.2.1 Antioksidan Pencegah …………………………….......19 2.3.2.2 Antioksidan Pemutus Rantai ……………………….....19 2.4 Ozon ………………………………………………………………...20 2.4.1 Reaksi Ozon Dalam Tubuh …………………………………..21 2.4.2 Mekanisme Kerja Terapi Ozon dalam Bidang Kedokteran Anti Penuaan …………………………………………………27 2.4.3 Proses Pembentukan Ozon Medis ……………………………29 2.4.4 Konsentrasi Ozon …………………………………………….30 2.4.5 Penghitungan Dosis Ozon ……………………………………30 2.4.6 Aplikasi Ozon dalam Bidang Kedokteran …………………...31 2.4.7 Indikasi Terapi Ozon …………………………………………33 2.4.8 Kontra Indikasi Terapi Ozon ………………………………...33 BAB III KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN .............35 3.1 Kerangka Konsep ..............................................................................36 3.2 Hipotesis Penelitian............................................................................37 BAB IV METODE PENELITIAN ....................................................................38 4.1 Rancangan Penelitian ........................................................................38 4.2 Tempat dan Waktu Penelitian ...........................................................39
4.3 Populasi dan Sampel .........................................................................39 4.3.1 Kriteria Sampel Inklusi ………………………………….......40 4.3.2 Kriteria Sampel Eksklusi ……………………………………40 4.3.3 Kriteria Drop Out ………………………………………….. 40 4.4 Besar Sampel ………………………………………………………40 4.5 Variabel Penelitian ...........................................................................42 4.5.1 Identifikasi Variabel ...............................................................42 4.5.2 Klasifikasi Variabel ................................................................42 4.5.3 Definisi Operasional Variabel ................................................42 4.6 Bahan Penelitian ...............................................................................43 4.6.1 Alat yang Digunakan ……………………………………….43 4.6.2 Bahan Penelitian ……………………………………………44 4.7 Prosedur Penelitian ………………………………………………..44 4.7.1 Pengambilan Subyek ………………………………………..44 4.7.2 Prosedur Pemeriksaan Kadar Radikal Bebas Dalam Darah ...46 4.7.3 Prosedur Ozon Mayor Autohemoterapi ……………………..47 4.7.4 Prosedur Penyuntikan NaCl ………………………………....47 4.8 Alur Penelitian ………………………………………………..........48 4.9 Analisis Data ……………………………………………………...49 BAB V HASIL PENELITIAN .........................................................................50 5.1 Uji Normalitas Data ……………………………………………….50 5.2 Uji Homogenitas ..............................................................................51
5.3 Nilai Fort Unit ..................................................................................51 5.3.1 Uji Komparabilitas ...............................................................51 5.3.2 Analisis Efek Perlakuan .......................................................52 5.4 Kadar MDA …………………………………………………………….55 5.4.1 Uji Komparabilitas ………………………………………….….55 5.4.2 Analisis Efek Perlakuan …………………………………….…56 5.4.2.1 Analis Perlakuan antar Kelompok …………………....56 5.4.2.2 Analisis Antar Kelompok Sebelum dan Sesudah Perlakuan……………………………………………… 57
5.4 Hubungan antar Kadar MDA dengan Nilai FORT Unit …………..58 BAB VI PEMBAHASAN .................................................................................59 6.1 Subyek Penelitian ………………………………………………….59 6.2 Pengaruh Pemberian Ozon Mayor Terhadap Kadar Radikal Bebas Dalam Darah ………………………………………………………60 6.3 Beberapa Manfaat Terapi Ozon Terhadap Kesehatan …………….63 6.5 ManfaatPenelitian……………………………………………….....61
BAB VII SIMPULAN DAN SARAN ..............................................................65 7.1 Simpulan …………………………………………………………....65 7.2 Saran ………………………………………………………………..65 DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………….....66
LAMPIRAN …………………………………………………………………...70
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Daftar tabel…………………………..………………………………….69 Lampiran 2. Penelitian yang Menggunakan alat FORM ……………………………77 Lampiran 3. Inform Consent …………………………………………………………79 Lampiran 4. Gambar Alat Generator Ozon Medis ….……………………...….........80 Lampiran 5. Gambar Proses Pengerjaan Ozon Mayor Autohaemotherapy ………..81 Lampiran 6. Gambar Alat pemeriksa kadar radikal bebas darah FORM ……..….83 Lampiran 7. Ethical Clearance……………………………………………………………… .85
DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Proses Oksidasi oleh O3 pada Membran sel Mengandung PUFA …24 Gambar 2.2 Proses Peroksidasi Lemak pada Membran Sel ……………………..25 Gambar 2.3 Proses Induksi antioksidan endogen oleh ozon …………………….28 Gambar 2.4 Metabolisme Sel Darah Merah yang Dipengaruhi oleh Peroxide ….29 Bagan 3.1. Bagan Kerangka Konsep Penelitian ....................................................38 Bagan 4.1. Rancangan Penelitian ..........................................................................39 Bagan 4.2 Tabel Nilai Kadar Radikal Bebas pada Alat FORM ………………...47 Bagan 4.7 Alur Penelitian ……………………………………………………….49
DAFTAR SINGKATAN ATP
: Adenosine triphosphate
ATPase
: Adenosine triphosphatase
CAT
: Catalase
Cl
: Chlorine
CO
: Carbon Monoxide
CO2
: Carbon Dioxide
COPD
: Chronic obstructive pulmonary disease
COS
: Chronic Oxidative Stress
EBOO
: Extracorporeal blood circulation against O2-O3
FDA
: Food and Drug Administration
Fe2+Fe3+
: Iron
G-6P
: Glucose-6 phosphate
G-6PD
: Glucose-6 phosphate dehydrogenase
GSH
: Glutathione reduced form
GSH-Px
: Glutathione peroxidase
GSH-T
: Glutathione transferase
GSSG
: Glutathione disulfide
GSSGR
: Glutathione reductase
H2O2
: Hydrogen peroxide
Hb
: Haemoglobin
HbCO
: Carboxyhaemoglobin
HO-1
: Haeme-oxygenase I (HSP 32)
HO2
: Hydroperoxy radical
IL
: Interleukin
IU
: International Unit
IV
: Intravenous
LOPs
: Lipid Oxidation products
MDA
: Malonyldialdehyde
N2
: Nitrogen
N2O
: Nitrous oxide
NAD
: Nicotinamide adenine dinucleotide, oxidized form
NADH
: Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced form
NADP
: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, oxidized form
NADPH
: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, reduced form
NaHCO3
: Sodium bicarbonate
NO.
: Nitrogen Oxide
NO.2
: Nitrogen Dioxide
NOs
: Nitric oxide synthase
O2
: Oxygen
O2-
: Anion Superoxide
O3
: Ozone
1
: Singlet
O2
Oxygen
OH
: Hydroxyl radical
ONOO-
: Peroxynitrite
RO.
: Alkoxyl radical
ROO.
: Alkoperoxyl radical
ROOH
: Hydroperoxide
ROS
: Reactive oxygen species
SD
: Standard deviation
SODs
: Superoxide dismutases
WHO
: World Health Organisation
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Rokok merupakan benda yang sudah tak asing lagi bagi kita. Merokok sudah menjadi kebiasaan yang sangat umum di masyarakat. Bahaya merokok terhadap kesehatan tubuh telah diteliti dan dibuktikan oleh banyak peneliti. Kebiasaan merokok meningkatkan resiko timbulnya berbagai macam penyakit seperti penyakit jantung, gangguan pembuluh darah, kanker paru-paru, kanker rongga mulut, kanker laring, kanker esofagus, bronkhitis, tekanan darah tinggi, impotensi serta gangguan kehamilan dan cacat pada janin. Hal ini disebabkan karena banyaknya kandungan radikal bebas pada rokok yang akan merusak biomolekul penting dalam tubuh seperti DNA. Data dari Depkes tahun 2000 terungkap bahwa sebanyak 70% laki-laki dewasa di Indonesia
(141,44 juta jiwa) merupakan perokok aktif dan 60% di
antaranya (84,84 juta jiwa) berasal dari masyarakat ekonomi lemah. Pada kenyataannya kebiasaan merokok ini sulit dihilangkan dan jarang diakui orang sebagai suatu kebiasaan buruk. Apalagi orang yang merokok untuk mengalihkan diri dari stress dan tekanan emosi, lebih sulit melepaskan diri dari kebiasaan ini dibandingkan perokok yang tidak memiliki latar belakang depresi (KPAI, 2009).
Dari hasil survei sosial ekonomi nasional pada tahun 2001, didapatkan juga adanya bahaya dari second hand smoke yaitu asap rokok yang terhirup oleh orangorang bukan perokok karena berada disekitar perokok atau bisa disebut juga sebagai perokok pasif. Dalam sebatang rokok terkandung tidak kurang dari 4000 zat kimia beracun diantaranya adalah arsen, karbon monoksida, amoniak, formalin, kadmium, aseton, metana, urea dan masih banyak kandungan beracun lainnya. Zat kimia yang dikeluarkan ini terdiri dari komponen gas (85%) dan partikel (WHO, 2002). Komponen gas asap rokok adalah karbon monoksida, amoniak, asam hidrosianat, nitrogen oksida dan formalin. Partikelnya berupa tar, indol, nikotin, karbarzol dan kresol. Zat-zat ini beracun karena menimbulkan efek inflamasi dan radikal bebas, menyebabkan proliferasi dan aktivasi dari fagosit pada paru dan seluruh tubuh yang dapat menurunkan efek antioksidan (Eiserich, 1995). Tingginya kadar radikal bebas dalam darah perokok aktif dapat memicu timbulnya berbagai penyakit yang berbahaya bagi tubuh sehingga hal ini berhubungan dengan timbulnya berbagai penyakit pada seorang perokok, seperti emfisema dan kanker paru-paru (KPAI, 2009). Sebenarnya radikal bebas ini penting artinya bagi kesehatan dan fungsi tubuh jika jumlahnya tidak berlebihan atau dalam keadaan seimbang. Saat tubuh kita dipenuhi radikal bebas yang berlebihan maka molekul yang tidak stabil yang berada di dalam tubuh kita berubah bentuk menjadi molekul pemangsa. Molekul-molekul ini mulai bergerak menyerang bagian tubuh yang sehat maupun yang tidak sehat sehingga terjadi penyakit (Devlin, 1982).
Secara alami tubuh dapat menghasilkan antioksidan. Namun sejalan dengan bertambahnya usia, kemampuan tubuh untuk memproduksi antioksidan alami pun akan semakin berkurang. Hal inilah yang menyebabkan terjadinya stres oksidatif, yaitu suatu keadaan dimana jumlah radikal bebas di dalam tubuh melebihi kapasitas tubuh untuk menetralisirnya. Akibatnya intensitas proses oksidasi sel-sel tubuh normal menjadi semakin tinggi dan menimbulkan kerusakan yang lebih banyak. Stres oksidatif adalah penyebab utama penuaan dini dan timbulnya penyakit kronis seperti kanker, penyakit jantung, Alzheimer, dan lain-lain (Bagiada, 2005). Untuk menghambat proses penuaan dan mengurangi stres oksidatif, diperlukan asupan antioksidan yang cukup dan optimal ke dalam tubuh ( Pangkahila, 2007) , dimana antioksidan bekerja dengan cara menghambat oksidasi dan bereaksi dengan radikal bebas reaktif membentuk radikal bebas tidak reaktif yang relatif stabil (Ginger, 2008). Di dalam tubuh kita terdapat dua macam antioksidan, yaitu antioksidan endogen yang terdiri dari enzim-enzim dan berbagai senyawa yang dapat diproduksi oleh tubuh seperti
Super Oxide Dismutase (SOD), Gluthation Peroxidase (GPx),
dan Catalase (Cat) . serta antioksidan eksogen yang tidak dihasilkan oleh tubuh tetapi berasal dari makanan atau melalui food supplement seperti Vitamin A, beta carotene, Vitamin C, Vitamin E, Selenium(Se), Zinc (Zn), dan Flavonoid (Bagchi and Puri,1998). Dalam perkembangan ilmu kedokteran masa kini dikenal terapi yang berfungsi untuk mengaktifkan antioksidan endogen dalam tubuh. Terapi tersebut adalah terapi
ozon medis yang menggunakan gas ozon yang di dapatkan dari pencampuran oksigen murni dan gas ozon dengan perbandingan 95% O2 dan 5% O3. Terapi ozon mengaktifkan metabolisme dari sel darah merah (RBC) dengan meningkatkan 2,3 DPG (2,3 DiPhospo Glycerate) dan ATP (Adenosin Tri Phosphate) yang menghasilkan peningkatan pelepasan O2, meningkatkan kemampuan sel-sel imun dengan melepaskan cytokine seperti interferon dan interleukin, menguatkan sistem imun dengan meningkatkan IFN β (Interferon β), TGF β 1 (Transformin Growth Factor β 1) dan meningkatkan antioksidan internal dengan mengaktivasi Superoksid Dismutase, Glutathion peroksidase, serta Catalase (Bocci, 2005). Walaupun terapi ozon sudah lama digunakan dan memiliki banyak manfaat, namun sampai saat ini masih banyak keraguan dari praktisi kesehatan mengenai terapi ozon, dikarenakan masih adanya anggapan bahwa gas ozon merupakan radikal bebas dan bersifat toksik. Anggapan ini harus diluruskan dengan membedakan gas ozon yang digunakan untuk industri dan gas ozon untuk terapi. Gas ozon yang digunakan untuk industri menggunakan udara bebas sebagai sumber oksigennya dimana oksigen dalam udara bebas bercampur dengan gas lain yang sangat toksik seperti nitrogen oksida sehingga gas ozon yang dihasilkan akan bersifat toksik (Viebahn and Hansler, 2002).
