Tehnik yang digunakan untuk mengetahui posisi DNA-binding protein terikat pada molekul DNA. K32-PIT-01 Disusun oleh: Didi Susanto
B1J006187
Lutfi Hadi Gunawan B1J006189 Bahtiar Efendi
B1J006191
Teknik ini dapat dibagi menjadi tiga 1. Metode mengidentifikasi daerah pada molekul DNA dimana protein diikat Banyak metode dilakukan untuk mengetahui letak DNA-binding protein ; -
Gel retardation : dapat membedakan DNA “telanjang” dan DNA yang terikat protein. Dengan elektroforesis gel agarosa terlihat bahwa fragmen yang lebih kecil akan bermigrasi lebih cepat daripada fragmen yang beasr. Bila DNA terikat protein maka migrasinya akan terganggu sehingga kompleks DNA dan protein akan membentuk pita yang lebih dekat ke titik mulai. Tehnik ini memerlukan beberapa frgmen pemotong yang dapat menjangkau daerah yang diperkirakan mengandung daerah protein pengikat.
-
Modification protection assay : prinsip kerjanya bila molekul DNA terikat protein, maka bagian urutan n\ukleotidanya akan dilindungi dari modifikasi, modifikasi dapat dilakukan dengan 2 cara : a. perlakuan dengan nuclease b. pemaparan pada agen metilasi.
-
Modification interference : mengidentifikasi nukleotida utama pada protein pengikat, prinsip kerjanya jika sebuah nukleotida penting pada protein pengikat dirubah, missal dengan penambahan gugus metal, maka ikatan akan dicegah.
2. Metode pemurnian DNA binding protein teknik ini memanfaatkan kemampuan dari protein untuk mengikat ke situs sasarannya teknik pemurnian yang mengikat dna dengan protein dibagi menjadi 2 : kromatografi afinitas dan setelah urutan diketahui ddari posisi yang telah di identifikasi dapat digunakan untuk mendegradasi ikatan dna protein. Metode ini dibagi menjadi 2 yaitu •
Affinitas kromatografi
teknik memanfaatkan kemampuan dari protein untuk mengikat ke situs sasarannya. Dalam teknik ini yang digunakan dalam menghilangkan/mengeliminasi protein histone melalui pencegahan kromatografi dengan cara memutus ikatan ke tempat target. Prosesnya yaitu ekstrak protein yang telah lolos di kolom dengan garam penyangga yang rendah akan berikatan dengan target, kemudian protein yang tidak diinginkan akan dilepaskan dalamm kolom garam penyangga yang tinggi •
Pemisahan kumpulan klon
Pemurnian ini menggunakan klon cDNA dimasukkan ke membrane nilon yang kemudian teridentifikasi sehingga dapat melakukan ekspresi. Pengidentifikasian klon terjadi dengan mendeteksi label dna yang terletak di membrane. Koloni ini memiliki fungsi melabeli DNA yang mengandung protein. Penghilangan protein histon pada metode ini terjadi melalui membrane. 3. Metode untuk mempelajari struktur tersier pada protein Pengikat dna, termasuk struktur kompleks yang yang terbentuk saat protein diikat pada DNA. Metode ini menggunakan sampel murni DNA-binding protein. Hal ini menyediakan informasi paling rinci mengenai interaksi DNA-protein agar struktur dari DNA-binding tepat
pada bagian suatu protein yang akan ditentukan dengan
menggunakan sionar X-ray crystallography dapat dalam bentuk X-ray crystallography NUKLIR dan X-ray crystallography MAGNETIk. X-ray crystallography mempunyai aplikasi yang luas. Kompleksitas metodologi yang digunakan untuk menentukan struktur molekul dari pola difraksi. Prinsipnya bahwa
posisi spot menunjukkan penataan
beberapa molekul dalam Kristal dan intesitas relatif memberikan informasi mengenai struktur dari molekul. bahwa molekul yang lebih kompleks, semakin besar jumlah bintikbintik, maka lebih besar perbandingan yang haru dibuat.
SITUS TERKAIT : http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi?key=DNA%20binding%20protein
http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/prot_dna/prot_dna.html
