TEKNIK PERBANYAKAN DAN KEKERABATAN GENETIK PASAK BUMI (Eurycoma longifolia Jack)
ARIDA SUSILOWATI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Teknik Perbanyakan dan Kekerabatan Genetik Pasak Bumi (Eurycoma longifolia Jack) adalah karya saya sendiri dengan arahan dosen pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka dibagian akhir tesis ini.
Bogor, Agustus 2008
Arida Susilowati NIM E051060111
3
Hak cipta milik IPB, tahun 2008 Hak cipta dilindungi undang-undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa menyebutkan sumber a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah. b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
Judul Tesis : Teknik Perbanyakan dan Kekerabatan Genetik Pasak Bumi (Eurycoma longifolia Jack) Nama : Arida Susilowati NIM : E051060111
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr Supriyanto Ketua
Dr. Iskandar Z. Siregar Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Ilmu Pengetahuan Kehutanan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Imam Wahyudi, MS
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS
Tanggal Lulus: / / 2008
Tanggal Ujian: /
/ 2008
5
Penguji Luar Komisi Pada Ujian Tesis: Dr Ervizal A.M. Zuhud, MS
TEKNIK PERBANYAKAN DAN KEKERABATAN GENETIK PASAK BUMI (Eurycoma longifolia Jack)
ARIDA SUSILOWATI
Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
ABSTRACT ARIDA SUSILOWATI. Propagation Technique and Genetic Relatedness of Pasak Bumi (Eurycoma longifolia Jack). Under direction of SUPRIYANTO and ISKANDAR Z. SIREGAR Pasak bumi (Eurycoma longifolia Jack) is a shrubs growing wildly in the forests of Southeast Asia and widely used throughout the region because of its medicinal properties. Uncontrolled harvesting of wild-grown trees has led to rapid decrease of natural populations, as well as causing a potential decrease in genetic diversity. The objectives of this research were 1). To get information about propagation technique of pasak bumi by seed and stem cutting and its suitable growing medium and 2). To estimate genetic relatedness of pasak bumi propagated by seed collected from Jambi using RAPD marker. Propagation by seed produced low germination percentage (14-34%) at different media. Seedling planted in pure carbonized rice husk medium produced the best growth variabel on vigority, primary root number, secondary root number, primary root length and secondary root length. Result from stem cutting showed that medium significantly improved secondary root length, while rooting percentage, primary root length and the number of root significantly was affected by Rootone F treatment. Genetic relatedness by RAPD marker showed that pasak bumi propagated by seed has high value of genetic diversity within population (He = 0,3076) and 78,57% all the loci tested were polimorphic, clustering analysis showed that the plant can be grouped into two group. Keywords: Eurycoma longifolia Jack, propagation technique, genetic relatedness.
RINGKASAN ARIDA SUSILOWATI. Teknik Perbanyakan dan Kekerabatan Genetik Pasak Bumi (Eurycoma longifolia Jack). Dibimbing oleh SUPRIYANTO dan ISKANDAR Z. SIREGAR. Indonesia sebagai salah satu negara megabiodiversity yang diperkirakan memiliki 30.000 tumbuhan dan sekitar 1260 spesies di antaranya berkhasiat sebagai obat. Sampai saat ini baru sekitar 180 spesies yang telah digunakan untuk berbagai keperluan industri obat dan jamu, tetapi hanya beberapa spesies saja yang telah dibudidayakan secara intensif (Supriadi 2001). Pasak bumi (Eurycoma longifolia Jack) merupakan salah satu tanaman obat asal hutan yang masih belum banyak dikembangkan padahal tanaman ini memiliki banyak khasiat. Berdasarkan kajian farmakologis diperoleh informasi bahwa senyawa canthin pada tanaman pasak bumi mampu menghambat pertumbuhan sel kanker (Nurhanan et al. 2005) , senyawa turunan eurycomanone sebagai anti malaria (Chan et al. 2005), senyawa quassinoid berfungsi sebagai anti leukimia, dan prospektif untuk anti HIV (Sindelar et al. 2005), serta senyawa etanol berfungsi sebagai afrodisiak (Nainggolan & Simanjuntak 2005). Industri obat-obatan selama ini hanya mengandalkan tanaman pasak bumi dari alam tanpa adanya upaya budidaya, akibatnya terjadi penurunan populasi pasak bumi di alam. Rifai (1992) bahkan menyatakan kondisi populasi pasak bumi asal Indonesia sudah dikategorikan sebagai tanaman langka dengan status ’terkikis’. Pemerintah Malaysia pada tahun 2001 menyatakan tanaman ini sebagai tanaman yang dilindungi, hal tersebut juga mendorong eksploitasi yang lebih tinggi terhadap pasak bumi asal Indonesia. Menurut Hussein et al. (2005), selama ini perbanyakan tanaman pasak bumi hanya mengandalkan biji di alam. Padahal sebagai tanaman yang memiliki tipe benih rekalsitran, persentase kecambahnya cenderung rendah dan memerlukan waktu yang cukup lama akibat embrio zigotik yang belum matang pada saat pemencaran.
Selain itu, perilaku berbunga yang tidak tentu
dan
pertumbuhannya yang lambat mengakibatkan tanaman ini semakin jarang ditemui.
9
Penelitian mengenai tanaman pasak bumi di Indonesia masih sedikit yang dilaporkan.
Beberapa penelitian tersebut antara lain: manfaat ekstrak etanol
pasak bumi untuk afrodisiak (Nainggolan & Simanjuntak 2005), produksi alkaloid pasak bumi dengan kultur in vitro dan kultur suspensi (Siregar et al. 2005), kajian potensi dan ekologi pasak bumi di Bengkulu (Heriyanto et al. 2006) dan kajian potensi pasak bumi di TNGL (Setyowati 2007). Belum ada satupun laporan mengenai teknik perbanyakan tanaman pasak bumi di Indonesia dan keragaman genetiknya padahal informasi tersebut penting dalam rangka kegiatan pemuliaan dan konservasi maupun usaha pemenuhan kebutuhan bahan baku obat. Berdasarkan alasan tersebut maka perlu dilakukan penelitian ” Teknik Perbanyakan dan Kekerabatan Genetik Pasak Bumi”. Adapun tujuan penelitan ini adalah: (1) Mendapatkan informasi mengenai perbanyakan tanaman pasak bumi secara generatif dan secara vegetatif dengan teknik stek pucuk serta media pertumbuhan yang sesuai, (2) Mendapatkan informasi mengenai kekerabatan genetik tanaman pasak bumi asal Jambi dari hasil perbanyakan secara generatif dengan penanda RAPD. Untuk perbanyakan tanaman secara generatif, bahan reproduktif tanaman diperoleh dari daerah Bukit Sari, Jambi, kemudian dilakukan kegiatan penanganan benih awal dan dikecambahkan dan disemaikan dengan media yang berbeda. Pada perbanyakan dengan stek pucuk, bahan tanaman diambil dari hasil perbanyakan secara generatif yang berumur 7 bulan. Prosedur penanaman dan pemeliharaan stek disesuaikan dengan prosedur yang ada di KOFFCO system yang ada di rumah kaca Badan Litbang Kehutanan dan Konservasi Alam, Bogor. Pada kegiatan analisis genetik bahan yang digunakan adalah sampel daun dari 20 individu, kemudian dilakukan ekstraksi dengan metode CTAB dan untuk amplifikasi digunakan 7 primer dari golongan OPY dan OPC dengan teknik PCR-RAPD. Hasil perkembangbiakan dengan biji menunjukkan persentase berkecambah rata-rata sebesar 34% pada media kombinasi pasir tanah, sedangkan persentase terendah diperoleh pada media kombinasi pasir kompos yaitu sebesar 14%. Sidik ragam menunjukkan bahwa media tidak berpengaruh terhadap pertumbuhan pucuk semai (kecuali jumlah malai daun), namun berpengaruh terhadap jumlah
10
dan panjang akar yang dihasilkan.
Media yang menghasilkan variabel
pertumbuhan terbaik adalah media arang sekam murni. Pada perbanyakan dengan teknik stek pucuk, perbedaan media berpengaruh terhadap panjang akar sekunder pasak bumi, sedangkan pemberian Rootone F mempengaruhi persentase stek berakar, panjang akar primer dan jumlah akar primer dan sekunder. Akar stek pasak bumi berasal dari primordia akar yang berkembang menjadi akar adventif. Hasil amplifikasi dengan PCR-RAPD menunjukkan bahwa jumlah fragmen pita DNA hasil amplifikasi 7 primer terpilih (OPY-15, OPY-17, OPY-6, OPY-8, OPY-19, OPY 20 dan OPC 7) berkisar antara 4-11 pita dengan kisaran pita yang teramplifikasi antara 100-1200bp, tergantung pada jenis primer yang digunakan. Dari total 56 pita yang teramplifikasi 78,57% atau sebanyak 44 pita menunjukkan polimorfik, sedangkan hasil analisis dengan Popgene diketahui nilai keragaman (He) sebesar 0,3076. Nilai persentase lokus polimorfik dan keragaman pasak bumi yang diteliti lebih tinggi dibandingkan dengan penelitian yang dilakukan oleh Osman et al. (2003) yaitu antara 45%-75% dan 0,182-0,246 dengan penanda SNP, dan lebih tinggi jika dibandingkan dengan tanaman daerah tropis lainnya seperti konifer (He = 0,145; Hamrick et al. 1992), eukaliptus (He = 0,182; Moran & Hopper 1987), namun lebih rendah dibandingkan tanaman berkayu, seperti kamper (He = 0,369; Lee et al. 2000) dengan menggunakan metode Isozim. Hal ini mengindikasikan bahwa heterogenitas individu pasak bumi dan kemampuan adaptasi terhadap perubahan lingkungan yang baik cuup tinggi. Menurut Li et al. (2006) pada beberapa kasus hal tersebut bisa disebabkan oleh tingginya instabilitas pada tanaman. Pengelompokan tersebut kemungkinan disebabkan adanya dua tipe penyerbukan yang berbeda (outcrossing dan kleistogami) sehingga benih yang dihasilkan juga berbeda. Individu pada kelompok I diduga merupakan hasil dari outcrossing, sedangkan kelompok II merupakan hasil dari kleistogami. Kemungkinan lain adalah benih berasal dari tanaman pasak bumi lain yang terbawa oleh burung, tikus atau terbawa oleh air sampai ke bawah pohon induk tersebut.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2007 ini adalah Teknik Perbanyakan dan Kekerabatan Genetik Pasak Bumi (Eurycoma longifolia Jack) Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Koordinator Kopertis Wilayah I Sumut NAD dan Rektor Universitas Tri Karya Medan atas kesempatan yang telah diberikan untuk melanjutkan studi ke Program Studi Ilmu Pengetahuan Kehutanan Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Terima kasih juga disampaikan kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi (Dirjen DIKTI) atas program Beasiswa Pendidikan Pascasarjana (BPPS) T.A 2006-2008. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Supriyanto dan Dr Iskandar Z. Siregar selaku komisi pembimbing yang telah memberikan arahan, bimbingan dan motivasi dalam penyelesaian karya ilmiah ini. Keberhasilan ini juga tidak terlepas dari doa dan dukungan kedua orang tua, suami dan keluarga, terimakasih untuk semuanya. Semoga dengan adanya karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Agustus 2008 Arida Susilowati
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Pekalongan, Jawa Tengah pada tanggal 13 Januari 1980 sebagai anak ketiga dari pasangan bapak Sukotjo dan ibu Sukarti. Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Manajemen Hutan, Fakultas Kehutanan, IPB, lulus pada bulan September 2003.
Kesempatan untuk melanjutkan ke
program master pada Progran Studi Ilmu Pengetahuan Kehutanan, sekolah Pascasarjana IPB diperoleh pada tahun ajaran 2006/2007. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Departemen Pendidikan Nasional Republik Indonesia. Penulis bekerja sebagai staf pengajar di Kopertis Wilayah I Sumut-NAD Beberapa mata kuliah yang pernah diasuh antara lain Bioteknologi Tanaman, Pemuliaan Tanaman dan Teknologi Benih.
Bogor, Agustus 2008
Arida Susilowati
ii
DAFTAR ISI Hal DAFTAR TABEL ........................................................................................ iii DAFTAR GAMBAR .................................................................................... iv DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. vi PENDAHULUAN ........................................................................................ 1 Latar Belakang....................................................................................... 1 Perumusan Masalah ............................................................................... 3 Tujuan ................................................................................................... 4 Kerangka Pemikiran............................................................................... 4 Manfaat.................................................................................................. 5 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................... 6 Pasak Bumi (Eurycoma longifolia Jack) ................................................ 6 Perbanyakan Tanaman Secara Generatif................................................. 11 Kekerabatan Genetik.............................................................................. 13 Perbanyakan Secara Vegetatif Dengan Stek Pucuk................................. 15 METODOLOGI PENELITIAN .................................................................... 19 Perbanyakan Tanaman Secara Generatif................................................. 19 Kekerabatan Genetik Antar Individu Pasak Bumi................................... 22 Perbanyakan Tanaman Dengan Stek Pucuk............................................ 27 HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................... 33 Perbanyakan Tanaman Secara Generatif................................................. 33 Kekerabatan Genetik Antar Individu Pasak Bumi .................................. 44 Perbanyakan Tanaman Dengan Stek Pucuk............................................ 51 KESIMPULAN ............................................................................................ 59 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 61 LAMPIRAN ................................................................................................. 66
iii
DAFTAR TABEL Hal 1
Beberapa kajian etnobotanis terhadap tanaman pasak bumi
8
2
Beberapa kajian farmakologis terhadap tanaman pasak bumi
9
3
Komposisi arang sekam padi
13
4
Kandungan bahan aktif Rootone f
17
5
Komposisi bahan untuk ekstraksi DNA
23
6
Urutan basa nukleotida 28 primer (Operon Technology)
24
7
Komposisi bahan untuk reaksi PCR
25
8
Tahapan dalam proses PCR
26
9
Rekapitulasi sidik ragam pertumbuhan semai pasak bumi selama 20 minggu Pengaruh media semai terhadap sebaran akar semai pasak bumi
35
10 11 12
Primer RAPD yang digunakan serta jumlah pita yang dihasilkan dari 20 individu semai pasak bumi Rekapitulasi hasil sidik ragam dan nilai rata-rata terhadap beberapa parameter pertumbuhan stek
41 46 51
iv
DAFTAR GAMBAR Hal 1
Kerangka pemikiran perbanyakan tanaman pasak bumi
4
2
Morfologi daun dan buah pasak bumi
7
3
Tanaman pasak bumi umur 6 bulan dan akarnya
7
4
Rumus bangun beberapa kandungan senyawa pasak bumi
9
5
Bentuk bunga pasak bumi
10
6
Tahapan dalam proses PCR
15
7
Prosedur penelitian keragaman genetik
22
8
Cara penilaian pita dengan sistem skoring
26
9
Mekanisme pembuatan media stek
27
10
Bahan tanaman untuk stek pucuk
28
11
Morfologi benih pasak bumi
33
12
Grafik kumulatif perkecambahan benih pasak bumi selama 60 hari
34
13
Tipe kecambah pasak bumi
35
14
Rata-rata tinggi tanaman pasak bumi pada media tumbuh
yang
36
Laju pertumbuhan tinggi semai tanaman pasak bumi selama 20 minggu pada tiga media tumbuh. Pertambahan diameter semai pasak bumi selama 20 minggu dalam tiga media tumbuh. Kekokohan semai pasak bumi selama 20 minggu dalam tiga media tumbuh. Jumlah malai daun pasak bumi yang terbentuk selama 20 minggu dalam tiga media tumbuh
36
berbeda selama 20 minggu 15 16 17 18
37 37 38
19
Panjang akar pasak bumi yang terbentuk dalam tiga media tumbuh.
selama 20 minggu
39
20
Jumlah akar pasak bumi yang terbentuk selama 20 minggu dalam tiga media tumbuh.
40
21
Semai dan distribusi akar pada tiga media semai yang berbeda
42
22
Serangan jamur penyebab busuk akar
44
23
Serangan larva Atteva sciodoxa
44
24
Hasil ekstraksi daun pasak bumi dengan metode CTAB
45
v
25
Foto hasil seleksi primer (gambar (a) primer yang terpilih adalah Y20 & C7, gambar (b) primer yang terpilih adalah Y17, Y15, Y8 dan Y6).