Gas ozon yang digunakan untuk terapi ozon
menggunakan oksigen murni sebagai sumber oksigen, sehingga hanya akan dihasilkan oksigen murni dan ozon dengan perbandingan 95% O2 dan 5% O3. Ozon dalam jumlah kecil tidak akan menimbulkan stress oxidative acut, namun justru akan
berfungsi sebagai transduksi signal pada beberapa proses biologis dalam tubuh (Bocci, 2006). Terapi ozon adalah terapi yang murah, mudah dikerjakan namun memiliki banyak manfaat, karena alasan ini, terapi ozon digunakan secara luas di Negara Jerman dan Rusia, namun di Negara Amerika sampai saat ini terapi ozon belum mendapatkan pengakuan dari FDA (Food and Drug Administration) dengan alasan ozon merupakan gas yang toksik bagi tubuh (Daniel, 2001). Walaupun FDA melarang penggunaan
terapi ozon, namun beberapa Negara bagian Amerika
menggunakan terapi ini, di antaranya adalah Georgia, Texas, Nevada, New York, New Mexico, Colorado, Washington, Alaska, Florida, Minesota dan California (Daniel, 2001). Terdapat beberapa metode pemberian terapi ozon di antaranya terapi ozon minor, injeksi intravena larutan salin yang diozonisasi, rectal insufflation, injeksi intramuscular, penggunaan minyak yang di ozonisasi, penggunaan air yang di ozonisasi dan terapi ozon mayor (Autohaemotheraphy). Terapi ozon mayor ( AHT) yang selanjutnya akan disebut terapi ozon adalah terapi dengan cara mengalirkan darah vena dari tubuh ke dalam kantung darah ( blood bag ) kemudian diberikan gas ozon sesuai dosis terapi dan dialirkan kembali ke tubuh (Bocci, 2005). Terapi ini akan mengaktifkan kerja antioksidan endogen, meningkatkan pelepasan O2 ke jaringan, juga terjadi peningkatan sistem imun, dimana hal ini sangat dibutuhkan oleh tubuh untuk menghambat proses penuaan ( Pangkahila, 2007 ). Oleh karena itu, terapi ozon dapat digunakan dalam bidang kedokteran anti penuaan (antiaging medicine).
1.2. Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang penelitian yang diuraikan di atas, maka dirumuskan masalah penelitian ini sebagai berikut : 1. Apakah pemberian terapi ozon menurunkan kadar total radikal bebas perokok berat? 2. Apakah pemberian terapi ozon menurunkan kerusakan oksidatif akibat radikal bebas pada perokok berat? 1.3. Tujuan Penelitian 1.3.1. Tujuan Umum Untuk mengetahui bahwa terapi ozon merupakan salah satu terapi untuk mengaktifkan antioksidan endogen yang dapat membantu menurunkan kadar radikal bebas dalam darah. 1.3.2 Tujuan Khusus Berdasarkan rumusan masalah di atas maka tujuan khusus penelitian adalah untuk mengetahui : 1. Pengaruh pemberian terapi ozon terhadap penurunan kadar radikal bebas pada perokok berat. 2. Pengaruh pemberian terapi ozon terhadap penurunan kerusakan oksidatif pada perokok berat yang ditandai dengan penurunan MDA.
1.4. Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat serta kontribusi bagi berbagai pihak sebagai berikut: 1.
Dalam Bidang Ilmiah Dapat menambah wawasan ilmiah tentang terapi ozon di bidang kedokteran.
2.
Dalam Bidang Kedokteran Ozon medis dapat digunakan sebagai salah satu terapi untuk mengaktifkan anti oksidan endogen.
3.
Dalam Bidang Sosial Menambah pengetahuan masyarakat tentang manfaat terapi ozon sehingga dapat digunakan sebagai salah satu alternatif pilihan terapi.
4.
Bagi Penelitian Selanjutnya Memberikan kontribusi bagi penelitian selanjutnya.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Rokok 2.1.1. Definisi merokok Merokok adalah kegiatan menghirup asap dari pembakaran tembakau pada rokok. Yang disebut perokok sesaat adalah seseorang yang merokok pada saat-saat tertentu, biasanya dilakukan pada saat sedang bersosialisasi dengan lingkungannya ataupun untuk mengurangi stres. Perokok berat adalah bila sudah terjadi ketergantungan secara fisik pada rokok (WHO, 2002).
2.1.1. Efek buruk rokok Kebiasaan merokok merupakan kebiasaan yang sangat merugikan, karena secara sengaja memasukkan berbagai racun kimiawi yang bersifat radikal bebas ke dalam tubuh. Tubuh manusia di desain untuk menerima asupan yang bersifat alamiah, sehingga bila menerima masukan seperti asap rokok, secara otomatis tubuh akan berusaha untuk mengeluarkan berbagai racun kimiawi ini dari tubuh melalui proses metabolisme, tetapi proses metabolisme ini pun sebenarnya menghasilkan racun bagi tubuh. Kadar radikal bebas yang tinggi dalam darah perokok aktif dapat memicu timbulnya berbagai penyakit yang berbahaya bagi tubuh. Dalam sebatang rokok terkandung zat-zat beracun diantaranya adalah arsenik, karbon monoksida, amonia,
formalin, kadmium, aseton, methane, urea dan masih banyak kandungan beracun lainnya (WHO, 2002). Dalam 1 kali hisapan rokok, akan terhisap banyak radikal bebas sehingga hal ini berhubungan dengan timbulnya berbagai penyakit pada seorang perokok, seperti emphysema dan kanker paru-paru (Siswono, 2005). Dalam asap rokok terkandung 2 jenis radikal bebas yang berbeda. Radikal bebas yang bertahan lama dalam darah yaitu tar dan yang hanya bertahan sebentar yaitu fase gas. Walaupun demikian fase gas mengandung radikal bebas dalam jumlah tinggi seperti nitrit oksida yang akan mengoksidasi bentuk nitrogen dioksida bereaksi dengan superoksid menjadi peroksinitrit yang merupakan oksidan kuat (Eiserich, 1995).
2.1.3. Rokok sebagai sumber radikal bebas Asap rokok mengandung berbagai macam radikal bebas, yang beberapa di antaranya telah dibuktikan bersifat mutagen dan karsinogen (WHO, 2002).
2.1.3.1. Kandungan zat beracun dalam rokok Dalam sebatang rokok terkandung zat-zat beracun seperti : (1) Nikotin adalah zat yang paling sering dibicarakan dan diteliti orang, karena nikotin dapat meracuni saraf tubuh, meningkatkan tekanan darah, menimbulkan penyempitan pembuluh darah tepi dan menyebabkan ketagihan dan ketergantungan pada pemakainya. Kadar nikotin 4-6 mg yang dihisap oleh orang dewasa setiap hari sudah bisa membuat seseorang ketagihan untuk merokok.
(2) Timah hitam (Pb) yang dihasilkan sebatang rokok sebanyak 0,5 µg. Sebungkus rokok (isi 20 batang) yang habis dihisap dalam satu hari menghasilkan 10 µg Pb Sementara ambang batas timah hitam yang masuk ke dalam tubuh adalah 20 µg per hari (WHO, 2002). Bisa dibayangkan bila seorang perokok berat menghisap rata-rata 2 bungkus rokok per hari, berapa banyak zat berbahaya ini masuk ke dalam tubuh. (3) Gas karbonmonoksida (CO) memiliki kecenderungan yang kuat untuk berikatan dengan hemoglobin dalam sel-sel darah merah. Seharusnya hemoglobin ini berikatan dengan oksigen yang sangat penting untuk pernapasan sel-sel tubuh, tapi karena afinitas gas CO terhadap hemoglobin lebih kuat dari pada O2 sehingga akan terbentuk hemoglobin CO lebih banyak. (4) Tar adalah kumpulan dari beribu-ribu bahan kimia dalam komponen padat asap rokok dan bersifat karsinogen. Pada saat rokok dihisap, tar masuk ke dalam rongga mulut sebagai uap. Setelah dingin akan menjadi padat dan membentuk endapan berwarna coklat pada permukaan gigi, saluran pernafasan dan paru-paru. Pengedapan ini bervariasi antara 3-40 mg per batang rokok, sementara kadar tar dalam rokok berkisar 24-45 mg. Paru-paru sebagai organ pernapasan pada manusia berfungsi sebagai pertukaran gas antara jaringan tubuh dan lingkungan luar, sehingga paru-paru terus menerus terpapar dengan radikal bebas tanpa bisa dihindari. Paru-paru selalu terpapar oleh asap rokok, pembuangan asap kendaraan bermotor, asap pabrik, herbisida dan partikel debu, yang akan menghasilkan Reactive Oksigen Species (ROS) dalam paru-
paru. Untuk mencegah atau mengurangi penyakit kronis karena radikal bebas maka diperlukan antioksidan (Dina Sofia, 2005). Antioksidan adalah substansi yang diperlukan tubuh untuk menetralisir radikal bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas terhadap sel normal, protein, dan lemak. Antioksidan menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas, dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas yang dapat menimbulkan stres oksidatif (Murray, 2009). 2.2.
Radikal Bebas
2.2.1. Definisi radikal bebas Adalah suatu molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan. Elektron yang tidak berpasangan berputar sendiri di orbitnya, dan dapat bertahan dalam waktu yang sangat singkat (waktu paruh 10 -14 sampai 10-13 detik). Elektron yang tidak berpasangan ini, akan berusaha untuk menarik elektron dari molekul lainnya untuk mendapatkan kembali konfigurasi pasangan elektron, oleh karena itu radikal bebas sangat reaktif. Sebuah radikal bebas yang berhasil mengambil elektron dari sesuatu molekul lain yang stabil, akan menyebabkan molekul tersebut kehilangan satu elektron dan berubah menjadi radikal bebas baru. Proses berantai ini dapat menyebabkan perubahan struktur pada molekul lainnya (Ginger, 2008).
2.2.2.
Sumber radikal bebas Radikal bebas khususnya senyawa oksigen yang reaktif (reactive oxygen
species) yang dapat merusak sel berasal dari proses metabolisme normal dalam tubuh dan dari luar tubuh. Pembentukan radikal bebas dalam tubuh terjadi terus menerus dalam sel sebagai reaksi enzimatik maupun reaksi non enzimatik. Sumber radikal bebas (Bagchi and Puri, 1998): 1. Sumber radikal bebas dari dalam tubuh yang merupakan hasil dari reaksi enzimatik adalah pada proses pernapasan, proses phagositosis, proses pembentukan prostaglandin, dan proses pembentukan sitokrom P450. 2. Yang merupakan hasil dari reaksi non enzimatik merupakan reaksi oksigen dengan senyawa organik dengan cara ionisasi dan radiasi contohnya adalah proses pada proses inflamasi dan iskemia. 3. Sumber radikal bebas dari luar tubuh yaitu asap rokok, polusi dari lingkungan, radiasi, obat-obatan, sinar UV dan limbah industri.
2.2.3. Tahapan Pembentukan Radikal Bebas Reaksi radikal bebas dapat dibagi menjadi tiga tahap (Setiati, 2003), yaitu : 1. Tahap Inisiasi, yaitu tahap yang menyebabkan terbentuknya radikal bebas. RH + O2
R˙ + HO2˙
2. Tahap Propagasi, yaitu tahap dimana radikal bebas cenderung bertambah banyak dengan membuat reaksi rantai dengan molekul lain. R˙ + O2
RO2˙
3. Tahap Terminasi, yaitu apabila terjadi reaksi antara radikal bebas dengan radikal bebas lain atau antara radikal bebas dengan suatu senyawa pembasmi radikal (scavenger). R˙ + R˙
R:R
Reaksi rantai ini dapat diakhiri dengan adanya reaksi antara satu radikal dengan radikal lainnya atau dengan adanya antioksidan. Apabila tidak terjadi proses terminasi maka akan terjadi proses berantai yang sangat merusak.
