2015.02.14.
Tartalomjegyzék
PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR
A fény; www.aok.pte.hu
Abszorpciós spektroszkópia
Elektromágneses hullám kölcsönhatása anyaggal;
(Nyitrai Miklós; 2015 január 27.)
Az abszorpció mérése;
Az abszorpció definíciója;
Alkalmazások; Speciális problémák, esetek. www.aok.pte.hu
Emlékeztetõ
Emlékeztetõ
Elektromágneses hullámok terjedése növekvõ energia távoli vörös
vörös
760nm
narancs 647nm
sárga
586nm
535nm
zöld
kék 492nm
ibolya 422nm
UV
390nm
Hogyan függ össze a frekvencia, hullámhossz és energia?
A fény transzverzális elektromágneses hullám. www.aok.pte.hu
Spektroszkópia
www.aok.pte.hu
Fényelnyelés híg oldatokban energia (eV)* hullámhossz (nm) frekvencia (Hz)
- transzmittancia - abszorpció
hullámhossz tart.
sp.-i módszer *1eV = 1,602 x 10-19 J = 3,83 x 10-20 cal
www.aok.pte.hu
www.aok.pte.hu
1
2015.02.14.
Transzmittancia I
I0 fényforrás
Abszorpció vagy fényabszorpció detektor
anyag T = I / I0
Általában százalékban (%) adjuk meg
www.aok.pte.hu
Megj.: hasonló a radioaktív bomlás egyenletéhez!
Abszorpció I0
Minta (homogén)
I = I0 exp (-kx) vagy
Exponenciális I = I0 e-kx függvény!!!
fény intenzitás
www.aok.pte.hu
N = N0 exp (-λt)
vagy N = N0 e-λt
I távolság www.aok.pte.hu
Megj.: eltérõ ábrázolások minta
Mi áll a megfigyelések hátterében?
Ez is exponenciális!
intenzitás
I0
www.aok.pte.hu
A Born-Oppenheimer közelítés: Mag mozgás vs. elektron mozgás.
I ln(távolság) www.aok.pte.hu
www.aok.pte.hu
2
2015.02.14.
Az energia felbontása
Például vízmolekula rezgései
Eösszes = Eelektron + Evibrációs + Erotációs Az egyes energia típusok megváltozása független. A megváltozás írható mint: ∆Eösszes = ∆Eelektron + ∆Evibrációs + ∆Erotációs http://www1.lsbu.ac.uk/water/vibrat.html www.aok.pte.hu
Energia séma: sávos spektrum
www.aok.pte.hu
Az energia felbontása
Az energia típusok nagyságrendje: ∆Eelektron ~ 1,000 * ∆Evibrációs ~ 1,000,000 * ∆Erotációs
www.aok.pte.hu
Az abszorpció értelmezése Gerjesztett-állapot
www.aok.pte.hu
Az abszorpció definíciója A cél:
Vibrációs relaxáció (10-12s)
S1 S1 → T1: rendszerek közötti átmenet (10-10 – 10-8 s)
gerjesztés (10-15s) S0 – S 1 hν S0
- legyen könnyen érthetõ - legyen jól mérhetõ
T1
- legyen additív T1 → S0 (10-3 – 10-1s )
5 4 3 2 1 0
vibrációs szintek
Megj.: a transzmittancia (T = I / I0) nem additív: ha az egyik komponens átenged 50%-ot, a másik 60%-ot, akkor a kettõ együtt NEM 110%-ot fog átengedni!
Alap-állapot www.aok.pte.hu
www.aok.pte.hu
3
2015.02.14.
A távolságfüggés más formában I0
abszorpció
intenzitás
minta
Miért ε(λ) és nem csak ε?
I távolság
I = I0 10-ε(λ) c x Paraméterek definíciója!
Miért ε(λ) és nemcsak ε ?
λ (nm) Az ε értéke λ függõ!
www.aok.pte.hu
Fotometriai mérések megvalósítása
Az abszorpció definíciója I
I0
www.aok.pte.hu
fotometriai = abszorpciós spektroszkópiai
anyag
OD = A = - log (I / I0) = ε (λ) c x Röv.: „optical density”
I = I0 10-ε(λ) c x www.aok.pte.hu
Hogyan mérjük az abszorpciót? Egy fotométer egyszer; sémája. fényforrás
monokromátor
minta
www.aok.pte.hu
Spektrofotométer Fõ komponensek:
detektor
1. Fényforrás • UV fényforrás (~180-350nm): Deutérium lámpa • Látható fény forrása (~350-800nm): Wolfram-izzó 2. Monokromátor: egyedi hullámhosszak kiválasztása. 3. Mintatartó: a minta és a referencia behelyezése a fényforrás és a detektor közé (küvetta: kisméretS, fényáteresztõ mintatároló egység) 4. fotodetektor: PMT, dióda… 5. Egyebek: lencsék, szSrõk, rések. www.aok.pte.hu
www.aok.pte.hu
4
2015.02.14.
Hogyan m;ködik a prizma? Hogyan m;ködik a prizma?
www.aok.pte.hu
A törésmutató hullámhosszfüggése
www.aok.pte.hu
A törésmutató hullámhosszfüggése
Monokromatikus fény
n
Fehér fény
piros sárga lila
λ
λ
www.aok.pte.hu
www.aok.pte.hu
Egy és két-utas fotométerek A fehérjék abszorpciója
Miért használunk referencia mintát?
www.aok.pte.hu
www.aok.pte.hu
5
2015.02.14.
A fehérjék abszorpciójának értelmezése
A fehérjék abszorpciója
www.aok.pte.hu
Alkalmazás: fehérjekoncentráció meghatározása
www.aok.pte.hu
Miért jó az additivitás? (példa)
A mért abszorpció: A
abszorpció
Szükség van egy ‘referencia’ számra (kalibráció): extinkciós koefficiens: ε ε szokásos egységei: M-1cm-1, vagy (mg/ml)-1cm-1 Ha A = 0.55 és ε = 1.1 (mg/ml)-1cm-1
fluoreszcens próba fehérje
c = (A/ ε) mg/ml-ben; c = 0.5 mg/ml
λ (nm) www.aok.pte.hu
Példa egy másik alkalmazásra: elektroforézis kiértékelése
www.aok.pte.hu
A lényeg - az abszorpció jelensége, értelmezése;
0.8
- az abszorpció definíciója;
0.6
- az abszorpció mérése;
S
1.0
0.4
- az abszorpció alkalmazásai.
0.2 0.0 0
5 10 15 [mDia3-FH2] (µM)
20 www.aok.pte.hu
www.aok.pte.hu
6
2015.02.14.
Köszönöm a figyelmet!
www.aok.pte.hu
7
