Szelektin és ösztrogén-receptor génpolimorfizmusok jelentősége perinatális gyulladásban, praeeclampsiában Doktori értekezés
Dr. Derzbach László Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Vásárhelyi Barna tudományos főmunkatárs Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Balogh Attila Ph.D. Dr. Tóth Miklós Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Szalai Csaba az MTA tagja Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Hermann Róbert tudományos főmunkatárs Ph.D. Dr. Pós Zoltán tudományos munkatárs Ph.D.
Budapest 2006.
TARTALOMJEGYZÉK 1.
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
2.
BEVEZETÉS
11
2.1 2.1.1 2.1.2 2.2 2.2.1 2.2.2
11 11 12 15 16
2.4.1.3.1.3 2.4.1.3.2 2.4.1.3.2.1 2.4.1.3.2.2 2.4.2 2.4.2.1 2.4.2.2 2.5 2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.4
A perinatális gyulladás Gyulladás kezdeti fázisa: adhézió Szelektinek Szelektinek szerepe a perinatális szövődményekben A magzati gyulladásos válaszreakció szindróma kialakulása A magzati gyulladásos válaszreakció szindróma és a koraszülés A magzati gyulladásos válaszreakció szindróma és a tüdőkárosodás A magzati gyulladásos válaszreakció szindróma és az idegrendszeri károsodások Praeeclampsia – a koraszülés fontos kockázati tényezője Immunmoduláció elméleti lehetőségei Foszfodiészteráz enzim gátlás Az adenozin és adenozin-receptorok jelentősége a gyulladásos folyamatok szabályozásában A foszfodiészteráz enzimek jelentősége a gyulladásos folyamatok szabályozásában A foszfodiészteráz enzim bénítók Pentoxifillin A pentoxifillin in vitro immunmoduláns hatása A pentoxifillin immunmoduláns hatása állatkísérletekben A pentoxifillin immunmoduláns hatásai emberben Szelektív foszfodiészteráz enzim (PDE) bénítók Szelektív PDE4 gátlók Szelektív PDE3 gátlók Ösztrogénpótlás Az ösztrogének hatásmechanizmusa Ösztrogénpótlás elméleti háttere Genetikai polimorfizmusok E-szelektin Ser128Arg polimorfizmus P-szelektin Thr715Pro polimorfizmus L-szelektin Pro213Ser polimorfizmus ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus
3.
CÉLKITŰZÉSEK
34
3.1 3.1.1
Genetikai polimorfizmus-vizsgálatok Szelektin polimorfizmusok koraszülöttségben és perinatális kórképekben Szelektin polimorfizmusok jelentősége praeeclampsiában
34
2.2.3 2.2.4 2.3 2.4 2.4.1 2.4.1.1 2.4.1.2 2.4.1.3 2.4.1.3.1 2.4.1.3.1.1 2.4.1.3.1.2
3.1.2
3
7
17 17 18 19 21 21 22 23 24 25 25 25 26 26 26 27 27 27 28 26 30 31 32 32
34 34
3.1.3
Ösztrogén receptor-α (ER-α) PvuII polimorfizmus jelentősége perinatális kórképekben ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus jelentősége praeeclampsiában Funkcionális vizsgálatok Pentoxifillin (PTXf) immunmoduláns hatásainak vizsgálata 17β-ösztradiol immunmoduláns hatásainak vizsgálata Kapcsolat vizsgálata az L- és P-szelektin polimorfizmus hordozás és expresszió között
36
4.
BETEGEK ÉS MÓDSZEREK
37
4.1 4.1.1 4.1.1.1
Betegek Genetikai polimorfizmus vizsgálatok A szelektin polimorfizmusok és koraszülöttség, perinatális morbiditás kapcsolatának vizsgálata A szelektin polimorfizmusok praeeclampsiában Az ER-α PvuII polimorfizmus perinatális morbiditásban Az ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus praeeclampsiában Funkcionális vizsgálatok A nem szelektív PDE gátló pentoxifillin immunmoduláns hatásának vizsgálata A 17-β-ösztradiol immunmoduláns hatásának vizsgálata Szelektin génpolimorfizmus és expresszió közötti kapcsolat Módszerek DNS izolálás DNS izolálás szűrőpapírra beszárított vérmintából DNS izolálás kisózással Polimeráz láncreakció, restrikciós fragment hossz polimorfizmus (PCR-RFLP) módszerek protokollja Szelektin polimorfizmusok vizsgálata PCR-rel ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus vizsgálata PCR-rel Flow citométeres vizsgálati módszerek 17-β-ösztradiol és pentoxifillin hatásának vizsgálata neutrofil granulocita és monocita fagocita képességére Mintaelőkészítés Flow citométeres analízis 17-β-ösztradiol és pentoxifillin hatásának vizsgálata neutrofil granulocita és monocita reaktív oxigéngyök termelő képességére Mintaelőkészítés Flow citométeres analízis 17-β-ösztradiol és pentoxifillin hatásának vizsgálata neutrofil granulocita és monocita aktiválhatóság mértékére. Trombocita aktiválhatóság vizsgálata Minták előkészítése Flow citométeres analízis Statisztikai elemzés Bevezetés Allélfrekvencia kiszámítása
37 37
3.1.4 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3
4.1.1.2 4.1.1.3 4.1.1.4 4.1.2 4.1.2.1 4.1.2.2 4.1.2.3 4.2 4.2.1 4.2.1.1 4.2.1.2 4.2.2 4.2.2.1 4.2.2.2 4.2.3 4.2.3.1 4.2.3.1.1 4.2.3.1.2 4.2.3.2 4.2.3.2.1 4.2.3.2.2 4.2.3.3 4.2.3.3.1 4.2.3.3.2 4.2.4 4.2.4.1 4.2.4.1.1
4
34 35 35 35 35
37 39 41 42 43 43 43 43 43 43 43 44 44 44 46 48 48 49 50 51 52 53 54 55 55 57 57 57
4.2.4.1.2 4.2.4.1.3 4.2.4.2
4.2.4.6 4.2.4.7 4.2.4.8
Hardy-Weinberg egyensúly és számítása 58 Power analízis 58 A szelektin polimorfizmusok és koraszülés, perinatális morbiditás kapcsolata 59 A szelektin polimorfizmusok és praeeclampsia kapcsolata 59 Az ER-α PvuII polimorfizmus és perinatális morbiditás kapcsolata 59 Az ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus és praeeclampsia kapcsolata 61 A nem szelektív PDE gátló pentoxifillin immunmoduláns hatása 61 A 17-β-ösztradiol immunmoduláns hatásának vizsgálata 61 Polimorfizmus és funkció közötti kapcsolat vizsgálata 61
5.