2.2.4. Sifat Radikal Bebas Radikal bebas memiliki dua sifat, yaitu: 1. Reaktivitas tinggi, karena kecenderungannya menarik elektron. 2. Dapat mengubah suatu molekul menjadi suatu radikal bebas baru sehingga terbentuk reaksi rantai yang memporak-porandakan membran lemak. Sifat radikal bebas yang mirip dengan oksidan terletak pada kecenderungannya untuk menarik elektron. Jadi sama halnya dengan oksidan, radikal bebas adalah penerima elektron. Itulah sebabnya dalam kepustakaan kedokteran, radikal bebas digolongkan dalam oksidan. Namun perlu diingat bahwa radikal bebas adalah oksidan, tetapi tidak setiap oksidan adalah radikal bebas. Radikal bebas lebih berbahaya dibanding dengan oksidan yang bukan radikal. Hal ini disebabkan oleh kedua sifat radikal bebas di atas, yaitu reaktivitas yang tinggi dan kecenderungan membentuk radikal baru (Widjaja, 2009), yang pada gilirannya nanti apabila menjumpai molekul lain akan membentuk radikal baru lagi, sehingga terjadilah reaksi
rantai (chain reaction). Di antara senyawa-senyawa oksigen reaktif, radikal hidroksil merupakan senyawa yang paling berbahaya karena reaktivitasnya sangat tinggi (Katleen, 2006). 2.2.4.1. Peroksidasi Lipid Komponen terpenting membran sel adalah fosfolipid, glikolipid dan kolesterol. Dua komponen pertama mengandung asam lemak tak jenuh yaitu linoleat, linolenat, dan arakidonat yang sangat rentan terhadap serangan radikal bebas, terutama radikal hidroksil (˙OH). Radikal hidroksil (˙OH) dapat menimbulkan reaksi rantai yang disebut peroksidasi lemak, dengan adanya reaksi rantai ini maka akan terbentuk radikal bebas lain, sehingga akan menyebabkan peroksidasi lebih lanjut (Suryohusodo, 2000). Reaksi rantai peroksidasi lemak( lipid peroxidation) tersebut adalah : a. Inisiasi : LH
+
˙OH
→
Asam lemak
L˙ +
H2O
radikal lemak
Peroksidasi lemak membran sel di inisiasi oleh radikal bebas, seperti radikal hidroksil (˙OH) yang menarik hidrogen dari polyunsaturated lipid (LH), sehingga menghasilkan radikal lipid (L˙). b. Propagasi : L˙
+
O2
→
LOO˙
Radikal peroksilipid
LOO˙ + LH
→ L˙ + LOOH
dan seterusnya. Reaksi rantai radikal bebas dipropagasi dengan penambahan O2, sehingga terbentuk radikal peroksi lipid (LOO˙), radikal lipid (L˙) lain dan peroksida lipid (LOOH), dengan demikian reaksi rantai peroksidasi lemak akan terus berlanjut. c. Degradasi : Hasil degradasi lemak membran sel tersebut antara lain MDA, bersifat larut dalam air, dan terdapat dalam darah dan urin. MDA hanya dibentuk dari asam lemak dengan 3 atau lebih ikatan rangkap dan pengukuran kadarnya dalam serum. dapat digunakan sebagai indikator dari lipid peroxidation. d. Terminasi : LOO˙ + L˙ → LOOH + LH Reaksi rantai ini dapat diakhiri dengan adanya reaksi antara satu radikal dengan radikal lainnya atau dengan adanya antioksidan. Apabila tidak terjadi proses terminasi, maka akan terjadi proses degradasi seperti tersebut di atas, dan akibat akhir dari reaksi rantai yang tidak mencapai tahap terminasi adalah terputusnya rantai asam lemak menjadi berbagai senyawa yang bersifat toksik terhadap sel, antara lain berbagai macam aldehida, seperti malondialdehide (MDA), 9 hidroksi-nonenal (Devlin, 1982).
2.2.5. Kerusakan oksidatif oleh oksidan rokok pada molekul biologik Asap rokok mengandung radikal bebas oksigen dan karbon yang cukup reaktif yang mempunyai waktu paruh dalam hitungan menit (WHO,2008). Pryor dan Stone melaporkan bahwa komponen gas dari asap rokok mengandung banyak radikal bebas pada setiap kali hisapan. Nitrogen monoksida ( NO) terdapat pada asap rokok dalam jumlah 500-1000 ppm, dan mungkin merupakan salah satu sumber ˙NO eksogen yang terbesar. Nitrogen monoksida bereaksi sangat cepat dengan radikal superoksida (O2.) untuk membentuk peroksi nitrit (ONOO) dan dengan radikal peroksil (dari asap rokok), membentuk alkilperoksinitrit (ROONO). Nitrogen reaktif ˙NO, ONOO dan ROONO, merupakan mediator penting untuk terjadinya kerusakan dalam sistem biologik. Senyawa-senyawa ini terdapat atau dibentuk di asap rokok, dan memberikan kontribusi pada modifikasi biologik karena asap rokok. Jumlah radikal bebas ini dan radikal lainnya yang terdapat dalam jumlah besar pada asap rokok, dapat menurunkan kadar antioksidan dan menyebabkan peroksidasi dari asam lemak tidak jenuh . Menurut Stratton dkk, asap rokok menghasilkan singlet oksigen (1O2) melalui reaksi dari NO dengan H2O2 yang terdapat pada asap rokok. Peroksinitrit yang merupakan komponen dari asap rokok, yang dibentuk melalui reaksi antara ˙NO dengan O2 ˙, juga bereaksi dengan H2O2 dan menghasilkan 1O2. Aktivasi makrofag alveoli paru (pulmonary alveolar macrophage/PAM) oleh asap rokok dapat menghasilkan hipoklorid dan H2O2, kemudian H2O2 bereaksi dengan NO2
menghasilkan 1O2. Perokok dapat terus terpapar oleh 1O2 karena asap rokok, yang dapat menimbulkan kerusakan biomolekuler (Eiserich, 1995).
2.2.6. Pengukuran radikal bebas Ada beberapa metode pengukuran radikal bebas, dimana salah satunya menggunakan alat FORM (Free Oxygen Radicals Monitor). Pengukuran kadar radikal bebas pada alat FORM, menggunakan kit FORT (Free Oxygen Radicals Testing) dimana cara kerjanya adalah dengan pemeriksaan skala warna yang berdasar pada transisi metal seperti kemampuan besi dalam mengkatalisis dengan adanya ROOH sebagai radikal bebas yang kemudian diikat oleh derivat amin (Hehrer, 2000). CrNH2 Ikatan amin ini bereaksi dengan radikal bebas membentuk warna, membentuk radikal kation yang kuat terdeteksi pada 5,05 nm sebagai hasil dengan reaksi linear kinetic. Intensitas warna berhubungan dengan jumlah dari ikatan radikal bebas dan konsentrasi dari hidroperokside dan itu menunjukkan contoh status oksidatif (verde, 2002) : 1. R-OOH + Fe2+ → RO˙ + OH- +Fe3+ 2. R-OOH + Fe2+ → ROO˙ + H+ +Fe2+ 3. RO˙ + ROO˙ + 2 CrNH2 → ROO- + RO- + [CrNH2˙] Pembacaan FORT berdasar pada reaksi linear kinetik dan ini ditunjukan dalam 3 menit pertama dan 3 menit berikutnya. Hasil didapatkan dari 2 proses pembacaan
yang berbeda. Nilai proses penyerapan kemudian dikonversi secara otomatis kedalam nilai konvensional yang disebut FORT unit atau dalam konsentrasi yang sama dengan H2O2 yang berdasar pada instrumen mikroprosesor. FORT unit sebanding dengan 7,6 µmol/l (0,26 mg/l) H2O2. 310 FORT unit sesuai dengan 2,35 mmol/l H2O2. Semakin tinggi hasil yang didapat menunjukan semakin tinggi tingkat hidroperoksida dan akan didapatkan kerusakan yang tinggi karena proses oksidasi oleh radikal bebas (FORT Assay, 2008). Untuk melakukan perbandingan contoh darah, tes harus dilakukan pada kondisi yang sama. Untuk mendapatkan hasil yang optimal, disarankan pada saat akan melakukan tes menghindari makan besar, selama masa pengobatan suatu penyakit, setelah olahraga berat, dan lain-lain yang dapat memicu kenaikan radikal bebas dalam tubuh (Bagchi and Puri, 1998). Pada penelitian ini dilakukan perbandingan hasil pada sampel darah yaitu dengan menggunakan pemeriksaan MDA ( Malondialdehid ) yang merupakan hasil kerusakan dari peroksidasi lemak pada membran sel dimana bila didapatkan penurunan kadar radikal bebas maka akan didapatkan penurunan perusakan akibat radikal bebas dalam darah dan terjadi penurunan MDA (Halliwel, 1999).
2.3. Antioksidan
2.3.1. Definisi antioksidan Antioksidan dapat didefinisikan sebagai suatu zat yang dapat memperlambat atau mencegah proses oksidasi. Oksidasi adalah suatu reaksi kimia dimana terjadi pengurangan elektron dari atom atau grup atom. Dalam pengertian kimia, antioksidan adalah senyawa-senyawa pemberi elektron, tetapi dalam arti biologis pengertian antioksidan lebih luas lagi, yaitu semua senyawa yang dapat meredam dampak negatif oksidan, termasuk enzim-enzim dan protein-protein pengikat logam (Katleen, 2006). 2.3.2.
Jenis Antioksidan
Berdasarkan mekanisme pencegahan dampak negatif oksidan, antioksidan dapat dibagi menjadi 2 golongan (Murray, 2009), yaitu : 2.3.2.1. Antioksidan pencegah Adalah antioksidan yang berfungsi mencegah terbentuknya radikal hidroksil, yaitu radikal yang paling berbahaya bagi tubuh. Yang termasuk kedalam antioksidan pencegah adalah : 1. Super Oxide Dismutase (SOD) yang ada di dalam tubuh manusia, yaitu yang berada di mitokondria (Mn SOD) dan di sitoplasma (Cu Zn SOD) 2. Katalase (Catalase) dalam sitoplasma, dapat mengkatalisir H2O2 menjadi H2O dan O2. Komponen katalase adalah Fe. 3. Bermacam-macam enzim peroksidase, seperti glutation peroksidase yang dapat meredam H2O2 menjadi H2O melalui system siklus redoks glutation.
4. Senyawa yang mengandung gugusan sulfhidril (glutation, sistein, kaptopril)
dapat
mencegah
timbunan
radikal
hidroksil
dengan
mengkatalisir menjadi H2O. 2.3.2.2. Antioksidan pemutus rantai ( Chain Breaking ) Antioksidan pemutus rantai adalah zat yang dapat memutuskan rantai reaksi pembentukan radikal bebas asam lemak pada membran sel untuk mencegah peroksidasi lemak (Sulistyowati, 2000). Antioksidan pemecah rantai dapat digolongkan menjadi : 1. Golongan antioksidan eksogen Contohnya adalah vitamin C, vitamin E dan betakaroten. 2. Golongan antioksidan endogen Contohnya adalah glutation dan sistein.
2.4. Ozon Ozon (O3) adalah komponen udara segar yang terjadi secara alami, terbentuk sebagai hasil reaksi antara sinar ultraviolet dari matahari dengan lapisan atas atmosfir bumi, dan membentuk lapisan pelindung yang menyelimuti bumi. Ozon sendiri adalah jenis gas yang sangat reaktif dan tidak stabil, dengan masa hidup yang sangat pendek (20-30 menit) sebelum kembali menjadi Oksigen (Bocci, 2005). Ozon yang digunakan dalam bidang kedokteran (O3), sangat berbeda dengan lapisan ozon pada atmosfir, maupun ozon untuk industri, dimana pada ozon industri, gas yang dihasilkan sangat beracun karena mengandung nitrogen oksida, nitrit, asam
nitrat, sulfur dioksida. Gas ozon ditemukan pertama kali oleh seorang ilmuwan jerman, pada tahun 1840, Christian Friedrich Schonbein. Dalam ilmu kedokteran, ozon (O3) telah banyak dipergunakan dalam pengobatan penyakit. Ozon mempunyai kemampuan membunuh bakteri, virus dan jamur, memperbaiki sirkulasi jaringan, mempercepat epitelisasi jaringan dan merangsang regenerasi sel (Novgorod, 2006). Untuk pengobatan, ozon medis diperoleh dari suatu proses oksigen murni yang dialirkan melalui tabung generator ozon (Corona Electrical Discharge). Oksigen yang melalui tabung ozon mendapatkan aliran listrik bertegangan tinggi. Dalam proses ini akan terbangkit gas ozon yang tercampur dengan gas oksigen medis dengan suatu konsentrasi yang sangat tergantung pada pengaturan regulator gas dan besarnya tegangan listrik yang diberikan. Sisa gas ozon yang tidak terpakai harus dinetralisir kembali menjadi oksigen dengan proses reaksi kimia di dalam tabung catalizer (Ozonosan, 1996) . 2.4.1. Reaksi ozon dalam tubuh : Seperti gas yang lain, ozon larut dalam cairan mengikuti hukum Henry’s, dipengaruhi oleh temperatur, tekanan dan konsentrasi ozon. Ozon cepat larut dalam cairan tubuh, dan bereaksi dengan cepat dengan antioksidan, protein, karbohidrat, dalam tubuh dan asam lemak tak jenuh ( PUFA) pada membran sel. Mekanisme dasar penyerapan ozon dalam tubuh : 1. Reaksi terpenting adalah bahwa ozon digunakan dalam proses oksidasi dari vitamin C, asam urat, gugus sulfhidril (SH) dari protein dan
glikoprotein. Proses ini sekaligus meredam efek radikal dari ozon, dan ini merupakan efek terpenting karena reaksi ini menimbulkan Reactive oxygen Spesies (ROS) yang akan mengaktifkan beberapa proses biokimia penting dalam tubuh (Bocci, 1998). ROS akan dinetralisir dalam 0,5-1 menit oleh sistem antioksidan tubuh (Katleen, 2006). 2. Reaksi peroksidasi lemak (lipid peroxidation) Dalam plasma hidropilik, satu molekul olefin (bagian dari asam arakhidonat yang terdapat pada trigliserida dan kilomikron) dengan 1 molekul ozon membentuk dua molekul aldehida dan satu molekul H2O2 (Bocci and Puri, 1998). Kedua reaksi ini terbentuk dalam hitungan detik menggunakan seluruh ozon yang ada dan menghasilkan H2O2 sebagai oksidan namun bukan dalam bentuk radikal dan beberapa bentuk aldehida yaitu Lipid Oxidation Products (LOPs). Ozon yang bereaksi dengan Poly Unsaturated Fatty Acids (PUFA) akan langsung bereaksi dengan antioksidan seperti asam askorbat, asam urat, gabungan thiol dengan SH group seperti systein, reduced glutation (GSH) dan albumin, semua zat ini berlaku sebagai donor elektron dan mengalami oksidasi. O3 + Biomolecules → O2 +OReaksi utama ozon dalam tubuh (Bocci, 2005) adalah: R - CH = CH - R˙ + O3 + H2O → R – CH = O + R˙ – CH = O + H2O2 Reaksi ini menunjukkan pada waktu yang bersamaan terbentuk satu molekul Hidrogen peroksida yang merupakan oksidan kuat dan dua molekul Lipid
Oxidation Products (LOPS). H2O2 merupakan sumber dari pada ROS bukan radikal dan berperan sebagai ozon messenger, bertanggung jawab merangsang terjadinya beberapa efek biologis dan terapi. Konsep bahwa ROS selalu berbahaya tidaklah selalu benar, karena ROS memiliki sejumlah efek fisiologis yang berperan dalam transduksi signal dan berperanan penting sebagai mediator dalam pertahanan tubuh dan respon kekebalan tubuh. Didapatkan juga pembentukan Nitrogen Monoxide (NO-) pada endotel sel manusia yang terekspos oleh serum yang telah di ozon. Namun kita juga harus berhati-hati, karena ROS yang berlebihan akan memicu terbentuknya zat beracun Peroxy Nitrite (O = NOO-) dan Anion Hipochloride (ClO-). Peroksidasi dari PUFA menghasilkan LOPS (Lester and Enrique, 2002) pada plasma yang terdapat banyak macam yang digolongkan sebagai Lipo Peroxides (LOO-), Alcoxyl Radicals (LO-), Lipohydro Peroxides (LOOH), Iso Prostanes dan Alkenals, diantaranya adalah 4 – Hydroxy – 2,3 Transnonenal (HNE) dan malondialdehide (MDA). Kesimpulan dari proses ini diterangkan dalam bagan 2.1.