46
26
Hasil amplifikasi RAPD dengan primer OPY-15 dan OPY-17
47
27
Dendrogram jarak genetik
49
28
50
29
Perbedaan morfologi daun dan pucuk pasak bumi hasil perbanyakan cara generatif. Rata-rata persentase hidup stek selama 20 minggu
52
30
Persentase berakar stek selama 20 minggu
52
31
Penampakan stek pucuk pada perlakuan yang berbeda
53
32
Panjang akar stek yang terbentuk selama 20 minggu
54
33
Jumlah akar stek yang terbentuk selama 20 minggu
55
34
Penampang melintang akar stek pasak bumi dengan perbesaran 40x
57
vi
DAFTAR LAMPIRAN Hal 1
Kandungan senyawa kimia pasak bumi
66
2
Foto Hasil Amplifikasi Primer OPY-6, OPY-8, OPY-19, OPY- 20 dan OPC-7 Skoring pita hasil amplifikasi
67
Hasil analisis media tanam dari Lab. Tanah dan Sumberdaya lahan, Faperta IPB Jarak genetik (Nei’s 1972)
70
3 4 5 6 7
Sidik ragam terhadap parameter pertumbuhan semai pasak bumi selama 20 minggu Sidik ragam terhadap parameter pertumbuhan stek pasak bumi selama 20 minggu
68
71 72 73
PENDAHULUAN Latar Belakang Perubahan kebijaksanaan kehutanan dari timber management menjadi resource base management telah mendorong peningkatan usaha pengembangan berbagai komoditi hutan non kayu yang berpeluang sangat besar untuk kesejahteraan masyarakat.
Salah satu usaha yang dilakukan adalah menggali
beberapa produk unggulan melalui pengayaan jenis-jenis tumbuhan yang memiliki nilai ekonomi tinggi seperti tumbuhan obat yang bermanfaat untuk industri farmasi. Berdasarkan data Badan Kesehatan Dunia (WHO) diketahui bahwa sampai saat ini 80% lebih penduduk dunia masih menggantungkan diri terhadap pengobatan tradisional termasuk penggunaan obat yang berasal dari tumbuhan. Indonesia sebagai salah satu negara megabiodiversity
diperkirakan
memiliki sekitar 30.000 jenis tumbuhan yang dapat ditemukan di dalam hutan hujan tropika, dan sekitar 1260 spesies di antaranya berkhasiat sebagai obat. Namun sampai saat ini baru sekitar 180 spesies yang telah digunakan untuk berbagai keperluan industri obat dan jamu, tetapi baru beberapa spesies saja yang telah di budidayakan secara intensif (Supriadi 2001). Pasak bumi (Eurycoma longifolia Jack) merupakan salah satu tumbuhan obat asal hutan yang memiliki banyak khasiat. Berdasarkan kajian farmakologis diperoleh informasi bahwa senyawa canthin pada tumbuhan pasak bumi mampu menghambat pertumbuhan sel kanker (Nurhanan et al. 2005), senyawa turunan eurycomanone sebagai anti malaria (Chan et al.
2005), senyawa quassinoid
berfungsi sebagai anti leukimia, dan prospektif untuk anti HIV (Sindelar et al. 2005), senyawa etanol berfungsi sebagai afrodisiak (Nainggolan & Simanjuntak 2005). Manfaat yang beragam tersebut menyebabkan pasak bumi banyak diekspor ke luar negeri untuk keperluan pembuatan obat herbal. Produk pasak bumi kering memiliki harga cukup mahal, produk berupa cacahan akar (chipped root) harganya 60 USD/kg sedangkan produk berupa ekstrak harganya 80 USD/kg (Sumatera Pasak Bumi 2007).
2
Tingginya permintaan dan mahalnya harga produk, menyebabkan eksploitasi pasak bumi di hutan alam meningkat, karena selama ini pemungutan dan pengolahan pasak bumi hanya mengandalkan pasak bumi liar, bukan berasal dari tanaman budidaya. Hal ini terjadi pula sebagai akibat dari tidak adanya peraturan baik daerah maupun pusat yang berkaitan dengan pengelolaan dan perlindungan pasak bumi. Habitatnya yang hanya di daerah tertentu (sebagian Sumatera dan Kalimantan Timur) menyebabkan pasak bumi diambang kepunahan sehingga perlu adanya upaya konservasi dan teknik budidaya agar keberadaannya tetap terjaga (Sitepu & Sutigno 2001). Bahkan Rifai (1992) menyatakan kondisi populasi pasak bumi asal Indonesia sudah dikategorikan sebagai tumbuhan langka dengan status ’terkikis’. Pengambilan pasak bumi secara liar di hutan alam telah menyebabkan kelangkaan populasinya, bahkan mulai tahun 2001 di Malaysia tumbuhan ini sudah dinyatakan sebagai tumbuhan yang dilindungi.
Akibatnya tekanan
eksploitasi terhadap populasi pasak bumi di Indonesia menjadi semakin meningkat, hal tersebut berpotensi mengakibatkan hilangnya keragaman genetik. Padahal sampai saat ini informasi mengenai keragaman genetik pasak bumi di Indonesia belum diketahui. Penelitian mengenai tumbuhan pasak bumi di Indonesia, masih sedikit dilaporkan.
Beberapa penelitian tersebut diantaranya: manfaat ekstrak etanol
pasak bumi untuk afrodisiak (Nainggolan & Simanjuntak 2005), produksi alkaloid pasak bumi dengan kultur in vitro dan kultur suspensi (Siregar et al. 2005), kajian potensi dan ekologi pasak bumi di Bengkulu (Heriyanto et al. 2006) dan kajian potensi pasak bumi di TNGL (Setyowati 2007). Belum ada satupun laporan mengenai teknik perbanyakan pasak bumi di Indonesia dan keragaman genetiknya padahal informasi tersebut penting dalam rangka kegiatan pemuliaan dan konservasi maupun usaha pemenuhan kebutuhan bahan baku obat, padahal menurut Hadiah (2000) adanya industri jamu yang semakin banyak dan potensi pasak bumi sebagai tumbuhan obat yang bernilai komersil memerlukan pembudidayaan untuk pemanfaatan terus menerus dan dalam jumlah besar Berdasarkan beberapa alasan tersebut maka penelitian mengenai budidaya pasak
3
bumi ini dilakukan untuk mendapatkan informasi awal bagi budidaya tumbuhan ini. Perumusan Masalah Pasak bumi memiliki daerah penyebaran di Semenanjung Malaysia, Sumatera dan Kalimantan. Penyebarannya yang hanya di daerah tertentu, serta pembukaan hutan alam yang terus-menerus untuk keperluan komersil, menyebabkan tumbuhan ini mengalami kepunahan di beberapa lokasi penyebarannya. Selain berakibat kepunahan, eksploitasi besar-besaran juga akan menyebabkan hilangnya sumberdaya genetik tumbuhan tersebut.
Di Pulau
Sumatera hanya beberapa daerah yang diduga masih ditemui tumbuhan pasak bumi yaitu kawasan Leuser, sebagian Provinsi Riau dan kawasan Kerinci Seblat. Menurut Hussein et al. (2005), selama ini perbanyakan pasak bumi hanya mengandalkan biji di alam. Padahal sebagai tumbuhan yang memiliki tipe benih rekalsitran, persentase kecambahnya cenderung rendah dan memerlukan waktu yang cukup lama akibat embrio zigotik yang belum matang pada saat pemencaran. Selain itu perilaku berbunga yang tidak tentu dan pertumbuhannya yang lambat mengakibatkan tumbuhan ini semakin jarang ditemui. Pengambilan tumbuhan pasak bumi secara liar di hutan alam telah menyebabkan kelangkaan populasinya, hal ini berpotensi mengakibatkan hilangnya keragaman genetik. Studi keragaman genetik sangat penting dalam rangka menyediakan informasi untuk kegiatan perbanyakan, domestikasi, program pemuliaan dan sekaligus konservasi sumberdaya genetik (Osman et al. 2003). Berdasarkan permasalahan tersebut maka penelitian ini perlu dilakukan untuk menjawab pertanyaan berikut: 1.
Adakah alternatif untuk memperoleh tumbuhan pasak bumi selain melalui cabutan alam?
2.
Bagaimanakah kekerabatan genetik tumbuhan pasak bumi hasil perbanyakan secara generatif?
4
Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk: 1.
Mendapatkan informasi mengenai perbanyakan tumbuhan pasak bumi secara generatif dan secara vegetatif melalui stek pucuk dengan media pertumbuhan yang sesuai.
2.
Mendapatkan informasi mengenai status kekerabatan genetik pasak bumi asal Jambi hasil perbanyakan secara generatif.
Kerangka Pemikiran Dari rumusan permasalahan tersebut dapat dibuat kerangka pemikiran budidaya tumbuhan pasak bumi disajikan pada Gambar 1. Pasak bumi
Permintaan Meningkat
Harga mahal
Populasi di alam menurun
Teknik budidaya
Secara generatif
Cabutan alam
biji
Status kekerabatan genetik Tanaman beragam ?!
Stek pucuk
Bibit
Gambar 1 Kerangka pemikiran penelitian perbanyakan tumbuhan pasak bumi.
5
Manfaat Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi awal dalam rangka budidaya dan konservasi pasak bumi di Indonesia.
TINJAUAN PUSTAKA Pasak Bumi (Eurycoma Longifolia Jack) Menurut Indonesian Botanic Garden (1998) Eurycoma Longifolia Jack memiliki beberapa nama lokal antara lain: penawar pahit, bedara pahit, bedara puteh, tongkat ali, lempedu pahit, payung ali, tongkat baginda, muntah bumi, petala bumi, akar jangat seinang, tungke ali, pasak bumi (Malaysia, Sumatera, Kalimantan), dan tung saw (Thailand).
Taksonomi dan deskripsi pohon Menurut Angiosperm Phylogeny Group (2003), kedudukan taksonomi pasak bumi adalah sebagai berikut: Dunia : Plantae Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Ordo : Sapindales Famili : Simaroubaceae Genus : Eurycoma Jenis : Eurycoma longifolia Jack
Indonesian Botanic Garden (1998) menyatakan pasak bumi umumnya berbentuk semak, atau pohon kecil yang tingginya jarang mencapai 10 meter, tetapi ada juga yang tingginya mencapai lebih dari 15 meter dan diameter mencapai 15 cm. Batang : Umumnya tidak bercabang, tetapi ada juga yang bercabang sedikit menyerupai payung dengan kedudukan daunnya melingkar (rosette), batangnya kokoh berwarna coklat keabu-abuan, licin. Daun
:
Daunnya majemuk menyirip, jumlahnya ganjil, panjang 0,3-1 meter dengan anak daun berjumlah 20-30 pasang, berbentuk oblong, bergelombang, warna anak daunnya hijau tua berukuran 5-25 cm x 1,25-3 cm, pinggirnya bergelombang, tangkai daunya berwarna coklat kehitaman.
7
Bunga : Bersifat monoceous atau dioceous, tetapi biasanya dijumpai sebagai dioceous. Berwarna merah jingga, lebar bunga 0,6 cm, berbulu halus dengan benjolan kelenjar di ujungnya, ada 2 (dua) kelompok tumbuhan yaitu tumbuhan berbunga jantan (tidak menghasilkan buah) dan berbunga betina (mampu menghasilkan buah). Buah : Panjang 1,25 cm, berbentuk oblong, ketika masak warnanya menjadi kuning kemudian memerah.
Berdasarkan sifat-sifatnya pasak bumi dikelompokkan bersama dengan marga quassia, picrasma, brucea dan soulamea dalam suku Simarubaceae yang terdiri dari tumbuhan yang mengandung substansi pahit (bitter plant). Morfologi daun, buah serta akar tumbuhan pasak bumi terlihat pada Gambar 2 dan Gambar 3.
Gambar 2 Morfologi daun dan buah pasak bumi.
Gambar 3 Pasak bumi umur 6 bulan dan akarnya.
Habitat dan kegunaan Menurut Wong et al. (1995) tumbuhan pasak bumi dijumpai pada tanah masam, berpasir dan beraerasi baik pada ketinggian dibawah 1200 m.dpl. Biasanya
ditemukan
pada
hutan
primer
dan
sekunder
Dipterocarpaceae dan juga pada hutan kerangas dan sub montana.
dengan
jenis
8
Heyne (1987) mengatakan pasak bumi merupakan pohon pantai yang bagus menarik, tingginya hingga 6 m, berasal dari bagian barat nusantara, tidak ditemukan di Jawa. Tumbuhan pasak bumi telah banyak dimanfaatkan oleh masyarakat tradisional untuk keperluan penyembuhan berbagai penyakit. Hampir seluruh bagian tumbuhan ini mengandung substansi pahit yang dapat digunakan untuk obat. Beberapa kajian etnobotanis yang telah dilakukan terhadap tumbuhan pasak bumi dapat disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 Beberapa hasil kajian etnobotanis terhadap tumbuhan pasak bumi Bagian tumbuhan Akar
Batang
Daun Bunga dan buah Kayu
Manfaat Akar tumbuhan ini dicampur dengan tumbuhan obat lain seperti kayu manis dan digunakan untuk tonik penyehat di Sabah. Selain itu di Malaysia kulit akarnya digunakan juga sebagai penawar demam, penyembuh luka-luka di gusi atau gangguan cacing serta tonikum setelah melahirkan (Wong KM & E. Supadmo 1995). Kulit batang digunakan untuk koagulan darah setelah melahirkan, sedangkan di Kalimantan dan Sabah kulit batang digunakan untuk mengobati nyeri pada tulang (Hadiah 2000 ). Daun pasak bumi yang muda dapat dimakan untuk pengobatan sakit perut. Di Vietnam bunga dan buah pasak bumi digunakan untuk obat desentri. Menurut sifat fisis, mekanis dan keawetan, kayu pasak bumi memiliki berat jenis 0,65, kelas awet 4-5, dan kelas kuat II. Kayu golongan ini dapat digunakan untuk keperluan konstruksi dan mebel (Oey Djoen Seng 1990).
Beberapa penelitian farmakologis yang telah dilakukan untuk mengetahui manfaat pasak bumi dapat disajikan pada Tabel 2.
9
Tabel 2 Beberapa penelitian farmakologis terhadap manfaat tumbuhan pasak bumi No
Manfaat
Sumber
1 2 3
afrodisiak antihyperglycaemic anti malaria
4 5 6
anti kanker anti HIV,anti leukimia anti proliferatif
Ang et al. 1999 Husen et al. 2004 Chan et al. 2005 dan Ridzuan et al. 2005 Nurhanan et al. 2005 Sindelar et al. 2005 Ueda J et al. 2002
Kandungan kimia Pasak bumi memiliki kandungan senyawa kimia yang banyak digunakan untuk keperluan obat-obatan. Terdapat 65 jenis senyawa kimia yang terkandung pada tumbuhan pasak bumi. Adapun kandungan pasak bumi secara lengkap dapat disajikan pada Lampiran 1. Rumus bangun beberapa kandungan senyawa penting pasak bumi disajikan pada Gambar 4.
Gambar 4 Rumus bangun beberapa kandungan senyawa pasak bumi.
10
Biologi reproduksi dan tipe benih pasak bumi Pasak bumi terdiri dari 2 tipe tumbuhan yaitu dioceous dan monoceous. Jenis dioceous tergolong unik karena terdiri dari pohon jantan dan pohon betina. Pohon jantan dapat menghasilkan buah namun gugur pada saat muda selain itu memliki bunga yang dapat tumbuh namun putiknya steril, sedangkan pohon betina mampu menghasilkan benih dan memiliki benang sari namun steril, oleh karena itu proses penyerbukannya kemungkinan dibantu oleh serangga dan penyerbukan silang (Padua et al. 1999). Bunga jantan dan betina pada pasak bumi dapat dibedakan secara mudah berdasarkan ukuran benangsarinya. Bunga betina memiliki benangsari yang besar, sedangkan bunga jantan memiliki benangsari yang tipis dan kecil (Gambar 5).
