Telomeráz expresszió mérése és galectin-3 vizsgálata patológiai mintákon
Doktori (PhD) értekezés
Dr. Kovács Rita Beáta
Témavezeto: Dr. Kopper László egyetemi tanár Konzulens: Dr. Sápi Zoltán egyetemi docens Programvezeto: Dr. Jeney András egyetemi tanár
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológiai Tudományok Doktori Iskolája Onkológia (8/1) Budapest 2004
1
Tartalomjegyzék
Összefoglaló/Summary
3-4. oldal
1. Bevezetés és irodalmi háttér
5. oldal
2. Célkituzések
26. oldal
3. Anyag és módszer
28. oldal
Szövetminta preparáció RNS izolálás RNS izolálás citológiai mintákból RT-PCR és a telomeráz (hTERT) assay Galectin-3 immunhisztokémia
29. oldal 29. oldal 30. oldal 30. oldal 33. oldal
4. Eredmények
34. oldal
5. Megbeszélés
48. oldal
Vesedaganatok Lágyrészdaganatok Húgyhólyagdaganatok és vizelet Pajzsmirigyléziók Egyéb elváltozások Terápiás konzekvenciák Galectin-3
52. oldal 52. oldal 55. oldal 59. oldal 60. oldal 62. oldal 68. oldal
6. Következtetések
71. oldal
7. Köszönetnyilvánítás
74. oldal
8. Irodalomjegyzék
75. oldal
Hivatkozások
75. oldal
Az értekezés tárgykörében megjelent saját közlemények
88. oldal
Egyéb közlemények
88. oldal
Eloadások, poszterek, elnyert tudományos díjak
89. oldal
2
Összefoglaló A telomeráz (tel) egy speciális reverz transzkriptáz, mely saját belso templát használatával képes pótolni a kromoszómák végeit (telomer). Ez ellensúlyozhatja a sejtosztódások során fiziológiásan bekövetkezo telomervesztést, mely egy kritikus rövidség elérésekor a sejt proliferációs képességének elvesztéséhez és végül apoptózishoz vezet. A tel expresszója lehetové teszi a sejt halhatatlanságát, mely kulcsfontosságú lépés az onkogenezisben, ugyanis a sejt a sorozatos osztódások során többszörös mutációkat felhalmozva malignus transzformációt szenvedhet. Egyes normál proliferáló sejteken kívül, a humán malignus daganatok 85%-ában, a carcinomák 90%-ában mutattak ki tel aktivitást (TA), és azt is megfigyelték, hogy a TA szintje többségükben korrelál a carcinogenezis stádiumával. (Kivételt képez pl. a világos sejtes veserák.) Következésképpen a tel az eddig ismert egyik legjobb molekuláris tumor marker, így egyben vonzó célpont a daganatok diagnosztikájában, prognosztikájában és terápiájában. Ezidáig nem ismerünk az irodalomban olyan tanulmányt, mely rutin anyagon vizsgálta volna a TA-t. Munkánk elso részében célul tuztük ki a tel reaktiváció vizsgálatát rutin hisztológiai és citoló giai anyagon. Megvizsgáltuk azt is, hogy a kapott értékek milyen kapcsolatban állnak a morfoló giai faktorokkal. A 118 (77 hisztológiai és 41 citológiai) mintát öt fo csoprtra osztottuk: vesedaganatok, lágyrészdaganatok, húgyhólyagtdaganatok (vizelet), pajzsmirigyléziók és egyéb (különbözo lokalizációjú és eredetu) elváltozások. A TA-val szorosan korreláló katalitikus alegység, a (human telomerase reverse transcriptase) hTERT mRNS relatív expresszióját mértük, real-time RT-PCR módszerrel. Az eredmények alapján megállapítható, hogy a hTERT expresszió mérése a preoperativ differenciál-diagnosztikában értékes segitséget nyújt, különösen a pajzsmirigy- és emloléziók dignitását illetoen. Vizeletmintákban vizsgálva, a hTERT expresszió meghatározása kiválóan alkalmas a korai daganat észlelésére és a hólyagrákos betegek monitorozására. Úgy tunik, a lágyrészdaganatok kialakulásában a tel reaktivációnak nincs lényeges szerepe, mégis, az egyéni terápia szempontjából vizsgálata fontos lehet. A pajzsmirigydaganatok változatos hisztopatoló giai megjelenést és klinikai viselkedést mutatnak. A molekuláris markerek, így a munka elso részében vizsgált telomeráz is, ígéretesek ugyan, de egyelore egyesek még kevéssé hozzáférhetok a rutin diagnosztika számára. A pajzsmirigydaganatok differenciál-diagnosztikájában és gradingjében azonban a diagnosztikus immunhisztokémiai antitestek is egyre fontosabbá válnak. Ezek közül -az irodalmi adatok alapján- a galectin-3 (gal3) igen specifikusnak és érzékenynek tunik. Munkánk második részében 91 pajzsmirigyelváltozásban vizsgáltuk meg retrospektive a gal3 immunhisztokémiai reakciót, és elemeztük diagnosztikus értékét a különbözo elváltozások dignitásának meghatározásában, különös tekintettel a follicularis eredetu léziókra. Míg a gal3 erosen és diffúzan expresszálódott a papillaris carcinomákban, más malignus léziókban gyengébb, foká lis vagy változó pozitivitast mutatott. Valamennyi gyulladásban fokális pozitivitás volt megfigyelheto. A nodózus struma és a normál pajzsmirigyszövet negativ volt. Eredményeink alapján a gal3 immunhisztokémiai reakció megbízhatónak látszik a papillaris carcinomák hisztoló giai diagnosztikájában. Azonban éppen a pajzsmirigydiagnosztika legnehezebb területén, a szoliter nodulusok és a follicularis léziók esetén, tapasztalataink nem támasztják alá a legtöbb eddigi tanulmányban leírtakat. A follicularis elváltozások esetén ugyanis -bár hasznos kiegészíto vizsgálat- a dignitás eldöntésére a módszer önmagában nem abszolút értéku, tehát alapvetoen továbbra is a klasszikus morfológiai kritériumokra kell támaszkodnunk. Legújabb megf igyeléseink arra utalnak, hogy Hashimoto thyreoiditisekben a papillaris képletek területén megjeleno gal3 pozitivitás már korai stádiumban, még a papillaris carcinoma jellegzetes morfológiai kritériumainak megjelenése elott jelezheti a malignus transzformációt.
3
Summary Telomerase (tel) is a special reverse transcriptase that is able to replace the ends of the chromosomes (telomer) by using an own inner template. This might compensate for the physiologically occurring telomeric loss, which – reaching a critical shortness – leads to the loss of the cell proliferation capacity and eventually to apoptosis. The tel expression makes the cellular immortality possible, which is a crucial step in oncogenesis, since the cell – during serial divisions, accumulating multiple mutations – can suffer a malignant transformation. Besides certain normal proliferating cells, in 85% of human malignant tumors, in 90% of carcinomas tel activity (TA) was detected, and it was also observed that in their majority the TA level correlated with the stage of the carcinogenesis. (An exception is represented e.g. by the clear cell renal cancer.) Consequently, tel is the best molecular tumor marker known so far, thus being an attractive target in the diagnosis, prognosis and therapy of tumors. Up to now no study examining TA in a routine material has been published in the literature. In the first part of our work we set the objective to study the tel reactivation in routine histological and cytological material. We also studied the correlation of the values received with the morhphological factors. We divided the 118 (77 histologic and 41 cytologic) samples into five major groups: kidney tumors, soft tissue tumors, bladder tumors (urine), thyroid lesions and other lesions (of various localisations and origin). We measured the mRNA relative expression of hTERT (human telomerase reverse transcriptase), a catalytic subunit closely correlating with TA. It was determined with real-time RT-PCR method. Based on the results it can be established that measuring expression of hTERT yields valuable assistance in the preoperative diagnosis, particularly regarding the dignity of thyroid and breast lesions. The study of urine samples suggests that determination the expression of hTERT is well suitable for the early detection and monitoring of bladder cancer. The tel reactivation does not seem to play a key role in the development of soft tissue tumors although its study might be important for individualised treatment. Thyroid tumors show varying histopathological feature and clinical behaviour. Molecular markers, among them the telomerase studied in the first part of this work, are promising, however, they have currently limited availability for routine diagnostics. Nevertheless, the diagnostic immunohistochemical antibodies are getting more and more important in the differential diagnostics and grading of thyroid tumors. Out of them – based on literature data – the galectin-3 (gal3) seems to be highly specific and sensitive. In the second part of our work, in 91 thyroid lesions we retrospectively studied the gal3 immunohistochemical reaction and analysed its diagnostic value in the determination of the dignity of various lesions, with special regard to those of follicular origin. While gal3 was markedly and diffusely expressed in papillary carcinomas, it showed weaker, focal or varying positivity in other malignant lesions. In all the inflammations focal positivity was observed. The nodal goiter and norma l thyroid tissue was negative. On the basis of our results the gal3 immunohistochemical reaction seems to be reliable in the histological diagnosis of papillary carcinomas. In the most difficult field of thyroid diagnostics, however, in the case of follicular lesions, our experience does support the observations described in most studies so far. In case of follicular lesions the method – although a useful supplementary examination – has no absolute value in itself, therefore fundamentally we must further rely on the classic morphologic criteria. Our most recent observations suggest that in the Hashimoto’s thyreoiditis the gal3 positivity occurring in papillary structures might indicate a malignant transformation already prior to the onset of the characteristic morphological criteria of papillary carcinomas.
4
1. Bevezetés és irodalmi háttér
1.I. A genom tagozódása lineáris kromoszómákra, a cirkuláris DNS-sel szemben nagyobb, független génkészlelet biztosit, ezzel evolúciós elonyt jelent. Azonban a végek megjelenése a sejtet végvédelemre, illetve - fenntartásra kényszeríti, mely esszenciális fontosságú a genom integritásának és stabilitásának megorzése tekintetében - a számos, primer RNS-t igénylo, DNS-polimeráz végrehajtotta replikációs ciklusban. Ezt a feladatot a telomerek látják el. Blackburn azt találta, hogy a Tetrahymenában a telomerek egy extrém rövid, egyszeru nucleotid-szekvencia ismétlodéseit tartalmazzák (TTGGGG) (1,2,3,4). A "telomer" szót a görög "vég" (telos) és "rész" (meros) kifejezésekbol alkotta Muller 1978-ban. A telomerek 6-25 kilobázispárnyi (kbp) specifikus struktúrák, ismétlodo hexamer DNS-szekvenciák (5’-(TTAGGG)n-3’) az eukario ta kromoszóma végeken (5), melyek speciális proteinekkel együttesen sapkaszeru végstrukturát alkotnak. McClintock megfigyelte, hogy ezek nélkül a végsapkák nélkül a kromoszómák egymáshoz „ragadnak”, strukturális változásokon mennek keresztül vagy más „abnormá lis viselkedést” mutatnak (6). A „telomer-sapka”: 1. Lehetové teszi a sejteknek, hogy a normális kromoszóma végeket a törött DNS-tol megkülönböztessék. (Ha a DNS-vég törött, két lehetoség áll fenn, miután a sejtciklus leállt: reparáció vagy sejthalál. ) A kettos szál törését kétféle mechanizmus állíthatja helyre: a) homológ rekombináció (HR) – a reparáció hibamentes, de homológ szomszéd kromoszómát igényel; b) non-homoló g vég-illeszkedés (NHEJ=non homolog end joining) – a reparáció során hibalehetoség van, de védi a kromoszómát a degradációtól. 2. Véd a NHEJ során esetlegesen bekövetkezo, egyéb kromoszómákkal való end-to-end fúziótól. (A fúzió-híd-törés ciklusok genomikus instabilitáshoz vezetnek, mely sejthalált vagy neoplasztikus transzformáció t eredményezhet.) 3. Véd az exonukleázok, ligázok okozta degradációtól, valamint az átrendezodésektol.
5
4. Segít a homológ kromoszómák párképzodésében és a crossing over-ben a meiosis I. profázisában, mellyel a számtartó sejtosztódás mechanizmusát biztosítja. Hozzájárul a kromoszómák térbeli és funkcionális rendezodéséhez a sejtmagon belül, részt vesz a transzkriptom regulációban (7). Összefoglalva: a telomerek a kromoszóma stabilitást biztosítják (6).
A differenciált muködést végzo szomatikus sejtekben a telomerek a DNS-replikáció mechanizmusának elégtelensége miatt fokozatosan rövidülnek. A DNS replikáció bidirekcionális, a vezeto és követo szálon különbözo módon zajlik. Ugyanakkor a DNS polimeráznak csak 5’-3’ irányú polimeráz aktivitása van, és de novo lánckezdésre sem képes, tehát a replikáció indításához primert igényel. A követo szálon különálló fragmentumok (ún. Okazaki- fragmentumok) keletkeznek, melyek mindegyikének iniciációjához új RNS primerek szükségesek, ezután képes a DNS polimeráz extendálni. Végül csak egyetlen, az 5’ végi terminális RNS primer marad a leány DNS-en, melyet az 5’-3’ exonukleáz lebont (8). A keletkezett rést azonban a DNS polimeráz nem tudja betölteni, mert nem áll rendelkezésre 3’-OH vég, amelyhez a következo RNS primer kötodne (ún. end-replikációs probléma) (9-12). Mivel a DNS-polimeráz nem tudja befejezni a követo szálak 5’ végi szintézisét, a kromoszómák minden osztódás Sfázisában progressziven, 8-12 bázispárral rövidebbek lesznek (ez kb. 50-200 nukleotidnyi nem replikálódott szekvencia), egyre rövidebb utód-DNS-ek jönnek létre az egyes replikációs ciklusok során (ezt nevezik “biológiai vagy mitotikus órá”- nak). 1. ábra
6
A DNS replikáció
1. ábra
A keletkezett hiányt a telome ráz enzim (a továbbiakban tel) képes pótolni. A normál sejtekben a proliferáció leállításáért két mechanizmus felelos. Az M1 fázis (mortality stage 1, replicativ senescence, senescence=elöregedés) akkor jelenik meg, amikor a kromoszómák többsége már legalább többezer bázispár telomer-szekvenciával, kb. 5 kb-nyira rövidült, mely kb. 60-80 sejtosztódás után következik be (11,13,14). Ez a mechanizmus az ARF/p53/p21CIP1/WAF1 vagy a pRb/p16INK4a antiproliferatív út génjei által mediált növekedés-leálláshoz vezet (funkcionális inaktiváció, ún. growth arrest és/vagy sejthalál apoptózissal - G1-ben). Az M1 fázist valószínuleg közvetlenül a subtelomerikus régióban elhelyezkedo gének aktivációja indukálja. A replikatív senescencia effektorainak részleges vagy teljes inaktivációja fontos addícioná lis követelménye a tel reaktiváció által eloidézett immortalizációnak egyes sejttípusokban
7
(pl. a keratinocytákban és egyéb emlos epithelsejtekben). Inaktivációt mutáción kívül virális onkoproteinek, pl. az SV40LT (amely a p53-at és a pRb-t egyaránt inaktiválja) vagy a human papillomavirus-16 E7 (amely a pRb-t inaktiválja) kötodése idézhet elo, melyek eredményeképp a sejt túléli a senescenciát (15,16). Így a sejtek tovább osztódnak, a telomerek tovább rövidülnek egészen addig, amíg a második független mechanizmus, az M2 (mortality stage 2, krízis pont) indukálódik. Az M2 azt a fiziológiásan- kritikussá vált telomerhosszat reprezentálja, amelynél a sejt már nem képes többé megvédeni a kromoszóma végeket, ezért end-degradáció, end-to-end fúzió következik be, mely a genom instabilitásához és sejthalálhoz vezet (cellular senescence). A legtöbb esetben a sejtek már elöregednek, mielott elegendo mutációt halmoznának fel ahhoz, hogy malignus fenotípusuk kialakuljon. Ezért a növekedés rövid telomerek miatti leállását potenciális rákellenes mechanizmusként is felfoghatjuk. Az M1 és M2 fázisok a replikativ kapacitás korlá tozottságával - a különbözo onkogén behatásokkal szembeni védelmen (tumor suppresszión) kívül kiküszöbölik az életkor elorehaladtával felhalmozódó elöregedo sejteket is. Utóbbi azért fontos, mert ezek a sejtek - távoli hatással is rendelkezo molekulák expressziója révén (proteázok, antiangiogén faktorok, növekedési faktorok, gyulladásos cytokinek) megbonthatják a normál szöveti integritást és funkciót. A telomerhossz vesztést felgyorsíthatja a hypoxia - a telomer törés indukálásával (17). A sejtek csak ritka esetben élik túl a krízis pontot és válnak halhatatlanná (immortalizáció). Ez leggyakrabban a tel reaktivációjával vagy up-regulációjával kapcsolatos, ilyenkor a tel - a sejtosztódás normális telomervesztése helyett - a telomervégeket pótolja (18,19). 2. ábra
8
M1=mortality stage1, replicative senescence M2=mortality stage2, crisis point
Telomerhossz Telomerhossz
p53,pRb inaktiváció
tel. upreguláció vagy reaktiváció reaktiváció
M1 M2
mitózisok száma proliferáció további leállása mitózisok
immortalizáció, immortalizáció, tumor
2. ábra
A tel enzimet 1984-ben fedezte fel Carol Greider és Elizabeth Blackburn, biokémiailag eloször 1985-ben azonosították (2,4). Az enzim az ismétlodo telomerikus szekvencia G-gazdag szálát ismeri fel, és komplementer DNS szál hiányában új, ismétlodo szakaszokat szintetizál (azaz polimerizálja a telomerikus DNS szekvenciát) különleges módon, saját belso RNS templát használatával (20,21,22). A tel jelen van a normál embrionális sejtekben. A fejlodés során a legtöbb szövetben represszálódik vagy down-regulálódik (mivel a normál humán sejtek domináns tel inhibitort expresszá lnak), ezért a sejt-reprodukció során a telomerek rövidülnek. (A tel represszor géneket a p53, pRB ellenorzi.) A kritikus hossz elérése a további sejtosztódásokat leállító szignálként szolgál, így a sejt - Hayflick szavával „senescens”-sé válik, azaz elöregszik (23). A 10-12 kb átlagos hosszúságú telomerrel rendelkezo sejtek életük során 50-60x osztódhatnak. (A telomerhossz spermium,
9
petesejt esetén 20 kb, magzati és újszülött sejtekben 15 kb., felnott sejtekben 10 kb, míg az elöregedo sejtek esetén 5 kb. Sejtkultúrában humán újszülött szomatikus sejtek 8090x osztódnak, míg egy 70 éves ember szomatikus sejtjei legfeljebb csak 20-30x, de ezt természetesen az adott sejt differenciáltsága is befolyásolja.) A tel a korai embrioná lis sejteken kívül - csökkent szinten ugyan -, de normálisan expresszálódik a csírasejtekben, bizonyos ossejtekben (melyekben igen szigorúan regulált) és a felnott progenitor sejtekben (24). Utóbbiak közé tartoznak a normál regeneratív sejtek, aktivált lymphocyták, specifikus hematopoetikus sejtek, az epidermisz bazális sejtjei, a premenopauzális proliferativ endometrium, a bél cryptáinak sejtjei, a dohányosok bronchiá lis epithelsejtjei. Tehát a tel expresszió önmagában nem jelent malignitást (25,26)! A legtöbb humá n szomatikus sejtben azonban a tel-t regulátor protein blokkolja (27). Az endometriumban a tel expresszió specifikus a glanduláris epithelsejtekre (a stromális sejtekben nincs). A késoi proliferativ fázisban a carcinomá val egyenértéku - maximális enzimaktivitás van jelen, míg a késoi szekrécióban az aktivitás minimális. A postmenopauzális és az anti-ösztrogénekkel kezelt endometrium csökkent telomeráz aktivitást (a továbbiakban TA) mutat (28). Csírasejtek esetén a TA szint az érési stádiumtól függ: A preovulációs follikulusokban magas, míg az ovulált oocitákban szignifikánsan alacsonyabb (29). A TA igen magas az I. típusú spermatogoniumokban, csökkent a spermatocitákban és a spermatidákban, míg teljesen hiányzik az epididymális spermatozoákban (29). A különbözo fajok embrió iban - így humánban is - a blasztociszta stádiumban észlelheto viszonylag magas TA. Elobbiek rögtön felvetnek egy érdekes kérdést is: ha a TA alacsony az ovulált oocitákban, illetve hiányzik spermatozoákban, akkor hogyan „szerzodik meg” a korai embrióban? Az immortalizált sejtekben a telomerhossz stabilizálódik, bár a telomerek rövidebbek, mint a normális (wild type) sejtekben (30). Az immortalizáció fenntartásához a tel állandó expressziója szükséges, ami a krízis értékeknél valamivel nagyobb telomerhosszúsággal társul. SCID (súlyos kombinált immundeficienciában szenvedo) egerekben az immortalizált sejtek nem képeznek daganatot, nem borul fel a sejtciklus szabályozás, nincs kariotípus
10
instabilitás sem (31). Tehát ahogyan a tel expresszió sem, önmagában az immortalizáció sem egyenlo a malignus átalakulással! Azonban a tel aktiváció által létrejött immortalizáció addicioná lis lépésként szolgál az onkogenezisben. A tel nemcsak a humán ossejtekben és reproduktiv sejtekben stabilizálja a telomerhosszat, hanem a daganatsejtek 80-90 %-ában is expresszálódik (32). A maradék 1020 %-ban az end replikációs probléma más módon, valószínuleg rekombinációval oldódik meg - ezt a késobbiekben részletezni fogom. Bár a tel reaktiváció számos humán malignitásban megtalálható, ugyanakkor hiányzik a tumorral szomszédos normál sejtekben (32). Ez azt sugallja, hogy a tel aktivációnak, illetve a telomerstabilitás fenntartásának (akár alternatív módon is) kulcs-szerepe lehet a maligus daganat folyamatos proliferációjában (32). Fentiekbol következoen a tel nemcsak a daganatok diagnosztikájában játszhat kiemelkedo szerepet, hanem az új onkoterápiás szerek kifejlesztésében
is
célponttá vált. Az az elképzelés, miszerint a tel-nak fontos szerepe lehet a humán daganatok folyamatos növekedésében, fenntartásában, 1990 körül kezdett napvilágot látni, de 1994-ig nem volt rá bizonyíték. Ebben az évben megfigyelték, hogy a tel nemcsak a laboratoriumi körülmények között fenntartott, hanem az emberi testben lévo daganatsejtekben is mutatott aktivitást (33). Mintegy egy évvel késobb Harley, Shay és munkatársai 101 humán daganatmintából (melyek 12 féle daganattípust reprezentáltak) 90-ben detektált tel-t, míg az 50 normál szövetmintából (melyek 4 féle szövettípust reprezentáltak) egyben sem (34). Már ezek elott is folytak kutatások a tel szerepérol a carcinogenezisben, sot az egyik tanulmány már azt is valószínusítette, hogy a tel feltehetoleg azután válik aktivvá, amikor a sejt már elvesztette proliferáció feletti kontrollját (24).