PUFA
Oksidasi O3
LOPS
Lipoperoxides (LOO) Alkoxil Radikal (LO) Lipohidroperoxides (LOOH) Isoprostanes &Alkenal
Malonil Dialdahide (MDA)
4 hydroxi 2,3 transnonenal (4HNE)
Bagan 2.1. Bagan proses oksidasi oleh O3 pada membrane sel yang mengandung PUFA
Bentuk radikal dari Aldehida adalah toksik dan hanya boleh terbentuk dalam konsentrasi kecil. Pada saat terapi, ketika darah kembali masuk ke tubuh, LOPS mengalami dilusi pada cairan tubuh kemudian diekskresi melalui urine dan empedu, dan
dimetabolisme
oleh
Glutathion
transferase
(GSPX)
dan
Aldehyde
Dehydrogenase dengan begitu hanya dalam dosis submicro molar yang dapat mencapai semua organ, khususnya pada sum-sum tulang, hati, susunan syaraf pusat (CNS), kelenjar endokrin, berperan sebagai molekul signal selama terjadinya stres oksidatif akut yang ringan, yang mampu membangkitkan efek biologis tanpa menimbulkan efek toksik (Viebahn, 2007).
Gambar 2.2. Skema proses peroksidasi lemak pada membran sel (lipid peroxidation)
Keterangan gambar: Setelah pemaparan ozon pada darah, akan terjadi peroksidasi lemak pada membran sel dan akan terjadi reaksi yang melibatkan sistem antioksidan endogen melalui jalur Glutation, dimana Glutation Reduktase oleh adanya gugus aldehid hasil dari peroksidasi lemak pada membrane sel berubah menjadi glutation teroksidasi, 15 menit setelah terapi dimana hal ini akan merubah NADPH menjadi NADP melalui jalur Glucose 6 Phosphat sehingga menyebabkan perubahan kembali NADP menjadi NADPH yang akan mengaktifkan 2,3 DPG yang akan mempengaruhi sel darah merah untuk melepaskan oksigen ke jaringan tubuh. Hal ini juga akan meningkatkan pembentukan ATP (Viebahn and Haensler, 2002). Proses ozon
yang dilakukan pada darah, pada otot maupun intra diskal
menimbulkan stress oksidatif akut. Dengan dosis ozon yang tepat, tidak akan menimbulkan efek yang merugikan, tetapi mampu membangkitkan beberapa respon biologis yang menguntungkan bagi tubuh, salah satunya adalah dengan mengaktifkan anti oksidan enzimatik yang terlibat dalam reaksi peroksidasi yang secara bersamaan mempunyai fungsi melindungi terhadap proses degenerasi yang terjadi pada saat kadar radikal bebas dalam tubuh meningkat. SOD bertanggung jawab dalam memecah kelebihan dari radikal superoksida, CAT berfungsi memecah hydrogen peroksida dan GSH-Px berfungsi memecah peroksida organik seperti peroksida yang dihasilkan oleh ozon, seperti H2O2 (Bocci, 1999). Rangkaian proses ini dapat mengurangi stres oksidatif kronik yang hubungan dengan proses penuaan, infeksi kronis, diabetes, atherosclerosis, proses degeneratif dan kanker (Novgorod, 2006).
2.4.2. Mekanisme kerja terapi ozon dalam bidang bidang Kedokteran Anti Penuaan
Dengan terjadinya proses penuaan, maka kemampuan tubuh dalam memperbaiki kerusakan-kerusakan yang terjadi karena pengaruh buruk lingkungan maupun proses dalam tubuh sendiri akan menurun. Oleh karena itulah diperlukan adanya tindakan ataupun pengobatan pencegahan untuk merangsang kemampuan tubuh untuk melakukan perbaikan dari kerusakan yang timbul. Terapi ozon
merupakan salah satu terapi tambahan (komplementer) yang dapat membantu tubuh dalam memperlambat proses penuaan (Viebahn, 2007) dengan cara : 1. Ozon menstimulasi peningkatan pengambilan dan pemakaian dari oksigen dengan menstimulasi peningkatan pembentukan dari antioksidan enzimatik (antioksidan endogen) dimana antioksidan enzimatik ini bertanggung jawab untuk melepasan oksigen pada tingkat sel. Penurunan dari fungsi enzim ini akan menjadi penyebab utama dari semua penyakit kronis, dan berkurangnya enzim ini dikarenakan proses penuaan. Terapi ozon adalah salah satu terapi yang sangat potensial dalam menginduksi pembentukan antioksidan enzimatik.
Bagan 2.3. Proses induksi antioksidan endogen oleh ozon
2. Ozon meningkatkan sirkulasi, dengan cara meningkatkan apa yang disebut sebagai sifat reologi darah yaitu karakteristik dari darah, dalam bentuk kelenturan dari eritrosit. Dengan meningkatnya reologi darah ini, maka transportasi oksigen ke jaringan juga meningkat. 3. Ozon meningkatkan enzim 2,3 DPG (2,3 Difosfogliserad) yang akan meningkatkan pelepasan oksigen oleh sel darah merah. Sehingga memperbaiki oksigenasi jaringan. Glucose PPW k+
Glucose-6-Phosphate
Na+ ADP ATP
1.3 DPG
NADPH
GSH
R-O-O-R
NADPH
GSSG
ROH
2,3DPG lactate
HbO2
Hb + O2
Bagan 2.4. Metabolisme dalam sel darah merah yang dipengaruhi oleh peroxide.
4. Dengan bertambahnya usia, maka sistem imunitas pun mengalami penurunan, dimana penurunan imunitas merupakan salah satu penyebab internal dari proses penuaan (Goldman and Klatz, 2007). Ozon penginduksi imun sistem yang potensial dengan mengaktifkan sitokin yang sudah menurun yaitu IFN α, IFN β, IFN γ, interleukin 1b, 2,4,6,8 dan 10, tumor nekrosis factor (TNF-α),
granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GMCSF) dan growth factor TGF-β1.
2.4.3. Proses pembentukan ozon medis Karena sifat radikal bebas yang tidak stabil dari gas ozon, maka gas ozon yang akan digunakan untuk terapi dibentuk pada saat akan digunakan. Ozon therapist harus mempunyai generator ozon yang aman, tidak toksis, dan bisa mendegradasi sisa ozon yang tidak terpakai. Ozon yang tidak terpakai tidak bisa terurai dalam lingkungan dan harus di uraikan menjadi oksigen oleh reaksi katalisis di dalam ruang penghancur yang sangat dibutuhkan yang mengandung oksida besi pada suhu 70C oleh termostat listrik (Vallachi, 2000). Generator ozon medis terdiri dari 2-4 tabung bervoltase tinggi yang tersambung dalam program elektronik berseri yasng mampu membentuk perbedaan voltase di antara 4000 dan 13000 volt. Dalam system ini ozon terbentuk ketika oksigen melewati celah antara tegangan tinggi dan elektroda. Energi dari pelepasan elektrik mengakibatkan pecahnya molekul oksigen menjadi atom oksigen di mana dari kelebihan molekul oksigen ini membentuk 3 atom molekul ozon. Pada generator di lewati oksigen medis murni dan pada selang supply terbentuk pencampuran gas yang tidak lebih dari 5% ozon dan 95% oksigen, hal ini dapat terjadi dengan adanya tekanan positif. Ozon untuk tujuan medis tidak bisa menggunakan udara bebas sebagai sumber oksigen karena mengandung 78% nitrogen ,dan hasil akhir
pencampuran gas akan mengandung nitrogen oksida yang sangat beracun selain oksigen dan ozon (Bocci., 2006).
2.4.4. Konsentrasi ozon Konsentrasi ozon ditentukan oleh 3 parameter (Ozonosan, 1996), yaitu: 1. Voltase Hasil akhir konsentrasi ozon semakin besar bila voltase semakin besar. 2. Jarak antara 2 elektroda Akan menentukan peningkatan konsentrasi ozon secara bertahap. 3. Aliran oksigen Ditunjukan dari volume aliran oksigen dalam liter/menit , biasanya dapat diatur dari 1 sampai 10 l/mnt. Hasil akhir ozon yang terbentuk berbanding terbalik secara proporsional dengan aliran oksigen, oleh karena itu unit per satuan waktu semakin tinggi aliran oksigen semakin rendah konsentrasi ozon, begitu pula sebaliknya.
2.4.5. Penghitungan dosis ozon 1.
Total volume dari pencampuran gas terdiri dari oksigen dan ozon
2.
Konsentrasi ozon ditunjukan dalam satuan microgram / milliliter
3.
Barometer tekanan (mmHg) apabila berbeda dari keadaan normal, untuk alasan
keamanan kita harus menghindari tekanan hiperbarik.
Total dosis ozon sama dengan volume gas (ml) dikalikan dengan konsentrasi ozon (mcg/ml). Sebagai contoh, apabila kita menggunakan volume gas sebanyak 100ml dan konsentrasi ozon sebesar 40 mcg/ml total dosis ozon adalah 100 x 40 = 4000 mcg atau 4.0 mg (Bocci, 2005). Generator ozon harus di cek secara konsentrasi berkala termasuk mengontrol titrasi iodometrik dari photometer untuk memastikan ketepatan konsentrasi ozon. Ozon harus diproduksi menggunakan ozon medis dengan generator tidak beracun yang dapat diandalkan yang dapat mengukur konsentrasi ozon yang tepat (1-100 mcg/ml) melalui photometer yang sering kali dikontrol oleh titrasi iodometrik (Ozonosan, 1996) .
2.4.6. Aplikasi ozon dalam bidang kedokteran Ozon merupakan oksidan sangat kuat, namun bila kita dapat mengetahui dengan tepat penggunaannya dalam dosis terapi, maka kita dapat menghindari efek buruk dari ozon dan mendapatkan efek terapi yang sangat bermanfaat (Bocci dkk, 2005). Dalam bidang kedokteran terdapat beberapa cara aplikasi ozon, dimana cara pemilihan ini tergantung dari kebutuhan terapi yang disesuaikan dengan kondisi penyakit pasien. Aplikasi terapi ozon dalam bidang medis antara lain ( Altman, 2001): 1. Mayor Auto Haemotherapy (Extra Corporeal Blood Therapy)
MAH adalah cara aplikasi ozone sistemik dengan cara mengalirkan darah dari tubuh pasien sebanyak 50-100cc kedalam blood bag, kemudian dicampurkan dengan ozon sesuai dosis, dan dialirkan kembali ke tubuh pasien dengan kecepatan tetesan 60-90 tetes/menit 2. Intra muscular Autohaemotherapy Terapi ozon dengan cara mengambil 2-5ml darah pasien dengan spuit disposable, kemudian dicampur dengan 20 µg/ml ozon, kemudian disuntikan ke pasien dengan cara IM. 3. Direct intramuscular 10 cc gas ozon diinjeksikan langsung intramuscular. 4. Insuflasi ozon Rectal Terapi ini dilakukan dengan cara memasukkan campuran ozon oksigen yang telah disediakan di dalam ozone spuit, kemudian dimasukkan melalui anus dengan menggunakan kateter sekali pakai (disposable chateter). 5. Topical Bagging adalah suatu metode ozonisasi untuk menyembuhkan luka-luka pada kaki akibat diabetes. Pada ulkus diabetes (gangren), terlebih dahulu dilakukan debridement, kemudian luka dibungkus dengan plastik khusus, dan dialiri gas ozon ( Bocci, 2005).
2.4.7.
Indikasi terapi ozon Ozon sangat efektif dalam mengaktifkan sistem imunitas tubuh dengan
mengaktifkan antioksidan endogen, ozon juga sangat efektif digunakan untuk membunuh virus, bakteri, dan jamur, abses, alergi, gangguan sirkulasi arteri, gangren, ulkus kruris, sirosis hepatis, polyneuritis, poliartritis, tromboplebitis, gangguan penyembuhan luka , penyakit Parkinson, hepatitis, ginggivitis, paradontosis (Bocci, 2005).
