Egyed szintje
Ökoszisztéma
Szervrendszerek szintje
Szervek szintje
Sejtek szintje Szöveti szint Molekulák szintje
Atomok szintje
TARTALOM: 1. Molekuláris biológiai/genetikai technikák 2. A genomika technikái 3. Komplex technikák Más előadásokban kerülnek tárgyalásra
TARTALOM (1): 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
Molekuláris klónozás Polimeráz láncreakció (PCR) Gél elektroforézis Makromolekulák kimutatása Gél retardáció Footprint analízis Immunhisztokémia In situ hibridizáció FRET Áramlásos citometria FACS
1. Molekuláris klónozás a. Restrikciós endonukleázok
b. DNS ligázok c. Plazmid vektorok d. Restrikciós/ligálásos klónozás e. Egyéb enzimek
A restrikciós enzimek 1978
Werner Arber
Daniel Nathans
Hamilton O. Smith
EcoRI
1
A restrikciós enzimek VÁGÁS ELŐTT 5’ túlnyúló vég: (pl. EcoRI)
3’ túlnyúló vég: (pl. KpnI)
Tompa vég: (pl. SmaI)
VÁGÁS UTÁN
5’-…GAATTC…-3’ 3’-…CTTAAG…-5’
5’-…G-3’ 3’-…CTTAA-5’
5’-AATTC…-3’ 3’-G…-5’
5’-…GGTACC…-3’ 3’-…CCATGG…-5’
5’-…GGTAC-3’ 5’-C…-3’ 3’-…C-5’ 3’-CATGG…-5’
5’-…CCCGGG…-3’ 3’-…GGGCCC…-5’
5’-…CCC-3’ 3’-…GGG-5’
5’-GGG…-3’ 3’-CCC…-5’
RESTRIKCIÓS – MODIFIKÁCIÓS RENDSZER EcoRI metiláz
CH3
EcoRI RE nem vág
5’-…GAATTC…-3’ 3’-…CTTAAG…-5’ CH3
X
5’-…G-3’ 3’-…CTTAA-5’
5’-AATTC…-3’ 3’-G…-5’
1
DNS ligáz DNS ligáz
Egy DNS molekula
Két DNS molekula
2
Plazmidok 1. Kisméretű nagy kópiaszámú
1. Fertilitás plazmidok 2. Rezisztencia plazmidok 3. Virulencia plazmidok
2. Nagyméretű kis kópiaszámú
3
3
Plazmid vektorok 1. Klónozó vektorok
2. Génbeviteli vektorok 3. Génexpressziós vektorok
3
Plazmid vektorok Plazmid vektor
Rekombináns plazmid
Molekuláris klónozás EcoRI hely
EcoRI hely
Eredeti DNS molekulák: EcoRI enzim
Ligáz
Rekombináns DNS molekula:
3
Molekuláris klónozás Plazmid vektor
DNS fragments
Rekombináns plazmid
Rekombináns plazmid előállítása ligálással
Transzformáció (sejtbe juttatás)
Sokszorozódás a sejtben
Baktérium sejtek sokszorozódása
Egy kolónia egyetlen sejtből származik
E. coli
4
4
lac operon
DNS P lacI
C
E
O
lacZ
represszor CAP hely pol kötő hely operátor
lacY
lacA
strukturális gének
laktóz
rep
T
DNS
terminátor
lacZ gén - X-Gal kromogén szubsztrát DNS P lacI
C
E
rep O
lacZ
represszor CAP hely pol kötő hely operátor
lacY
strukturális gének
IPTG indoxyl galaktóz
X-Gal
lacA
T
DNS
terminátor
4
lacZ gén - X-Gal kromogén szubsztrát DNS P lacI
C
E
rep O
lacZ
represszor CAP hely pol kötő hely operátor
pol
lacY
lacA
strukturális gének
-gal
permeáz
T
DNS
terminátor
transzacetiláz
4
lacZ gén a klónozásban
4
lacZ
DNS P lacI
C
E
O
-fragment
represszor CAP hely pol kötő hely operátor
lacZ -fragment
lacZ-
lacA
strukturális gének
Idegen DNS lacZ-
lacY
T
DNS
terminátor
Egyéb enzimek a klónozásban 5’-AGTGGGAATTCAAGGC-3’ 3’-TCACCCTTAAGTTCCG-5’
5’-AGTGGG-3’ 3’-TCACCCTTAA-5’
5’-AATTCAAGGC-3’ 3’-GTTCCG-5’
EcoRI hasítás
- Klenow fragment
5’-AGTGGGAATT-3’ 3’-TCACCCTTAA-5’
- S1 nukleáz
5’-AGTGGG-3’ 3’-TCACCC-5’
- Alkalikus foszfatázok
5’-AGTGGG-OH-3’ 3’-TCACCCTTAA-P-5’
