DOKTORI ÉRTEKEZÉS
TERMÉSZETES MÁTRIXOK SZERVES ÖSSZETEVİINEK MINİSÉGI - MENNYISÉGI ELEMZÉSE, TRIMETILSZILIL SZÁRMAZÉKOKKÉNT, EGYETLEN OLDATBÓL, GC-MS ELJÁRÁSSAL
Papp-Füzfai Zsófia Témavezetı: Perlné Dr. Molnár Ibolya egyetemi tanár Eötvös Loránd Tudományegyetem Kémiai Intézet, Analitikai Kémia Tanszék
Kémia Doktori Iskola Vezetı: Dr. Inzelt György Analitikai, kolloid- és környezetkémia, elektrokémia program Programvezetı: Dr. Záray Gyula
Budapest, 2008
Köszönetnyilvánítás
İszinte köszönettel tartozom mindazoknak, akik disszertációm elkészítésében segítségemre voltak:
Perlné Dr. Molnár Ibolya egyetemi tanárnak, témavezetımnek, iránymutatásáért, önzetlen segítségéért, bátorításáért és tanácsaiért, Dr. Orbán Miklós és Dr. Záray Gyula egyetemi tanároknak, az Analitikai Kémiai Tanszék egykori és jelenlegi tanszékvezetıinek, hogy kutatómunkámat lehetıvé tették, Dr. Lemberkovics Éva egyetemi tanárnak, aki a sárkányfő mintákat rendelkezésünkre bocsátotta, Dr. Boldizsár Imre tanársegédnek, a festıbuzér-minták elemzésében nyújtott nélkülözhetetlen segítségéért.
2
Tartalomjegyzék: 1. Bevezetés, célkitőzések ..........................................................................................................5 2. Rövidítések jegyzéke ..............................................................................................................6 3. Irodalmi áttekintés ..................................................................................................................7 3.1. A flavonoidok ..................................................................................................................8 3.1.1. Flavonoidok általános jellemzése, biológiai jelentıségük........................................8 3.1.2. A flavonoidok elemzésének kromatográfiás lehetıségei .........................................9 3.1.3. Flavonoidok meghatározása GC módszerrel ..........................................................10 3.1.3.1. Flavonoidok elválasztása és meghatározása származékkészítés nélkül ...11 3.1.3.2. Származékká alakított flavonoidok meghatározása..................................13 3.2. Antrakinonok gázkromatográfiás meghatározásának lehetıségei.................................18 3.3. Glikozidkötéső szacharidok trimetilszilil-származékainak GC-MS vizsgálata.............20 3.4. Az általunk vizsgált természetes mátrixok elemzési lehetıségei ..................................22 3.4.1. Citrus-gyümölcsök..................................................................................................22 3.4.2. Sárkányfő-fajok ......................................................................................................22 3.4.3. Festıbuzér...............................................................................................................23 3.4.4. Meggyek és ber gyümölcs ......................................................................................23 4. Kísérleti rész .........................................................................................................................25 4.1. Kémszerek .....................................................................................................................25 4.2. Minták............................................................................................................................25 4.3. Eszközök........................................................................................................................26 4.4. Módszerek .....................................................................................................................27 4.4.1. A reagens oldatok készítése....................................................................................27 4.4.2. A származékképzés.................................................................................................28 4.4.3. A modelloldatok készítése......................................................................................28 4.4.4. A minták elıkészítése az analízishez......................................................................28 4.4.5. A minták hidrolízise ...............................................................................................30 5. A kísérleti eredmények értékelése ........................................................................................31 5.1. Alapkutatás ....................................................................................................................31 5.1.1. Flavonoidok TMS-származékokkénti GC-MS elemzése: fragmentációs tanulmány ..........................................................................................................................................31 5.1.1.1. A választott flavonoidok TMS- és TMS (oxim)-származékainak fragmentációja.......................................................................................................31 5.1.1.2. A naringenin és a heszperetin fragmentációjának felhasználása a mennyiségi elemzésben ..........................................................................................36 5.1.1.3. A naringin, a heszperidin és a rutin optimális hidrolízis körülményeinek tanulmánya ............................................................................................................38 5.1.2. Antrakinonok szilil-származékká alakításának és fragmentciójának tanulmánya..41 5.1.2.1. A modell-antrakinonok TMS- és TBDMS-származékainak fragmentációja ...............................................................................................................................41 5.1.3. Különbözı szacharidok TMS- és TMS(oxim)-származékainak fragmentációs tanulmánya........................................................................................................................45 5.1.3.1. Nem redukáló glikozidkötést tartalmazó szacharidok TMS-származékainak elválasztása és fragmentációja..............................................................................45 5.1.3.2. A redukáló glikozidos kötést tartalmazó szacharidok TMS(oxim)származékainak elválasztása és fragmentációja ...................................................51 5.1.3.3. A TMS és TMS(oxim)-származékká alakított szacharidok mennyiségi elemzésének lehetıségei szelektív fragmentum ionjaik alapján ............................54 5.2. Analitikai alkalmazások ................................................................................................55 3
5.2.1. Modelloldatok válaszjelei.......................................................................................55 5.2.2. A grépfrút, citrom és narancs albedók és préselt levek összetevıinek minıségimennyiségi elemzése ........................................................................................................58 5.2.3. Sárkányfő-fajok összetevıinek minıségi-mennyiségi elemzése............................62 5.2.4. A festıgyökér-kivonatok összetevıinek minıségi-mennyiségi elemzése..............65 5.2.5. A három hazai meggyfajta és az indiai ber gyümölcs összetevıinek minıségimennyiségi elemzése ........................................................................................................72 5.2.5.1. A három hazai meggyfajta összetevıi.......................................................72 5.2.5.2. Az indiai ber gyümölcs összetevıinek minıségi-mennyiségi elemzése.....78 6. Új tudományos eredmények; Összefoglalás............................................................................80 7. Summary...............................................................................................................................81 8. Irodalmi hivatkozások ..........................................................................................................82 9. Az értekezés anyagából készült dolgozatok, poszterek és szakmai elıadások ....................89
4
1. Bevezetés, célkitőzések A karbonsavak, aminosavak, szacharidok és polialkoholok trimetilszilil(oxim)éter/észterekkénti, együttes, azaz egy oldatból, egyetlen felvételbıl történı egyidejő gázkromatográfiás-tömegspektrometriás (GC-MS) elemzése, mind az alapkutatás szintjén, mind
nagyszámú
természetes
mátrix
összetételének
meghatározásában
sokoldalúan
bizonyított [1-12]. A flavonoidok és az antrakinonok a növényvilágban elterjedt, biológiai/fiziológiai szempontból jelentıs vegyületek, ezért minıségi-mennyiségi elemzésük különbözı természetes mátrixokban, érdeklıdésre tarthat számot. Munkánk célja volt, hogy a meglévı analízisrendszerünket a flavonoidok és az antrakinonok csoportjával bıvítsük. Elsı lépésként modell-vegyületek elemzése útján, részletes fragmentumanalitikai tanulmány készítését terveztük: a flavonoidok és az antrakinonok trimetilszilil- és trimetilszilil (oxim)-származékainak GC-MS elemzése közbeni fragmentációját és a képzıdött fragmentum-ionok mennyiségi elemzésre alkalmasságát vizsgáltuk. Második lépésként, modell-vizsgálataink eredményét felhasználva, optimáltuk - a flavonoidok meghatározását különbözı természetes anyagokból, mint citrusfélék, sárkányfő fajok; és - az antrakinonok elemzését festıbuzér kivonatokban. A különbözı természetes mátrixok vizsgálata során, kevésbé ismert diszacharidok azonosítása vált szükségessé. A diszacharidok elemzésével kapcsolatos korábbi kutatási eredmények tanulmányozása után, célul tőztük ki a glikozidkötést tartalmazó, különbözı polimerizációs fokú szacharidok részletes fragmentumanalitikai vizsgálatát. A Központi Élelmiszeripari Kutatóintézettel közös kutatásunk célja a meggyek és az indiai ber gyümölcs érés- és tárolás közbeni összetétel-változásának követése, így az érésmenet, valamint a tárolás optimalizálása volt. Ennek érdekében módszerünk, azaz, a karbonsavak,
aminosavak,
szacharidok
és
polialkoholok
trimetilszilil (oxim)-
éter/észterekkénti, együttes, egy oldatból, egyetlen felvételbıl történı, egyidejő GC-MS elemzése segítségével a két természetes mátrix, a meggy és a ber gyümölcsök összetételét kívántuk feltérképezni.
5
2. Rövidítések jegyzéke ACN BSA
acetonitril N,O-bisz(trimetilszilil)acetamid BSTFA N,O-bisz(trimetilszilil)trifluoracetamid CE kapillárelektroforézis CEC kapilláris elektrokromatográfia D. Dracocephalum DAD diódasoros detektor DMF dimetil-formamid DMSO dimetil-szulfoxid FID lángionizációs detektor FL fluoreszcencia GC gázkromatográfia GC-MS gázkromatográfia tömegspektrometria GLC gáz-folyadék kromatográfia HMDS hexametil-diszilazán HPLC nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia LC folyadékkromatográfia MS tömegspektrometria MSD tömegszelektív detektor MTBSTFA N-metil-N-terc.butildimetilszilil trifluoracetamid
n.a. NMR
TMCS TMS
nem azonosított mágneses-magrezonancia spektroszkópia fázis-átviteli katalízis relatív standard deviáció Rubia tinctorum (festıbuzér) gyökér-kivonat szuperkritikus folyadék extrakció szilárdfázisú extrakció szilárdfázisú mikroextrakció szelektív fragmentum ion terc.-butildimetil-klórszilán trifluorecetsav trifluorecetsav-anhidrid tetrahidrofurán összion-áram vékonyréteg-kromatográfia tetrametil-ammóniumhidroxid trimetil-klórszilán trimetilszilil
TMSI
N-trimetilszilil-imidazol
UV
ultraibolya
PTC RSD RTGY SFE SPE SPME SFI TBDMSCl TFA TFAA THF TIC TLC TMAH
6
3. Irodalmi áttekintés A különbözı gyümölcsök, zöldségfélék és egyéb természetes alapú termékek (gomba, méz, gyógyszerhatóanyagot és/vagy ipari terméket szolgáltató növények, fák) összetételének jellemzésekor, a cukor- és polialkohol-tartalom minıségi-mennyiségi meghatározása mellett, ezek karbonsav-, esetenként aminosav-összetétele is fontos kiegészítı információul szolgál. Mindezek alapján, a fenti összetevık egy oldatból, egyetlen felvételbıl való, szelektív, minıségi és mennyiségi meghatározása, az elemzési munka hatásfoka, a feladatra fordított idı és anyagiak igénye szempontjából, kitüntetett jelentıségő. E feladat megoldásában a kromatográfia pótolhatatlan szerepe nem kétséges [13,14]. Az idevonatkozó irodalmi adatok ismeretében ugyancsak egyértelmő, hogy a nagyszámú, egymáshoz viszonyítva nagyságrendekkel eltérı koncentrációban jelenlévı, legkülönbözıbb funkciós csoportú összetevı egyidejő meghatározása – azonos származékként, egyetlen elválasztókolonnán és egyetlen detektor alkalmazásával – kizárólag a gázkromatográfia (GC), s a legkülönbözıbb funkciós csoportú vegyületek egyidejő trimetilszilil (TMS)-származékokkénti elemzése útján lehetséges [1-12]. A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) alkalmazásakor ugyanis, a nagyszámú, eltérı funkciós csoportú összetevı, egy oldatból való együttes mérése két különbözı detektor sorba kapcsolásával történhet: ilyen körülmények között is, a gázkromatográfiás elemzésekhez viszonyítva, az elválasztás hatásfoka/minısége rosszabb, a mérés szelektivitása és érzékenysége számottevıen kisebb, következésképp, az egy oldatból elemezhetı összetevık száma jelentısen kevesebb. Az elválasztást nehezíti, hogy a gyakorlati feladatok zömében a cukrok, cukoralkoholok és karbonsavak koncentrációja között nagyságrendbeli különbségek vannak [1-12]. A GC-meghatározások során a cukrok, cukoralkoholok, karbonsavak és aminosavak analízise TMS(oxim)-éter/észter származékokként egy oldatból, egyetlen detektorral oldható meg [7,9,13,14]. Amennyiben ez a detektor a tömegdetektor, és az elválás az egyes esetekben nem tökéletes, de az el nem váló összetevık szelektív fragmentum ionjai (SFI) ismertek, a kvantitatív elemzés lehetıségei jelentısen kedvezıbbek [1-12]. Ezt a korábban már sok esetben sikerrel alkalmazott, kedvezı analitikai eljárást kívántuk a flavonoidok és az antrakinonok csoportjával bıvíteni, melyhez elsı lépésként az irodalomban megtalálható gázkromatográfiás meghatározási lehetıségeket tekintettük át.
7
3.1. A flavonoidok 3.1.1. Flavonoidok általános jellemzése, biológiai jelentıségük A flavonoid elnevezés a szerves vegyületek egy csoportját jelöli, melynek tagjai hasonló
alapvázzal
rendelkeznek
(flavon,
flavanon, flavonol,
izoflavon,
katechin,
antocianidin; 1. Ábra), amelyhez általában a 3, 5, 7, 3’, 4’ szénatomokon hidroxil-, illetve metoxi-csoportok kapcsolódnak. A vegyületek részben szabadon (aglikon), részben glikozidjaik (glikozid) formájában fordulnak elı a különbözı növényekben, azaz egyes hidroxil-csoportokon keresztül valamilyen mono-, di-, vagy triszacharidhoz kapcsolódnak. Ebbıl következik az a nagy szerkezeti változatosság, amely a flavonoidok csoportját jellemzi: elméletileg több mint 2×106 flavonoid létezhet, mostanáig több mint 2×103 számút már sikerült azonosítani [15]. Csak a kvercetinnek több mint 179 glikozidja ismeretes [16,17].
1. Ábra A flavonoid vegyületcsoport alapvetı típusai 3' 4 + 2'
O
7 6 5
4
3
O
O
5'
2
6'
OH
OH
O
Antocianidinek
Katechinek
O
Flavonok
O
O
O
O
OH O Flavonolok
A
Flavanonok
flavonoidok
a
természetben
Izoflavonok
széles
körben
elterjedt
vegyületek.
Mikroorganizmusokban és algákban nem találhatók, moszatokból sikerült flavonoidokat izolálni [18]. Magasabbrendő növényekben (harasztok, nyitvatermık, zárvatermık) viszonylag nagy mennyiségben és igen változatos formában vannak jelen [18]. Néhány flavonoid-aglikon, mint a kempferol és kvercetin gyakori a növényvilágban, a zárvatermık mintegy 75%-a tartalmazza e vegyületeket. A harmadik legelterjedtebb a miricetin, mely a
8
zárvatermı növények 10%-ában elıfordul. A glikozidok közül a rutin (kvercetin-rutinozid) a leggyakoribb, a vizsgált növények 50%-a tartalmazza. A többi flavonoid kevésbé elterjedt, csupán bizonyos növénycsoportokra jellemzık. Az antocianidinek színes vegyületek, melyek a virágok, gyümölcsök nagy részének színét okozzák [18]. A flavonoidok élettani hatása sokáig ismeretlen volt. Biológiai jelentıségük felismerése magyar kutatók nevéhez főzıdik. 1936-ban Szent-Györgyi Albert izolálta a rutint, és Rusznyák Istvánnal együtt kimutatta hajszálér-permeabilitást és -törékenységet mérséklı hatását (P-vitamin) [19]. A rutin kémiai szerkezetét ugyancsak magyar kutatók, Zemplén Géza és Gerecs Árpád derítették fel [20]. Manapság a rutint önmagában, vagy C-vitaminnal kiegészítve (Rutascorbin) alkalmazzák gyógyászati célokra. A vegyületcsoport fontossága (azaz, hogy sokoldalú jótékony hatású természetes vegyületek) a felbecsülhetetlen fiziológiai/biológiai és gyakorlati tulajdonságaikból fakad [2122]. A polifenolos szerkezető és antioxidáns hatású flavonoidok (melyeket majdnem minden növényben, zöldségben és gyümölcsben fıként β-glikozidjaik formájában azonosítottak [22]) az élı szervezetben gyorsan felszívódnak [21]. Epidemiológiai tanulmányok szerint a flavonoid-tartalmú zöldségek és gyümölcsök, antioxidáns hatásuknak köszönhetıen védı hatásúak a rák, a szívinfarktus és a szív-koszorúér betegségek ellen. [22]. Flavonoidok antimutagén hatását bróm-benzollal kezelt patkányokon bizonyították [23].
3.1.2. A flavonoidok elemzésének kromatográfiás lehetıségei Az irodalmat áttekintve kitőnik, hogy nagyszámú dolgozat foglalkozik különbözı mátrixok flavonoid-tartalmának minıségi és/vagy mennyiségi elemzésével [25-62]. A flavonoidok teljes körő analízise, ideértve a részletes szerkezetet, a győrők helyzetét, a kettıskötések számát, a szabad és szubsztituált hidroxil-csoportokat és a győrő egyéb szubsztituenseit, az analitikai kémikusok valamint a fejlett elválasztási és azonosítási technikák (kromatográfia, mágneses-magrezonancia spektroszkópia {NMR}, tömegspektrometria {MS}, stb.) szoros összhangját igényli. Természetesen a legmegfelelıbb megoldás erre a feladatra a HPLC-MS-NMR készülék volna, mely ezeket az elvárásokat egyszerre teljesíti [24]. Sajnálatos módon csupán néhány laboratórium rendelkezik ilyen viszonylag új rendszerrel. Az egyszerőbb berendezések, mint HPLC, kapillárelektroforézis (CE), kapilláris elektrokromatográfia (CEC), GC, is hasznos információkat szolgáltathatnak a minıségimennyiségi meghatározás tekintetében. A kromatográfia kiegészítése egyéb, kapcsolt 9
detektor-rendszerekkel {HPLC: ultraibolya (UV) - fluoreszcens (FL), diódasoros detektor (DAD) - FL, UV(DAD)-MS; GC: lángionizációs detektor (FID), MS, MS-MS} hatványozottan növeli az analitikai eredmények bizonyosságát [25]. A közlemények áttekintése alapján megállapítható, hogy az elızetes mintaelıkészítési lépések, mint elválasztás/extrakció, az analízis megbízhatósága és reprodukálhatósága tekintetében
elsıdleges
fontosságúak
[25-28].
Flavonoidok
különbözı
természetes
mátrixokból való elkülönítése céljából, számos klasszikus és modern technikát vizsgáltak meg. Az irodalom összegzése alapján elmondható, hogy általánosan optimális körülmények nincsenek, mivel azok függnek a komponensektıl és a mátrixtól: elemzésük kivonatokból történik [25-28]. Mivel a flavonoidok a természetes mátrixokban mind szabad aglikonok, mind glikozidok formájában elıfordulnak, ily módon a szabad és glikozid kötéső flavonoidok egyenkénti meghatározása hidrolízissel követhetı [25]: (i) Az extraktum flavonoid-tartalmának kromatográfiás meghatározása hidrolízis nélkül, annak reményében, hogy a szabad és cukor-tartalmú flavonoidok egymás jelenlétében minıségileg-mennyiségileg meghatározhatók. (ii) A hidrolizált extraktumokból, különös tekintettel a TMS-származékok GC-MS elemzésére, nagyszámú összetevı meghatározása lehetséges. Természetesen, ebben az esetben a szabad aglikonok és a hidrolízis elıtt glikozid formában levı flavonoidok nem különíthetık el: mennyiségük számítható. Nagy molekulatömegük és az aglikonok hidrofób, a glikozidok hidrofil tulajdonságai miatt, a kromatográfiás javaslatok nagy része a HPLC-t és/vagy a kapcsolódó technikákat részesíti elınyben [25-28]. Jóllehet, a GC tömegdetektorral kiegészítve, az aglikonok, fıleg az összes többi összetevı szilil-származékkénti, egyidejő elemzése esetén, mással nem helyettesíthetı technika.
3.1.3. Flavonoidok meghatározása GC módszerrel Az irodalomban a flavonoidok GC meghatározására két megközelítés általános: (i)
Flavonoidok elválasztása és meghatározása származékképzés nélkül
(ii)
Flavonoidok elválasztása és meghatározása származékká (metil- és etilszármazékok; szilil-származékok) alakított formában.
10
3.1.3.1. Flavonoidok elválasztása és meghatározása származékkészítés nélkül
Ez a megközelítés a flavonoidok nagy molekulatömege miatt meglepı. Az irodalomban mégis találhatunk munkákat, melyekben különbözı természetes mátrixok flavonoidjait származékkészítés nélkül, GC-módszerrel elemzik [29-37]. A dolgozatokat az 1. Táblázat foglalja össze. A szerzık a származékká alakítás elhagyásának fı elınyeként, az elemzési idı csökkenését említik, tehát a flavonoidok és egyéb illékony összetevık gyors GC-elemzésére javasolják ezt a módszert [30-33, 35]. Ugyanakkor a kromatográfiás elválasztások 25-70 perc idıtartamúak, mely átlagosnak nevezhetı, továbbá hosszadalmas mintaelıkészítés elızi meg a méréseket: szuperkritikus-folyadék-extrakciót (SFE) [35], Soxhlet extrakciót [36], vagy egyszerő oldószeres extrakciót [30-37] alkalmaznak, majd a kivonatokat GC-FID [30-33,37] és/vagy GC-MS [29-36] rendszerbe injektálják. Egyetlen dolgozat esetében a szárításon, és az aprításon kívül nincsen mintaelıkészítési lépés, a porított mintát közvetlenül adagolják a pirolízis-tér-ionizációs tömegspektrométerbe [29]. A meghatározások az esetek többségében minıségi elemzésre korlátozódnak [2933, 35], három esetben találhatunk mennyiségi adatokat [34,36,37]. A minıségi elemzések során különbözı természetes mátrixokban, 3-26 flavonoid-aglikont azonosítottak egyéb összetevık mellett. Céljuk a különbözı növényfajok összetevıinek leírása volt, melyhez a minıségi azonosítás elegendı. A három mennyiségi elemzést tartalmazó dolgozat közül kettı tekinthetı valódi mennyiségi meghatározásnak [36,37], mivel a harmadik [34] esetben az azonosított 14 aglikon közül 12 esetében, csak nyomnyi mennyiséget tudtak megállapítani.
11
1. Táblázat Flavonoidok származékképzés nélküli gázkromatográfiás elemzése Mátrix
Mintaelıkészítés
Norvég lucfenyı tőlevelek
szárítás, aprítás
Propolisz
1g minta+15mL metanol 1h, extr. 3×petróleum, 3×dietiléter; egyesítés, beszárítás; + 100µL aceton, inj.: 1-2 µL
Arnica alpina ssp. attenuata virág/ Arnica angustifolia Vahl subsp. attenuata Thymus vulgaris levél, virág, szár Scutellaria baicalensis gyökér
Rezgı nyárfa
Kaempferia parviflora rizóma
Det
Azonosított flavonoidok
Ref
MS
kempferol, epikatechin, pungenin, izoramnetin
[29]
FID/MS
krizin, tektokrizin, galangin, pinocembrin
[30]
FID/MS
21 aglikon/ 26 aglikon
[31-33]
MS
14 aglikon
[34]
kol: 30m×0,25mm HP5MS; hım.pr.: 100oC (2min) 100-280oC (10oC/min) 280oC (15min)
MS
wogonin, baikalin, baikalein
[35]
kol: 10m×0,25mm DBXLBitd; hım.pr.: 50o (3min) 50-340oC (10oC/min) 340oC (36min) 340-360oC (10oC/min)
MS
4 aglikon
[36]
kol: 30m×0,32mm HP50+ hım.pr.: 255°C (2min) 255-260°C (1°C/min) 260°C (15min) 260-268°C (5°C/min) 268-269°C (0,5°C/min) 269°C (3min) 269-270°C (0,5°C/min) 270°C (5min) 270-277°C (1°C/min) 277°C (10min)
FID
11 aglikon
[37]
Elválasztás pirolízis: (100µg por) 50-700oC (12min), kol: 30m×0,25mm DB1730N / 30m×0,32 DB130W; hım.pr.: 40200oC (5oC/min) 200280oC (10oC/min) kol: 9m×0,25mm SE54; hım.pr.: 80-280oC (20oC/min) 280-300oC (2oC/min) 300oC (10min)
metilén-klorid extraktum metanolban oldható frakciója – gél-kromatográfia (SephadexLH-20)
kol: 25m×0,25mm Permabond OV-1; izoterm: 270oC
szárítás, aprítás, diklórmetán-extraktum
kol: 30m×0,25mm (5% fenil-metil-szilikon); hım.pr.: 50oC (0,5min) 50-300oC (10oC/min)
szárítás, aprítás, 1g minta – SFE (10mL cartridge), 70% metanol, 20mL CO2(l) 3×15min – 3×20mL kül. oldószerek 30min liofilizálás, Soxhlet extr. 8h, 200mL aceton, 4-5 ciklus, frakciók egyesítése, lepárlás, lefúvatás N2 árammal, maradék ~1mL
szárított rizóma-por +95% etanol (4nap, szobahım.) – szőrés vákuumban, fagyasztva-szárítás, metanolos törzsoldat
Jelölések: Det = detektálás, Ref = referencia; kol = kolonna; hım.pr. = hımérséklet-program; extr. = extrakció, szobahım. = szobahımérséklet, SFE = szuperkritikus-folyadék-extrakció, FID = lángionizációs detektor; MS = tömegdetektor
12
3.1.3.2. Származékká alakított flavonoidok meghatározása a.) Flavonoidok meghatározása metil- és etil-származékokként
A flavonoidok meghatározása metil- és etil-származékokként nem elterjedt módszer, melyet a témában született dolgozatok csekély száma bizonyít [38-40]. A három dolgozat közül a legkorábbi [38], kizárólag elméleti jelentıségő: perdeuterometilezett modell-flavonoidokat vizsgáltak GC-MS módszerrel. A flavonoid-glikozidokat perdeutero-metilezés után, 2 N kénsavoldattal hidrolizálták, majd ezt követıen éterben diazoetánnal etilezték. Így a cukor-egység aglikonhoz kapcsolódási helyét állapították meg (a cukoregységet nem mérték), és felderítették az aglikonok fragmentációját. A módszer gyakorlati alkalmazását nem írták le. A másik két dolgozatban természetes mátrixok fenolos összetevıit elemezték [39,40]. Diazo-metán [39] és metil-jodid [40] alkalmazásával képzett metil-származékok oldatait injektálták a GC-MS rendszerbe. Fázis-átviteli katalízist (PTC) tanulmányoztak a metil-jodid esetében: extrakciót és származék-képzést egyesítı módszert dolgoztak ki [40]. Így, különbözı növényi kivonatok nyolc fenolkarbonsav és négy flavonoid (naringenin, galangin, kempferol, luteolin) összetevıjének minıségét és mennyiségét mérték. A propolisz-kivonat fenolos összetevıit metil-származékként, GC-MS eljárással mérték [39]. A flavonoid származékok kis GC-MS válaszjelei miatt, a mennyiségi meghatározáshoz HPLC-t alkalmaztak UV detektálással.
b.) Flavonoidok meghatározása szilil-származékokként
A gázkromatográfiás elemzések során a vizsgált anyagok illékonyságának növelésére, a különbözı szilil-származékokká alakítás a legelterjedtebb módszer, melyre a flavonoidok meghatározásában is sok példát találunk [41-62]. A dolgozatokat a 2. Táblázat foglalja össze. Az elemzések során, egy kivétellel [60], TMS-származékokat képeznek, melyeket hexametil-diszilazán (HMDS) [41,43-45], N,O-bisz(trimetilszilil)-acetamid (BSA) [42,52,53] és N,O-bisz(trimetilszilil)-trifluoracetamid (BSTFA) [45-51,54-59,61,62] szililezıszerekkel állítanak elı, és az esetek egy részében trimetil-klórszilán (TMCS) katalizátort alkalmaznak [41-44,55,62].