(a)
(b)
Gambar 5 Bentuk bunga pasak bumi. (a) bunga jantan, (b) bunga betina. (sumber Wong K.M & Soepadmo 1995)
Pada beberapa kasus proses penyerbukan dan pembuahan terjadi pada saat bunga masih belum membuka (penyerbukan tertutup/ kleistogami). Letak benang sari yang lebih rendah daripada kepala putik menyebabkan proses penyerbukan pada tipe ini sulit dilakukan, proses penyerbukan hanya terjadi ketika ada vektor yang dapat menggerakkan bunga sehingga putik dan benangsari bertemu (Hadiah 2000). Pasak bumi memiliki tipe benih rekalsitran. Persentase perkecambahan pasak bumi yang terjadi di habitat alamnya sangat rendah serta membutuhkan waktu yang cukup lama, hal ini disebabkan karena adanya embrio yang belum cukup masak pada saat pemencaran (Hussein et al. 2005). Budidaya pasak bumi belum pernah dilaporkan, sehingga belum ada informasi mengenai persentase kecambahnya, kualitas bibit yang dihasilkan dan parameter lainnya.
11
Perbanyakan Tanaman Secara Generatif
Perkecambahan benih Perkecambahan benih adalah proses pembentukan organ tumbuhan yang berasal dari benih yang ditandai dengan munculnya radikula untuk menjadi bibit, atau pengaktifan kembali aktifitas pertumbuhan embrionik di dalam biji untuk kemudian membentuk bibit (seedling). Secara morfologis suatu biji yang sedang berkecambah (germinate) umumnya ditandai dengan terlihatnya akar (radikula) atau daun (plumula) yang menonjol keluar dari biji.
Media tumbuh Media tumbuh merupaka elemen penting bagi tumbuhan karena merupakan tempat berjangkarnya akar, penompang batang agar dapat berdiri kokoh dan juga sebagai sumber hara dan mineral yang diperlukan bagi kelangsungan hidupnya. Media tumbuh yang baik harus memenuhi persyaratan fisik (tekstur, struktur, porositas dan konsistensi) dan kimia (pH, unsur hara mikro dan makro). a. Tanah Tanah yang baik untuk usaha penanaman adalah tanah yang mampu berfungsi baik untuk penopang mekanis, mampu menahan air sesuai keperluan tumbuhan, mampu menyerap kelebihan air (porous), menjamin terjadinya pertukaran gas (aerasi) yang baik serta mampu menyediakan unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan tumbuhan. Tanah harus subur, tidak asam atau basa, dalam, dan berdrainase baik agar terhindar dari terendam air, tetapi cukup menyimpan air sehingga tidak terjadi kekeringan. b. Pasir Pasir merupakan media yang mudah tersedia bersih dan daya rekatnya rendah. Pasir tidak menyimpan kelembaban sehingga membutuhkan frekuensi penyimpanan yang lebih. Penggunaan tunggal tanpa adanya campuran media lain akan membuat pasir bersifat kasar sehingga memberikan hasil yang baik (Hartmann et al. 1997).
12
c. Kompos Kompos merupakan bahan organik yang berfungsi sebagai pupuk. Selain itu dapat memperbaiki sifat fisik tanah karena tanah remah dan mikroba-mikroba tanah yang bermanfaat dapat hidup dengan subur (Wudianto 1998). Murbandono (2001) menjelaskan bahwa bahan organik yang telah terkompos dengan baik mempunyai banyak peranan antara lain memperbesar daya ikat tanah yang berpasir sehingga struktur tanah akan lebih baik, mempertinggi kemampuan tanah untuk menyerap air dan menyediakannya untuk kepentingan tumbuhan, memperbaiki drainase dan tata udara tanah serta mempertinggi daya ikat tanah terhadap hara sehingga tidak mudah larut oleh air hujan atau pengairan. Kompos dapat mempengaruhi kesuburan tanah terutama sifat fisik tanah, sifat kimia dan biologi tanah. Kompos juga mampu menyediakan unsur hara seperti N, P, K, Mg, Fe, S, Mn dan Cu, sehingga dapat memperbaiki sifat kimia tanah.
Jumlah populasi mikroorganisme tanah juga akan meningkat akibat
pemberian kompos. d. Arang sekam Sekam dan arang sekam padi sering digunakan di persemaian. Arang yang berwarna hitam dapat menyerap panas sehingga suhu tanah naik dan mempercepat pertumbuhan semai. Sekam padi sangat baik sebagai pendukung media atau pengganti tanah pertanian. Apabila sekam padi mengalami penguraian, maka sekam akan membebaskan unsur P dan K dengan kadar yang cukup berarti. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Harsono (2002) menunjukkan bahwa arang sekam memiliki kandungan silika yang tinggi (94-96%) serta kandungan unsur lain yang mendukung pertumbuhan tumbuhan. Adanya kandungan silika yang tinggi tersebut mampu menyerap kadar unsur yang berlebih. arang sekam padi dapat disajikan pada Tabel 3. Tabel 3 Komposisi arang sekam padi Unsur Na Fe Ca K Mg Si P Cl
Persentase (%) 0,0065 0,0043 0,0006 0,0059 0,0010 56,8081 0,0041 0,0924
Komposisi
13
Kekerabatan Genetik Perkembangbiakan secara generatif mempunyai arti yang penting bagi genetika, karena pada pembiakan ini terjadi terlebih dahulu pembuahan antara gamet jantan (n, haploid) dan betina (n, haploid) sehingga keturunan yang dihasilkan akan memiliki sifat yang dimiliki oleh salah satu atau kedua induknya (Suryo 1986). Pola variasi genetik suatu jenis ditentukan oleh sistem perkawinan yang terjadi dan akan mempengaruhi struktur genetik dan dinamikan populasi dalam jenis tersebut. Dengan mengetahui proses-proses perkawinan yang terjadi pada suatu jenis akan bermanfaat bagi efektifitas konservasi sumberdaya genetik dan optimalisasi upaya pemuliaan genetik jenis tersebut. Pasak bumi merupakan tipe tumbuhan dioceous dan hermaprodit. Pada tumbuhan tipe hermaprodit mampu melakukan selfing dan outcrossing dengan derajat yang dipengaruhi oleh kondisi lingkungan (Fingkeldey 2005). Pengetahuan mengenai kekerabatan genetik antar individu genotip sangat berguna bagi pemulia tumbuhan.
Kekerabatan ini diperkirakan berdasarkan
analisis keturunan, karakter morfologi, kompatibilitas seksual dan klasifikasi taksonomi (Renganayaki et al. 2001).
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA ) RAPD merupakan salah satu metode penanda genetik berbasis DNA yang telah cukup banyak digunakan untuk menilai keragaman genetik tumbuhan hutan. RAPD memiliki keunggulan dibandingkan jenis penanda lain yaitu tidak dipengaruhi oleh umur tumbuhan, mudah dilakukan, biaya relatif murah dan hasil yang cepat diperoleh, namun salah satu kekurangan dari teknik ini adalah hasilnya yang terkadang tidak konsisten, namun hal tersebut dapat diminimalisir dengan prosedur teknik yang hati-hati dan teliti. Teknik RAPD didasarkan pada penggunaan primer sekuens Nukleotida yang berubah-ubah untuk mengamplifikasi segmen genomik DNA acak melalui pemanfaatan
PCR
(Polymerase
Chain
Reaction)
sehingga
menujukkan
polimorfisme. Primer untuk analisis RAPD mengandung 9-10 basa panjangnya. Polimorfisme yang teramati dengan menggunakan RAPD diyakini karena adanya
14
perubahan basa tunggal yang mencegah perpasangan primer dan sekuens target, delesi sisi utama, insersi atau delesi yang modifikasi ukuran DNA. Keuntungan metode ini adalah set oligonukleotida yang sama dapat digunakan untuk berbagai spesies atau organisme dan setelah amplifikasi selama 2-4 jam polimorfisme ni dapat diamati secara langsung dengan agarose normal gel elektroforesis (Nasir 2002). Beberapa alasan pemilihan teknik RAPD untuk menganalisis keragaman genetik antara lain tidak membutuhkan latar belakang pengetahuan tentang genom yang akan dianalisis, tersedianya primer yang secara universal dapat digunakan untuk organisme prokariot maupun eukariot, mampu menghasilkan karakter yang relatif tidak terbatas jumlahnya, bahan-bahan yang digunakan relatif lebih murah, mudah dalam preparasi, dan relatif cepat memberikan hasil. Sampai saat ini studi mengenai kekerabatan genetik tumbuhan pasak bumi yang ada di Indonesia belum pernah dilaporkan.
PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR adalah suatu metode untuk menggandakan atau mengamplifikasi ADN yang diisolasi pada sebuah tabung reaksi kecil dengan melalui replikasi berulang (Finkeldey 2005). Secara skematis proses PCR dapat disajikan pada Gambar 6. Menurut
Bernard
(1998),
PCR
memperbanyak potongan DNA spesifik.
merupakan
suatu
teknik
untuk
Ada 4 komponen utama yang
dibutuhkan untuk melakukan proses PCR yaitu 1). DNA target, 2). Primer, 3). DNA polymerase dan 4). 4 dNTP.
15
Gambar 6 Tahapan dalam proses PCR (Anonim 2007).
Produk PCR dari individu pohon yang berbeda akan menghasilkan panjang sekuen yang berbeda pula. Perbedaan ini akan dapat dideteksi dengan elektroforesis dengan gel agarose.
Perbanyakan Secara Vegetatif dengan Stek Pucuk Pembiakan vegetatif merupakan pembiakan tumbuhan yang menggunakan salah satu bagian vegetatif tumbuhan itu sendiri misalnya akar, batang, daun, pucuk, jaringan bunga, jaringan meristem dan sel tanpa melibatkan proses perkawinan atau pembuahan. Zobel dan Talbert (1984) menyatakan bahwa pembiakan vegetatif memiliki beberapa kegunaan khususnya dibidang kehutanan, yaitu untuk : 1.
Memperbanyak genotipe-genotipe unggul yang diinginkan.
2.
Menilai genotipe dan interaksinya dengan lingkungan.
3.
Memperoleh keuntungan genetik maksimum.
Menurut
Sorianegara
dan
Djamhuri
(1979)
tumbuhan
dapat
dikembangbiakan secara vegetatif karena memiliki sifat totipotensi dan dedeferensiasi sel.
16
Pada dasarnya perbanyakan tumbuhan secara stek merupakan teknik perbanyakan dengan cara memindahkan bagian tumbuhan dari induk kemudian menumbuhkannya kembali menjadi tumbuhan utuh. Teknik stek ini dibedakan berdasarkan bagian tumbuhan induk yang digunakan untuk perbanyakan antara lain batang, pucuk, daun, maupun akar (Bir 2006).
Faktor yang mempengaruhi keberhasilan stek pucuk. Keberhasilan stek ditentukan oleh kondisi lingkungan yang ideal bagi berlangsungnya proses fotosintesis secara optimal dan transpirasi yang seimbang. Kedua proses fisiologis tersebut sangat berperan terhadap metabolisme stek untuk pembentukan akar.
Dari serangkaian penelitian diketahui bahwa tiga faktor
lingkungan yang sangat berperan dalam pembentukan akar stek adalah kelembaban, temperatur dan intensitas cahaya.
Ketiga faktor tersebut
mempengaruhi besaran perbedaan tekanan uap daun dan udara (leaf to air pressure deficit/VPD) pada stek (Sakai et al. 2002). Menurut Toenyan et al. (2006), keberhasilan teknik stek dapat dilihat dari pembentukan akar. Beberapa faktor yang mempengaruhi pembentukan perakaran stek antara lain: nutrisi/karbohidrat/nitrogen, juvenility, pemilihan waktu/timing, wounding & girlding, serta hormon. Teknik stek pucuk KOFFCO (Komatsu-FORDA Fogging Cooling System) merupakan teknologi yang dikembangkan untuk perbanyakan massal jenis-jenis meranti dan jenis indigenous lainnya. Pengembangan teknik KOFFCO melalui teknik pendinginan rumah kaca meliputi pengkabutan, proses pembuatan stek, pembuatan media, proses perawatan bibit stek pada tahap pembentukan akar dan tahap adaptasi stek di persemaian.
Zat pengatur tumbuh (ZPT) ZPT adalah salah satu bahan sintesis atau hormon tumbuh yang mempengaruhi proses pertumbuhan dan perkembangan tumbuhan melalui pembelahan sel, pembesaran sel dan deferensiasi. Pengaturan pertumbuhan ini dilaksanakan dengan cara pembentukan hormon-hormon, mempengaruhi sistem
17
hormon, pengrusakan, translokasi, atau dengan perubahan tempat pertumbuhan hormon. Wattimena et al. (1992) membedakan 6 (enam) kelompok zat pengatur tumbuh yaitu: auksin, giberalin, sitokinin, asam absisik (ABA), etilen dan retardan.
Auksin adalah jenis senyawa yang mengatur segala bentuk gejala
pembentukan organ atau jaringan tumbuhan dan dapat aktif diluar titik tumbuhnya dalam jumlah yang sangat sedikit. Menurut Hartmann et al. (1997), pemberian auksin bertujuan untuk meningkatkan persentase stek berakar, meningkatkan jumlah dan kualitas akar serta menyeragamkan kualitas akar Yasman dan Hernawan (2002) mengemukakan bahwa sebenarnya hormon telah tersedia secara alami pada tumbuhan, namun tetap diberikan pada stek dengan
tujuan
untuk:1).
Meningkatkan
kemampuan
stek
berakar;
2).
Mempercepat proses pertumbuhan akar; 3). Meningkatkan jumlah dan kualitas akar dan 4) Mengurangi keragaman jumlah dan kualitas perakaran. Rootone F merupakan salah satu hormon penumbuh akar yang diperdagangkan dalam bentuk serbuk berwarna putih, tidak larut dalam air dan berguna mempercepat dan memperbanyak pertumbuhan akar-akar baru. Bahan aktif yang terkandung dalam hormon penumbuh akar Rootone-F dapat disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4 Kandungan bahan aktif Rootone F Bahan Aktif 1-Napthalena Acetamid 2-Methyl-1-Napthalena Acetic Acid 2-Methyl-1-Napthalena Acetamida Indole-3-Butyric Acid Thiram Inert Ingredient
Komposisi 0,067 % 0,033 % 0,013 % 0,057 % 4,000 % 95,330 %
Senyawa yang memiliki inti napthalena berfungsi memperbanyak dan mendorong timbulnya suatu perakaran sedangkan senyawa Indole bermanfaat untuk memperbanyak dan mempercepat perakaran. Selain itu terdapat Thiram yang berfungsi sebagai fungisida.
18
Media tumbuh Menurut Sakai dan Subiakto (2007), pemilihan media stek harus memperhatikan 3 (tiga) karakteristik yaitu: 1. Kandungan kimia. Kandungan kimia yang harus diperhatikan adalah, kadar garam, tingkat keasaman dan tingkat ionisasi media. Kandungan kimia yang ekstrim akan menyebabkan gangguan selama proses pembentukan akar stek. Media yang baik adalah media yang memiliki kandungan kimia minimal, seperti kadar garam yang rendah, pH yang netral dan tingkat ionisasi yang rendah. 2. Sifat fisik Sifat fisik lebih diarahkan pada karakteristik fisik dari media yang digunakan seperti kemampuan mengikat air, dan porositas media. Porositas media yang dicirikan dari tingginya unsur udara (aerasi) dalam media merupakan unsur fisik yang penting untuk media stek. Sehingga media stek yang ideal adalah media yang dapat memiliki aerasi yang cukup namun dapat mengikat air. 3. Kandungan mikrobiologi. Media tumbuh yang baik adalah media yang higienis atau populasi mikrobanya rendah. Untuk meminimalkan kandungan mikroorganisme di dalam media dapat dilakukan dengan penjemuran atau pengukusan. Penelitian stek pucuk pada tumbuhan pasak bumi belum pernah dilaporkan, sehingga belum ada informasi mengenai persentase keberhasilan dan kualitas bibit yang dihasilkan serta media tanam yang digunakan.