A tel egy RNS templátot hordozó speciális reverz transzkriptáz (RNS-függo DNS polymeráz), hexa-ribonukleoprotein komplex, mely az egyláncú DNS hosszabbítására képes. Miután hat dezoxiribonukleotid trifoszfátot (dNTP) ad hozzá a telomer túlnyúló szabad 3’OH végéhez, 6 nukleotidnyit transzlokálódik, és ismét 6 nukleotidnyit hosszabbít a telomer végén. Ez többször ismétlodik, majd a folyamat végén a tel 11
disszociálódik. A komplementer szálon a túlnyúló G-gazdag lánc a szabad 3’OH csoportjával hajtut képez, és így primerként szolgál, tehát a követolánchoz hasonlóan szintetizálódik (35).
A telomeráz fo komponensei
CAATCCCAAT
hTR
telomerikus DNS
3.ábra
A humán tel, mely egy relative nagy molekulasúlyú holoenzim-komplex, három fo alegységbol áll:
1. az RNS templát (AATCCC), vagyis a strukturális RNS komponens (hTR=humán telomeráz RNS komponens, melynek génje a humán a 3q26 kromoszómán van) (17)
2. a tel asszociált protein (TEP1) (36,37)
12
3. és a katalitikus alegység (hTERT=human telomeráz reverz transzkriptáz, melynek génje az 5p15 kromoszómán van) (38,39).
Ezen kívül a tel-nak még számos protein alegysége van, és számos protein kapcsolódik a hTR-hez, valamint a hTERT-hez, melyek elosegítik ezek egyes alkotórészeinek „összeillesztését” és struktúrába rendezését. 3. ábra (40. nyomán). Így pl. a p23 és hsp90 molekuláris chaperonok a hTERT- hez kötodve az aktiv tel- l kapcsoltak a sejtekben. Ennek a kapcsolódásnak a blokkolása a tel funkcionális gátlását eredményezi, ezért - többek között - az egyik lehetséges támadáspont az antitel terápiában (41). A telomerikus DNS-hez is több különféle protein kötodik (ún. telomer asszociált proteinek), melyek szintén közremuködnek a tel felépítésében (I/1. Táblázat - Shay és mtsai után,12).
I/1. Táblázat. A fo humán telomer asszociált proteinek és telomeráz komponensek HUMÁN TELOMER ASSZOCIÁLT PROTEINEK a TRF1 (telomeric repeat binding factor 1: a duplex TTAGGG- hoz kapcsolódik )
Tankiráz (TRF1 interacting protein: poli (ADP-ribóz) - polimeráz) TIN2 (TRF1 interacting protein 2)
TRF2 (telomeric repeat binding factor 2: a duplex TTAGGG- hoz kapcsolódik, és a végvédelemben van szerepe)
hRap1 (TRF2 interacting protein: vég-védelemben szerepel) Mre11/Rad50/Nbs1 (DNS reparáció; a t-loop modulálása)
13
HUMÁN TELOMERÁZ KOMPONENSEK hTERT (human telomerase reverse transcriptase: a katalitikus alegység)
p23/hsp90 (chaperonok)
hTR (human telomerase RNA: a belso templát)
SnoRNA binding proteins (dyskerin, hGar1) TEP1 (asszociált protein) hnRNPs C1/2 (heterogén nukleáris ribonukleoproteinek) La (autoantigén) L22, hStau (riboszomális protein és a dupla szálú RNS-t köto protein)
a
A telomer biokémiájában valószínuleg még szerepet játszó egyéb proteinek: Ku, ATM,
hnRNPA1, PARP, BLM, WRN, Rad51 és RPA.
A tel expresszió és funkció bonyolult szabályozás alatt áll, melynek fo eleme a hTERT gén transzkripcionális repressziója. A tel szuppresszor géneket a p53 és pRB ellenorzi. (4. ábra – 42)
14
A hTERT gén expressziójának regulációja
4. ábra
Számos trans zkripciós faktor befolyásolja a hTERT gén expresszióját, pl.:
- Mad1/c–Myc, Sp1 (mely a TGF-béta út transzkripcionális targetje) – mindketto represszor - ösztrogének (43) - Est1 és Cdc13 - mindketto a tel funkció pozitiv regulátora (44) - E2F-1 (45), WT-1 (46), NF- B (47), MZF-2 (48), stb., - a tumor supresszor menin, mely a hTERT direkt represszora (49).
15
Fentiek közül a myc-et tanulmányozták a legrészletesebben. A humán daganatokban a cmyc gének gyakran dereguláltak, a tel reaktiváció, a TA indukciója általában a myc gén overexpressziójával kapcsolatos (50). A hTERT promoter számos c- myc köto helyet tartalmaz, melyek közvetlenül mediálják a transzkripciós aktivációt. Mindezek alapján valószínusítheto, hogy a tel a humán daganatokban onkociter mutációk által reaktiválódik. Ugyanakkor nem biztos, hogy ezek a faktorok elégségesek a hTERT transzkripció teljes „ki-be-kapcsolásához”. Az egyik tanulmány eros pozitiv korrelációt talált a hTERT promoter metiláció és a génexpresszió között, mely szöges ellentétben áll a metilációszabályozott transzkripcióról általában elfogadott modellel. A direkten és indirekten a telomerekhez kötodo, fentebb már részletezett telomer asszociált proteinek nem csak a tel felépülésében, hanem regulációjában is fontosak. A két fo paralog telomerikus DNS-köto fehérje, a TRF1 és TRF2, minden humán sejttípusban expresszálódik, és a sejtciklus során nagy affinitással kötodik a dupla szálú telomerikus DNS-hez. Így részben direkt módon, részben ko- faktorokkal történo interakció által vesz részt a telomerhossz szabályozásában (12,51). Ha a TRF2-t eltávolitjuk a telomerrol, 3’túlnyúló vég-vesztés, telomerfúzió, valamint p53 függo apoptózis következik be. A primer TRF2 overexpresszió a tel negatív sejtekben megvéd a telomerfúziótól és késlelteti a senescenciát (52).
A telomer maga is szabályozza a tel muködését. A telomer guanin- gazdag oligonukleotid szekvenciái (3’ túlnyúló vég) -hidrogénkötések révén- egy speciális szerkezetet, négyes gyurut alakítanak ki (ún.G-kvartettek), melyek gátolják a TA-t. (5. ábra)
16
G-kvartet
5. ábra 3 szomszéd G-kvartet intramolekuláris G-kvadruplex struktúrát alkot (ezt tetraplexnek is nevezik), mely megakadályozza a tel elongációs lépését (53,54).
Fentiekbol következoen az antitumor terápia egyik célpontja lehet a ligand-indukált G-kvadruplex stabilizáció (55). Ilyen antitumor szerek pl. a quinolin-bázisú Gquadruplex ligandok (56).
Számos élolényben a tel pozitiv sejtek telomerjének hossza állandó, tehát az elongáció és a rövidülés egyensúlyban van (57).
A tel nemcsak a telomerek hosszabbítására képes, hanem gátolhatja a telomerhossz megtartásának rekombinációs alapú útját is, többféle módon: 1. Képes direkten leválasztani a DNS-rol a rekombinációs alapú út iniciációjához szükséges proteineket. 17
2. A reiniciációt a telomer végek „sapkával” való ellátásával gátolhatja meg. 3. Egyszeruen megváltoztathatja a telomer struktúrát, mely önmagában is elégséges lehet ahhoz, hogy a rekombináció s út funkcionálisan elégtelenné váljék.
Az enzim meghatározó komponens e - egy viszonylag nagy (127 kDa) protein - a hTERT, mely a tel reaktiválásához szükséges. A halhatatlan humá n sejtvonalak szignifikáns TA-t és emelkedett hTERT expressziót mutatnak. A halandó sejtek analízise negatív TA esetén nem mutatott szignifikáns hTERT expressziót. Ez a megfigye lés alátámasztja azt a feltételezést, miszerint a hTERT expresszió szorosan korrelál a TAval, és azt sugallja, ho gy segíthet a tel szerepének értelmezésében a carcinogenezisben (58). Több közleményben szerepel, hogy a carcinomákban csak a hTERT expresszió mutat szignifikáns összefüggést az enzimaktivitással, míg a hTR és a TEP1 nem. A hTR minden sejtben alapvetoen jelen van, többé-kevésbé állandó, de a carcinomás sejtvonalakénál alacsonyabb expressziós szinten. A hTERT expresszió azonban a tel negatív sejtekben visszaállítja - és szintje meg is határozza - a TA-t, meghosszabbítva a sejt élettartamát.
Mivel a hTERT és TA közt szoros korreláció van, vizsgálatainkban a tel hTERT katalitikus alegysége által kódolt mRNS mennyiségének mérése (59) lehetové tette a tel expresszió indirekt meghatározását, amplifikációs (RT-PCR) módszerrel. A RTPCR (reverse transcription polymerase chain reaction) eljárás mRNS templát megsokszorozását jelenti.
A TA különbözo fagyasztott hisztoló giai mintákon kívül citológiai anyagokban is mérheto, így vizeletüledékben vagy hólyagmosó folyadékban (60), egyéb mosófolyadékokban - szájüregi, vastagbél (61), epeúti, tüdo (bronchiolo-alveolaris lavage) -, szívadékban és kefe-anyagban, pancreas-nedvben (62), testüregi folyadékgyülemekben, köpetben (63-66). De nem csak az exfoliativ, hanem a vékonytu aspirációs biopsziás (FNAB, fine needle aspiration biopsy) minták is (pl. emlo, pajzsmirigy, nyirokcsomó, stb.) alkalmasak TA kimutatására (67,51).
18
A tel expresszió meghatározásának különbözo módja i ismeretesek, így pl.:
- in situ módszerek, melyek a tel expressziót topográfiai összefüggésükben teszik láthatóvá (68) (6. ábra)
Telomeráz kimutatása in situ hibridizációval
6. ábra Felül colorectalis adenomából származó mirigy részlete, mérsékelt TA-val, a kép alsó felében intenzív TA-t mutató adenocarcinoma látható
-
FISH (69) (fluorescens in situ hybridisatio n), mellyel a telomerek hossza vizualizálható TRF (Terminal Restriction Fragment) demo nstrációval. A metafázikus kromoszómákat kettosen festjük DAPI-val (kék színu, DNS-t és kromoszómákat jelöl) és in situ hibridizáljuk PNA (peptide nucleic acid) fluoreszcensz telomer próbával (piros vég minden kromoszómán). A tel-hossz, a fluoreszcens z s zignál intenzitása direkten arányos az enzimaktivitással (70,71). (7. ábra)
19
Telomeráz kimutatása FISH módszerrel
7. ábra
- PCR alapú módszerek.
A TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) egy PCR-alapú, szenzitív vizsgálati mód, mely apró szövetmintából képes szemikvantitative detektálni a TA-t (72,73). A Kim és munkatársai által bevezetett módszer fontos mérföldko volt a tel kutatásban, és standard technikává vált az enzim tulajdonságainak tanulmányozásában (74). A módszer két lépcsos enzimaktivitás-mérés: a) A tel-extrakció után, tel- mediált oligonukleotid primer extenzió történik, a tel 5’TTAGGG-3’ ismétlodo szekvenciákat ad a szintetikus TS (telomerase substrate) primer végéhez b) A második lépésben az extendált primer termékek amplifikációja következik, reverz primerek (CX primerek) felhasználásával, melyek komplementerek az ismétlodo szakaszokkal. (A reverz primerek a primer-dimer artefaktok képzodését hivatottak megelozni, bár teljesen nem eliminálják azokat.) A vizualizálás autoradiográfiával, polyacrilamid gé l electroforesissel (PAGE) vagy
20
enzime linked immunosorbent assay- l (ELISA) történik. A pozitiv PAGE assay a különbözo hosszúságú, 6 bp alapú sávok létráját mutatja. A sávok intenzitási területe volumen denzitometriával mérheto.
Bár a PCR alapú konvencionális TRAP assay igen szenzitiv és specifikus módszer, számos problémája, korlátja is van, különösképp rutin klinikai alkalmazását illetoen (75): - maga a minta anyaga, ide értendo az enzimatikusan aktiv tel követelménye. Az aktivitás mérése céljából történo sejtkivonat preparálás idoigényes munka és nehéz automatizálni. - instabilitás az anyag tárolása során - end-point detekció, ezért elégtelen kvantitativ információ - idoigényes, fáradságos komplex post-PCR procedura: az amplifikációs termékek detektálása (PAGE-analizis + komputeres denzitometria vagy ELISA detekció) - kontamináció veszélye - fals pozitivitás lehetséges, mert a módszer nem tesz lehetové korrelációt a TA és a sejttípus között. Pl. a tumor gyulladásos sejtekkel (aktív lymphocytákkal) vagy nyirokcsomókkal való kontaminációja során nem specifikus amplifikációs termékek keletkezhetnek (az in situ TRAP ezt kiküszöböli, mivel jelzi a topográfiai összefüggést) - fals negativitás, alacsonyabb szenzitivitás is lehetséges, mert: a) a TA a tumorsejtekben heterogé n eloszlású b) a mintából származó különbözo PCR inhibitorok lehetnek jelen (RNázok, proteázok, detergens, fenol, hemoglobin, stb.) Mivel ez gyakori probléma, ennek kiküszöbölése érdekében rutinszeruen belso kontrollt (36 bp) kell használni, mely egyben a TA kalibrálához is szolgál. c) az RNS esetleges degradációja miatt - a mag-lízis hatásfokának ingadozása - limitált dinamikus tartomány - relative alacsony teljesítmény Mindezek miatt a konvencionális TRAP csak korlátozott számú minta együttes analízisére alkalmas, foképp ezért nem megfelelo rutin klinikai alkalmazásra.
21
Minthogy a tel mint biomarker egyre fontosabbá válik a jövoben -diagnosztikai és prognosztikai szempontból egyaránt-, ezért annak érdekében, hogy a módszer alkalmazható legyen a rutin klinikai diagnosztikában, számos módosítása vált szükségessé. . Néhány, a TRAP-assay alternatívák közül:
1. TRAPeze Telomerase Detection Test (76) - fagyasztott metszeten, lízis-puffer alkalmazásával (mely komplett ma g- lízist biztosít) végzett protein assay, - a PCR inhibitorok eltávolítása fenol/kloroform extrakcióval történik a primer extenzió után - módosított reverz primer szekvenciák használata, melyek: a) a hot start wax barrier eliminálják b) az amplifikációs artefaktokat redukálják c) a TA pontosabb mérését teszik lehetové - 36 bp belso pozitiv kontrollt tartalmaz, mely: a) pontosabb TA kvantitációt (szélesebb, 2.5 log linearis tartomány) eredményez b) Taq polymeráz inhibitort tartalmazó fals negativ minták felismerését szolgálja - a konvencionális TRAP- nál sokkal szenzitívebb - a szükséges reagenseket kényelmesebb formában tartalmazza, kevésbé költséges
De: még mindig radioaktív módszert, ill. PAGE elektroforézist használ, és hosszadalmas, mivel 8-10 órát igényel, ezért az elektroforetikus lépést ELISA detekcióval helyettesítették (melynél a linearis tartomány 250-5000 sejt ekvivalens). Ez a TRAPeze ELISA Telomerase Detection Test (77).
2. Az in situ TRAP-assay fluorescens festékeket használ a TA vizualizálásához a kérdéses sejtek magjában, és mikroszkóppal lokalizál (68). A különbözo munkacsoportok számos különféle in situ hybridizációs (ISH) módszert dolgoztak ki, melyek kvantifikálják a hTERT mRNS-t, és korrelálnak a daganatok prognosztikai faktoraival is (69).
22
3. RTQ-PCR (real-time quantitative PCR) (78) A módszer bevezetése elott nem volt olyan tanulmány, melyben a tel detekció független diagnosztikus vagy prognoszt ikus információt nyújtott volna. Alapja: a kétszálú reakciótermékhez kötodo festék specifikus fluoresce ns szignálokat emittál, melyet egy oligonukleotid hyb ridizációs próba hasadása generál. Ezeket detektáljuk minden ciklus során, folyamatosan, azaz real-time. A real-time (valós ideju) PCR szenzitív, kvantitatív és igen megbízható módszer (78) Elonyei: - nagyobb teljesítmény, nagyobb mennyiségu minta analizálható - nincsenek addicionális idoigényes lépések, egyszerubb, gyorsabb - zártcsövu, a kontamináció lehetosége minimálisra csökken - a hagyományos PCR-ban alkalmazott végpont mérés helyett pontos TA kvantifikáció történik, mivel exponenciális növekedési fázisba gyujti az adatokat - az exponenciális amplifikáció korai fázisában analizálja a mintákat, amikor még a reakciókomponensek elegendo mennyiségben állnak rendelkezésre, de az inhibitorok még nem halmozódtak fel. Bár fals pozitiv szignálok képzodhetnek, de az elso 30 ciklus alatt ezek még gyengék, ezért nincs interferenc ia a primer-dimer artefaktokkal. Az a pont, amikor eloször válik detektálhatóvá a PCR termék az amplfikációs ciklus alatt, a fo paramétere a méréseknek. - inhibitorok elofordulása itt is lehetséges, ezért a fals negativitás vagy alacsonyabb szenzitivitás kiküszöbölésére rutin belso kontroll alkalmazása ezen módszerben is szükséges - az adatok analízise (a standard görbe létrehozása, a kópiaszám kalkulációja, stb.) automatikus
A legújabb, kvantitativ real-time PCR-t használó TRAP módszerrel történt mérések azt mutatták, hogy hólyagcarcinomák esetén a hTERT szint a daganat stádiumával és differenciáltsági fokával egyaránt korrelál (79).
Hou és munkatársainak mérései szerint, a tel féléletideje 5-11 óra kísérletes sejtvonalakban, a testüregi folyadékokban pedig még kevesebb, tehát a daganat
23
operációjának kezdetétol számítva a minta gyors transzportja kritikus fontosságú (78). Mivel a tel ribonukleoprotein, ezért a TA pontos mérésének lényeges feltétele az RNS stabilitása a vizsgált mintákban. Ugyancsak fontos a daganatsejtek aránya is. Ezeket veszi figyelembe:
4. A real-time RT-PCR (reverse transcription) assay (80). a) A módszer a minta RNS szintjét úgy határozza meg, hogy mRNS-rol cDNS kópia készül fordított átírással, a reverz transzkriptáz enzim segítségével. A keletkezett mRNS-cDNS kétszálú nukleinsavat PCR-rel sokszorozzuk meg. b) A TA standardizálva van egy normál minta RNS- mennyiségéhez c) mindegyik mintánál szövettani, ill.citológiai vizsgálat is történik. Mivel nem csak a tel RNS- vagy protein-komponensének detekciója történik, ezért enzimatikus aktivitás (TA) megléte is feltétel, tehát RNáz mentes körülmények és stabil mRNS szükséges a mérésekhez. Lépései: -totál RNS izolálás acid-phenol- guanidin módszerrel -az RNS minta minoségének detektálása -cDNS szintézis (reverz transzkripció) -amplifikáció -detektálás relativ kvantifikációval
Mivel a hTERT mRNS gén expresszió és a TA szoros korrelációt mutat, elobbi kvantitatív mérésével a TA indirekt módon meghatározható. Az RNS izolálás, a reverz transzkripció mintánként eltéro hatékonyságából eredo hiba, a nehéz standardizálhatóság kiküszöbölésére a minta mRNS mennyiségét egy endogén RNS-kontroll (ún. house-keeping gén transzkript - lásd késobb) mennyiségéhez viszonyítjuk: ez a relativ kvantifikáció. A belso kontroll, a hTERT primerek és próbák elozoleg validált formában állnak rendelkezésre A módszer magas szenzitivitású a templát RNS exponenciális amplifikációja miatt, nagyon specifikus , mert génspecifikus primereket használ a cDNS szintézishez, valamint gyors eredményt ad.
24
Elozo tanulmányok szerint a RT-PCR a hTERT detektálásában - hólyagcarcinomás esetekben - sokkal szenzitívebbnek bizonyult, mint a TRAP (81).
Valamennyi leírt nehézsége t kiküszöbölendo, az alternatívák elonyeit egyesítve, saját vizsgálatainkban kvantitativ real-time RT-PCR módszert alkalmaztunk, ultragyors LightCycler rendszerrel, TeloTAGGG hTERT Kvantifikációs (egylépéses PCR) Kittel (82). A LightCycle r rendszer a hTERT gén expresszió meghatározásának igen érzékeny, kvantitatív módszere, a hTERT-et tartalmazó minták RNS-izolátumaiból, a mRNS detektálásával (83). Munkánk elso részében célul tuztük ki a tel reaktiváció vizsgálatát, a hTERT mRNS relatív expressziójának mérését rutin hisztológiai és citológiai anyagon, a fenti módszerrel. Megvizsgáltuk azt is, hogy a kapott értékek milyen kapcsolatban állnak a morfológiával.
1.II. A galectin-3 (a továbbiakban gal3) 31 kDa molekulasúlyú, béta-galaktozidázt köto polypeptid, a lektinek családjába tartozik. Számos szövetben és sejttípusban expresszá lódik, ahol a sejtmagra és/vagy a citoplazmára, a sejtfelszínre vagy a sejt környezetében lévo mátrixra lokalizálódik. A normál humán sejtek közül a makrofá gok, monociták, különbözo epithelsejtek (vastagbél-, emlo-, vesehámsejtek) expresszálnak gal3-t, de számos humán daganatban is megjelenik, így pajzsmirigy-, emlo- és vastagbélrákban, melanoma malignumban, sot, HTLV1- fertozött T-sejtekben is kimutatható. A felsorolt különféle sejttípusok esetén számos biologiai és patológiai folyamatban játszik szerepet: a sejtciklus reguláló komponense (apoptózis inhibitor, stimulálja a sejtproliferációt; ilyenkor emelkedett az expressziója és nukleáris lokalizáció észlelheto) (84-88), szabályozza a sejt-sejt és a sejt- matrix kölcsönhatást, az adhéziót (major non-integrin laminin-köto fehérje) (85,88,89,90), a migrációt, szerepe van a gyulladásban (91), a daganatos transzformációban (92), a metasztázis-képzésben, a károsodott sejt reparációjában. Az utóbbi idokben történt vizsgálatok és közlemények alapján a gal3 expresszió a különbözo daganatok invazív és metasztatikus potenciáljával korrelál (93). Mint adhéziós molekula az embriogenezisben (94,95) és a daganat progresszió jának különbözo stádiumaiban játszik szerepet. Így pl. colorectalis rákban és emlorákban valószínuleg a gal3 down-regulációja teszi lehetové a 25
daganatsejtek és a laminin interakcióját, ezáltal elosegítve az inváziót és a metasztázisképzodést (96-98). Kimutatták anaplasztikus nagysejtes lymphomákban is, ahol azok karakterizációjában nyújthat segítséget (99). Végül, elkülöníthetonek látszanak a benignus és malignus pajzsmirigydaganatok, valamint a malignus daganatok és az egyéb tumorszeru állapotok (100-102) - az újabb közlemények alapján a CD-44v6 és/vagy CK-19 markerek együttes vizsgálatával (103,104). Egyes szerzok prospektív analízise alapján a gal3 immundetekció a preoperatív diagnosztikában csaknem 100%-os biztonságú a benignus és malignus léziók elkülönítésének tekintetében (105). Ebben a tanulmányban Bartolazzi és munkatársai azt találták, hogy a pajzsmirigynodulusok vékonytu aspirációs citológiai keneteiben a szenzitivitás és specificitás több mint 99% és 98%. Munkánkban, fenti tapasztalatok megerosítése céljából, 91 db pajzs mirigyelváltozás metszetét vizsgáltuk retrospektive gal3 immunhisztokémiai reakcióval.