Az
egyetlen
kivétel,
butildimetilszilil-trifluoracetamidot
ahol
a
(MTBSTFA)
származékképzéshez alkalmaznak,
és
N-metil-N-terc.-
ekkor
terc.-butil-
13
dimetilszilil-származékokat
(TBDMS)
kapnak
[60].
A
származékképzési
reakciót
szobahımérsékleten [41], vagy magasabb hıfokokon (50-120oC), eltérı ideig vezetik [42-62], a körülmények esetenként különböznek. A származékképzést valamennyi mátrix esetében kivonási lépés elızi meg, mely egyszerő oldószeres extrakció [44-52,54-56,59,61,62], Soxhlet extrakció [42,57] vagy szilárd fázisú extrakció (SPE) [53,60]. Két esetben a kivonást sósavas [52,53] vagy enzimes hidrolízis [52] követte. Modellvizsgálatok során a származékká alakított flavonoidok kromatográfiás és/vagy tömegspektrometriás tulajdonságait kutatták [41,43,58], melyek közül a legkorábbi dolgozat 1966-ban született. A többi vizsgálat célja valamilyen növény, vagy növényi kivonat (Sophora japonica, Alpinia japonica, nyárfa fajok, propolisz, eurázsiai varjúháj, kövirózsa, szentjánoskenyér, Croton hemiargyreus) összetételének minıségi és/vagy mennyiségi leírása [42,44-52,56-57,59], vagy biológiai minták (vérplazma, vizelet, széklet) flavonoidkoncentrációjának idıbeli követése volt [53-55,60-62]. Az elemzések a 2. Táblázat „Azonosított flavonoidok” oszlopában feltüntetett összetevıkre terjedtek ki, egyéb összetevıket (karbonsavak, cukrok, cukoralkoholok, aminosavak, stb.) nem mértek. Fıként a korai dolgozatokban minıségi elemzéseket találunk [41-50,59], a többi esetben az összetevık mennyiségét is mérték [51-58, 60-62]. Hasonlóképpen, FID detektálásra is a korai cikkek között találunk példát [41,42,51], a többi dolgozatban MS detektálást alkalmaznak [45-50, 53-62], esetenként FID mellett [43,44,52]. A dolgozatok
áttekintése után megállapítható, hogy a flavonoidok szilil-
származékokként elemzése mindenkor eredményes volt, jóllehet fragmentumanalitikai tanulmányokat, a vizsgált mátrixok esetében, nem tartalmaznak. Ugyanakkor a fenolos összetevık mellett más anyagokat (cukrok, karbonsavak, aminosavak) nem mértek.
14
2. Táblázat Flavonoidok minıségi-mennyiségi meghatározása szililszármazékokként, gázkromatográfiás módszerrel Mátrix
Mintaelıkészítés
Modellvegyületek, szılılé, burgundi bor, bodzakivonat
6-10mg + 1mL piridin+0,2mL HMDS+0,1mL TMCS (50°C, 10min), majd 30mg minta+0,5mL DMSO+0,2mL HMDS+0,1mL TMCS (melegítés nélkül) Extr.:100mg drog+10mL metanol reflux (2h)+újabb 10mL metanol reflux(4h)-lepárlás→ +20mg koleszteril-benzoát+2mL piridin+2mL BSA+0,6mL TMCS (60°C, 2h) Közv.: 100mg drog+20mg koleszterilbenzoát+3mL piridin+2mL BSA (120°C, 6h) 1mg modellvegyület+0,1mL TMCS+0,2mL HMDS+100µL DMSO+150µL THF (80°C, teljes oldódásig és elszíntelenedésig) [43] 50g fagyasztott gyümölcs+100mL metanol (5h, szobah.) →lepárlás, liofilizálás→50mL metanolban oldás→0,5mL lepárlás +0,2mL TMCS+0,4mL HMDS+0,03mL dioxán+0,015mL THF (60°C, 30min) [44]
Sophora japonica (bimbó) Alpinia japonica (mag)
Modellvegyületek, Vaccinum myrtillus
Nyárfa-fajok
Propolisz
Elválasztás
Det
Azonosított flavonoidok
Ref
kol: töltetes oszlop: 6 láb ¼ inch SE-30 hım.pr.: 50-260°C (többféle program)
FID
pelargonidin, cianidin, delfinidin, malvidin, petunidin
[41]
kol: töltetes oszlop: 1/1,5/2m×3,0mm OV-1/OV-17/OV-25/OV-210/OV-225 hım.pr.: izoterm: 210°C (flavonoidok)/260°C (flavonoidglikozidok)
FID
alpinon, izalpinin, 3acetalpinon, kvercetin, rutin
[42]
kol: 0,5m×2mm OV-101 hım.pr.: 200320°C (10°C/min) [43] 20m×0,3mm SE-52 hım.pr.: 280-310°C (1°C/min) [44]
FID/MS
4db rügy+1mL dietiléter (10s), lepárlás+50µL piridin+100µL BSTFA(1%TMCS) (100°C, 30min)
kol: 50m×0,3mm OV-1, 25m×0,32mm OV-1, hım.pr.: 85-310°C (3°C/min)
MS
1g minta+20mL 70% etanol (éjszaka) →lepárlás; Szárm.: 1.5mg extrakt+95µL BSTFA (65°C,30min)
kol: 9m×0,25mm, hım.pr.: 80-280°C (20°C/min) 280-300°C (2°C/min) [49], 40-250°C (40°C/min) 250-390°C (12°C/min) 390°C (20min)
FID [51] MS [56]
petunidin, petunidin-glükozid, petunidin-di-glükozid, malvidin, malvidin-glükozid, petunidin-di-glükozid, cianidin, cianidin-glükozid, cianidin-xilozilglükozid, cianidin-di-glükozid, cianidinxilozilglükozid-glükozid fenolkarbonsavak, katechin [45], fenolkarbonsavak, pinocembrin, pinostrombin, pinobanksin, tektokrizin, krizin, galangin, naringenin, katechin, luteolin, taxifolin [46-50] pinocembrin, galangin, kávésav, β-fenil-etil-kaffeát
[43] [44]
[4550]
[51] [56]
15
2. Táblázat folytatása Mátrix
Eurázsiai varjúháj, kövirózsa Gingko biloba flavonoidjai emberi vizeletben Gingko biloba flavonoidjai gyógyszerészeti készítményekben Biológiai folyadékok
Mintaelıkészítés 10g szárított levél+40g aceton - centr., felülúszóbepárlás→Vizes oldat híg. H2O 10 g-ra, mosás; Hidr.: extr.+ 10 mL 2 M HCl (100°C,1h) elpárologtatás, extr. dietiléter (3 mL × 15 mL); Szárm.: szárított extrakt+0.5-1mL piridin →100µL+100µL BSA (70°C, éjszaka) hidr.: 1mL vizelet+0.5 mL 3M HCl (80°C, 1h), vagy β-glükuronidáz+1mL puffer (pH 8) → SPE; Szárm.: maradék+0.2mL BSA (70°C, 30min) 40mg extrakt+5mL 1M HCl 20%metanol (85°C, 1h); keveréses extr. 5mL EtAc (1min vortex, 5min szonikálás, 10min centr.) Szárm.: 50µL szerves fázis+250µL DMF + 250µL BSTFA cont 1%TMCS(115°C, 45min) 100 µL szérum/vizelet+0.8mL EtAc, majd 0,5mL EtAc → centr. (5min, 3500g); EtAc fázis-szőrés. (Na2SO4); Szárm.: 100µL EtAC+100µL BSTFA (vortex 30s, 70°C, 1h)
Elválasztás
Det
Azonosított flavonoidok
Ref
FID/MS
kempferol, herbacetin, sezangulaterin, kvercetin, gosszipetin, konikulatuzin, izoramnetin, limocitrin, miricetin, hibiszcetin
[52]
MS
kvercetin, kempferol
[53]
kol: 20m×0,20mm HP Ultra 1 hım.pr.: 80-245°C (25°C/min) 245°C (25,5min) 245-270°C (60°C/min) 270°C (8min)
MS
bilobalid, ginkgolid A, ginkgolid B, ginkgolid C, kempferol, izoramnetin, kvercetin
[55]
kol: DB-5I; hım.pr.: 120°C (2min) 120300°C (20°C/min) 300°C (6min)
MS
trans-rezveratrol, katechin, fizetin, kvercetin
[54]
[57]
kol: 10m×0,32/0,25mm hım.pr.: 125-325°C (4°C/min)
kol: 30m×0,32mm Restek RTX-5 hım.pr.: 160-290°C (20°C/min) 290320°C (5°C/min)
Szentjánoskenyér rost
- 10g+100ml H2O (18h, szobah.) → centr. (30min, 5000g)-felülúszó - 10g - Soxhlet extr.: hexán 3h, metanol 3h (ezt alkalmazták nagy mennyiségő mintához) Szárm.: 10µL extrakt+100µL BSTFA (37°C, 30min)
kol: 30m×0,25mm HP 5MS hım.pr.: 100-270°C (4°C/min) 270°C (20min)
MS
fenolkarbonsavak, apigenin, krizoeriol, tricetin-glükozid, kempferol-ramnozid, kvercetin-ramnozid, kvercetinarabinozid, miricetinramnozid, miricetin-glükozid, naringenin, genistein
Modellvegyületek, Croton hemiargyreus levelei
1mg std. + 500µL BSTFA (60°C, 30min + 100°C, 5min/ 100°C, 72h)
kol: 17m × 0,20mm HP-1 hım.pr.: 40-250°C (40°C/min) 250360°C (12°C/min) 360°C (5min)
MS
heszperidin, krizin, apigenin, kvercetin
[58]
Török propolisz
+70% etanol (24h), lepárlás →5mg+50 µL piridin+75µL BSTFA (80°C, 20min)
kol: 23m×0,25mm HP 5MS hım.pr.: 100-310°C (5°C/min) 270°C (20min)
MS
fenolkarbonsavak, pinocembrin, pinobanksin, krizin, galangin
[59]
16
2. Táblázat folytatása Mátrix
Emberi széklet
Mintaelıkészítés
Elválasztás
10 mL fermentum→SPE(C18)-lepárlás Szárm.: +50µL acetonitril+20µL TBDMS(1%TBDMSCl) (30min), beszárítás→20µL undekán [60] centr. 30000×g-felülúszó, szőrés, enzimes kezelés→Szárm.: +10µL ACN+50µL BSTFA (1%TMCS) (50°C, 4h) [61] 300µL plazma extr. 3×0,5mL EtAc, vortex (1min)
Emberi vérplazma
+0,5M HCl (pH→2) EtAc fázis lepárlás Szárm.: +50µL BSTFA+TMCS (70°C, 4h)
Det
Azonosított flavonoidok
Ref
kol: 15m×0,25mm DB-1701 hım.pr.: 150°C (1min) 150-300°C (20°C/min) [60] kol: 12m×0,2mm DB-5 hım.pr.: 100°C (1,5min) 100-140°C (10°C/min) 140°C (2min) 140-150°C (15°C/min) 150-160°C (2°C/min) 160215°C (15°C/min) 215-262°C (20°C/min) 262°C (4min) 262-290°C (10°C/min) 290°C (3min) [61]
MS
fenolkarbonsavak, naringin, rutin [60] naringenin, kvercetin, formononetin, (epi)katechin, izoramnetin, apigenin, kempferol, rezveratrol, daidzein, floretin, diozmetin, eriodiktiol, biochanin, genistein, hesperetin [61]
[60] [61]
kol: 30m×0,35mm DB-5 hım.pr.: 80°C (1min) 80-220°C (10°C/min) 220-310°C (20°C/min) 310°C (6min)
MS
fenolkarbonsavak, rezveratrol, (epi)katechin, kvercetin, miricetin
[62]
Jelölések, mint az 1. Táblázatban, továbbá: hidr. = hidrolízis, szárm. = származékkészítés, centr. = centrifugálás, híg. = hígítás, std. = standard, SPE = szilárd fázisú extrakció, HMDS = hexametil-diszilazán, TMCS = trimetil-klórszilán, BSA = N,O-bisz(trimetilszilil)-acetamid, BSTFA = N,O-bisz(trimetilszilil)-trifluoracetamid, TBDMS = N-metil-N-terc.-butildimetilszilil-trifluoracetamid, TBDMSCl = terc.-butildimetil-klórszilán, DMSO = dimetil-szulfoxid, THF = tertahidrofurán, EtAc = etil-acetát, DMF = dimetil-formamid, ACN = acetonitril
17
3.2. Antrakinonok gázkromatográfiás meghatározásának lehetıségei Gázkromatográfiás módszerrel a festıbuzér antrakinonjait eddig nem vizsgálták, ezért a növény- és gombavilágban elıforduló egyéb antrakinon-származékok gázkromatográfiás elemzésével foglalkozó irodalmat tekintettük át (3. Táblázat). A közlemények alapján az antrakinonok származékkészítés nélkül [70-72], vagy származékká alakítás után [63-68,73-75] egyaránt elválaszthatók. A származékkészítéshez számos módszert alkalmaznak, melyeknél a körülmények (reagens, hıfok, idıtartam) különbözıek, és ezeket nem optimálták. Szilil-származékok elıállításához HMDS-t [63,66], BSA-t [64,65,67,68], és BSTFA-t [74,75] használnak. Egy esetben általánosan nem elterjedt szililezési módszert is felhasználtak, reduktív trimetilsziliezést végeztek N-metil-N-trimetilszilil-trifluoracetamiddal ammónium-jodid katalizátor jelenlétében [69]. Az MTBSTFA reagenst az antrakinonok esetében nem alkalmazták. Egyedi módszert, vizes közegben tetrametil-ammónium-hidroxid jelenlétében, pirolízist használtak modell-vegyületek vizsgálatára, mellyel céljuk módszerkidolgozás volt régi mővészi alkotások festékanyagainak vizsgálatához [73]. A meghatározások nagy része modellvizsgálat [63-67,69,73,75], ahol a GC elválasztás körülményeit, illetıleg a vegyületek fragmentációját tanulmányozták [64,66,69]. A fragmentációs vizsgálat, egy esetben [67] a képzıdött fragmentum-ionok, és intenzitásuk felsorolására korlátozódott, s nem terjedt ki a fragmentum-ionok képzıdésének és összetételének magyarázatára. A további két esetben a kutatások [66,69] reduktív szililezés során keletkezett antrakinon-származékokra vonatkoztak. Ekkor az antrakinonok két kettıs kötéső oxigénjéhez is kapcsolódnak TMS-csoportok, emiatt fragmentációjuk eltér az általunk vizsgált termékektıl. A modellvizsgálatok nagy része minıségi elemzés volt [63-67, 73], mennyiségi adatokat két közleményben adtak meg [69, 75]. A többi dolgozatban az antrakinon ipari elıállítását követik [70], kozmetikumokat [68], aloe-tartalmú termékeket [74], környezeti mintákat [71] és egyéb növényi mintákat [72] vizsgálnak. Ezekben az estekben, egyet kivéve [70], mintaelıkészítésként kivonási módszert is alkalmaznak [68,71,72,74]. Valamennyi mátrix vizsgálatában mennyiségi eredményeket közölnek. A detektálás kétféle: FID [63-65,67,70], valamint az informatívabb MS [66,6869,71-75]. A mért antrakinonok száma 1 és 37 között változott.
18
3. Táblázat Antrakinonok minıségi-mennyiségi meghatározása gázkromatográfiás módszerrel Mátrix Modellvegyületek Modellvegyületek Modellvegyületek Modellvegyületek Modellvegyületek Kozmetikumok Modellvegyületek A. ipari elıállítás követése Környezeti minták Növényi minták
Mintaelıkészítés Szárm.: 1-2 mg minta+0,1 ml piridin+0,1 ml HMDS + 0,05 ml TMCS, összerázás 30s – 10min állás 25°C Szárm.: 1.: 50 mg minta+10 ml CHCl3+1 ml BSA, keverés 1min + 3 csepp TFAA; 2.: 50 mg minta+10 ml nitrobenzol + 1ml TFAA keverés + 3 csepp piridin Szárm.: 1-2 mg minta+100µl BSA/TMCS=5/1, 30s rázás – 5min állás 25°C Szárm.: 10 mg minta+1.0 ml piridin+0.2 ml HMDS + 0.1ml TMCS, 80 °C(2h)+25°C (8h); red. szil. (10mg Zn) Szárm.: 0.1-1.0mg minta+TMSI:BSA:TMCS= 3:3:2 Extr.: 10mL alkoholos oldat – lepárlás +20mL víz ODS cartridge → eluátum; Szárm.: eluátum lepárlás +200µl ACN + 200µl BSA, 90 °C, 60perc Szárm.: minta + MSTFA, ammónium-jodid, 60°C, 60min (reduktív szililezés) – Extr.: 5g iszap + 40mL CH2Cl2-aceton (5:1) 15min 125°C → 1mL rész – tisztítás 5g szilikán → acetonos kivonat; Szárm.: – Extr.: homogenizálás, fagyasztva szárítás – 1g minta +100mL 0,2% NaHCO3 – ACN (6:4) – 40min ultrahangos fürdı – szőrés – extrakció: CHCl3; Szárm.: –
Modellvegyületek
Szárm.: minta+3 µl TMAH, 10s pirolízis 700°C
Aloe tartalmú termékek (ital, gél, por, kapszula)
Extr.: 1mL termék +0,5mL etanol+1mL telített NaCl oldat+2mL EtAc-metanol (9:1) – vortex (30s)- centr. – szerves fázis – lepárlás – oldás: 0,5mL EtAc-metanol (9:1); Szárm.: kivonat+100 ml BSTFA, 70°C, 15 perc Szárm.: minta+1-3 µl BSTFA, termál deszorpció (In-tube szililezés)
Modellvegyületek
Det
Azonosított A.
Ref
kol: töltetes oszlop: 2,25m×4mm 1,5% SE-30 on Chromosorb W; izoterm: 240°C
Elválasztás
FID
18
[63]
kol: töltetes oszlopok: OV-101, OV-1,UC-W98, OV-17
FID
9
[64]
kol: töltetes oszlop: 3% SE-30 on Gas-Chrom Q hım.pr.: 225°C (8min) 225-280°C (5°C/min) kol: 25m SE-54 SCOT hım.pr.: 70°C (2min) 70-250°C (8°C/min) kol: 10m×0,32mm 5 CB hım.pr.: 200°C (3min) 200-260°C (5°C/min) kol: töltetes oszlop: 1m×2mm, 2% OV Chromosorb W AW; hım.pr.: 250°C (2min) 250280°C (16°C/min) 280°C (4min) kol: 25m×0,2mm OV-1; hım.pr.: 80°C (3min) 80280°C (25°C/min) 280°C (10min) kol: töltetes oszlop: 6 láb ⅛ inch 15% OV-17 on Chromosorb W AW; hım.pr.: izoterm 250°C kol: 30m×0,25mm DB-5; hım.pr.: 90°C (0,1min) 90-280°C (6°C/min) 280°C (1min) 280-300°C (20°C/min) 300°C (20min)
FID
13
[65]
MS
9
[66]
FID/MS
37
[67]
MS
1
[68]
MS
10
[69]
FID
1
[70]
MS MS-MS
4
[71]
kol: 15m×0,25mm DB5 izoterm: 260°C
MS
3
[72]
kol: 30m×0,25mm SPB5; hım.pr.: 50°C (2min) 50-300°C (5°C/min)
MS
3
[73]
kol: 20m×0,18mm DB-1 (majd 10m×0,18mm DB1); hım.pr.: 150°C (1min) 150-280°C (30°C/min)
MS
2
[74]
kol: 30m×0,25mm HP-5MS; hım.pr.: 50°C (3min) 50-300°C (10°C/min)
MS
9
[75]
Jelölések, mint az 1-2. Táblázatban, továbbá: A. = antrakinon, red.szil. = reduktív szililezés, CHCl3 = kloroform, CH2Cl2 = diklórmetán, TFAA = trifluorecetsavanhidrid, TMSI=N-trimetilszilil-imidazol; MSTFA = N-metil-N-trimetilszilil-trifluor-acetamid, TMAH = tetrametil-ammónium-hidroxid
19
3.3. Glikozidkötéső szacharidok trimetilszilil-származékainak GC-MS vizsgálata A glikozidkötéső, különbözı polimerizációs fokú szacharidok minıségi-mennyiségi meghatározására jó lehetıséget nyújt a TMS-származékaik GC-MS elválasztása. Az egylépéses szililezés kiváló a nem redukáló cukrok esetében, melyek egyetlen terméket adnak. A redukáló szacharidok szililezése elméletileg 6 termékhez vezethet: a győrős α és βpiranóz/furanóz anomer párok és a két nyílt láncú forma keletkezik. Ez a szükségtelen konformációs információ lehetetlenné teszi több szacharid egymás melletti elválasztását. Amennyiben a kétlépcsıs származékkészítést követjük – elsı lépésben oximmá/metoximmá alakítás, második lépésben szililezés – sokkal egyszerőbb képet kapunk: szin (Z) és anti (E) oximokat/metoximokat, melyek e cukrok redukáló tulajdonságát jelzik. Az MS detektor nagy segítséget nyújt a különbözı polimerizációs fokú szacharidok minıségi-mennyiségi meghatározásában, fıként abban az esetben, ha egy természetes mátrixban több azonos polimerizációs fokú szacharid található egymás jelenlétében. Mint ismeretes, ezek egymástól a hidroxil-csoportjaik helyzetében különböznek, így SFI szerinti azonosításuk, hasonló fragmentációjuk miatt, nem egyszerő. Korai irodalmi adatok [76-83] jelentısége, hogy megalapozták a mai fragmentációs kutatásokat. A közleményekben a TMS-aldozil- [76], TMS-fruktozil-oligoszacharidokat [77], oligoszacharidok TMS-származékait [78], oligoszacharid alditolokat [78,79], deutériummal jelzett monoszacharidok TMS-származékait [80], 2-ketohexózok TMS-étereit [81], cukrok és hidroxi-savak kromatográfiás elemzését [82], mono- és diszacharidok TMS-metiloximjait [83] vizsgálták. A tanulmányok néhány kivételtıl eltekintve [80,82,83] a vizsgált anyagok közvetlen fragmentációján alapultak, nem hasznosították a kromatográfiás elválasztás elınyeit. A kutatások fı célja oligoszacharidok tagszámának meghatározása, a kérdéses szacharid molekulatömegének megállapítása, a glikozidos kötés helyének megállapítása volt. Napjaink kutatásainak fı célja (4. Táblázat), hogy a szacharidokat TMS- [84-86], TMS-oxim [1-9,87-26] és permetilezett [94-96] származékokként különbözı mátrixokban meghatározzák. A dolgozatokban a fragmentációt kvantitatív célokra csak korlátozottan használták [84,9,88,90], s nem hívták fel a figyelmet a glikozidkötéső, nem redukáló szacharidok TMS-származékainak, s a redukálók TMS-oxim-származékainak eltérı viselkedésére.
20
4. Táblázat Legújabb kutatási eredmények a diszacharidok GC-MS elemzésében Mátrix
Származékképzés
Alma, ıszibarack, körte, édesburgonya
- 0,5mL NH2OH.HCl (2,5 % m/v)/piridin 75oC, 30min - 0,5mL BSTFA(1% TMCS): 75oC, 20min
Streptococcus pneumoniae poliszacharidok
permetilezés, 0,2mL Trisil reagens: 80oC, 20min
Elválasztás kol: 15m×0,25mm DB1; hım.pr.: 150 oC (4min) 150-192oC (4oC/min) 192oC (0,5min) 192-240oC (10oC/min) 240oC (7min) kol: 30m×0,25mm HP-5; hım.pr.: 50oC (2min) 50-150oC (30oC/min) 150-220oC (3oC/min) 220-300oC (30oC/min) 300oC (10min)
Det
Azonosított vegyületek
Ref
MS
nem illékony savak, cukrok
[84]
MS
monoszacharidok
[85, 94,95]
mono-, anhidro-, di-, triszacharidok, cukoralkoholok mono-, di-, triszacharidok alifás és aromás karbonsavak, aminosavak
Környezeti minták (talaj, üledék)
20-25µL BSTFA (1%TMCS) + 10µL piridin 70 oC, 3h
kol: 30m×0,25mm DB5-MS; hım.pr.: 65oC (2min) 65-300oC (6oC/min) 300oC (15min)
MS
Modellvegyületek, méz, gombapoliszacharidok, kajszibarack,
- 0,5mL NH2OH.HCl (2,5 % m/v)/piridin 70oC, 30min - 0,9mL HMDS + 0,1mL TFA 100oC,60min
kol: 30m×0,25mm DB-5; hım.pr.: 60oC (2min) 60-120oC (20oC/min) 120-155 oC (6oC/min) 155oC (10min) 155-250oC (13oC/min) 250oC (12min) 250-330oC (20oC/min) 330oC (10min)
MS
Mesterséges táplálék
- 0,35mL NH2OH.HCl (2,5 % m/v)/piridin 75oC, 30min - 0,35mL HMDS + 35µL TFA: 45oC,30min
kol: 25m×0,25mm OV-101; hım.pr.: 180-280oC (2oC/min) 280oC (1min) 280-290oC (10oC/min) 290oC (15min)
FID
mono- és diszacharidok
[87]
Modell diszacharidok, méz
- 0,35mL NH2OH.HCl (2,5 % m/v)/piridin 75oC, 30min - 0,35mL HMDS + 35µL TFA: 45oC,30min
kol: 30m×0,25mm SPB-1 / 25m×0,25mm Rtx-65TG; hım.pr.: 1. 100oC (1min) 100-170oC (70oC/min) 170oC (10min) 170215oC (15oC/min) 215-280oC (2oC/min) 280oC (20min) 2. 170oC (10min) 170-215oC (15oC/min) 215-240oC (1oC/min) 240-320oC (5oC/min) 320oC (20min)
MS
diszacharidok
[88-91]
Festıbuzér, grépfrút, citrom, narancs
- 0,5mL NH2OH.HCl (2,5 % m/v)/piridin 70oC, 30min - 0,9mL HMDS + 0,1mL TFA 100oC,60min
kol: 30m×0,25mm DB-5; hım.pr.: 150oC (4,5min) 150-330oC (10oC/min) 330oC (7min)
MS
mono-, di-, triszacharidok, alifás és aromás karbonsavak, aminosavak, antrakinonok, flavonoidok
[92,93]
Szılılé
10 µL vizes minta + 0,7mL DMSO + NaOH – keverés (szobahım.) + MeI keverés (10min) → extr.: CH2Cl2
kol: 30m×0,25mm DB-5; hım.pr.: 100oC (2min) 100-140oC (3oC/min) 140-240oC (10oC/min) 240oC (10min)
MS
mono- és diszacharidok
[96]
Jelölések, mint az 1-3. Táblázatban, továbbá: NH2OH.HCl = hidroxilamin-hidroklorid, MeI = metil-jodid, TFA = triflourecetsav
21
[86]
[1-9]
3.4. Az általunk vizsgált természetes mátrixok elemzési lehetıségei
3.4.1. Citrus-gyümölcsök A citrusok elemzésében a gázkromatográfia alkalmazása korlátozott: az illékony összetevıket [97-108] szilárd-fázisú-mikroectrakciót (SPME) követıen [97-100], préselt lébıl [97-99] és narancs-párlatból [100], származékkészítés nélkül mérték. Az illékony illatanyagokat a gyümölcs-levekbıl ioncsere-kromatográfia [101] segítségével, dietiléter/npentán=2/1 elegyével [102], vagy speciális elpárologtatási technikával [103] vonták ki. Az illékony citrus-olaj összetevıket gızdesztillátumokban [104,105], és közvetlenül injektált [106-108] mintákban mérték. A narancs és grépfrút keserő olajának nem illékony összetevıit, szintén közvetlen injektálásokból azonosították [109]. Említésre méltó, hogy választott gyümölcsök és zöldségek összes fenol- és flavonoidtartalmának [110], vagy a különbözı citrus-feldolgozási módszerek melléktermékeinek meghatározását, még 2007-ben is, különféle nem-szelektív módszerekkel végezték [111].