METODOLOGI PENELITIAN
Percobaan I. Perbanyakan Tanaman Secara Generatif Tempat dan waktu penelitian Perbanyakan tanaman secara generatif dilaksanakan di rumah kaca Laboratorium Silvikultur, Fakultas Kehutanan IPB selama 6 bulan (Januari-Juli 2007). Alat dan bahan Alat yang digunakan untuk untuk perkecambahan benih dan perbanyakan secara generatif antara lain bak kecambah, sprayer, polibag, cangkul dan alat-alat tulis dan sungkup plastik untuk naungan. Sedangkan bahan yang digunakan untuk perbanyakan generatif adalah top soil, arang sekam dan pasir (untuk media tanam), Dithane M-45 sebagai fungisida, Decis® (insektisida) dan pupuk NPK. Metode Penelitian Eksplorasi bahan tanaman. Eksplorasi bahan tanaman dilakukan dengan mengambil benih pasak bumi dari sebuah pohon induk yang sehat, dengan diameter ± 20 cm dan tinggi 10 meter di areal hutan dataran rendah, Bukit Sari, Kabupaten Kerinci, Provinsi Jambi. Benih tersebut kemudian disimpan dalam wadah kedap udara agar kelembabannya tidak mengalami penurunan.
Persiapan benih dan media kecambah Benih pasak bumi yang akan dikecambahkan dibersihkan terlebih dahulu dari sisa daging buah yang masih melekat dengan cara pengerikan. Benih yang telah dibersihkan tersebut kemudian dipisahkan dari kotoran benih untuk mendapatkan benih murni, benih jelek selanjutnya dibuang, kemudian dilakukan penimbangan untuk mengetahui berat 1000 benih.
20
Untuk kegiatan perkecambahan benih media yang digunakan merupakan kombinasi dari 4 (empat) media dasar yaitu: pasir murni; pasir : tanah (1/1, v/v); pasir : arang sekam (1/1, v/v); pasir : kompos (1/1, v/v). Media dibersihkan dari kotoran dan diayak, kemudian disangrai selama 15 menit hingga tanah menjadi panas dengan tujuan untuk mensterilkan media dari pathogen yang terbawa oleh tanah.
Benih sebanyak 360 butir dikecambahkan
pada 4 (empat) media kecambah yang berbeda kemudian diletakkan di rumah kaca. Penyapihan Semai Setelah berumur ± 8 minggu dan siap tanam, tanaman dipindahkan ke media semai yang terdiri dari 3 (tiga) perlakuan yaitu : M1 = arang sekam : tanah (1/1, v/v); M2 = arang sekam murni; M3 = pasir : tanah (1/1, v/v).
Variabel yang diamati Variabel yang diamati dalam perkecambahan benih ini adalah : 1. Diameter benih, berat 1000 butir benih 2. Hari berkecambah. Pengamatan hari berkecambah dilakukan mulai dari saat benih ditanam hingga benih berkecambah. 3. Persentase
kecambah.
Persentase
kecambah
dihitung
dengan
cara
membandingkan antara jumlah benih yang berkecambah dengan jumlah seluruh benih yang ditanam. Persentase Kecambah =
Jumlah benih yang berkecambah x 100 % Jumlah seluruh benih yang dikecambahkan
4. Pengamatan visual. Pengamatan visual dilakukan dengan melihat penampilan fisik kecambah yang dihasilkan pada 4 (empat) media kecambah yang berbeda selama waktu pengamatan. 5. Rasio panjang pucuk/akar. Rasio panjang pucuk/ akar dihitung dengan membandingkan panjang pucuk dengan panjang akarnya. 6. Tinggi semai. Pengukuran Tinggi semai dilakukan setiap 7 hari selama 5 bulan dimulai saat penyapihan.
21
7. Diameter semai. Pengukuran diameter semai dilakukan pada awal dan akhir pengamatan. 8. Kekokohan semai. Kekokohan semai dihitung dengan membandingkan tinggi akhir dan diameter akhir semai. Kekokohan Semai =
Tinggi semai akhir (cm) Diameter semai akhir (cm)
9. Jumlah akar primer dan sekunder. Pengukuran jumlah akar dilakukan pada akhir pengamatan. 10. Panjang akar primer dan sekunder. Pengukuran jumlah akar dilakukan pada akhir pengamatan.
Rancangan percobaan dan analisis data Pada perkecambahan benih ini rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan perlakuan media tanam (M1: arang sekam-tanah dengan perbandingan 1:1; M2: arang sekam murni dan M3: kombinasi pasir- tanah dengan perbandingan 1:1(v/v)
dan ulangan masing-
masing 10 semai. Model statistik linier dari rancangan percobaan ini dinyatakan dalam persamaan sebagai berikut:
Yij = µ + αi + Σij Keterangan : Yij
= Respon pengamatan pada perlakuan media tanam taraf ke-i dan ulangan ke-j µ = Nilai rata-rata umum αi = Pengaruh perlakuan media tanam taraf ke-i Σij = Sisaan acak dari satuan percobaan ulangan ke-j yang dikenai perlakuan media tanam taraf ke-i i = 1,2,3,… j = 1,2,3,… Data selanjutnya dianalisa dengan ANOVA dan faktor yang berpengaruh
nyata dilakukan uji lanjut dengan DNMRT.
22
Percobaan II. Kekerabatan antar Individu Semai Pasak Bumi Tempat dan waktu penelitian Penelitian mengenai kekerabatan tanaman pasak bumi dilaksanakan di Laboratorium Genetika, Departemen Silvikultur Fakultas Kehutanan IPB, sedangkan untuk dokumentasi hasil PCR dilaksanakan di Laboratorium Biorin, PAU IPB. Waktu Penelitian selama 5 bulan (Nopember 2007-Maret 2008).
Alat dan bahan Untuk analisis keragaman genetik tanaman pasak bumi alat yang digunakan adalah tube, gelas piala, gelas ukur, sarung tangan, UV transiluminator, kamera digital, mortar dan pestel, hotplate, stirer, neraca analitik, vortex dan Peltier Thermal Cycler, pipet, freezer dan sentrifuse. Bahan tanaman yang digunakan adalah sampel daun pasak bumi asal Jambi sebanyak 20 buah hasil perbanyakan generatif yang berumur 7 bulan. Sedangkan
bahan
kimia
yang
digunakan
adalah
buffer
TE,
PVP
(polyvinylpyrrolidone) 2%, agarose, ethidium bromida (EtBr), buffer ekstrak, CTAB, cloroform IAA, pheol, propanol, NaCl, etanol 100%, green go Taq dan primer.
Metode Penelitian Metode analisis DNA dengan RAPD dibagi menjadi tiga tahapan yaitu ekstraksi, RAPD dan analisis data. Secara umum prosedur penelitian dengan metode RAPD dapat dilihat pada Gambar 7. Pengambilan sampel daun Ekstraksi dan isolasi DNA Seleksi primer PCR RAPD Interpretasi dan analisis data
Popgene versi 3.2
NTSYS
Gambar 7 Prosedur penelitian dengan metode RAPD.
23
Ekstraksi dan isolasi DNA Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan metode CTAB (Milligan 1989) yang meliputi beberapa kegiatan yaitu: ekstraksi, pemurnian dan presipitasi. Pada kegiatan ekstrasi sampel daun digerus dalam pestel dengan penambahan larutan buffer ekstraksi sebanyak 300-500 µl dan larutan PVP 2% sebanyak 100 µl sampai berbentuk serbuk. Hasil gerusan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tabung plastik steril yang kemudian diisi dengan buffer pengekstrak CTAB dengan komposisi seperti Tabel 5, sebanyak 500 µl dan 100 µl PVP 2%. Tabung kemudian ditutup rapat, kemudian buffer dan sampel dikocok lalu diinkubasi dalam water bath selama 45 menit – 1 jam pada suhu 65 0C. Setiap 15 menit sekali tabung-tabung tersebut diangkat dari water bath untuk dikocok perlahan-lahan.
Tabel 5 Komposisi bahan untuk ekstraksi DNA No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Nama Bahan Tris-HCl 1 M NaCl 5 M EDTA 0.5 M CTAB 10% Merkapetanol PVP 1% Akuades
1 sampel reaksi 100 mikro liter 280 mikro liter 40 mikro liter 200 mikro liter 5 mikro liter 100 mikro liter 280 mikro liter
X sample reaksi X x 100 mikro liter X x 280 mikro liter X x 40 mikro liter X x 200 mikro liter X x 5 mikro liter X x 100 mikro liter X x 280 mikro liter
Setelah inkubasi selesai, tabung diangkat dan didinginkan pada suhu ruang selam 15 menit dan dicuci dengan menambahkan 500 µl Cloroform IAA dan phenol 10 µl, campuran digoyang perlahan dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 2 menit. Supernatan yang diperoleh kemudian dipindahkan ke tabung baru dengan penambahan kembali 500 µl Cloroform IAA dan phenol 10 µl dan disentrifugasi kembali pada 13.000 rpm selama 2 menit. Tahap presipitasi adalah memindahkan supernatan hasil pemurnian ke tabung steril baru kemudian ditambahkan isopropanol dingin dan NaCl masingmasing sebanyak 500 µl dan 300 µl, dikocok kemudian disimpan pada freezer selama 60 menit. Setelah itu dilakukan sentrifugasi kembali selama 2 menit , dan cairan dalam tube dibuang sehinga yang tertinggal adalah pellet DNA. Ditambah etanol 100% sebanyak 300 µl, kemudian disentrifugasi kembali dan cairan tesebut dibuang, selanjutnya ditambahkan etanol lagi dan disentrifugasi. Setelah proses
24
selesai kemudian dikeringanginkan dalam desikator selama 15 menit. Tambahkan TE 20 µl kemudian dicampur dan disentrifugasi kembali.
Uji kualitas DNA Untuk uji kualitas DNA, selama proses pengeringan pellet DNA disiapkan agarose 1% (0,33 gram agarose dalam 33 ml TAE). Untuk proses elektroforesis ditambahkan TE 20 µl pada pellet DNA lalu sentrifugasi, diambil 3 µl DNA ditambahkan 2 µl BJ (blue Juice) 10x dan running/elektroforesis pada tegangan 100 volt selama ± 24 menit. Hasil elektroforesis kemudian direndam dalam larutan etidium bromide (EtBr) 10 µl per 200 ml aquades selama 5-10 menit dan selanjutnya dilihat pada UV transiluminator dan didokumentasikan dengan menggunakan foto gel.
Seleksi primer Pada kegiatan seleksi primer, dilakukan seleksi terhadap 28 primer secara random yaitu primer golongan OPO dan OPY yang diproduksi oleh Operon Technology. Selanjutnya dari 28 primer tersebut dipilih 5 primer yang menghasilkan fragmen DNA polimofik. Urutan basa nukleotida dari 28 primer produksi Operon Technology yang digunakan, disajikan pada Tabel 6.
Tabel 6 Urutan basa nukleotida 28 primer (Operon Technology) No. Primer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
OPO-05 OPO-06 OPO-07 OPO-08 OPO-11 OPO-13 OPO-14 OPO-16 OPY-01 OPY-05 OPY-06 OPY-7 OPY-08 OPY-09
Urutan Basa
No.
Primer
Urutan Basa
5' CCCAGTCACT '3 5' CCACGGGAAG '3 5' CAGCACTGAC '3 5′ CCTCCAGTGT '3 5' GACAGGAGGT '3 5' GTCAGAGTCC '3 5' AGCATGGCTC '3 5' TCGGCGGTTC '3 5' GGTGGCATCT '3 5' AGCCGTGGAA '3 5' AAGGCTCACC '3 5'AGAGGGGTGA '3 5' AGGCAGAGCA '3 5' GTGACCGAGT '3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
OPY-10 OPY-11 OPY-12 OPY-13 OPY-14 OPY-15 OPY-16 OPY-17 OPY-18 OPY-19 OPY-20 OPC 4 OPC 5 OPC 7
5' CAAACGTGGG '3 5' AGACGATGGG '3 5' AAGCCTGCGA '3 5' CACAGCGACA '3 5' GGTCGATCTG '3 5' AGTCGCCCTT '3 5' GGGCCAATGT '3 5' GACGTGGTGA '3 5' GTGGAGTCAG '3 5' TGAGGGTCCC '3 5' AGCCGTGGAA '3 5' CCGCATCTAC '3 5' GATGACCGCC '3 5' GTCCCGACGA '3
Untuk proses PCR, DNA hasil ekstraksi diambil masing-masing 1 µl dicampur menjadi satu kemudian diencerkan dengan 99 µl aquibides. Ambil
25
komponen campuran untuk reaksi PCR (green go Taq 7,5 µl, nuclease-free water 2,5 µl, DNA mix masing-masing 2 µl dan primer masing-masing 1,5 µl disentrifugasi selama 5-10 detik, kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR. DNA hasil PCR kemudian dieletroforesis dengan menggunakan agarose 2% (0,30 g agarose, 15 ml TAE) pada tegangan 90 volt selama 24 menit, selanjutnya dilihat pada UV transiluminator. Primer yang menghasilkan pita atau jumlah amplifikasi yang terbanyak selanjutnya digunakan untuk amplifikasi DNA dari 20 sampel yang diuji.
Amplifikasi dengan PCR (Polimerase Chain Reaction) Sebelum melakukan amplifikasi PCR, DNA hasil ekstraksi diencerkan dengan aquabides. Perbandingan antara DNA dengan aquabides tergantung pada resolusi pita genomik hasil ekstrasi (misalnya pengenceran 100x artinya 99 µl aquabides dan 1 µl DNA hasil ekstrasi). Proses amplifikasi dilakukan dengan metode RAPD menggunakan mesin PCR MJ Research PTC-100. Untuk proses ampifikasi DNA dengan PCR terdapat empat komponen yang digunakan antara lain green go Taq, DNA sampel dari bibit tanaman, primer dan aquaidest. Komposisi bahan untuk PCR disajikan pada Tabel 7.
Tabel 7 Komposisi bahan untuk reaksi PCR No. 1 2 3 4
Nama Bahan H2 O green go Tag Primer Cetakan DNA
1 sampel reaksi 2 mikro liter 7.5 mikro liter 1.5 mikro liter 2 mikro liter
X sample reaksi X x 2 mikro liter X x 7.5 mikro liter X x 1.5 mikro liter X x 2 mikro liter
DNA hasil PCR dielektroforesis dengan menggunakan konsentrasi agarose 2% (0,66 gram agarose dan 33 ml TAE), di running pada tegangan 90 volt selama 24 menit, kemudian direndam dalam larutan etidium bromide 10 µl per 200 ml aquades selama 5-10 menit. Visualisasi fragmen DNA dilakukan pada UV transiluminator. Seragam tidaknya DNA diamati dari pita yang dihasilkan. Selanjutnya hasil running tersebut didokumentasikan dengan menggunakan Foto gel. Pengaturan suhu pada mesin PCR MJ Research PTC-100 disajikan pada Tabel 8.
26
Tabel 8 Pengaturan suhu dalam beberapa tahapan dalam proses PCR Tahapan Pre denaturasi Denaturasi Annealing Extension Final Extension
Suhu (oC) 95 95 37 72 72
Waktu (menit) 2 1 2 2 10
Jumlah siklus 1 45 1
Analisis hasil PCR Berdasarkan foto DNA kemudian dilakukan scoring dan diterjemahkan dalam data biner berdasarkan ada tidaknya pita dengan ketentuan nilai 0 (nol) untuk tidak ada pita dan nilai 1 (satu) untuk adanya pita pada suatu posisi yang sama dari setiap individu yang dibandingkan (Gambar 10). Data yang diperoleh, diolah dengan menggunakan software Popgene versi 3.2.
Lokus 1
2
3
4
5
Individu 6 7
8
9
10
11
Individu 6 7 0 1 1 1
8 0 1
9 1 0
10 0 1
11 1 1
L-1 L-2 Lokus L-1 L-2
1 1 1
2 1 1
3 1 1
4 1 0
5 1 1
Gambar 8 Cara penilaian pita dengan sistem skoring (1 = ada pita, 0 = tidak ada pita).