EREDMÉNYEK
62
5.1 5.1.1
62
5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3
Genetikai polimorfizmus-vizsgálatok Szelektin polimorfizmusok koraszülöttségben és perinatális kórképekben Szelektin polimorfizmusok praeeclampsiában Az ER-α PvuII polimorfizmus perinatális kórképekben Az ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus praeeclampsiában Funkcionális vizsgálatok Pentoxifillin immunmoduláns hatásainak vizsgálata 17-β-ösztradiol immunmoduláns hatásainak vizsgálata Kapcsolat vizsgálata a polimorfizmus és a funkció között
62 63 64 65 67 67 68 69
6.
MEGBESZÉLÉS
70
6.1 6.1.1
70
6.2.3
Genetikai polimorfizmus vizsgálatok A szelektin polimorfizmusok és koraszülöttség, perinatális morbiditás kapcsolata A szelektin polimorfizmusok és praeeclampsia kapcsolata Az ER-α PvuII polimorfizmus és perinatális morbiditás Az ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus és praeeclampsia Funkcionális vizsgálatokkal kapcsolatos megbeszélés A nem szelektív PDE gátló pentoxifillin és 17β-ösztradiol immunmoduláns hatásainak összefüggései Polimorfizmusok és funkció közötti kapcsolat vizsgálata
7.
TÉZISEK
80
8.
ÖSSZEFOGLALÁS
81
9.
SUMMARY
82
10.
TÁBLÁZAT ÉS ÁBRAJEGYZÉK
83
10.1
Táblázatok jegyzéke
83
4.2.4.3 4.2.4.4 4.2.4.5
6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.2 6.2.1-6.2.2
5
70 72 73 75 77 77 79
10.2
Ábrák jegyzéke
84
11.
IRODALMI HIVATKOZÁSOK
86
12.
ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT, KÖZLÉSRE ELFOGADOTT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE
106
13.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
107
14.
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT, KÖZLÉSRE ELFOGADOTT CIKKEK KÜLÖNLENYOMATA
109
6
1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACE
angiotenzin konvertáz enzim
ADP
adenozin-difoszfát
ALT
alanin-aminotranszferáz
AP-1
aktivátor protein-1
APC
allofikocianin
ARF
akut veseelégtelenség (acute renal failure)
AST
aszpartát-aminotranszferáz
ATP
adenozin-trifoszfát
BMI
testtömegindex (body mass index)
BPD
bronchopulmonalis dysplasia
cAMP
ciklikus adenozin-monofoszfát
cGMP
ciklikus guanozin-monofoszfát
CD
differenciációs marker (cluster of differentiation)
CD62E
E-szelektin
CD62L
L-szelektin
CD62P
P-szelektin
COPD
krónikus obstruktív tüdőbetegség (chronic obstructive pulmonar disease)
DHR123
dihidrorodamin 123
dNTP
dezoxiribóz nukleotid-trifoszfát
FITC
fluoreszcens izotiocianát
E2
17β-ösztradiol
EDTA
etilén diamin tetraecetsav
EGF
epidermális növekedési faktor (epidermal growth factor)
eNOS
endoteliális nitrogén-monoxid szintetáz
ER-α
ösztrogén receptor-α
ESGL-1
E-szelektin glikoprotein ligand-1
F
forward primer
FEV-1
1. másodpercre eső erőltetett kilégzési volumen (forced exspiratory volume-1sec)
7
FIRS
magzati gyulladásos válaszreakció szindróma (fetal inflammatory response syndrome)
fMLP
N-formyl-MetLeuPhe
FSC
sejt méretet mutató flow citométeres csatorna (forward
scatter)
FSH
follikuláris stimuláló hormon
FVC
erőltetett vitálkapacitás (forced vital capacity)
GM-CSF
granulocita-monocita colonia stimuláló faktor
Gs
stimuláló G-protein
GTP
guanozin-trifoszfát
HELLP-szindróma
hemolízissel, emelkedett májenzimekkel és alacsony trombocita számmal jellemzett szindróma (hemolysis, elevated liver enzymes, low platelet cell syndrome)
HEV
magas endothelialis venula (high endothelial venule)
HSP-90
hősokkprotein-90
ICAM-1
intercelluláris adhéziós molekula-1
IL
interleukin
IVH
intraventricularis hemorrhagia
IFNγ
interferon-γ
IgG1
immunglobulin G1
IRDS
idiopáthiás respiratiós distressz syndroma (idiopathic respiratory distress syndrome)
KCl
kálium klorid
LEC-CAM