3.4.2. Sárkányfő-fajok A Dracocephalum növényfaj (Laminaceae család, Nepetoideae alcsalád) egyedei antioxidáns [112] és antimutagén [22] tulajdonságú, jótékony hatású összetevıket tartalmaznak.
A
Dracocephalum
kotschyi
(kivonata)
immunomoduláns
[113]
és
antihiperlipidémikus [114] hatását említik. A jótékony hatású összetevıikként elsısorban, az esszenciális olaj-tartalmukat tanulmányozták [115-119]. Napjainkban figyelmet szenteltek a nem illékony szerves összetevık minıségi-mennyiségi elemzésére, mint terpén-típusú-glikozidok [120-123], flavonoidok, és fenolsavak [122-131], melyeket a teljes növényekbıl, vagy a növények egyes részeibıl vontak ki. Az esszenciális-olaj tartalmat GC-MS [115,116], GC-FID és HPLC-MS és klasszikus módszerekkel [119] vizsgálták. Különbözı kivonatok flavonoid és fenolsav tartalmának minıségi/mennyiségi meghatározására HPLC-UV [124], HPLC-DAD [118,127,129,130] módszert és 1H és
13
C
NMR spektroszkópiát [125,126,128] alkalmaztak. Az azonos virágzati jellegzetességek [132],
22
a fenolos összetevık [133] és elektron-spin-rezonancia spektroszkópiai mérések [133] taxonómiai kutatások alapjául szolgáltak, melyek a Laminaceae család tagjai közti filogenetikai kapcsolatot állapítottak meg. A kémiai összetétel-kutatások fıként a minıségi meghatározásra korlátozódtak.
3.4.3. Festıbuzér A festıbuzér antrakinonjainak meghatározása során, leggyakrabban nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszert alkalmaztak fordított fázisú oszlopon történı elválasztással (RP-HPLC) [134-141]. A többi esetben az antrakinonok összmennyiségét spektrofotometriás [142,143], és vékonyréteg-kromatográfiás [144] módszerrel határozták meg. Az antrakinonok mennyiségének meghatározása többféleképpen történt. Egyes esetekben az alizarinra viszonyított összes antrakinon-tartalmat mérték [134,142,143,], vagy HPLC elválasztás után spektrofotométeriásan azonosították az antrakinonokat [135,137,139,141, 145]. A gyökérminták összetételére kapott eredmények összehasonlításakor látható, hogy ugyanannak az antrakinon-származéknak a mennyisége az egyes forrásmunkák között nagy eltéréseket mutat. A lucidin és az alizarin koncentrációjára eltétı adatok találhatók: 0,002– 0,09 mg/g és 1,5–1,7 mg/g [137], és 6,3 mg/g és 70,6 mg/g [145]. A nagy eltérések feltehetıen a mérési módszerek különbözıségére vezethetık vissza.
3.4.4. Meggyek és ber gyümölcs A meggy gyümölcs (Prunus cerasus) és az indiai ber (Zizyphus mauritiana) esetében egyaránt, a cukor-, cukor-alkohol-, karbonsav-, aminosav-összetételére vonatkozóan irodalmi adat nem állt rendelkezésre. Néhány esetben [146-155] tanulmányozták a Zizyphus xylopyrus-ban található triterpenoidokat [146], a Zizyphus mauritiana-ban a lektineket [147], és a ciklopeptid típusú alkaloidokat [148], továbbá vizsgálták a Zizyphus jujuba flavonoidjait [149-151], nem-édes összetevıit [152], lipid-frakciójának zsírsav-összetételét [153], és sokirányú felhasználhatóságát [154, 155]. A meggy szacharid- és polialkohol-tartalmára vonatkozó mérések eredményei [156] a gyümölcs 80% etilalkohollal készült kivonatának HPLC elemzésébıl származnak. A gyümölcsben oldott anyagok összegét refraktometriásan [157,158], összes savtartalmát
23
titrálással, aroma-összetevıit a dietiléter/pentánnal (2/1, v/v) nyert extraktumokban GC-MS eljárással mérték [158]. A teljes, és hámozott meggy karotin-tartalmát friss állapotban és fagyasztva tárolás után, hosszadalmas extrakció utáni oszlopkromatográfiás tisztítást követıen, spektrofotometriásan határozták meg [159]. Az igen kis mennyiségő melatonint, mint értékes antioxidánst, a Montmorency és Balaton fajtákban, munkaigényes, hosszantartó elválasztások után, HPLC módszerrel azonosították és mérték [160]. A legfrissebb irodalomban található, meggyre vonatkozó munkák túlnyomó többsége azok flavonoid-tartalmával kapcsolatos kutatásokra vonatkozik [22, 161-176]. E kutatások idıszerősége a flavonoidok, mint vegyületcsoport felbecsülhetetlen értékő élettani és gyakorlati jellemzıinek köszönhetı [22,161,167,168]. A meggyben található flavonoidokról igazolták, hogy mint antioxidáns tulajdonságú polifenolok, az élı szervezetben rendkívül gyorsan hasznosulnak [161]. Fentiekbıl következik, hogy a meggyfajták flavonoidjainak minısége és mennyisége, a korszerő kromatográfiás módszerek felhasználásával széleskörően kutatott [162-172]. Viszonylag nagy tömegő molekulákról lévén szó, az elemzések zöme származékkészítés nélküli, HPLC módszer [162-171]: UV [162-171], NMR [166,167] és MS/gyorsatombombázásos (FAB) [163] detektálásokkal. Kivétel, amikor a flavonoidok, és ezek bomlástermékeinek elemzése szililszármazékokként, GC-MS eljárással történt [172], valamint amikor a flavonoidok szacharid-összetevıit a hidrolizátumaikban szililszármazékokként, GCFID módszerrel azonosították [167]. A meggyben lévı flavonoidok stabilitását csökkenı színük alapján spektrofotometriásan, összegük mérésével [173-175], illetıleg trisztimulusz koloriméter alkalmazásával követték [176].
A különbözı természetes mátrixok (citrusfélék, sárkányfő, festıbuzér, meggy, ber) összetevıinek elemzésével foglalkozó dolgozatok [97-176] áttekintése után kitőnt, hogy - a fenolok/flavonoidok/antrakinonok biológiailag aktív, értékes összetevık, s - az alkalmazott analitikai módszereket kivétel nélkül, idı- és munkaigényes elıkészítı elválasztások/dúsítások, elızték meg. Így egy közvetlen módszer, mely a flavonoidok, antrakinonok, fenolsavak, karbonsavak, aminosavak, szacharidok szelektív, mennyiségi meghatározását egyidejőleg, egyetlen injektálásból lehetıvé teszi, kétségtelenül fontos technika lehet.
24
4. Kísérleti rész
4.1. Kémszerek A felhasznált anyagok és reagensek mindegyike analitikai tisztaságú volt. A Reanaltól (Budapest, Magyarország) vásároltuk a piridint, a hidroxilaminhidrokloridot, a metanolt, az acetonitrilt, az etil-acetátot, az ammónium-acetátot, a benzolt, a glükózt, a fruktózt, a szacharózt, a maltózt, a benzoesavat, az alizarint és az antrakinont. A Sigmától (St. Louis, MO, USA) szereztük be a hexametil-diszilazánt (HMDS), az N,O-bisz(trimetilszilil)trifluoracetamidot (BSTFA), az N-tert.-butil-dimetilszilil-N-metiltrifluoracetamidot (MTBSTFA), a trifluor-ecetsavat, a karbonsavakat, a szacharidokat, a flavonoidokat (naringin, naringenin, heszperidin, heszperetin, rutin, kvercetin). A Roth-tól (Carl Roth GmbH & Co. KG, Németország) vásároltuk az antocianineket: a cianin-kloridot, a cianidin-kloridot, a pelargonidin-kloridot és a malvidin-kloridot. Az ICN-tıl (Aurora, OH, USA) az antrakinonok közül a purpurint és a kinizarint vásároltuk. A többi antrakinon származékot (lucidin-ω-metil-éter, alizarin-2-metil-éter, lucidin-ω-etil-éter, munjistin-etil-észter, pszeudopurpurin és nordamnakantál) a kivonatokban azonosítottuk.
4.2. Minták A citrus-minták: A grépfrútot (Citrus paradisi L.), a citromot (Citrus limon L.), a spanyol és görög narancsot (Citrus aurantium L.) piacon vásároltuk.
A sárkányfő-minták: A növények Marosvásárhelyrıl (Erdély, Románia) származnak, 1999. augusztusában (Dracocephalum moldavica L.) és 2001. június - júliusában (Dracocephalum ruyschiana L.) teljes virágzáskor győjtötték. A virágot (csésze- és sziromlevelek) és szárat levegın szárított sárkányfő gyógynövénybıl különítették el.
A festıbuzér minták: A festıbuzér (Rubia tinctorum L.) gyökér és gyöktörzs mintákat az ELTE Botanikus kertjében 2004. júniusában győjtöttük.
25
A meggyminták: A hazai meggyminták (Prunus cerasus L.) Érdi bıtermı (E), Pándy (P) és Kántorjánosi (K) felirattal, frissen szedve, közvetlenül az Érd Elviramajori Gyümölcskutató Intézetbıl, eltérı idıben (E0: 02.06.17; P0: 02.06.27; K0: 02.06.25.), illetıleg, a Központi Élelmiszeripari Kutatóintézetben +4-6oC hıfokon különbözı ideig vezetett tárolások után (I. kitárolás, E1: 02.07.01; P1: 02.07.08; K1: 02.07.08.) érkeztek. A 2001. és 2002. évi mintákat az évjárat feltüntetésével jelezzük.
A ber-minták: A ber-minták (Zizyphus mauritiana L.) „Umran” és „Reshmi” Indiából (2002.) származtak, zöld (éretlen) és sárga (szobahımérsékleten 3 napig érlelt) állapotban érkeztek.
4.3. Eszközök A minták vízmentesítése Büchi Rotavapor (Büchi Laboratoriums-Technik AG, Schweiz) készüléken, a származékkészítés termosztálható, a kémcsövekkel egyezı mérető fémbetéteket tartalmazó melegítıblokkokban (Kutesz, Magyarország) történt.
Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia diódasoros detektálással (HPLC-DAD): A méréseket Agilent 1100 típusú HPLC-DAD/1946A típusú készüléken végeztük. DAD paraméterek: spektrum on-line (200-600 nm). Kromatográfiás oszlop: 150×4 mm MOS Hypersil BDS C18 5 µm RP (Shandon Southern Products, Runcorn, UK). Injektált mennyiség: 20 µL. Grádiens elúció: A eluens: acetonitril/0,02 M ammónium-acetát (pH=4) = 15/85 (v/v); B eluens: acetonitril/0,02M ammónium-acetát (pH=4) = 85/15 (v/v). Lineáris gradienssel, 10% B → 90% B 40 perc alatt. Áramlási sebesség: 1 mL/perc. Az antrakinonok mennyiségét λ=254 nm-en mértük.
Gázkromatográfia-tömegspetrometria (GC-MS): A méréseket a SATURN II GC-MS jelő, Varian gyártmányú (Walnut Creek, USA) készüléken végeztük, amely ioncsapda rendszerő tömegszelektív detektorral, Varian 8200 automata mintaadagolóval és főthetı injektorral rendelkezik. Az elválasztásokat SGE BPX5 (30 m×0,25 mm, 0,25 µm filmvastagságú) kolonnán végeztük. A vivıgáz hélium volt (1,5 mL/perc). A transfer line hıfoka 280oC volt. A GC paraméterei (az injektor és a kolonna főtési programja) az 5. Táblázatban láthatók.
26
Az ioncsapda detektor optimális mérési paramétereit a készülék-szoftver (Saturn) segítségével ellenıriztük: a tömegtartomány: 50-650 amu, Fil/Mul késleltetés: 420 sec. A tömegspektrométer adatfelvételi sebessége egységesen 1,0 sec/scan volt.
5. Táblázat A kromatográfiás oszlop és injektor hımérsékletprogramjai 1. Program Kolonna Idı/perc 2,00 3,00 5,83 10,00 7,30 12,00 4,00 10,00 54,13 2. Program Kolonna Idı/perc 4,61 22,50 7,00 34,11
o
o
o
o
C 60 120 155 155 250 250 330 330
C 150 330 330
C/perc 0,0 20 6,0 0,0 13,0 0,0 20,0 0,0
C/perc 0,0 8,0 0,0
Injektor Idı/perc 2,00 1,44 5,00
Injektor Idı/perc 2,00 1,00 5,00
o
o
C/perc 0,0 180,0 0,0
o
o
C/perc 0,0 180,0 0,0
C 60 320 320
C 150 330 330
4.4. Módszerek
4.4.1. A reagens oldatok készítése Oximmá alakítás reagense: A 2,5% hidroxilamin-hidroklorid oldatot 1,25 g hidroxilaminhidroklorid 50 mL piridinben való oldásával készítettük.
Szilil-származékká alakítás reagensei: A HMDS, a BSTFA, az MTBSTFA és TFA analitikai tisztaságú készítményeket további tisztítás nélkül használtuk. Reagens a hidrolízishez: Az analitikailag legtisztább trifluorecetsavból 2 mol/dm3 (M) oldatot készítettünk (23 g/100 mL). A továbbiakban 2 M TFA-oldat.
27
4.4.2. A származékképzés A következı pontokban leírt módon elıkészített, lepárolt minták maradékát piridinben oldott, 500 µL 2,5% hidroxilamin-hidrokloridot tartalmazó oldattal 30 percig, 70oC hıfokon melegítettük. A lehőlt oldatot 900 µL HMDS és 100 µL TFA hozzáadása után, 60 percen keresztül, 100oC hıfokon szilileztük. Az így kapott oldatot hőtöttük, s eltérı hígításokból 1 µL-eket elemeztünk.
4.4.3. A modelloldatok készítése Az egyes szacharidok, cukoralkoholok (20–100 mg/mL), karbonsavak/aminosavak (20 mg/mL) desztillált vízzel, a zsírsavak (10 mg/mL), a flavonoidok (2 mg/mL) etilalkohollal készült oldatainak 10–200 µL-ét, a vákuumlepárló készülékhez csatlakoztatható, teflonnal fedett, csavarmenettel ellátott kémcsövekbe (szükség szerint 2, 4, 12, 15 mL térfogatúak: a továbbiakban szililezı edények) mértük, és 60oC hıfokú vízfürdıbıl, vákuumlepárló készüléken szárazra pároltuk. A származékká alakítás a 4.4.2. pont szerint történt. A szililszármazékok törzsoldatából húszszoros, illetıleg tízszeres hígítások készültek. E hígítások 1 µl-ét egymást követıen kétszer vagy háromszor injektáltuk.
4.4.4. A minták elıkészítése az analízishez Citrusok: A meghámozott gyümölcsök belsı fehér héját (albedó) eltávolítottuk, szárítószekrényben 80oC-on tömegállandóságig szárítottuk, majd achátmozsárban elporítottuk. A gyümölcsök belsı, lédús részét turmixgépben homogenizáltuk, szárazanyag-tartalmát 80oC hıfokon, szárítószekrényben, tömegállandóságig szárítással határoztuk meg. A citrus-pépek 0,15–0,25 g-nyi, analitikai pontossággal mért mennyiségeit a szililezı edényekbe mértük, tartalmukat szobahıfokon, 10 percig ultrahanggal buborékmentesítettük, vákuumlepárlókészülékkel vízmentesítettük, s a továbbiakban a 4.4.2. pontban leírtak szerint jártunk el. A porított albedókból analitikai pontossággal 0,03–0,04 g-ot mértünk be, és a szililezést ebben az esetben is a 4.4.2. pont szerint végeztük.
Sárkányfő: A Dracocephalum moldavica L. szárított, porított virágának és szárának 0,25 gját, továbbá a Dracocephalum ruyschiana L. virágának 1 g-ját, egymást követıen négyszer, 28
25 mL metanol-aceton 1:1 arányú, sósavval savanyított (0,05 m/m%) elegyével, 20 percig ultrahanggal extraháltuk. Ezt követıen a maradékot 40 mL-ben, 4oC-on, 16 óráig áztattuk. Végül a kapott kivonatokat egyesítettük, majd vákuumlepárló-készülékkel oldószermentesítettük. Az így kapott kivonatból 0,05–0,1 g-ot szililezı edénybe mértünk és a továbbiakban a a 4.4.2. pont elıiratát követtük. Festıbuzér: A Rubia tinctorum L. gyökereit és gyöktörzsét 60oC-on, 5 napig szárítottuk, majd porítottuk. A por analitikai pontossággal mért 0,20 g-os részletét, 30 mL 80 v/v%-os metanollal vagy etanollal, visszafolyó-hőtı-feltét felhasználásával, 1 órán át forraltuk. Az oldat szőrése után az oldhatatlan maradékot még egyszer extraháltuk. Az összeöntött szőrletekbıl 100 mL térfogatú törzsoldatot készítettünk (melyet a megfelelı, a kivonáshoz használt oldószerrel egészítettük ki). A törzsoldatból analitikai pontossággal mért 15,00 mL térfogatú részletet 30-40 oC-on, vákuumlepárló-készülékkel 12 mL-es szililezı edényben, több részletben szárítottunk. Ezután a származékkészítést a 4.4.2. pont szerint végeztük.
Meggyek: A vízzel mosott, majd törlıpapírral szárított, 0,05 g pontossággal mért, 100 g magozott meggyhúst kézi burgonyanyomóba terített, háromszoros gézre juttattuk, s a gyümölcs préselését mindaddig folytattuk, amíg abból további préselés hatására lé már nem keletkezett. A préselt lé mennyiségét 0,05 g pontossággal mértük, majd csiszolatos folyadéküvegben, –15oC-on, fagyasztóban tároltuk (a továbbiakban: meggylé vagy meggyminta). A préselt meggylé szárazanyag-tartalmának meghatározása 80oC hıfokon, szárítószekrényben tömegállandóságig szárítással történt. A meggylevek analitikai pontossággal mért 0,15-0,25 g-nyi mennyiségeit a szililezı edényekbe mértük, tartalmukat szobahıfokon 10 percen át ultrahanggal buborék-mentesítettük, vákuumlepárló-készülékkel vízmentesítettük, majd mindenben a 4.4.2. pont elıiratát követtük.
Ber: A vízzel mosott, majd törlıpapírral szárított, 0,05 g pontossággal mért, 45-55 g indiai gyümölcs húsát almareszelın lereszeltük. Ezután a reszeléket háromrétegő, kissé nedves gézre juttattuk, és átpréseltük. A préselt lé mennyiségét 0,05 g pontossággal mértük, majd gumidugós kis üvegekben, –15oC-on, fagyasztóban tároltuk (a továbbiakban: pép). A gyümölcspép szárazanyag-tartalmának meghatározása 80oC hıfokon, szárítószekrényben tömegállandóságig szárítással történt. A pépek analitikai pontossággal mért 0,15 - 0,25 g-nyi mennyiségeit a szililezı edényekbe mértük, tartalmukat szobahıfokon, 10 percig ultrahanggal
29
buborékmentesítettük, vákuumlepárló-készülékkel vízmentesítettük, majd mindenben a 4.4.2. pont elıiratát követtük.
4.4.5. A minták hidrolízise Savas hidrolízis: A citrusalbedók és -pépek, sárkányfő-, festıbuzér-kivonatok, meggylevek, berpépek, analitikai pontossággal mért megfelelı (a fentebb leírtakkal megegyezı) mennyiségeit 12 mLes szililezı edénybe mértük. A hidrolízist 4 mL 2 M-os TFA-oldattal eltérı ideig folytattuk. Ezután a hidrolizátumot vákuumlepárló-készülékkel vízmentesítettük, majd a szililszármazékká alakítást 4.4.2. pont elıirata szerint végeztük.
Enzimatikus hidrolízis: A 60oC hıfokon szárított, majd porított, homogenizált gyökérporból analitikai pontossággal 0,03 g-ot fızıpohárba mértünk, és 5 mL desztillált vizet öntöttünk hozzá, és 40oC hıfokon 24 órán át kevertettük (így a gyökér saját enzimeit használtuk a hidrolízishez). A hidrolizátumot 40oC-os vízfürdın vákuumlepárló készülékkel vízmentesítettük, majd a továbbiakban a kivonást 4.4.4. pont, származékképzést a 4.4.2. pont szerint végeztük.
30
5. A kísérleti eredmények értékelése
5.1. Alapkutatás 5.1.1. Flavonoidok TMS-származékokkénti GC-MS elemzése: fragmentációs tanulmány
5.1.1.1. A választott flavonoidok TMS- és TMS (oxim)-származékainak fragmentációja Korábbi elemzırendszerünket, amely a karbonsavak, aminosavak, polialkoholok és szacharidok TMS(oxim)-éter/észterekkénti együttes GC-MS elemzésére vonatkozott, rendre a flavonoidok s az antrakinonok rendszerbe foglalásával bıvítettük. Elsı lépésként a flavonoidok származékká alakítását tanulmányoztuk. E célból, modelloldatokból, külön-külön három antocianidint (pelargonidin, cianidin, malvidin), egy flavonolt (kvercetin), két flavont (apigenin, luteolin) és két flavanont (naringenin, heszperetin) alakítottunk származékká: - egy lépésben TMS-származékká, továbbá, - két egymást követı lépésben, elıször piridinben oldott hidroxilamin-hidrokloriddal oximmá, majd második lépésben, HMDS-sel TFA-katalizátor jelenlétében TMS (oxim)származékká. A kapott eredmények szerint i.) az antocianidinek, benzpirílium-kationokként, a hidroxilaminnal pirílium-sóként reagálnak, s egy közti-terméken keresztül a megfelelı oximokká alakulnak (2.A Ábra). Ezen oximoknak négy E/Z izomerük létezik, melyek azonos módon fragmentálódó, teljes mértékben trimetilszililezett származékokat képeznek (2.B Ábra, 1-4). A pelargonidin esetében a molekulaion [M] = m/z = 574 is detektálható (2.C Ábra, 1) a többi antocianidinben is megtalálható fragmensekkel együtt: m/z = 382 (2.C Ábra, 2), m/z = 355 (2.C Ábra, 3). Ha az oximálási lépést elhagyjuk, a közvetlenül szililezett antocianidinek, mivel a pirílium kationjaikat az oximmá alakítás nem stabilizálja, elbomlanak, és a megfelelı hidroxi-benzoesav képzıdik (2.D Ábra): a pelargonidin esetében a 4-hidroxi-benzoesav, m/z=267=[M-CH3]+, a cianidin esetében a 3,4dihidroxi-benzoesav, m/z = 372, a malvidin esetében 4-hidroxi-3,5-dimetoxi-benzoesav, m/z = 312. A 2.D Ábra a pelargonidin jellegzetes viselkedését mutatja: oximmá alakítás 31
nélkül a fı termék a 4-hidroxi-benzoesav trimetilszilil származéka (2.D Ábra, felsı kromatogram), a 4 E/Z izomer a 2.D Ábra alsó kromatogramján látható (PO1-PO4 csúcsok és a megfelelı tömegspektrumok).
2. Ábra (A-C) A benzpirílium-ion típusú antocianidinek oximálás közbeni nyílt láncú oximokká alakulása (A, 1-3), E/Z izomerjeinek egyensúlyi formái (B, 1-4), a pelargonidin trimetilszilil(oxim)-származékának jellemzı fragmentációja (C, 1-3), [M] = m/z = 574 (1); a ketén-típusú ion m/z = 382 (2); CO távozásával képzıdı bomlásterméke m/z = 355 (3) Pelargonidin: R1=H, R2=OH, R3=H Cianidin: R1=OH, R2=OH, R3=H Malvidin: R1=OCH3, R2=OH, R3=OCH3
32
2. Ábra (D) A pelargonidin trimetilszilil-származékká alakítása közben képzıdı 4-hidroxibenzoesav kromatogramja (felsı kromatogram), és a pelargonidin trimetilszilil(oxim)származékának kromatogramja (alsó kromatogram) (PO1, PO2, PO3, PO4: az E/Z izomerek, és tömegspektrumaik)
ii.) Az apigenin, a luteolin és a kvercetin azonosan viselkednek: mindkét származék-képzési módszer után ugyanazok a termékek keletkeznek, amelyek azonosan fragmentálódnak (6. Táblázat), tehát, ezek a flavonoidok nem oximálhatók. Az apigenin és a luteolin két származéka nem válik el teljes mértékben, a kvercetin két trimetilszilil-származéka két csúcsban eluálódik: az elsı a teljes mértékben szililezett (az 5 TMS-csoportot tartalmazó molekula-ion egy metil-csoport vesztéssel keletkezı terméke: [M-CH3]+=m/z=647), a második a csupán 4 TMS-csoportot tartalmazó termék (3. Ábra).