Variabel genetik yang diukur pada studi kekerabatan genetik pasak bumi adalah: 1. Persentase pita DNA polimorfik 2. Keragaman (He) 3. Analisis gerombol
27
Percobaan III. Perbanyakan Tanaman Dengan Stek Pucuk
Tempat dan waktu penelitian Penelitian Perbanyakan tanaman dengan stek pucuk dilaksanakan di Rumah kaca KOFFCO System, Puslitbang Kehutanan dan Konservasi Alam Bogor, untuk analisis tanah dilaksanakan di Laboratorium Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian IPB dan analisis histologi akar di Laboratorium Bioteknologi, SEAMEO-BIOTROP.
Waktu penelitian selama 5 bulan
(Nopember 2007-April 2008).
Alat dan bahan Untuk pembuatan stek pucuk diperlukan sungkup propagasi, gunting stek, politube. Sedangkan bahan yang digunakan adalah campuran cocodust dan sekam dengan perbandingan tertentu sebagai media tanam serta Rootone-F sebagai hormon perakaran.
Metode Penelitian Persiapan media tanam dan bahan stek Media tanam yang digunakan adalah campuran antara cocodust dan sekam padi dengan perbandingan yang berbeda 1:0 (media A1), 1:1 (media A2) dan 2:1 (media A3).
Untuk pembuatan media tanam mengikuti prosedur KOFFCO.
Secara skematis proses pembuatan media dapat disajikan pada Gambar 9. serbuk kelapa
sekam padi
Steamer (100 0C, 30 menit) Mixer (1:0, 1:1, 2:1) Dryer (80 0C) Media
Gambar 9 Mekanisme pembuatan media stek. Media tanam yang dibuat kemudian diisikan ke pot-ray kemudian diletakkan ke dalam sungkup propagasi yang di dalamnya telah diisi dengan zeolit.
28
Bahan tanaman yang digunakan untuk pembuatan stek pucuk berasal hasil perbanyakan dengan biji dan berumur 7 bulan yang memenuhi beberapa kriteria antara lain kesehatan batang dan daun, tunas vertikal dan tunas muda (juvenil). Adapun bahan tanaman yang digunakan untuk stek pucuk dapat disajikan pada Gambar 10.
Gambar 10 Bahan tanaman untuk stek pucuk.
Setelah itu bahan stek diambil dari tanaman induk dengan pemotongan menggunakan gunting pemotong. Teknik pemotongan bahan stek dilakukan dengan memotong batang tunas dengan ukuran minimal dua ruas daun (3 nodul) atau kurang lebih berukuran 5-10 cm.
Penanaman stek dan pemeliharaan stek. Penanaman stek dilakukan setelah media disiapkan dan potongan bahan stek tersedia.
Media tanam pada pot-ray terlebih dahulu dilubangi untuk
memasukkan batang stek. Bahan stek diberi perlakuan dengan diolesi hormon Rootone-F (B1) dengan konsentrasi 5 g untuk 100 stek dan tidak diolesi hormon (B2) kemudian bahan stek ditanam pada pot-ray dan dimasukkan ke dalam sungkup propagasi.
Sungkup propagasi kemudian ditutup dan diletakkan di
rumah kaca KOFFCO System. Pemeliharaan stek pada tahap pembentukan akar meliputi penyiraman, pembersihan kotoran dari sungkup propagasi dan membuang guguran daun stek yang tidak tumbuh. Penyiraman dilakukan secara periodik disesuaikan dengan umur stek.
Pengecekan akar dilakukan setelah stek berumur 11 minggu,
kemudian setelah stek berakar dan siap sapih maka stek dipindahkan ke media semai.
29
Pengamatan histologi akar Pengamatan histologi akar dilakukan pada akhir pengamatan untuk mengetahui daerah munculnya akar pertama kali.
Untuk pengamatan ini
dilakukan dengan membuat potongan longitudinal dari mulai pangkal stek. Tahapan kerja pembuatan preparat dengan menggunakan metode parafin (SASS 1951) adalah sebagai berikut: 1. Pematian dan fiksasi. Pematian dan fikasai dilakukan dengan merendam bahan ke dalam cairan FAA (Formaldehyd-Acetic Acid Alcohol) dengan komposisi 5:5:90 (v/v/v) selama 3-4 hari.
Fiksasi bertujuan untuk mengawetkan semua
struktur sel sehingga sedapat mungkin berada pada keadaan yang sama dengan keadaan pada waktu masih hidup. 2. Dehidrasi Dehidrasi dilakukan dengan merendam potongan bahan secara bertahap melalui serangkaian alkohol bertingkat yait 20%, 40%, 60% dan 100% secara rutin minimal 2 x 15 menit. Fungsi dehidrasi adalah untuk menghilangkan air dari jaringan agar dapat dimasuki cairan pelarut parafin (xylol). 3. Preparafinasi Preparafinasi dilakukan dengan memasukkan potongan bahan ke dalam campuran alkohol 100% dan xylol dengan perbandingan 4:0, 3:1, 2:2, 1:1, 1:3 dan 0:4 (v/v) secara berurutan masing-masing minimal selama 2 x 15 menit. Tahapan ini bertujuan untuk menghilangkan alkohol dari jaringan agar dapat dimasuki larutan parafin. 4. Parafinasi Parafinasi dilakukan dengan merendam potongan bahan ke dalam campuran xylol parafin dengan perbandingan 4:0, 2:2 dan 0:4 secara berurutan masing-masing minimal selama 15 menit, jika parafin mulai memadat maka dilakukan pemanasan di dalam oven pada suhu 56oC supaya parafin tetap cair. Selanjutnya bahan tersebut direndam dalam parafin murni pada suhu 60o C minimal selama 1 hari. Tujuan dari proses parafinasi ini adalah memasukkan parafin ke dalam jaringan agar pada saat
30
jaringan dipotong dengan mikrotom tidak akan pecah dan strukturnya dapat dipertahankan. 5. Penanaman dalam balok parafin (Blocking) Penanaman dilakukan pada kotak dengan cetakan besi dengan cara meletakkan potongan bahan dalam cetakan, setelah sebelumnya parafin murni cair yang dituangkan terlebih dahulu dalam cetakan tersebut. Penanaman dilakukan dengan bantuan pinset sesuai dengan arah yang diinginkan (longitudinal). Setelah parafin mengeras, balok parafin beserta bahan dikeluarkan dari cetakan. Proses tersebut bertujuan menyimpan material ke dalam balok parafin agar memudahkan dalam penyayatan. 6. Penyayatan (Embeding) Penyayatan dilakukan setelah terlebih dahulu balok parafin dibentuk trapesium dengan tujuan agar pita yang terbentuk lurus dan tidak pecahpecah. Selanjutnya disayat pada mesin mikrotom putar dengan ketebalan diatur berkisar antara 5µ-20µ. 7. Penempelan sayatan Sayatan ditempel pada gelas preparat dengan menggunakan zat perekat berupa albumin. Setelah penempelan dilakukan, gelas preparat dipanaskan sebentar dengan oven pada suhu 40-60oC agar sayatan merekat erat 8. Pewarnaan (staining) Kegiatan pewarnaan berdasarkan pada metode SASS yang terbagi atas beberapa tahapan: a. Penjernihan tahap I (Dedehidrasi I) Penjernihan dilakukan dengan memasukkan secara berurutan ke dalam xylol, xylol-alkohol (1:1), alkohol 100%, alkohol 80%, alkohol 60% , alkohol 40% dan alkohol 20%, aquadest masingmasing selama 5 menit.
Tujuan penjernihan ini adalah agar
menghilangkan parafin dalam jaringan. b. Pewarnaan. Pewarnaan dilakukan agar bagian-bagian tertentu pada jaringan menjadi lebih kontras dan mudah diamati. Pewarnaan dilakukan
31
dengan menggunakan pewarna Easin, setelah itu dimasukkan ke dalam aquades selama 5 menit, dilanjutkan dengan metil blue. Pencelupan ke dalam zat warna masing-masing dilakukan minimal selama 30 menit. c. Penjernihan tahap II (Dedehidrasi II) Proses ini merupakan kebalikan dari penjernihan tahap I dan bertujuan untuk membuang zat pewarna berlebih yang melekat pada potongan bahan. Selanjutnya sayatan bahan yang diperoleh diolesi dengan etelen, agar coverglass menempel dengan sempurna dan terlindungi. 9. Pemotretan Pemotretan merupakan proses terakhir yang
dilakukan dengan
menggunakan photonic microscope dengan perbesaran 20-100 kali sesuai dengan arah yang diinginkan, dengan tujuan mengetahui asal usul primodia akarnya.
Variabel yang diamati Variabel yang diamati pada pembuatan stek pucuk ini antara lain : 1. Persentase hidup stek (PHS). Persentase hidup stek dihitung dengan membandingkan jumlah stek yang ditanam dengan jumlah stek yang mampu bertahan hidup sampai akhir pengamatan. 2. Persentase stek berakar (PSB). Persentase stek berakar dihitung dengan membandingkan jumlah stek yang mampu berakar pada 3 (tiga) perlakuan yang berbeda dengan jumlah stek total yang ditanam. 3. Jumlah akar stek (JAS) Dihitung Panjang akar dihitung dari pangkal akar sampai dengan ujung titik tumbuh. 4.
Panjang akar stek (PAS) Panjang akar stek diukur dari pangkal akar primer dan sekunder sampai ujung akar, dilakukan pada akhir pengamatan.
32
5. Analisis histologi akar Analisis histologi akar diperoleh melalui hasil pemotretan pada photonic microscope untuk mengetahui keberadaan primordia akar yang terbentuk pada stek pucuk pasak bumi. 6. Data penunjang penelitian Sebagai data penunjang penelitian dilakukan analisis sifat fisik dan kimia media tanam dan kondisi suhu dan kelembaban rumah kaca KOFFCO.
Rancangan percobaan dan analisis data Pada perbanyakan dengan stek pucuk ini rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) Faktorial dengan 2 faktor yaitu media tanam
(cocodust: sekam dengan perbandingan 1:0, 1:1 dan 2:1) dan
ZPT
(Rootone F dan tanpa Rootone F) dengan ulangan 10 tanaman. Adapun model statistik linier dari rancangan percobaan ini dinyatakan dalam persamaan sebagai berikut: Model umum rancangan faktorial tersebut adalah : Yijk
= µ + αi + βj + αβij + εijk
Keterangan: Yijk
= hasil pengamatan terhadap parameter sebagai pengaruh media tanam ke-i, zat pengatur tumbuh ke-j, dan ulangan ke-k; dengan i =1,2,3,4; j = 1,2,3,4; dan k = 1,2,….12.
µ
= nilai rata-rata umum
αi
= pengaruh media tanam ke-i
βj
= pengaruh zat pengatur tumbuh ke-j
αβij
= pengaruh interaksi media dasar ke-i dan zat pengatur tumbuh ke-j
εijk
= pengaruh galat percobaan pada media ke-i, zat pengatur tumbuh ke-j, dan ulangan ke-k. Data selanjutnya dianalisis dengan ANOVA dan faktor yang berpengaruh
nyata dilakukan uji lanjut dengan DNMRT.
HASIL DAN PEMBAHASAN Percobaan I. Perbanyakan Secara Generatif Informasi umum mengenai benih pasak bumi (Eurycoma longifolia Jack) Fenologi benih Pasak bumi merupakan tumbuhan yang berbunga dan berbuah sepanjang tahun. Masa berbunga dan berbuah pasak bumi berbeda untuk daerah Kalimantan dan Sumatera. Untuk pasak bumi asal Sumatera biasanya berbunga dan berbuah terbanyak pada bulan September-Nopember, sedangkan di Kalimantan masa berbunga dan berbuah terbanyak pada bulan Juli-Agustus.
Benih Pasak bumi memiliki warna kulit buah merah kehitaman saat mulai masak. Buah tersusun atas lapisan luar yang sangat tipis, lapisan tengah dan endocarp yang keras seperti tempurung, tanpa endosperm. Biji berwarna putih dengan 2 keping, dengan plumula kecil (Gambar 11). Tipe benih pasak bumi adalah rekalsitran, dimana tipe benih ini mudah mengalami penurunan viabilitas. Jumlah biji yang digunakan untuk penelitian ini adalah sebanyak 360 biji dengan diameter antara 0,5-0,7 cm dan berat untuk tiap butir benih berkisar antara 0,29 gram atau 290 gram untuk 1000 butir benih.
Gambar 11 Morfologi benih pasak bumi.
Perkecambahan benih Benih pasak bumi yang dikecambahkan pada 4 (empat) media yang berbeda menunjukkan perbedaan jumlah dan kecepatan berkecambah.
Hari
berkecambah tercepat diperoleh pada media pasir murni (M1) yaitu hari ke-14, diikuti oleh media pasir–sekam perbandingan 1:1 (M3) pada hari ke-15, media
34
pasir–kompos (M4) benih mulai berkecambah pada hari ke-18 dan media pasir– tanah perbandingan 1:1 (M2) pada hari ke-20. Jumlah kecambah kumulatif tertinggi diperoleh pada media M2 yaitu sebanyak 31 buah (34%), diikuti oleh media M1 yaitu sebanyak 20 buah (22%), M3 sebanyak 15 buah (16%) dan M4 sebanyak 13 buah (14%). Grafik kumulatif perkecambahan benih pasak bumi disajikan pada Gambar 12.
Gambar 12 Grafik kumulatif perkecambahan benih pasak bumi selama 60 hari. Hari berkecambah tercepat diperoleh pada media pasir murni. Hartmann et al. (1997) menyatakan pasir merupakan media yang mudah tersedia bersih dan daya rekatnya rendah, pasir tidak menyimpan kelembaban sehingga membutuhkan frekuensi penyimpanan yang lebih. Penggunaan tunggal tanpa adanya campuran media lain akan membuat pasir bersifat kasar sehingga memberikan hasil yang baik. Media yang menghasilkan hari berkecambah paling lambat dan jumlah kecambah paling sedikit adalah media kompos, hal ini kemungkinan disebabkan karena media kompos kurang sesuai untuk perkecambahan benih pasak bumi karena terlihat beberapa kecambah mengalami lodoh dan layu. Pasak bumi memiliki tipe kecambah semi hypogeal yang merupakan tipe antara hipogeal dan epigeal. Pada tipe ini hipokotil tidak memanjang, namun kotiledon timbul, kemungkinan disebabkan pemanjangan dari tangkai kotiledon (Gambar 13).
35
Gambar 13 Tipe kecambah pasak bumi. Penyapihan bibit dilakukan pada saat berumur 8 minggu.
Bibit yang
dipilih untuk disapih memiliki tinggi bervariasi antara 8-10 cm dan penampakan fisik yang sehat.
Pengaruh media terhadap pertumbuhan semai pasak bumi Rekapitulasi sidik ragam terhadap parameter pertumbuhan semai Pada penelitan ini media yang digunakan adalah campuran arang sekam dan tanah dengan perbandingan 1:1 (M1), arang sekam murni (M2) dan campuran pasir tanah dengan perbandingan 1:1 (M3). Pemilihan media tersebut didasarkan pada pengamatan pertumbuhan semai pada saat perkecambahan. Tabel 9 menunjukkan bahwa media tidak berpengaruh terhadap pertumbuhan pucuk semai (kecuali jumlah malai daun), namun berpengaruh terhadap jumlah dan panjang akar yang dihasilkan. Media yang menghasilkan variabel pertumbuhan terbaik adalah media arang sekam murni.
Tabel 9 Rekapitulasi sidik ragam pertumbuhan semai pasak bumi selama 20 minggu Parameter Media Signifikans i M1 M2 M3 Tinggi semai Diameter semai Kekokohan Jumlah malai daun Panjang akar primer Panjang akar sekunder Jumlah akar primer Jumlah akar sekunder Keterangan
14,3a 0,42a 54,33a 14,7 b 4,78a 4,9a 1a 24,2 a
13,48a 0,37a 59,76a 14,2 b 9,18b 5,94a 1,8 b 65,2 b
12,2a 0,37a 59,53a 9,9 a 6,38a 4,8a 1a 24,6 a
tn tn tn * ** tn ** **
: tn: tidak berbeda nyata pada selang kepercayaan 95% dan 99% *: Angka yang diikuti huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata pada selang kepercayaan 95% **: Angka yang diikuti huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata pada selang kepercayaan 99%
36
Pertumbuhan pucuk semai pasak bumi a. Tinggi semai Gambar 14 menunjukkan tinggi rata-rata terbaik diperoleh pada media campuran arang sekam-tanah (M1) yaitu sebesar 20,76 cm, diikuti oleh media campuran pasir-tanah (M3) sebesar 19,22 cm dan media arang sekam murni (M2) sebesar 18,98 cm.