2. Célkituzések
2.I. Az eddigi irodalmi adatok alapján a tel értékes diagnosztikus és prognosztikai markernek, valamint terápiás célpont nak ígérkezik. Utóbbi tekintetében még csak kutatások folynak - biztató eredményekkel. A másik két szempontból is foképp experimentalis vizsgálatok történtek, a tel expresszió mérésének rutinszeru alkalmazása, kiváltképp hazánkban, még nem megoldott.
1. Célkituzésünk volt a tel reaktivációjának vizsgálata és a TA indirekt meghatározása (az ezzel szoros korrelációban álló hTERT mRNS mennyiségének mérésével), gyakorlatilag válogatás nélküli, rutin hisztológiai és citológiai anyagokban - jó kooperációban a bonni patológiával. Mivel az osztályunkra érkezo különbözo nativ anyagokból tumorbankunkba lehetoség szerint elteszünk, így módunkban állt különféle léziókat megvizsgálni. Lágyrész és urológiai centrum lévén, különösen ezekbol az anyagokból állt rendelkezésre megfelelo mennyiségu minta.
2. Míg számos daganat esetén a TA prognosztikai jelentoséggel is rendelkezik, addig a vesesejtes veserákok (RCC) esetén a szokásos prognosztikai faktorokkal nem 26
mutatható ki összefüggés (182,183). A konvencionális világos sejtes veserákból is relative nagyobb számú minta állt rendelkezésünkre, ezért ezeket külön csoportot képezve vizsgáltuk, hogy van-e összefüggés a Fuhrman grade és a TA között.
3. Ismert, hogy a TA a legtöbb humán carcinomában kimutatható, de kevesebbet tudunk a TA-ról lágyrésztumorokban. E tekintetben eddig relative kevés vizsgálat történt, kérdéses eredményekkel. A különbözo dignitású lágyrésztumorok hTERT expresszióját és TA-t szintén külön csoportban vizsgáltuk. Megnéztük, van-e összefüggés a kvantitatív adatok és a morfológiai faktorok (hisztológiai és citológiai klasszifikáció, tumor típus és grade) között.
4. Megvizsgáltuk azt is, hogy a hTERT expresszió elég érzékenyen jezi -e a maligitást exfoliativ és vékonytu aspirációs citológiai anyagban. Utóbbiak többsége pajzsmirigyminta volt, ezért ezeket is külön csoportba soroltuk.
5. Az irodalomban leírt tapasztalatok megerosítése céljából, miszerint a hTERT mRNS kimutatása vizeletüledékben kiválóan alkalmas monitorozásra, (exfoliatív citológiai) vizeletanyagunkon ezirányú megfigyeléseket is végeztünk.
6. Céljaink közöttt szerepelt még a konvencionális TRAP és a különbözo mérési alternatívák technikai korlátainak legyozése a tel indirekt mérésével, a vele kapcsolatban lévo géntermék, a hTERT mRNS útján. Ezért a mérések real-time RTPCR alkalmazásával igen gyors, kvantitativ, on- line rendszeren (LightCycler), fluoreszcens z próbákkal történtek.
2.II. A pajzsmrigydaganatok változatos hisztopatológiai megjelenést és klinikai viselkedést mutatnak. A molekuláris markerek, így a munka elso részében vizsgált telomeráz is, ígéretesek ugyan, de egy részük egyelore még kevéssé hozzáférheto a rutindiagnosztika számára. A pajzsmirigydaganatok differenciáldiagnosztikájában és gradingjében azonban a diagnosztikus immunhisztokémiai antitestek is egyre fontosabbá válnak.
27
Osztályunkon, minthogy viszonylag gyakran érkezik pajzsmirigyrezekátum, egyre gyakrabban
találkozunk
differenciáldiagnosztikai
problémákkal
is,
az
egyes
pajzsmirigyléziók hisztopatológiai értékelése során. Az immunhisztokémiai markerek között -az irodalmi adatok alapján- a galectin-3 (gal3) igen specifikusnak és érzékenynek tunik (egyes
szerzok korábbi eredményei csaknem 100%-os specificitást és szenzitivitást mutattak utóbbi kérdésben). Ezért munkánk második részében 91 pajzsmirigyelváltozásban végeztük el retrospektive a gal3 immunhisztokémiai reakciót, és elemeztük ennek diagnosztikus értékét a különbözo elváltozások dignitásának meghatározásában, különös tekintettel a follicularis eredetu léziókra.
3. Anyag és módszerek 3/I. TA mérése 3.I.1. Vizsgálati anyag A minták 2 év (2000. II. félévtol 2002. II. félévig terjedo) rutin his ztológiai és citológiai anyagából származnak. A budapesti és bonni patoló gia 118 db (77 db budapesti hisztológiai és 41 db bonni citológiai minta), gyakorlatilag válogatás nélküli esetét analizáltuk. Ez azt jelenti, hogy valamennyi olyan anyagból, mely -kérésünkre- natív állapotban érkezett, és lehetoség volt arra is, hogy a kivétel után közvetlenül osztályunkra juttassák, lefagyasztottunk három, kb. 0,5 cm3 darabkát. Mivel a TA meghatározása paraffinos metszeten nem lehetséges, ezért a szövetminták tumorbankból származnak, ahová azokat közvetlenül kivételük után helyeztük, és fagyasztott
állapotban
tároltuk.
Osztályunk
tumorbankjából
77,
különbözo
lokalizációkból származó, -70?C-on tárolt fagyasztott szövetmintát vettünk. Ezek között benignus, szemimalignus és malignus elváltozás egyaránt volt. A hisztológiai tipizálás és szubtipizálás a formalin- fixált és paraffinba ágyazott anyagból készült H.E. festett metszetek alapján, a WHO szerint történt. Amennyiben szükséges volt, úgy kiegészíto vizsgálatokat is (immunhisztokémia, DNS-citometria, FISH, egyes esetekben elektronmikroszkópia) végeztünk. 28
A 41 db citológiai mintából az RNS izolálás azonnal, a mintavétel után megtörtént, míg véleményezésre ThinPrep (monolayer) feldolgozás és H.E festés után került sor. A vizsgálati anyagokat 5 csoportba osztottuk: vesedaganatok, lágyrészdaganatok, húgyhólyagdaganatok- vizelet, pajzsmirigyléziók és egyéb kategória.
3.I.2. Szövetminta preparáció 25 mg szövetmintát homogenizáltunk 500 µl TRI REAGENT-ben (Sigma) manuálisan, Potter homogenizátorral. A homogenizátumot 12000 g-vel, 10 percig, 4?C-on centrifugáltuk, hogy eltávolithassuk a nem oldható anyagot. A tiszta felülúszót új Eppendorf csobe tettük át. A nukleoprotein komplexek teljes disszociációjának biztosítására a mintát 5 percig szobahomérsékleten tartottuk. Ezután a mintát 100 µl chloroformban elkevertük, szorosan lezártuk és Vortexeltük (eros rázásnak vetettük alá) 30 mp-ig, majd 3-5 percig szobahon hagytuk állni. A keletkezett keveréket 12000 g- n, 15 percig, 4?C-on centrifugáltuk. Ez 3 fázisra szeparálta a keveréket: a vörös organikus fázis tartalmazta a proteint, az interfázis a DNS-t és a felso színtelen, vizes fázis az RNS-t. 3.I.3. RNS izolálás A vizes fázist pipettával leszívtuk, áttettük egy új csobe, azonos mennyiségu (ml) isopropanollal kevertük el, majd szobahon 5-10 percig állni hagytuk A mintát 12000 gn, 10 percig, 4?C-on centrifugáltuk. Ezáltal az RNS precipitátum a cso alján egy pellettet alkotott. Miután a felülúszót leöntöttuk, 500 µl 75%-os ethanolba mostuk a mintát, Vortexeltük és 12000 g-n, 5 percig, 4 C-on centrifugáltuk. A felülúszót ismét leöntöttük. Az RNS pelletet vákumban kiszárítottuk, 50 µl RN-áz mentes vizben (DEPC= diethyl pyrocarbonate-os víz) oldottuk. Az izolátumot -80?C-on azonnal lefagyasztottuk Az RNS koncentrációját és “tisztaságát” spektrofotométerben határoztuk meg a 260 nm/280 nm-en mért abszorbanciával. Technikai szempontból fontos, hogy az RNS preparáció contaminalt DNS-tol mentes legyen, mert az analyzálandó RNS mennyiségét túlbecsülhetjük a standard módszeru DNS/RNS kvantifikáció során (260 nm mérés), ezért ez fals eredményekhez vezet a hTERT és a PBGD átiratok kvantifikálásakor.
29
A totál RNS fotometriás kvantifikációja során használt értékek: OD260=nukleinsavak (RNS,DNS) abszorpciós maximuma OD280=fehérjék abszorpciós maximuma OD240 v.320=háttér abszorpció kontamináció következtében (pl. fenol, stb.) OD260/OD280 hányados=az RNS preparáció minosége (quality) (kívánatos tartomány:1,7-2,0) OD260/OD240/320=az RNS preparáció tisztasága (purity)
3.I.3.a. A citológiai mintákból történt RNS-izoláláshoz: High Pure RNA Tissue Kit-et (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) használtunk, a gyártó cég használati utasítása szerint. A vizelet (4. csoport) esetében az exfoliált sejteket 50 ml-nyi ürített vizeletmintából nyertük, a hólyagmosás 50 ml sóoldat transurethralis irrigációjával történt. A vizeletet és a hólyagmosó folyadékot 15 percen belül, 10000 x g-n, 10 percig lecentrifugáltuk. Az így nyert sejt üledéket PBS-ben (fiziológiás NaCl-t tartalmazó foszfát-puffer) mostuk, majd az RNS izolálás a fentebb már leírtak szerint történt. 3.I.4. RT-PCR és a telomeráz (hTERT) assay A hTERT mRNS mennyiségét és az ezzel korreláló TA-t real-time RT-PCR módszerrel, TeloTAGGG hTERT Kvantifikációs Kittel, LightCycler segítségével végeztük, a gyártó cég (Roche) használati utasítása szerint. A tel-kódolt mRNS átírása után, az így keletkezett cDNS-nek egy 198 bázispár nagyságú fragmentjét specifikus primerekkel amplifikáltuk egylépéses RT-PCR reakcióban. Az amplikont fluorescenciával detektáltuk, specifikus hibridizációs próbapárok használatával. (7. ábra)
30
A cDNS 198 bp fragmentumainak PCR amplifikációja
7. ábra A különbözo ciklusok során a jelintenzitás a minta hTERT mRNS-ének és a PBGD-nek a kezdeti koncentrációjától függoen válik detektálhatóvá. A standardok és a minták szignáljainak folyamatos monitorizálásával keletkezik az amplifikációs görbék sorozata.
A minden reakciókeverékhez hozzáadandó, az abszorbancián alapuló pontos totál RNS mennyiség megállapítása, kimérése és megfelelo minoségének biztosítása (pl. mentes legyen a degradációtól) nehézségeket okozhat, fennáll a pontatlanság lehetosége. Ezért ún. house-keeping gént kell használni, és ennek transzkriptjét is kvantifikálni kell, mint endogén RNS kontrollt, és minden egyes mintát hitelesíteni kell a house-keeping gén tartalom alapján. A stabilan expresszálódó ún. house-keeping gének olyan fehérjéket kódolnak, melyek aktivitása a sejtfunkciók fenntartásában alapveto. Ezek a gének hasonló szinten expresszálódnak a különbözo sejttípusokban. A megfelelo house-keeping 31
gén a vizsgált mintákban nem mutathat változatosságot. Méréseinkben a PBGD (porphobilinogen deami nase, a hem bioszintézisben részt vevo citoszolikus enzim) gént használtuk. A minták normalizálása a PBGD tartalomhoz viszonyítva történt. Egy külön RT-PCR reakcióban a PBGD mRNS-t dolgoztuk fel. Ez utóbbi reakciótermék szolgált kontrollként és referenciaként a reakcióban és a relativ kvantifikációban. A relativ tel expressziós szintek ennek a génnek az expressziós szintjéhez viszonyítva, arányként lettek meghatározva.
Az irodalmi adatok figyelembe vételével (188,189) - a
szövetminták 300 PBGD kópiánál nagyobb, a citoló giai minták 150 PBGD kópiánál nagyobb értékek esetén voltak értékelhetoek, azaz tartalmaztak elegendo mennyiségu és minoségu RNS-t a tel tartalom meghatározásához. A reakcióban a relativ target gén expresszió s szint ugyancsak kalibrátorhoz (azaz a legkisebb mérheto mennyiségu hTERT mRNS-t tartalmazó mintához) van hitelesítve. A kalibrátor ezáltal jelzi a target kvantifikáció assay határértékét, mely megfelel a 35. hTERT
Ct
értéknek.
(N
hTERT= hTERT
minta
hTERTkalibrátor/PBGDminta
PBGDkalibrátor) A standard görbe felvétele a kitben található sejtvonalból nyert cDNS-ek különbözo hígításaival történik. A kalibrátor az a minta, melyet a végso eredmények normalizációjához használunk. Minden minta referencia hányadosa osztva van a kalibrátor referencia hányadosával. Ez normalizálja a különbözo detekciós szenzitivitásokat a target és referencia termékekre.
A reakcióelegy tartalma: -2 µl hTERT reakciókeverék -0,1 µl reverz transzkriptáz -2 µl hTERT vagy PBGD detekciós keverék -13,9 µl víz -2 µl saját mintánkból preparált RNS vagy standard RNS templát.
32
A reakció lépései: a) Reverz transzkripció (60 o C,10 min) b) kezdo denaturáció (95 o C, 30 sec) c) 40 ciklus: - denaturáció (95 o C, 0.5 sec) - primerek kötodése (annealing) (60 o C, 10 sec) - extenzió (72 o C, 10 sec - amplifikációs ciklusonként).
A külso standard görbe megállapításához minden, a LightCycler-ben végbemeno ciklus tartalmazza öt standard hTERT mRNS-ének meghatározását, melyek 1.3 x 106 , 9.8 x 104 , 8.0 x 103 , 7.2 x 102 és 1.4 x 102 /2 µl kópiát tartalmaznak; valamint a - pozitiv kontrollként szolgáló - total RNS-t, mely a kitben található hTERT mRNS-t expresszáló HeLa sejtvonalból származik.
II. Galectin-3 immunhisztokémia 91 db formalinban fixált, paraffinba ágyazott pajzsmirigyminta metszetein végeztük el a gal3 immunperoxidáz reakciót. Az elváltozások his ztopatoló giai klasszifikációja a következo volt: 20 papillaris carcinoma, 19 follicularis adenoma (köztük egy atypusos adenoma), 10 follicularis carcinoma (köztük egy Hürthle-sejtes carcinoma ), 5 medullaris carcinoma, 1 mucoepidermoid carcinoma, 7 Hashimoto thyreoiditis, 1 de Quervain thyreoiditis,
3
pseudopapilláris
pajzsmirigyszövettel felállításában
az
hyperplázia
összefüggésben.
A
és
felsorolt
25
nodozus
struma,
elváltozások
alapveto hisztomorfológiai kritériumok közül
normál
diagnózisainak kiemeljük
a
következoket. A follicularis carcinoma feltétlen kritériumaiként tekintettük az együttes ér- és tokinváziót, önmagában a tokinvázió t nem fogadtuk el. A papillaris carcinoma esetén az egymást részben fedo magvakat, illetve magtorlódást, a tejüveg- magvakat, az intranuk leáris pszeudoinklúziókat és groove-okat, valamint - a follicularis variáns kivételével - a jellegzetes strukturát tekintettük diagnosztikusnak.
33
A reprezentatív metszetek deparaffinálása után, citrátos mikrohullámú antigén-feltárás történt 30 percig 1000W-on, DAKO feltáró oldat (Denmark A/S, Glostrup, Denmark) 1:10 higításával. Az endogén peroxidáz gátlás a metszetek 10 percig tartó, 3%-os H2O2-ba
merítésével
történt.
Ezután
idirekt
avidin-biotin
immunperoxidáz
technikával (Vectastain ABC kit) gal-3 reakciót végeztünk (Ventana Nexes automatával, Ventana Medical Systems, Inc., AZ, USA), a Novocastra Laboratories útmutatása alapján. Minden metszetre 1:50 hígítású gal3 primer egér antitestet (Novocastra Labs Ltd, 9C4 clone, IgG1 subclass) helyeztünk 30 percig. Az enzimaktivitás vizualizálása amino-ethyl-carbasol-lal (AEC) történt. Negatív kontrollként a primer gal3 antitest kihagyásával, egyebekben pedig a fent leírtakkal megegyezoen kezelt metszetek szolgáltak, melyek egyikében sem észleltünk pozitivitást.
Az eredmények értékelése a következo kritériumok alapján történt. -negativ: nincs reakció vagy egy-egy magreakció t mutató sejt -fokális pozitivitás: <20% cytoplazmatik us (és mag-) reakció -pozitív: >20% cytoplazmatikus (és mag-) reakció.
4. Eredmények
4.I. A vizsgálati anyagokat 5 fo csoportba soroltuk: vesedaganatok, lágyrészdaganatok, húgyhólyag és vizelet, pajzsmirigyléziók és egyéb elváltozások. Az adatokat és eredményeket a I-V. táblázatban fogla ltuk össze. Az összesen 118 hisztológiai és citoló giai mintából 86 esetben (73%) volt detektálható kontroll gén (PBGD), ennek megfeleloen további vizsgálat és értékelés csak ebben a 86 esetben történt. Szoros korreláció mutatkozott a hTERT mRNS expresszió és a TA között. TA 35 esetben (29,66%) volt mérheto.
34
4.I.1. Vesedaganatok
I. táblázat Vesedaganatok hTERT expressziójának mérése és TA-ának indirekt meghatározása Hisztológiai és citológiai Minta klasszifikáció
Kiegészíto TA (%) vizsgálatok
PBGD
hTERT
13370 4321
131 1301
1 30
0 0 0 1300 0 0 687 0 0 1166 4649 1460 0 0 7371 0 0 13730
0 0 1037 152,4 0 0 0 23,5 0 764 37,3 0 0 0 1064 0 0 8,8
n.é. n.é. ? 117,2 n.é. n.é. 0 ? n.é. 66 0,8 0 n.é. n.é. 14,4 n.é. n.é. 0,1
21.
RCC, Fgr II. terület RCC (1.sz.minta onkocyter és Fgr IV. terület) RCC, Fgr II. RCC, Fgr II. RCC, Fgr II, RCC, Fgr II. RCC, Fgr III. RCC, Fgr III. RCC, Fgr III. RCC, Fgr III. RCC, Fgr III. RCC, Fgr IV. RCC, Fgr IV. RCC, Fgr IV. RCC, Fgr IV. RCC, Fgr IV. RCC, Fgr IV. RCC, Fgr IV. RCC, Fgr IV. RCC onkocyter-papilláris , Fgr.II. RCC papilláris , Fgr II.
0
0
n.é.
22. 23. 24.
Pyelon TCC, gr II. Pyelon TCC + SCC, gr.III. Wilms tumor
0 1420 0
0 3 0
n.é. 21,1 n.é.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.
DI=0,95 DI=1,82
DI=0,94 DI=0,95
DI=1,05 és DI=2,3 DI=2,06
DI=2,0 DI=1.45
DI=1,27
DI=1,00 FISH: 7 és 17 kr. triszomia DI=1,64
Fgr=Fuhrman grade; RCC=Renal cell carcinoma (vesesejtes veserák, konvencionális); TCC=Transitional cell carcinoma (átmeneti sejtes rák); SCC=Squamous cell carcinoma (laphámrák); PBGD=porphobilinogen deaminase; hTERT=human telomerase reverse transcriptase; TA=telomeráz aktivitás; DI=DNS index; n.é.=nem értékelheto
A nem értékelheto esetek zömét (a vizsgált vesedaganatok kb. felét) a vesecarcinomák tették ki. Az értékelheto RCC (renal cell carcinoma, konvencionális non-papilláris subtípus ) esete k csaknem mindegyike mutatott hTERT expressziót és TA-t, két kivétellel: egy Fgr (Fuhr man grade) III és egy Fgr IV. A TA mértéke változó volt, a konvencioná lis RCC-k esetén független volt a Fgr-tol: a Fgr II. RCC szignifikánsan magasabb TA értékeket mutat, mint a Fgr IV. RCC-k. Az 1.sz. és 2.sz. anyag ugyanazon
35
daganat, melyen belül morfoló giailag, valamint hTERT, TA és DNS-tartalom tekintetében egyaránt markánsan eltéro két komponens volt detektálható.
4.I.2. Lágyrészdaganatok II. táblázat Lágyrészdaganatok hTERT expressziójának mérése és TA-ának indirekt meghatározása Minta 1.
Hisztológiai és citológiai klasszifikáció Synovialis sarcoma
PBGD 677
hTERT Nyomokban pozitív
TA (%) 0
2. 3. 4.
Synovialis sarcoma Synovialis sarcoma, gr. II. Leiomyosarcoma
0 894 8717
0 25 36
n.é. 3 0,4
5. 6. 7.
11130 0 2043
0 0 0
0 n.é. 0
8. 9.
Recidiv fibrosarcoma, gr. II. Recidiv fibrosarcoma, gr. II. Recidiv MFH, Storiform-pleomorph, gr. III. Malignus mesenchymoma Malignus haemangiopericytoma
44 1820
0 285
0 16
10. 11.