5’- P 3’-HO
OH-3’ P - 5’
5’-AATTCAAGGC-3’ 3’-TTAAGTTCCG-5’ 5’-CAAGGC-3’ 3’-GTTCCG-5’ 5’-P-AATTCAAGGC-3’ 3’-HO-GTTCCG-5’
defoszforiláció
P - 5’
5’-AGTGGG-OH-3’ 3’-TCACCCTTAA-5’
5’-AATTCAAGGC-3’ 3’-HO-GTTCCG-5’
5
6
2. PCR: 1993
polimeráz lánc reakció
Forward primer Reverz primer
denaturáció
annealing
szintézis
1. ciklus 2. ciklus 3. ciklus
A PCR reakcióhoz szükséges: 1. DNS templát 2. DNS polimeráz 3. Két primer 4. dNTP-k 5. Puffer
PCR Denaturáció (2 DNS szál szétválik)
Összekapcsolás (a primer kapcsolódása az egyszálú DNS-ekhez)
melegítés 94 - 96 C°-ra hűtés 60 - 65 C°-ra
Primer
Szintézis (új DNS szál képződése a primerről a DNS pol által)
melegítés 68 - 72 C°-ra
Új DNS
Régi DNS
6
A DNS mennyisége minden ciklusban duplázódik (optimális körülmények között)
3. Gél elektroforézis a. Agaróz gél elektroforézis b. Poliakrilamid gél elektroforézis (PAGE)
7
Agaróz gél elektroforézis
Molekulasúly marker
7
Agaróz gél elektroforézis
7
Etidium bromidban való áztatás
A DNS csíkok fluoreszkálnak
UV
UV
UV
Poliakrilamid gél elektroforézis
7
Molekulasúly marker
40 nukleotid
gél
10 nukleotid
7
SDS-PAGE
Sodium dodecil szulfát – poliakrilamid gél elektroforézis
Fehérje 2 alegysége diszulfid híddal összekötve
Egy alegységből álló fehérje
-S-S-
SH HS
Negatív töltésű SDS molekulák C
A
B
A C B
A futás független a (1) molekulaszerkezettől (denaturáció) (2) és az aminosav összetételtől (maszkírozó hatás)
4. Makromolekulák kimutatása a. Southern blot b. Northern blot c. Western blot d. Eastern blot
8
Southern blot DNS Restrikciós emésztés Gél elektroforézis
Sir Edwin Southern
Nitrocellulóz membrán
Nitrocellulóz Gél
Filter papír
Lúgos oldat DNS transzfer a kapilláris erő felhasználásával: gélről nitrocellulóz membránra
Hibridizáció radioaktívan jelölt DNS próbával
Autoradiogram
8
Southern blot (A) DNS transzfer gélről a membránra DNS Megemésztett marker DNS
Papír törölköző Nylon membrán Gél
Puffer
Nylon membrán
Agaróz gél
(B) Hibridizációs analízis
P
Jelölt DNS próba
Hibridizáló csíkok Nylon membrán
Röntgen film
9
Northern blot Sejtek, szövetek
RNS kivonat
RNS marker
RNS Agaróz gél elektrofotézis
RNS minta (hasonlóan a genomiális DNS-hez, nincsenek nem egzakt csíkok a molekulák heterogenitása miatt)
Blottolás Szűrő papír
Nitrocellulóz Gél
Hibridizáció és autoradiográfia
9
Northern blot Sejtek
RNS kivonat
Gél elektroforézis
RNS minta
Elektroblot Blottolás, Northern hibridizáció, autoradiográfia
DNS próba hibridizációja a komplementer RNS molekulához
10
Western blot (A) Elektroforézis/transzfer
Elektromos áram
SDS-PAGE
(B) Antitest reakció
Inkubáció antitest-1-el: Ab1( )
Membrán
Inkubáció enzimmel kötött antitesttel: Ab-2 ( )
(C) Színreakció
Szubsztrát hozzáadása
5. Gél retardáció analízis DNS/fehérje kölcsönhatás kimutatása Restrikciós fragmensek
DNS marker
Restrikciós fragmensek + magi proteinek
11
6. Footprint analízis
12
DNS/fehérje kölcsönhatás kimutatása Végjelölt restrikciós fragmensek - sejtmagi kivonat