Gambar 14 Rata-rata tinggi tanaman pasak bumi pada media tumbuh yang berbeda selama 20 minggu. Laju pertumbuhan tinggi semai terbaik selama 20 minggu diperoleh pada media M1 sebesar 14,3 cm, sedangkan laju pertumbuhan semai terjelek diperoleh pada media M3 yaitu sebesar 12,2 cm.
Laju pertumbuhan semai pada ketiga
media tersebut disajikan pada Gambar 15.
Gambar 15 Laju pertumbuhan tinggi semai tanaman pasak bumi selama 20 minggu pada tiga media tumbuh. Berdasarkan hasil sidik ragam (Tabel 9) terlihat bahwa tinggi semai pasak bumi tidak dipengaruhi oleh media yang digunakan.
37
b. Diameter semai Nilai pertumbuhan diameter merupakan selisih antara pengukuran diameter akhir dengan diameter awal pengamatan. Berdasarkan hasil pengamatan diketahui bahwa rata-rata pertambahan diameter tertinggi diperoleh pada media M1 yaitu sebesar 0,42 cm, sedangkan M2 dan M3 memiliki rata-rata pertambahan diameter yang sama yaitu 0,37 cm (Gambar 16).
Gambar 16 Pertambahan diameter semai pasak bumi selama 20 minggu dalam tiga media tumbuh. Hasil sidik ragam (Tabel 9) menunjukkan bahwa pertambahan diameter semai pasak bumi tidak dipengaruhi oleh media tumbuh yang digunakan.
c. Kekokohan semai Kekokohan semai merupakan perbandingan antara tinggi terhadap diameter yang diukur pada akhir pengamatan. Berdasarkan hasil pengamatan diketahui bahwa media M2 memiliki nilai kekokohan rata-rata tertinggi yaitu sebesar 59,76 sedangkan media M1 memiliki nilai kekokohan rata-rata terendah yaitu sebesar 54,33 (Gambar 17).
Gambar 17 Kekokohan semai pasak bumi selama 20 minggu dalam tiga media tumbuh.
38
Hasil sidik ragam (Tabel 9) menunjukkan bahwa media semai tidak mempengaruhi kekokohan semai pasak bumi.
d. Jumlah malai daun Jumlah malai daun merupakan jumlah kumulatif malai daun yang terbentuk sampai akhir pengamatan.
Gambar 18 menunjukkan media M1
menghasilkan rata-rata malai daun yang terbanyak yaitu sebesar 14,7 sedangkan media M3 menghasilkan rata-rata jumlah malai daun paling sedikit yaitu 9,9.
Gambar 18 Jumlah malai daun pasak bumi yang terbentuk selama 20 minggu dalam tiga media tumbuh. Hasil sidik ragam dan uji Duncan (Tabel 8) menunjukkan bahwa media semai berpengaruh terhadap pembentukan malai daun pasak bumi. Semai yang ditanam pada media M3 meghasilkan rata-rata jumlah malai daun yang paling sedikit (9,9) dan berbeda nyata dengan media M2 dan M1. Variabel pertumbuhan pucuk yang dihasilkan pada ketiga media semai menunjukkan nilai yang hampir sama. Menurut Anonim (2007) pertumbuhan pucuk semai pasak bumi yang cenderung lambat kemungkinan disebabkan karena adanya fenomena dominasi apikal. Sitokinin yang mengalir dari ujung akar ke bagian atas dan berfungsi merangsang pertumbuhan tanaman bagian atas terhambat oleh adanya aktifitas auksin yang mengalir dari bagian atas menuju akar (basipetal) dan berfungsi merangsang tumbuhnya perakaran terlalu tinggi sehingga tunas cabang dan ranting menjadi sulit tumbuh.
39
Pertumbuhan akar semai pasak bumi a. Panjang akar Panjang akar yang diukur adalah akar (primer dan sekunder) pasak bumi terpanjang pada akhir penelitian. Berdasarkan hasil pengamatan diketahui bahwa rata-rata panjang akar primer tertinggi diperoleh pada media M2 yaitu sebesar 9,18 cm, sedangkan rata-rata akar primer terpendek diperoleh pada media M1. Rata-rata akar sekunder terpanjang diperoleh pada media M2 yaitu 5,94 cm sedangkan akar sekunder terpendek dperoleh pada media M3 sebesar 4,8 cm (Gambar 19).
Gambar 19 Panjang akar pasak bumi yang terbentuk selama 20 minggu dalam tiga media tumbuh. Hasil sidik ragam dan uji Duncan (Tabel 9) menunjukkan bahwa media semai berpengaruh sangat nyata terhadap panjang akar primer pasak bumi namun tidak berpengaruh nyata terhadap panjang akar sekunder. Media M2 menghasilkan rata-rata panjang akar primer yang tertinggi dan sangat berbeda nyata dengan media M1 dan M3. Media arang sekam murni menghasilkan akar yang lebih banyak dan lebih panjang jika dibandingkan dengan media yang lain, hal ini sesuai dengan Thomas (1995) yang menyatakan bahwa arang sekam padi dapat menciptakan kondisi lingkungan tumbuh, khususnya sifat fisik dan kimia tanah yang lebih baik bagi pertumbuhan tanaman karena lebih cepat mengalami proses pelapukan dan dekomposisi.
Apabila sekam padi mengalami penguraian, maka sekam akan
membebaskan unsur N, P, K, Mg dan Cl dengan kadar yang cukup berarti.
40
b. Jumlah akar Jumlah akar adalah akar (primer dan sekunder) yang dihitung pada akhir pengamatan. Berdasarkan hasil pengamatan (Gambar 20) diketahui bahwa media M2 menghasilkan rata-rata jumlah akar primer yang tertinggi, yaitu 1,8 buah, sedangkan media M1 dan M3 memiliki rata-rata jumlah akar primer yang sama yaitu sebanyak 1 buah. Jumlah rata-rata akar sekunder terbanyak diperoleh pada media M2 yaitu 65,2 buah, sedangkan rata-rata akar sekunder paling sedikit diperoleh pada media M1 yaiu 24,2 buah.
Gambar 20 Jumlah akar pasak bumi yang terbentuk selama 20 minggu dalam tiga media tumbuh. Hasil sidik ragam dan uji Duncan (Tabel 9) menunjukkan bahwa media semai berpengaruh sangat nyata terhadap jumlah akar primer dan sekunder pasak bumi. Semai yang ditanam pada media M2 menghasilkan rata-rata jumlah akar primer yang terbanyak dan sangat berbeda nyata dengan media M1 dan M3. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Harsono (2002) menunjukkan bahwa arang sekam memiliki kandungan silika yang tinggi (94-96 %) serta kandungan unsur lain yang mendukung pertumbuhan tanaman. Adanya kandungan silika yang tinggi tersebut mampu menyerap kadar unsur yang berlebih.
Sebaran perakaran semai pasak bumi Sebaran atau distribusi perakaran semai pasak bumi merupakan jumlah akar primer dan sekunder semai pasak bumi, pada tiga zone atau bagian dari wadah yang digunakan, sehingga dapat diketahui kemampuan akar dalam
41
melakukan penetrasi untuk mencari unsur hara yang diperlukan dalam tahapan pertumbuhan dan perkembangannya. Data selengkapnya disajikan pada Tabel 10.
Tabel 10 Pengaruh media semai terhadap sebaran akar semai pasak bumi Media
Ulangan
M1
M2
M3
Distribusi Zona Perakaran Atas (0-5 cm)
Tengah (6-10cm)
Bawah (11-15cm)
1
30
0
0
2 3
25 20
0 0
0 0
4 5
27 19
0 0
0 0
1 2
22 60
0 43
0 0
3 4
60 30
40 20
0 9
5 1
24 10
18 12
10 0
2 3
30 15
0 9
0 0
4 5
20 15
0 12
0 0
Pola perakaran pada tiga media yang digunakan menunjukkan adanya perbedaan.
Pada media kombinasi sekam-tanah, akar semai yang dihasilkan
terkonsentrasi pada zona atas, sedangkan pada media arang sekam murni, akar semai yang dihasilkan selain terkonsentrasi pada zona atas, terdapat juga pada zona tengah dan bawah (Gambar 21). Hal ini menunjukkan bahwa adanya arang sekam mampu meningkatkan jumlah dan sebaran akar semai yag dihasilkan sehingga kemampuan melakukan penetrasi dan mencari unsur hara yang diperlukan akan semakin baik.
42
M1
M2
M3
Gambar 21 Semai dan distribusi akar pada tiga media semai yang berbeda. Media berpengaruh terhadap tipe sistem perakaran stek. Pada media dengan kombinasi arang sekam, akar yang dihasilkan relatif lebih banyak hal ini dikarenakan media tersebut lebih lembab daripada media lainnya.
Hasil
penelitian yang dilakukan pada beberapa jenis stek dengan media pasir, menghasilkan akar yang panjang, sedikit percabangan, kasar dan rapuh. Sedangkan kombinasi pasir dengan kompos menghasilkan akar yang lebih berkembang, banyak cabang, tipis dan lentur.
Perbedaan sistem perakaran
tersebut berhubungan dengan kelembaban media (Hartmann et al. 1997).
43
Pengamatan visual selama penelitian. Berdasarkan pengamatan visual selama penelitian, media arang sekam murni menghasilkan semai yang memiliki penampakan fisik (warna daun lebih hijau, kesehatan) yang lebih baik dibandingkan dengan media lain. Selama penelitian beberapa semai mengalami kematian tiba-tiba, yang kemungkinan disebabkan busuknya akar akibat serangan jamur. Serangan jamur yang menyebabkan kematian tersebut dapat disajikan pada Gambar 22.
Gambar 22 Serangan jamur penyebab busuk akar. Selain serangan larva yang mengakibatkan busuknya akar, pada saat penelitian dijumpai juga serangan larva Atteva sciodoxa.yang menyerang pucuk yang masih muda.
Gambar 23 Serangan larva Atteva sciodoxa.
44
Percobaan II. Kekerabatan Genetik Antar Individu Semai Pasak Bumi
Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA merupakan faktor yang menentukan kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh untuk analisis genetik. Dalam ekstraksi DNA terdapat dua tahapan penting yang dilakukan yaitu mendegradasi sel untuk mengeluarkan DNA dan mengekstraksi untuk memisahkan DNA dari kontaminan yang ada. Permasalahan yang dihadapi dalam ekstraksi DNA jenis tanaman keras atau berkayu adalah adanya senyawa fenol, senyawa protein, karbohidrat dan polisakarida yang dapat menurunkan kemurnian dan konsentrasi DNA. Dalam penelitian ini metode yang digunakan adalah metode CTAB. Penggunaan CTAB dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya karakteristik perbedaan larutan antara keduanya dalam CTAB. Senyawa fenol yang ditunjukkan dengan terbentuknya warna coklat pada saat ekstraksi dapat dihilangkan dengan menambahkan senyawa fenol, selain itu pencucian berulang dengan menggunakan etanol dapat menghilangkan kontaminan-kontaminan yang ada. Menurut
Qiagen
(2001),
pita
DNA
yang
berekor
(smearing)
mengindikasikan bahwa pita tersebut masih kotor. Hasil ekstraksi yang kotor ini masih mengandung larutan kloroform, kadungan fenol yang tinggi dan alkohol. Selain itu, hasil yang kotor tersebut masih mengandung kontaminasi protein, polisakarida dan RNA.
Gambar 24 Hasil ekstraksi daun pasak bumi dengan metode CTAB.
45
Seleksi primer Seleksi primer dimaksudkan untuk mencari primer acak yang dapat menghasilkan amplifikasi, karena tidak semua primer nukleotida dapat menghasilkan produk amplifikasi (primer positif) dan dari primer positif tidak semuanya menghasilkan fragmen DNA polimorfik. Dalam penelitian ini DNA contoh untuk seleksi primer disiapkan dengan cara bulking DNA, yaitu DNA dari masing-masing sampel dicampur menjadi satu dan kemudian dijadikan template. Berdasarkan hasil seleksi terhadap 28 primer, diperoleh 16 primer yang menunjukkan amplifikasi dan dari 18 primer tersebut diambil 7 primer yang menunjukkan ampifikasi terbanyak (OPY-6, OPY-15, OPY-17, OPY-19, OPY-20 dan OPC 7). Hasil kegiatan seleksi primer dan beberapa primer terbaik dapat disajikan pada Gambar 25.
Y20 Y9 O16 O13 O6
(a)
M
C7
C5
C4
MM Y7 Y6
M Y19 Y17 Y15 Y14 Y13 Y11 Y10 Y8
(b)
Gambar 25 Foto hasil seleksi primer (gambar (a) primer yang terpilih adalah Y20 & C7, gambar (b) primer yang terpilih adalah Y17, Y15, Y8 dan Y6).
RAPD Hasil amplifikasi PCR-RAPD dari sampel daun hasil perbanyakan secara generatif menunjukkan bahwa jumlah fragmen pita DNA hasil amplifikasi 7 primer terpilih berkisar antara 4-11 pita dengan kisaran pita yang teramplifikasi antara 100-1200 bp, tergantung pada jenis primer yang digunakan (Tabel 11). Dari total 56 pita yang teramplifikasi 78,57% atau sebanyak 44 pita menunjukkan polimorfik, sedangkan hasil analisis dengan Popgene diketahui nilai keragaman genetik dalam populasinya adalah sebesar 0,3076.
46
Tabel 11 Primer RAPD yang digunakan serta jumlah pita yang dihasilkan dari 20 individu semai pasak bumi Primer
Sekuens
OPY 15 OPY 6 OPY 17 OPY 8 OPY 19 OPY 20 OPC 7 Total
5’TGGCGTCCTT’3 5’AGCCGTGGAA’3 5’GACGTGGTGA’3 5’AGGCAGAGCA’3 5’TGAGGGTCCC’3 5’AGCCGTGGAA’3 5’GTCCCGACGA’3
Range Pita Yang Teramplifikasi (Kb)
200 -1200 200 - 1200 200 - 1200 200 - 1200 200-700 100-500 100-800
Jumlah Total Pita DNA 10 11 10 9 6 4 6 56
Jumlah Pita DNA Polimorfik
Persentase Pita DNA Polimorfik (%) 80 72,7 80 100 83,3 50 66,7 78,57
8 8 8 9 5 2 4 44
Gambar 26 menunjukkan contoh hasil amplifikasi dari 2 primer (OPY-15, OPY-17), sedangkan hasil amplifikasi 5 primer lainnya hasil skoring fragment pita hasil amplifikasi disajikan pada Lampiran 2.
1000 bp500 bp 100 bp P20 P19 P18 P17 P16 P15 P14 P13 P12 P11 P10 P9 P8 P7 P6 P5 P4 P3 P2 P1
M
OPY-15
1000 bp500 bp bp 100 P20 P19 P18 P17 P16 P15 P14 P13 P12 P11 P10 P9 P8 P7 P6 P5 P4 P3 P2 P1
M
OPY-17
Gambar 26 Hasil amplifikasi RAPD dengan primer OPY-15 dan OPY-17. (Keterangan: P1-P20: sampel tanaman, M:marker)
Nilai persentase lokus polimorfik dan keragaman tersebut lebih tinggi dibandingkan dengan penelitian yang dilakukan oleh Osman et al.
(2003)
terhadap tanaman pasak bumi di Malaysia dengan menggunakan penanda Single Nukleotide Polymorphisme (SNPs) terhadap 8 sampel dengan asal usul yang
47
berbeda (Langkawi, Malaka, Trengganu, Pahang, Johor dan kultur jaringan) yaitu antara 45%-7% dan 0,182-0,246 dengan penanda SNP dan lebih tinggi jika dibandingkan dengan tanaman daerah tropis lainnya seperti konifer (He = 0,145; Hamrick et al. 1992), eukaliptus (He = 0,182; Moran & Hopper 1987), namun lebih rendah dibandingkan tanaman berkayu, seperti kamper (He = 0,369; Lee et al. 2000) dengan menggunakan metode Isozim. Hal ini mengindikasikan bahwa heterogenitas individu pasak bumi dan kemampuan adaptasi terhadap perubahan lingkungan yang baik cukup tinggi. Menurut Li et al. (2006) pada beberapa kasus hal tersebut bisa disebabkan oleh tingginya instabilitas pada tanaman.