leukocita endotélsejt sejt adhéziós molekula (leukocyte endothelial cell cell adhesion molecule)
LDH
laktát-dehidrogenáz
LH
luteinizáló hormon
LPS
lipopoliszacharid
M
mól
M1,2
intenzitás kapuk
MIF
átlagos fluoreszcens intenzitás (mean fluorescens intensity)
MMP-8
mátrix metalloproteináz-8 (v. neutrofil kollagenáz)
NEC
enterocolitis necrotisans (necrotising enterocolitis)
8
NFκB
nukleáris faktor κB
Ne Gr
neutrofil granulocita
NK-sejt
természetes ölő sejt (natural killer sejt)
NO
nitrogén-monoxid
NOS
nitrogén monoxid szintetáz
OR
esélyhányados (odds ratio)
PBS
foszfáttal pufferelt sóoldat (phosphate buffer saline)
PCR-RFLP
polimeráz láncreakció, restrikciós fragment hossz Polimorfizmus (polimerase chain reaction restriction fragment lenght polymorphism)
PDA
ductus Botalli persistens (patent ductus arteriosus)
PDE
foszfodiészteráz enzim (phosphodiesterase enzyme)
PerCP
peridinin-klorofill-protein (fluoreszcens festék)
PE
fikoeritrin (fluoreszcens festék)
PHA
phytohemagglutinin
PKU
phenilketonuria
PMA
phorbol-12 mirisztát-13 acetát
PSGL-1
P-szelektin glikoprotein ligand-1
PTXf
pentoxifillin
PVL
periventricularis leukomalacia
R
reverse primer
R1
kapuzott régió
ROP
koraszülöttek retinopátiája (retinopathy of prematurity)
SDS
natrium-dodecil-szulfát (sodium dodecyl sulphate)
SLE
systémás lupus erythematosus
sLx
szialil Lewis X-szerű mlekula
SNP
egy bázist érintő polimorfizmus (single nucleotide polymorphism)
SSC
granuláltságot mutató flow citométeres csatorna (side scatter)
Taq-polimeráz
Thermophilus acquaticus-ból kivont polimeráz enzim
Th-sejt
T-helper sejt
TNF-α
tumor nekrózis faktor-α
9
TUKEB
Tudományos Kutatási Etikai Bizottság
U
unit (nemzetközi egység)
VCAM-1
vaszkuláris sejt adhéziós molekula-1
VEGF
vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (vascular endothelial growth factor)
10
2. BEVEZETÉS 2.1 A perinatális gyulladás 2.1.1 Gyulladás kezdeti fázisa: adhézió és szelektinek A gyulladásos folyamat iniciálásában, a sejt-sejt, sejt-extracelluláris mátrix közötti kapcsolat kialakításában a sejtek felszínén jelenlevő adhéziós molekulák alapvető szerepet játszanak. Ezek szükségesek ahhoz, hogy a gyulladásban részt vevő sejtek közel kerüljenek egymáshoz, illetve meghatározott helyeken kitapadjanak, ott feldúsuljanak. A keringésben lévő limfociták, monociták és granulociták olyan, az adhéziós molekulák családjába tartozó receptorokkal rendelkeznek, melyek lehetővé teszik endotélsejtekkel való kölcsönhatásukat. Szerkezeti felépítésük alapján az adhéziós molekulák különböző molekulacsaládokba sorolhatók: Ig-szuperfamília tagjai, szelektinek, integrinek és a mucinok. PhD munkám során közülük a szelektinekkel foglalkoztam. A szelektinek az adhézió első fázisában játszanak szerepet, a kezdeti laza kapcsolat kialakításával megteremtik a lehetőséget a stabilabb, integrin mediált kontaktus kialakulására (1. ábra) Leukocita Kitapadás
Gördülés
Lassú gördülés
Erős adhézió
S Z E L E K T I N E K
1. ábra: Szelektinek az adhézióban (forrás: http://bme.virginia.edu/ley/)
11
Transzmigráció
2.1.2 Szelektinek A szelektineket 1989-ben azonosították. Ekkor igazolták, hogy fontos szerepük van a leukociták
vándorlásában,
az
egymással
és
környezetükkel
való
kapcsolat
kialakításában. A szelektinek elsősorban a limfocita-homingban és a leukociták extravazációjában játszanak fontos szerepet. Ezek a szénhidrátokat felismerő molekulák (Leukocyte Endothelial –Cell-Cell-Adhesion Molecules – LEC-CAM) trombocitákon, leukocitákon és endotélsejteken is megjelennek. A szelektin struktúra tartalmaz egy lektin-domént, egy epidermális növekedési faktorhoz hasonló domént és egy változó számú rövid ismétlődő szakaszt (2. ábra).