33
Pelargonidin Cianidin Apigenin
L1: 25,90 L2: 26,03
Naringenin
Kvercetin
Luteolin
CO1: 21,18 CO2: 21,32 CO3: 21,53 CO4: 22,92 MO1: 21,18 MO2: 21,32 MO3: 21,53 MO4: 22.92 A1: 24,95 A2: 25,33
Heszperetin
Flavanonok
Flavonol
Flavonok
Malvidin
Antocianidinek
6. Táblázat Eltérı mennyiségő flavonoidok válaszjelei és fragmentációja, trimetilszilil(oxim) éter/észter származékokként GC-MS eljárással mérve TIC retenciós mennyiség: Szelektív fragmentum ionok (SFI) Aglikon Mt válaszjel idı, perc ng m/z Ie/ng* 20,17 574,6 PO1: 20,10 60,50 768,1 [M]=574, PO2: 20,50 271,25 PO3: 20,92 355*, 382* 121,0 745,6 PO4: 21,85
Q1: 24,92 Q2: 25,05
22,06 58,83 117,67
214,7
21,69 57,83
623,9 518,8 589,3
20,21 60,63
– –
270,24
121,25
127,0
21,06 56,17
– 36,1
286,24
112,33
179,8
23,56 58,9 117,8
310,4 488,2 667,5
5,24 13,10 26,20 39,30
H1: 23,90 H2: 24,13
331,30
115,67
235,6
NO1: 23,33 NO2: 23,57
287,25
150,2 149,1
5,56 13,89 27,78 41,68
302,24
355*, 382*
355*, 382*
A1+A2: [M-CH3]+=471 [M-TMS]+=414 [M-(TMS+CH3)]+=399 L1+L2: [M]=574; [M-CH3]+=559 [M-TMS]+=502 [M-(TMS+{CH3}4Si)]+=471
Q1: [M-CH3]+=647 [M-(TMS+CH3)]+=575 [M-({CH3}4Si)+CH3]+=559 Q2: [M-(TMS+CH3)]+=575 1025,0 [M-(TMS+CH3+({CH3}4Si)]+=487
+ *175,18 NO1: [M]=575; [M-CH3] =560 [M-TMSOH]+=485 *276,26 [M+TMS-TMSOH)]+=470;267** 272,25 *196,93 NO2: [M-TMS]+=503 [M-TMS-CH3]+=488 *217,75 [M-TMS-TMSOH-H]+=412 + *118,48 HO1: [M]=605; [M-CH3] =590 + [M-TMSO] =516 *219,75 [M-CH3-TMSOH]+=500; 297** 302,28 *338,27 HO2: [M-TMS]+=533 [M-TMS-CH3]+=518 *380,52 [M-TMS-TMSO]+=444
Jelölések: Mt: molekulatömeg; a származékok csúcsai, tömegspektrumai és egyensúlyi tulajdonságai a 2-4. ábrákon láthatók; A1, A2 és L1, L2 csúcsok nem válnak el egymástól, így a fragmentum ionok közösek. A flavonok és flavanolok nem képeznek oximokat (A1, A2, L1, L2, Q1, Q2). Az antocianidinek és a flavanonok oximokká alakulnak, melyek jelölése PO1-PO4, CO1-CO4, MO1-MO4, NO1-NO2, HO1-HO2. [M]=molekula-ion, az elméletileg teljes mértékben szililezett termék; a tömegvesztések: CH3, TMS, TMSO, TMSOH, stb. a következı tömegeket jelölik: m/z=15, 73, 89, 90. Az aláhúzott tömegek a legnagyobb intenzitású ionok; Ie/ng = integrátoregység/ng; –: kimutatási határ alatt; * és ** jelő ionok magyarázata a 2.A-C és 4.C ábrákon látható
34
3. Ábra (A-B) A kvercetin kromatogramja és tömegspektrumai, egy lépésben hexametildiszilazánnal (A: Q1, Q2), és két egymást követı lépésben, elsıként hidroxilaminnal, majd hexametil-diszilazánnal (B: Q1, Q2) származékká alakítva
iii.) A naringenin és a heszperetin azonosan viselkednek, az antocianidinekhez hasonlóan oximokat képeznek. A TMS- és TMS(oxim)-származékaik eltérı retenciós idıvel, két csúcsban eluálódnak. a.) Oximálás nélkül két csúcsot kapunk (4. Ábra N1, N2, H1, H2), a négy és három TMS-csoportot tartalmazó származékokat. b.) A naringenin és a heszperetin szin és anti oximjai elválnak egymástól. Fragmentumaik tömege m/z = 30 egységgel tér el, mely megfelel a molekulatömegeik különbségének (MN: 272,25; MH: 302,28). Az anti-TMS(oxim)-származékok hosszabb retenciós idıvel érkeznek, s tartalmazzák a molekulaiont (m/z = 575 és 605), a rövidebb retenciós idıvel érkezı szin oximok csúcsaiban a 4-OH-benzoesav (m/z = 267) és a vaníliasav (m/z = 297) jellemzı fragmentum ionjai jelennek meg, melyek a molekulák egy részletébıl származnak a 4.C Ábra szerint. 35
4. Ábra (A-B) A naringenin és heszperetin trimetilszilil- (A: N1, N2, H1, H2) és trimetilszilil (oxim)- (B: NO1, NO2, HO1, HO2) származékának kromatogramja és tömegspektrumai (C) A naringenin (NO1, NO2) és heszperetin (HO1, HO2) trimetilszilil(oxim)származékának fragmentációja
5.1.1.2. A naringenin és a heszperetin fragmentációjának felhasználása a mennyiségi elemzésben Analitikusi szemszögbıl a legfontosabb, a mennyiségi meghatározás céljára alkalmas fragmentum-ionok kiválasztása volt (7. Táblázat). A naringenin és a heszperetin (a citrusokban várható összetevık) szelektív fragmentum ionjainak relatív mennyisége alapján megállapítható, hogy i.) a naringenin és a heszperetin oximjainak, valamennyi fragmentum ionja alkalmas e flavonoidok mennyiségi meghatározására (7. Táblázat). ii.) A 13,10–41,68 ng tartományban a szelektív ionok összmennyisége 30,4–46,5% közötti, mely alapján a szelektív ionok összege is használható mennyiségi meghatározás céljára. iii.) Legelınyösebben, az elsıként eluálódó szin oximot, a 4-hidroxi-benzoesav (m/z = 267: NO1), vagy a vaníliasav (m/z = 297: HO1) eliminációjával képzıdı ionok segítségével, az anti oximokat az m/z = 503 (NO2) és m/z = 533 (HO2) ([M-TMS]+) tömegő ionok alapján lehet értékelni. 36
7. Táblázat A naringenin és heszperetin össz-ionszám (TIC) értékekbıl számított szelektív fragmentum ionjaik (SFI) reprodukálhatósága, trimetilszilil(oxim) éter/észterekként, GC-MS eljárással mérve Fragmentumok: m/z ⇓ Injektált: ng ⇒ TIC: NO1+NO2 179 267 412 486 503 560 576 SFI összesen: Fragmentumok: m/z ⇓ Injektált: ng ⇒ TIC: HO1+HO2 209 297 444 516 533 590 SFI összesen:
A szelektív fragmentum ionok relatív mennyisége, az összeg százalékában kifejezve Naringenin NO1: retenciós idı 23,33 perc NO2: retenciós idı 23,57 perc 5,24 13,10 26,20 39,30 5.24 13.10 26.20 39.30 175,2 276,3 196,9 217,8 1,25 (17) 0,75 (8,6) 0,54 (5,1) 0,42 (1,7) 5,02 (7,1) 4,09 (3,0) 3,79 (8,2) 3,09 (3,4) 26,8 (3,9) 22,3 (6,4) 22,3 (2,8) 22,4 (0,73) 2,29 (9,8) 2,04 (7,7) 1,97 (7,6) 2,04 (7,7) 0,86 (6,0) 1,10 (2,64) 0,91 (2,85) 0,87 (5,0) 15,1 (4,3) 16,6 (9,0) 16,6 (2,9) 16,8 (1,5) 2,06 (17,2) 8,02 (6,6) 10,0 (7,1) 9,69 (2,1) 0,27 (6,9) 0,36 (13) 0,41 (9,4) 0,43 (2,5) 0,16 (19) 0,54 (12) 0,48 (5,7) 0,43 (3,2) 7,33 (3,25) 13,1 (3,39) 14,3 (4,82) 16,4 (2,99) 0,39 (21) 2,99 (17) 4,79 (2,4) 5,31 (4,0) 0,019 (27) 0,050 (24) 0,11 (12) 0,15 (20) 1,37 (20) 4,29 (1,8) 7,37 (6,6) 0,044 (20) 0,23 (16) 0,46 (4,50) 1,02 (4,01) 31,7 37,1 43,3 46,5 30,0 36,4 37,6 39,9 Heszperetin HO1: retenciós idı 23,90 perc HO2: retenciós idı 24,13 perc 5,56 13,89 27,78 41,68 5,56 13,89 27,78 41,68 118,5 219,8 338,3 380,5 0,29 (10) 0,53 (7,8) 0,46 (15) 6,33 (3,43) 6,43 (1,67) 2,20 (8,4) 3,76 (2,22) 15,2 (5,1) 19,2 (5,5) 19,1 (6,6) 19,3 (4,14) 2,08 (2,01) 1,59 (0,90) 1,76 (1,20) 1,66 (5,1) 0,25 (13) 0,41 (17) 0,29 (5,6) 0,24 (2,89) 7,62 (9,0) 8,63 (4,67) 8,94 (5,8) 9,53 (4,15) 4,15 (6,9) 6,09 (9,6) 6,50 (7,7) 6,75 (0,42) 0,37 (3,93) 0,27 (9,8) 0,27 (7,4) 0,24 (8,8) 0,36 (12) 0,59 (8,9) 0,55 (2,62) 0,50 (3,98) 12,8 (3,9) 16,4 (4,50) 18,4 (1,85) 20,1 (1,13) 1,88 (7,1) 3,83 (6,7) 4,75 (9,9) 5,20 (3,04) 0,048 (14) 0,088 (8,3) 0,10 (9,4) 0,13 (5,2) 21,9 30,4 31,7 32,5 29,3 33,5 34,7 35,4
Jelölések, mint a 6. Táblázatnál, továbbá: ()=a zárójelben lévı értékek a párhuzamos fragmentációkból kapott RSD%-okat jelentik
37
5.1.1.3. A naringin, a heszperidin és a rutin optimális hidrolízis körülményeinek tanulmánya Irodalmi adatok alapján ismert, hogy a természetben a flavonoidok fıként glikozidjaik formájában fordulnak elı. Elızetes vizsgálataink során két flavonoid-glikozidot, a naringint (naringenin-rutinozid) és a rutint (kvercetin-rutinozid) hidrolízis nélkül, két lépésben alakítottuk származékká. Ekkor a származékok kis retenciós-idı eltéréssel eluálódtak, s csúcsformáik, és válaszjeleik kedvezıtlenek voltak (5. Ábra, A kromatogram). E tapasztalatok alapján kitőnt, hogy a már meglévı vizsgálati rendszerünknek a flavonoidok minıségi-mennyiségi meghatározásával kiegészítése érdekében, a származékká alakításuk elıtt, szabad formában kell jelen lenniük. Így, modell-hidrolízist végeztünk, hogy megbizonyosodjunk az aglikon kvantitatív képzıdésérıl (1 M aglikon/1 M glikozid). Erre a célra a „lágy”, 2M trifluorecetsavas hidrolízist választottuk, és vizsgáltuk a hidrolízis-idı változtatásának hatását (8. Táblázat). Az eredmények azt mutatták, hogy a három glikozid esetében, a hidrolízis sebessége eltérı: a rutin és a naringenin mennyiségi elbomlásához szükséges idı mindösszesen 1 óra, míg a heszperidin bomlása legalább 3 óráig tart. A biztonságos munka érdekében a továbbiakban 4 órás hidrolízis-idıt alkalmaztunk (5. Ábra).
38
5. Ábra A rutin trimetilszilil-származékának kromatogramja közvetlenül (A) és eltérı idejő (B-F: 15, 30, 60, 120, 180 perc), 2 M trifluorecetsav-oldattal vezetett hidrolízis után
39
8. Táblázat A rutin, a naringin és a heszperidin cukrokká és aglikonokká hidrolízisének reprodukálhatósága, TMS(oxim)-éter/észter származékokként, GC-MS módszerrel mérve Rutin Hidrolízis idı
Ramnóz
Glükóz
Rutinóz
Kvercetin
Rutin
15 perc 30 perc 1 óra 2 óra 3 óra 4 óra
0,35 (2,60) 0,64 (4,46) 0,84 (1,31) 0,95 (2,94) 1,00 (1,62) 0,95 (5,12)
0,35 (0,63) 0,65 (5,13) 0,84 (2,87) 0,99 (2,62) 1,00 (0,51) 0,97 (6,57)
0,59 (4,09) 0,25 (5,31) – – – –
0,949 (5,00) 1,05 (2,58) 1,106 (2,11) 1,003 (2,33) 0,946 (1,19) 0,946 (5,61)
– – – – – –
Naringin Hidrolízis idı
Ramnóz
Glükóz
Rutinóz
Naringenin
Naringin
15 perc 30 perc 1 óra 2 óra 3 óra 4 óra
0,81 (1,48) 0,97 (1,09) 0,99 (0,76) 1,00 (4,08) 0,89 (2,77) 0,93 (3,55)
0,32 (2,27) 0,71 (1,14) 0,98 (5,57) 1,00 (4,24) 0,94 (3,16) 0,99 (1,80)
– – – – – –
0,32 (5,13) 0,83 (4,60) 1,06 (3,32) 0,98 (2,89) 0,95 (2,65) 1,01 (2,23)
0,18 (6,33) 0,15 (1,04) – – – –
Heszperidin Hidrolízis idı
Ramnóz
Glükóz
Rutinóz
Heszperetin
Heszperidin
15 perc 30 perc 1 óra 2 óra 3 óra 4 óra
0,17 (4,53) 0,37 (4,80) 0,46 (6,49) 0,70 (4,29) 0,90 (5,57) 1,00 (3,20)
0,082 (6,21) 0,27 (3,11) 0,46 (3,29) 0,71 (5,34) 0,93 (4,98) 1,00 (1,52)
0,75 (2,49) 0,47 (5,24) 0,29 (6,27) 0,14 (4,52) 0,091 (1,44) –
– 0,25 (2,96) 0,48 (4,28) 0,70 (3,31) 0,93 (1,88) 1,00 (0,30)
0,80 (2,37) 0,58 (3,00) 0,23 (4,23) 0,17 (2,31) – –
Jelölések, mint a 7. Táblázatban
40
5.1.2. Antrakinonok szilil-származékká alakításának és fragmentciójának tanulmánya Bevezetı vizsgálataink, melynek során a modell antrakinonokat (antrakinon, kinizarin, alizarin, purpurin) származékképzés nélkül választottuk el, az alizarin és kinizarin esetében alacsony válaszjeleket, a purpurin esetében feltehetıleg a kimutatási határ alatti válaszjeleket eredményeztek (9. Táblázat). Mindezek alapján a származékképzés az antrakinonok minıségi-mennyiségi meghatározásához nélkülözhetetlen. A
származékképzés
körülményeinek
optimálásához,
három
szililezı-reagenst
választottunk, és a reakcióidı és hımérséklet hatását tanulmányoztuk (9. Táblázat). Az MTBSTFA-val végzett származékká alakítás az alizarin esetében kedvezıtlen eredményt adott, mivel az alizarinnak négy TBDMS-származéka (aM1, aM2, aM3, aM4) képzıdött, melyek válaszjeleinek összege (109 ie/ng) jóval alacsonyabb volt a HMDS-sel vagy a BSTFA-val képzett TMS-származékok esetén (328 ie/ng) mért értékeknél. A BSTFA-val és a HMDS-sel végzett származékképzés után az alizarinnak, a purpurinnak és a kinizarinnak két TMS-származéka (a1, a2; p1, p2; q2, q3), és a nem reagált kinizarin (q1) volt kimutatható. A hasonlóan jó eredményeket szolgáltató HMDS és BSTFA közül, jóval kedvezıbb ára miatt, a HMDS-t részesítettük elınyben. Mindezek alapján (9. Táblázat) az antrakinonok GC-MS meghatározását HMDS-sel, 100oC hıfokon, 60 perc után nyert származékokkal készítettük.
5.1.2.1. A modell-antrakinonok TMS- és TBDMS-származékainak fragmentációja A 6. Ábrán és a 9. Táblázatban a kereskedelemben beszerezhetı antrakinonok szililszármazékai és fragmentációs termékei, a 19. Táblázatban és a 16. Ábrán a festıbuzér mintákban azonosított lucidin, pszeudopurpurin és nordamnakantál szilil-származékai és fragmentációs termékei láthatók. A szililezett antrakinonok válaszjelei (9. Táblázat, ie/ng egységben kifejezve) és a termékek fragmentációja alapján megállapítható, hogy i.) a kinizarin, alizarin és purpurin TMS-származékait elsısorban, a fı ionok, a molekulaionok
és
az
azokból
metil-csoport(ok)
eliminációjával
keletkezı
fragmentum-ionok alkotják (2A-B. Ábra, [M−2CH3]+: m/z = 354 = q3 = kinizarin3; [M−CH3]+: m/z = 369 = a2 = alizarin2 és [M−2CH3]: m/z = 442 = p2 = purpurin2).
41
Ezek a nagy tömegő fragmentumok rendre >80.1%, >95.2% és >93.4%-át adják a képzıdött ionok összegének. ii.) A teljes mértékben szililezett termékek mellett nem szililezett (m/z = 240 = q1) és részlegesen szililezett (q2, a1, p1) antrakinonokat is kimutattunk (a fragmentumok magyarázata a 9. Táblázat lábjegyzetében).
9. Táblázat Antrakinonok származékkészítésének vizsgálata: a szililezı-szerek, a hıfok és a hidrolízisidı hatása A több csúcsot adó antrakinonok csúcsokhoz tartozó válaszjeleinek# aránya %-ban, a csúcsok összegének megfelelı válaszjelet (T) 100%-nak tekintve; a származékot nem adó antrakinon válaszjelei# Antrakinon* Injektált ng: 181,1
Reakcióidı, perc
Hımérséklet oC
Reagens
Körülmények
Alizarin**: Injektált ng: 168,9; a1=m/z=297 a2=m/z=369
Purpurin**: Injektált ng: 162,2; p1=m/z=370 p2=m/z=442
q1
q2
q3
T
a1
a2
T
p1
p2
T
3,5 2.3 1.9 1.2 2.7 2.2 1.0 2.3 1.6 1.2 0.9 1.1 0.9
22,7 17.6 15.3 15.4 17.2 17.4 16.4 17.1 15.4 17.4 16.7 16.4 17.0
73,8 80.1 82.8 83.4 80.1 80.4 82.6 80.6 83.0 81.4 82.4 82.5 82.1
149 161 177 174 147 160 163 168 173 179 181 182 177
4,8 2.8 2.8 2.9 3.2 3.3 2.5 1.8 2.4 1.5 1.4 1.3 1.4
95,2 97.2 97.2 97.1 96.8 96.7 97.5 98.2 97.6 98.8 98.6 98.7 98.4
304 315 329 329 306 319 316 337 324 331 334 344 326
5,9 6.2 6.2 6.6 5.7 6.3 6.4 6.3 6.5 6.1 6.0 5.6 6.2
94,1 93.8 93.8 93.4 94.3 93.7 93.6 93.7 93.5 93.9 94.0 94.4 93.8
96 139 166 153 114 140 143 144 145 163 158 166 157
antrakinon
Reakcióidı, perc
Hımérséklet oC
MTBSTFA
BSTFA
HMDS
15 247 30 240 70 60 250 120 246 15 243 100 30 243 60 248 15 250 120 30 250 15 249 30 237 100 60 242 90 241 TMS-származékok válaszjel# összegeinek (T) átlaga: RSD%
Kinizarin**: Injektált ng: 177,8; q1=m/z=240 q2=m/z=297 q3=m/z=354
q M1 97.7 97.4 97.5
172: 4,7%
328: 2,9%
152: 6,8%
m/z=354 m/z=410
m/z=297 m/z=412 m/z=484 m/z=526
m/z=412 m/z=484
q M2 2.3 2.6 2.5
T 188 195 209
aM1
aM2
aM3
aM4
T 111 106 109
pM = T 171 230 230
15 240 30 22 43 5 30 237 29 23 44 4 60 238 34 22 40 4 TBDMS-származékok válaszjel# összegeinek 202: 4,9% 109: 2,3% 230: 0% (T) átlaga: RSD% Származékkészítés 32 65 nem ad jelet nélküli válaszjel# 9.Táblázat, lábjegyzetek: antrakinon*=nem ad származékot, válaszjeleinek átlaga=243,8; RSD%=2,0; válaszjel#= integrátor egység/ng injektált antrakinon; A kinizarin**, alizarin** és purpurin** mindhárom reagenssel több szililszármazékot képeznek, melyeket TMS-származékok esetén q1, q2, q3, a1, a2, p1, p2, 100
42
9.Táblázat, lábjegyzetek folytatása: TBDMS-származékok esetén qM1, qM2, aM1 – aM4, pM jelzéssel tüntettünk fel. A hozzájuk tartozó értékeket a válaszjeleik arányának %-ában adtuk meg, az összegüknek megfelelı válaszjelet (T) 100%-nak tekintve. Dılt betőkkel írt értékeket az átlag és RSD% számításakor nem vettük figyelembe. m/z=SFI=szelektív fragmentum ionok: származékkészítés nélkül: antrakinon (M=208,2): m/z=208=[M]; m/z=180=[M-CO]+, m/z=152=[M2CO]+; HMDS és BSTFA reagensekkel képzett trimetilszilil-származékok esetében: kinizarin (M=240,2): q1=m/z=240; q2=m/z=297=[M-(TMS+CH3)]+, q3=m/z=354=[M-2CH3]+; alizarin (M=240,1): a1= m/z=297=[M(TMS+CH3)]+, a2= m/z=369=[M-CH3]+; purpurin (M=256,2): p1= m/z=370=[M-(TMS+2CH3)]+, p2= m/z=442=[M-2CH3]+; MTBSTFA reagenssel képzett TBDMS-származékok esetében: kinizarin (M=240,2): qM1=m/z=354=[M-TBDMS]+, qM2=m/z=410=[M-(C4H9+H)]+; alizarin (M=240,1): aM1 és aM2=m/z=297=[M(TBDMS+C4H9)]+, aM3=m/z=484=[M+16]+, aM4=m/z=526= [M+TBDMS-(C4H9+H)]+; megjegyzés: aM3 és aM4 „túlszililezett” származékok; purpurin (M=256,2): pM=m/z=484=[M-TBDMS]+
43
6. Ábra (A-C) Antrakinonok modell-oldatának HMDS-sel (A), BSTFA-val (B) és MTBSTFA-val (C) képzett származékainak GC-MS kromatogramjai
Csúcsok: ant (A,B,C)= antrakinon; q1 – q3 (A,B), qM1, qM2 (C)=kinizarin, a1, a2 (A,B), aM1 – aM4 (C)=alizarin, p1, p2 (A,B), pM (C)=purpurin
44
5.1.3. Különbözı szacharidok TMS- és TMS(oxim)-származékainak fragmentációs tanulmánya Az antrakinonokkal és a flavonoidokkal kapcsolatos GC-MS kutatásaink, melyek során két diszacharid, a primveróz és a rutinóz SFI szerinti minıségi-mennyiségi meghatározását tanulmányoztuk, azt mutatták, hogy a redukáló és nem redukáló glikozidkötéső vegyületek eltérıen és szelektíven fragmentálódnak. Ez azt jelenti, hogy valamennyi glikozid, a redukálók és a nem redukálók esetében egyaránt, a fragmentáció a glikozidkötéső oxigénatomon proton-„támadással” kezdıdik (710. Ábra), és a kiindulási szacharid-összetevıre minıségileg és mennyiségileg jellemzı fragmentumokhoz vezet. (10-11. Táblázatok)
5.1.3.1. Nem redukáló glikozidkötést tartalmazó szacharidok TMS-származékainak elválasztása és fragmentációja A különbözı polimerizációs fokú, nem redukáló glikozidok képviselıi, mind egyetlen TMS-származékot adnak (7-8. Ábra). Az összion-számból extrahált szelektív fragmentum ionjaik
eloszlását
mennyiségi
alapon,
az
összion-szám
százalékában
számítottuk.
(10. Táblázat) A nem redukáló glikozidok TMS származékainak fragmentum ion-összetétele (7. Ábra, tömegspektrumok: 1A metil-mannozid és 2A metil-galaktozid) alapján kitőnt, hogy i.) a metil-mannozid és metil-galaktozid TMS származéka, a monomer szacharidra és a glikozidra egyaránt jellemzı fragmentumokat adja. - A monomer szacharidra jellemzı szelektív fragmentum ionok: m/z = 204, a molekula két szomszédos egységébıl származik (m/z = 2HCOTMS = 2x102, kivéve C1 és C6 szénatomokat), és m/z = 217, amely tartalmazza az m/z = 2HCOTMS = 205 egységet a C6 és C5 egységbıl, kiegészítve a C4 atommal. - A metil-glikozidokra jellemzı fragmentum az m/z = 360, amely a glikozidos oxigénatomon való hasadással, a glikozidos kötés jelenlétére utal.