Kekerabatan antar individu semai pasak bumi Menurut Namkoong et al. (1996) dalam Finkeldey (2005) keragaman genetik yang besar sangat mempengaruhi kemampuan suatu jenis untuk beradaptasi. Individu atau populasi dengan keragaman genetik yang sempit akan rentan terhadap kondisi lingkungan yang heterogen.
Salah satu akibat yang
disebabkan oleh sempitnya variasi genetik adalah mudah terserang oleh hama dan penyakit. Pada dasarnya kemampuan suatu jenis untuk beradaptasi pada berbagai kondisi lingkungan sangat tergantung pada keragaman genetik dan multiplisitas indivividual dalam populasi (Gregorius 1989 dalam Hosius et al. 2000). Pola variasi genetik suatu jenis ditentukan oleh sistem perkawinan yang terjadi dan akan mempengaruhi struktur genetik dan dinamikan populasi dalam jenis tersebut. Dengan mengetahui proses-proses perkawinan yang terjadi pada suatu jenis akan bermanfaat bagi efektifitas konservasi sumberdaya genetik dan optmalisasi upaya pemuliaan genetik jenis tersebut. Pasak bumi memiliki kemampuan perkawinan yang unik.
Sebagai
tanaman dioceous pasak bumi memiliki tipe pohon jantan dan betina sehingga perkawinan dilakukan secara kawin silang (outcrossing), namun pada beberapa kasus tanaman pasak bumi juga mampu melakukan penyerbukan sendiri saat bunga masih belum membuka (penyerbukan tertutup/kleistogami). Letak benang sari yang lebih rendah daripada kepala putik menyebabkan proses penyerbukan hanya terjadi ketika ada vektor yang dapat menggerakkan bunga sehingga putik dan benangsari bertemu (Hadiah 2000). Adanya dua tipe perkawinan yang
48
berbeda tersebut sangat mungkin menjadi penyebab tingginya keragaman genetik tanaman pasak bumi hasil perbanyakan secara generatif.
Jarak genetik dan analisis cluster Berdasarkan analisis gerombol dan nilai jarak genetik (Lampiran 5) dengan menggunakan metode pemasangan kelompok aritmatika tidak berbobot (Unweightted Pair-Grouping Method With Aritmatic Averaging, UPGMA) dihasilkan dendrogram jarak genetik antar populasi seperti pada Gambar 27. .
Gambar 27 Dendrogram jarak genetik. Pada Gambar 17, terlihat bahwa populasi membentuk dua kelompok yaitu kelompok I (terdiri dari 17 individu) dan kelompok II (terdiri dari 3 individu) dan akhirnya membentuk satu kelompok yang lebih besar. Individu yang memiliki jarak genetik terdekat adalah individu 19 dan 20 (0,1542), sedangkan individu yang memiliki jarak genetik terjauh adalah individu 1 dan 13 (0,8036). Perbedaan kedua kelompok tersebut juga dapat diamati pada semai hasil perbanyakan generatif yang secara morfologi memiliki beberapa perbedaan penampakan seperti ukuran daun, warna daun serta pertumbuhan batangnya (Gambar 28). Perbedaan pengelompokan tersebut diduga karena adanya dua tipe
49
penyerbukan yang berbeda (outcrossing dan kleistogami) sehingga benih yang dihasilkan juga berbeda.
Individu pada kelompok I (17 individu) diduga
merupakan hasil dari outcrossing, sedangkan kelompok II (3 individu) diduga merupakan hasil dari kleistogami.
Kemungkinan lain adalah benih tersebut
berasal dari tanaman pasak bumi lain yang terbawa oleh burung, tikus atau terbawa oleh air sampai ke bawah pohon induk tersebut (migrasi gen).
Gambar 28 Perbedaan morfologi daun dan pucuk pasak bumi hasil perbanyakan secara generatif. Menurut Osman et al. (2003) tanaman pasak bumi memiliki tipe dispersal yang mengikuti gaya berat (ke bawah) sehingga benih yang dihasilkan hanya tersebar di bawah pohon induk, hal tersebut menyebabkan tanaman pasak bumi di alam selalu dtemui secara berkelompok dibawah pohon induk. Hadiah (2000) juga menyatakan bahwa penyebaran benih pasak bumi umumnya hanya terbatas di sekitar pohon induk.
Pemencaran ke tempat yang lebih jauh lagi hanya
mungkin terbawa oleh aliran air hujan, karena ukuran buahnya yang relatif cukup besar sehingga tidak mungkin terbawa angin.
Implikasi status keragaman terhadap konservasi pasak bumi Pengetahuan mengenai variasi genetik sangat penting untuk merumuskan program konservasi. Memahami dan mempertahankan keragaman genetik suatu populasi sangat penting dalam konservasi, karena keragaman genetik yang tinggi akan sangat membantu suatu populasi beradaptasi terhadap perubahan-perubahan yang terjadi di lingkungan sekitarnya, termasuk mampu beradaptasi terhadap penyakit-penyakit yang ada di alam.
50
Berdasarkan hasil analisis genetik, pasak bumi memiliki keragaman yang tinggi, oleh karena itu kemampuan adaptasi terhadap perubahan lingkungan juga lebih baik. Hal yang perlu diperhatikan adalah menjaga kelangsungan hidupnya yang terancam akibat pemanenan berlebihan terhadap habitatnya di hutan alam untuk keperluan industri obat maupun perkebunan.
Percobaan III. Perbanyakan Dengan Stek Pucuk Pada penelitian stek pucuk ini perlakuan yang diberikan adalah faktor media yang merupakan campuran cocodust dan sekam dengan perbandingan yang berbeda yaitu 1:0 (A1), 1:1 (A2) dan 2:1 (A3) dan pemberian zat pengatur tumbuh, tanpa ZPT (B1) dan pemberian ZPT (B2).
Rekapitulasi sidik ragam pengaruh media dan zat pengatur tumbuh terhadap keberhasilan stek pucuk pasak bumi. Sidik ragam (Tabel 12) menunjukkan bahwa media berpengaruh terhadap panjang akar sekunder, sedangkan persentase stek berakar, panjang akar primer dan jumlah akar lebih dipengaruhi oleh pemberian ZPT.
Interaksi antara
media*ZPT tidak memberikan pengaruh nyata terhdap parameter apapun.
Tabel 12 Rekapitulasi hasil sidik ragam dan nilai rata-rata terhadap beberapa parameter pertumbuhan stek Parameter Persentase stek hidup Persentase stek berakar Panjang akar primer Panjang akar sekunder Jumlah akar primer Jumlah akar sekunder
A1B1 77,78
A1B2 77,78
Media A2B1 A2B2 77,78 100
A3B1 77,78
A3B2 77,78
signifikansi tn
44,44a
66,67b
33,33a
44,44b
44,44a
77,78b
*
3,18a
4,93b
2,03a
6,84b
3,68a
5,76b
*
1,43b
1,63b
0,4a*
1,0a *
1,48b
2,04b
*
1,50a
3,0b
2,0a
2,8b
2,5a
2,0b
*
4,75a
10,67b
3,33a
20,2b
6,5a
20,86b
**
Keteragan: tn: tidak berbeda nyata pada selang kepercayaan 95% dan 99% *: Angka yang diikuti huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata pada selang kepercayaan 95% **: Angka yang diikuti huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata pada selang kepercayaan99%
51
Pengaruh media dan zat pengatur tumbuh terhadap keberhasilan stek pucuk pasak bumi. a. Persentase stek hidup (PSH) Persentase stek hidup yang dimaksud adalah stek pasak bumi yang masih hidup (segar) dan tidak menunjukkan gejala kematian. Berdasarkan hasil pengamatan diperoleh rata-rata persentase stek hidup tertinggi diperoleh pada stek dengan A2B2 yaitu sebesar 100%, sedangkan perlakuan yang lain menghasilkan persentase hidup yang sama yaitu 77,78% (Gambar 29).
Gambar 29 Rata-rata persentase hidup stek selama 20 minggu. Hasil sidik ragam (Tabel 12) menunjukkan bahwa perlakuan media, hormon ataupun interaksi keduanya tidak berpengaruh nyata terhadap persentase hidup stek.
b. Persentase stek berakar (PSB) Persentase stek berakar dihitung pada akhir penelitian. Berdasarkan hasil pengamatan stek yang ditanam pada perlakuan A3B2 memiliki persentase tertinggi yaitu sebesar 77,78% sedangkan persentase terendah diperoleh pada perlakuan A2B1 yaitu sebesar 33,33% (Gambar 30)
Gambar 30 Persentase berakar stek selama 20 minggu.
52
Hasil sidik ragam (Tabel 12) menunjukkan bahwa media tidak berpengaruh terhadap persentase berakar, interaksi media dan ZPT
tidak
memberikan pengaruh nyata, sedangkan ZPT memberikan pengaruh nyata. Stek pasak bumi tanpa pemberian Rootone F juga menunjukkan adanya perakaran namun berdasarkan hasil pengamatan, stek tersebut membutuhkan waktu yang lebih lama untuk berakar dan akar yang terbetuk pun relatif lebih pendek dengan jumlah akar primer serta sekunder yang lebih sedikit. Hal ini membuktikan bahwa stek pasak bumi memiliki kandungan auksin endogen yang cukup untuk menghasilkan perakaran namun memerlukan tambahan hormon eksogen untuk mempercepat dan memperbanyak perakarannya. Pemberian Rootone F merangsang proses morfologis yaitu pembentukan kucup lateral dan pertumbuhan akar baru pada jaringan kalus yang terbentuk pada stek. Jaringan kalus yang terbentuk pada stek sebagai akibat respons tumbuhan terhadap pemberian Rootone F berfungsi untuk memacu proses diferensiasi sel pada jaringan merismatik, dimana jaringan merismatik pada batang mengandung meristem yang memiliki jumlah sel sedikit dan aktifitas selnya rendah sehingga dibutuhkan hormon eksternal dalam hal ini Rootone-F untuk pertumbuhannya.
Media
Media
Media Gambar 31 Penampakan stek pucuk pada perlakuan yang berbeda.
53
c. Panjang akar Panjang akar dihitung pada akhir penelitian. Gambar 32 menunjukkan bahwa perlakuan media A2 dengan pemberian Rootone F menghasilkan rata-rata akar terpanjang yaitu 6,84 cm sedangkan perlakuan media A2 tanpa pemberian Rootone F menghasilkan rata-rata akar terpendek yaitu 2,03. Akar sekunder terpanjang diperoleh pada media A3 dengan pemberian Rootone F yaitu 2,04 cm, sedangkan akar terpendek diperoleh pada media A2 tanpa Rootone F yaitu 0,4 cm. Hasil sidik ragam (Tabel 12) menunjukkan bahwa perlakuan media berpengaruh nyata terhadap panjang akar sekunder dan interaksi Media*ZPT tidak berbeda nyata, sedangkan pemberian ZPT berpengaruh nyata terhadap panjang akar primer stek pasak bumi.
Gambar 32 Panjang akar stek yang terbentuk selama 20 minggu. Hasil pengujian terhadap media tanam menunjukkan bahwa pH media yang digunakan masih dalam kisaran yang dianjurkan (6,6-7,1). Media tanam A3 memiliki kapasitas tukar kation, kandungan C, N dan Zn yag lebih tinggi dibandingkan media lain.
Hasil analisis media tanam secara lengkap dapat
disajikan pada Lampiran 4. Berdasarkan hasil pengamatan dan uji Duncan dapat diketahui bahwa media kombinasi cocodust dan sekam dengan perbandingan 2:1 menghasilkan akar sekunder yang lebih panjang jika dibandingkan dengan media lain. Hal ini
54
sesuai dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh KOFFCO bahwa media tersebut merupakan media paling ideal untuk produksi stek jenis dipterokarpa. Pada media kombinasi dengan perbandingan 2:1, akar sekunder yang dihasilkan relatif lebih panjang, hal ini dikarenakan media tersebut lebih lembab daripada media lainnya. Hasil penelitian yang dilakukan pada beberapa jenis stek dengan media pasir, menghasilkan akar yang panjang, sedikit percabangan, kasar dan rapuh. Sedangkan kombinasi pasir dengan kompos menghasilkan akar yang lebih berkembang, banyak cabang, tipis dan lentur. Perbedaan sistem perakaran tersebut berhubungan dengan kelembaban media (Hartman et al. 1997).
d. Jumlah akar Jumlah akar (primer dan sekunder) dihitung pada akhir penelitian. Berdasarkan hasil pengamatan (Gambar 33) dapat diketahui bahwa perlakuan media A1 dengan penambahan Rootone F menghasilkan rata-rata jumlah akar primer terbanyak yaitu 3 buah, sedangkan perlakuan media A1 tanpa pemberian Rootone F menghasilkan jumlah akar paling sedikit yaitu 1,5 buah. Media A3 dengan pemberian Rootone F menghasilkan rata-rata jumlah akar sekunder stek yang paling banyak yaitu 20,86 buah, sedangkan rata-rata jumlah akar sekunder paling sedikit diperoleh pada media A2 tanpa penambahan Rootone F.
Gambar 33 Jumlah akar stek yang terbentuk selama 20 minggu.
55
Hasil sidik ragam (Tabel 12) menunjukkan bahwa perlakuan pemberian ZPT
berpengaruh nyata terhadap jumlah akar primer dan sekunder stek,
sedangkan media serta interaksi Media* ZPT tidak memberikan pengaruh nyata. Hal tersebut sesuai dengan fungsi dan kandungan Rootone F yang terdiri dari dua jenis golongan auksin sekaligus yaitu NAA dan IBA. NAA dan senyawa naphthelena lainnya berfungsi memperbanyak dan mendorong timbulnya suatu perakaran, sedangkan IBA bermanfaat untuk memperbanyak dan mempercepat perakaran. Selain itu terdapat Thiram yang berfungsi sebagai fungisida.
Pembentukan tunas dan akar pasak bumi Tunas atau daun menghasilkan suatu senyawa kompleks selain auksin yang merangsang pembentukan akar.
Senyawa tersebut oleh Bouillenne dan
Went (1933) dalam Hartman et al. (1997) disebut dengan rhizocaline. Rhizocaline merupakan suatu senyawa kompleks yang terdiri atas tiga komponen yaitu: 1. Faktor spesifik yang ditranslokasikan dari daun dengan sifat kimia sebagi ortho-dihydroxyphenol. 2. Faktor non spesifik (auksin) yang ditranslokasikan dan ditemukan dalam konsentrasi biologi yang rendah. 3. Faktor enzimatik yang berada dalam jaringan sel (pericyle, phloem, kambium) yang dimungkinkan sebagai polyphenol-oxidase. Inisiasi
akar
terbentuk
apabila
ortho-dihydroxyphenol
bereaksi
dengan
penambahan konsentrasi auksin dan enzim, maka akan terjadi akselerasi proses respirasi dan mitosis sel yang menyebabkan diferensiasi sel serta jaringan.
a. Pengamatan histologi akar Akar adventif pada stek dapat diklasifikasikan ke dalam 2 tipe yaitu, preformed root yang berkembang secara alami pada bagian batang ketika masih berada pada tanaman induk dan wound root yang berkembang hanya setelah pemotongan stek dar tanaman induk sebagai respon terhadap perlukaan pada batang.