Myositis ossificans Myositis ossificans
62930 1898
7,6 7,4
0 0,4
12. 13. 14. 15.
Desmoid Benignus granular sejtes tumor Benignus granular sejtes tumor PNET
0 11450 832 1580
0 0 0 386
n.é. 0 0 244
16. 17.
Myxoid tumor, intermedier mal. Synplastic leiomyoma ,uterus
290 395
0 4,8
0 16
Kiegészíto vizsgálatok DI=0,96, Ki67:38-40%, FISH: t(x;18) Ki67: 8-10% DI=3,7 és 0,96, Ki67:36-40% Ki67:25-27% Ki67:22-24% Ki67:28-30% Ki67:22-23% DI=1,00,Ki67: 26-28% DI=1,02 DI=0,96,Ki67: 18-20% DI=0,93 Ki67:75-80%, FISH: t(11;22)
PBGD=porphobilinogen deaminase; hTERT=human telomerase reverse transcriptase; TA=telomeráz aktivitás; DI=DNS index; n.é.=nem értékelheto
A 17 mintából 3 nem volt értékelheto. A vizsgált daganatok kevesebb mint fele mutatott mérheto hTERT expressziót és TA-t, melyek mértéke meglehetosen változó volt. PNET esetünkben extrém magas volt az aktivitás. Az egyik myositis ossificans negativ, míg a másik mérsékelt TA-t mutatott, mely érdekes módon megegyezett a leiomyosarcomában mért értékkel. A recidiv fibrosarcoma, a storiform-pleiomorph MFH (malignus fibrosus histiocytoma), a malignus mesenchymoma, az intermedier malignitású myxoid tumor egyaránt negativak voltak. A malignus haemangiopericytoma pozitivitása azonban az uterusban 36
talált synplasticus leiomyomáéval volt egyenlo mértéku! A benignus granularsejtes tumor a vártnak megfeleloen negatív volt. Tehát a lágyrészdaganatok esetén a hTERT expresszió és a TA nem mutatott összefüggést a hisztogenezissel.
4.I. 3. Húgyhólyag és vizelet III. táblázat Húgyhólyag és vizelet elváltozások hTERT expressziójának mérése és TA-ának indirekt meghatározása Minta 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
12.
13. 14. 15. 16.
Hisztológiai és citológiai klasszifikáció Noincs tumor recid., V Nincs tu. recid, V Nem tu suspect., V Nincs tu recidiva, V Tu negative, Ureter lavage Degenerativ urothel, V Degeneráció, nincs tu recidíva, V Regenerativ urothel, V Regeneráció, nincs tu. recidíva, V Regeneráció, nincs tu.recidiva ,V Granulomat.gyull.,erózió, regener.,hengersejtes metaplasia, nincs tu.recidíva, BW + Histologia Regeneráció, Mitomycin okozta magatípia, nincs tu. recidíva, Histologia
19. 20.
Chr. gyulladás V Mitomycin terápia okozta atypia, BW Mérsékelt gyulladás, degeneráció., V Enyhe mag/cytopl. Eltérések, nincs definitiv dg. V Atypusos papilláris urothel proliferáció, V Atypusos papilláris urothel proliferáció, V Atypusos urothel proliferáció, V Papill.cc.suspect, V
21. 22. 23.
Urothelialis cc.suspect, V Susp.for recid., V Low gr. TCC suspect, V
24. 25. 26. 27. 28.
Papilláris TCC suspect, V TCC suspect, V Papillaris TCC suspect, V Papillaris TCC, jól differenciált, V TCC, rosszul differenciált, V
17. 18.
PBGD 210 116 0 0 83,2 0 253 0 0 68 417
hTERT 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
TA (%) 0 0 n.é. n.é. 0 n.é. 0 n.é. n.é. 0 0
0
0
n.é.
0 0 24,3 0
0 n.é. 10! 0
460
2
4,6
80
0
0
131 11
0 0
0 0
107 670,40 <100
0 1,995 0
0 30 0
58 0 174 52 220
0 0 <10 0 0
0 n.é. 0,8 0 0
340 0 342 ~300
37
Kiegészíto Vizsgálatok
Mitomycin terápia okozta DNS degradáció
Emelkedett CA 19/9!
DI:peridiploid
V= ürített vizelet; BW = bladder washing (hólyagmosás); TCC=transitional cell carcinoma (átmeneti sejtes rák); PBGD=porphobilinogen deaminase; hTERT=human telomerase reverse transcriptase; TA=telomeráz aktivitás; DI=DNS index; n.é.=nem értékelheto
A 28 mintából 8-ban nem volt detektálható house-keeping gén. Ebbol 7 nem tumorgyanús eset. 14 mintában volt ugyan PBGD, de az elégséges 300 kópiánál alacsonyabb mértékben. Ennek ellenére ezeket az eseteket is értékeltük, egy kivételével TA negatívnak ítéltük, annak tudatában, hogy ezek ál- negatívak is lehetnek. Azon értékelheto minták (7 eset), amelyek hólyagrákos anamnézisu betegbol származtak, - egy kivétellel - TA negatívnak bizonyultak, és a cystoscopos kép is tumor-negatív volt. Ezekben a betegekben a hisztomorfológia (amennyiben történt biops zia) és a citológia is negativ volt, illetve benignus elváltozásokat (hyperplázia, laphám metaplázia, degeneráció ) mutatott. Az egyetlen pozitív (de nem suspect) monitorozott vizeletmintában mérsékelt TA mellett, morfoló giailag enyhe gyulladás és degeneráció is jelen volt, de FISH vizsgálattal numerikus kromoszó mális eltérést nem találtunk. 2 definitív TCC-t (transitiocellularis carcinoma) és 11 tumorgyanús vizeletcitológiai mintát találtunk. A 13 tumoros, tumorgyanús, illetve recidivagyanús esetbol TA tekintetében 1 értékelhetetlen, 9 negatív, 3 pozitív. A citomorfoló gia hisztológiai vizsgálatot indikált, mellyel utóbbi 3 daganat igazolódott is (ebbol egy recidíva, 2 primer daganat - utóbbiakban párhuzamos his ztológia és citológia történt ). egyben a CA 19/9 tumormarker emelkedett volt.
38
A 9 negatívból
4.I.4. Pajzsmirigyléziók
IV. táblázat Pajzsmirigyléziók hTERT expressziójának mérése és TA-ának indirekt meghatározása
7.
Hisztológiai és citológiai klasszifikáció Cysticus, degeneratív gobos struma, FNAB Cysticus, degeneratív gobos struma, FNAB Degeneratív foll. npl, vs adenoma, FNAB Cysticus, degeneratív foll. npl, vs.adenoma, FNAB Degeneratív microfollicularis adenoma, hist Göbös struma, degeneratív macrofollicularis adenoma, hist Foll. npl, vs adenoma, FNAB
8. 9.
Foll. npl, vs adenoma, FNAB Foll. npl, vs adenoma, FNAB
10. 11. 12.
0 11110 400
0 0 0
n.é. 0 0
886
26,7
31
14.
Foll. npl, vs adenoma, FNAB Microfollicularis adenoma, hist Degeneratív foll. npl,onkocyter transzformációval, FNAB Onkocyter follicularis cc.,minimális invázióval, hist Degeneratív vagy valódi atypia FNAB
333
0
0
15. 16. 17. 18.
Atypusos adenoma, hist Atypusos adenoma, hist Medulláris carcinoma, hist Adenolipoma, hist
0 1822 24666 16990
0 0 26,1 33,9K
n.é. 0 0,11 0,2
Minta 1. 2. 3. 4. 5. 6.
13.
PBGD 0
hTERT 0
TA (%) n.é.
476
0
0
368
0
0
515
0
0
226,7
0
0
156
0
0
975
0
0
830 733
0 0
0 0
Kiegészíto vizsgálatok
DI: nincs aneuploidia DNS: nincs aneuploidia DI: diploid DI=1,7
DI: nincs aneuploidia
FNAB= fine needle aspiration biopsy (vékonytu aspirációs biopszia); foll.npl=follicularis neoplázia; hist=hisztológia; vs=verosimiliter; PBGD=porphobilinogen deaminase; hTERT=human telomerase reverse transcriptase; TA=telomeráz aktivitás; DI=DNS index; n.é.=nem értékelheto
A 18 vizsgálati anyagból 10-et vékonytu aspirációs biops ziával (FNAB) nyertünk, 8 szövetminta volt. Mindkét módszerrel nyert anyagok - két, illetve egy kivétellel értékelhetoek voltak (tehát a PBGD detektálható). Valamennyi degenerativ elváltozás és follicularis neoplázia TA negatív volt. A 13. sz. hisztológiai mintában (minimálisan 39
invazív/enkapszulált onkocyter follicularis carcinoma) jelentos mértéku TA mutatkozott. A medullaris carcinomában alacsony TA volt megfigyelheto. Ahol kiegészíto vizsgálatként DNS-tartalom meghatározás is történt, ott - egy kivétellel a TA negativitás lényegében diploid állapotnak felelt meg, illetve nem volt aneuploid sejt. A 12. sz. esetben (degeneratív follicularis neoplázia, onkocyter transzformáció val, FNAB), a tel negativitás ellenére a DI aneuploidnak bizonyult (DI=1,7). Meglepetésre a benignus angiolipomában is megfigyelheto volt - a medullaris carcinomához hasonlóan alacsony - TA.
4.I.5. Egyéb elváltozások
V. táblázat Különbözo lokalizációjú és eredetu elváltozások hTERT expressziójának mérése és TA-ának indirekt meghatározása Minta 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.
16. 17.
Hisztológiai és citológiai klasszifikáció Seminoma, here, h ist Seminoma, here, hist Összetett csírasejtes tumor, here, hist Összetett csírasejtes tumor, here, hist Diffúz nagy B-sejtes lymphoma, here, hist Nodularis paragranuloma, nyirokcsomó, hist Follicularis lymphoma, nyirokcsomó, hist Vegyes tumor, parotis, hist Rosszul differenciált adenocarcinoma áttét, nyirokcsomó, hist Sarcomatoid carcinoma áttét, nyirokcsomó, hist Végbélcarcinoma áttét, máj, hist Végbálcarcinoma áttét, máj, hist Adenocarcinoma, gr.II, colon asc.,hist Endometrioid adenocarcinoma., ovarium, hist Atrophiás endometrium,cervicalis microglandularis hyperplasia, uterus, hist Focalis adenomatosus hyperpl.asia, endometrium, hist Premenopauzális endometrium, hormonális insufficientia, cervicalis erosio, uterus, hist
PBGD 352 260 380 3342 349
Kiegészíto hTERT TA % vizsgálatok minimális Gyakorlati poz. lag 0 0 0 111 62 1805 54,0 2,2 0,6
16910
79,6
0,5
0
0
n.é.
8011 0
21 0
0,3 n.é.
14880
104,4
0,7
6,250 304 605 470,0
47,5 0 0 94,3
0,8 0 0 2,0
1660
0
0
<100
0
0
298,7
11,2
2,4
40
DI = 0,99
18. 19. 20. 21. 22.
Myoepithelialis daganat, a dignitás nem állapítható meg, emlo, FNAB Fibrocystás betegség, emlo, FNAB Fibrocystás betegség, nincs recidiv atyp.duct.hyperpl., emlo, FNAB Cysta + epithelialis proliferation, emlo, FNAB Ductalis cc.+ DCIS, emlo, hist
261,6
25,1
1,0
0 2100
0 0
n.é. 0
380
0
0
219,20
108
0,5
23.
Cysta tartalom,5 ml, mal.suspect, emlo, FNAB
2641
3,7
0,14
24.
Lobularis carcinoma, emlo, hist
4,079
0
0
25. 26.
Lobularis carcinoma, emlo, hist Atypusos medullaris carcinoma, emlo, hist Rupturált epidermalis cysta, bor, hist Condyloma acuminatum, praeputium, hist Acut appendicitis, hist Chronicus dudodenalis ulcus, hist Colitis ulcerosa, hist
670,40 305,6
1,995 50,8
30 1,7
25,0 0
0 0
0 n.é.
262 332,2 172,0
0 0 8,3
0 0 0,5
27. 28. 29. 30. 31.
Aneuploidia
DI: aneuploid, magas rizikó Aneuploidia; de FISH,p53,cycl. D1: nincs genet.mutáció Diploidtetraploid Aneuploid, magas rizikó
PBGD=porphobilinogen deaminase; hTERT=human telomerase reverse transcriptase, TA=telomeráz aktivitás, DI=DNS index; hist=hisztológia ; n.é.=nem értékelheto; FNAB=fine needle aspiration biopsy (vékonytu aspirációs biopszia);
A 2 db összetett csírasejtes heretumor magas TA-t mutatott, míg a két seminoma gyakorlatilag negativ volt. 3 lymphoma- mintánk közül a diffúz nagy B-sejtes non-Hodgkin lymphoma (mely szokatlan módon a herére lokalizálódott) enyhe pozitivitást mutatott, hasonlóképpp a nodularis paragranulomához. A harmadik minta (nodalis, azaz nyirokcsomói follicularis NHL) nem volt értékelheto. A parotis pleiomorph adenomájában enyhe pozitivitást észleltünk. A különbözo eredetu carcinomák és metasztázisaik - két kivétellel (egy lobularis emlorák és egy közepesen differenciált vastagbélrák) - pozitívnak bizonyultak. A premenopauzális proliferatív endometrium mintában, mely cervix-erózióból származó szövetdarabokat is tartalmazott, enzimaktivitás volt mérheto. A különbözo benignus emloelváltozásokban (hyperplázia, fibrocystás betegség) negativitás, míg a carcinomákban - egyetlen lobularis carcinoma kivételével pozitivitás mutatkozott. A 2 malignitásra suspect, illetve a citológiai kép alapján nem eldöntheto dignitású elváltozásban (egy myoepithelialis daganat és egy malignitásra
41
suspect cystatartalom - 18. sz. és 23. sz. esetek) enyhe TA volt detektálható, valamint a 18. sz. mintában aneuploidia is volt. A 3 gyulladásos lézióból 2 (appendicitis, duodenumfekély) negativ, míg a colitis ulcerosában alacsony enzimaktivitás volt mérheto.
A különbözo csoportokba sorolt citológiai anyagok összességét illetoen szoros összefüggés (92,3 %-os specificitás és 60%-os szenzitivitás) mutatkozott a hTERT expresszió, a TA és az elváltozások dignitása között.
4.II. Galectin-3 Az eredmények összefoglalása a VI. sz. táblázatban látható.
VI. sz. táblázat Pajzsmirigyléziók gal3 immunhisztokémiai vizsgálata
Hisztopatol. klasszifikáció Esetszám Papillaris carcinoma 20 Follicularis adenoma 19 Follicularis carcinoma 10 Medullaris carcinoma 5 Mucoepidermoid carcinoma 1 Hashimoto thyreoiditis 7 DeQuervain thyreoiditis 1 Pseudopapilláris hyperplázia 3 Normál + nodosus struma 25 Összesen 91
Pozitív 19 0 2 3 0 0 0 0 0
Fokálisan pozitív Negatív 1 0 4 15 5 3 1 1 1 0 7 0 1 0 0 3 0 25
Valamennyi papillaris carcinoma egyértelmu, eros pozitivitást mutatott (8. és 9. ábra), egyetlen kivétellel, melyben csak fokális pozitivitást észleltünk (mely 100%-os szenzitivitást jelent).
42
8. ábra Intenzív cytoplazmatik us, néhol sejtmagban is megjeleno gal3 pozitivitás a klasszikus papillaris carcinomában (200x)
9. ábra A kifejezett gal3 reactio jól láthatóvá teszi a daganat széli részén az inváziot (100x)
A 10 follicularis carcinomából 2 volt gal3-pozitív, míg 5 fokális pozitivitást mutatott (10. és 11. ábra). 3 gal3-negatív follicularis carcinomát is találtunk (ez 30%-os álnegativitást jelent!).
10. ábra Diffúz citoplazmatikus gal3 pozitivitás follicularis carcinomában (200x)
11. ábra Fokális gal3 pozitivitás follicularis carcinomában (200x)
A 19 follicularis adenomából 4 esetben találtunk fokális pozitivitást. (ez 21% álpozitivitást jelent) (12. és 13. ábra), a többi 15 negatív volt.
43
12. ábra Fokális cytopla zmatikus gal3 pozitivitás a follicularis adenomában (400x)
13. ábra Follicularis adenoma (H.E., 400x)
A follicularis daganatok tekintetében a szenzitivitás 70%, míg a specificitás 78,9% volt.
Az 5 medullaris carcinomából 3 pozitiv, egy fokálisan pozitív és egy negatív volt. Az egyetlen mucoepidermoid carcinoma fokális pozitivitást mutatott.
Az expresszálódott gal3 foképp cytoplazmatikus lokalizációjú, magpozitivitás csak kevés sejtben volt megfigyelheto. Ezek a sejtek ki-67 proliferáció s markerrel is pozitívnak bizonyultak (14. és 15. ábra).
14. ábra 15.ábra A megelozoleg elvégzett gal3 reakcióval magpozitivitást is mutató sejtek mind a follicularis carcinomában (14. ábra, 100x), mind a Hashimoto-thyreoiditisben (15. ábra, 100x) ki-67 immunperoxidáz reakcióval is pozitivnak bizonyultak.
44
A stromában jelen lévo macrophagok, szegmentált magvú granulocyták, follicularis dendriticus reticulumsejtek, fibroblastok, simaizomsejtek egyaránt mutattak fokális gal3 expressziót.
Vizsgálatainkban a gyulladásos léziók (7 Hashimoto- és egy deQuervain-thyreoiditis) mindegyikében fokális pozitivitás volt megfigyelheto. A Hashimoto-thyreoiditisekben az aktivált nyiroktüszokkel összefüggo, onkocyter átalakulást mutató sejtek kifejezett gal3 expresszióját észleltük (16. és 17. ábra). Ezen kívül a súlyos chronicus lymphocytás gyulladás területébe záródott follicularis sejtek egy része is pozitiv volt. A gyulladásos területen lé vo nem-daganatos thyreocyták pozitivitása benignus és malignus daganatok mellett egyaránt megjelent.
16. ábra Hürthle-sejtek, Hashimoto-thyreoiditis (H.E., 400x)
17. ábra Intenzív gal3 pozitivitást mutató Hürthlesejtek Hashimoto-thyreoiditisben (400x)
Egyes Hashimoto-thyreoiditisekben fokális papillaris strukturák területén is megfigyeltünk gyenge, de egyértelmu gal3 pozitivitást, melynek megfeleloen hiszto- és citomorfológiailag is dysplasia mutatkozott (18-20. ábra).
45
18. ábra Papillaris struktúrák területén mutatkozó magtorlódás, magbarázdák, tejüveg-szeru magvak
19, ábra A strukturális mellett citomorfológiai atípia is megfigyelheto (400x)
46
20. ábra Gyenge, de egyértelmu gal3 pozitivitás a papillaris dysplasticus lézió területén (400x)
A normál pajzsmirigyszövet (a daganat melletti is), valamint a 25 db nodozus struma és a 3 db pseudopapillaris hyperplázia mindegyike negativnak bizonyult (tehát a papillaris carcinoma versus pseudopapillaris hyperplázia specificitása 100%). Cysticusan degenerált strumában elvétve egysejtes, bár gyenge, membranózus pozitivitást figyeltünk meg a habos cytoplazmájú sejtek (macrophagok) részérol (21. ábra).
47
21. ábra Membranózus gal3 pozitivitás a macrophagok részérol degeneratív strumában (400x)
5. Megbeszélés
5.I.0. A TA vizsgálatának módszertani alternatíváiban felmerülo technikai korlátok legyozhetok a tel indirekt mérésével - a vele kapcsolatban lévo géntermék, a hTERT útján. Valamennyi -a bevezetésben részletezett- nehézséget kiküszöbölendo, az alternatívák
elonyeit
egyesítve,
kvantitativ,
real-time
RT-PCR
módszert
alkalmaztunk, LightCycler rendszerrel, egylépéses PCR Kittel.
A LightCycler rendszerrel végzett real-time RT-PCR módszer elonyei (106): ?
igen szenzitív (már 100 kópia hTERTmRNS is kimutatható, az exponenciális amplifikáció révén)
?
nagyon specifickus (elozoleg validált, génspecifikus PBGD és hTERT primereket és probákat használ a cDNS szintéziséhez)
?
ultragyors eredményt ad (mivel a 20 µliteres reakciótérfogatú kvarckapillárisok
48
hokapacitása: 20celsius/sec futési sebesség, 30 ciklus közel 20 perc alatt megy végbe) ?
nincs post-PCR-procedura
?
egylépéses, zárt csövu
?
ready-to-use keverékben található: -a pozitiv kontrollként szolgáló totál RNS, mely a kitben lévo sejtvonalból származik, -5 különbözo elo hígítású hTERTmRNS-t tartalmazó standard (hTERT szekvenciák in vitro RNS transzkriptjei), melyek igen megbízható és reprodukálható, retrospektív tanulmányozásra is kiválóan alkalmas analízist biztosítanak (standard görbék alkalmazása)
?
beépített szoftver rendszer analizálja on-line az egyes ciklusok alatt összegyujtött specifikus fluorescens szignálokat (melyeket egy oligonukleotid hybridizációs próba hasadása generál, precíziós fotométer mér), és a fluorescens intenzitást a ciklusszám függvényében ábrázolja, ciklusonként real-time kijelzi. (A precíziós fotométer egy gerjesztocsatornával és három mérocsatornával rendelkezik, eredmény a reakciónként emittált fluorescens jel, melyet a kvarckapillárisok fókuszálnak, így az a kapilláris csúcsán kilépve érkezik a detektorba.) Az így keletkezett kinetikus görbe monitoron nyomon követheto, exponenciális növekedési fázisba gyujti az adatokat.
?
a fluorescens szignál emelkedése direkten arányos a keletkezett PCR-termékek számával
?
a hasított próbák a termék folyamatos amplifikációját biztosítják
?
pontos kvantitativ mérés történik: Minél magasabb a kiindulási kópiák száma, annál korábbi ciklusban válik láthatóvá a kinetikus görbe. A rendszer a kiindulási mennyiséget automatikusan, a standard görbe, az elozetes kalibráció és a Ct alapján határozza meg. (Az elozetes kalibráció a target gén expressziójának 49
normalizálását jelenti a legkisebb mérheto hTERTmRNS-t tartalmazó mintához. Ez egyben a target kvantitáció limitjét is jelzi. A Ct az a reakcióra jellemzo pont, amikor a PCR termék eloször válik detektálhatóvá. A Ct paraméter, aza z küszöbciklus , olyan ciklus-szakasz számként van meghatározva, elynél a próba hasadása által generált fluorescencia az alaptól számított fix küszöbértékbe megy át. Az ennek megfelelo RNS koncentrációt a LghtCycler software számítja ki.) ?