lektin
repetitív domén
EGF
farokrész hélix
2. ábra: Az E-szelektin szerkezete (1) (EGF-epidermal growth factor) A szelektin családnak 3 tagja van. Ezek az L- E- és P-szelektin. Nevüket arról a sejttípusról kapták, amelyen először leírták őket (1 táblázat). 1. táblázat: Szelektinek típusai, előfordulása Család Előfordulás Partner sejt
Ligand
L-szelektin (CD62L)
Leukocita
Szialil-Lewis X-szerű molekulák (sLx)
E-szelektin (CD62E) P-szelektin (CD62P)
Citokinaktivált endotélsejt Citokinaktivált endotélsejt, trombocita
Citokin-aktivált endotélsejt, nyirokcsomó magas endoteliális venul Mieloid sejtek, monociták, limfociták Neutrofil granulocita, monocita, limfocita
12
E-szelektin glikoprotein ligand-1 (ESGL-1), sLx P-szelektin glikoprotein ligand-1 (PSGL-1), sLx
Az L-szelektin megtalálható a neutrofil granulocitákon, a monocitákon, a T- és Blimfociták többségén, valamint az NK (természetes ölő)-sejtek bizonyos típusain (2-4). A különféle stimulusokra, például citokinek hatására a sejtfelszíni L-szelektin denzitás gyorsan csökken. Ezzel egyidőben a szolubilis L-szelektin szintje a környezetben megnő (5, 6). Egészséges egyénekben magas szolubilis L-szelektin szinteket lehet mérni (7) és ezek szintje különféle kórállapotokban változik. A szolubilis L-szelektin a membránkötött forma proteolítikus hasítása során keletkezik; lehasadva a sejtfelszínről a sejt környezetébe kerül (8). Az
E-szelektin
kizárólag
a
citokin-,
illetve
LPS
(lipopoliszacharid)-aktivált
endotélsejten található (9). Az E-szelektin gén promotere NFκB (nukleáris faktor κB) kötőhelyeket tartalmaz. A génexpresszió NFκB dependens (10). Az E-szelektin expresszió növekedés átmeneti, mivel az mRNS féléletideje rövid (11), a kész protein gyorsan internalizálódik és a lizoszómákban degradálódik (12). A P-szelektin expresszió szintén indukálható, bár a P-szelektin nyugalmi állapotban is jelen van az endotélsejt-granulumokban (Weibel-palade testek) (13) és a trombocitákban (14). Különféle aktivátorok, mint például trombin, hisztamin, komplement fragmentek és a trombocita esetében az ADP (adenozin difoszfát) hatására a granulumok a membránnal fúzionálnak (15) és tartalmuk a membrán felszínén megjelenik, illetve a környezetbe kerül. A P-szelektin expresszió növekedése is átmeneti. A felszínről lehasadva egy része a környezetbe kerül, más része gyors internalizáció után lizoszómákba (16) vagy újra granulumokba kerülhet. A szolubilis P-szelektin két forrásból származik. A membránkötött forma lehasadása mellett alternatív splicing eredményeképpen olyan mRNS molekula képződik, melyből a membránkötésért felelős régiót kódoló rész hiányzik, ezért a fehérje közvetlenül a keringésbe kerül (17). A különféle sejteken eltérő szelektin és szelektin ligand mintázat fejeződik ki, mely az endotéliummal való interakció különbözőségét magyarázhatja. Az összes neutrofil granulocita és monocita expresszálja az L-szelektint, valamint az E-, P- és L-szelektin ligandjait. A szelektin mintázatban megfigyelhető eltérés részben magyarázhatja a leukocita populációk különféle szövetekbe történő vándorlásának képességét. A különféle ingerekre bekövetkező immunválasz első lépése a „rolling”-nak és „capture”-nek nevezett folyamat, melynek során a fehérvérsejt mozgása lelassul, a sejt „gördül” az endotéliumon, majd pedig kialakítja a szelektin mediált, kezdeti laza
13
kapcsolatot. Ezt követi a stabil, integrin mediált kapcsolat kialakulása (18). Az immunrendszer működése során a T- és B-limfociták állandóan recirkulálnak a periféria és a másodlagos immmunszervek (nyirokcsomó, Peyer-plakk) között. A limfociták nyirokcsomókba történő vándorlása specializált endotélsejteken, a magas endoteliális venulákon (HEV-high endothelial venule) át történik. Az L-szelektin és receptora elengedhetetlen ebben a folyamatban (19). L-szelektin hiányos (knock-out) egereknél kisebb méretű, hipocelluláris nyirokcsomókat találtak (20). A rolling legkoraibb fázisáért (<20 perc) az L-szelektin mellett szinte kizárólag a Pszelektin felelős (21). A rolling későbbi fázisában (>20 perc) a P-szelektin gyors downregulációja után az L-szelektin veszi át a fő szerepet. Kísérletes tüdőgyulladásos modellekben az L-szelektin ellenes antitest megakadályozza a neutrofil granulociták kitapadását a gyulladás helyére (22). L-szelektin hiányos egerekben károsodott immunválaszt találtak LPS indukálta toxikus sokk modellben (23). Az L-szelektin tehát elengedhetetlen a különféle leukocita populációk különböző szövetekbe történő migrációjához az akut és a krónikus gyulladások során. Mindezek mellett az Lszelektinnek szerepe van a neutrofil granulociták egymással történő interakciójában is. L-szelektin ellenes antitesttel a neutrofil aggregáció blokkolható (24). A P-szelektin a rolling legkoraibb fázisát mediálja. Kísérletes peritonitises modellekben a P-szelektin hiányos egerek neutrofil granulocitái későn akkumulálódnak a gyulladásos területen hasonlóan az L-szelektin hiányos egerekhez, azonban 2-4 óra elteltével normális szintet érnek el (25). Az L- és P-szelektin együttes blokkolásával a neutrofil granulociták kitapadása teljesen gátolható (26). Ezek a megfigyelések alátámasztják az L- és P-szelektin molekulák jelentőségét a gyulladás korai fázisában. A szelektinek közül csak a P-szelektin jelenik meg az aktivált trombocitákon. Ezzel fontos szerepet játszik a trombocita és a leukocita interakcióban, a sebgyógyulás és hemosztázis folyamatában. P-szelektin mediálja az aktivált vérlemezkék monocitákhoz, neutrofil granulocitákhoz (27), NK sejtekhez, dendritikus sejtekhez és memória Tsejtekhez (28) történő kapcsolódását. Ez az interakció megsokszorozza a sérülés helyére vándorló leukociták számát. A kapcsolat hatására a leukocitákban gyulladásos mediátorok szintézise indul meg. A neutrofil granulociták leukotrién B4 termelése fokozódik (29), melynek többek között a T-limfociták homingjában van fontos szerepe (30). A veleszületett és szerzett immunitás közötti egyik kapcsolatot jelentő dendritikus
14
sejtek felszínén is megtalálható a P-szelektin ligandja (31). Kimutatták, hogy az aktivált trombociták szerepet játszanak a dendritikus sejtek érésében is (32). A P-szelektin, tehát fontos közvetítő szerepet játszik a gyulladás, a hemosztázis és a sebgyógyulás között. Az E-szelektin szintén a leukocita rollingban játszik szerepet a gyulladás, illetve szövetsérülés helyén (33). Mivel az E-szelektin gyulladásos mediátorok hatására de novo képződik, ezért a rolling korai fázisában nem játszik szerepet. Az E-szelektin egyedüli blokkolásával a leukocita kitapadás a gyulladás helyén zavartalanul zajlik, ugyanis szerepét a többi szelektin molekula átveheti (34). A szelektineknek szerepük van a gyulladásos folyamatokban, az immunrendszer működésében, a hemosztázisban és a sebgyógyulásban egyaránt.