Primordia akar umumnya berasal dari sel kambium yang bersifat
meristematik, pada tanaman lain primordia akar juga berasal dari jaringan lain
56
seperti floem, jari-jari vaskular, korteks dan empulur atau sel parenkim yang lain seperti lentisel (Hartmann et al. 1997; Syros et al. 2004). Berdasarkan pengamatan terhadap potongan melintang akar dapat diketahui bahwa primordia akar yang kemudian berkembang menjadi akar pada stek, berasal dari bagian kambium. Asal muasal perakaran dengan tipe seperti pasak bumi juga dapat dijumpai pada stek rhododendron (Strzelecka 2007), Pinus radiata (Cameron dan Thomson 1969) dan begonia (Smith 1936 dalam Hartmann et al 1997). Penampang melintang akar stek dapat disajikan pada Gambar 36. Proses pembentukan akar stek pasak bumi dimulai dari sel-sel meristem pada kambium atau yang berada di antara atau di luar jaringan pembuluh dan aktif membelah setelah auksin dari tunas, rooting cofactor dan karbohidrat bergerak ke bagian dasar stek. Sel-sel tersebut kemudian berkumpul membentuk calon akar, jika terdapat luka akibat pemotongan maka sel-sel membentuk agregat massa sel yang disebut kalus. Massa kalus tersebut kemudian membelah kembali membentuk banyak kumpulan sel-sel meristem yang disebut primordia akar. Pembelahan sel terus berlangsung dari kumpulan sel membentuk ujung akar atau root tip (Rochiman & Harjadi 1973). Sistem pembuluh dibentuk dalam primordia akar dan membentuk hubungan dengan jaringan pembuluh didekatnya, ujung akar tersebut akan terus tumbuh menembus lapisan korteks dan epidermis membentuk akar adventif.
57
ED
Pr
E
SP I
Kr Ra R
M R
Gambar 36 Penampang melintang akar stek pasak bumi dengan perbesaran Keterangan: Rc: Root Cap Kr: Korteks Ep: Epidermis Ra: Hairy Root SP : Silinder Pusat
40x Ed: Endodermis Mr : Meristem Region
Pr Ia
: Prokambium : Intercelular Air Channel
b. Pembentukan tunas pasak bumi Tunas baru pada stek pasak bumi berasal dari tunas terminal yang tumbuh pada ketiak malai daun. Pada awal penanaman stek terlihat persentase bertunas stek yang cukup tinggi, hal ini terjadi karena penurunan kandungan auksin pada saat pemotongan bahan stek.
Menurunnya kandungan hormon auksin akan
menyebabkan tunas terminal pada stek yang sebelumnya berada pada kondisi dorman menjadi terpacu pertumbuhannya, fenomena tersebut merupakan akibat pengaruh hormon auksin terhadap dominasi apikal yang menurun. Bonga & Durzan (1987), menyatakan bahwa berkurangnya kandungan auksin pada bagian atas akan memacu pertumbuhan tunas karena kandungan sitokininnya meningkat. Pada akhir penelitian beberapa stek mengalami kematian, hal ini dikarenakan cadangan makanan yang tersimpan pada bahan stek lama kelamaan akan habis akibat proses fisiologis tanaman. Untuk proses selanjutnya stek akan tergantung pada suplai dari media stek, apabila stek belum berakar maka proses penyerapan dari media tanam oleh akar tidak terjadi, maka stek akan mengalami kematian.
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Kesimpulan dari penelitian ini adalah: 1.
Hasil perbanyakan secara generatif menunjukkan persentase berkecambah rata-rata tertinggi (34%) diperoleh pada media kombinasi pasir-tanah. Sidik ragam menunjukkan bahwa media tidak berpengaruh terhadap pertumbuhan pucuk semai (kecuali jumlah malai daun), namun berpengaruh terhadap jumlah dan panjang akar yang dihasilkan.
Media yang menghasilkan
parameter pertumbuhan terbaik adalah media arang sekam murni. 2.
Pasak bumi hasil perbanyakan secara generatif memiliki keragaman dalam populasi (He) yang tinggi yaitu sebesar 0,3076 dengan persentase pita polimorfik sebanyak 78,57%. Hal ini mengindikasikan bahwa heterogenitas individu pasak bumi dan kemampuan adaptasi terhadap perubahan lingkungan yang baik cukup tinggi.
3.
Pada perbanyakan dengan teknik stek pucuk, perbedaan media berpengaruh terhadap panjang akar sekunder pasak bumi, sedangkan pemberian Rootone F mempengaruhi persentase stek berakar, panjang akar primer dan jumlah akar primer dan sekunder. Akar stek pasak bumi berasal dari primordia akar yang berkembang menjadi akar adventif.
59
Saran Saran dari penelitian ini adalah 1.
Perlu adanya usaha untuk mencegah eksploitasi berlebihan terhadap pasak bumi dan menjaga kelangsungan hidupnya, walaupun secara genetik memiliki kemampuan adaptasi yang baik. Budidaya tanaman pasak bumi dengan teknik lain seperti kultur jaringan dan aeroponik sangat prospektif untuk menjaga keberadaan tanaman ini.
2.
Pasak bumi dapat diperbanyak dengan stek dan memiliki kemampuan regenerasi yang baik. Untuk menjaga kelangsunganya di alam seharusnya para pemburu pasak bumi liar menanam kembali batang pasak bumi yang telah dipanen agar dapat tumbuh kembali.
3.
Hasil perbanyakan secara generatif dan stek pucuk pada media tanam yang berbeda menghasilkan pola perakaran yang berbeda.
Dalam rangka
produksi metabolit sekunder akar perlu dilakukan kajian lebih lanjut mengenai hubungan pola perakaran dan teknik perbanyakan
dengan
kandungan metabolit sekuder akar yang dihasilkan. 4.
Dalam rangka kegiatan konservasi dan pemuliaan dimasa yang akan datang diperlukan adanya pembuatan kebun benih baik CSO (Clonal Seed Orchard ) maupun SSO (Seedling Seed Orchard) untuk menghasilkan genotipegenotipe yang unggul.
DAFTAR PUSTAKA Ang HH, Lee Kl and Kiyoshi M. 2003. Eurycoma longifolia Jack enhances sexual motivation in middle-aged male mice. J Basic Clin Physiol Pharmacol.14(3) 301-8. Anonim. 2007. Active content of Eurycoma http://content.nhiondemand.com [ 20 February 2007]. Anonim. 2007. Polimerase Chain Reaction. [20 Februari 2007].
longifolia
root.
Http//www. wikipedia. Org
[APG] Angiosperm Phylogeny Group. 2003. An update of the Angiosperm phylogeny group classification for the orders and families of flowering plants: APG II. Botanical Journal of the Linnean Society 141: 399-436. Bernard J. 1998. Molecular Biotechnology, Principles and Application of Recombinant DNA. University of Waterloo. Waterloo Ontario Canada. Bir D and Bilderback T. 2006. Plant Propagation by Stem Cutting. http://www.ces.ncsu.edu/depts/hort/nursery/pdf/cultural_practices/prop agation/rooting_4_you.pdf [20 February 2007]. Bonga JM and DJ Durzan. 1987. Cell and Tissue Culture in Forestry. Netherland: Martinus Nijhoff Publisher. Cameron RJ and Thomson GV. 1969. The vegetatif propagation of Pinus Radiata: root initiation on cutting. Bot.Gaz 130(4):242-251. Chan KL, Choo Cy and Abdullah NR. 2005. Semisynthetic 15-O-acyl- and 1,15-di-O-acyleurycomanones from Eurycoma longifolia as potential antimalarials. Planta Med 71(10): 967-9. Eriksson G, Ekberd I and Clapham D. 2006. An Introduction to Forest Genetic Second Edition. Uppsala: Genetic Center, Departemen of Plant Biology and Forest Genetik, SLU. Finkeldey R. 2005. Pengantar Genetika Hutan Tropis. E. Jamhuri , I.Z. Siregar, U.J. Siregar dan A.W. Kertadikara, penerjemah. Gottingen : Institute of Forest Genetics and Forest Tree Breeding Georg-August-UniverityGöttingen. Terjemahan dari : An Introduction to Tropical Forest Genetics. Hadiah
JT. 2000. Eurycoma longifolia Jack (Pasak bumi). http://www.bogor.indo.net.id/kri/eurycoma.htm [ 21 Februari 2007].
Hamric Jl, Godt MJW and Sherman-Broyles SL. 1992. Factor influencing level of genetic diversity in woody plant species. New For 6:96-124.
61
Heriyanto NM, Sawitri R dan Subiandono E. 2006. Kajian ekologi dan potensi Pasak Bumi (Eurycoma longifolia Jack) di kelompok hutan Sungai Manna-Sungal Bengkulu. Plasma Nutfah: 12:2. Harsono H. 2002. Pembuatan silika amorf dari limbah sekam padi. Jurnal Ilmu Dasar Vol 3 No 2: 98-103. Hartmann TH , Kester DE, Davies FT dan Geneve RL. 1997. Plant Propagation Principles and Practices. New Delhi: Prentice-Hall of India Private Limited. Heyne K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia Jilid III. Jakarta : Badan Litbang Kehutanan. Husen R, Pihie AH dan Nallappan M. 2004. Screening for antihyperglycaemic activity in several local herbs of Malaysia. J Ethnopharmacol 95:205-208. Hussein S, Ibrahim R, Kiong ALP, Fadzilah NM and Daud SK. 2005. Multiple shoot formation of important tropical mediclinal plant, Eurycoma longifolia Jack. J. Biotechnol 22: 349-351. Hosius B, Bergman F, Konnert M and Henkel W. 2000. A concept for seed orchard based on isoenzim gene marker. Elsever: Forest Ecology and Management. [IBG] Indonesian Botanic Garden. 1998. The Flora of Bukit Tiga Puluh National Park, Kerumutan Sanctuary And Mahato Protective Reserve Riau, Indonesia. Jakarta: Indonesian Botanical Garden. Lee SL, Wickneswari R, Mahani MC and Zakri AH. 2000. Genetic diversity of Dryobalanops aromatica gaertn.F (Dipterocarpaceae) in Peninsular Malaysia and its pertinence to genetic conservation and tree improvement. for genet 7:209-217. Li XL, Yu XM., Guo WL, Li YD, Liu XD, Wang NN and Liu B. 2006. Genomic diversity within Taxus cuspidata var nana revealed by Random Amplified Polimorphic DNA Marker. Russian Journal Of Plant Physiology Vol.53 No 5:684-688. Marliani L dan Wiguna I. 2007. Tongkat ali (Pasak Bumi). Jakarta: Trubus Gold Edition. Nainggolan O dan Simanjuntak JW. 2005. Pengaruh ekstrak etanol akar pasak bumi terhadap perilaku seksual mencit putih. Cermin Dunia Kedokteran 146: 47. Nasir M. 2002. Bioteknologi: Potensi dan Keberhasilannya dalam Bidang Pertanian. Jakarta: Rajawali Press.
62
Nurhanan MY, Azimahtol HLP, Mohd IA and Shukri MA. 2005. Cytotoxic effects of the root extracts of Eurycoma Longifolia Jack. Phytoter Res 19(11) 994-6. Oey Djoen Seng. 1990. Specific Gravity of Indonesian Wood and its Significance for Practical Use. Bogor: Badan Litbang Kehutanan. Osman A, Jordan B, Lessard PA, Muhammad N, Haron MR, Riffin NM, Sinskey AJ, Rha C, Housman DE. 2003. Genetic diversity of Eurycoma longifolia inferred from single nucleotide polymorphism. Plant Physiol 131: 1294 1301 Padua LS de. 1999. Plant Resources of South East Asia. Bibliography 12: Mediclinal Plant, Bagian ke-1 [bibliografi]. Bogor: Prosea Foundation. Promega. 2003. PCR Core System. USA. Promega Corporation. Qiagen. 2001. Hotstar Taq PCR Handbook. Germany: Qiagen. Renganayaki K, Read JC, Fritz AK. 2001. Genetic diversity among Texas bluegrass genotype revealed by AFLP and RAPD marker. Theor. App.Genet 102:1034-1045. Ridzuan M, Rain NA, Zhahri I and Zakiah I. 2005. Effect of Eurycoma longifolia extract on the glutathione level in Plasmodium Falciparum infected erythrocytes in vitro. J Trop Biomed 22(2) 155-63. Rifai MA. 1992. Eurycoma longifolia Jack. Di dalam Rifai et al. editor. Tiga Puluh Tumbuhan Langka Indonesia. Floribunda 2: 1-28. Rochiman K, Harjadi SS. 1973. Pembiakan Vegetatif. Bogor: Departemen Agronomi, Fakultas Pertanian IPB. Sakai C, Subiakto A, Nuroniah HS, Kamata N dan Nakamura K. 2002. Mass propagation method from the cutting of tree Dipterocarp species. J For Res 7:73-80. Sakai C dan Subiakto A. 2007. Pedoman Pembuatan Stek Jenis-Jenis Dipterokarpa Dengan KOFFCO System. Bogor: Kerjasama Badan Litbang Kehutanan, KOMATSU dan JICA. Sass JE. 1951. Botanical Microtechnique. Lowa:The Lowa State College Press. Schmidt L dan Danida Forest Seed Center. 2000. Pedoman Penanganan Benih Tanaman Huta Tropis Dan Sub Tropis. Jakarta: Departemen Kehutanan, Direktorat Jenderal Rehabilitasi Lahan dan Perhutanan Sosial. Setyowati MS. 2007. Keanekaragaman Pemanfaatan Tumbuhan Masyarakat di Sekitar Taman Nasional Gunung Leuser. Plasma nutfah
63
Sindelar RD, Walker LA, Sindelar RW, Vangapandu S dan Guo Z. 2005. Biologically active quassinoids and their chemistry: potential leads for drug design. Current Medicinal Chemistry 12:173-190. Siregar LAM, Keng KL and Lim BP. 2005. Production of alkaloid from callus culture and cell suspencion of Eurycoma longifolia Jack. Di dalam: National Seminar of Mediclinal Plant XXVII; Bogor, 15-16 Sep 2005. Bogor: ISMECRI-POKJANAS. Sitepu D , Sutigno P. 2001. Peranan tanaman obat dalam pengembangan hutan tanaman. Http:// www. dephut.go.id [20 februari 2007]. Soerianegara I dan Djamhuri E. 1979. Pemuliaan Pohon Hutan. Bogor: Fakultas Kehutanan, Institut Pertanian Bogor. [SPB] Sumatra Pasak Bumi. 2007. Chipped tongkat ali root and tongkat ali root powder. http://www.tongkatali.org/index.htm [20 Februari 2007]. Strzelecka K. 2007. Anatomical structure and adventitious root formation in Rhododendron ponticum L cutting. Acta. Sci. Pol 6(2). Tumbuhan Obat Indonesia, Penggunaan dan Khasiatnya. Ed ke- 1 . Jakarta: Pustaka Populer Obor.
Supriadi. 2001.
Suryo. 1986. Genetika. Yogyakarta : UGM Press. Syros T, Yupsanis T, Zafiriadis H and Economou A. 2004. Acticity and isoforms of peroxidases, lignin and anatomy, during adventitious rooting in cuttings of Ebenus cretica L. Plant Physiol 161: 69–77. Tada H, Yasuda F, Otani K, Doteuchi M, Ishihara Y and Shiro M. 1991. New antiulcer quassinoids from Eurycoma longifolia . Eur J Med Chem . 26:345-349. Thomas.
1995. Pengaruh Mulsa Terhadap Pertumbuhan dan Efisiensi Penggunaan Air Pada Bibit Karet Klon GT 1. Sumatera Selatan: Sembawa
Toenyan N . 2006. Cutting Propagation For PNV Native Shrub & Trees. Http//www.fs.fed.us [ 20 Februari 2007]. Wudianto R. 1998. Swadaya.
Membuat Stek Cangkok dan Okulasi. Jakarta: Penebar
Wattimena GA dan Gunawan LW. 1992. Bioteknologi Tanaman. Bogor: Pusat Antar Universitas Bioteknologi IPB.
64
Wong KM dan Soepadmo E. 1995. Tree Flora of Sabah and Sarawak. Vol ke-1. Sabah: Sabah Forestry Departement and Forest Research Institute Malaysia. Yasman I dan Hernawan. 2002. Manual Persemaian Dipterocarpaceae. Jakarta: Badan LitBang Kehutanan. Yasman I dan Smits WTM. 1988. Metode Pembuatan Stek Dipterocarpaceae. Samarinda: Departemen Kehutanan. Badan Penelitian dan Pengembangan Kehutanan, Balai Penelitian Kehutanan. Zobel B and Talbert J. 1984. Applied Forest Tree Improvement. New York: Jhon Willey and Sons.