A reakcióhoz adott RNS- minta standardizálására relativ kvantifikáció történik. A rendszer a target gén expresszióját egy stabilan (endogénen) expresszálódó génhez (endogen RNS kontroll, ún.”housekeeping gén”) viszonyítva határozza meg. A LightCycler TeloTAGGGhTERT Quantification Kitben használt PBGDamplifikációs körülmények tehát RNS-specifikusak. Ez azt jelenti, hogy a primerek tervezésénél intronokat átívelo primer párokat terveztek, ami eleve kizárja a genomiális DNS szennyezodésbol származó szignált. Az eddigi mérések során gyakorlatilag nem figyeltek meg kontaminált DNS-amplifikációt.
A daganat kialakulásának korai stádiumában a sejtosztódás -tel hiányában- progressziv telomer rövidülést eredményez. Ez addig folytatódik, míg a telomerek nem képesek többé megvédeni a kromoszómavégeket, és a legtöbb sejt elpusztul. Azonban a legtöbb daganat progressziója során a tel aktivációja visszaállitja a telomer funkciót, és megvédi a rákos sejtet a sejthaláltól (107). Tehát a tel upregulációnak vagy reexpressziónak kritikus jelentosége van a folyamatos daganatsejt növekedésben a daganatok többségének esetén. Az onkogén és tumor szupresszor gén mutációk felhalmozódását megelozoen
a
daganatsejt
„halhatatlanná”
válik,
túléli
azokat
a
normál
sejtszignálokat, melyek a folyamatos osztódástól megvédenék. A fiatal sejtek sokszor osztódhatnak, mégsem tekinthetok rákos sejtnek mindaddig, amíg nem halmozzák
fel
azokat
az
elváltozásokat,
melyek
a
malignus
trans zformációhoz szükségesek. A legtöbb esetben a sejt elöregszik, mielott daganatsejtté válna. Bár eddig számos biomarkert használtak már a daganatok kimutatására (108), nincs olyan univerzá lis marker, mely a tumortípusok többségében egyaránt megfelelo volna. Amióta tudjuk, hogy TA az összes humán malignus daganat 85%-ában és a carcinomák 90%-ában kimutatható (109,110), és azt, hogy a TA szintje korrelál a 50
carcinogene zis stádiumával (111), a tel mint lehetséges tumormarker, illetve a TA vagy a hTERT expressziós szint meghatározása nagy jelentoségu az onkológiai diagnosztikában,
valamint
a
betegkövetésben
(monitorozásban).
Különbözo
munkacsoportok eredményei azt mutatják, hogy a hTERT expresszió szint mérése prognosztikai markerként használható urothelialis (transitiocellularis) carcinomákban (112), colorectalis carcinomákban (113), emlorákokban (114) egyaránt. A további kutatások egyik feldata, hogy pontosan meghatározzuk, mely daganattípusokban (valamint mely egyedi esetekben) mutatkozik összefüggés a TA és a diagnózis, illetve prognózis között. Ebben nagy segítséget nyújthat a különbözo markereket, így a TA-t is alkalmazó molekuláris staging, különösen más molekuláris markerekkel kombinálva. A daganatos és az egészéges szövetek közti hTERT expressziós különbség alapján ígéretesnek mutatkozik a hTERT expressziós szint meghatározása, illetve TA mérése különbözo citológiai anyagokban is, így emlo, pajzsmirigy és egyéb aspirációs citológiai mintákban, pancreas nedvben, oesophagus- vagy bronchus-kefével nyert mintákban, vizeletben, ill. ureter-katéterrel nyert mintákban, különbözo testüregi folyadékgyülemekben, mosófolyadékokban (bronchiolo-alveolaris lavage, bronchus-, oral- és hasüregi mosófolyadék), plazmában, stb. (60-67). A közlemények alapján a TA, mint tumormarker mérése a citológiai anyagban a carcinomák tekintetében szenzitívebb (60-90% szenzitivitás és 90% specificitás), mint a konvencionális citomorfológia, mely 40-65%-os a különbözo tanulmányokban (115). A citológiai mintavétel során minimalis invazivitással nyerhetünk sejteket a TA meghatározásra, és igen rövid idon belül adhatunk diagnózist. A primer tumorok TA meghatározása a diagnosztikán kívül a terápia megtervezésében is hasznos lehet.
Az irodalmi adatokkal és számos labor eredményeivel összhangban, RNS- izolátumaink közel 80%-a volt értékelheto, azaz tartalmazott house-keeping gént – a vesedaganatok kivételével (116).
51
5.I.1. Vesedaganatok A house-keeping gén alacsony elofordulása vesedaganatainkban arra késztetett minket, hogy felvessük az ún.„samplig error” valószínuségét a minták fagyasztása és a szövetminta preparáció során. Számos körülmény, buktató befolyásolhatja a tel detekció minoségi és mennyiségi eredményét, az izolált mRNS épségét, melyeket már mások is leírtak (110,117), és melyek közül az egyik legfontosabb a minta késedelmes eljuttatása a patológiai osztályra. A lehetséges hiba keresése során késobb kiderült, hogy urológusaink a vesetumor- mutétek során számos daganatot nem közvetlenül a kivétel után, hanem csak az operáció befejezése után juttattak el osztályunkra. Ez alatt az ido alatt a tel minden bizonnyal elbomlott. Ezen kívül a nemcsak a makroszkóposan látható, hanem a sejtszintu nekrózis és hypoxiás károsodások is okozhattak tel inaktivációt, annak ellenére, hogy vizsgálatainkhoz a mintavétel a daganat necrosis által nem érintett, ún. „élo” területébol történt. Továbbá a tel pozitív daganatokban a TA heterogén eloszlása ál- negatív interpretációhoz vezethet.
Az irodalmi adatokkal összevetve, RCC mintáinkban észlelt 83%-os TA hasonló a carcinomák esetén általában megfigyeltekhez (118). Azonban ez függetlennek bizonyult mind a Fuhrman grade -tól, mind a daganat stádiumától. A DI - mely az egyik legfontosabb független progno sztikai faktor a RCC esetén – szorosabb összefüggést mutatott a Fgr-del. Figyelembe véve a RCC kifejezett heterogenitását és bizonytalan klinikai kimene telét, úgy gondoljuk, hogy pontosabban prognosztizálhatunk, ha lehetoség szerint minél több kiegészíto vizsgálatot végzünk és adunk meg a Fgr mellett (így pl. TA, DNS-index).
5.I. 2. Lágyrészdaganatok Méréseink alapján ebben a daganat-kategóriában viszonylag alacsony gyakorisággal, csak kis százalékban mutatható ki TA. Ez azt valószínusíti, hogy a tel reaktiváció nem játszhat jelentos szerepet ezen daganatok keletkezésében. Blackburn és munkatársai azt figyelték meg, hogy a TA gátolt volta arra indukálhat bizonyos daganatsejteket, hogy a telomerhossz fenntartását más módon, az ún. ALT mechanizmus (Alternative Lenghtening of Telomeres) elohívásával érjék el (121). Ez egy a TA által normálisan szuppresszált, tel-független út, melynek az aktivációja maga után vonhatja a 52
daganatsejtek korlátlan növekedését a sarcomák többségében. Az „ALT-sejtek” úgy kompenzálják a tel- vesztést, hogy a megrövidült végeket más módon, rekombináció val reparálják, tehát az egyik kromoszóma a másiktól kap DNS-t.
A halhatatlan humán sejtek telomerjeiket két független mechanizmussal tarthatják fenn. Az egyik, egyben a gyakoribb, a telomerikus DNS de novo szintézise a tel által; a másik, a ritkább (kb.20%-a a halhatatlan sejteknek és kisebb százaléka a daganatoknak), a
telomerek
homológ
rekombinációján
alapul
(122).
Utóbbit
„támasz”
mechanizmusnak tartják abban az esetben, amikor a tel nem expresszálódik (123). Az ALT-represszorok normál és tel-pozitiv sejtekben is jelen vannak. Az ALT-sejtek telomer-hosszának dinamikája a tel-pozitív sejtekétol eltéro. Utóbbiakhoz viszonyítva, az ALT-sejteknek általában sokkal hosszabb telomerjeik vannak, és ezen belül a telomerek -hosszukat tekintve- sokkal heterogénebbek (a szinte detektálhatatlantól az abnormális hosszúságúig sokféle variáció fordul elo), (124), valamint rapid rövidülési és elongációs ciklusokon mennnek keresztül (125-127). Az ALT-sejtek egyébként morfológiailag is jellegzetesek, nagy, farsangi fánk alakú magstruktúrák (nuclearis domének) jelenlétével jellemezhetok interfázis sejtekben. Ezek az ún. ALT-asszociált PML testek (APBs), melyek PML (promyelocytic leukemia) proteint, TRF1 és TRF2 (human telomere repeat binding factor 1 és 2) telomerikus proteineket, különbözo, a DNS reparációban és rekombinációban résztvevo proteineket és extrakromoszomális telomerikus DNS-t tartalmaznak (128).
53
Az ALT (Alternative Lenghtening of Telomeres) sémás mechanizmusa
22. ábra (Scheel és Poremba nyomán,129)
Az ALT során intertelomerikus másolás történik, megegyezo módon az intratelomerikus rekombinációban ismertekkel. Ennek során az egyszálú DNS (az egyik telomer vég) „behatol” a dupla szálhoz, hurkot képez, és a 3’ végu szálat templátként használja (22. ábra) (130).
Függetlenül a hisztogenetikai eredettol és a dignitástól, vizsgált mintáinkban különbözo szintu mRNS expressziós szintet és TA-t mértünk. Egyes közlemények alapján a leiomyosarcomák és a storiform-pleiomorph MFH ritkán mutat TA-t (119). Mi is negativitást tapasztaltunk MFH-ban, és leiomyosarcoma- mintánk is csak enyhe
54
pozitivitást mutatott. Az intermedier és high grade lágyrészdaganatok 55 %-ában nem volt TA mérhe to. Következésképp, eredményeink alátámasztják azokat a tanulmányokat, melyek azt állítják, hogy a TA mérése ne m megbízható módszer a reaktiv, benignus és - foképp low grade - malignus léziók elkülönítésére a lágyrészdaganatok esetében. Ennek oka a fent említett ALT mechanizmus jelenléte. Ezen kívül nem használható prognosztikai markerként sem, ellentétben a hámeredetu és más egyéb (pl glialis) daganatokkal (119,120).
A humán sejtek azon képessége, hogy telomerjeik hosszát két féle mechanizmus használatával is fenn tudják tartani, azt jelenti, hogy ezen sejtek tel gátlása nem fogja megszüntetni halhatatlan fenotípusukat (130). Ezért fontos tudni, hogy a konkrét lágyrészdaganat mutat-e TA-t vagy sem, mert segít annak eldöntésében, hogy alkalmazzunk-e tel gátló kezelést. Ha ALT- l állunk szemben, a tel gátló terápia hatástalan lesz. Tehát a TA pontos mérése egyes, konkrét esetekben is fontos lesz az antitelomeráz kezelés kidolgozásakor, hiszen a lágyrészdaganatok terápiája komplex, változatos, igen különbözo és még nem megoldott (121). Ugyancsak fontos adat a terápia szempontjából, hogy ALT-ot kimutattak más daganatokban is, így mellékvesekéreg carcinomában, melanoma malignumban, tüdorákban, petefészekcarcinomában, sot RCC-ban egyaránt (132).
Tovább bonyolíthatja a terápiás nehézségeket, hogy ritkán ugyan, de ALT és TA együttesen is fennállhat - sejtkultúrákban és tumorokban egyaránt (133) -, sot, a daganatok egy része rövidült telomerekkel is képes proliferálni!
5.I.3. Húgyhólyag és vizelet Mivel a hólyagrák erosen hajlamos a recidivára, a tünetmentes betegek monitorozása különös fontosságú. Erre a célra lehetoleg minél egyszerubb, egyben nonivaziv módszer kívánatos. Jelenleg a cystoscopia hólyagmosás alkalmazásával a „gold standard” mind a hólyagrák diagnosztikájában, mind a kezelés utáni betegkövetésben. A cystoscop kituno diagnosztikus eszköz, mely lehetové teszi a hólyag belfelszínének direkt megtekintését és a mucosa biopsziáját, de a beavatkozás invaziv, melynek alacsony beteg-compliance-a van, emellett a hólyagrák rutin szurésére drága módszer. 55
A vizeletcitológia a recidiv hólyagrák noninvaziv kimutatására egyszeru és specifikus eljárás. Azonban számos korlátja is van:
- a jól differenciált (low grade) daganatok detektálásának alacsony szenzitivitása - a benignus léziókban nagy százalékban megjeleno, esetleg ijeszto képet nyújtó kifejezett reaktív sejtelváltozások - az ún. degenerativ atypia - az analizáló citopatoló gus tapasztalatától függo pontosság (134,135).
Badalament munkacsoportjának vizsgálatai szerint a superficialis transitiocellularis carcinoma diagnosztikájának és monitorozásának tekintetében a hólyagmosó folyadék citomorfológiai vizsgálata 40%-os szenzitivitású, de ismételt hólyag-beavatkozások, húgyúti infekciók, köves betegségek is komplikálhatják a hólyagrák diagnózisát, mert az exfoliálódott sejteken morfologiai elváltozásokat okoznak (136).
Ezért szükségessé vált egy nagyobb szenzitivitással járó noninvaziv, objektív módszer alkalmazása a hólyagrákos anamnézisu betegek követésére, melynek érdekében számos újabb, vizelet-vizsgálaton alapuló tesztet fejlesztettek ki. Mivel a tumorprogresszió a genetikai módosulások többlépcsos felhalmozódásán keresztül jelenik meg, ezért számos, a hólyag tumorigenezisében érintett gént vizsgáltak meg vizeletben, hogy alkalmasak-e diagnosztikus molekuláris markernek. Az exfoliált carcinoma sejtekben (kb. 47%-ban) megjeleno p53 és H-ras gén mutációt már azonosították (137,138). Újabban abnormális CD-44 gén aktivitást találtak a hólyagrákos betegek 91%-ának vizeletében (139).
Ezeken kívül számos más tumormarkert is ajánlanak
diagnosztikus céllal hólyagrák esetén, pl. BTA, NMP22, GDP stb., melyek változó szenzitivitásúak és specificitásúak (140). A tel, mivel közponi szerepe van a carcinogenezisben és aktivációja igen gyakori a humán daganatokban, az egyik legígéretesebb addicionális tumormarker a hólyagcarcinomák diagnosztikájában és monitoro zásában is (141,142). A tel az összes urothelialis carcinomák 95%-ában kimutatható, de az egészséges urothelben nem. De Kok, Kinoshita és munkatársainak vizsgálata alapján TCC-ban konzekvensen megjelenik a TA (141,142). Ennek detektálása a vizeletben megbízhatóbbnak bizonyult -
56
különösen a low grade carcinoma versus reaktív elváltozások esetén -, mint a citomorfológia önmagában (143). Kinoshita munkacsoportja (142) a TA mérését 89%-os szenzitivitásúnak találta vizeletben és hólyagmosó folyadékban, amikor ugyanazon beteg esetén a két módszert kombinálták. A citoló giai vizsgálat ezen betegeknél csak 42%-os szenzitivitású volt (142). Ramakumar munkacsoportja (144) különbözo markerekkel és módszerekkel szurt vizeletek analízisekor a TRAP- módszert találta a legs zenzitívebbnek és legspecifickusabbnak. Tanulmányukban minden tumorban (ebbe a stádiumot és gradet is beleértve) a TA mutatott a legszorosabb összefüggést a húgyhólyagrákkal, foképpen a grade I és a noninvazív tumorok esetében (144). Bár a TRAP-assay a legjobb szemikvantitatív módszer, a tel vizeletmintákban észlelt instabilitása és a TA detekciójának alacsony szenzitivitása miatt szükségessé vált olyan TRAP-assay alternativák kidolgozása, melyek stabilabbak és megbízhatóbbak a klinikai alkalmazás szempontjából (145). A hTERT mRNS nemcsak diagnosztikus marker, hanem prognosztikai markerként is használható lehet, ugyanis pontos mérésével a TCC-k grá dusa meghatározható. A normalizált hTERT mRNS mennyiség a TCC klinikopatoló giai jellemzoivel korrelál. A superficiális TCC low grade és high grade voltának elkülönítése, valamint a dedifferenciáció detektálása klinikai, ill. predik tiv-prognosztikai szempontból azért fontos, mert a high grade és dedifferenciált daganatok esetén - különösen, ha azok recidivek - eros hajlam mutatkozik a progresszióra, azaz a símaizom invázióra! (146).
Mi 28 vizeletet, 2 hólyagmosó folyadékot és egy ureter- lavage-t analizáltunk, melyek hólyagrákos anamnézisu, a mintavétel idején - ketto kivételével - daganatmentes státus zú betegektol származtak. Utóbbi ketto esetén a szimultán elvégzett his ztológia igazolta a carcinoma-recidívát. Ez a prospektív vizsgálat igazolta, hogy a hTERT mRNS expresszió könnyen detektálható vizeletben vagy cystoscopos hólyagmosó folyadékban. Az a tény, hogy a korai superficiális low grade TCC-k esetében is már kimutatható, lehetoséget jele nt arra, hogy a hTERT mRNS potenciális tumormarkerként szerepeljen a carcinomák korai, preinvazív stádiumban történo felismerésében, valamint a monitorozásban is. Ha a vizeletben megjelenik, akkor további, immár invazívabb beavatkozás végezheto, sot a sebészi terápia utáni reziduumot is jelzi.
57
Eredményeink tehát azt mutatják, hogy a hTERT mRNS relativ expressziója vizeletben és hólyagmosó folyadékban igen alkalmas a hólyagrák diagnosztikájában és monitorozásában. Elobbiekbol következik, hogy a TCC-k szurésében is értékes segítséget nyújthat. Szuréskor azonban már nem indokolt a real-time PCR használata, ugyanis itt a kvantitatív információnak nincs jelentosége. Ezen kívül - mivel szurésrol van szó- praktikus egy költségkímélobb módszert választani (pl. nested PCR).
Ezen betegségcsoportba tartozó anyagok vizsgálatakor azonban kifejezett technikai nehézségek is felmerültek. Mivel a vizeletminta exfoliativ, tehát viszonylag sejszegény, ezért az RNS izolálás a mintából meglehetosen nehéz. Ez lehetett az oka annak, hogy ezen vizsgálati anyagok többségében lehetetlen volt PBGD-t detektálni. (Ezekben a sejtkoncentráció feltehetoleg egészen alacsony lehetett.) A Mitomycin terápia nyilván nemcsak a DNS-t, hanem az RNS-t is degradálta, hozzájárulva ezzel az RNSizolációs nehézségekhez. Másrészt viszont a hólyagmosó folyadékban, a tumoros, valamint a gyulladásos mintákban a sejtszám/sejtkoncentráció nyilvánvalóan magasabb volt. Ez azt jelenti, hogy -bár a hTERT expresszió, a TA megjelenése a vizeletben primer tumor esetén vagy betegkövetésben nagy segítséget jelenthet- az érzékenység fokozása, a fals negatív eredmények kiküszöbölése érdekében tökéletesíteni kell az anyaggyujtési technikát. Célunk, hogy ezáltal minél több sejtet nyerjünk ahhoz, hogy elérjük a kritikus (300 kópia értékelhetoségi küszöböt jelento) PBGD szintet. Hasonló problémával más munkacsoport is küszködött, akik TUR elotti vizeletmintákban TRAPeze módszerrel TA-t, RTQ PCR-rel pedig hTERT mRNS-t detektáltak. Mivel mindkét módszerrel egyformán alacsony, 29%-os szenzitivitást tapasztaltak, az érzékenység növelésének reményében a vizsgálatot megismételték reggeli elso vizeletbol, mely nyilvánvalóan több exfoliálódott sejtet tartalmaz. Azonban szignifikáns szenzitivitás növekedést nem tapasztaltak, mert a sejtek hosszas érintkezése a vizeletben, mint folyadékban lévo különbözo egyéb anyagokkal, degradációt eredményezett sejt-, protein-, illetve RNS-szinten egyaránt (141). A 15. sz. mintában a mukózát infiltráló lymphocyták voltak jelen, és bár ismert tény, hogy az aktivált lymphocytákban lehetséges alacsony szintu TA (147), azonban az általunk alkalmazott mérési módszer kiküszöböli a lymphocyták kontaminációból adódó 58
fals pozitivitást. Kinoshita és munkatársai az általuk alkalmazott TRAP módszerrel 39%-os fals pozitivitást észleltek azon betegekben, akiknek súlyos gyulladása volt, a minták lobsejtekkel történt kontaminációja miatt (138). Mivel az általunk alkalmazott real-time RT-PCR módszer miatt a kontamináció lehetosége praktikusan kizárható, ezért valószínu, hogy esetünkben a TA megjelenése a korai recidívát jelezte. Ez már jóval korábban (akár hónapokkal is) detektálható lehet - a citomorfológiai atypia vagy a cystoscoposan látható daganat megjelenése elott (148). A 20. sz. mintában (citomorfoló giailag suspect, de tel- negativ volt), a CA 19/9 tumormarker emelkedett szintje volt az, amely korrelált a morfológiai képppel. Ezért a kétes esetekben ajánlatos - ha lehetséges- minél több kiegészíto vizsgálatot is elvégezni, így pl. tumormarkerek, DNS-index meghatározás.
5.I.4. Pajzsmirigyléziók A degenerativ atypia, az atypusos adenoma és az ún. follicularis neopláziák nemcsak a preoperatív FNAB-ban (149), hanem még a his ztológiai vizsgálat során is diagnosztikus nehézséget okozhatnak. Ezen elváltozások tekintetében számos kiegészíto vizsgálat létezik a dignitás eldöntésére, bár egyik sem abszolút specifikus vagy szenzitiv (RET onkogén, ras onkogén, TTF-1 azaz „thyroid transcription factor-1”, p53, nm-23, galectin-3, stb. )(150). A gal3 tekintetében saját tanulmányunk is ezt mutatta – ld. a II. fejezetben. Jelen vizsgálatunkban azt találtuk, ho gy a tel expresszió és/vagy a TA mérése, különösen a szimultán végzett DNS-tartalom méréssel, segíthet kimutatni a malignus transzformációt – fent említett léziók esetén, valamint segíthet eldönteni, hogy valódi vagy degeneratív atypiáról van-e szó, különösen a vékonytu biops ziás minták esetén.