2.4.8. Kontra indikasi terapi ozon Terapi ozon sebaiknya tidak dilakukan pada keadaan, intoksikasi alkohol akut, infark jantung baru, hipertiroid, alergi ozon. renjatan, edem
paru, hipokalsemia
(Bocci, 2005). Penggunaan campuran O3 melebihi 3000ug/ kali dapat menyebabkan hemolisis butir darah merah. Emboli udara, hal yang diduga akan dapat terjadi pada penggunaan ozon secara intraarteri/ intravena, tidak perlu terjadi apabila oksigen yang digunakan benar-benar murni (100%). Sebab yang membuat emboli udara terjadi ialah adanya gas tidak larut yaitu komponen nitrogen (Viebahn, 2007). Tindakan pengamanan segera perlu dilakukan bila pada saat terapi ozon dilakukan, terdapat gejala awal shock pada pasien yang ditandai dengan adanya sesak nafas, dada terasa tertekan, akral teraba dingin, denyut jantung cepat, hipotensi, penurunan kesadaran. Bila ditemukan salah satu atau beberapa tanda ini maka tindakan yang harus kita lakukan segera adalah menghentikan terapi ozon yang
sedang dilakukan dan segera lakukan penanganan berikut (Viebahn and Renate, 2007) : 1.
Segera baringkan pasien dengan posisi kepala lebih rendah dari bagian tubuh yang lain.
2.
Bebaskan jalan nafas.
3.
Lakukan resusitasi jantung paru.
4.
Infus NaCl.
5.
Berikan pilihan terapi, lidocain 2%, adrenalin, atropine, sodium bicarbonate, cortisone, alupent, medigoxin, lasix, theophiline, aminophiline, dimana pilihan terapinya disesuai dengan kondisi pasien.
BAB III
KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS 3.1 Kerangka Konsep Bahaya merokok terhadap kesehatan tubuh telah diteliti dan dibuktikan banyak peneliti. Kebiasaan merokok meningkatkan resiko timbulnya berbagai penyakit seperti penyakit jantung dan gangguan pembuluh darah, kanker paru-paru, kanker rongga mulut, kanker laring, kanker osefagus, bronkhitis, tekanan darah tinggi, impotensi serta gangguan kehamilan dan cacat pada janin. Komponen gas asap rokok adalah karbonmonoksida, amoniak, asam hidrosianat, nitrogen oksida dan formalin. Partikelnya berupa tar, indol, nikotin, karbarzol dan kresol. Zat-zat ini beracun, karena menimbulkan efek inflamasi dan radikal bebas, menyebabkan proliferasi dan aktivasi dari fagosit pada paru dan seluruh tubuh yang dapat menurunkan efek dari oksidan. Untuk mencegah dan mengurangi dampak buruk dari radikal bebas yang terkandung dalam rokok, diperlukan antioksidan. Tubuh manusia mempunyai beberapa mekanisme untuk bertahan terhadap radikal bebas dan ROS lainnya. Pertahanan yang bervariasi saling melengkapi satu dengan yang lain karena bekerja pada oksidan yang berbeda atau dalam bagian seluler yang berbeda. Suatu garis pertahanan yang penting adalah sistem enzim, termasuk superoxide dismutase (SOD), catalase, dan glutathion peroksidase. Pada umumnya semua sel jaringan organ tubuh dapat menangkal serangan 35 radikal bebas , tetapi seiring peningkatan usia maka sistem pertahanan tubuh
mengalami degradasi atau kemunduran, akibatnya pemunahan radikal bebas tidak dapat terpenuhi dengan baik, maka kerusakan jaringan terjadi secara perlahan-lahan. Dalam perkembangan ilmu kedokteran masa kini dikenal terapi ozon medis, yang menggunakan ozon untuk mengaktifkan antioksidan endogen dalam tubuh dengan mengaktivasi Superoksid Dismutase, Glutathion peroksidase, Catalase, sehingga dapat membantu menurunkan kadar radikal bebas dalam tubuh.
Berdasarkan rumusan masalah dan tinjauan pustaka, maka dapat disusun kerangka konsep sebagai berikut :
TERAPI OZON FAKTOR INTERNAL -
Gen Radikal bebas Kerusakan DNA
FAKTOR EKSTERNAL -
Polusi lingkungan Gaya hidup tidak sehat Stress Penyakit
-
-
Aging proses Meningkatkan total radikal bebas Meningkatkan MDA
me
Bagan 3.1. Kerangka dan Konsep
3.2 Hipotesis Penelitian 1. Pemberian terapi ozon menurunkan kadar radikal bebas total pada perokok berat. 2. Pemberian terapi ozon menurunkan kerusakan oksidatif akibat radikal bebas pada perokok berat.
BAB IV METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan menggunakan rancangan pre-test post-test control group design (Pocock, 2008). Skema rancangan penelitian adalah sebagai berikut : P0 O1
P
R
O2
S P1 O3
O4
Bagan 4.1. Rancangan Penelitian
38 Keterangan : P = Populasi
S = Sampel R = Random O1 = kondisi sebelum pemberian Nacl 1cc 03 = kondisi sebelum pemberian terapi ozon P0 = Perlakuan dengan pemberian NaCl 1 cc, selama 10 minggu P1 = Perlakuan dengan pemberian terapi ozon selama 10 minggu O2 = Kondisi setelah pemberian NaCl 1 cc, selama 10 minggu O4 = Kondisi setelah pemberian ozon mayor dengan dosis 40µg/ml darah selama 10 minggu
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di klinik Bianca, Jakarta, bulan April sampai Juli 2010.
4.3 Populasi dan Sampel Dalam penelitian ini digunakan para perokok berat dengan kriteria sebagai berikut :
4.3.1. Kriteria Sampel Inklusi: 1. Bersedia menjadi subyek penelitian dan menandatangani inform consent
2. Pria usia 30-50 tahun. 3. Perokok 10-15 batang/hari atau sudah mengalami ketergantungan fisik terhadap rokok. 4. Lama merokok di atas 10 tahun.
4.3.2. Kriteria Sampel Eksklusi : 1. Batuk kronis. 2. Sedang menjalani terapi hormon atau obat-obatan lain.
4.3.3. Kriteria drop out : 1. Bila dalam periode penelitian meminum obat-obatan. 2. Tidak menjalani terapi lebih dari 10 hari.
4.4. Besar sampel Besar sampel dihitung dengan menggunakan rumus Pocock (2008) 2 σ2 n
= ----------------- X ƒ (α,β ) (µ2 - µ1)2
Keterangan : n
= Besar sampel
µ2 = Rerata hasil radikal bebas total sebelum perlakuan pada kelompok perlakuan µ1 = Rerata hasil radikal bebas total sesudah perlakuan pada kelompok perlakuan α
= Simpangan baku kontrol
ƒ (α,β) = Besarnya dilihat pada Tabel Pocock
Berdasarkan uji terhadap 3 sampel pada setiap kelompok perlakuan dengan terapi ozon diperoleh rerata kelompok sebelum perlakuan = 400,67 dan SD = 64,79 rerata kelompok seasudah perlakuan P2 = 285. Perhitungan besar sampel dalam penelitian ini menggunakan α = 0,05 dan β = 0,1 sehingga diperoleh :
2( 64,79 )2 n =
___________
X 10,5
( 400,67 – 285 )2 = 6,59 + 15% = 7,5 = 8 Orang Berdasarkan hasil tersebut, jumlah subyek dalam penelitian ini menjadi 2 x 8 = 16 orang. Pada penelitian awal digunakan 3 orang subyek, sehingga jumlah subyek adalah 19 orang.
4.4 Variabel Penelitian 4.4.1 Identifikasi Variabel Variabel penelitian yang akan diukur adalah : 4.4.2 Klasifikasi Variabel a. Variabel bebas
: Ozon autohaemoterapi dengan dosis 40 µg/ml darah.
b.Variabel tergantung
: Kadar radikal bebas dalam darah.
4.4.3 Definisi Operasional Variabel a.
Ozon adalah gas berwarna biru yang berbau sangat spesifik, dan sangat reaktif, merupakan allotropi dari oksigen, dimana satu molekul ozon terdiri dari 3 atom oksigen. Ozon medis yang digunakan untuk terapi ozon dibuat dari oksigen murni yang dialirkan melalui generator ozon, sehingga dihasilkan oksigen dan ozon dengan perbandingan 95 % : 5 %.
b.
Terapi ozon autohaemoterapi (AHT) adalah salah satu terapi ozon dengan cara memasukkan gas ozon dalam konsentrasi kecil 4 µg/ml darah ke dalam
50ml darah vena yang sudah dikeluarkan dari dalam tubuh
kemudian di alirkan kembali kedalam tubuh yang diberikan satu minggu sekali selama 10 minggu. c.
Radikal bebas adalah suatu molekul yang memiliki satu atau elektron
lebih
yang tidak berpasangan pada orbit luarnya, bersifat sangat
reaktif terhadap sel atau komponen di sekitarnya, dimana radikal bebas dalam darah dapat diketahui konsentrasinya dengan menggunakan alat FORM. Alat ini sudah digunakan berdasarkan banyak penelitian yang tercantum pada lampiran 2. d.
Antioksidan adalah suatu zat yang dapat memperlambat atau mencegah proses oksidasi. Oksidasi pada penelitian ini adalah suatu reaksi kimia dalam darah, dimana terjadi pengurangan elektron dari atom atau grup atom.
e.
Perokok berat adalah orang yang
sudah mengalami
ketergantungan
secara fisik pada rokok. Ketergantungan fisik terjadi bila mengkonsumsi rokok di atas 5 batang sehari. 4.5 Alat dan Bahan 4.5.1. Alat yang digunakan adalah 1. Generator ozon 2. Tabung oksigen 3. Tensimeter 4. Alat pengukur kadar radikal bebas darah FORM 5. Centrifuge 6. Cuvet 7. Tabung reagen 8. Blood lancet
9. Bloodbag, abocath no.27 10. Spuit 50cc 11. Klem selang infus 12. Boks plastik 13. Tiang infus 14. Kamera 4.5.2. Bahan penelitian : 1. 50 cc darah 2. Ozon 40 µg/ml darah 4.6
Prosedur Penelitian Penelitian dilakukan sebagai berikut : 4.6.1. Pengambilan subyek Penelitian dilakukan pada laki-laki perokok usia 30 tahun sampai 50 tahun
karena pada usia 30 tahun biasanya sudah didapatkan penurunan fungsi metabolism tubuh dikarenakan mulai menurunnya kadar hormon-hormon dalam tubuh dan sudah mulai terjadi proses degeneratif (Pangkahila, 2007). Dengan kebiasaan merokok akan semakin memperburuk kondisi ini. Batas atas usia di tentukan 50 tahun, karena pada usia ini diharapkan belum terjadi kerusakan-kerusakan yang lebih memperburuk kondisi stress oksidatif.
Subyek terbagi menjadi 2 kelompok perlakuan dimana kelompok pertama sebanyak 8 orang mendapatkan terapi ozon medis sebanyak 10 kali yang dilakukan dengan selang waktu 1 minggu, sementara kelompok kedua yang juga berjumlah 8 orang merupakan kontrol yang mendapat terapi placebo injeksi 1 CC NaCl secara I.V., yang dilakukan sebanyak 10 kali, dengan selang waktu 1 minggu. Pemilihan pemberian NaCl agar tidak mempengaruhi kenaikan kadar antioksidan dalam tubuh. Pemeriksaan kadar radikal bebas darah dilakukan pada kedua kelompok, yaitu pada awal dilakukannya penelitian dan pada akhir penelitian untuk mendapatkan perbedaan kadar radikal bebas dalam darah sebelum dan setelah dilakukan penelitian. Untuk membandingkan hasil dari pemeriksaan kadar radikal bebas darah dengan alat FORM, maka pada kelompok perlakuaan juga dilakukan pemeriksaan dengan MDA, dimana bila ditemukan penurunan kadar radikal bebas darah, maka akan terjadi penurunan dari kerusakan oksidatif pada sel sehingga akan didapatkan penurunan dari hasil MDA.
4.6.2. Prosedur pemeriksaan kadar radikal bebas dalam darah Pada awal penelitian dilakukan pengukuran kadar radikal bebas darah, dengan menggunakan alat pengukur kadar radikal darah FORM dengan cara: darah
diambil dari ujung jari tangan menggunakan lancet sebanyak 0.5 cc, kemudian di alirkan kedalam pipa kapiler berukuran 20µl, dimasukkan dalam tabung reagen, kocok perlahan, hingga darah dalam pipa kapiler tercampur reagen R2, tuang larutan ini kedalam tabung reagen R1, kemudian di pusingkan selama 1 menit, setelah itu tabung ini diletakkan dalam alat diagnostik radikal bebas, dan ditunggu selama 6 menit hingga didapatkan hasilnya.
Penentuan kadar radikal bebas dalam darah: Table nilai FORT tes : FORT units
Mmol/l, H2O2 eq
<300-310
<2.28-2.35
Normal
300-330
2.28-2.50
Batas atas
>330
>2.50
Oxidative Stress
Tabel 4.2. Tabel nilai kadar radikal bebas pada alat FORM
4.6.3. Prosedur terapi ozon (major autohaemotherapy) Darah dialirkan ke blood bag sebanyak 50cc, kemudian diberikan ozone 40µg/ml darah, kemudian, darah dalam blood bag yang sudah diberikan ozon,
dicampur
perlahan
diletakkan pada telapak telapak tangan diputar angka 8, sehingga darah
dengan cara blood bag PEROKOK BERAT Pria usia 30-50 tahun Merokok 10-15 batang/hari Lama merokok lebih dari 10 tahun
tangan,
kemudian
perlahan dan
membentuk
ozon
dapat
tercampur sempurna, hal ini dilakukan lebih kurang 30 detik, kemudian darah dimasukkan kembali ke tubuh pasien dengan kecepatan tetesan 60-80 tts/mnt. 4.6.4. Prosedur penyuntikan NaCl Disuntikan NaCl sebanyak 1 cc pada vena cubiti lengan kanan atau lengan kiri.