45
10. Táblázat A nem-redukáló glikozidos kötést tartalmazó szacharidok jellemzı fragmentációja, a szelektív fragmentum ionok képzıdésének reprodukálhatósága* az injektált mennyiség függvényében Fragmentumok A nem-redukáló szacharidok szelektív fragmentum ionjainak relatív mennyisége, TMS-származékokként, az összeg százalékában kifejezve m/z ⇓ Metil- Metil-
A glikozid ⇒ manno- galakto- Laktitol zid
Raffinóz
Erlóz
zid
Retenciós idı, perc
9,98 10,66 21,33
Injektált: ng ⇒ 204 217 271 319 345 360 361 436 448 SFI összesen
40,3 51,5 52,1 27,5 28,7 10,02 7,9 8,4 7,10 1,05 0,93 2,33 7,21 3,72 3,15 11,40 0,15 0,052 0,84 40,3 41,2 40,4
26,30 6,07 3,84 5,76 2,04 1,01 32,63 5,59 0,40 51,3
12,13 3,87 6,25 2,00 1,14 32,33 6,42 0,44 56,4
Melecitóz
26,80 27,12 24,27 3,60 5,94 2,11 0,94 35,14 6,16 0,44 54,4
30,0 5,09 5,35 2,56 0,71 38,70 1,86 0,26 56,4
28,9 2,82 4,20 3,14 0,82 38,42 0,54 0,03 50,0
10,28 0,77 5,13 1,91 0,19 38,84 5,93 0,41 53,9
Szacharóz
Trehalóz
20,03
21,08
20,56 0,66 5,34 2,37 0,96 41,10 5,44 0,24 53,8
41,12 0,54 4,63 1,84 0,85 44,81 6,04 0,27 59,0
82,24 0,67 2,81 0,92 0,63 43,80 5,76 0,29 54,9
4,38 8,76 19,52 2,63 2,60 2,34 4,66 4,65 4,45 3,17 3,01 3,21 1,41 1,33 1,48 30,0 30,90 34,60 0,25 0,15 0,39 0,00 0,00 0,00 38,9 39,7 43,3
35,00 2,19 2,63 2,70 1,33 40,50 0,39 0,02 47,0
*=Három párhuzamos származékká-alakítás átlagából (RSD % ≤ 3,0)
46
11. Táblázat A redukáló glikozidos kötést tartalmazó szacharidok jellemzı fragmentációja, a szelektív fragmentum ionok képzıdésének reprodukálhatósága* az injektált mennyiség függvényében Fragme ntumok A redukáló szacharidok szelektív fragmentum ionjainak relatív mennyisége, TMS-származékokként, az összeg százalékában kifejezve m/z ⇓ A Cello- Cello- Cello- Cello- Mal- Mal- Mal- Mal- Ruti- Ruti- Ruti- RutiPrimve- Primve- Primve- Lak- Lak- Meli- Meli- Palati- Palati- Maltotrióz glikozid bióz1 bióz2 bióz1 bióz2 tóz1 tóz2 tóz1 tóz2 nóz1 nóz2 nóz1 nóz2 Primveróz1 róz2 róz1 róz2 tóz1 tóz2 bióz1 bióz2 nóz1 nóz2 1+2# ⇒ Ret. idı, 21,53 21,80 21,53 21,80 22,07 22,25 22,07 22,25 17,59 17,93 17,59 17,93 21,18 21,50 21,18 21,50 21,43 21,55 22,93 23,35 22,63 22,80 28,40/28,70 perc
Inj.: ng ⇒ 204 217 259 271 273 319 361 363 436 448 538 SFI összesen
17,50 8,83 5,19 1,71 3,05 22,63 0,40 1,04 5,94
35,00
28,60
57,20
40,0
10,02 8,43 10,18 4,76 5,56 4,30 5,43 7,53 4,87 5,01 5,01 4,96 4,47 4,36 4,48 5,70 1,70 1,86 1,80 1,79 2,06 1,74 2,11 7,11 2,85 2,96 2,86 3,35 3,45 2,92 3,30 3,05 19,36 24,29 20,32 28,27 26,39 29,20 27,75 5,53 0,21 0,55 0,19 0,50 0,25 0,64 0,35 0,08 1,36 1,18 1,37 1,05 1,18 1,11 1,25 1,56 1,78 6,57 1,73 4,92 0,92 5,76 1,35 1,96
48,8 42,1
50,8
7,34 5,45 6,76 2,74 4,75 0,02 0,18 0,31
80,0 8,35 6,25 6,94 2,82 5,02 0,07 1,29 1,50
60,0
8,44 1,37 1,38 7,13 6,99 20,23 11,37 8,27 2,50 1,34 1,71 5,43 0,00 1,18 4,35 0,28 2,09 2,31 0,29 2,90 3,27
120,0 2,64 2,76 29,90 2,22 1,23 1,69 3,03
1,81 10,43 9,44 1,68 4,99 2,34 2,64
32,7 6,88 8,18 5,20 4,86 2,02 1,95 5,22 4,96 18,75 16,52 0,45 0,13 0,98 1,26 4,76 1,78
46,6 7,53 5,47 2,33 2,86 26,38 0,28 2,33 3,33
8,16 5,41 2,42 2,74 23,10 0,09 0,46 0,70
38,4 5,15 6,06 2,08 1,63 26,71 0,38 1,15 6,99
22,4 44,8
6,16 6,49 2,21 1,60 28,26 0,19 1,05 1,32
10,88 10,92 4,50 4,55 3,64 3,84 1,65 1,63 23,90 23,23 0,21 0,20 0,82 0,79 3,71 3,61
43,5 49,6 44,3 50,0 46,0 32,5 27,6 32,3 32,3 29,1 31,4 43,5 33,3 44,3 39,7 48,0 41,8 50,1 47,3 49,3 48,8
Jelölések: mint a 10. Táblázatban, továbbá: Ret.=retenciós, Inj.=injektált, #=nem válnak el teljesen
47
ii.) A laktitol TMS származéka (7. Ábra, 3A tömegspektrum) a szerkezetének megfelelı fragmentumokat ad: egy piranóz-győrőt m/z = 451-90 = 361 és egy meglehetısen stabil, nyílt láncú egységet m/z = 525-90 = 435-90 = 345. iii.) A nem redukáló di- és triszacharidokból kapott legnagyobb intenzitású fragmentumion minden esetben az m/z = 361 (8. Ábra, tömegspektrumok: 1A szacharóz, 2A trehalóz, 3A raffinóz). Ezt a di- és triszacharidokra jellemzı fragmenst korábban is leírták, jóllehet, a keletkezésének magyarázata, s mennyiségi értékelése nélkül, mely teljes mértékben függ a győrő egységek lényeges tulajdonságaitól, amelyekbıl származik. iv.) Ez azt jelenti, hogy a szacharóz TMS-származéka, glükozil-fruktozid lévén, a mennyiségével arányos mértékben, az m/z = 451-90 = 361 (a glükóz egységbıl), és az m/z = 436 (a fruktóz egységbıl) tömegő fragmentumot szolgáltatja. A szacharóz egység jellegzetes viselkedése, a viszonylag stabil m/z = 436 tömeghez vezet, mely egyaránt jellemzı a szacharózból és raffinózból származó fruktóz egységre (8. Ábra, tömegspektrumok: 1A szacharóz és 3A raffinóz). v.) A trehalóz TMS-származéka, lévén glükozil-glükozid, két azonos fragmentumot szolgáltat (8. Ábra, tömegspektrum 2A). Az m/z = 451 tömegő fragmentumok, egy TMSOH = m/z = 90 vesztéssel stabilizálódnak, és az m/z = 361, legnagyobb intenzitású ion képzıdik, mely az össz-ionszám 30-40%-át adja. vi.) Az erlóz és a melecitóz (10. Táblázat) TMS származékaiban egyaránt, az m/z = 361 tömegő a legnagyobb intenzitású ion.
48
7. Ábra A metil-α-D-mannopiranozid (1A), a metil-α-D-galaktopiranozid (2A) és a laktitol (3A) kromatogramja, tömegspektruma és fragmentációja, trimetilszilil-származékokként, GC-MS módszerrel mérve
O CH3
O
m/z=450-90=360 →
← m/z=32
TMSO OTMS
TMSO
OTMS
O CH3
O
← m/z=32
TMSO
m/z=450-90=360 →
TMSO
OTMS OTMS
OTMS
m/z=451-90=361 →
TMSO O TMSO
OTMS O
← m/z=525-90=435 435-90=345
OTMS TMSO
OTMS TMSO TMSO
49
8. Ábra A szacharóz (1A), a trehalóz (2A) és a raffinóz (3A) kromatogramja, tömegspektruma és fragmentációja trimetilszilil-származékokként, GC-MS módszerrel mérve
O
m/z=451-90=361 →
O
TMSO O
TMSO
TMSO
TMSO
←m/z=451-16=436 OTMS OTMS
OTMS OTMS
← m/z=451-90=361
OTMS OTMS
TMSO
OTMS O
O
O
TMSO
m/z=451-90=361 →
TMSO
OTMS OTMS
50
5.1.3.2. A redukáló glikozidos kötést tartalmazó szacharidok TMS(oxim)-származékainak elválasztása és fragmentációja A választott jellegzetes példák, a hét diszacharid és egy triszacharid TMS(oxim)származékai, mind az α-glikozid- (maltóz, melibióz, palatinóz, maltotrióz), mind a βglikozidkötéső (cellobióz, laktóz, rutinóz, primveróz) szacharidokat képviselik (11. Táblázat, 9-10. Ábra). A redukáló szacharidok TMS(oxim)-származékainak fragmentációja közötti alapvetı különbség oka, hogy két különbözı cukor-egységet tartalmaznak: i.) az egyik egység győrős szerkezető, így az összes nem-redukáló glikozid jellemzı és megfelelı szelektív fragmentum ionjait adja, amelyek - a cellobióz, a maltóz, a laktóz, a melibióz, a palatinóz és a maltotrióz esetében egyaránt az m/z = 361 ionok (9. Ábra, tömegspektrumok: 1A, 2A, 3A, 4A, m/z = 451-90) - a rutinóz esetében az m/z = 273 ion (9. Ábra, tömegspektrumok: 1A, 2A, m/z = 36390 = 273), míg - a primveróz esetében az m/z = 259 ion (9. Ábra, tömegspektrumok: 3A, 4A, m/z = 34990 = 259). ii.) A másik egység nyílt láncú, TMS(oxim)-csoportot tartalmaz, amely - minden vizsgált esetben, - a glikozidos kötéstıl függetlenül, a nagy tömegő m/z = 553-15 = 538 iont adja (910. Ábra, 11. Táblázat).
51
9. Ábra A cellobióz1 (1A), a cellobióz2 (2A), a maltóz1 (3A) és a maltóz2 (4A) kromatogramja, tömegspektruma és fragmentációja trimetilszilil(oxim)-származékokként, GCMS módszerrel
TMSO TMSO
m/z=553-15=538 OTMSOTMS
O
N O
TMSO OTMS
TMSO
OTMS
OTMS
m/z=451-90=361
52
10. Ábra A rutinóz1 (1A), a rutinóz2 (2A), a primveróz1 (3A) és a primveróz2 (4A) tömegspektruma és fragmentációja trimetilszilil(oxim)-származékokként, GC-MS módszerrel mérve (*=a festıgyökér mátrix szacharóz-tartalma)
CH3 TMSO TMSO OTMS
m/z=363-90=273
TMSO
OTMS
O TMSO
N
OTMS
OTMS
m/z=553-15=538
OTMSOTMS
O
TMSO
OTMSOTMS
O
O TMSO
m/z=349-90=259
N
OTMS
OTMS
m/z=553-15=538
53
5.1.3.3. A TMS és TMS(oxim)-származékká alakított szacharidok mennyiségi elemzésének lehetıségei szelektív fragmentum ionjaik alapján Tanulmányoztuk a glikozidok TMS- és TMS(oxim)-származékainak fragmentációját, az injektált mennyiség függvényében (10-11. Táblázat). Eredményeink azt mutatták, hogy a TMS- és TMS(oxim)- fragmentum ionok egyaránt, a vizsgált glikozidok mennyiségi értékelésére alkalmasak. A nem redukáló glikozidok (10. Táblázat) legnagyobb intenzitású ionjait értékelve kitőnt, hogy i.) a di- és triszacharidok esetében a fı-ion az m/z = 361, és az intenzitása, az összes ion összegének százalékában kifejezve, jelentıs: 30,0-44,8% (10. Táblázat) ii.) A glükopiranozil és galaktopiranozil egységeket tartalmazó trehalóznak, erlóznak és melecitóznak az m/z = 451-90 = 361 tömegő ionjai a legnagyobb intenzitásúak (10. Táblázat, 38,4 – 40,5%, 7. Ábra). iii.) A szacharóz-típusú glikozidokban, a szacharóz és a raffinóz fruktofuranozil egységei (m/z = 451), a piranozil egységhez viszonyított nagyobb stabilitása miatt, az m/z = 45115 = 436 iont is tartalmazzák (10. Táblázat, 7. Ábra). iv.) A ramnóz- és a xilóz-tartalmú primveróz és a rutinóz győrő-egysége is alkalmas mennyiségi meghatározásra. A rutinóz és a primveróz kereskedelmi forgalomban nem kapható, a minıségi-mennyiségi elemzésüket szelektív fragmentum ionjaik (primveróz: m/z = 259, rutinóz: m/z = 273, 363) alapján végeztük.
54
5.2. Analitikai alkalmazások Alapkutatásaink, melyeket az 5.1. fejezet pontjaiban (5.1.1., 5.1.2.) részleteztünk, lehetıvé tették a flavonoidok és antrakinonok együttes elemzését az adott mátrixok karbonsav, aminosav és szacharid összetevıivel, a vizsgálatot megelızı dúsítási és kivonási lépés nélkül. Ezt a lehetıséget a.) a citrus-mátrixok (5.2.2.) b.) a sárkányfő-kivonatok (5.2.3.) c.) a festıbuzér-kivonatok (5.2.4.) d.) a meggy és ber gyümölcs mátrixok (5.2.5.) összetevıinek minıségi-mennyiségi elemzésekor hasznosítottuk.
5.2.1. Modelloldatok válaszjelei Korábbi kutatási eredmények alapján a természetes mátrixokban várható karbonsavak, szacharidok, polialkoholok, s az esetlegesen jelenlévı aminosavak retenciós idıi és szelektív fragmentum ionjai rendelkezésre álltak [1-12]. Azonosítási és mennyiségi értékeléseink, többek között, e vizsgálatok eredményeire is támaszkodnak. Ugyanezen tapasztalatok kiegészítéseként a minıségi- és mennyiségi-elemzés céljából modelloldatokat készítettünk. A modelloldatok, minden egyes természetes mátrix esetében, az azokban várható összetevıket tartalmazták, különbözı koncentrációban. A modelloldatok összetételének meghatározására a mátrixok összetételét elızetesen feltérképeztük. Példaként, a citrusok esetében használt modelloldatok összetevıinek válaszjeleit a 12. Táblázat tartalmazza. Az adatokból kitőnik, hogy a legtöbb esetben, a három különbözı injektált mennyiségő összetevıkhöz, hibahatáron belül (1,56–14 RSD%), ugyanaz a válaszjel tartozik. Ezekben az esetekben az értékeléshez, a három eredmény átlagát használtuk. Ahol a válaszjelek nem voltak koncentrációtól függetlenek, azaz, növekvı, vagy csökkenı nagyságúak voltak, azokban az esetekben, kalibrációs görbe szolgált az értékelés alapjául. A kis mennyiségben jelenlevı (hidroxi-benzoesavak, klorogénsav, tokoferol) és kis válaszjelő (aminosavak) összetevık esetében szükség volt a szelektív fragmentum-ionok alapján értékelésre, s a fragmentumok kis mennyisége miatt kalibrációs görbét alkalmaztunk.
55
A többi mátrix esetében hasonló módon jártunk el, mindenkor a legmegfelelıbb értékelési módszert (átlagérték vagy kalibrációs görbe) alkalmaztuk. A mátrixokban speciálisan jelenlevı összetevık, a flavonoidok és antrakinonok értékeléséhez az 5.1. pont fejezeteiben ismertetett eredményeket hasznosítottuk. A számításokhoz használt válaszjelek i.)
a naringenin, a heszperetin, az apigenin és a luteolin esetében a 6. Táblázatban,
ii.)
az antrakinonok esetében a 9. Táblázatban találhatók.
56
12. Táblázat Eltérı mennyiségő cukrot, cukoralkoholt, karbonsavat és aminosavat tartalmazó modelloldatok összetevıinek válaszjele, TMS(oxim)-éter/észter-származékokként, GC-MS módszerrel Összetevı
Aa 865 1118
Integrátoregység/ng B=A×2a C=A×4a 912 880 994 771
Átlag 886 961
RSD%
1. Foszforsav A: 15,6 2.71 2. Almasav A: 8.29 kal. 3. Aszparaginsav A: 33.4 TIC 181 175 188 181 3.68 m/z = 232 38.4 44.8 44.6 42.6 8.6 4. Glutaminsav A: 37.6 TIC 266 240 243 250 5.7 m/z = 156 99.3 110.8 114.6 108.2 7.4 m/z = 230 9.5 8.8 14.3 – kal. 5. Trimetoxi-benzoesav A: 2.83 3030 2967 2746 2914 5.1 6. Alanin A: 37.2 TIC 299 337 363 333 9.7 m/z = 116 30.1 34.8 41.8 – kal. m/z = 252 6.3 7.2 9.5 – kal. m/z = 371 4.7 6.2 8.6 – kal. 7. Prolin A: 35.6 TIC 113.5 249.7 273.1 – kal. m/z = 142 17.4 46.6 50.9 – kal. m/z = 216 6.5 20.8 19.5 – kal. 8. Xilóz A: 3.05 2900 2861 2998 2920 2.4 9. Arabinóz A: 2.83 3030 2967 2746 2914 5.1 10. Ribóz A: 3.25 2756 2915 2874 2848 2.9 11. Vaníliasav A:36.0 TIC 870 859 886 871 1.56 m/z = 267 104.3 119.3 117.0 113.5 7.1 m/z = 297 129.2 122.3 134.5 128.7 4.8 m/z = 312 85.3 – – – 8.5 12. Ramnóz A: 0.45 2675 2860 2583 2706 5.2 13. 4-OH-benzoesav A: 30.7 TIC 1114 1122 1210 1149 4.43 m/z = 193 188 242 205 212 13 m/z = 267 261 297 344 301 14 14. Citromsav A: 8.02 1745 1587 1488 1607 kal. 15. Kínasav A: 8.21 2179 2097 1955 2077 5.5 16. Fruktóz A: 80.12 1906 1789 1810 1835 3.4 17. Glükóz A: 63.83 2503 2398 2375 2425 2.8 18. Galakturonsav A: 8.34 1863 1851 1690 1800 5.4 19. Inozit A: 8.13 2719 2662 2556 2646 3.1 20. Szacharóz A: 10.28 2440 2364 2283 2362 3.3 21. Cellobióz A: 17.39 3274 3156 3099 3176 2.8 22. Genciobióz A: 16.81 3494 3215 3370 3360 4.1 23. Raffinóz A: 3.03 1471 1542 1750 1588 kal. 24. Klorogénsav A: 31.0 TIC 149 404 606 – kal. m/z = 255 13.4 33.9 53.8 – kal. m/z = 345 19.2 54.1 83.8 – kal. 25. Tokoferol A: 6.24 TIC 331 406 539 – kal. m/z = 237 97.9 107.8 121.6 – kal. m/z = 502 12.6 57.2 134.7 – kal. 26. Rozmaringsav A: 14.96 765 856 968 – kal. Jelölések: kal.=kalibrációs görbe alkalmazása az értékelésnél, a injekált mennyiség (ng/1µL), - kimutatási határ alatt
57
5.2.2. A grépfrút, citrom és narancs albedók és préselt levek összetevıinek minıségimennyiségi elemzése A citrus-mátrixok összetevıit közvetlenül, és hidrolízist követıen, TMS(oxim)éter/észter-származékokként mértük (17. Táblázat, 14. Ábra), abból a célból, hogy felmérjük a különbségeket és elınyöket a hidrolízis elıtti és utáni elemzésekben. Az összetevık mennyiségét a minták szárazanyag-tartalom százalékában számítottuk. A különbözı citrus-gyümölcsök albedójának és préselt levének összetétele egyaránt jellemzı a gyümölcsre (grépfrút/citrom/narancs) és a gyümölcs-részre (albedó/lé): i.) Figyelembe véve az azonosítottság mértékét a nem hidrolizált és a hidrolizált mintákban, az albedók és levek jellemzı különbségeket mutattak (17. Táblázat). Az összetevık nagy részét TIC, míg a kis mennyiségő összetevıket SFI alapon értékeltük. A flavonoidok és aminosavak esetében, a TIC-bıl és az SFI-bıl számított átlagokat egyaránt, a 17. Táblázat mutatja, zárójelben az RSD%-ot tüntettük fel. Az albedók azonosítottságának mértéke hidrolízis hatására nı (a nagy molekulatömegő összetevık bomlásának következtében), míg a levek esetében csökken (a szacharóz és fruktóz bomlása miatt [8]). ii.) A hidrolizátumok elemzésének legnagyobb elınye, a citrusok jellemzı összetevıinek közvetlen, egy oldatból egy felvétellel, trimetilszilil(oxim)éter/észter-származékokkénti minıségi-mennyiségi meghatározása. Összességében 33 összetevıt találtunk a hidrolizált
mintákban
(17. Táblázat).
Az
összetevıket
a
2×10-3 – 49,9% - os
koncentráció-tartományban mértük, az azonosítottság 26,4-77,5% között változott. iii.) A naringenint és a heszperetint kizárólag a hidrolizált mintákban találtuk (17. Táblázat, naringenin a hidrolizált mintákban: 2,29%, 0,052%, 0,038%, 0,047%, heszperetin a hidrolizált mintákban: 1,06%, 0,31%, 0,073%, 0,10%, 0,072%), minthogy a természetes mátrixokban glikozidjaikként fordulnak elı, melyek válaszjele kicsiny. Ezt támasztja alá a ramnóz és glükóz mennyiségének változása is: mindkét monoszacharid mennyisége nı a hidrolízis során. A ramnóz a hidrolizálatlan mintákban nem, vagy csak nyomnyi mennyiségben található (17. Táblázat, ramnóz a nem hidrolizált mintákban: 0,011%, 0,0073%, 0,0079% és a hidrolizált mintákban: 2,88%, 0,26%, 1,80%, 0,17%, 1,54%, 0,32%, 0,88%, 0,26%), és mennyiségének növekedése arányos a flavonoidok mennyiségének változásával, ezért feltehetıen a ramnóz ezekben a gyümölcsökben, csak a flavonoidokhoz kötötten fordul elı. 58
A glükóz mennyisége is nı a hidrolízis során, s mennyiségének változása nem követi a flavonoidok mennyiségének változását. Feltehetıleg az egyéb di-, tri- és oligoszacharid egységek hidrolízise során, nagy mennyiségben szabadul fel. iv.) A naringenint és heszperetint a hidrolizált grépfrút és citrom albedók esetében TIC- és SFI-alapon egyaránt értékeltük. A 17. Táblázatban a különbözı értékekbıl számított eredmények átlagai szerepelnek, zárójelben az RSD%-ok láthatók. A többi esetben a flavonoid-összetevık kis mennyisége miatt, csak az SFI-szerinti értékelésre volt lehetıség. Az értékelés alapjául a naringenin esetében m/z = 267 (4. Ábra), m/z = 412 = [M-TMS-TMSOH-H]+, m/z = 503 = [M-TMS]+, a heszperetin esetében m/z = 297 (4. Ábra), m/z = 444 = [M-TMS-TMSO]+, m/z = 533 = [M-TMS]+ tömegő szelektív ionok szolgáltak. 14. Ábra (A-B) A grépfrút albedó összetevıinek kromatogramja közvetlenül, és 240 percig, 2 M trifluorecetsavval vezetett hidrolízis után, TMS(oxim)éter/észter származékokként, GCMS eljárással
Csúcsok: 1-33, mint 17. Táblázatban, * szennyezés
59
17. Táblázat A grépfrút, citrom, görög és spanyol narancs albedójának és préselt levének összetétele közvetlenül (nem hidrolizált) és 4 óráig vezetett hidrolízis után, TMS(oxim) éter/észterekként, GC-MS eljárással
Összetevı ⇓ Szárazanyag-tartalom%: 1. Foszforsav 2. Levulinsav 3. Almasav
Retenciós idı, perc ⇓ 2,03 2,97/3,27 4,43
4. Aszparaginsav [232]
5,05
5. Glutaminsav [156, 230]
5,42
6. Trimetoxi-benzoesav
5,85
7. Alanin [116, 252, 371]
6,00
8. Prolin [142, 216] 9. 4-OH-benzoesav [193, 267] 10. Xilóz 11. Arabinóz 12.Vaníliasav [267, 297, 312] 13. Ramnóz 14. Fukóz 15. Citromsav 16. Kínasav 17. Fruktóz 18. Galaktóz 19. Glükóz 20. Galakturonsav
6,48 7,17 8,78/8,90 8,92/9,00 9,60 9,95/10,13 9,98/10,26 10,12 10,52 11,63/12,05 12,18/12,65 12,43/12,66 12,98/13,38
Összetevı %, a minta szárazanyag-tartalom százalékában kifejezve Grépfrút Citrom Görög narancs Spanyol narancs albedó lé albedó lé albedó lé albedó lé n.hidr. hidr. n.hidr. hidr. n.hidr. hidr. n.hidr. hidr. n.hidr. hidr. n.hidr. hidr. n.hidr. hidr. n.hidr. hidr.
29,5 11,8 23,6 0,13 0,18 0,39 0,68 0,13 0,21 0,51 1,63 0,55 0,25 0,51 0,97 0,65 0,31 0,76 0,53* 1,15* 0,0085 0,031 0,017 0,019 (0) (3,7) 0,82* 0,47* 0,045 0,067 0,030 0,046 (2,60) (6,0) 1,51 4,73 1,70 0,34* 0,47 (12) 0,14 0,18 3,83 2,08 0,088 0,24 - 0,030 - 0,017 0,023 0,13 3,09 0,068 0,83 5,7 0,0021 0,074 - 0,068 0,011 0,10 2,88 0,26 0,011 1,80 - 0,095 0,14 0,022 9,7 7,7 0,11 0,67 0,67 0,14 0,068 0,63 0,75 10,3 8,1 18,6 6,3 14,6 11,7 0,98 0,10 1,72 6,2 14,9 10,8 18,1 14,0 25,4 0,11 - 0,099 0,12
10,6 28,8 13,1 17,1 10,0 0,37 0,41 0,080 0,13 0,21 0,28 0,084 0,13 0,42 0,50 0,61 1,79 0,88 1,31 1,06 1,67 1,39 0,045 0,069 1,29 1,25 0,22 0,34 1,66 1,61 0,64* 0,91* 0,0034 0,0084 0,036 0,12 - 0,011 0,021 0,35 (8,8) (3,1) 0,34 0,35
-
0,021 0,078 0,096 0,016 0,027 0,15 0,13
0,26* (2,7) 1,97 0,032 49,9 0,45 7,3 4,60 -
1,53
-
1,15
0,35
-
-
1,38 0,84 0,17 48,0 0,29 1,90 5,17 0,20
-
3,08
-
2,49
-
2,40
0,013 0,033
-
-
-
0,035
0,0088 0,067 0,20 0,22 0,014 0,064 0,085 0,10 0,0023 0,011 - 0,0091 0,0068 0,012 - 0,0097
4,48 0,010 0,040 0,0073 1,54 0,33 0,0076 0,064 0,060 12,4 0,81 0,38 3,53 7,9 13,3 3,38
0,036 3,01 0,17 15,1 8,3 -
0,10 2,00 2,87 0,042 0,0087 0,026 0,32 0,0079 0,88 2,97 0,0053 0,14 0,053 0,042 9,5 18,3 1,21 1,65 0,49 2,28 16,1 11,7 14,4 2,27
0,086 0,95 0,068 15,0 7,6 -
1,42 0,032 0,26 1,04 0,055 9,2 1,16 14,5 -
60
21. Inozit 22. Szedoheptulóz 23.Cukor-foszfát [299, 315, 387] 24. Diszacharid1 (n.a.) 25. Diszacharid2 (n.a.) 26. Szacharóz 27. Diszacharidok (n.a.) 28. Diszacharid3 (n.a.)