2.2 Szelektinek szerepe a perinatális szövődményekben Az E-, P- és L-szelektin expresszió eltérései szerepet játszhatnak a koraszülés patomechanizmusában és olyan perinatális kórképekben, mint a korai postnatális sepsis és a bronchopulmonalis dysplasia (BPD). Az adhéziós molekuláknak alapvető szerepe van a normál terhességben is. Szelektinek magas expressziója figyelhető meg a placentában, mely elengedhetetlen a megfelelő implantációhoz és a placenta normál fejlődéséhez (35, 36). Génkiütött állatkísérletekben megfigyelték, hogy L-szelektin hiányában a citotrofoblaszt invázió károsodik és terhesség nem jön létre (37). Ez magyarázatot adhat arra, hogy az abnormális Lszelektin szintek esetén miért zavart a reprodukció, gyakoribbak egyes terhességi szövődnények (38). Számos adat támasztja alá a szelektinek szerepét a korai postnatális sepsisben. Koraszülöttek köldökzsinórvéna endotélsejtjein csökkent P-szelektin expresszió figyelhető meg. Ez hozzájárulhat a neutrofil granulociták csökkent mértékű kivándorlásához a gyulladás helyére (39). Akut bakteriális infekcióban szenvedő újszülöttekben Buhrer és mtsai. csökkent L-szelektin expressziót találtak a köldökvér neutrofil granulocitáin és monocitáin (40). A tüdőt érintő gyulladásos folyamatok is részben szelektinek által mediáltak. A neutrofil granulociták alveolusokba történő migrációja is több lépésben zajlik. A folyamat kezdeti fázisában a szelektinek döntő szerepet játszanak. Több adat támasztja alá a szelektinek szerepét BPD-ben. Magasabb
15
E-szelektin szintek prediktívek a BPD kialakulására (41, 42). A korai posztnatális periódusban mért alacsonyabb szolubilis L-szelektin szintek szintén jól korrelálnak a későbbi oxigénkezelés hosszával (43) és a BPD rizikójával (44, 45). A BPD kezelésben alkalmazott szteroid kedvező hatása részban az L-szelektin expresszióra kifejtett hatásán keresztül valósul meg (46). A koraszülöttek mintegy harmadában a súlyos perinatális szövődmények az adekvát terápia ellenére is fellépnek. Kialakulásuk szempontjából a koraszülöttet már in utero ért gyulladásos
noxa
az
egyik
legfontosabb
kockázati
tényező
(47,
48).
Az
amnionfolyadékban magasabb interleukin-6 (IL-6) és mátrix metalloproteáz-8 (MMP-8, neutrofil kollagenáz) szintet, illetve magasabb neutrofil leukocita számot találtak azoknál, akiknél megszületésük után periventricularis leukomalacia és BPD alakult ki (48, 49). A köldökzsinór-gyulladás, azaz a funisitis előfordulása is gyakoribb volt ebben a populációban (50). A funisitis a magzati gyulladásos válaszreakció szindróma szövettani
megfelelője.