4.7. ALUR PENELITIAN
PEROKOK B
Kadar radikal bebas darah, MDA
Pre Test
Kelompok 1
Kelompok 2
Kontrol
Perlakuan
Injeksi NaCl 1 cc, IV, 1x/minggu
Terapi ozon 40µg/ml, 1x/minggu
Selama 10 minggu
Selama 10 minggu
Kadar radikal bebas darah, MDA
Analisis data
Laporan Bagan 4.3. Alur Penelitian
4.8.
Analisis Data
Post Test
Data yang diperoleh akan dianalisis dengan langkah-langkah sebagai berikut : 1. Analisis deskriptif -
Frekuensi
-
Distribusi
2. Analisis normalitas (Shapiro-Wilk) dan homogenitas (Levene Test) 3. Analisis perbandingan sebelum dan sesudah diberi perlakuan dengan uji t-paired karena data menyebar normal. 4. Analisis perbandingan 2 kelompok menggunakan uji t-independent karena data menyebar normal.
BAB V
HASIL PENELITIAN
Dalam penelitian ini digunakan sebanyak 16 orang sebagai sampel, 8 orang di antaranya sebagai kelompok kontrol dan 8 orang sebagai kelompok perlakuan. Dalam pembahasan ini akan diuraikan uji normalitas data, uji homogenitas data, uji komparabilitas, dan uji efek perlakuan. 5.1 Uji Normalitas Data Data kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit diuji normalitasnya dengan menggunakan uji Shapiro-Wilk. Hasilnya menunjukkan data berdistribusi normal (p>0,05), disajikan pada Tabel 5.1. Tabel 5.1 Hasil Uji Normalitas Kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit kelompok Sebelum dan Sesudah perlakuan Kelompok Subjek Kontrol pre Ozon pre Kontrol post Ozon post
n
p
8 8 8 8
0,511 0,888 0,269 0,167
Keterangan Normal Normal Normal Normal
5.2 Uji Homogenitas 50 Data kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit diuji
homogenitasnya dengan menggunakan uji Levene’s test. Hasilnya menunjukkan data homogen (p>0,05), disajikan pada Tabel 5.2. Tabel 5.2 Rerata Kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit antar kelompok sesudah diberikan perlakuan Kelompok Subjek
F
P
Keterangan
Sebelum Perlakuan (pre)
3,645
0,077
Homogen
Sesudah Perlakuan (post)
3,539
0,078
Homogen
5.3 Nilai FORT unit 5.3.1 Uji Komparabilitas Uji Komparabilitas bertujuan untuk membandingkan rerata kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit antar kelompok sebelum diberikan perlakuan berupa terapi ozon 40 µg/ml. Hasil analisis kemaknaan dengan uji t-independent test disajikan pada Tabel 5.3 berikut.
Tabel 5.3 Rerata Kadar kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit antar Kelompok Sebelum Diberikan Perlakuan
Kelompok Subjek
Kontrol (NaCl 1 cc) Perlakuan (Terapi ozon 40 µg/ml)
n
Rerata Kadar kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit
SB
8
400,75
109,48
8
428,12
t
P
-0,654
0,524
45,26
Tabel 5.3 di atas, menunjukkan bahwa rerata kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit kelompok kontrol adalah 400,75109,48, rerata kelompok terapi ozon 40 µg/ml adalah 428,1245,26. Analisis kemaknaan dengan uji tindependent test menunjukkan bahwa nilai t = -0,654 dan nilai p = 0,524. Hal ini berarti bahwa kedua kelompok sebelum diberikan perlakuan, rerata kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit tidak berbeda secara bermakna (p > 0,05). 5.3.2 Analisis efek perlakuan 5.3.2.1 Analisis efek Perlakuan antar Kelompok Analisis efek perlakuan diuji berdasarkan rerata kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit antar kelompok sesudah diberikan perlakuan berupa Terapi ozon 40 µg/ml. Hasil analisis kemaknaan dengan uji t-independent disajikan pada Tabel 5.4 berikut. Tabel 5.4 Rerata Kadar kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit antar
kelompok sesudah diberikan perlakuan Rerata Kadar kadar radikal bebas dalam Kelompok Subjek n SB darah dengan nilai FORT unit Kontrol (NaCl 1 cc)
P
2,562
0,023
8 419,75
Perlakuan (terapi Ozon 40 µg/ml)
T
8
311,00
113,47 39,17
Tabel 5.4 di atas, menunjukkan bahwa rerata kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit kelompok kontrol adalah 419,75113,47, rerata kelompok terapi adalah 311,0039,17. Analisis kemaknaan dengan uji t-independent test menunjukkan bahwa nilai t = 2,562 dan nilai p = 0,023 (Widowati, 2010). Hal ini berarti bahwa kedua kelompok sesudah diberikan perlakuan, rerata kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit berbeda secara bermakna (p < 0,05).
500
400.75 428.12
419.75 311
400 300
Kontrol
200
Ozon Mayor 40 ug/ml
100 0
Sebelum Perlakuan
Sesudah Perlakuan
Gambar 5.1 Grafik Penurunan Kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit
5.3.2.2 Analisis efek Perlakuan antara Sebelum dengan Sesudah Perlakuan Analisis efek perlakuan diuji berdasarkan rerata kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit antara kelompok sebelum dengan sesudah diberikan perlakuan berupa terapi ozon. Hasil analisis kemaknaan dengan uji t-paired disajikan pada Tabel 5.5 berikut. Tabel 5.5 Analisis Komparasi Kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit antara Sebelum dan Sesudah Perlakuan Beda Kelompok P Interpretasi Rerata Tidak Berbeda Kontrol pre – Kontrol post 19,00 0,407 Terapi ozon pre – Terapi ozon post
117,13
0,000
Berbeda
Tabel 5.5 di atas, menunjukkan bahwa dengan uji t-paired rerata kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit antara kelompok kontrol pre dengan kelompok kontrol post tidak berbeda (p > 0,05), sedangkan kelompok terapi pre dengan terapi post berbeda secara bermakna (p < 0,05). 5.4. Kadar MDA 5.4.1 Uji Komparabilitas Uji Komparabilitas bertujuan untuk membandingkan rerata kadar MDA antar kelompok sebelum diberikan perlakuan berupa Terapi ozon. Hasil analisis
kemaknaan dengan uji t-independent test disajikan pada Tabel 5.6 berikut. Tabel 5.6 Rerata Kadar MDA antar Kelompok Sebelum Diberikan Perlakuan N
Rerata Kadar kadar Kadar MDA
SB
Kontrol (NaCl 1 cc)
8
0,044
0,005
Perlakuan (Terapi ozon)
8
0,047
0,006
Kelompok Subjek
t
P
-0,759
0,460
Tabel 5.6 di atas, menunjukkan bahwa rerata kadar MDA kelompok kontrol adalah
0,0440,005, rerata kelompok terapi ozon adalah 0,0470,006. Analisis
kemaknaan dengan uji t-independent test menunjukkan bahwa nilai t = -0,759 dan nilai p = 0,460 (Widowati, 2010). Hal ini berarti bahwa kedua kelompok sebelum diberikan perlakuan, rerata kadar MDA tidak berbeda secara bermakna (p > 0,05).
5.4.2 Analisis efek perlakuan 5.4.2.1 Analisis efek Perlakuan antar Kelompok Analisis efek perlakuan diuji berdasarkan rerata kadar MDA antar kelompok sesudah diberikan perlakuan berupa terapi ozon. Hasil analisis kemaknaan dengan uji t-independent disajikan pada Tabel 5.7 berikut. Tabel 5.7 Rerata Kadar MDA antar kelompok sesudah diberikan perlakuan Kelompok Subjek
n
Rerata Kadar MDA
SB
T
P
Kontrol (NaCl 1 cc) Perlakuan (Terapi ozon)
8
0,046
0,006 2,873
8
0,012
0,005
0,038
Tabel 5.7 di atas, menunjukkan bahwa rerata kadar MDA kelompok kontrol adalah
0,0460,006, rerata kelompok terapi ozon adalah 0,0380,005. Analisis
kemaknaan dengan uji t-independent test menunjukkan bahwa nilai t = 2,873 dan nilai p = 0,012 (Widowati, 2010). Hal ini berarti bahwa kedua kelompok sesudah diberikan perlakuan, rerata kadar MDA berbeda secara bermakna (p < 0,05).
0.05
0.04425
0.0465
0.045875 0.038
0.04 0.03
Kontrol
0.02
Ozon Mayor
0.01 0 Pre
Post
Gambar 5.2 Grafik Penurunan Kadar MDA
5.4.2.2.Analisis efek Perlakuan antara Sebelum dengan Sesudah Perlakuan Analisis efek perlakuan diuji berdasarkan rerata kadar MDA antara kelompok
sebelum dengan sesudah diberikan perlakuan berupa Terapi ozon. Hasil analisis kemaknaan dengan uji t-paired disajikan pada Tabel 5.8 berikut. Tabel 5.8 Analisis Komparasi Kadar MDA antara Sebelum dan Sesudah Perlakuan Kelompok Beda Rerata P Interpretasi Tidak Berbeda Kontrol pre – Kontrol post
0,002
0,573
Terapi ozon pre – terapi ozon post
0,009
0,000
bermakna
Berbeda bermakna
Tabel 5.8 di atas, menunjukkan bahwa dengan uji t-paired rerata kadar MDA antara kelompok kontrol pre dengan kelompok kontrol post tidak berbeda (p > 0,05), sedangkan kelompok terapi ozon 40 µg/ml pre dengan terapi ozon 40 µg/ml post berbeda secara bermakna (p < 0,05).
5.5. Hubungan antara Kadar MDA dengan Nilai FORT unit Analisis korelasi Pearson digunakan untuk mengetahui hubungan linier antara kadar MDA dengan nilai FORT unit. Hasil analisis korelasi menunjukkan bahwa terdapat korelasi yang kuat (r = 0,626; p = 0,009) antara penrunan kadar MDA dengan penurunan kadar radikal bebas dalam darah yang dinilai dengan FORT unit. Hal ini menunjukkan bahwa nilai FORT unit dapat dipakai sebagai pengganti untuk mengukur kadar MDA dalam darah atau kadar radikal bebas dalam darah
(Widowati, 2010). Dengan menurunnya kadar radikal bebas dalam darah yang di dapat diketahui dengan alat FORM, maka terdapat penurunan kerusakan oksidatif pada sel, dan akan didapatkan penurunan kadar MDA dalam darah.
BAB VI PEMBAHASAN
6.1. Subyek Penelitian Untuk menguji pemberian terapi ozon terhadap penurunan kadar radikal bebas pada darah, maka dilakukan penelitian pada perokok berat. Sebagai sampel digunakan pria usia 30-50 tahun, tidak menderita hipertensi, perokok berat 10-15 batang/hari, dan lama merokok di atas 10 tahun. Pada penelitian ini digunakan pria berusia 30-50 tahun karena pada usia ini belum terjadi kerusakan oksidatif lebih lanjut oleh karena efek radikal bebas maupun karena penurunan fungsi hormonal (Pangkahila, 2007). Subyek pada penelitian ini
menggunakan perokok berat karena pada perokok berat ditemukan kadar radikal bebas yang tinggi dikarenakan paparan zat toksik yang terkandung dalam rokok (WHO, 2008). Sampel yang dipergunakan dalam penelitian ini berjumlah 16 orang, dibagi menjadi 2 kelompok yaitu kelompok kontrol P0 (injeksi Nacl 1 cc), kelompok P1 (terapi ozon). Penelitian dilakukan selama 10 minggu. Pemeriksaan kadar radikal bebas darah dilakukan pada kedua kelompok kontrol pada awal dilakukannya penelitian dan pada akhir penelitian untuk mendapatkan perbedaan kadar radikal bebas dalam darah sebelum dan setelah dilakukan penelitian.