Végjelölt restrikciós fragmensek + sejtmagi kivonat
DNS-kötő protein Részleges DNáz-I emésztés
Footprint
Gél elektroforézis, autoradiográfia
Footprint (lábnyom)
7. Immunhisztokémia
13
- immunfluoreszcencia
fluoreszcens festék
A
Y
B
C
B B
B
A
D citoplazma
Közvetlen (direkt) módszer
C
sejtfelszíni antigének citoplazmatikus antigének
E sejtmag
nyúl anti-C elsődleges antitest
B
B
sejtfelszíni antigének citoplazmatikus antigének
Y Y
anti-C antitest
kecske anti-nyúl másodlagos antitest
E sejtmag
D citoplazma
Közvetett (indirekt) módszer
7. Immunhisztokémia
13
- immunperoxidáz módszerek
DAB + H2O2
Ni-DAB + H2O2
- peroxidáz – diamino-benzidin (peroxid jelenlétében): barna csapadék
Y Y
- biotin – avidin – peroxidáz
peroxidáz
Kecske anti-nyúl antitest (másodlagos antitest)
B
A
Y Y
peroxidáz
kecske anti-nyúl másodlagos antitest nyúl anti-C elsődleges antitest
Nyúl anti-C antitest
C
B
B
sejtfelszíni antigének citoplazmatikus antigének
sejtmag
D citoplazma
biotin peroxidáz
anti-nyúl antitest (másodlagos antitest)
Közvetett (indirekt) módszer
Y Y
E
anti-C antitest
peroxidáz peroxidáz
avidin
7. Immunhisztokémia
13
- immunperoxidáz módszerek
DAB + H2O2
Ni-DAB + H2O2
ABC módszer (ABC = avidin-biotin complex)
Y Y
avidin biotin peroxidáz
anti-nyúl antitest (másodlagos antitest)
elsődleges antitest antigén
Y Y
7. Immunhisztokémia alk. foszfatáz
- digoxigenin – anti-digoxigenin – alkalikus foszfatáz
B
A
Y Y
alkalikus foszfatáz
Y Y
- alkalikus foszfatáz
13
kecske anti-nyúl másodlagos antitest nyúl anti-C elsődleges antitest
anti-nyúl antitest
anti-C antitest
C
B
B
sejtfelszíni antigének citoplazmatikus antigének
alk. foszfatáz
E
citoplazma
Közvetett (indirekt) módszer
alk. foszfatáz
DIG
anti-nyúl antitest
anti-C antitest
Y
D
Y Y
sejtmag
DIG
anti-C antitest
8. In situ hibridizáció A próba jelölése:
14
- DNS vagy mRNS kimutatása
Radioaktív
1. Radioaktív (S35) 2. Nem radioaktív - fluoreszcens - enzimatikus
S35
Fluoreszcens
biotin
Enzimatikus
fluoreszcens festék
sztreptavidin
FISH
próba (DNS vagy RNS)
avidin
peroxidáz
biotin
anti-DIG antitest
cél-DNS
DIG fluoreszcens festék fluoreszcencia
Anti-DIG antitest DIG
próba cél-DNS
DIG anti-DIG-peroxidáz
Fluoreszcens in situ hibridizáció 14 Metafázisos kromoszóma Osztódó sejt tárgylemez
A DNS denaturálódik
Fluoreszcens jelölés
9. FRET
Kék fluoreszcens protein
UV fény gerjesztés
Kék fény kibocsátás
Sárga fluoreszcens protein Kék fény gerjesztés
Protein X
Sárga fény kibocsátás
Protein Y
Nincs fehérje kölcsönhatás UV fény
15
Fluorescence resonance energy transfer
Kék fény
Van fehérje kölcsönhatás UV fény
Sárga fény
16
10. Áramlásos citometria Flow cytometry PMT4
Minta
PMT3 Fotomultiplier-ek
Kétszínű szűrők
PMT2 PMT1
sejtek szűrők Scatter detektorok Lézer Válogató
11. FACS
17
Fluorescence activated cell sorting Minta
Burok folyadék vörös fluoreszcencia
Fénysugár megosztó
Zöld fluoreszcencia
Lézer
900 fényszóró (garnularitás)
Töltő gallér Detekciós lemezek
„Előre” fényszóró (méret)
Gyűjtő csövek
Hulladék