13,70 15,20/15,38 17,22 19,00 19,40 19,58 18,30-23,00 20,57
29. Naringenin [267, 412, 503]
23,33/23,57
30. Heszperetin [297, 444, 533]
23,90/24,13
31. Klorogénsav [255, 345]
24,18
32. Tokoferol [237, 502] 33. Rozmaringsav Azonosítva összesen⇒
24,80 26,86
1,26 1,31 0,11 0,26 7,7 0,35 -
1,45 0,080 0,10 0,038 4,57 2,29* (7,2)
-
-
1,03 0,083 29,1 0,044
0,80 0,23 0,044 6,43 -
1,30 0,099 0,047 0,16 3,27 0,54 0,66
1,96 0,18 0,15 4,20 -
1,17 0,93 0,77 0,81 1,06 1,05 0,74 - 0,061 0,27 0,30 - 0,099 0,025 - 0,041 0,066 0,18 0,12 0,079 0,13 0,12 4,29 0,28 3,02 19,7 3,00 1,32 0,49 1,60 0,21 4,10 0,59 0,11 0,55 - 0,038 0,21
1,01 0,11 0,12 0,89 -
1,21 1,19 0,24 0,038 0,063 0,33 19,8 0,17 4,98 0,021 -
-
-
-
-
-
-
-
0,052
-
0,038
-
-
-
0,047
-
-
-
1,06* (12)
-
-
-
0,31
-
0,073
-
0,10
-
0,072
0,006 0,011 9 - 0,022 0,025 - 0,046 0,026 0,043 0,11 0,71 0,060 - 0,040 0,097 0,062 0,084 0,13 0,082 - 0,097 0,11 0,054 0,072 0,086 0,11 0,061 0,077 0,080 0,097 28,9 42,5 77,5 52,9 37,1 59,7 73,3 66,1 26,4 34,7 49,8 44,2 35,9 30,7 47,7 40,6
0,028 0,011
Jelölések: Az összetevık számozása megegyezik a 14. Ábra számozásával; n.hidr.= nem hidrolizált, hidr.= 2M TFA oldattal 100oC-on 4 óráig hidrolizált, n.a. = nem azonosított; a xilóz az elsı az arabinóz a második csúcsa alapján értékelve. [ ] = m/z jellemzı szelektív fragmentum ionok *: Egyes összetevık (pl. aminosavak) mennyiségét, ha lehetséges volt, TIC és SFI (az összetevık neve mellett lévı m/z szerint) alapján egyaránt értékeltük (a zárójelben lévı értékek a TIC és SFI alapon értékelt eredmények RSD%-át jelentik). A többi, nyomnyi mennyiségben lévı összetevıt, mint a prolin, 4-OH-benzoesav, vaníliasav, cukor-foszfát, klorogénsav és tokoferol, kizárólag SFI alapon értékeltük.
61
5.2.3. Sárkányfő-fajok összetevıinek minıségi-mennyiségi elemzése A gyógynövények virág (Dracocephalum moldavica L. és Dracocephalum ruyschiana L.) és szár (Dracocephalum. moldavica L.) kivonatának összetevıit, közvetlenül és hidrolízist követıen TMS(oxim)-éter/észter-származékokként mértük (18. Táblázat, 15. Ábra). Az összetevık mennyiségét a minták szárazanyag-tartalom százalékában számítottuk. Az eredmények alapján megállapítható, hogy i.) a hidrolízis eredményeképpen az összetevık mennyisége nıtt, a glikozidkötéső szacharidok, és az észterek bomlása következtében. ii.) A sárkányfő virág és szár (D. moldavica L.) összetételében jelentıs különbségek nem mutatkoztak. iii.) A két különbözı fajta virág (D. moldavica L. és D. ruyschiana L.) kivonata között csekély különbségeket mértünk: - a D. ruyschiana L. jelentısebb mennyiségő arabitolt (18. Táblázat, 0-0,6%), ramnózt (18. Táblázat, 0-3,19%) és ötszörös mennyiségő kínasavat (18. Táblázat, 0,140,73%) tartalmaz. - Nem tartalmaz ferulasav-3,4-dihidroxifenil-tejsav-észtert, továbbá - a szabad 3,4-dihidroxifenil-tejsav tartalma hozzávetıleg az egyötöde a többi mintában mértnek (18. Táblázat, 0,12%). - A
legfontosabb
különbség
az
apigenin-tartalomban
mutatkozik;
jelentısen
alacsonyabb, csupán a tizede a D. moldavica L. fajta virág és szár kivonatban mérthez képest (18. Táblázat, 0,070%). Még a hidrolizált mintában (0,035%) is csupán az egyhuszada a megfelelı D. ruyschiana L. hidrolizátumban (0,76%) mértnek. iv.) Minthogy a mintákban a két flavonoid, az apigenin és a luteolin kis mennyiségben volt jelen, szelektív fragmentum ionok (SFI) alapján értékeltük: az apigenint m/z = 414 = [MTMS]+, m/z = 471 = [M-CH3]+, a luteolint m/z = 471 = [M-(TMS+{CH3}4Si)]+, m/z = 502 = [M-TMS]+, m/z = 559 = [M-CH3]+ ionok alapján.
62
18. Táblázat D. moldavica L. és D. ruyschiana L. kivonatok összetétele közvetlenül és eltérı ideig vezetett hidrolízisek (2h, 4h) után, trimetilszilil(oxim)éter/észterekkénti, GC-MS eljárással Összetevı⇓ Minta ⇒
Retenciós idı, perc
⇓
Hidrolízis idı, óra ⇒ 2,27 1. Foszforsav 2,62 2. Borostyánkısav 2,70/2,98 3. Levulinsav 4,58 4. Almasav 5,70 5. Borkısav 5,85 6. Trimetoxi-benzoesav 7. Hidroxi-benzoesav 7,28 [193, 267]
Összetevı %, a kivonatok szárazanyag-tartalmának százalékában kifejezve Dracocephalum Dracocephalum Dracocephalum ruyschiana L. moldavica L. virág moldavica L. szár virág 0 2 4 0 2 4 0 2 4 0,64 0,38 1,12 0,40 0,44
1,26 0,93 1,12 3,56 0,52 10,8
1,13 0,92 2,81 3,10 0,30 10,9
1,35 0,36 0,34 0,049 0,40
0,046 1,043
0,12
0,015 0,053 0,042
8,40 8. Arabitol 8,98 9. Vaníliasav [267, 297] 9,08 0,27 10. Arabinóz 9,95 11. Ramnóz 10,13 12. Citromsav 10,68 0,14 13. Kínasav 11,82/11,95 10,6 14. Fruktóz 12,23 15. Galluszsav [443, 458] 12,45/12,85 1,18 16. Galaktóz 12,63/12,85 4,82 17. Glükóz 13,45 0,25 18. Galakturonsav 19. 3,4-dihidroxifenil13,75 1,14 tejsav [267, 396] 13,87 0,78 20. Inozit 13,93 0,53 21. Palmitinsav [117, 313] 15,03 2,99 22. Kávésav 15,98 0,20 23. Margarinsav [117, 339] 16,23 0,53 24. Sztearinsav [117, 341] 18,33-23,12 3,80 25. Diszacharidok 24,35 0,37 26. Klorogénsav [255, 345] 24,83 27. Tokoferol [237, 502] 24,88/25,13 0,28 28. Apigenin [414, 471] 0,058 29. Luteolin [471, 502, 559] 26,67 0,45 30. Rozmaringsav [396] 31. Ferulasav-3.4-dihidroxi26,92
fenil-tejsav észter [338, 396]
1,48
1,90 0,65 0,73 1,58 3,75
2,16 0,94 2,17 2,07 5,83
1,63 0,45 0,67 0,20 0,96
1,52 0,76 1,22 2,52 0,17 9,0
1,47 0,85 3,50 1,66 0,18 10,74
-
-
-
0,047 0,41 0,23 0,21 1,21 1,12 0,11 0,34 0,51 0,033 0,084 0,25 0,19 0,32 0,49 0,30 0,27 0,037 0,023 0,030 14,7 6,5 13,0 3,07 2,98 0,037 0,063 2,78 2,25 0,52 2,18 3,06 11,7 10,3 8,5 9,1 13,6 0,39 0,27 0,33 0,38
0,16 0,33 0,73 16,3 1,62 7,6 0,37
0,12 0,14 0,75 1,29 3,19 3,77 1,37 1,58 8,6 5,7 0,015 0,022 2,44 2,77 14,1 17,5 1,03 1,06
4,15
4,96
0,58
0,12
0,59
1,19 0,91 3,47 0,12 0,91 4,85 0,24 0,41 0,76 0,17 0,43
1,11 0,47 2,84 0,15 0,47 3,98 0,80 0,27 0,50
0,88 0,67 0,89 0,50 0,63 0,78 0,49 0,24 0,21 0,78 0,31 0,32 3,68 2,44 2,34 1,44 1,46 1,07 0,19 0,088 0,054 0,27 0,12 0,085 0,49 0,24 0,21 0,78 0,31 0,32 4,96 6,56 4,64 8,74 8,26 5,78 0,54 0,32 0,32 0,31 0,17 0,18 0,28 0,13 0,070 0,035 0,095 0,058 0,024 0,013 1,26 0,90 1,19 0,50 0,49
-
-
3,43
3,76
-
6,62
-
-
-
0,87
-
28,48/29,00 2,60 1,27 1,07 2,34 4,10 4,88 4,03 2,53 2,35 32. N.a. összetevı [320] 28,97/29,50 1,30 33. N.a. tetraszacharidok 35,0 69,2 57,6 46,4 44,3 56,5 48,7 62,2 65,1 Összesen⇒ ⇒ Jelölések, mint a 17. Táblázatban; az összetevık számozása megegyezik a 15. Ábra számozásával
63
15. Ábra A D. moldavica L. kivonat összetevıinek kromatogramja közvetlenül (felsı kromatogram), és 2 óráig, 2 M trifluorecetsavval vezetett hidrolízis után (alsó kromatogram), TMS(oxim)éter/észter származékokként, GC-MS eljárással
Csúcsok: a számozás megegyezik a 18. Táblázat összetevıinek sorszámával
64
5.2.4. A festıgyökér-kivonatok összetevıinek minıségi-mennyiségi elemzése A festıbuzér, a Rubia tinctorum, gyökerébıl és gyöktörzsébıl (RTGY) a 4.4.4. és a 4.4.5. fejezetben leírtak szerint elıállított hidrolizálatlan, savval eltérı ideig és enzimatikusan hidrolizált kivonatok összetételét, párhuzamosan, GC-MS (16. Ábra) és HPLC-DAD (17. Ábra) módszerrel mértük (19. Táblázat). Az RTGY minták TMS(oxim)éter/észter származékokkénti GC-MS elemzésének elınye, hogy egyetlen felvételbıl jóval több információ nyerhetı, mint a HPLC-DAD meghatározásokból (19. Táblázat). Így tehát, a vizsgálatunk alapelve szerint, ugyanabból a kivonatból savas, és enzimatikus hidrolízisek után, a hidrolizátumok összetételének párhuzamos GC-MS és HPLC-DAD elemzése, az e folyamatokban elbomló és átalakuló összetevıkrıl (antrakinokok, antrakinon-glikozidok, di- és triszacharidok) támpontokkal szolgált, a minta eredeti összetételére vonatkozóan. Továbbá, a különbözı módszerekkel végzett mérések révén, az egész analitikai eljárás reprodukálhatóságát – ideértve a minta-elıkészítési, hidrolízis- és származékképzési lépéseket – a mindkét módszerrel mérhetı antrakinonok esetében, két, egymástól független kromatográfiás eljárással követtük. A reprodukálhatóságokat a párhuzamos GC és HPLC mérések eredményeibıl számítottuk, az alizarin, purpurin, lucidin, nordamnakantál és pszeudopurpurin esetében, az értékek 0,3-9,4% (19. Táblázat) között változtak.
65
19. Táblázat Festıgyökér-minták összetétele hidrolízis nélkül (RTGy0), 2M trifluorecetsavval eltérı ideig vezetett (15-300 perc) és enzimatikus (RTGyenz) hidrolízisek után, TMS(oxim)éter/észter származékokként, GC-MS eljárással, és származékképzés nélkül HPLC-DAD módszerrel Összetevık Szám Retenciós Név * idı, perc 1 4,51 almasav 2 5,92 trimetoxi-benzoesav 3 8,50 xilóz 4 9,87 ribóz 5 10,22 citromsav 6 10,6 kínasav 7 11,72/11,85 fruktóz 8 12,63/12,85 glükóz 9 13,78 inozit 10 19,08/11,95 alizarin** 6♠ HPLC-DAD 11 19,80 szacharóz 12 20,45/20,88 purpurin** 7♠ HPLC-DAD 13 20,95/21,28 cellobióz 14 21,18/21,48 primveróz 15 21,82/21,92 # lucidin** 4♠ HPLC-DAD 16 21,93 #
Összetevı mennyisége, mg/g a szárított mintában RTGY0
HPLCDAD
7.9 2.38 0.076 2.99 6.4 0.23 0.94 (6.3) 0.86 104.2 0.60 (6.7) 0.66 0.17 0.73 0.37 (6.0) 0.34 nordamnakantál** 13♠ HPLC-DAD detected 17 22,08/2240 genciobióz 18 23,47/24,22 n.a. diszacharidok 11.2 19 23,47 # 21.1 (9.4) pszeudopurpurin** 3♠ HPLC-DAD 24.1 20 25,93 0.89 raffinóz 21 26,55 0.14 rozmaringsav lucidin-ω-metiléter 9♠ 0.041 (5.6) 10♠ alizarin-2-metiléter detected 12♠ lucidin-ω-etiléter 0.11 15♠ munjistin-etilészter 0.23 161.8 GC-MS és HPLC-DAD összesen 45.2 Azonosítva összesen***
RTGY15
RTGY30
RTGY60
7.8 (2.8) 0.37 (6.1) 9.1 (4.0) 0.59 (4.6) 2.02 (5.2) 0.075 (3.1) 89.7 (4.7) 80.1 (1.3) 0.22 (2.3) 5.4 (5.4) 5.0 1.80 13.5 (2.6) 14.0 1.32 (4.2) 8.1 (4.9) 0.94 (4.4) 1.0 1.55 (4.2) 5.3 (2.7) 12.7 (7.2) 11.5 0.025 (4.5) 0.17 (4.3) 0.083 detected 240.3 (4.2) 67.1
7.2 (5.6) 1.15 (6.4) 16.5 (3.9) 1.11 (4.2) 2.01 (3.6) 0.067 (4.0) 75.5 (2.8) 84.9 (5.1) 0.21 (4.8) 11.8 (6.9) 10.7 26.2 (1.1) 25.8 1.14 (2.9) 3.61 (4.5) 2.28 (6.8) 2.07 1.30 (4.8) 1.10 (7.6) 1.56 0.025 (5.3) 0.17 (3.5) 0.11 detected 235.8 (4.7) 65.9
7.2 (4.6) 1.80 (4.1) 20.7 (3.9) 1.37 (5.5) 1.12 (4.0) 0.068 (4.1) 67.6 (4.7) 91.8 (5.6) 0.22 (5.2) 14.9 (1.9) 14.5 25.8 (3.0) 26.9 1.02 (4.8) 3.13 (4.6) 3.98 (5.0) 4.27 1.05 (5.2) 0.63 0.020 (3.0) 0.16 (5.5) 0.15 detected 243.1 (5.3) 67.9
RTGY150 RTGY300 RTGYenz 7.6 (8.4) 2.9 (7.5) 20.1 (0.3) 2.66 (4.0) 0.49 (5.7) 0.069 (2.6) 38.4 (5.2) 94.5 (6.4) 0.22 (5.4) 16.0 (2.6) 16.6 24.3 (6.9) 26.8 0.59 (4.8) 1.49 (5.2) 8.8 (1.6) 8.6 0.34 (6.3) 0.48 0.020 (3.6) 0.17 (1.3) 0.32 (3.8) detected 0.91 0.18 220.6 (4.7) 61.6
6.3 (5.7) 3.60 (6.1) 20.6 (4.4) 3.33 (4.9) 0.40 (5.3) 0.075 (3.4) 25.0 (4.6) 92.5 (5.7) 0.23 (5.0) 16.8 (1.3) 16.5 26.9 (0.3) 27.0 0.36 (4.5) 0.58 (3.5) 7.9 (2.7) 7.6 0.15 (4.7) 0.017 (5.1) 0.18 (3.8) 0.25 detected 204.7 (4.9) 57.2
9.1 (4.4) 0.22 (2.5) 0.26 (3.7) 0.034 (3.8) 8.4 (4.8) 21.0 (2.3) 0.097 (4.2) 16.0 (0.9) 16.2 130.3 (3.9) 0.39 (6.9) 0.43 40.0 (3.0) 0.46 (7.3) 0.51 0.19 (4.1) 4.13 (5.2) 0.37 (6.0) 12.6 (3.9) 22.6 (5.9) 24.6 1.20 (4.3) 0.19 (4.9) 0.10 (4.7) detected 268.5 (5.2) 77.8
RTGYH 3.76 (3.4) 6.1 (7.3) 72.3 (7.4) 23.0 (3.7) 2.03 (4.2) 0.068 (3.6) 26.6 (4.6) 111.3 (2.7) 0.13 (5.1) 14.7 (2.4) 14.2 1.33 (5.7) 19.0 (4.7) 20.3 1.11 (3.6) 5.0 (3.9) 0.39 (5.2) 0.42 0.91 (4.3) 2.8 (3.3) 0.32 0.029 (4.6) 0.16 (4.4) 0.30 (5.1) detected 291.5 (3.8) 54.5
66
19. Táblázat lábjegyzete: RTGYH: extrakció elıtt 150 percig 2M TFA-oldattal hidrolizált minta, ( ) zárójelben a GC-MS mérések RSD% eredményei, a félkövérrel írt számok a GC-MS és HPLC-DAD mérések RSD% eredményei; * = az összetevık számozása a 16. Ábra számozásának megfelelı; ♠ = az antrakinonok számozása a 17. Ábra számozásának megfelelı; n.a. = nem azonosított; ** = SFI alapján értékelt (az autentikus modellvegyületek alapján); **# = SFI alapján értékelt (RTGY kivonatokból izolált összetevık szerint); SFI-k: alizarin: m/z=[M-CH3]+=369, purpurin: m/z = [M2CH3]+ = 442, lucidin: m/z = [M-CH3]+ = 471 és m/z = [M-(TMS+CH3)]+ = 399; nordamnakantál: m/z = [M] = 484; pszeudopurpurin: m/z = [M] = 588 és m/z = 500 = [M-(CH3)4Si]+; *** = a kivonatok szárazanyag-tartalmára vonatkoztatott %-ban megadva.
A szelektív enzimatikus hidrolízis, az antrakinon-glikozidok szabad antrakinonokká és a megfelelı szacharidokká hasadását eredményezi. A savas és enzimatikus hidrolizátumokban az antrakinonok és szacharidok mennyiségeinek összevetése alapján, az alábbi megállapítások tehetık: - A közvetlenül és hidrolízis után mért antrakinonok mennyisége közti különbség, megfelel az antrakinon-primverozidok mennyiségének, amennyiben feltételezzük, hogy a hozzá kapcsolódó antrakinonok a hidrolízis körülményei között változatlanok maradnak. - A pszeudopurpurin HPLC-vel és GC-vel mért mennyiségei összhangban, és rendre hidrolízis nélkül 21,1/24,1 mg/g (19. Táblázat) és az enzimatikus hidrolizátumban 22,6/24,6 mg/g (19. Táblázat), a méréseink hibahatárán belül ugyanannyi volt, eszerint a festıbuzér-mintában szabad állapotban van jelen. A pszeudopurpurin a savas hidrolízis során fokozatosan elbomlik (19. Táblázat, RTGY0: 21,1 mg/g – RTGY300: 0 mg/g), és mennyiségileg purpurinná alakul (19. Táblázat, RTGY0: 0,60 mg/g – RTGY300: 26.9 mg/g). Ezt támasztja alá, hogy enzimatikus hidrolízis közben, a glikozidok aglikonra és a megfelelı cukrokra bomlanak, és az enzimatikus hidrolízis után purpurin alig mutatható ki (19. Táblázat, RTGYenz: 0,39 mg/g), tehát a savas hidrolíziskor nem glikozidjából válik szabaddá, hanem a pszeudopurpurinból keletkezik. - A másik két antrakinon (alizarin, lucidin), csaknem teljesen glikozid (alizarin- és lucidinprimverozid)
formában
található
a
festıbuzér-mintákban,
mivel
mennyiségük
a
hidrolizálatlan mintában csekély (19. Táblázat, RTGY0, alizarin: 0,94 mg/g, lucidin: 0,37 mg/g). - A savas és enzimatikus hidrolízis során az alizarin és a lucidin szabaddá válik, ugyanakkor az
enzimatikus
hidrolízis
folyamán
a
lucidin
meglehetısen
gyorsan,
részben
nordamnakantállá oxidálódik (a lucidin másik bomlásterméke ismeretlen). A savas hidrolíziskor a lucidin primverozidjából lassan válik szabaddá (17. Ábra), melyet szintén
67
lassú, s nem elhanyagolható mértékő bomlása és a primveróz gyors glükózzá és xilózzá hidrolízise kísér. - Mindezekbıl következik, hogy a lucidin mennyisége csak számítás útján határozható meg. Amennyiben feltételezzük, hogy a primveróz kizárólag az alizarin- és a lucidinprimverozidjából származik, és az alizarin az enzimatikus hidrolíziskor nem bomlik, akkor az összes primveróz mennyiségébıl a teljes alizarin mennyiséget kivonva, eredményül a lucidin összmennyiségét kapjuk. - Így tehát, a lucidin savas hidrolízis közbeni legnagyobb vesztesége, a mért és számított lucidin-mennyiségek különbségébıl adódik, mely 48%-os lucidin-veszteséget jelent.
A
cukrok
és
karbonsavak
GC-MS
mérésének
reprodukálhatósága
a
19. Táblázatban látható, a zárójelben lévı értékek az RSD%-ok mutatják. A legalább két párhuzamos mérés alapján számított reprodukálhatóság 0,3% (xilóz) – 8,4% (almasav) között változott. Az eltérı módon készített kivonatok összes azonosított összetevıinek mennyisége 45,2-77,8% (19. Táblázat, utolsó sor: RTGY0 – RTGYenz) között változott. Ez az eltérés azzal magyarázható, hogy a nem hidrolizált minta nagy molekulákat tartalmaz, és az enzimatikus hidrolízis során képzıdı di- és triszacharidok, fruktóz, almasav, citromsav, stb. változatlan marad, s GC-MS-sel mérhetı trimetilszilil(oxim)-éter/észter származékokká alakul. Az eltérı hidrolízis-körülmények során, az RTGY összetevıinek keletkezését és stabilitását tanulmányozva kitőnt, hogy - az almasav szabad formában van jelen, és még a 150 perces hidrolízis alatt is stabil; bár az RTGY mátrix egyéb összetevıi csekély bomlását elısegíthetik (19. Táblázat, RTGYH minta: 3,76 mg/g almasav). - A trimetoxi-benzoesav kötötten fordul elı, mivel mennyisége a savas hidrolízis elırehaladtával folyamatosan nı (19. Táblázat, 0-3,60 mg/g). - A xilóz feltehetıen, nem kizárólag a primveróz (6-β-D-xilozil-glükóz) bomlásterméke, mivel a 15 és 30 perc közötti felszabadulása 3,4-szer nagyobb mértékő volt a primveróz bomlásához képest. - A kínasav és az inozit mennyisége minden esetben változatlan volt (19. Táblázat, kínasav: 0,067-0,076 mg/g, inozit: 0,21-0,23 mg/g). - A minták fruktóz- és glükóz-tartalmának eredete, annak a ténynek ismeretében, hogy a fruktóz keletkezése és bomlása a hidrolízis folyamán párhuzamosan zajlik [8], az RTGY68
minták glükóz- és szacharóz-tartalmának változásait követve állapítható meg. A 60-300 percig, savval hidrolizált kivonatok átlagos glükóz-tartalma, feltehetıleg, maradéktalanul az enzimes hidrolizátumokban mért szacharóz- és primveróz-tartalomból származik, mivel a mért és számított eredmények egyértelmő egyezést mutatnak. - A diszacharidok (cellobióz, primveróz, genciobióz, nem azonosított diszacharid) és a triszacharid (raffinóz) mennyisége a 15-30 perces hidrolízis után maximumot mutatott, majd folyamatosan csökkent (19. Táblázat, cellobióz: 1,32–0,36 mg/g, primveróz: 8,1– 0,58 mg/g, genciobióz: 1,55–0,15 mg/g, nem azonosított diszachrid 5,3–0 mg/g, raffinóz: 0,025–0,017 mg/g). - A primveróz legnagyobb intenzitású fragmentum-ionja az m/z = 259 (16. Ábra C, 14 a,b csúcsok), a pentóz-egységbıl származik, hasonlóan a hexozil-diszacharidokhoz, melyek a megfelelı m/z = 361-es tömeget adják. A két tömeg közötti különbség, m/z = 361259 = 102, megfelel egy „CHOTMS”-egységnek.
69
16. Ábra (A-B) A 150 percig 2M trifluorecetsav oldattal és (C) az enzimatikusan hidrolizált minták összetétele TMS(oxim)éter/észter származékokként, GC-MS eljárással
A: teljes kromatogram, B: A részlete nagyítva, a számozás megegyezik a 19. Táblázat összetevıinek sorszámaival, a, b: ugyanazon összetevı két származéka
70
17. Ábra Antrakinonok modell oldatának (A), a festıgyökér-kivonatok hidrolizálatlan (B) és 2M trifluorecetsavval 100ºC-on, 150 percig hidrolizált mintájának (C) 254 nm hullámhosszon felvett HPLC-DAD kromatogramjai
Csúcsok: 1=lucidin-primverozid; 2=alizarin-primverozid; 3=pszeudopurpurin; 4=lucidin; 5=2-hidroxiantrakinon; 6=alizarin; 7=purpurin; 8=ismeretlen, 9=lucidin-metiléter; 10=alizarin-2-metiléter; 11=antrakinon; 12=lucidin-ω-etiléter; 13=nordamnakantál; 14=1-hidroxi-antrakinon; 15=munjistin-etilészter; 16=kinizarin.
71
5.2.5. A három hazai meggyfajta és az indiai ber gyümölcs összetevıinek minıségimennyiségi elemzése A meggy (Prunus cerasus) és a ber (Zizyphus mauritiana) vizsgálatát a Központi Élelmiszeripari Kutatóintézettel együttmőködésben végeztük. Kutatásunk célja, a meggy- és a ber-gyümölcsök karbonsav-, aminosav- és szacharid-tartalmának érés/tárolás közbeni követése volt. Ennek keretében három hazai meggyfajta, az Érdi bıtermı, Pándy és Kántorjánosi frissen szedett, és 2 hétig +4-6oC hıfokon tárolt mintáit, továbbá két különbözı ber gyümölcs, a Reshmi és Umran fajta éretlen (zöld) és érett (sárga) mintáit vizsgáltuk. A vizsgálatokat a flavonoidok elemzésével is szerettük volna kiegészíteni, ám ez sem a meggyek, sem a ber esetében nem teljesült. Ennek oka, a meggyek esetében feltehetıleg a flavonoidok tárolás közbeni bomlása volt. A ber esetében, a minta kis mennyisége miatt, hidrolízis-vizsgálatokra nem volt lehetıség, így a flavonoidok kimutatása nem volt lehetséges, hiszen glikozidjaik formájában a kimutatási határ jelentısen kedvezıtlenebb.