A follicularis neopláziában megfigyelheto onkocyter transzformáció vagy a tisztán onkocyter neoplázia esetén a diagnó zis felállitásakor különösen óvatosan kell eljárni, hiszen - mint jól ismert- ezen elváltozások meglehetosen gyakran malignizálódhatnak. Ezért indokolt - ha lehetséges- ezen eseteket különbözo módszerekkel megvizsgálni, hogy az esetleges korai malignus transzformációt idoben felfedezhessük. Mindezek alapján a 12. sz. citoló giai mintában mért aneuploid DI, fokális malignus transzformációt 59
valószínusít - a tel negativitás ellenére -, sebészi eltávolitást indikálva. Ez analógiát mutat a gal3- mal, melynek expressziója follicularis adenomában -egyes tanulmányok szerint- , habár vaszkuláris vagy tokinfiltráció még nem látható, malignus transzformáció lehetoségét jelzi (92). A 13. sz. hisztoló giai mintában megfigyelt TA is nagy valószínuséggel malignus transzformációt jelez, melyet a morfoló giai kép alátámaszt. Irodalmi adatokból ismert, hogy a hTERT expresszió és/vagy a TA a daganatos progresszió indikátora (151). Következésképp, ha TA jelenik meg follicularis vagy onkocyter adenomában, a hisztológiai feldolgozás és értékelés során ajánlatos különös gondossággal keresni a malignitási jeleket.
5.I.5. Egyebek (heterogén csoport, különbözo lokalizációjú és eredetu elváltozások)
Bár a kis esetszámok miatt messzemeno következtetések nem vonhatók le, mégis érdemes megemlíteni, hogy a két összetett csírasejtes malignus heredaganat magas TA-t mutatott, míg a két seminoma gyakorlatilag negativ (vagy legalábbis alacsony aktivitású). Összetett csirasejtes daganat esetén az igen magas TA szint logikus, de további vizsgálatokat indikál az, hogy vajon miért (közel) negatív a seminoma, hiszen az is csirasejtes daganat? Ugyancsak további vizsgálatokkal kell megkeresni, hogy melyik, illetve melyek azok a komponensek (esetleg milyen arányban), amelyek a magas TA-ért felelosek. Számos összetett -de a vizsgált metszetekben monokomponensunek vagy csírasejtes komponenst nem tartalmazónak látszó- heredaganat esetén a hibás mintavétel (ún. sampling error) kiküszöbölheto lehet kiegészíto TA vizsgálattal. Ugyanis magas TA esetén másik, csírasejtes komponenst is keresni kell, természetesen kiegészítve egyidejuleg elvégzett szé rum hormonvizsgálatokkal (béta-HCG, AFP). A csírasejtes komponens jelenlétének kimutatása terápiás konzekvenciájú, hiszen ezen daganatok más protokoll szerint kezelendok.
Az emloelváltozások esetén a benignus léziók negativitása és a carcinomák pozitivitása az irodalmi adatokhoz hasonló eredményeket hozott (152). A különbözo szerzok eredményeit áttekintve, egyik tanulmányban sem észleltek minden esetben TA-t 60
a különbözo emlocarcinoma sub típusok esetén (184,185,186). Saját vizsgálatainkban is volt egy TA negatív invazív lobularis carcinoma. Ebben azonban -a TA negativitás ellenére- az abnormális DI-t (diploid-tetraploid) tekinthetjük a malignitás jeleként. A myoepithel- tumor TA pozitivitása és az aneuploidia együttesen, valamint a cysta folyadékban talált enyhe TA ugyancsak malignus transzformációt jelezhetnek. Török szerzok tanulmánya alapján a magasabb TA agresszívabb emlocarcinomákban fordul elo, rosszabb prognózist jelez (187). Néhány újabb közlemény azt sugallja, hogy a TA korai indikátora lehet a malignus transzformációnak egyes premalignus emloelváltozásokban, így pl. atypusos ductalis hyperplasiában (153). A TA más premalignus elváltozásokban is detektálható (az emlorákon kívül tüdo- és hólyagrák tekintetében is), ezáltal korai felismerést tesz lehetové , még az invázió bekövetkezte elott. (Sajnos, colon- és pancreasrák esetén már csak a késobbi carcinomastádiumban mutatható ki.)
Egyes tanulmányok szerint a tel expresszió a cervix carcinogenezissel is kapcsolatos. Így a cervix kaparékokból elvégzett TA meghatározás segíthet a betegkövetés során megjósolni a CIN kimenetelét.
A 17. sz. esetben (premenopauzális proliferativ endometrium) a TA emelkedés elvileg lehetne a jelenlévo gyulladás miatt is -minthogy a minta erozív cervix-részleteket is tartalmazott-, azonban vizsgálataink során alkalmazott igen specifikus módszerrel a kontaminált aktiv lymphocytákból eredo fals pozitivitás kiküszöbölheto – mint már korábban leírtam. Ismert azonb an az a tény, hogy enyhe TA fiziológiásan is jelen lehet a premenopauzális proliferatív endometriumban (154,155).
Ebben a csoportban a többi, külön nem említett, morfoló giailag általában TA negatív volt.
61
benignus lézió is
Terápiás konzekvenciák
A tel reaktiváció cellularis halhatatlansággal társul, és gyakori esemény a tumorigenezis során. A carcinomák majdnem 90%-ában mutatható ki TA, míg a benignus tumorokban és a legtöbb nomál szövetben általában hiányzik (32). A tel az egyik legkiválóbb eddig ismert molekuláris tumormarker, A tel gátlása limitálhatja a tumorsejtek növekedését, ezért a tel lényeges célpont az onkoterápiában, és a telomeráz gátlókat új potenciális rákellenes szereknek tekintik. A carcinomák terápiájában a tel inhibitorok bevezetését nagy várakozás elozi meg. Az eddigi eredmények kétségkívül ígéretesek, de a megközelítés még kísérleti stádiumban van.
A tel gátlók eloször a kritikus hosszig tartó telomer-eróziót eredményeznek, mely nem érinti a sejtnövekedési rátát egészen addig, míg a progresszív telomer rövidülés végül is a növekedés leállásáhaoz, elöregedési szignálhoz vagy a ráksejt halálához vezet. Így a daganatvolumen -a várt terápiás volumen-redukcióhoz képest- eleinte folytathatja növekedését (ezt lag fázisnak hívják). Ez azt sugallja, hogy a tel gátló terápia önmagában nem elégséges a nagy tumortömegu betegek esetében, viszont kiválóan alkalmazható lehet a minimális reziduá lis betegséggel rendelkezo páciensek esetén, a látható tumor sebészi eltávolítása után (ún. debulking), ezek a szerek leginkább ekkor fejthetik ki terápiás hatásukat. A lag fázis áthidalására bizonyos ideig azonban fenntartó kemoterápia szükséges, mely idot biztosíthat a tel gátló szerek hatásának kifejlodésére. Az antitel kezelés azonban csak a tel pozitiv sejtekre hat, az ALT sejtek repopulálják a tumormasszát.
Az irradiáció számos daganat kezelésében kulcsfontosságú, ezért a tumorsejtek túlélo frakciójának pontos meghatározása a sugárterpia után, az eredményesség megítélése szempontjából kulcsfontosságú lehet. Bár számos biomarkert használnak a reziduá lis betegség kimutatására (156), nincs olyan univerzá lis marker, mely a legtöbb tumortípusra használható volna. Amióta TA-t kimutattak majdnem minden carcino mában (109), és megállapították, hogy szintje korrelál a carcinogenesis stádiumával (111), a TA meghatározás potenciálisan nagy jelentoséguvé nott a klinikumban a reziduális tumor, a minimális reziduális betegség, illetve a daganatrecidívák kimutatásában is. Egyes szerzok megvizsgálták, hogy van-e korreláció az ionizáló sugárzás indukálta sejtpusztulás és a TA között (157). A kapcsolat igazolódott, a TA csökkenés a 62
radioterápia után a sejthalállal párhuzamosnak bizonyult. Legkorábban a sugárterápia utáni 7. naptól volt nyerheto információ a reziduális betegséget illetoen. A tanulmányban megfeleloen szenzitív módszer alkalmazásával 10000 tel negatív sejt között már egyetlen ráksejtet is ki tudtak mutatni. Ezen vizsgálat bizonyította, hogy a tel potenciális marker a radioterápiás protokoll hatásosságát illetoen is, ill. a (sebészi és/vagy adjuváns kemoterápia
utáni)
minimális
reziduális
betegség
monitorozásában
(157).
Megjegyzendo azonban, hogy a vizsgálati módszernek igen specifikus nak is kell lennie, hogy a minimális reziduális betegség vizsgálata során a mintában lévo csontveloi hematopoetikus sejtek normál TA-a ne okozzon fals pozitivitást!
A kifejlesztendo tel gátlóknak nagy specificitással, alacsony toxicitással és kevés mellékhatással kell rendelkezniük, valamint kívánatos, hogy adjuváns kezelésként lehessen ezeket alkalmazni - kombinálva a sebészi, radiologiai kezeléssel és a konvencionális kemoterápiával, minimalis tumortömeg esetén. Az is lehetséges, hogy a tel inhibitorok a standard terápiát fogják követni, klinikailag tünetmentes állapotban, ilyenkor az esetleges mikrometasztázisok kezelése céljából, a carcinoma -recidiva megelozésére lennének alkalmazhatók. Mivel ezek az állapotok hosszas kezelést igényelnek, ezért fontos az alacsony toxicitás. A legtöbb létezo rákellenes terápia meglehetosen toxikus, mert a normál sejteket ugyanúgy károsítja, mint a malignusakat. A tel gátló szerek kutatása során meg kellett vizsgálni azt is, hogy mely normál sejtek expresszálnak tel-t, és fel kellett becsülni a tel jelentoségét ezekben a sejtekben. Ugyanis, ha a tel kulcsfontosságú, akkor valószínusítheto, hogy a vele interferáló gyógyszerek elfogadhatatlanul toxikusak. A tel expressziót nem mutató normál szomatikus sejtekre az antitel terápia hatástalan. Az eddigiek alapján azonban joggal merülhet fel aggodalom az antitel terápiának a tel pozitiv normál ossejtekre, reproduktiv sejtekre (csírasejtekre) és a megújuló szöve tek proliferativ sejtjeire (pl.a normál hematopoetikus sejtekre) irányuló esetleges toxicitása miatt (12,158,159). Ezért az lenne az ideális, hogy ezen szerek a tel pozitív normál sejtekre sokkal kevésbé hassanak, mint az osztódó tumorsejtekre. A kérdéses normál sejtek azonban eleve kevésbé érzékenyek a tel gátló terápiára, mint az osztódó daganatsejtek, melynek magyarázata a következo: Általában sokkal hosszabb telomerekkel rendelkeznek, mint a legtöbb daganatsejtpopuláció, továbbá -beleértve a
63
legprimitívebb ossejpopuláció t is- csak ritkán osztódnak, így telomerjük sokkal lassabban rövidül, mint a tel függo, gyorsabban proliferáló daganatsejteké, melyek elobb érik el a kritikus telomer-rövidséget és pusztulnak el, mint a normál sejtek. Így az antitel terápia eliminálja a prolferativ potenciálú daganatsejteket, mielott a telomer-hossz a normál reproduktiv és ossejtekben annyira lerövidülne, hogy funkciójuk megszakadna. Miután a daganatsejtek elpusztulnak, az antitel terápia megszakítható, így a TA a reproduk tív és ossejtekben megorzodik, illetve helyreáll (160) (23. ábra). Az antitel terápia ezért várhatóan kevésbé lesz toxikus, mint a konvencionális kemoterápia. Így a tel gátlókkal a standard kemoterápia számos mellékhatása kiküszöbölheto (trombocitopénia, leukopénia, nauzea, hajhullás, stb.). Kinetikailag azonban a tel gátlók csak prolongált növekedési fázis után indukálják a sejtnö vekedés gátlását vagy az apoptózist – mint már korábban kifejtettem. A fenti magyarázat a tel pozitív daganatok esetén logikus, de sajnos a valóságban ez alól is létezik kivétel, ugyanis némely daganatsejtek rövid telomerrel is proliferálhatnak!
64
A telomeráz gátlás valószínu hatásmechanizmusa
telomertelomer-hossz csírasejtek telomerek növekedésének visszaállása
ossejtek
telomeráz gátlás
normál szomatikus hámsejtek ráksejtek telomeráz aktiváció növekedés leállás
növekedés leállás
mitózisok száma
kritikus rövidséget elért telomer
ido
23. ábra
Az antitel terápia módját illetoen többféle elképzelés alakult ki (24.ábra). Génterápiával targetként a tel különbözo alkotórészei, funkciója, stb. egyaránt szóba jöhet: - a tel RNS vagy protein komponenseit célozva – oligonukleotidok vagy egyéb kis molekulák alkalmazása (2’-O-metilált RNS és peptid-nukleinsav oligomerek) (anti-szenz cDNS vagy ribozim a templátot célozva) (161)- ezzel a katalitikus aktivitás, a DNS szubsztrát kötés, a reguláció gátlása érheto el. Mindez reaktiválhatja a normál utat, mely a fejlodés során represszálja a tel-t. - telomer köto fehérjék - a tel reverz traszkriptáz funkciója
65
- a telomerek G-kvadruplex funkciója - inaktív tel- t produkáló mutáns bevitele a sejtbe, amely komplexe t képez az aktív enzimmel - egy további útja a tel-expresszáló sejtek direkt elpusztításának az immuntherapia (162), mely jelenleg még vizsgálatok alatt áll. Ennek a megközelitésnek az elonye, a lag fázis megszüntetése, mely a klasszikus tel gátláshoz szükséges. Ennélfogva azonban ez a kezelés toxikus lehet a normál, tel expresszáló sejtekre.
Antitelomeráz terápiás lehetoségek (163 - Mergny és mtasi után)
24. ábra
66
A TA gyakoris ága és bioló giai fontossága - úgy tunik - a daganat típusától függoen változó. A molekuláris staging, felhasználva a TA-t (foképp kombinációban más molekuláris
markerekkel),
ígéretes
segítséget
nyújthat
azon
daganattípusok
meghatározásában, melyekben korre láció mutatkozik a TA és a diagnózis vagy prognózis között. Így pl. neuroblastomákban, gyomor- és emlorákban a magasabb TA szint rosszabb prognózissal társul. Ugyancsak prediktív-prognosztikai értéku lehet a TA megléte vagy hiánya, és segíthet a betegeket különbözo rizikócsoportokba osztani. Ha a beteg a kedvezo csoportba sorolható -alacsony vagy nem detektálható TA eseténmegóvhatjuk a felesleges kezeléstol, viszont kedvezotlen prognózis esetén - magas TAaz onkológus intenzívebb, ezáltal hatékonyabb kezelést alkalmazhat. Az antitel kezelés használható lehet a daganatos betegség korai stádiumában a magas rizikójú, ún. örökletes rákszindromákban szenvedo betegekben kemoprevencióként.
A konvencionális daganatterápiát követoen (sebészi-, radio-, kemoterápia) az antitel szerek limitálhatnák a túlélo daganatsejtek proliferativ kapacitását, ennek reményében megelozhetnék a rák recidíváját.
Elvileg nemcsak daganatoknál, hanem minden magas proliferációs aktivitást mutató betegségnél is – például myeloproliferativ szindróma, májcirrhosis – szóba jöhet a tel gátlása. A tel paradoxonja egy újabb terápiás lehetoséget is felvetít. Ha ugyanis ez az enzim, amely a rák keletkezésében valószínuleg dönto fontosságú, az élet meghosszabbítására is alkalmas lehet (halhatatlanság), akkor fontos célpont lehet nemcsak a carcinoma, hanem a korfüggo, az öregedéshez vezeto betegségek esetén is. Bár az öregedés folyamata igen komplex, a tel-on kívül számos más tényezo befolyásolja. A tel hasznos lehet a sejtek terápiás célokra történo felszaporításában. A különbözo betegségek génterápiás kezelésére irányuló törekvések szükségessé teszik sejtkivonatok készítését, azon céllal, hogy a kívánt gén beillesztése után a genetikailag korrigált sejteket visszajuttassuk a betegbe. Gyakran az extrahált sejtek lassan proliferálnak laboratoriumi körülmények között. Talán a tel inzerciója - esetleg más faktorokkal
67
kombinálva - ideiglenesen megnövelheti a replikációs kapacitást, így nagyobb mennyiségu terápiás sejt adható a betegnek.
5.II. Galectin-3
A papilláris carcinomák tekintetében eredményeink megegyeztek az irodalmi adatokkal: valamennyi daganat (beleértve a follicularis variánst is) eros gal3 pozitivitást mutatott, egyetlen -mindössze fokálisan pozitív- eset kivételével. Irodalmi adatok szerint (164), a follicularis adenoma és a minimálisan invazív follicularis carcinoma tekintetében szignifikáns különbséget mutat a gal3 cytoplazmatikus expressziója, mind his ztológiai, mind citológiai mintákban. Ennek alapján a gal3 citoplazmatik us expressziót a malignus trans zformáció jelének tekintik (míg a nukleáris lokalizáció csak a sejtproliferáció val kapcsolatos (84). Néhány follicularis és Hürthle-sejtes
adeno ma
fokális
pozitivitása
megjósolhatja
ezen
benignus
elváltozások lehetséges késobbi malignizálódását (165). Több szerzo a gal3 pozitív és morfológiailag szuszpekt (sejtatípiát mutató) follicularis adenomákat potenciális korai ráknak tekinti, melyekben tokinvázio és érbetörés még nem látható, de már molekuláris szintu malignus trans zformáció bekövetkezett (105,166). Kawachi és munkatársai szerint (167) papilláris pajzsmirigy carcinomában a gal3 downregulációja segítheti elo a daganatsejtek kiszabadulását a primer tumorból, mely metasztázis képzodéséhez vezet. Egyetlen, metasztatikus papilláris carcinomából származó esetünkben eros gal3 pozitivitast észleltünk
A gal3 immunhisztokémiai lokalizáció ja segítséget jelenthet a szoliter pajzsmirigyléziók hisztopatoló giai diagnosztikájában, markerként szolgálhat a follicularis carcinoma, foképp a minimálisan inva zív forma felismerésében.
Az elozo tanulmányokban a gal3 változó expresszioját irták le medullaris carcinomában (168).
68
Irodalmi adatok szerint a gal-3 ott is expresszálódik, ahol a follicularis sejtek intenzív gyulladás területén vannak. Így denz lymphocytás infiltrációban gal3 pozitívak lehetnek azon sejtek is, melyek citoló giai atípiát nem mutatnak, és azok is, melyek Hashimoto-thyreoiditisben az aktivált nyiroktüszokkel összefüggésben állnak és onkocyter átalakulást mutatnak (utóbbiak kifejezetten). A gyulladásos területen lévo nem- neoplasztikus follicularis sejtek gal-3 expresziójának kétféle magyarázata valószínu: a) a gyulladásos sejtek által szekretált cytokinek hatására történo neoszintézis b) vagy a lymphocyták által boségesen leadott gal-3 egyszeru permeáció ja a szomszédos follicularis sejtekbe (169). Kérdésként merül fel, hogy Hashimoto-thyreoiditisben az aktivált lymphoid follikulusok sejtjei rendelkeznek-e aktív immunválasszal a közöttük lévo, gal3 pozitiv, esetleg korai transzformációt mutató thyreocyták ellen?
Ismert, hogy Hashimoto-thyreoiditis talaján - lymphomán kívül - papilláris carcinoma is keletkezhet. Újabban megfigyeltük, hogy egyes Hashimoto-thyreoiditisekben a fokális papilláris struktúrák területén is mutatkozik gal3 pozitivitás, melynek megfeleloen hiszto- és citomorfológiailag is dysplasia látszik. Tehát a fokális gal3 pozitivitás - a follicularis adenomákon kívül – ezekben az esetekben is felhívhatja a figyelmet egy esetleges korai malignus transzformációra (korai papillaris carcinomát jelezhet). Elobb leírt papillaris struktúráktól eltekintve azonban - a follicularis sejtek benignus megjelenése miatt - az inflammatorikus léziók pozitivitása nem jelent problémát diagnosztikus szempontból, hacsaknem citológiai kenetekben, foképp, ha a gyulladásos komponens nem szembetuno.
Mivel az aspirációs citológia önmagában a follicularis neopláziák dignitásának eldöntésére nem alkalmas, ezért ezeket a betegeket operálni kell, habár végül is csak kevesebb mint 20%-uk léziója bizonyul malignusnak. Ezért lenne szükséges egy megbízható
marker,
mellyel
preoperative
azonosíthatnánk
a
malignusan
trans zformá lódott thyreocytákat. A gal-3 immunhisztokémia érzékeny és megbízható megközelítést biztosíthat a FNAB- l végzett preoperativ kórismézésben (101,170) a papilláris carcinomák tekintetében. Bár a papilláris daganatok és a gyulladások legtöbb formája citológiailag pusztán morfológiai alapon is meglehetos biztonsággal felismerheto. A két fo problémát a minimalisan invaziv follicularis carcinoma és a 69
follicularis adenoma elkülönítése, valamint a papilláris carcinoma follicularis variánsának azonosítása jelenti. Fentiekkel kapcsolatban kiemeljük három esetünket, melyekben a klasszikus morfológiai kritériumok ellenére a mindhárom follicularis carcinoma gal3 negativ volt, pedig minimálisan invazív típusúak és jól differenciáltak voltak. (Irodalmilag ismert tény, ho gy a rosszul differenciált follicularis carcinoma szubtípusok gyengébb gal3 expressziot mutatnak a jól differenciált carcinomákhoz képest -vagy egyáltalán nem expresszálnak-, a differenciálatlan carcinoma pedig negatív (171).) A gal3 negativitásnak ezen három esetünkben nincs elfogadható magyarázata.
Valószínuleg más munkacsoportban is femerülhettek a miénkhez hasonló kétségek, amikor tanulmányaikban a gal3 mellett, egyidejuleg más markert is vizsgáltak - így pl. a CD44v6 és a CK-19 monokloná lis antitesteket (103,104). Megállapították, hogy ez a hármas kombináció szenzitívebb és specifikusabb a follicularis neoplázia dignitásának eldöntésére. A CD44v6 sejtadhéziós molekula- izoform expressziója -a gal3- hoz hasonlóan- down-regulálódik az epithelsejtek malignus trans zformációja során. A CK-19 a pajzsmirigydaganatok tekintetében csak a follicularis carcinomákban mutat expressziót, tehát a papillaris carcinoma follicularis variánsának a follicularis adenomáktól és a noduláris hyperpláziáktól való elkülönítésében nyújthat segítséget.
A gal3 immunhisztokémia alkalmazhatósága tekintetében - a legutóbbi irodalmat áttekintve - Davies és munkatársai a legkételkedobbek, akiknek eredményei szerint a gal3 festés önmagában a pajzsmirigyléziók dignitásának kérdésében csak minimális segítséget nyújt, és - ezen túlmenoen - nehezen reprodukálható mind citológiai, mind hisztológiai minták esetén (181).