Az
amnionfolyadékban
mért
szintek
mellett
a
köldökzsinórvérben is nagyobb volt az interleukin-6 szintje a korábban említett két szövődmény jelenléte esetén (51). Egyesek összefüggést mutattak ki a magzatburok gyulladása (chorioamnionitis) és a különféle funkcionális és strukturális idegrendszeri zavarok között (47). Ezek alapján a koraszülötteket érintő gyulladásos szövődmények hátterében egy közös patomechanizmus,
a
„magzati
gyulladásos
válaszreakció
szindróma”
(Fetal
Inflammatory Response Syndrome, rövidítve FIRS) állhat (51). 2.2.1 A magzati gyulladásos válaszreakció szindróma kialakulása A FIRS az esetek többségében chorioamnionitissel együtt fordul elő. Az intrauterin fertőzést az esetek jelentős hányadában hosszú ideig nem ismerik fel (47), ugyanis sokszor az erre utaló tünetek teljesen hiányoznak (52, 53, 54). A chorioamnionitis hátterében legtöbbször ascendáló hüvelyi fertőzés áll, az amnionfolyadékban mikroorganizmusok elszaporodása igazolható (51). Ezek leggyakrabban az emésztő traktus és a légzőrendszer nyálkahártyáján keresztül hatolnak be a magzat szervezetébe, de közvetlenül a véráramba is bejuthatnak (47). Ennek eredményeképpen akut gyulladásos reakció indulhat be, mely proinflammatorikus citokin felszabadulással jár a
16
magzat szervezetében. Ez leginkább a tüdőben és az idegrendszerben okoz károsodásokat. Ezt támasztja alá, hogy a FIRS a korai burokrepedés esetén független rizikótényezője a koraszülésnek, emellett a BPD, a periventricularis leukomalacia és több más idegrendszeri károsodás kialakulásának (48, 51, 55,) 2.2.2 A magzati gyulladásos válaszreakció szindróma és a koraszülés A proinflammatorikus citokin szintek emelkedése többféle mechanizmuson keresztül a szülés idő előtti megindulásához vezethet. A deciduát granulociták infiltrálják, melyek a decidua necrosisát okozzák. Ez idő előtti burokrepedéshez és így koraszüléshez vezet (55). Az
amnionfolyadékban
található,
magzati
eredetű
fehérvérsejtek
száma
chorioamnionitisben megemelkedik. Szekréciós termékeik jól jellemzik a magzati gyulladásos válaszreakció jelenlétét és súlyosságát (50). Ilyen például az MMP-8, melynek fontos szerepe van a burokrepedésben és a méhnyak érésében. Citokinek hatására a miometrium sejtjeinek a szerkezete megváltozik, kontraktilitásuk fokozódik (55). 2.2.3 A magzati gyulladásos válaszreakció szindróma és a tüdőkárosodás A BPD a lélegeztetett újszülöttek 20%-ában, az 1500 g alatti súllyal születettek 1547%-ában alakul ki (48). Tapasztalatok szerint, kíméletes lélegeztetés mellett, kifejezett barotrauma és oxigén-toxicitás nélkül is kialakulhat a BPD. A koraszülötteket érintő krónikus tüdőbetegség, a BPD jellemzője a 36. gesztációs héten, illetve az 56. postnatalis napon fennálló oxigénadás szükségessége. A túllélegeztetés
központi
szerepet
játszik
kialakulásában.
Korábban
ezen
tüdőelváltozások olyan respiratiós distressz syndromában (IRDS-ben) szenvedő újszülöttekben fordultak elő, akik hosszú időn keresztül részesültek oxigénterápiában és nagy volumenű lélegeztetésben (56). Gyakran lázzal, tüdőfibrosissal, interstitialis és alveoláris oedemával járt együtt. A BPD e formája ma már ritka és többnyire olyan érett újszülöttekben fordul elő, akiknél meconium aspiráció, vagy congenitális hernia diaphragmatica terápiájaként hosszabb ideig lélegeztetést alkalmaztak.
17
Az utóbbi évtizedben azonban mégsem szűnt meg a BPD. Ez a szövődmény leginkább azokat az 1000 g alatti súllyal született koraszülötteket fenyegeti, akiknél nem alakult ki IRDS, akik ezért kevésbé szorultak rá a lélegeztetésre és oxigén szupplementációra. Ezekben az esetekben a láz és a tüdőfibrosis sem jellemző, viszont a korai sepsis, connatalis infectio sokkal gyakoribb. Azt, hogy betegségükben szerepet játszanak intrauterin gyulladásos folyamatok, alátámasztja, hogy az amnionfolyadékban, illetve a köldökzsinórvérben az IL-1β, IL-6, IL-8 és a TNF (tumor nekrózis faktor)-α szint is magasabb (48, 51). A magas citokintartalmú amnionfolyadék intrauterin aspirációja lokalizált pneumóniát válthat ki. Az aspecifikus gyulladás tovább fokozza a tüdőszövetnek a BPD-re hajlamosító kockázati tényezők (oxigén toxicitás, barotrauma) iránti fogékonyságát. A proinflammatorikus citokinek fokozzák a plazmában a mátrix degradáló enzimek aktivitását, hatásukra a neutrofil granulociták, a monociták és a trombociták aktiválódnak, melyek indirekt módon károsítják a tüdőt. A proinflammatorikus citokinek fokozzák a tüdő kapillárisok permeabilitását is, amelyeken át folyadék szivárog ki az alveolusokba (48). Így az alveolusokba szivárgó protein-filtrátum gátolhatja a surfactant hatását (57). Az emelkedett gyulladásos citokin-szintek feltételezések szerint megzavarják a tüdő érési
mechanizmusait
irányító
szignáltranszdukciós
mechanizmusokat,
aminek