59
6.2. Pengaruh Pemberian terapi ozon terhadap kadar radikal bebas dalam darah Hasil penelitian dan analisis data kadar radikal bebas dalam darah yang diukur dengan nilai FORT pada kelompok kontrol dan kelompok P1 menunjukkan bahwa uji normalitas (Uji Shapiro Wilk) dan homogenitas (Levene test) untuk kelompok pre dan post-test (Pocock, 2008) masing-masing kelompok berdistribusi normal dan homogen (p > 0,05). Uji perbandingan sebelum diberikan perlakuan (pre test) antara kedua kelompok digunakan uji t-independent, didapatkan bahwa rerata kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit kelompok kontrol adalah 400,75109,48, rerata kelompok terapi adalah 428,1245,26, dengan uji t-independent didapatkan bahwa
tidak terdapat perbedaan bermakna rerata radikal bebas dalam darah yang diukur dengan nilai FORT antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan 1 (P1) (p > 0,05). Uji perbandingan sesudah diberikan perlakuan (post test) antara kedua kelompok digunakan uji t-independent, didapatkan bahwa rerata kadar radikal bebas dalam darah dengan nilai FORT unit kelompok kontrol adalah 419,75113,47, rerata kelompok terapi adalah 311,0039,17, dengan uji t-independent didapatkan bahwa terjadi penurunan rerata radikal bebas dalam darah yang diukur dengan nilai FORT antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan 1 (P1) secara bermakna (p < 0,05). Uji perbandingan antara sebelum perlakuan (pre) dan sesudah perlakuan (post) dengan Uji t-paired pada kelompok kontrol tidak terdapat perbedaan rerata radikal bebas dalam darah yang diukur dengan nilai FORT ( p > 0,05), sedangkan pada kelompok perlakuan 1 (P1) terdapat perbedaan rerata radikal bebas dalam darah yang diukur dengan nilai FORT secara bermakna (p < 0,05). Di samping dengan menggunakan nilai FORT unit untuk mengetahui radikal bebas dalam darah juga diukur kadar MDAnya. Hasil analisis dengan uji tindependen didapatkan bahwa rerata kadar MDA sebelum perlakuan pada kelompok kontrol adalah 0,0440,005, rerata kelompok terapi adalah 0,0470,006. Analisis kemaknaan dengan uji t-independent test menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan ( p > 0,05). Sedangkan sesudah perlakuan rerata kadar MDA kelompok kontrol adalah 0,0460,006, rerata kelompok terapi adalah 0,0380,005. Analisis kemaknaan
dengan uji t-independent test menunjukkan bahwa terdapat perbedaan bermakna ( p <0,05) (Widowati, 2010). Berdasarkan hasil penelitian di atas, menunjukkan terjadinya penurunan bermakna rerata radikal bebas dalam darah baik yang diukur dengan nilai FORT maupun kadar MDA pada kelompok P1 yang diberi terapi selama 10 minggu. Hal ini disebabkan karena terapi ozon dapat mengaktifkan antioksidan endogen dalam tubuh yaitu Superoksid Dismutase, Glutathion peroksidase, Catalase (Bocci dan Luzzi, 2005). Analisis korelasi Pearson digunakan untuk mengetahui hubungan linier antara kadar MDA dengan nilai FORT unit. Hasil analisis korelasi menunjukkan bahwa terdapat korelasi yang kuat (r = 0,626; p = 0,009) antara penrunan kadar MDA dengan penurunan kadar radikal bebas dalam darah yang dinilai dengan FORT unit. Hal ini menunjukkan bahwa nilai FORT unit dapat dipakai sebagai pengganti untuk mengukur kadar MDA dalam darah atau kadar radikal bebas dalam darah. Terapi ozon dengan dosis yang tepat, tidak akan menimbulkan efek yang merugikan, tetapi mampu membangkitkan beberapa respon biologis yang menguntungkan bagi tubuh, salah satunya adalah dengan mengaktifkan anti oksidan enzimatik yang terlibat dalam reaksi peroksidasi yang secara bersamaan mempunyai fungsi melindungi terhadap proses degenerasi yang terjadi pada saat kadar radikal bebas dalam tubuh meningkat (Novgorod, 2006). Pada penelitian yang dilakukan oleh Marshall, 2001 pada subyek yang menderita penyakit infeksi
dan dilakukan terapi ozon secara rectal insufflations satu kali seminggu selama 3 minggu, juga didapatkan penurunan kadar radikal bebas darah, dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa terapi ozon walaupun dilakukan pada subyek yang menderita penyakit dan dengan cara terapi ozon minor (rectal insufflations) dan hanya dilakukan 3 kali terapi tetap didapatkan penurunan kadar radikal bebas pada darah.
6.3. Beberapa Manfaat Terapi Ozon terhadap Kesehatan Selain meningkatkan antioksidan endogen, ozon juga memiliki beberapa manfaat lainnya (Viebahn, 1994) di antaranya adalah, terapi ozon mengaktifkan metabolisme dari sel darah merah (RBC) dengan meningkatkan 2,3 DPG (Di Phospo Glycerate) dan ATP (Adenosin Tri Phosphate) yang menghasilkan peningkatan pelepasan O2, sehingga dapat memperbaiki oksigenasi jaringan di seluruh tubuh, meningkatkan kemampuan sel-sel imun dengan melepaskan cytokine seperti interferon dan interleukin, menguatkan sistem imun dengan meningkatkan IFN β (Interferon β), TGF β 1 (Transformin Growth Factor β 1). Ozon sangat efektif dalam mengaktifkan sistem imunitas tubuh dengan mengaktifkan antioksidan endogen, ozon juga sangat efektif digunakan untuk membunuh virus, bakteri, dan jamur, abses, alergi, gangguan sirkulasi arteri,
gangren, ulkus kruris, sirosis hepatis, polyneuritis, poliartritis, tromboplebitis, gangguan penyembuhan
luka,
penyakit
Parkinson,
hepatitis,
ginggivitis,
paradontosis (Valacchi, 2000). Terapi ozon sebaiknya tidak dilakukan pada keadaan, intoksikasi alkohol akut, infark jantung baru, hipertiroid, alergi ozon. Renjatan, edem paru, hipokalsemia. Penggunaan campuran O3 melebihi 3000ug/ kali dapat menyebabkan hemolisis butir darah merah. Emboli udara, hal yang diduga akan dapat terjadi pada penggunaan ozon secara intraarteri/ intravena, tidak perlu terjadi apabila oksigen yang digunakan benar-benar murni (100%). Sebab yang membuat emboli udara terjadi ialah adanya gas tidak larut yaitu komponen nitrogen (Viebahn, 1985).
6.5. Manfaat penelitian Dari hasil penelitian yang dilakukan didapatkan bahwa pemberian terapi ozon dengan dosis 40 µg/ml yang dilakukan 1x/minggu selama 10 minggu pada perokok berat dapat menurunkan
kadar radikal bebas total dan MDA yang merupakan
petunjuk adanya kerusakan oksidatif pada tubuh (Widowati, 2010). Dengan menurunnya kadar radikal bebas pada tubuh maka akan terjadi penurunan kerusakan oksidatif pada sel , diketahui dengan menurunnya kadar MDA pada darah (Enrique and Packer, 2002). Sehingga penyakit degeneratif seperti gangguan cardiovascular, cerebrovascular, premature aging dapat dihindari. Dengan demikian diharapkan akan didapatkan keadaan kesehatan yang semakin baik dan kualitas hidup yang lebih baik.
BAB VII SIMPULAN DAN SARAN
7.1 Simpulan Berdasarkan hasil penelitian pemberian terapi ozon pada perokok berat dengan dosis 40 µg/ml didapatkan simpulan sebagai berikut: Pemberian terapi ozon (AHT) menurunkan kadar radikal bebas dalam darah perokok aktif sebesar 23,16%.
7.2 Saran Sebagai saran dalam penelitian ini adalah:
1. Disarankan untuk melakukan penelitian lanjutan, untuk mengetahui manfaat lain penggunaan terapi ozon. 2. Bagi perokok yang belum bisa menghentikan kebiasaan merokoknya, disarankan untuk melakukan terapi ozon mayor (AHT) sedikitnya 10 kali terapi dengan jangka waktu seminggu sekali untuk menurunkan kadar radikal bebas dalam darah.
65 DAFTAR PUSTAKA
Altman, N.2001, Oxygen Healing Therapies. Rochester. Vermont: 21-37 Anonim, 2009. Antioksidan, Jenis Antioksidan dan Manfaat Antioksidan. [cited 2010 April, 6]. Available from URL; http://netsains.com/2009/antioksidanapa-yang-kitaperlu-ketahui-tentangnya/ Bagiada, A., Arcana. 2005. Peran Antioksidan Untuk Mencegah Beberapa Kelainan Jaringan Tubuh. Majalah Kedokteran Indonesia, vol55(6), 455-458. Bagchi, K. Puri, S. 1998. Free Radicals and Antioxidants in Health and Disease. [cited 2009 August. 5]. Available from:URL: http//www.emro.who.int/publication/EMHJ/0402/2/htm. Bocci, V., Valacchi, G., Corradeschi, F., Aldinucci, C., Silvestri, S., Paccagnini, E. 1998. Studies on The Biological Effects of Ozone: 7. Generation of Reactive Oxygen Species (ROS) After Exposure of Human Blood to Ozone. Germany. J Biol Regulat Homeost Agent ;12:67-75. Bocci, V., 2005. Ozone; A New Medical Drug. The Netherlands: Springer, 9-21
Bocci, V., Aldinucci, C., Bianchi, L. 2005. The use of hydrogen peroxide as a medical drug. Germany. Riv Ital Ossigeno Ozonoterapia ;4:30-39 Bocci, V., Luzzi, E. 2005. Studies on Biological Effect of Ozone, Germany. 4: 30-39 Bocci, V. 2005. Scientific and Medical Aspects of Ozone Therapy. State of the Art, Medical Research 37. Siena. Italy. Elsevier:425-435. Bocci, V. 1999, Biological and Clinical Effects of Ozone. Has Ozone Therapy a Future in Medicine?. Siena, Italy. British Journal of Biomedical Science 1999; 56; 270-279. Bocci, V.2006, Is it true that ozone is always toxic? The end of the dogma, Toxicology appl. Pharmacol. 2006, 493-504 Enrique, C and Packer, L, 2002. Handbook of antioxidants, second edition. Newyork. Daniel
haley,2001, politic in healing, http://www.politicsinhealing.com/townsend.htm-top-of-page
from:
Dina, S. 2005, Antioksidan, Radikal Bebas, [cited 2010 April, 6]. Available from URL:http://www.ehem-is try.org/artikel_kimia/berita/antioksida_dan_radikal_bebas Devlin, T.M. 1982. Text Book of Biochemistry Correlations.,Philadelphia, Willey Medical Publication: 408-413 Eiserich, 1995. Dietary Antioxidants and Cigarette Smoke-induced Biomolekuler Damage, California,USA,62:1490-1500 FORT Assay Kit, 2010. Technical Manual ( Mei 23 ). Available at www.callegari1930.com/catellani_eng/hom.html Ginger, L., 2008. Text Book of Oxidative Stress and Inflammatory Mechanisms in Obesity, Diabetes, and the Metabolic Syndrome. USA. Brokensound Parkway SW,38-39. Goldman,R. and Klatz, 2007. The New Anti Aging Revolution. Malaysia Edition: 1939 Halliwel B., 1999, Free Radicals in Biology and medicine, 3th edition, New York: oxfort university press Hoffman and Nehbahn, 1992. The influence of ozone an 2,3-diphosphogly cerate synthesis in red blood cell concentrates, research centre of medical Technology and Biotechnology bad Langensalza.
Katleen, M. B. and Peter A. M. 2006. Biokimia Harper, Edisi 27. Jakarta. EGC:101. Kehrer, JP. 2000. The Haber Weiss Reaction and Mechanism of Toxicology. Germany. 149: 43-50 KPAI. 2009. Perlindungan dan Pencegahan Bahaya Merokok Pada Anak. , [cited 2009 Oktober. 12]. Available from: URL: http//www.kpai.go.id-Perlindungan dan Pencegahan Bahaya Merokok pada anak.htm Murray, R.K.2009. Harper’s Illustrated Biochemistry. USA. Mac Graw Hill Company 28: 101, 2009 Novgorod, N. 2006. Physician’s Manual For Ozone Theraphy, Rusian Association of Ozone Theraphy, 22-37. Ozonosan, 1996. Precision and Safety Ozonosan Photonik, www.ozonetherapy.de/english/photonik.html.
available at
Pangkahila, W. 2007. Memperlambat Penuaan, Meningkatkan Kualitas Hidup. Anti Aging Medicine, cetakan ke-1, Jakarta, penerbit buku Kompas, 13-23. Pertozi. 1997. Pengaruh Ozon Terhadap Berbagai Aspek Mekanisme Metabolisme Tubuh. Naskah Temu Ilmiah Perhimpunan Dokter Seminat Terapi Ozon Indonesia (PERTOZI). Jakarta 9 Agustus. Pocock, S.J. 2008, The size of a Clinical Trial, Clinical Trials, A Practical Approach, 123-127. Simanjuntak, D.H., Sudaryati, E. 1998. Aspek Pencegahan Radikal Bebas Melalui Antioksidan. Majalah Kedokteran Indonesia, vol 48:1: 50-54. Siswono. 2005. Berhentilah Merokok, [cited 2010 April, 5]. Available from: URL: http://www.gizi.net/cgi-bin/berita/fullnews.cgi?newsid1118034832. Sulistyowati, T. 2000, Radikal Bebas dan Anti Oksidan, Cermin Dunia Kedokteran, 128, 49-51 Setiati, S, 2003, Radikal Bebas, Antioksidan dan Proses Menua, Jakarta,Medika 6: 366 Valacchi, G.,2000. Studies on The Biological Effects of Ozone: 11. Release of Factors from Human Endothelial Cells. Germany. Mediat Inflamm 2000;9:271-276 Valacchi, G., 2008, Oxidants in biology, Springer, 2008, 155-165
Verde, V., 2002. Use of N,N Dietyl P Phenilendiamine to Evaluate the Oxidative Status of Human Plasma. Free Rad Test, 36(8) : 869-873,2002 Viebahn, R. 1994. The Use of Ozone in Medicine, Vol. 2. Heidelberg. Karl F Haug Publishers. WHO. 2002. Prevalence of Current Tobacco Use Among Adults Aged ≥ 15 year. [cited 2010 April, 5]. Available from URL: http://www.who.int/whosis/indicators/compendium/2008/2ptu/en/index.html WHO,
2008. WHO Report on http://www.int/entity/tobacco
tobacco
Wikipedia. 2010. Rokok. [cited 2010 URL:http://id.wikipedia.org/wiki/Rokok,
epidemic,
available
April,6].