5.2.5.1. A három hazai meggyfajta összetevıi Elızetes vizsgálataink alapján kitőnt, hogy az egyes savak, cukrok és cukoralkoholok, széles koncentráció-tartományban vannak jelen a meggyekben. Az összetevıket egymás jelenlétében retenciós idejük és SFI alapján azonosítottuk, és TIC alapon értékeltük. Az egyetlen kivétel a glikolsav, melyet a reagenscsúcsok elfedtek, ilyen módon mennyiségét SFI alapon határoztuk meg: [M] = m/z = 220, [M-CH4]+ = m/z = 204 és [M-Si(CH3)4]+ =m/z=132. Aminosavakat nem tudtunk azonosítani, mivel azok feltehetıleg, a kimutatási határ (5-15 ng/µL injektált mennyiség) alatti mennyiségben voltak jelen a mintákban. A kapott adatok átlagos reprodukálhatósága: RSD%: 3,2-3,5% volt.
A 2001. és 2002. évi meggyminták összetétele frissen szedés és tárolás után
A három hazai meggyfajta (Érdi bıtermı, Pándy és Kántorjánosi) frissen szedett és két különbözı ideig tárolt mintáinak, szárazanyag-tartalmakra számított összetételét 2001. és 2002. években vizsgáltuk. A fı összetevık változásait a két évben a 18. Ábra szemlélteti, a 2002. évi vizsgálatok eredményeit a 20. Táblázat mutatja.
72
18. Ábra A 2001. és 2002. évi meggyfajták fı összetevıinek mennyiségi változása a frissen szedett, és a két hétig 4oC-on tárolt mintákból készült TMS(oxim)-éter/észter származékok GC-MS elemzése alapján Almasavtartalom a frissen szedett meggyekben
Szorbittartalom a frissen szedett meggyekben
12,0
15,0
%*
20,0
%*
16,0
8,0 4,0
5,0
0,0
0,0
E02001
E02002
P02001
P02002
K02001
K02002
E02001
E02002
P02001
P02002
K02001
K02002
Glükóztartalom a frissen szedett meggyekben
Fruktóztartalom a frissen szedett meggyekben
50,0
40,0
40,0
%*
30,0
%*
10,0
20,0 10,0
30,0 20,0 10,0
0,0
0,0
E02001
E02002
P02001
P02002
K02001
K02002
E02001
Almasavtartalom a 2 hétig tárolt meggyekben
E02002
P02001
P02002
K02001
K02002
Szorbittartalom a 2 hétig tárolt meggyekben
12,0
20,0
10,0 15,0
%*
%*
8,0 6,0 4,0
10,0 5,0
2,0 0,0
0,0 E12001
E12002
P12001
P12002
K12001
E12001
K12002
P12001
P12002
K12001
K12002
Glükóztartalom a 2 hétig tárolt meggyekben
50,0
50,0
40,0
40,0
30,0
30,0
%*
%*
Fruktóztartalom a 2 hétig tárolt meggyekben
E12002
20,0
20,0 10,0
10,0 0,0
0,0
E12001
E12002
P12001
P12002
K12001
K12002
E12001
E12002
P12001
P12002
K12001
K12002
Jelölés: *a szárazanyag-tartalom %-ában kifejezett %
73
20. Táblázat: A 2002. évi meggyfajták összetevıinek mennyiségi változása a frissen szedett, és a két hétig tárolt mintákból készült TMS(oxim)-éter/észter származékok GC-MS elemzése alapján, zárójelben: RSD% Összetevı mennyisége, Az összetevı⇓ Retenciós a meggyminta szárazanyag-tartalmának %-ában kifejezve Érdi bıtermı Pándy Kántorjánosi idı: perc ⇓ A meggy ⇒ E0 E1 P0 P1 K0 K1 13,9 14,9 16,8 15,8 16,8 17,4 szárazanyag-tartalom % ⇒ 7,46 1. foszforsav 0,65 (4,4) 0,51 (4,3) 0,82 (0,2) 0,58 (1,0) 0,79 (5,2) 0,49 (5,5) 8,34 2. borostyánkısav 0,13 (4,0) 0,12 (5,3) 0,15 (0,3) 0,07 (9,3) 0,11 (15,5) 0,05 (1,0) 11,02 3. C10karbonsav 0,17 (0,7) 0,20 (0,4) 0,13 (8,0) 0,071 (17,1) 0,062 (3,9) 0,068 (26,3) 11,21 4. almasav 9,1 (1,8) 6,4 (1,8) 11,6 (7,6) 9,7 (3,4) 9,13 (1,5) 8,8 (2,4) 19,31/19,53 0,087 (1,8) 0,084 (1,0) 0,12 (0,9) 0,093 (4,3) 0,087 (1,3) 0,079 (4,6) 5. xilóz 22,45/22,56 0,019 (13) 6. ramnóz 0,00 (0) 0,013 (2,3) 0,00 (0) 0,00 (0) 0,00 (0) 23,04 7. citromsav 0,057 (9,2) 0,10 (2,9) 0,12 (5,0) 0,052 (0,05) 0,12 (14,9) 0,061 (7,0) 23,38 8. kínasav 0,070 (1,6) 0,059 (7,4) 0,13 (2,1) 0,081 (2,5) 0,11 (2,7) 0,080 (2,6) 24,56 9. szorbit 10,8 (5,7) 9,8 (2,3) 18,5 (1,8) 18,5 (0,7) 14,3 (0,3) 14,3 (1,6) 25,05/25,13 31,3 (1,1) 39,7 (2,9) 28,1 (1,3) 32,9 (2,8) 26,5 (2,8) 10. fruktóz 29,2 (0,4) 25,55/26,05 36,9 (4,3) 31,9 (1,5) 41,0 (4,1) 34,3 (4,2) 32,6 (1,2) 11. glükóz 29,2(1,5) 12. galakturonsav 25,25/26,44 1,09 (3,19) 0,92 (3,8) 0,92 (0,8) 0,84 (2,3) 0,90 (2,4) 0,66 (2,2) 26,58 13. inozit 0,11 (3,5) 0,089 (4,8) 0,07 (3,3) 0,052 (5,5) 0,05 (4,3) 0,037 (7,2) 28,56 14. sztearinsav 0,090 (0,9) 0,089 (2,5) 0,085 (2,7) 0,069 (10) 0,076 (0,7) 0,049 (2,0) 33,17 15. szacharóz 0,035 (3,5) 0,030 (8,9) 0,023 (7,6) 0,021 (4,4) 0,031 (1,0) 0,019 (2,4) 36,08/36,26 0,060 (0,3) 0,059 (2,4) 0,063 (1,6) 0,043 (0,3) 0,059 (2,4) 0,043 (2,2) 16. laktóz 40,28/41,11 0,40 (0,7) 0,18 (1,1) 0,33 (0,3) 0,29 (0,4) 0,28 (2,8) 0,30 (1,6) 17. genciobióz 93,7 91,5 99,2 91,3 84,9 84,6 Azonosítva összesen ⇒ A fajta és a tárolás hatása a 2002. évi meggyekben A három különbözı fajta összetétele között, jelentısebb különbséget nem találtunk. A két hétig, +4oC-on való tárolás hatását figyelembe véve megállapítható, hogy minden fajta esetében (i) az almasav-tartalom jelentıs mértékben, miközben a citrom- és kínasav-tartalom csak kis mértékben csökkent. (ii) A szorbit, fruktóz és glükóz tekintetében a közölt és általunk mért eredmények (20. Táblázat, 18. Ábra), figyelembe véve, hogy különbözı fajtákról van szó, összhangban vannak az egyetlen irodalmi adattal [157]. A növekvı fruktóz-tartalom a fruktóz-tartalmú poliszacharidok bomlásával magyarázható [177]. Az alkalmazott módszer hatékonyságát az egyetlen oldatból, egyetlen felvétellel azonosított összetevık összmennyisége bizonyítja: 82,7-99,9% (20. Táblázat)
A szedés évének hatása Összehasonlítva a 2001-ben és 2002-ben, frissen szedett gyümölcsök fı összetevıinek mennyiségét, megállapítható, hogy (i) az almasav- és szorbit-tartalom 2002-ben magasabb, 74
ugyanakkor, (ii) a glükóz és fruktóz mennyisége, a méréseink hibahatárán belül, megegyezik a két évben. A meggyek fı összetevıinek tárolás közbeni változását vizsgálva a két egymást követı évben (2001, 2002), megállapítható, hogy a változások iránya ugyanaz, annak megfelelıen, hogy azonos helyrıl származnak, és ugyanazzal a szakértelemmel kezeltek, amely reprodukálható tulajdonságot eredményezett.
A meggyminták összetétele 2M-os trifluorecetsavas hidrolízis után
A hidrolízis vizsgálatok célja flavonoidok, s egyéb hidrolízis-termékek meghatározása volt a meggyekben. A hidrolízis-körülmények optimálását, korábbi tapasztalatok alapján [8], a három meggyminta közül, az Érdi bıtermıvel (21. Táblázat, E minta, 19. Ábra), a hidrolízis idejét változtatva, 2 M TFA-oldat felhasználásával modelleztük.
19. Ábra Az Érdi bıtermı meggy összetétele hidrolízis nélkül (E0 kromatogram) és trifluorecetsavval 3 óráig tartó hidrolízis (E0H kromatogram) után TMS(oxim)-éter/észterekként, GC-MS módszerrel
Csúcsok: számozás megegyezik a 21. Táblázat összetevıinek sorszámával
75
Az Érdi bıtermı (E) meggyel végzett hidrolízis-vizsgálatok alapján, a korábbi tapasztalatokkal megegyezıen [8], megállapítható, hogy az optimális hidrolízis idı mindig kompromisszum eredménye, mivel a hidrolízis közben egyes összetevık keletkeznek, míg mások elbomlanak. A hidrolízis optimális idejének, a 21. Táblázat tanúsága alapján, a meggyminták esetében a 3 órát tekintettük, s ennek alapján a másik két meggyminta (Kántorjánosi, K és Pándy, P) összetételét is, 3 óra hidrolízis idı után elemeztük (22. Táblázat). 21. Táblázat: Az Érdi bıtermı (E) eltérı ideig hidrolizált mintáinak összetétele, TMS(oxim)éter/észter származékokként, GC-MS módszerrel
Összetevı⇓
Retenciós idı: perc ⇓
1. glikolsav 4:25/4:31 2. foszforsav 7:46 3. levulinsav 8:51/9:20 4. oxálecetsav 10:24/10:32 5. almasav 11:21 6. szacharid jellegő 13:04 bomlástermék 7. xilóz 19:31/19:53 8. arabinóz 19:58/20:09 9. ribóz 20:16/20:41 10. ramnóz 22:36/22:48 11. citromsav 23:04 12. kínasav 23:38 13. szorbit 24:56 14. fruktóz 25:05/25:13 15. glükóz 25:55/26:06 16. galakturonsav 26:25 17. inozit 26:58 18. n.a. 28:41/28:45/ bomlástermék 28:50/28:55 19. szacharóz 33:17 20. diszacharidok 35:20-41:30 azonosítva összesen⇒ ⇒
Az összetevı mennyisége a meggyminta szárazanyagtartalmának %-ában kifejezve, a hidrolízisidı függvényében 0 óra 1/2 óra 1 óra 3 óra 5 óra 1,67 1,81 1,86 2,63 4,24 0,36 0,37 0,34 0,37 0,34 0 1,86 3,49 11,1 13,9 0 1,12 1,24 1,55 1,45 9,1 7,0 7,5 8,3 7,9 -
1,29
2,19
1,57
1,21
0,098 0,10 0 0 0,075 0,052 10,5 40,6 35,0 1,49 0,10
0,11 0,32 0,048 0,097 0,055 0,054 5,8 13,3 28,1 1,10 0,093
0,10 0,36 0,083 0,11 0,040 0,062 5,4 7,9 26,5 1,10 0,086
0,11 0,34 0,29 0,12 0,038 0,089 5,1 1,26 29,2 0,73 0,11
0,11 0,41 0,40 0,12 0,057 0,10 5,9 0,67 27,2 0,54 0,26
-
0,12
0,17
0,63
0,76
0,039 0,63 100,5
9,0 72,2
5,38 64,4
3,38 67,5
2,19 68,2
Jelölések: n.a.=nem azonosított; - : kimutatási határ alatt
76
22. Táblázat: A 2002. évi meggyminták összetétele hidrolízis nélkül, és 2M TFA-oldattal, 3 óráig vezetett hidrolízis után, TMS(oxim)-éter/észter származékokként, GC-MS eljárással
Összetevı⇓
Retenciós idı: perc ⇓
1. glikolsav 4:25/4:31 2. foszforsav 7:46 3. levulinsav 8:51/9:20 4. oxálecetsav 10:24/10:32 5. almasav 11:21 6. szacharid jellegő 13:04 bomlástermék 7. xilóz 19:31/19:53 8. arabinóz 19:58/20:09 9. ribóz 20:16/20:41 10. ramnóz 22:36/22:48 11. citromsav 23:04 12. kínasav 23:38 13. szorbit 24:56 14. fruktóz 25:05/25:13 15. glükóz 25:55/26:06 16. galakturonsav 26:25 17. inozit 26:58 18. n.a. 28:41/28:45/ bomlástermék 28:50/28:55 19. szacharóz 33:17 20. diszacharidok 35:20-41:30 azonosítva összesen⇒ ⇒
Az összetevı mennyisége a meggyminta szárazanyagtartalmának %-ában kifejezve, fajtánként, hidrolízis nélkül és 3 órás hidrolízis után E0
P0
K0
0 óra 1,67 0,36 9,1
3 óra 2,63 0,37 11,1 1,55 8,3
0 óra 2,39 10,3
3 óra 1,89 0,16 12,4 0,29 11,1
0 óra 1,69 14,6
3 óra 4,07 0,17 11,8 0,24 14,3
-
1,57
-
0,69
-
0,61
0,098 0,10 0,075 0,052 10,5 40,6 35,0 1,49 0,10
0,11 0,34 0,29 0,12 0,038 0,089 5,1 1,26 29,2 0,73 0,11
0,16 0,12 17,8 37,0 31,8 1,22 0,20
0,19 0,67 0,72 0,16 0,013 0,21 11,6 0,78 26,7 0,93 0,12
0,14 0,022 0,083 15,4 35,9 31,0 1,04 0,048
0,17 0,58 0,60 0,15 0,022 0,21 7,8 0,54 28,0 0,80 0,065
-
0,63
-
0,96
-
0,99
0,039 0,50 99,7
3,38 67,5
0,23 0,80 101,8
2,33 71,8
0,19 0,77 100,9
2,50 73,6
Jelölések: mint a 21. Táblázatban
Az eredményeket az alábbiakban összegezzük: - Számos új, jellegzetes hidrolízis-termék képzıdött. Sajnálatos módon a várt flavonoidokat nem detektáltuk a hidrolizátumokban. - Az újonnan képzıdött összetevık: a levulinsav, oxálecetsav, ribóz, ramnóz, mono- és diszacharid jellegő vegyületek. - Az arabinóz és kínasav mennyisége nıtt a nem hidrolizáltban mérthez képest. - A fruktóz és a galakturonsav jelentıs mértékben bomlanak, (a szorbit mennyiségének csökkenésében feltehetıleg a vele együtt eluálódó, részlegesen szililezett fruktóz bomlását mértük. Modellvizsgálatok szerint, a hidrolízis feltételei között a szorbit nem bomlik).
77
5.2.5.2. Az indiai ber gyümölcs összetevıinek minıségi-mennyiségi elemzése Az általunk vizsgált, négy különbözı ber fajta (Reshmi sárga, Reshmi zöld, Umran sárga, Umran zöld) mintáinak szárazanyag-tartalomra vonatkoztatott összetételét a 23. Táblázat tartalmazza. A minıségi-mennyiségi meghatározás alapjául, a cukrok és karbonsavak jól ismert fragmentációs tulajdonságai és rendelkezésre álló retenciós idejük szolgált [7-10].
23. Táblázat Indiai ber minták karbonsav-, szacharid- és polialkohol-tartalma TMS(oxim)észter/éterekként, GC-MS eljárással Az összetevı mennyisége, a ber minta szárazanyagtartalmának %-ában kifejezve
Ber ⇒ Összetevı ⇓
Retenciós idı/ perc
Reshmi sárga
1
2
3
0,64 0,59 2,22 0,77 0,50 0,11 0,03 0,18 0,10 0,02 0,09 0,85 13,6 12,6 0,23 60,6 0,61 0,87 94,6
14,52 0,61 0,52 2,03 0,70 0,48 0,05 0,04 0,18 0,08 0,02 0,09 0,86 13,8 12,9 0,17 62,2 0,51 0,76 96,0
Szárazanyag-tartalom % ⇒ 1. foszforsav 2. almasav 3. cukor-jellegő összetevık 4. xilóz 5. n.a. pentóz 6. citromsav 7. kínasav 8. n.a. hexóz 9. mannit 10. fruktóz 11. glükóz 12. inozit 13.szacharóz 14. n.a. diszacharid 15. raffinóz
6,46 9,44 10,26 10,44 10,57 13,02 15,33/15,47 16,30/16,45 18,30 20,16 22,12 22,54 23,20/23,29 24,25/24,38 25,37 31,12 34,29/34,49 44,06
azonosítva összesen ⇒
0,55 0,51 2,18 0,61 0,51 0,04 0,04 0,22 0,08 0,01 0,08 0,86 14,3 13,1 0,23 60,7 0,52 0,73 95,3
átlag 0,61 0,52 2,20 0,75 0,50 0,10 0,04 0,18 0,10 0,02 0,09 0,87 14,1 13,0 0,23 61,1 0,58 0,74 95,7
RSD %
3,44 1,12 2,61 5,0 1,63 17,5 13,3 6,1 5,7 2,36 1,64 1,22 2,57 1,08 5,5 3,54
Reshmi Umran zöld sárga
11,60 0,51 2,94 0,78 0,24 0,03 0,03 0,29 0,03 0,10 0,01 11,3 8,56 0,20 66,2 0,25 91,5
13,21 0,82 1,42 1,56 0,34 0,32 0,35 0,12 0,17 0,09 0,11 6,9 10,3 9,9 0,54 57,6 0,22 1,14 91,9
Umran zöld
10,99 0,51 1,85 0,47 0,07 0,47 0,07 0,01 0,08 0,14 1,02 15,3 12,6 0,42 51,8 0,05 0,63 85,5
Jelölések, mint a 21-22. Táblázatban
A mérések eredményeibıl megállapítható, hogy egyes összetevık a fajtára jellemzıek, mások a gyümölcs érettségével mutatnak összefüggést, míg vannak olyanok, amelyek mennyisége az egyes mintákban közel azonos. Az almasav-tartalom a fajtára és érettségre egyaránt jellemzı: a Reshmi és Umran zöld/sárga mintákban, rendre, 2,94/0,52% és 1,85/1,42%. 78
A xilóz- és a nem azonosított pentóz-tartalom, feltehetıleg, a gyümölcs érése folyamán végbemenı hidrolízis-folyamatok következtében, számottevıen magasabb a sárga, mint a megfelelı zöld gyümölcsben; a pentózok összmennyisége (xilóz + n.a. pentóz) a Reshmi és Umran fajtában (sárga/zöld) rendre a következık voltak: 0,04 + 0,18% / 0,03 + 0,03%; 0,12 + 0,017% / 0,07 + 0,01%. A raffinóz is vélhetıen hidrolízistermék; a raffinóz-tartalom határozottan magasabb a sárga, mint a zöld gyümölcsökben (Reshmi és Umran sárga/zöld: 0,74/0,25% és 1,14/0,63%). Közelítıleg állandó mennyiségő összetevı a fruktóz (8,56-14,3%), glükóz (9,9-13,1%) továbbá a szacharóz (51,8-66,2%), mely egyben – a gyümölcs meglehetısen édes ízének megfelelıen – a fı alkotója is. Az érett (sárga) és éretlen (green) ber gyümölcsök cukor-, cukoralkohol- és karbonsavtartalmának együttes elemzése alapján megállapítható, hogy a gyümölcsök cukortartalma (fıként a szacharóz) meglehetısen magas, savtartalmuk alacsony.
A karbonsavak, aminosavak, szacharidok és polialkoholok TMS (oxim) éter/észterekkénti, együttes elemzırendszerét sikeresen alkalmaztuk a meggyek és a ber gyümölcsök esetében. Az összetevıket hosszadalmas mintaelıkészítési eljárás nélkül, a mátrix jelenlétében, egy oldatból, egyetlen felvétellel határoztuk meg. Módszerünk, bármely más természetes mátrix esetében is eredményesen alkalmazható technika, mely lehetıvé teszi a különbözı összetevık feltérképezését, és esetlegesen változásuk követését - különbözı technológiai, biológiai folyamatok során, - gyógyhatású készítményekben, - eredetiség megállapításában.