Az immunhisztokémiai vizsgálatokon kívül azonban próbálkozások történtek szérum gal3 meghatározás tekintetében is. Egy újabb tanulmány szerint (172) a szérum gal3 szignifikánsan emelkedett emlo-, gastrointestinalis-, tüdo- és ovariumrákos, valamint melanomás és non-Hodgkin lymphomás betegekben. A szerzok azt is megfigyelték, hogy az áttétes betegek szé rum gal3 szintje magasabb volt a lokalizált daganattal rendelkezo betegekénél. Ezért feltételezik, hogy a keringo gal3 szerepet játszhat a daganatprogresszióban, így ennek alapján a korai stádiumban végzett gal3 vizsgálat megjósolhatná a daganat metasztatikus potenciálját. 70
6. Következtetések 6.I. 1. A hTERT expresszió meghatározásának szempontjából a citológiai vizsgálatok jelentik a legminimálisabb invazivitást, és ezzel a módszerrel igen rövid idon belül juthatunk diagnózishoz. Saját anyagunkat illetoen szoros összefüggés (92,3 %-os specificitás és 60%-os szenzitivitás) mutatkozott a hTERT expresszió és az elváltozások dignitása között. Eredményeink azt sugallják, hogy a normalizált hTERT mRNS mennyiségének mérése valamennyi citológiai anyagunkban, a FNAB anyagban (pajzsmirigy- és emloléziók) ugyanúgy, mint az exfoliativ citoló giában (vizeletüledék és hólyagmosó folyadék), hasznosnak bizonyult. 2. Saját gyakorlatunkban tapasztaltak és az elvégzett munkánk alapján átgondolásra, újraértékelésre érdemes, hogy milyen PBGD szint esetén tekintsük értékelhetonek az exfoliatív vizeletcitológiai mintákat, és hogyan tökéletesíthetjük az exfoliatív minta gyujtését, valamint az RNS izolálást ebbol az anyagból. 3. A hTERT mRNS mérése -különösen a pajzsmirigy aspirációs és vizelet citológiai minták esetén- nagy segítséget nyújthat a preoperatív differenciáldiagnosztikában, a korai tumor észlelésében és a monitorozásban. 4. Kiegészítheti - de potenciálisan helyettesítheti is - a fénymikroszkópos citomorfológiai vizsgálatot, hiszen az érzékeny módszer alkalmas olyan malignus sejtek kimutatására is, melyek citoló giailag nem karakterisztikusan malignusak és/vagy elégtelen számban vannak jelen.
5. Használható lehet hólyagrák szurésére is, foképpen a magas rizikójú, de az általános populációban is. Szuréskor azonban már nem indokolt a real-time PCR használata, ugyanis itt a kvantitatív információnak nincs jelentosége. Ezen kívül - mivel szurésrol van szó- praktikus egy költségkímélobb módszert választani (pl.nested PCR).
6. Bár a lágyrészdaganatok esetén nem alkalmas a tumor dignitásának eldöntésére,
71
vagy a prognózis és agresszivitás meghatározására (mert a lágyrésztumorok keletkezésében nagy valószínuséggel más mechanizmusok is szerepet játszanak), mégis, az individuális terápia szempontjából ezeknél a daganatoknál is fontos lehet a hTERT mRNS kvantitatív kimutatása.
7. A tel pozitív tumorokban a TA heterogén eloszlása ál-negatív értékeléshez vezethet. 8. Tel, illetve hTERT expresszió vizsgálatát rutin anyagból, ritka daganatok esetében is javasolt elvégezni, hiszen olyan biztató eredmények születhetnek, melyek késobb, nagyobb minta részletesebb vizsgálatát indikálhatják.
6.II. 1. Vizsgálataink alapján a gal3 immunhisztokémiai reakció alkalmazása a pajzsmirigy betegségekben segítséget jelent :
a) a papilláris carcinoma follicularis variánsának felismerésében (mert a reakció erossége és a pozitivitás eloszlása is különbözik a follicularis carcinomában észlelhetoektol)
b) pozitivitása esetén a (foképp a minimálisan invazív) follicularis carcinomának a follicularis adenomától való elkülönítésében
c)a preneoplasztikus esetekben, amikor még ér- és tokinvázió nem mutatkozik, de már molekuláris szintu átalakulás valószínusítheto.
2. Ugyanakkor értékelési gondot is okozhat:
a) a gyulladásos és a cysticus elváltozásokban észlelheto fokális pozitivitás b) ha a follicularis carcino ma ál-negativnak bizonyul.
72
3.
Mivel saját vizsgálataink és eredményeink alapján, a follicularis neopláziák
tekintetében a gal3 reakció specificitása 78.9% volt, szenzitivitása pedig csak 70%-nak bizonyult, véleményünk szerint, ellentétben a korábbi közlemények többségével, nem biztonságos módszer a follicularis adenoma és a follicularis carcinoma (illetve a follicularis neopláziák) elkülönítésére , különösen aspirációs citoló giai anyagon.
4. Ugyanakkor, egyéni tapasztalataink alapján - az interpretációs nehézségek ellenére dysplasia, ill. korai malignus transzformáció tekintetében patognomikus lehet bizonyos gyulladásos pajzsmirigy-betegségek - így Hashimoto-thyreoiditis - esetén, az esetlegesen megjeleno papillaris léziók területén.
5. Bár a gal3 fontos kiegészíto vizsgálatnak számít a pajzsmirigydaganatok hisztológiai és citológiai diagnosztikájában, a konvencionális morfológiai és klinikai vizsgálatokat nem helyettesítheti. Továbbra is csupán a - klasszikus morfoló giai kritériumok alapján történo - hisztológiai vizsgálat adhat megnyugtató és végleges választ a benignitásmalignitás kérdésének eldöntésében.
73
7. Köszönetnyilvánítás Köszönetet mondok mindazoknak, akik az értekezés elkészültéig vezeto munkákban támogattak, segítséget nyújtottak: -programvezetomnek, Dr. Jeney András egyetemi tanárnak, a SE I.sz. Pathologiai és Kísérletes Rákkutató Intézetbol -témavezetomnek, Dr. Kopper László egyetemi tanárnak, a SE I.sz. Pathologiai és Kísérletes Rákkutató Intézetbol -munkahelyem vezetojének, Dr. Bodó Miklós egyetemi tanárnak, Szent János Kórház, Pathologiai Osztály -Dr.Sápi Zoltánnak, aki fáradságot nem ismerve, gyakorlatilag a munka valamennyi szakaszában szakmailag és emberileg is önzetlenül segített -Dr. Matolcsy András egyetemi tanárnak és az általa vezetett labor összes dolgozójának, köztük Dr.Csernus Balázsnak, akik az RNS izolálás rejtelmeibe vezettek be -Dr. Magdolna Bollmann, Dr.Reinhard Bollmann és Norbert Speich pathologus és biológus kollégáknak, a bonni „Institut für Pathologie” Intézetbol, a munka citológiai részében, valamint a mérésekben nyújtott segítségükért -A gondos immunhisztoló giai munkákért Polgár Zoltánné és Bányik Lászlóné asszisztenseket illeti a köszönet -A közlemények és az értekezés formai kialakításában Poloniczky Józsefné Anna titkárno segített -Valamennyi munkatársamnak, kollégáimnak, akik mindvégig támogatásukról biztosítottak -Édesanyámnak szeretetéért, megértéséért, türelméért
74
8. Irodalom
8.1.Hivatkozások
1. Blackburn EH, Gall JG. A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes is Tetrahymena. J Mol Biol 1978, 120(1):3353. 2. Blackburn EH, Chiou SS. Non-nucleosomal packaging of a tandemly repeated DNA sequence at termini of extrachromosomal DNA coding forr RNA in Tetrahymena. Proc Natl Acad Sci USA. 1981, 78(4):2263-2267. 3. Yao MC, Balckburn E, Gall J. Tandemly repeated C-C-C-C-A-A hexanucleotide of Tetrahymena rDNA is present elsewhere in the genome and may be related to the alteration of the somatic genome. J Cell Biol. 1981, 90(2): 515-520. 4. Greider CW, Blackburn EH. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in tetrahymena extracts. Cell 1985, 43:405-413. 5. Moyzis RK, Buckingham JM, Cram LS et al. A highly conserved repetitive DNA sequence (TTAGGG)n , present at the telomeres of human chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA 1988, 85:6622-6626. 6. Hackett JA, Feldser DM, Greider CW. Telomere dysfunction increases mutation rate and genomic instability. Cell 2001, 106:275-286. 7. Lesur I, Campbell JL. The transcriptome of prematurely aging yeast cells is similar to that of telomerase-deficient cells. Mol Biol Cell. 2004 Mar;15(3):1297-312. Epub 2004 Jan 12. 8. Makarov VL, Hirose Y, Langmore JP. Long G tails at both ends of human chromosomes suggest a C strand degradation mechanism for telomere shortening. Cell 1997, 88:657-666. 9. Olovnikov AM. Principles of marginotomy in template synthesis of polynucleotides. Dokl Akad Nauk 1971, 201:1496-1499. 10. Watson JD. Origin of concatemeric T7 DNA. Nat New Biol 1972, 239:197-201. 11. Harley CB, Futcher AB, Greider CW. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Natur 1990, 345:458-460. 12. Shay JW, Zou Y, Hiyama E et al. Telomerase and cancer. Hum Mol Genet 2001, 10(7):677-685. 13. Broccoli D, Cooke H. Aging, healing and the metabolism of telomeres. Am J Hum Genet 1993, 52:657-660.
75
14. Hastie ND, Dempster M, Dunlop MG et al. Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with ageing. Nature 1990, 346(6278):866-868. 15. Morales CP, Holt SE, Ouellette M et al. Absence of cancer-associated changes in human fibroblasts immortalized with telomerase. Nat Genet 1999, 21:115-118. 16. Kiyono T, Foster SA, Koop JI et al. Both Rb/p16INK4a inactivation and telomerase activation are required to immortalize human epithelial cells. Nature 1998, 396:84-88. 17. Martin JA, Klingelhutz AJ, Moussavi-Harami F et al. Effects of oxidative damage and telomerase activity on human articular cartilage chondrocyte senescence. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2004 Apr;59(4):324-37. 18. Counter CM, Avilion AA, LeFeuvre CE et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. EMBO J 1992, 11:1921-1929. 19. Wright WE, Pereire SO, Shay JW et al. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Mol Cell Biol 1989, 9:30883092. 20. Greider CW, Blackburn EH. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell 1985, 43:405-413. 21. Feng J, Funk WD, Wang SS et al. (1995). The RNA component of human telomerase. Science 1995, 269:1236-1241. 22. Yu GL, Bredley JD, Attardi LD et al. In vivo alteration of telomere sequences and senescence caused by mutated Tetrahymena telomerase RNAs. Nature, 1990, 344:126132. 23. Hayflick L. Againg and the genome. Science 1999, 283(5410):2019. 24. Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 1994, 266:2011-2015. 25. Belair CD, Yeager TR, Lopez PM et al. Telomerase activity: a biomarker of cell proliferation, not malignant transformation. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94:1367713682. 26. Allsopp RC, Harley CD. Evidence for a critical telomere length in senescent human fibroblasts. Exp Cell Res 1995, 19(1):130-136. 27. Shay, J. W. Toward identifying a cellular determinant of telomerase repression. J. Natl Cancer Inst 1999, 91: 4-6. 28. Kyo S, Masahiro Takakura M, Kanaya T et al. Estrogen Activates Telomerase. Cancer Research 1999, December 1 (59), 5917-5921.
76
29. Xu J, Yang X. Telomerase activity in early bovine embryos derived from parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biol Reprod 2001, 64 (3): 770-774. 30. Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M et al. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science 1998, 279(5349):349. 31. Hahn WC, Counter CM, Lundberg AS et al. Creation of human tumour cells with defined genetic elements. Nature 1999, 400:464-468. 32. Dhaene K, Van Marck E, Parwaresch R. Telomeres, telomerase and cancer: an update. Virchows Arch 2000, 437:1-16. 33. Counter GM, Hirte HW, Bacchetti S et al. Telomerase activity in human ovarian carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 2900-2904. 34. Shay JW. Aging and cancer: are telomeres and telomerase the connection? Mol Med Today 1995; 1: 378-84. 35. Bhattacharyya A, Blackburn EH. Architecture of telomerase RNA. EMBO J 1994, 13:5721-5731. 36. Harrington L, Zhou W, McPhail T et al. Human telomerase contains evolutionarily conserved catalytic and structural subunits. Genes Dev 11, 3109-3115, 1997. 37. Nakayama JM, Saito H, Nakayama A et al. TLP1: A gene encoding a protein component of mammalian telomerase is a novel member of WD-repeats family. Cell 1997, 88:875-884. 38. Meyerson M, Counter CM, Eaton EN et al. HEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization. Cell. 1997 Aug 22;90(4):785-95. 39. Nakamura TM, Morin GB, Chapman KB et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.Science. 1997 Aug 15;277(5328):955-9. 40. Mergny JL, Riou JF, Mailliet P et al. Natural and pharmacological regulation of telomerase. Nucleic Acids Research 2002, Vol. 30, No. 4 839-865. 41. Holt SE, Tesmer VM, Aisner DL et al. Functional requirement of p23 and hsp90 in telomerase complexes. Genes and Development 1999, 13:817-826. 42. www.biocarta.com 43. Kyo S, Takakura M, Kanaya T et al. Estrogen activates telomerase. Cancer Res 1999, 59, 5917–5921. 44. Evans SK, Lundblad V. Est1 and Cdc13 as comediators of telomerase access. Science. 1999 Oct 1;286(5437):117-20.
77
45. Crowe DL, Nguyen DC. Rb and E2F-1 regulate telomerase activity in human cancer cells. Biochim Biophys Acta 2001, 1518, 1–6. 46. Oh S, Song Y, Yim J et al. The Wilms’ tumor 1 tumor suppressor gene represses transcription of the human telomerase reverse transcriptase gene. J Biol Chem 1999, 274, 37473–37478. 47. Yin L, Hubbard AK, Giardina C. NF-kappa B regulates transcription of the mouse telomerase catalytic subunit. J Biol Chem 2000, 275, 36671–36675. 48. Fujimoto K, Kyo S, Takakura M et al. Identification and characterization of negative regulatory elements of the human telomerase catalytic subunit (HTERT) gene promoter: possible role of MZF-2 in transcriptional repression of hTERT. Nucleic Acids Res 2000, 28, 2557–2562. 49. Lin SY, Elledge SJ. Multiple tumor suppressor pathways negatively regulate telomerase. Cell 2003 Jun 27;113(7):881-9. 50. Liu YC, Chen CJ, Wu HS et al. Telomerase and c- myc expression in hepatocellular carcinomas. Eur J Surg Oncol 2004 May;30(4):384-90. 51. Shay JW. Telomerase in cancer: Diagnostic, prognostic and the rapeutic implications. Cancer J Scientific Amer 1998, 4:26-34. 52. Karlseder J. Telomere repeat binding factors: keeping the ends in check. Cancer Lett 2003 May 15;194(2):189-97. 53. Fletcher TM, Sun D, Salazar M et al. Effect of DNA secondary structure on human telomerase activity.Biochemistry. 1998 Apr 21;37(16):5536-41. 54. Shore D. Telomeres--unsticky ends. Science 1998 Sep 18;281(5384):1818-9. Review. 55. Hurley LH. Secondary DNA structures as molecular targets for cancer therapeutics. Biochem Soc Trans.2001 Nov;29(Pt 6):692-6. 56. Maraval A, Franco S, Vialas C et al. Porphyrin-aminoquinoline conjugates as telomerase inhibitors.Org Biomol Chem 2003 Mar 21;1(6):921-7. 57. Hemann MT, Strong MA, Hao LY et al. The shortest telomere, not average telomere length, is critical for cell viability and chromosome stability. Cell 2001, 107:67-77. 58. Keith WN, Evans TRJ, Glasspool RM. Telomerase and cancer: time to move from a promising target to a clinical reality. J Pathol 2001, 195:404-414. 59. Keith WN, Hoare SF. Detection of telomerase hTERT gene expression and its splice variants by RT-PCR. Methods Mol Med. 2004;97:297-309.
78
60. de Kok JB, Ruers TJ, van Muijen GN, van Bokhoven A, Willems HL, Swinkels DW. Real-time Quantification of human telomerase reverse transcriptase mRNA in tumors and healthy tissues. Clinical Chemistry 2000;46:313-318. 61. Ishibashi K, Hirose K, Kato H et al. Determining the telomerase activity of exfoliated cells in intestinal lavage solution to detect colorectal carcinoma. Anticancer Res 1999 Jul- Aug;19(4B):2831-6. 62. Kondo H, Sugano K, Fukayama N et al. Detection of point mutations in the K-ras oncogene at codon 12 in pure pancreatic juice for diagnosis of pancreatic carcinoma. Cancer 1994;73:1589-1594. 63. Sugino T, Yoshida K, Bolodeoku J et al. Telomerase activity in human breast cancer and benign breast lesions: Diagnostic applications in clinical specimens, including fine needle aspirates. Int J Cancer 1996, 69, 301-306. 64. Yan YL, Zheng JX, Wang X et al. Detection of telomerase activity in bronchoscopic brush-off samples in patients with lung cancer. Ai Zheng 2002, 7, 768-771. 65. Wu WJ, Liu LT, Huang CH et al. Telomerase activity in human bladder tumors and bladder washing specimens. Kaohsiung J Med Sci 2001, 12, 602-609. 66. Cunningham VJ, Markham N, Shroyer Al et al. Detection of telomerase expression in fine-needle aspirations and fluids. Diagn Cytopathol 1998, 18, 431-436. 67. Poremba C, Shroyer KR, Frost M et al. Telomerase is a highly sensitive and specific molecular marker in fine- needle aspirates of breast leisons. J Clin Oncol 1999, 17:20202026. 68. Ohyashiki K, Ohyashiki JH, Nishimaki J et al. Cytological detection of telomerase activity using an in situ telomeric repeat amplification protocol assay. Cancer Res 1997, 57:2100-2103. 69. Sklenickova M, Fajkus J. Telomere analysis in tumor cells using in situ techniques. Article in Czech. Cas Lek Cesk. 2003 Aug;142(8):479-82. 70. Kapoor V, Telford WG. Telomere length measurement by fluorescence
in situ hybridization and flow cytometry. Methods Mol Biol 2004;263:385-98. 71. Lansdorp PM, Poon S, Chavez E et al. Telomeres in the haemopoietic system Ciba Found Symp 1997, 211:209-218. 72. Prowse KR, Avilion AA, Greider CW. Identification of a nonprocessive telomerase activity from mouse cells. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:1493-1497. 73. Sommerfeld HJ, Meeker AK, Piatyszek MA et al. Telomerase activity: a prevalent marker of malignancy in human colorectal cancer. Cancer Res 1996;56:218-222. 74. Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 1994;266:2011-2015.
79
75. Wu YY, Hruszkewycz AM, Delgado RM et al. Limitations on the quantitative determination of telomerase activity by the electrophoretic and ELISA based TRAP assays. Clin Chim Acta 2000 Mar;293(1-2):199-212. 76. Elmore LW, Forsythe HL, Ferreira-Gonzalez A et al. Real-time quantitative analysis of telomerase activity in breast tumor specimens using a highly specific and sensitive fluorescent-based assay. Diagn Mol Pathol. 2002 Sep;11(3):177-85. 77. Park TK, Jin KH. Telomerase activity in pterygeal and normal conjunctival epithelium. Korean J Ophthalmol 2000 Dec;14(2):85-9. 78. Hou M, Xu D, Bjorkholm M, Gruber A. Real-time quantitative telomeric repeat amplification protocol assay for the detection of telomerase activity. Clin Chem 2001 Mar;47(3):519-24. 79. de Kok JB, van Balken MR, Roelofs RW et al. Quantification of hTERT mRNA and telomerase activity in bladder washings of patients with recurrent urothelial cell carcinomas. Clin Chem 2000 Dec;46(12):2003-7. 80. Keith WN, Hoare SF. Detection of telomerase hTERT gene expression and its splice variants by RT-PCR. Methods Mol Med 2004;97:297-309. 81. Bialkowska-Hobrzanska H, Bowles L, Bukala B et al. Comparison of human telomerase reverse transcriptase messenger RNA and telomerase activity as urine markers for diagnosis of bladder carcinoma. Mol Diagn 2000 Dec;5(4):267-77. 82. Emrich T, Gerlinde K, Panzinger B. Detection of Telomerase Components by Quantitative Realtime On- line PCR Analysis with the LightCycler. Biochemica 2000, 4, 16-19. 83. Schrader M, Burger AM, Muller M et al. Quantification of human telomerase reverse transcriptase mRNA in testicular germ cell tumors by quantitative fluorescence real-time RT-PCR. Oncol Rep 2002, 5, 1097. 84. Gaudin JC, Mehul B, Hughes RC. Nuclear localisation of wild type and mutant galectin-3 in transfected cells. Biology of the Cell 2000, 92: 49-58. 85. Hadari YR, Arbel-Goren R, Levy Y et al. Galectin-8 binding to integrins inhibits cell adhesion and induces apoptosis. Journal of Cell Science 2000, 113:2385-2397. 86. Inohara H, Akahani S, Raz A. Galectin-3 stimulates cell proliferation. Experimental Cell Research 1998, 245:294-302. 87. Matarresea P, Tinari N, Semeraroa ML et al. Galectin-3 overexpression protects from cell damage and death by influencing mitochondrial homeostasis. FEBS Letters 2000, 473:311-315.