következtében az alveolusok száma születéskor kisebb lesz (57). 2.2.4 A magzati gyulladásos válaszreakció szindróma és az idegrendszeri károsodások A kora- és újszülöttkori motoros idegrendszeri károsodások 70-80%-ban az in utero elszenvedett káros behatásokra vezethetőek vissza (47). A köldökzsinórvérben emelkedett IL-6 szinttel együtt gyakoribbnak találták az agyban kialakuló fehérállomány elváltozások és a periventricularis leukomalacia előfordulását (48). A chorioamnionitis a periventricularis leukomalacia mellett a kamratágulat, az intra- és periventriculáris vérzések szempontjából is önálló kockázati tényező. A gliarostok károsodása megzavarja a neuronsejtek agykéregbe történő vándorlását. Ez a cortex lamináris szerkezetének változásával, érrendszeri károsodásokkal és a gyrusok
18
fejlődési zavarával jár (47). A második trimester végén történik a fehérállományban a mielinizáció. A koraszülöttség ezért fontos rizikótényező a mozgásszervi bénulások szempontjából: a gesztációs idő előrehaladtával ezek incidenciája csökken. A gesztációs kor mellett szoros összefüggést találtak e károsodások kialakulása és súlyossága, valamint a chorioamnionitis és az anyai fertőzések között (58). 2.3 Praeeclampsia - a koraszülés fontos kockázati tényezője A fertőzés mellett a praeeclampsia a koraszülés egyik leggyakoribb oka. A terhességek 5-8 %-át érintő szövődmény, mely az anyai és újszülött morbiditás és mortalitás egyik legfontosabb rizikótényezője (59). Jellemzője a 20. hét után fellépő hipertónia, proteinuria. Az esetek döntő többségében oedema is társul a kórképhez. Praeeclampsiával szövődött terhességben az újszülött mortalitása ötször magasabb, mint szövődmény nélkül. A mortalitás emelkedésének okai a placenta leválása, elégtelen placentáris keringés és a iatrogén koraszülés, ugyanis a kórkép egyetlen, oki kezelése a terhesség befejezése. A praeeclamapsia az esetek 10 %-ában a 34. terhességi hét előtt fordul elő. A koraszülések mintegy 15 %-áért ez a kórkép a felelős (60). A magzati mortalitás összefügg a diasztolés vérnyomás és proteinuria emelkedésének mértékével, tehát a praeeclampsia súlyosságával (61). Praeeclampsiás anyák újszülöttjei általában retardáltak. Ennek hátterében a placentáris érhálózat defektusa és a következményes perfúziócsökkenés áll. Praeeclampsiában a méh vérátáramlása fele-harmada az egészséges terhesekben mértekhez képest (62). A magzat ennek kompenzálására vérátáramlását a vitális szervekre (agy, mellékvese) centralizálja, ha azonban a csökkent vérátáramlás a korai időszaktól áll fent vagy igen súlyos, akkor a központi idegrendszer fejlődése is zavart szenvedhet. A praeeclampsiát még ma is a „teóriák betegségének” tartják. Placentáris ischaemia, oxidatív stressz mellett elsősorban a gyulladásos teória az elfogadott. A gyulladásos válaszkészség fokozódása, illetve az endotélsejt diszfunkció fokozott trombózis-hajlam révén is fokozhatják a betegség kockázatát. Számos gént hoztak összefüggésbe a praeeclampsia rizikójával. Ezek közül néhány: angiotenzin konvertáz enzim (63), angiotenzin II receptor (64), endothelin-1 (65), eNOS (66, 67), TNF-α (68), IL-1β (69), V-ös faktor Leiden mutációja (70).
19
A praeeclampsiában megfigyelhető tünetek hátterében, a szisztémás gyulladásos válasz részeként az anyai endotélium generalizált aktivációja, diszfunkciója áll (71), amely egy. Emellett azonban megfigyelhető a leukocita aktivációt jelző markerek fokozott expressziója, a fehérvérsejtek fokozott szabadgyök termelése, a proinflammatorikus citokin és C-reaktív protein szintek emelkedése (72). A gyulladásos folyamatok intenzitása hasonló ahhoz, amit sepsisben figyelhetünk meg (73). A gyulladásos válasz egészséges terhességben is jelen van (74). Praeeclampsiában azonban valamilyen ok miatt szélsőséges méreteket ölt és endoteliális diszfunkciót okoz. A kiváltó tényezők (proinflammatorikus citokinek (75), activin A (76) a placenta csökkent vérátáramlásakor fellépő oxidatív stressz következtében jutnak fokozottabb mértékben a keringésbe és az anyai gyulladásos választ fokozzák. A gyulladás központi szerepét támasztja alá, hogy preeclampsiában kimutattak endotélsejt-ellenes antitestet, immunkomplexet, komplement aktivációt, komplement és immunkomplex lerakódást a spirális artériákban, a placentában, a májban és a vesében. Kimutatták a Th1/Th2 arány eltolódását is (77). A gyulladásos folyamat első fázisában a szelektineknek fontos szerep jut, megteremtik a fehérvérsejtek és környezetük közötti kezdeti kapcsolatot. A szelektinmediált interakció hatására a stabil kapcsolatért felelős integrin expresszió fokozódik. A gyulladás az alvadási kaszkádot is aktiválja, emelkedik a trombociták P-szelektin expressziója. Az aktivált
trombociták
további
endotélsejt-
és
leukocita-aktivációt
okoznak,
következményes szelektin expresszió változással. Praeeclampsiában a szelektin expresszió és a szolubilis szelektin szintek eltéréseit számos irodalmi adat támasztja alá (78-84). Az
ösztrogének
szerepét
is
számos
adat
bizonyítja
a
praeeclampsia
patomechanizmusában. Az ösztrogének számos genitális és extragenitális hatást fejtenek ki. Praeeclampsiában megfigyelték, hogy a 17β-ösztradiol koncentrációja alacsonyabb a normotenzív kontrollokhoz viszonyítva (85). Ezt közvetve epidemiológiai adatok is alátámasztják: praeeclampsiás egyénekben az ösztrogéndependens mellrák rizikója kisebb (86). Az ösztrogén hormonok az érrendszer homeosztázisára is hatással vannak. Az endotélsejtekben aktiválják a mitogén-aktivált protein kinázt, ami sejtproliferációhoz vezet (87). A simaizom-rétegben viszont ellentétes hatást fejtenek ki, gátolják a