79
6. Új tudományos eredmények; Összefoglalás 1. Három antocianidin (pelargonidin, cianidin, malvidin), egy flavonol (kvercetin), két flavon (apigenin, luteolin) és két flavanon (naringenin, heszperetin) TMS(oxim)-származékainak szelektív fragmentációját és e fragmentum ionok mennyiségi meghatározásra való alkalmasságát, valamennyi vizsgált esetben, elsıként bizonyítottuk. i) Megállapítottuk, hogy a származékkészítés során (oximmá alakítás, majd szililezés) az antocianidinek és a flavanonok TMS-oximokat, a flavonolok és flavonok TMS-származékokat képeznek. ii) Az antocianidinek oximmá alakulásának jellemzı reakcióútját, s a folyamatban keletkezı termékeket elsıként azonosítottuk és mértük. 2. Négy antrakinon modell-vegyület (antrakinon, kinizarin, alizarin, purpurin) származékkészítését, trimetilszilil- és terc.-butil-dimetilszilil-származékaik fragmentációját, GC-MS módszerrel követtük. i) Bizonyítottuk, hogy a származékká alakítás elınyös és szükséges, s a származékkészítı szerek választékából (BSA, HMDS, MTBSTFA), a HMDS-sel 100oC hıfokon, 60 percig vezetett származékképzés a legkedvezıbb. ii) Elsıként írtuk le a festıbuzér-mintákban azonosított, a kereskedelemben nem kapható antrakinonok, a pszedopurpurin és lucidin, valamint, a lucidin bomlásterméke, a nordamnakantál TMS-származékainak fragmentációját, s fragmentum ionjaik mennyiségi mérésre való alkalmasságát. 3. Felderítettük a nem redukáló és redukáló glikozidkötéső szacharidok TMS- és TMS(oxim)származékainak egymástól eltérı, jellemzı fragmentációját. i) Nagyszámú, eltérı polimerizációs fokú és mennyiségő glikozid TMS(oxim)-származékainak részletes fragmentum analitikai tanulmánya alapján ii) bizonyítottuk, hogy a redukáló és nem redukáló szacharidok, eltérı és jellemzı fragmentumionjaik alapján, autentikus vegyület hiányában is, azonosíthatók és mennyiségileg mérhetık. 4. Az 1.-3. pontokban részletezett alapkutatások analitikai felhasználása sorából, új kutatási eredményünknek tekintjük az alábbi mátrixok összetevıinek, elızetes kivonási és dúsítási lépés nélkül, a mátrix jelenlétében, s kivonatokban, egy oldatból egyetlen gázkromatográfiás felvételbıl való minıségi-mennyiségi azonosítását, nagyságrendileg eltérı mennyiségekben, úgymint i) a citrus gyümölcsök, 33 összetevıjét a 2×10-3-49,9%, ii) a sárkányfő gyógynövény 33 összetevıjét az 1,3×10-2-17,5%, iii) a festıgyökér-kivonatok savas/enzimes hidrolizátumai 21 összetevıjét, a 2,0×10-3-13%, iv) a meggyminták 20 összetevıjét, az 1,9×10-2-41%, s v) a ber minták 15 összetevıjét, az 1,0×10-3-66,2% koncentráció tartományokban azonosítottuk és mértük. A felsorolt mátrixok szárazanyag-tartalmaikra számított azonosítottsága, rendre, 26,477,5% (i), 35,0-69,2% (ii), 45,2-77,8% (iii), 64,4-101,8% (iv) és 85,5-96,0% (v) között változott. 80
7. Summary 1. The selective fragmentation patterns of the trimethylsilyl (oxime) derivatives of three anthocyanidins (pelargonidin, cyanidin, malvidin), one flavonol (quercetin), two flavons (apigenin, luteolin), two flavanones (naringenin, hesperetin), and, the suitability of these fragmentum ions for quantitation purposes have been confirmed for the first time. i) We showed first that under the derivatization process (oximation and subsequent silylation), anthocyanidins and flavanons form TMS-oxime-, while flavanols and flavons TMS-derivatives, and, ii) we also documented the pathway of the TMS-oximes’ formation along with the identification and quantification of products originated from. 2. Derivatization and fragmentation patterns of the TMS- and tert.butyldimethyilsilyl- derivatives of four model athraquinones (anthraquinone, quinizarin, alizarin, purpurin) have been followed applying GC-MS. i) We proved that derivatization of these compounds are advantageous and necessary, and, out of the choice of derivatization reagents (BSA, HMDS, MTBSTFA), HMDS should be used at 100oC temperature, for 60 min. ii) We described first the fragmentation patterns and the suitability for quantitation of the TMSderivatives of pseudopurpurin, lucidin and nordamnacanthal, – not available on the market – together with the identification and quantification of several other constituents. 3. We cleared up the substantially different fragmentation of the TMS- and TMS-oxime derivatives of non-reducing and reducing saccharides of glycosidic linkages. i) Based on the fragmentation study of TMS (oxime) glycosides of various degree of polymerization ii) it has been proved that the reducing and non-reducing saccharides, due to their different and characteristic fragmentum ions, can be identified and quantified, also in the shortage of the corresponding authentic compound. 4. We evaluate also as basic researches, the analytical applications of our studies, (detailed in points 13), consisting of the identification and quantification of several compounds in extracts, or without any preliminary enrichment methods, in the presence of their various matrices, from one solution, by one injection, present in extremely different concentrations in the ranges as follows: (i) the 33 constituents of citrus fruits at 2×10-3-49,9%, (ii) the 33 constituents of the Dracocephalum medicinal plant at 1,3×10-217,5%, (iii) the 21 constituents of the Rubia tinctorum root at 2,0×10-3-13%, (iv) the 20 constituents of sour cherry fruits at 1,9×10-2-41%, as well as, (v) the 15 constituents of ber fruits at 1,0×10-3-66,2%. The total amounts of the identified and quantified constituents, (calculated on dry basis) proved to be, in order of listing, between 26,4- 77,5% (i), 35,0-69,2% (ii), 45,2-77,8% (iii), 64,4-101,8% (iv) and 85,596,0% (v), respectively. 81
8. Irodalmi hivatkozások [1] I. Molnár-Perl, K. Horváth, Chromatographia 45 (1997) 321 [2] K. Horváth, I. Molnár-Perl, Chromatographia 45 (1997) 328 [3] I. Molnár-Perl, R. Bartha, K. Horváth, Chromatographia 48 (1998) 101 [4] I. Molnár-Perl, A. Vasanits, K. Horváth, Chromatographia 48 (1998) 111 [5] I. Molnár-Perl, J. Chromatogr. 845 (1999) 181 [6] I. Molnár-Perl, J. Chromatogr. 891 (2000) 1 [7] K. Horváth, I. Molnár-Perl, Chromatographia 48 (1998) 120 [8] I. Boldizsár, K. Horváth, Gy. Szedlai, I. Molnár-Perl, Chromatographia 47 (1998) 413 [9] Zs. Katona, P. Sass, I. Molnár-Perl, J. Chromatogr. 847 (1999) 91 [10] I. Molnár-Perl, Zs.F. Katona, Chromatographia, 51 (2000) S227 [11] I. Molnár-Perl, Zs. Füzfai, J. Chromatogr. A 1073 (2005) 201 [12] Zs. Füzfai, Zs.F. Katona, E. Kovács, I. Molnár-Perl, J. Agric. Food Chem. 52(2004) 7444 [13] Z. Deyl, I. Mikšik, F. Tagliaro, E. Tesařova, Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in BioSciences, Journal of Chromatography Library, Vol. 60, (1998) Elsevier [14] G. Lunn, L.C. Hellwig: Handbook of Derivatization reaction for HPLC, John Wiley, (1998) Interscience. [15] B.H. Havsteen, Pharm. Ther. 96 (2002) 67 [16] P.C.H. Hollmann, J. Sci. Food Agric. 80 (2000) 1081 [17] H.M. Rawel, S. Rohn, J. Kroll, Int. J. Biol. Macromolecules 32 (2003) 109 [18] Dr. Tarr Ferenc, A flavonoidok, 2002. [19] Rusznyák I., Szent-Györgyi A., Nature 27 (1936) 138 [20] G. Zemplén, Á. Gerecs, Berichte der Deutchen Chemischen Gesellschaft 71 (1938) 2520 [21] S.A. Aherne, N.M. O’Brien, Nutrition 18 (2002) 75 [22] M. Netzel, G. Strass, C. Kaul, I. Bitsch, H. Dietrich, R. Bitsch, Food Res. Int. 35 (2002) 213 [23] K.Y. Park, G.O. Jung, K.T. Lee, J. Choi, M.Y. Choi, G.T. Kim, H.J. Jung, H.J. Park, J. Ethnophar. 90 (2004) 73 [24] M.V.S. Elipe, Anal. Chim. Acta 479 (2003) 1 [25] I. Molnár-Perl, Zs. Füzfai, J. Chromatogr. A 1073 (2005) 201
82
[26] E. de Rijke, P. Out, W.M.A. Niessen, F. Ariese, C. Goojier, U.A.Th. Brinkman, J. Chromatogr. A 1112 (2006) 31 [27] J.K. Prasin, C. Wang, S. Barnes, Free Radical Biology & Medicine, 37 (2004) 1324 [28] M. Naczk, F. Shahidi, J. Chromatogr. A 1054 (2004) 95 [29] H.R. Shulten, N. Simmleit, R. Müller, Anal. Chem. 61 (1989) 221 [30] R. Cristov, V. Bankova, J. Chromatogr. 623 (1992) 182 [31] T.J. Schmidt, I. Merfort, J. Chromatogr. 634 (1993) 350 [32] T.J. Schmidt, I. Merfort, G. Willuhm, J. Chromatogr. A 669 (1994) 236 [33] T.J. Schmidt, G. Willuhn, Biochem. Syst. Ecol. 28 (2000) 133 [34] M.D. Guillén, M.J. Manzanos, Food Chem. 63 (1998) 373 [35] M.C. Lin, M.J. Tsai, K.C. Wen, J. Chromatogr. A 830 (1999) 387 [36] M.P. Fernandez, P.A. Watson, C. Breuil, J. Chromatogr. A 922 (2001) 225 [37] K. Sutthanut, B. Sripanidkulchai, C. Yenjai, M. Jay, J. Chromatogr. A 1143 (2007) 227 [38] R.D. Schmid, R. Mues, J.H. McReynolds, G.V. Velde, N. Nakatani, E. Rodrígez, T.J. Marby, Phytochem. 12 (1973) 2765 [39] K.R. Markham, K.A. Mitchell, A.L. Wilkins, J.A. Daldy, Y. Lu, Phytochem. 42 (1996) 205 [40] Y.C. Fiamegos, C.G. Nanos, J. Vervoort, C.D. Stalikas, J. Chromatogr. A 1041(2004) 11 [41] E.S. Keith, J.J. Powers, J. Food Sci. 31 (1966) 971 [42] T. Katagi, A. Horri, Y. Oomura, H. Miyakawa, T. Kyu, Y. Ikeda, K. Isoi, J. Chromatogr. 79 (1973) 45 [43] E. Bombardelli, A. Bonati, B. Gabetta, E.M. Martinelli, G. Mustich, J. Chromatogr. 139 (1977) 111 [44] A. Baj, E. Bombardelli, B. Gabetta, E.M. Martinelli, J. Chromatogr. 279 (1983) 365 [45] W. Greenaway, T. Scaysbrook, F.R. Whatley, Phytochem. 27 (1988) 3513 [46] W. Greenaway, F.R. Whatley, Phytochem. 29 (1990) 2551 [47] S. English, W. Greenaway, F.R. Whatley, Phytochem. 30 (1991) 531 [48] W. Greenaway, I.Gusdere, F.R. Whatley, Phytochem. 30 (1991) 1883 [49] W. Greenaway, F.R. Whatley, Phytochem. 30 (1991) 1887 [50] W. Greenaway, S. English, J. May, F.R. Whatley, Biochem. Syst. Ecol. 19 (1991) 507 [51] V. Bankova, R. Christov, G. Stoev, S. Popov, J. Chromatogr. 607 (1992) 150 [52] J.F. Stevens, H. Hart, E.T. Elema, A. Bolck, Phytochem. 41 (1996) 503 [53] D.G. Watson, E.J. Oliveira, J. Chromatogr. B 723 (1999) 203 [54] G.J. Soleas, J. Yan, D.M. Goldberg, J. Chromatogr. B 757 (2001) 161 83
[55] F. Deng, S.W. Zito, J. Chromatogr. A 986 (2003) 121 [56] E. Prytzyk, A.P. Dantas, K. Salamo, A.S. Pereira, V.S. Bankova, S.L. DeCastro, F.R.A. Neto, J. Ethnopharm. 88 (2003) 189 [57] R.W. Owen, R. Haubner, W.E. Hull, G. Erben, B. Spiegelhalder, H. Bartsch, B. Haber, Food Chem. Toxicology 41 (2003) 1727 [58] A. dos Santos Pereira, M.C. Padilha, F.R. de Aquino Neto, Microchem. J. 77 (2004) 141 [59] M. Popova, S. Silici, O. Kaftanoglu, V. Bankova, Phytomedicine 12 (2005) 221 [60] A.R. Rechner, M.A. Smith, G. Kuhnle, G.R. Gibson, E.S. Debnam, S.K.S. Srai, K.P. Moore, C.A. Rice-Evans, Free Rad. Biol. Med. 36 (2004) 212 [61] A.M. Jenner, J. Rafter, B. Halliwell, Free Rad. Biol. Med. 36 (2004) 212 [62] K. Zhang, Y. Zuo, J. Agric. Food Chem. 52 (2004) 222 [63] T. Furuya, S. Shibata, H. Iizuka, J. Chromatog. 21 (1966) 116 [64] J. B. Terrill, E. S. Jacobs, J. Chromatogr. Sci. 8 (1970) 604 [65] G.W. van Eijk, H.J. Roeymans, J. Chromatogr. 124 (1976) 66 [66] L.M. Henriksen, H. Kjosen, J. Chromatogr. 258 (1983) 252 [67] G.W. van Eijk, H.J. Roeijmans, J. Chromatogr. 295 (1984) 497 [68] H. Nakamura, T. Okuyama, J. Chromatogr. 509 (1990) 377 [69] M.N. Bakola-Christianopoulou, V.P. Papageorgiou, K.K. Apazidou, J. Chromatogr. 645 (1993) 293 [70] S. Husain, P.N. Sarma, K.S.R. Rao, V.V.S. Lakshimi, J. Chromatogr. A 685 (1994) 356 [71] A.A. Mosi, K. J. Reimer, G.K. Eigendorf, Talanta 44 (1997) 985 [72] S.O. Mueller, M. Schmitt, W. Dekant, H. Stopper, J. Schlatter, P. Schreier, W.K. Lutz, Food Chem. Toxicol. 37 (1999) 481 [73] D. Fabbri, G. Chiavari, H. Ling, J. Anal. Appl. Pyrolysis 56 (2000) 167 [74] M.A. Elsohly, W. Gul, T.P. Murphy, Inter. Immunpharm. 4 (2004) 1739 [75] N. Itoh, H. Tao, T. Ibusuki, Anal. Chem. Acta 555 (2006) 201 [76] J.P. Kamerling, J.F.G. Vliegenthart, J.Vink , J.J. Ridder, Tetrahedron 27 (1971)4275 [77] J.P. Kamerling, J.F.G. Vliegenthart., J. Vink, J.J. Ridder, Tetrahedron 28 (1972 4375 [78] N.K. Kochetkov, O.S. Chizhov, N.V. Molodtsov, Tetrahedron 24 (1968) 5587 [79] J. Lönngren, S. Svensson, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 29 (1974) 41 [80] D.C. DeJongh, T. Radford, J.D. Hribar, S. Hanessian, M. Bieber, G. Dawson, C.C. Sweeley, J. Amer. Chem. Soc. 91(1969)1728 [81] S. Karady, S.H. Pines, Tetrahedron 26 (1970) 4527 [82] G. Petersson, Carbohydr. Res. 26(1974) 47 84
[83] R.A. Laine, C.C. Sweely, Carbohydr. Res. 27 (1973) 199 [84] G.W. Chapman, R.J. Horvat , J. Agric. Food Chem.37 (1989) 947 [85] J.S. Kim, E.R. Laskowich, R.G. Arumugham, R.E. Kaiser, G.J. MacMichael, Anal. Biochem. 347 (2005) 262 [86] M. Medeiros, B.R.T. Simoneit, J. Chromatogr. A 1141 (2007) 271 [87] J.L. García Banos, A. Olano, N. Corzo, Chromatographia 52 (2000) 221 [88] M.L. Sanz, J. Sanz, I. Martínez-Castro, Chromatographia 56 (2002) 617 [89] M.L. Sanz, M.T. Diez-Barrio, J. Sanz, I. Martínez-Castro, J. Chromatogr. Sci. 41 (2003) 205 [90] M.L. Sanz, J. Sanz, I. Martínez-Castro, J. Chromatogr. A 1059 (2004) 143 [91] E. de la Fuente, M.L. Sanz, I. Martínez-Castro, J. Sanz, J. Chromatogr. A 1135 (2006) 212 [92] I. Boldizsár, Z. Szőcs, Zs. Füzfai, I. Molnár-Perl, J. Chromatogr. A 1133 (2006) 259 [93] Zs. Füzfai, I. Molnár-Perl, J. Chromatogr. A 1149 (2007) 88 [94] J.S. Kim, E.R. Laskowich, F. Michon, R.E. Kaiser, R.G. Arumugham, Anal. Biochem. 358 (2006) 136 [95] J.S. Kim, B.L. Reuhs, F. Michon, R.E. Kaiser, R.G. Arumugham, Carbohydr. Res. 341 (2000) 1061 [96] I. Ciuanu, R. Caprita, Anal. Chim. Acta 585 (2007) 81 [97] M. Jia, Q.H. Zhang, D.B. Min, Food Chem 65 (1999) 445 [98] I.A. Baxter, K. Easton, K. Schneebeli, F.B. Whitfield, Innovations Food Sci. Emerg. Technol. 6 (2005) 372 [99] S.L. Birla, S. Wang, J. Tang, J.K. Fellmann, D.S. Mattinson, S. Lurie, Post. Biol. Tech. 38 (2005) 66 [100] C. Da Porto, F. Cordaro, N. Marcassa, LWT 39 (2006) 159 [101] D. Tonder, M.A. Petersen, L. Poll, C.E. Olsen, Food Chem. 61 (1998) 223 [102] S. Selli, T. Cabaroglu, A. Canbas, J. Food Comp. Anal. 17 (2004) 789 [103] J.L. Gómez-Ariza, T. Garcia-Barrera, F. Lorenzo, J. Chromatogr. A 1047 (2004) 313 [104] D.R.L. Caccioni, M. guizzardi, D.M. Biondi, A. Renda, G. Ruberto, Int. J. Food Microbiol. 43 (1998) 73 [105] F. De Pasquale, M. Siragusa, L. Abbate, N. Tusa, C. De Pasquale, G. Alonzo, Sci. Hort. 109 (2006) 54 [106] Á. Högnadóttir, R.L. Rouseff, J. Chromatogr. A 998 (2003) 201
85
[107] M. Sawamura, U.S. Son, H.S. Choi, M.S.L. Kim, N.T.L. Phi, M. Fears, C. Kumagai, Int. J. Aromather. 14 (2004) 27 [108] M.R. Maróstica, Jr. G.M. Pastore, Food Chem. 101 (2007) 345 [109] F. Buiarelli, G.P. Cartoni, F. Coccoli, T. Leone, J. Chromatogr. A 730 (1996) 9 [110] J.Y. Lin, C.Y. Tang, Food Chem. 101 (2007) 140 [111] F.R. Marin, C. Soler-Rivas, O. Benavente-Garcia, J. Castillo, J.A. Perez-Alvarez, Food Chem. 100 (2007) 736 [112] S.A. Aherna, N.M. O’Brien, Nutrition 18 (2002) 75 [113] Z. Amirghofran, M. Azabbakht, M.H. Karimi, J. Ethnopharm 72 (2000) 167 [114] S. Saeidnia, G.A. Reza, M. Ito, F. Kiuchi, G. Honda, J. Biosci 60 (2005) 22 [115] U. Mahmood, V.K. Kaul, V. Singh B. Lal, H.R. Negi, P.S. Ahuja, Flav. Frag. J. 20 (2005) 173 [116] S.G. Agarwal, B.K. Kapahi, R.K. Thappa, J. Ess. Oil Res. 17 (2005) 94 [117] H. Michal, J. Pavel, Z. Petr, H. Lucie, J. Chromatogr. A 1010 (2003) 195 [118] A.Z. Kakasy, É. Lemberkovics, L. Kursinszki, G. Janicsák, É. Szıke, Herba Pol. 3 (2002) 112 [119] J. Domokos, J. Petredi, K. Halasz-Zelnik, Ind. Crops. Prod. 3 (1994) 91 [120] S. Salidnia, R.G. Ahmad, N. Uchiyama, M. Ito, G. Honda, F. Kiuchi, Chem. Pharm. Bull. 52 (2004) 1249 [121] U. Nahoko, I. Michiho, K. Fumiyuki, H. Gisho, T. Yoshio, K.K. Olimjon, A.A. Ozodbek, Tetrahedron Lett. 45 (2004) 531 [122] U. Nahoho, K. Fumiyuki, I. Michiho, H. Gisho, T. Yoshio, K. Olimjon, A. Ozodbek, J. Natural Products 66 (2003) 128 [123] A.D. Zorina, G.A. Fokina, A.L. Shavarda, A.M. Batyuk, Rastit. Resur. 38 (2002) 60 [124] F. Jahaniani, S.A. Ebrahimi, N. Rahbar-Roshandel, M. Mahmoudian Phytochemistry 66 (2005) 1581 [125] S. Saeidnia, A.R. Gohari, M. Ito, F. Kiuchi, G. Honda, Z. Naturforsch. 60 (2005) 22 [126] G. Hai Feng, C. Ruo-Yun, China J. Chin. Mat. 29 (2004) 232 [127] Z. Jamzad, R.J. Gayer, G.C. Kite, M.S.J. Simmonds, M. Inrouille, A. Jalili, Biochem. System. Ecol. 31 (2003) 587 [128] J.B. Li, Y. Ding, China J. Chin. Mat. 26 (2001) 697 [129] V. Povilaiyté, M.E. Cuvelier, C. Berset, J. Food Lipids 8 (2001) 45 [130] G. Janicsák, I. Máthé, V. Miklóssy-Vári, G. Blunden, Biochem. Syst. Ecol. 27 (1999) 733 [131] N. Saito, J.B. Harborne, Phytochemistry 31 (1992) 3009 86
[132] Z. Jamzad, M.W. Chase, M. Ingrouille, M.S. Simmonds, Taxon. 52 (2003) 21 [133] J.A. Pedersen, Biochem. Syst. Ecol. 28 (2000) 229 [134] L.G. Angelini, L. Pistelli, P. Belloni, A. Bertoli, S. Panconesi, Ind. Crops Prod. 6 (1997) 303 [135] T. Masawaki, M. Taya, S. Tone, J. Ferm. Bioeng. 81 (1996) 567 [136] Z.A. Tóth, O. Raatikainen, T. Naaranlahti, S. Auriola, J. Chromatogr. 630 (1993) 423 [137] K. Krizsán, Gy. Szókán, Z.A. Tóth, F. Hollósy, M. László, A. Khlafulla, J. Liq. Rel. Technol. 19 (1996) 2295 [138] G.C.H. Derksen, T.A. van Beek, E. de Groot, A. Capelle, J. Chromatogr. A 816 (1998) 277 [139] K. Sato, T. Yamazaki, E. Okuyama, K. Yoshihira, K. Shimomura, Phytochemistry 30 (1991) 1507 [140] P. Bányai, N. Kuzovkina, É. Szıke, Chromatographia 63 (2006) 111 [141] F. Nakanishi, Y. Nagasawa, Y. Kabaya, H. Sekimoto, K. Shimomura, Plant Physiol. 43 (2005) 921 [142] K. Bóka, J. Jakab, I. Király, Biologia Plantarum 45 (2002) 281 [143] A. Vasconsuelo, A.M. Guiletti, G. Picotto, J. Rodriguez-Talou, R. Boland, Plant Sience 165 (2003) 429 [144] Y. Yasui, N. Takeda, Mutation Research 121 (1983) 185 [145] Y. Kawasaki, Y. Goda, K. Yoshihira, Chem. Pharm. Bull. 40 (1992)1504 [146] S. G. Jagadeesh, G. L. D. Krupadanam, G. A. Srimannarayana, Indian J. Chem., 39 (2000) 396 [147] N.Gupta, P.S. Srivastava, Plant Cell Rep. 17 (1998) 552 [148] A. Jossang, A. Zahir, D. Diakite, J. Mauritine, Phytochemistry 42 (1996) 565 [149] M. Medic-Sÿaric, Z. Males, G. Stanic, S. Saric, Croat. Chem. Acta, 69 (1996) 1265 [150] G. Cheng, Y. Bai, Y. Zhao, J. Tao, Y. Liu, G. Tu, L.Ma, N. Liao, X. Xu, Tetrahedron 56 (2000) 8915 [151] C. Shou, Z. Feng, J. Wang, X. Zheng, Planta Med. 68 (2002) 799 [152] K. Yoshikawa, N. Shimono, S. Arihara, Tetrahedron Lett. 32 (1991) 7059 [153] S.D. Gusakova, S.S. Sagdullaev, K.N. Aripov, K.H.C. Basher, M. Kurkcuoglu, B. Demirci, Chem. Nat. Compd. 35 (1999) 401 [154] W.H. Outlaw,K.A. Shuqiu Zang, K.A. Riddle, A. Womble, L.C. Anderson, W.M. Outlaw, N.N. Outlaw, E.C. Outlaw, A.B. Thistle, Econ. Bot. 56 (2002) 198
87
[155] B.N. Su, M. Cuendet, N. R. Farnsworth, H. S. Fong, J. M. Pezzuto, D. Kinghorn, Planta Med. 68 (2002) 1125 [156] M.L. Richmond, S.C.C. Brandao, J.I. Gray, P. Markakis & C.M. Stine, J. Agric. Food Chem. 29 (1981) 4 [157] P. Hansen, Gartenbauwissenschaft, 62 (1997) S97 [158] M.B. Petersen, L. Poll, Eur. Food Res. Technol. 209 (1999) 251 [159] I. Vedrina-Dragojević, B. Šebečić, M. Horvatić, Nahrung 41 (1997) S355 [160] S. Burkhardt, Dun Xian Tan, L.C. Manchester, R. Hardeland, R.J. Reiter, J. Agric. Food Chem. 49 (2001) 4898 [161] S.A. Aherne, N.M. O'Brien, Nutrition 18 (2002) 75 [162] J-P. Goiffon, P.P. Mouly, E.M. Gaydou, Analytica Chimica Acta 382 (1999) 39 [163] C.T. da Costa, D. Horton, S.A. Margolis, J. Chromatogr. A 881 (2000) 403 [164] A. Chandra, M.G. Nair, A.F. Iezzoni, J. Agric. Food Chem. 40 (1992) 967 [165] A. Chandra, M.G. Nair, A.F. Iezzoni, J. Agric. Food Chem. 41 (1993) 1062 [166] H. Wang, M.G. Nair, A.F. Iezzoni, G.M. Strasburg, A.M. Booren, J.I. Gray, J. Agric. Food Chem. 45 (1997) 2556 [167] H. Wang, M.G. Nair, G.M. Strasburg, A.M. Booren, J.I. Gray, J. Agric. Food Chem. 47 (1999) 840 [168] N.P. Seeram, L.D. Bourquin, M.G. Nair, J. Agric. Food Chem. 49 (2001) 4924 [169] A. Versari, D. Barbanti, S. Biesenbruch, P.J. Farnell, Ital. J. Food Sci. 9 (1997) 141 [170] A. Lugasi, J. Hóvári, Acta Alimentaria 31 (2002) 63 [171] M. Geibel, D. Treutter, N. Meier, Euphitica 45 (2000) 229 [172] W. Schwab, G. Scheller, P. Schreier, Phytochemistry, 29 (1990) 607 [173] B. Cemeroglu, S. Velioglu, S. Isik, J. Food Sci. 59 (1994) 1216 [174] M. Özkan, A. Yemenicioglu, B. Citak, B. Cemeroglu, J. Food Quality 23 (2000) 421 [175] M.R. Ochoa, A.G. Kessler, A. De Michelis, A. Mugridge, A.R. Chaves, J. Food Eng. 49 (2001) 55 [176] Gy. Urbányi, K. Horti, Acta Alimentaria 21 (1992) 307 [177] C.L’Homme, J.L. Peschet, A. Puigserver, A.J. Biagini, J. Chromatogr.A 920 (2001) 291
88
9. Az értekezés anyagából készült dolgozatok, poszterek és szakmai elıadások Referált tudományos folyóiratokban megjelent közlemények:
1. Zs. Füzfai, E. Kovács, I. Molnár-Perl: Identification and Quantitation of the Main Constituents of Sour Cherries: Simultaneously, as Their Trimethylsilyl Derivatives, by GC-MS Chromatographia, 60 (2004) S143-S151
2. Zs. Füzfai, Zs. F. Katona, E. Kovács, I. Molnár-Perl: Simultaneous identification and quantification of the sugar, polyalcohol, carboxylic and amino acid contents of sour cherry, apple and ber fruits as their trimethylsilyl derivatives, by gas chromatography mass spectrometry J. Agr. Food Chem. 52 (2004) 7444-7452
3. I. Molnár-Perl, Zs. Füzfai: Chromatographic, Capillary electrophoretic and capillary electrochromatographic techniques analysis of flavonoids J. Chromatogr. A 1073 (2005) 201-227
4. A. Kakasy, Zs. Füzfai, L. Kursinszki, I. Molnár-Perl, É. Lemberkovics: Analysis of Nonvolatile Constituents in Dracocephalum Species by HPLC and GC-MS Chromatographia, 63 (2006) S17-S22
5. I. Boldizsár, Z. Szőcs, Zs. Füzfai, I. Molnár-Perl: Identification and quantification of the constituents of madder root by gas chromatography and high-performance liquid chromatography J. Chromatogr. A 1133 (2006) 259-274
6. Zs. Füzfai and I. Molnár-Perl: Gas chromatographic–mass spectrometric fragmentation study of flavonoids as their trimethylsilyl derivatives: Analysis of flavonoids, sugars, carboxylic and amino acids in model systems and in citrus fruits J. Chromatogr. A 1149 (2007) 88-101
89
7. Zs. Füzfai, I. Boldizsár, I. Molnár-Perl: Characteristic fragmentation patterns of the trimethylsilyl and trimethylsilyl oxime derivatives of various saccharides as obtained by gas chromatography coupled to ion-trap mass spectrometry J. Chromatogr. A 1177 (2008) 183-189
Konferenciákon megjelent poszterek:
1. Füzfai Zsófia, Perlné Molnár Ibolya: Flavonoidok szilil(oxim)észter/éterekkénti elemzése GC-MS eljárással: meggymintákból, szacharidokkal és karbonsavakkal egyidejőleg, egyetlen felvétel alapján Congressus Pharmaceuticus Hungaricus (poszter, 2003. május)
2. Zs. Füzfai, E. Kovács & I. Molnár-Perl: Identification and Quantitation of Various Flavonoids as Their Trimethylsilyl Derivatives, by GC-MS; Determination of the Main Constituents of Sour Cherries 5th Balaton Symposium (poszter, 2003. szeptember)
3. Zs. Füzfai, I. Molnár-Perl: Identification and Quantitation of Various Flavonoids as Their Trimethylsilyl Derivatives, by GC-MS 8th HTC-Symposium (poszter, 2004. február)
4. Zs. Füzfai, Zs. Bánfalvi & I. Molnár-Perl: Analysis of the Amino and Carboxylic Acids, Sugars, Sugar Alcohols and Flavonoids in Potato Herbs as Their Trimethylsilyl Derivatives by GC/MS International Symposium on Chromatography 2004 (poszter, 2004. október)
5. Zs. Füzfai, I. Molnár-Perl: Analysis of the Amino and Carboxylic Acids, Sugars, Sugar Alcohols and Flavonoids in Sour Cherries, in Potato Herbs and in Dracocephalum moldavica as Their Trimethylsilyl Derivatives by GC/MS The 4th International Conference on Instrumental Methods of Analysis (Modern Trends and Applications) 2005 (poszter, 2005. október)
90
6. Zs. Füzfai, I. Molnár-Perl: GC-MS Fragmentation Study of Flavonoids as Their Trimethylsilyl Derivatives: Analysis in Model Solution and in Citrus Fruits International Symposium on Chromatography 2006 (poszter, 2006. augusztus)
Szakmai elıadások:
1. Füzfai Zsófia: Hazai meggyek szacharid- és karbonsavtartalmának szimultán elemzése GC/MS módszerrel ELTE, Házi TDK Konferencia (elıadás, 2002. december)
2. Füzfai Zsófia: Hazai meggyek szacharid- és karbonsavtartalmának szimultán elemzése GC/MS módszerrel Országos TDK Konferencia (elıadás, 2003. április)
3. Füzfai Zsófia, Perlné Molnár Ibolya: Hazai meggyek szacharid- és karbonsavtartalmának szimultán elemzése GC/MS módszerrel MKE, Fiatal analitikusok elıadói napja (elıadás, 2003. november)
4. Füzfai Zsófia: Természetes anyagok kromatográfiás vizsgálata ELTE, Vasi kémiatanárok továbbképzése (elıadás, 2006. november)
91