80
88. Matarrese P, Fusco O, Tinari N et al. Galectin-3 overexpression protects from apoptosis by improving cell adhesion properties. International Journal of Cancer 2000, 85:545-554. 89. Fernandez PL, Merino MJ, Gomez M et al. Galectin-3 and laminin expression in neoplastic and non-neoplastic thyroid tissue. Journal of Pathology 1997, 181:80-86. 90. Perillo NL, Marcus ME, Baum LG. Galectins: versatile modulators of cell adhesion, cell proliferation and cell death. Journal of Molecular Medicine 1998, 76:402-412. 91. Sotomayor CE, Rabinovich GA. Galectin-1 induces central and peripheral cell death: implications in T-cell physiopathology. Development Immunology 2000, 7:117-129. 92. Yoshii T, Inohara H, Takenaka Y et al. Galectin-3 maintains the transformed phenotype of thyroid papillary carcinoma cells. International Journal of Oncology 2001, 18:787-792. 93. Nakamura M, Inufusa H, Adachi T et al. Involvement of galectin-3 expression in colorectal cancer progression and metastasis. International Journal of Oncology 1999, 15:143-148. 94. Nangia-Makker P, Honjo Y, Sarvis R et al. Galectin-3 induces endothelial cell morphogenesis and angiogenesis. American Journal of Pathology 2000, 156:899-909. 95. Plzak J, Smetana K Jr, Hrdlickova E et al. Expression of galectin-3 reactive ligands in squamous cancer and normal epithelial cells as a marker of differentiation. International Journal of Oncology 2001, 19:59-64. 96. Baldus SE, Zirbes TK, Weingarten M et al. Increased galectin-3 expression in gastric cancer: correlations with histopathological subtypes, galactosylated antigens and tumour cell proliferation. Tumour Biology 2000, 21:258-266. 97. Honjo Y, Nangia-Makker P, Inohara H et al. Down-regulation of galectin-3 suppresses tumorigenicity of human breast carcinoma cells. Clinical Cancer Research 2001, 7:661-668. 98. Sanjuan X, Fernandez PL, Castells A et al. Differential expression of galectin 3 and galectin 1 in colorectal cancer progression. Gastroenterology 1997, 113:1906-1915. 99. Konstantinov KN, Robbins BA, Liu FT. Galectin-3, a beta- galactoside-binding animal lectin, is a marker of anaplastic large-cell lymphoma. American Journal of Pathology 1996, 148:25-30. 100. Cvejic D, Savin S, Paunovic I et al. Immunohistochemical localization of galectin-3 in malignant and benign human thyroid tissue. Anticancer Research 1998, 18:2637-2641. 101. Niedobitek C, Niedobitek F, Lindenberg G et al. Expression of galectin-3 in thyroid gland and follicular cell tumors of the thyroid. A critical study of its possible role in preoperative differential diagnosis. Pathologe 2001, 22:205-213.
81
102. Rosahl SK, Erpenbeck V, Vorkapic P et al. Solitary follicular thyroid carcinoma of the skull base and its differentiation from ectopic adenoma-review, use of galectin-3 and report of a new case. Clinical Neurology and Neurosurgery 2000, 102:149-155. 103. Beesley MF, McLaren KM. Cytokeratin 19 and galectin-3 immunhistochemistry in the differential diagnosis of solitary thyroid nodules. Histopathology 2002, 41:236-243. 104. Gasbarri A, Martegani MP, Del Prete F et al. Galectin-3 and CD44v6 isoforms in the preoperative evaluation of thyroid nodules. Journal of Clinical Oncology 1999, 17:3494-3502. 105. Bartolazzi A, Gasbarri A, Papotti M et al. Application of an immunodiagnostic method for improving preoperative diagnosis of nodular thyroid lesions. Lancet 2001, 357:1644-1650. 106. Wittwer CT, Ririe KM, Andrew RV et al. The LightCycler: a microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control. Biotechniques 1997, Jan;22(1):176-81. 107. Hanahan D. Benefits of bad telomeres. Nature 2000, Vol 406, No 6796: 573-574. 108. Sidransky D. Nucleic acid-based methods for the detection of cancer. Science 1997, Nov 7;278(5340):1054-9. 109. Meeker AK, Coffey DS. Telomerase: a promising marker of biological immortality of germ stem, and cancer cells. A review. Biochemistry (Mosc) 1997, Nov;62(11):132331. 110. Shay JW, Wright WE: Telomerase activity in human cancer. Curr Opin Oncol 1996, 8: 66-71. 111. Calaf G, Smilenov LB, Pandita TK et al. Correlation Between Telomerase Activity And Telomere Length In Human Breast Epithelial Cell Lines. Oncogene 1996, 13:1423. 112. Li Z, Kong C, Wang P et al. Telomerase activity in urine in diagnosis and recurrence surveillance of urothelial carcinoma. Chin Med J (Engl) 2002, Nov;115(11):1650-2. 113. Boldrini L, Faviana P, Gisfredi S et al. Evaluation of telomerase mRNA (hTERT) in colon cancer. International Journal of Oncology 2002, 21:493-497. 114. Poremba C, Heine B, Diallo R et al. Telomerase as a prognostic marker in breast cancer: high-throughput tissue microarray analysis of hTERT and hTR. J Pathol 2002; 198: 181-189. 115 . Hess JL, Highsmith WE Jr. Telomerase detection in body fluids. Clin Chem 2002 Jan;48(1):18-24. 116. Guo D, Catchpoole DR. Isolation of intact RNA following cryosection of archived frozen tissue. Biotechniques 2003, 1: 48-50.
82
117. Jarboe EA, Liaw KL, Thompson LC et al. Analysis of telomerase as a diagnostic biomarker of cervical dysplasia and carcinoma. Oncogene 2002, Jan 21;4, 664-673. 118. Newbold RF. The significance of telomerase activation and cellular immortalization in human cancer. Mutagenesis 2002, 6:539-550. 119. Yan P, Coindre JM, Benhattar J et al. Telomerase activity and human telomerase reverse transcriptase mRNA expression in soft tissue tumors: correlation with grade, histology and proliferative activity. Cancer Res 1999, 59:3166-3170. 120. Leuraud P, Aguirre-Cruz L, Hoang-Xuan K et al. Telomerase reactivation in malignanat gliomas and loss of heterozigosity on 10p15.1 Neurology, 2003 Jun 10; 60(11):1820-22. 121. Chang S, Khoo CM, Naylor ML et al. Telomere-based crisis: functional differences between telomerase activation and ALT in tumor progression. Genes Dev 2003, 17:88100. 122. Dunham MA, Neumann AA, Fasching CL et al. Telomere maintenance by recombination in human cells. Nat Genet 2000, 26: 447–450. 123. Cerone MA, J. Londono-Vallejo JA, Bacchetti S. Telomere maintenance by telomerase and by recombination can coexist in human cells. Human Molecular Genetics 2001, Vol. 10, No. 18 1945-1952. 124. Bryan TM, Englezou A, Gupta J et al. Telomere elongation in immortal cells without detectable telomerase activity. EMBO J 1995, 14: 4240–4248. 125. Ford LP, Zou Y, Pongracz K et al. Telomerase can inhibit the recombination-based pathway of telomere maintenance in human cells. J Biol Chem 2001, 276:32198-32203. 126. Perrem K, Colgin LM, Neumann AA et al. Coexistence of alternative lenghthening of telomeres and telomerase in hTERT-transfected GM847 cells. Mol Cell Biol 2001, 21:3862-3875. 127. Scheel C, Schaefer KL, Jauch A et al. Alternative lengthening of telomeres is associated with chromosomal instability in osteosarcomas. Oncogene 2001, 20:38353844. 128. Yeager TR, Neumann AA, Englezou A et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a noveltype of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Res 1999, 59:4175-4179. 129. Scheel C, Poremba C. Telomere lengthening in telomerase-negative cells: the ends are coming together. Virchows Arch 2002, Jun;440(6):573-82. Epub 2002 Apr 09. 130. Rezler EM, Bearss DJ, Hurley LH. Telomere inhibition and telomere disruption as processes for drug targeting. Ann Rev Pharmacol Toxicol 2003, 43:359-379.
83
131. Henson JD, Neumann AA, Yeager TR, Reddel RR. Alternative lengthening of telomeres in mammalian cells. Oncogene 2002, Jan 21;21(4):598-610. 132. Bryan TM, Englezou A, Dalla-Pozza L et al. Evidence for an alternative mechanism for maintaining telomere length in human tumors and tumor-derived cell lines. Nat Med 1997, 3:1271-1274. 133. Yan P, Benhattar J, Coindre JM, Guillou L. Telomerase activity and hTERT mRNA expression can be heterogeneous and does not correlate with telomere length in soft tissuesarcomas. Int J Cancer. 2002 Apr 20;98(6):851-6. 134. Wiener HG, Vooijs GP, van't Hof-Grootenboer B. Accuracy of urinary cytology in the diagnosis of primary and recurrent bladder cancer. Acta Cytol 1993, MarApr;37(2):163-9. 135. Yang SC, Lee DH, Hong SJ et al. Telomerase activity: a potential marker of bladder transitional cell carcinoma in bladder washes. Yonsei Med J 1997, 38:155-9. 136. Badalament RA, Hermansen DK, Kimmel M et al. The sensitivity of bladder wash flow cytometry, bladder wash cytology, and voided cytology in the detection of bladder carcinoma. Cancer 1987, Oct 1;60(7):1423-7. 137. Duffy MJ. Can molecular markers now be used for early diagnosis of malignancy? Clin Chem 1995, Oct;41(10):1410-3. 138. Buyru N, Tigli H, Ozcan F et al. Ras oncogene mutations in urine sediments of patients with bladder cancer. J Biochem Mol Biol 2003, Jul 31;36(4):399-402. 139. Miyake H, Eto H, Arakawa S et al. Over expression of CD44V8-10 in urinary exfoliated cells as an independent prognostic predictor in patients with urothelial cancer. J Urol 2002, Mar;167(3):1282-7. 140. Little B. Non- invasive methods of bladder cancer detection. Int Urol Nephrol 2003, 35(3):331-43. 141. de Kok JB, van Balken MR, Ruers TJ et al. Detection of telomerase activity in urine as a tool for noninvasive detection of recurrent bladder tumors is poor and cannot be improved by timing of sampling. Clin Chem 2000, Dec;46(12):2014-5. 142. Kinoshita H, Ogawa O, Kakehi Y et al. Detection of telomerase activity in exfoliated cells in urine from patients with bladder cancer. J Natl Cancer Inst 1997, May 21;89(10):724-30. 143. Lin Y, Miyamoto H, Fujinami K et al. Telomerase activity in human bladder cancer. Clin Cancer Res 1996, Jun;2(6):929-32. 144. Ramakumar S, Bhuiyan J, Besse JA et al. Comparison of screening methods in the detection of bladder cancer. J Urol 1999. Feb;161(2):388-94.
84
145. Dennis YM. Quantitative Assays for Telomerase: Means for Studying the End. Clinical Chemistry 1998, 44:2399-2400. 146. de Kok JB, van Balken MR, Roelofs RW et al. Quantification of hTERT mRNA and telomerase activity in bladder washings of patients with recurrent urothelial cell carcinomas. Clin Chem 2000, Dec;46(12):2003-7. 147. Rhyu MS. Telomeres, telomerase and immortality. J Natl Cancer Inst 1995, 87:884894. 1995. 148. Isurugi K, Suzuki Y, Tanji S et al. Detection of the presence of catalytic subunit mRNA associated with telomerase gene in exfoliated urothelial cells from patients with bladder cancer. J Urol 2002, 168:1574-1577. 149. Winzer R, Schmutzler C, Jakobs TC et al. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction analysis of thyrocyte-relevant genes in fine-needle aspiration biopsies of the human thyroid. Thyroid 1998, 11:981-987. 150. Nascimento MC, Bisi H, Alves VA et al. Differential reactivity for galectin-3 in Hurthle cell adenomas and carcinomas. Endocr Pathol 2001, 3:255-257. 151. Hoang-Vu C, Boltze C, Fimm O et al. Expression of telomerase genes in thyroid carcino ma. Int J Oncol 2002, 2:265-272. 152. Herbert B-S, Wright WR, Shay JW: Telomerase and breast cancer. Breast Cancer Res 2001, 3(3):146-149. 153. Sugino T, Yoshida K, Bolodeoku J et al: Telomerase activity in human breast cancer and benign breast lesions: Diagnostic applications in clinical specimens, including fine needle aspirates. Int J Cancer 1996, 69:301-306. 154. Kyo S, Nakamura M, Kiyono T et al. Successful immortalization of endometrial glandular cells with normal structural and functional characteristics. Am J Pathol 2003, Dec;163(6):2259-69. 155. Williams CD, Boggess JF, LaMarque LR et al. A prospective, randomized study of endometrial telomerase during the menstrual cycle. J Clin Endocrinol Metab 2001, Aug;86(8):3912-7. 156. Ahrendt SA, Yang SC, Wu L et al. Comparison of oncogene mutation detection and telomerase activity for the molecular staging of non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 1997, Jul;3(7):1207-14. 157. Blackburn EH. Telomerases. Annu Rev Bio chem 1992, 61:113-29. 158. Zhang X, Mar V, Zhou W et al. Telomere shortening and apoptosis in telomeraseinhibited human tumor cells. Genes Dev 1999, 13:2388–2399. 159. Huard S, Autexier C. Targeting human telomerase in cancer therapy. Curr Med Chem Anti-Canc Agents 2002, Sep;2(5):577-87. 85
160. Sager R. Senescence as a mode of tumor suppression. Environ Health Perspect 1991;93:59-62. 161. Kopper L. Theoretical possibility of using gene therapy in malignant diseases. Orv Hetil 1992, Oct 11;133(41):2609-13. 162. Minev B, Hipp J, Firat H et al. Medical Sciences Cytotoxic T cell immunity against telomerase reverse transcriptase in humans. Proc Natl Acad Sci USA 2000, April 25; 97 (9):4796–4801. 163. Mergny JL, Riou JF, Mailliet P et al. Natural and pharmacological regulation of telomerase Nucleic Acids Research 2002, Vol. 30, No. 4 839-865. 164. Saggiorato E, Cappia S, Giuli P et al. Galectin-3 as a presurgical immunocytodiagnostic marker of minimally invasive follicular thyroid carcinoma. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2001, 86:5152-5158. 165. Nascimento MC, Bisi H, Alves VA et al. Differential reactivity for galectin-3 in Hurthle cell adenomas and carcinomas. Endocrine Pathology 2001, 1:275-279. 166. Coli A, Bigotti G, Zucchetti F et al. Galectin-3, a marker of well-differentiated thyroid carcinoma, is expressed in thyroid nodules with cytological atypia. Histopathology 2002, 40:80-87. 167. Kawachi K, Matsushita Y, Yonezawa S et al. Galectin-3 expression in various thyroid neoplasms and its possible role in metastasis formation. Human Pathology 2000, 31:428-433. 168. Cvejic D, Savin S, Golubovic S et al. Galectin-3 and carcinoembryonic antigen expression in medullary thyroid carcinoma: possible relation to tumour progression. Histopathology 2000, 37:530-535. 169. Rabinovich GA, Rubinstein N. Galectins: a novel family of proteins involved in the regulation of the immune response. Implications in immunopathological processes. Medicine 2001, 61:85-92. 170. Papotti M,Volante M, Saggiorato E et al. Role of galectine-3 immunodetection in the cytological diagnosis of thyroid cystic papillary carcinoma. European Journal of Endocrinology 2001, 147:515-521. 171. Inohara H, Honjo Y, Yoshii T et al. Expression of galectin-3 in fine- needle aspirates as a diagnostic marker differentiating benign from malignant thyroid neoplasms. Cancer 1999, 85:2475-2484. 172. Iurisci I, Tinari N, Natoli C et al. Concentrations of galectin-3 in the sera of normal controls and cancer patients. Clinical Cancer Research 2000, 4:1389-1393. 173. Wynford-Thomas Jan;187(1):100-11.
D.
Cellular
senescence
86
and
cancer.
J
Pathol 1999,
174. Poremba C, Willenbring H, Hero B et al. Telomerase activity distinguishes between neuroblastomas with good and poor prognosis. Ann oncol 1999, 10:715-721. 175. Poremba C, Scheel C, Hero B et al. Telomerase activity and telomerase subunits gene expression patterns in neuroblastoma: a molecular and immunohistochemical study establishing prognostic tools for fresh- frozen and paraffin-embedded tissues. J Clin Oncol 2000, 18:2528-2592. 176. Wang SZ, Sun JH, Zhang W et al: Telomerase activity in cervical intraepithelial neoplasia. Chin Med J (Engl) 2004, Feb; 117(2): 202-6. 177. Sawant SG, Gregoire V, Umbricht CB et al. Telomerase Activity As A Measure For Monitoring Radiocurability Of Tumor Cells. Annual Report 1998 Center for Radiological Research. 178. Greider CW, Blackburn EH. Telomeres, Telomerase and Cancer. Scientific American 2/96, page92 179. Martins L, Matsuo SE, Eb ina KN et al. Galectin-3 messenger ribonucleic acid and protein are expressed in benign thyroid tumor. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2002, 87:4806-4810. 180. Niedziela M, Maceluck J, Korman E. Galectin-3 is not an universal marker of malignancy in thyroid nodular disease in Mildred and adolescents. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2002, 87:4411-4415. 181. Davies R, Dina R. Galectin-3 in thyroid nodules: A cytohistological correlation. Cytopathology 2003, 14 (Suppl. 1), page 9. 182. Hara T, Noma T, Yamashiro Y, Naito K, Nakazawa A: Quantitative analysis of telomerase activity and telomerase reverse transcriptase expression in renal cell carcinoma. Urol Res 1, 1-6, 2001. 183. Mehle C, Piatyszek MA, Ljungberg B, Shay JW, Roos G: Telomerase activity in human renal cell carcinoma. Oncogene 13, 161-166, 1996. 184. Yashima K, Milchgrub S, Gollahon LS et al. Telomerase enzyme activity and RNA expression during the multistage pathogenesis of breast carcinoma. Clin Cancer Res. 1998, Jan;4(1):229-34. 185. Muelleri C, Riesel U, Kosmehl H et al. Telomerase activity in microdissected human breast cancer tissues: association with p53, p21 and outcome. International Journal of Oncology 2002, 20:385-390. 186. Poremba C, Shroyer KR, Frost M et al. Telomerase Is a Highly Sensitive and Specific Molecular Marker in Fine-Needle Aspirates of Breast Lesions. Journal of Clinical Oncology 1999, Vol 17, Issue 7 (July):2020 187. Handan Kaya H, Hücümeno S, Kot E et al. Telomerase mRNA Expression in Ductal Carcinomas of the Breast. Turk J Med Sci 2002, 32:417-419.
87
188. Schneider-Stock R, Emrich T, Peters B et al. Analysis of human telomerase reverse transcriptase mRNA (hTERT) expression in myxoid liposarcomas using LightCycler realtime quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Electrophoresis, 2001 Vol 22, Issue 6:1098-1101. 189. Schrader M, Muller M, Schulze W et al. Quantification of the expression level of the gene encoding the catalytic subunit of telomerase in testicular tissue specimens predicts successful sperm recovery. Hum Reprod. 2002 Jan;17(1):150-6.
8.2. Az értekezés tárgykörében megjelent saját közlemények - Kovács RB, Földes J, Winkler G, Bodó M, Sápi Z: The investigation of galectin-3 in disease of the thyroid gland. Eur J Endocrinol. 2003. Nov;149(5):449-53. - Kovács RB, Bollmann M, Speich N, Bollmann R, Bodó M, Sápi Z: Measuring telomerase activity in various human tumors in routine histology and cytology. Int J Mol Med. 2004. Feb;13(2):303.9.
8.3. Egyéb közlemények - Gábor Zs, Kovács RB, Bencze B: Dendriform parenchymás ossificatio (Pneumopathia osteoplastica). Medicina Thoracalis 45,92-94,1992. - A cervix citológia aktuális kérdései I. Pozitív citológia – negatív szövettan. A CYBAkör konszenzus konferenciája és - A cervix citológia aktuális kérdései II. Negatív citológia – pozitív szövettan. Magyar Noorvosok Lapja 63,499-501 (2000). – társszerzoként - Zábó A, Bodó M, Sápi Z, Kovács R.B., Baltschik M., Lintner F.: Életmento (?) tubáris terhesség. Magyar Noorvosok Lapja 63,411-415,2000. -Sápi Z, Kovács RB, Bodó M: Gastrointestinalis stromalis tumorok. Saját tapasztalatok 29 eset kapcsán Orvosi Hetilap, 2001 Nov 11;142(45):2479-2485. - Cserni G, Kovács RB, Tarján M, Sápi Z, Domján Zs, Szabó Z: Sarcomatoid Renal Cell Carcinoma with Foci of Chromophobe Carcinoma. Pathology Oncology Research, 2002, Vol8.No2, 142-144. - Julow J, Viola A, Major T, Valálik I, Sági S, Mangel L, Kovács RB, Repa I, Bajzik G, Németh G: Brachytherapy of brain stem tumors Clinical Neuroscience/Ideggyógy.Sz. 2004. Jan 20;57(1-2):30-5.
88
- Julow J, Viola Á, Major T, Valálik I, Sági S, Mangel L, Kovács RB, I Repa: Iodine125 Brachytherapy of Brain Stem Tumors. Strahlentherapie und Onkologie 2004, No7, 449-454. - Jakab Cs, Gál J, Kovács RB: Gemistocytás astrocytoma hét hónapos macskában. Magyar Állatorvosok Lapja, 126. évf., 2004/8. 487-491.
8.4. Eloadások és poszterek - idézheto abstract-tal, a témához kapcsolódó fobb eloadások, elnyert tudományos díjak - Simon K., Kovács R.B., Dénes R., Torbágyi E., Pálóczi K., Kelemen E.: Csontvelo transzplantáltak kórboncolási leletei. Magy.
Hematológiai és Transzfúziológiai
Társ.XVI.Kongr.1997.04.24-26.Szeged. - Viola A, Julow J, Major T, Valálik I, Sági S, Mangel L, Kovács RB: 125 Iodine brachytherapy of brain stem tumours – 2 cases. Annual Brachytherapy Meeting, (GECESTRO), Germany, Lübeck 15-17. May, 2003. poster - Kovács RB, Bodó M, Bollmann M, Sápi Z: Real-time RT-PCR technika alkalmazása humán tumorok telomeráz aktivitásának meghatározására. 62. Pathológus Kongresszus, Budapest, 2003. szeptember 25-27. - Kovács RB, Bollmann M, Bodó M, Sápi Z: Detection of telomerase activity by realtime reverse transcription-polymerase chain reaction assay in routine cytology. XV. International Congress of Cytology, Santiago de Chile, April 11-15. 2004. 06. 13. - Kovács RB, Bollmann M, Bodó M, Sápi Z. Telomeráz aktivitás vizsgálata rutin cytologiai anyagon real-time PCR módszerrrel. IV. Cytologus Kongresszus, 2004. május 7-8., Miskolc - Kas J, Kovács RB, Kocsis Á: Transbronchial needle aspiration – our first results. 13th World Congress for Bronchology (WCB) abd 13th Won for Bronchoesophagology (WCBE), Spain, Barcelona, Jun 20-23, 2004. - Pápay J, Márk Zs, Kovács RB, Szepesi Á, Matolcsy A: Tüdo MALT- lymphoma diagnózisa bronchoszkópos mintából. 61. Pathologus Kongresszus, Gyor, 2002. szeptember 26-28. -poster, I. díj - Bohács A, Kovács RB: Pulmonalis amyloid tumor. Fiatal Tüdogyógyászok Fóruma, 2001. Bp. I. díj - A Magyar Endokrin és Anyagcsere Társaság Pajzsmirigy Szekció Henning -díja, 2004. év (ápr.21) 89