Available
at
:
from
Widjaja, S. 2009. Antioksidan: Pertahanan Tubuh Terhadap Efek Oksidan dan Radikal Bebas. Majalah Ilmiah Fakultas Kedokteran Trisakti 16(1): 16591666. Wirahadikusumah, M. 2001. Biokimia Protein, Enzim, dan Asam Nukleat. Bandung. Penerbit ITB Bandung. 53-54
LAMPIRAN Lampiran 1 Uji Normalitas Data
Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova kelompok Fortpre Kontrol (NaCl 1 cc)
Statistic
df
.187
Shapiro-Wilk
Sig. 8
ozon mayor .141 8 40µg/ml fortpost Kontrol (NaCl 1 cc) .298 8 ozon mayor .281 8 40µg/ml a. Lilliefors Significance Correction *. This is a lower bound of the true significance.
Statistic
df
Sig.
*
.929
8
.511
.200*
.969
8
.888
.036
.897
8
.269
.063
.875
8
.167
.200
Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova kelompok
Statistic
df
Sig.
Shapiro-Wilk Statistic
df
Sig.
MDApre Kontrol (NaCl 1 cc) ozon mayor 40µg/ml MDApost Kontrol (NaCl 1 cc) ozon mayor 40µg/ml
.248
8
.157
.838
8
.071
.158
8
.200*
.907
8
.332
.247
8
.162
.887
8
.221
.223
8
.200*
.906
8
.327
a. Lilliefors Significance Correction *. This is a lower bound of the true significance.
Group Statistics kelompok fortpre
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol (NaCl 1 cc)
8 4.0075E2
109.47635
38.70574
ozon mayor 40µg/ml
8 4.2812E2
45.25937
16.00160
8 4.1975E2
113.47089
40.11802
8 3.1100E2
39.17361
13.84996
fortpost Kontrol (NaCl 1 cc) ozon mayor 40µg/ml
Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances
t-test for Equality of Means 95% Confidence Interval of the Difference
F
Sig.
T
fortpre Equal variances 3.645 .077 -.654 assumed Equal variances not assumed
df
Sig. (2Mean Std. Error tailed) Difference Difference Lower
Upper
14
.524 -27.3750 41.88299 -117.205 62.45509
-.654 9.325
.529 -27.3750 41.88299 -121.620 66.87012
fortpost Equal variances 3.539 .078 2.562 assumed Equal variances not assumed
14
.023 108.7500 42.44145 17.72214 199.7778
2.562 8.645
.032 108.7500 42.44145 12.13678 205.3632
kelompok = Kontrol (NaCl 1 cc) Paired Samples Statisticsa Mean Pair 1
fortpre
N
4.0075E2
fortpost 4.1975E2 a. kelompok = Kontrol (NaCl 1 cc)
Std. Error Mean
Std. Deviation 8
109.47635
38.70574
8
113.47089
40.11802
Paired Samples Correlationsa N
Correlation
Pair 1 fortpre & fortpost 8 a. kelompok = Kontrol (NaCl 1 cc)
Sig.
.851
.007
Paired Samples Testa Paired Differences
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
95% Confidence Interval of the Difference Lower
Upper
t
Pair fortpre 60.96369 21.55392 31.96692 -.882 1 fortpost 1.90000E1 69.96692 a. kelompok = Kontrol (NaCl 1 cc)
Sig. (2tailed)
df 7
.407
kelompok = ozon mayor 40µg/ml Paired Samples Statisticsa Mean Pair 1
fortpre
N
4.2812E2
fortpost 3.1100E2 a. kelompok = ozon mayor 40µg/ml
Std. Error Mean
Std. Deviation 8
45.25937
16.00160
8
39.17361
13.84996
Paired Samples Correlationsa N
Correlation
Pair 1 fortpre & fortpost 8 a. kelompok = ozon mayor 40µg/ml
Sig.
.341
.408
Paired Samples Testa Paired Differences
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
95% Confidence Interval of the Difference Lower
Upper
t
Pair fortpre 1.17125E2 48.70447 17.21963 76.40705 157.84295 6.802 1 fortpost a. kelompok = ozon mayor 40µg/ml
Sig. (2tailed)
df 7
.000
Group Statistics kelompok MDApre
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol (NaCl 1 cc)
8
.044250
.0054182
.0019156
ozon mayor 40µg/ml
8
.046500
.0063920
.0022599
8
.045875
.0058172
.0020567
8
.038000
.0051270
.0018127
MDApost Kontrol (NaCl 1 cc) ozon mayor 40µg/ml
Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variance s
F
Sig.
t-test for Equality of Means
T
MDApre Equal variance .278 .607 -.759 s assumed Equal variance s not assumed
df
95% Confidence Sig. (2Mean Std. Error Interval of the Difference tailed Differenc Differenc ) e e Lower Upper
14
.004104 .460 -.0022500 .0029626 .008604 1 1
13.63 -.759 4
.004120 .460 -.0022500 .0029626 .008620 1 1
MDApos Equal t variance 2.87 .798 .387 s 3 assumed
14
.012 .0078750 .0027415
.001995 .013754 1 9
Equal variance s not assumed
2.87 13.78 3 2
.001986 .013763 4 6
.012 .0078750 .0027415
Paired Samples Statisticsa Mean Pair 1
N
Std. Error Mean
Std. Deviation
MDApre
.044250
8
.0054182
.0019156
MDApost
.045875
8
.0058172
.0020567
a. kelompok = Kontrol (NaCl 1 cc)
Paired Samples Correlationsa N Pair 1
MDApre & MDApost
Correlation 8
Sig.
.042
.921
a. kelompok = Kontrol (NaCl 1 cc)
Paired Samples Testa Paired Differences
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
95% Confidence Interval of the Difference Lower
Upper
t
df
Sig. (2tailed)
Pair MDApre 1 MDApost 1.6250000E- .0077816 .0027512 .0048806 -.591 .0081306 3
7
.573
a. kelompok = Kontrol (NaCl 1 cc)
Paired Samples Statisticsa Mean Pair 1 MDApre MDApost
N
Std. Deviation
Std. Error Mean
.046500
8
.0063920
.0022599
.038000
8
.0051270
.0018127
a. kelompok = ozon mayor 40µg/ml
Paired Samples Correlationsa N Pair 1
MDApre & MDApost
Correlation 8
.854
Sig. .007
a. kelompok = ozon mayor 40µg/ml
Paired Samples Testa Paired Differences
t
df
Sig. (2-
Mean Pair MDApre 1 MDApost
Std. Deviation
95% Confidence Interval of the Difference
Std. Error Mean
Lower
Correlations selfort selfort
Pearson Correlation
selMDA 1
.626**
Sig. (2-tailed) N selMDA Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N
Upper
.0085000 .0033381 .0011802 .0057093 .0112907 7.202
a. kelompok = ozon mayor 40µg/ml
.009 16
16
.626**
1
.009 16
**. Correlation is significant at the 0.01 level (2tailed).
16
tailed)
7
.000
LAMPIRAN 2 Penelitian yang menggunakan alat Form 1. Mahdi O., Garelnabi W., Virgil Brown, Ngoc-Anh Le, 2008. Evaluation of a novel colorimetric assay for free oxygen radicals as marker of oxidative stress, Division of Cardiothoracic Surgery, Ohio State University Medical Centre, 460 W 12 th Avenue, Room 350C, Columbus, OH 43210, USA. Division of Endocrinology, Emory University School of Medicine, Atlanta, GA, USA. Atlanta Veterans Affairs Medical Centre, Decatur, GA, USA. Accepted 18 July 2008 2. Harris MT., Davis WW., Le NA., Eggleston B, Austin GE., Moussa M., Brown WV., 2007. Free oxygen radicals in whole blood correlate strongly with high-sensitivity C- reactive protein.. Journal of Clinical Lipidology, 1: 593-598. 3. Maria G., Pavlatou, Maria Papastamataki, Filia Apostolakou, Ioannis Papassotiriou, Nicholas Tentouris, 2009. FORT and FORD : 2 simple and rapid assays in the evaluation of oxidative stress in patients with type 2 diabetes mellitus.. a Department of Clinical Biochemistry, “ Aghia Sophia “ Children’s Hospital, 11527 Athens, Greece. b First Department of Propaedeutic Medicine, “ Laiko “ General Hospital, University of Athens, Medical School, Athens, Greece. Received 14 February 2009.
4. Palmieri B., lannitti T., Sblendorio V., 2009. Oxidative stress : how to detect it, cope with and treat basing on evidence?. The Internet Journal of Aesthetic and Antiaging Medicine Volume 2 Number 1. 5. Palmieri B., Sblendorio V., 2010. Current Status of Measuring Oxidative Stress. Advanced Protocols in Oxidative Stress II, Methods in Molecular Biology, Volume 594, pp. 3-17. 6. Dal Negro R W., Visconti M., Micheletto C., Pomari C., Squaranti M., Turati C., Trevisan F., Tognella S., 2003. Normal Values and Reproducibility of the Major Oxidative Stress obtained thanks to FORM System. GIMT, Italian Journal of Chest Diseases, 57 (3): 199-209. 7. Torri C., 2003. Oxidative Stress, Human Diseases and Biomarkers.. Clinical Laboratory International, 27(5): 28-29. 8. Riccioni G., Sblendorio V, Mancini B., Paolino I., Palumbo N., Guerra PA., Palmieri B., 2007. Relationship between Oxidative Stress parameters and Atherosclerotic Carotid plaque. World Conference of Stress. 23-26 August, Budapest, Hungary. 9. Lundstrom P., Fritz T., Krook A., Wandell P., Ostensson CG., Zierath J., Caidahl K., 2007. Oxidative Stress Related to Body Fat in women. ACC.07, American College of Cardiology, 56 th Annual Scientific Session, New Orleans, March 24-27. 10. Agnati L.F. and Leo G., 2002. Form and Obesity. Sect. of Physiology, Dept. of Biochemical Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, Italy. 11. Papastamataki M., Apostolakou F., Lazaropulou C., Matsiouri C., Ladis V., Kanavakis E., Kattamis A., 2007. FORT and FORD two novel assays for the assessment of oxidative stress in patients with thalassemia intermedia and sickle cell disease. Haematologica, 92, Supplement no. 1, Abstract 0806 pp. 301-302. 12. Sblendorio V., Palmieri B., Tesini EMC.; Vandelli C., 2007. Oxidative status in chronic Liver Disease. World Conference of Stress. 23-26 August, Budapest, Hungary. 13. Parmigiani S., Grassi L., Solari E., Torri C., Bacchi-Modena A., Bevilacqua G. J Perinat., 2003. Determination of Reactive Oxygen Species: Evaluation of a Simple Colorimetric Method. Med 31 ( Suppl 1): pp-264, 6 th World Congress of Perinatal Medicine. 14. Dal Negro RW., Visconti M., Trevisan F., Bertacco S., Micheletto C., Tognella S., 2008. Erdosteine enhances airway response to salbutamol in
patients with mild-to-moderate COPD.. Therapeutic Advances in Respiratory Disease, 2(5): 271-277. 15. Dal Negro RW., Visconti M., Micheletto C., Tognella S. Changes in Blood ROS, e-NO, and some pro-inflammatory mediators in bronchial secretions following erdosteine or placebo: A controlled study in current smokers with mild COPD. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics, 21: 304-308. 16. Visconti, M. Micheletto, Tognella, S., Trevisan, C. Pomari, RW. Dal Negro, 2008. Blood measures of Oxidative stress assessed in capillary blood: range of measures in normals and asymptomatic current smokers. European Respiratory Journal 22 ( Suppl 45): pp. 101S, 13 th ERS Annual Congress, 2003. 17. Verduri A., Del Donno M., Chetta A., Olivieri D., 2002. Oxygen Free Radicals Measurement in Capillary Blood in Healthy Subjects, Smokers and COPD Patients. Dip. Malattie Respiratorie, Universita degli Studi di Parma. Proceeding from 98 th International Conference, American Thoracic Society, May 17-22, Atlanta, Georgia, USA. Lampiran 3 SURAT PERSETUJUAN PENGOBATAN OZON Yang bertanda tangan dibawah ini : Nama : Umur : Jenis kelamin : Alamat : No. KTP : Telah memahami penjelasan yang diberikan oleh Dokter bahwa Pengobatan Ozon dapat digunakan untuk :
1. Mengobati penyakit Infeksi 2. Meningkatkan sistem imunitas tubuh 3. Memperbaiki sirkulasi darah Oleh karena itu dapat pula digunakan sebagai salah satu pengobatan alternatif untuk meningkatkan daya tahan tubuh dan atau pengobatan tambahan terhadap penyakit jantung koroner, dan penyakit pembuluh darah nadi dan vena. Kepada saya Dokter menerangkan bahwa Pengobatan Ozon dapat menimbulkan efek samping seperti pusing dan kadang-kadang ada reaksi. Namun hal tersebut jarang terjadi. Namun bila timbul efek samping akan diberikan pertolongan sebaik-baiknya.
Dengan menyadari manfaat dan kemungkinan terjadinya efek samping pada diri saya, maka risiko ini akan menjadi tanggung jawab saya sendiri, dan saya tidak akan menuntut. Sepenuhnya saya mengerti dan dengan sadar menyatakan persetujuan dengan menandatangani formulir ini tanpa tekanan dari pihak manapun.
Jakarta, Dokter,
Tanda tangan & nama jelas Perawat,
Tanda tangan & nama jelas
LAMPIRAN 4
Alat generator Ozon medis
Pasien,
Tanda tangan & nama jelas Keluarga Pasien,
Tanda tangan & nama jelas
LAMPIRAN 5
Proses Pengerjaan Ozon Major Autohaemotherapy
LAMPIRAN 6 Alat dan Bahan Pemeriksaan Radikal Bebas FORM
Lampiran 7. Ethical Clearance