20
proliferációt (88). Mindkét sejttípuson megtalálható a sejtfelszíni ösztrogén receptor is. Érösszehúzó hatásukat elsősorban ezen keresztül fejtik ki (89). Praeeclampsiában generalizált vasospasmus figyelhető meg, melyet az agyi és hepaticus MR angiográfiás vizsgálatok is igazolnak (90). Az angiospasticus állapot hátterében többek között endotél disfunctio áll, melynek morfológiai és működésbeli jegyei is megfigyelhetőek. Praeeclampsiás egyénektől származó artériák áramlásmediált dilatációja károsodott mértékű. A 17beta-ösztradiol előkezelés az NO-közvetített dilatációt szignifikánsan javítja (91). Vedernikov és mtsai. praeeclampsiás nőkből kivett cseplesz-ereket vizsgált. A noradrenalinra bekövetkező válaszképesség visszanyerését és a kalcium ionokra adott fokozott választ a preeclampsiában megfigyelhető megnövekedett érreaktivitásra vezették vissza. 17beta-ösztradiol előkezelés után az aktiváló ágensek érösszehúzó hatása kisebb volt (92). 2.4 Immunmoduláció elméleti lehetőségei Teoratikusan, a kóros immunaktiváció gátlása révén a FIRS progresszióját is meg lehetne akadályozni. Erre számos lehetőség kínálkozik, PhD munkám során ezek közül kettővel foglalkoztam. 2.4.1 Foszfodieszteráz enzim gátlás FIRS–asszociált szövődmények, elsősorban a BPD megelőzésére immunmodulánsként több évtizede adnak kortikoszteroidokat. A posztnatálisan adott kortikoszteroidok hatására csökken egyes proinflammatorikus transzkripciós faktorok, így az aktivátor protein-1 (AP-1 ) és az NF-κB szintje: ezek kulcsfontosságúak a gyulladásos citokinek, adhéziós molekulák és receptoraik génexpressziójának szabályozásában (93). A prenatális szteroid adással ellentétben a posztnatális kortikoszteroid-terápia napjainkban visszaszorulóban van, mivel súlyos szövődményeket (gastrointestinális vérzés,
bélperforáció,
hyperglikemia,
magas
vérnyomás,
hypertrophiás
cardiomyopathia, késői szövődményként infantilis cerebralis paresis) okozhat (94). Ezért újabb, kevesebb mellékhatással rendelkező immunmoduláns szerek bevezetésére
21
lenne szükség. Az egyik lehetőséget a ciklikus AMP (cAMP) szintet emelő készítmények jelentik. Az adenil ciklázok hatására ATP-ből ciklikus nukleotid monofoszfát a cAMP keletkezik. A cAMP az immunsejtek működésében fontos szerepet játszik. A cAMP dependens
protein
kinázok
különféle
fehérjéket
foszforilálnak,
aminek
az
eredményeként az immunsejtek proinflammatorikus citokintermelése csökken. Az intracelluláris cAMP szint emelkedése gátolja a T-limfociták IL2 és IL-2-receptor expresszióját, befolyásolja a T-sejt aktiváció markereként ismert CD7 expresszióját (95). A cAMP általános gátló hatást fejt ki a gyulladásban szerepet játszó leukociták működésére (96). A cAMP szint emelésére több lehetőség van. Közülük a két legfontosabb a foszfodieszteráz (PDE) enzim gátlása és az adenil-cikláz működését aktiváló adenozinreceptor stimulálása. 2.4.1.1 Az adenozin és adenozin-receptorok jelentősége a gyulladásos folyamatok szabályozásában A gyulladásos szövetkárosodás helyén, adenozin és adenozin-vegyületek (ADP, ATP) szabadulnak fel a hízósejtekből és trombocitákból. Az adenozin nagy részét az adenozin kináz azonnal AMP-vé foszforilálná, de a gyulladás során fellépő lokális hipoxia ezt a folyamatot gátolja. Az adenozin így az A2A és az A2B típusú adenozin-receptorokhoz kötődve az intracelluláris cAMP szint emelkedését váltja ki (3. ábra). Bár igazolt, hogy számos gyógyszer, így a nem szteroid gyulladás gátlók hatásában az adenozin rendszer szerepet játszik, a klinikum számára specifikus adenozin-receptor agonisták még nem állnak rendelkezésre (97).
22
adenozin Gs
Adenilcikláz
A2A receptor
ATP PDE gátló
cAMP
-
PDE
adhézió degranuláció reaktív oxigén gyök produkció stb.
5’AMP
3. ábra: Az adenozin jelentősége a gyulladásos folyamatban (98) (A2A receptor: 2-es típusú adenozin receptor, ATP: adenozin trifoszfát, cAMP: ciklikus adenozin monofoszfát, Gs: stimuláló G-protein, PDE: foszfodiészteráz enzim, 5’AMP: 5’adenozin monofoszfát)
2.4.1.2 A foszfodiészteráz enzimek jelentősége a gyulladásos folyamatok szabályozásában A PDE-ek a ciklikus nukleotidokból a 3’-foszfodiészter kötés hidrolízisével inaktív 5’monofoszfátokat hoznak létre, így a sejtben a ciklikus nukleotidok szintjét csökkentik. A foszfodiészteráz enzimeknek szubsztrát specificitásuk, illetve szekvencia homológia alapján 14 típusát, ezen belül számos szubtípusát, izoformáját különítik el (2. táblázat). A PDE-k reguláló N-terminális, és C-terminális részekből és a centrális katalitikus doménből állnak. A centrális domén tekintetében magas fokú, a másik két domén esetében kisebb fokú a homológia az egyes PDE típusok között (96). Az immunsejtek cAMP szintjének csökkentésében a PDE3 és PDE4 típusok játszanak elsősorban szerepet, ezért e típusok gátlásakor lehet immunmoduláns hatásra leginkább számítani. A 2. táblázat az immunsejtekben lévő PDE-izoformákat és az izoformák gátlására bekövetkező hatást mutatja be (96).
23
2. táblázat: Az immunsejtekben előforduló PDE típusok és szerepük (PDE: foszfodiészteráz enzim, cAMP: ciklikus adenozin monofoszfát, IL: interleukin, IgE: immunglobulin E, VCAM-1: 1-es típusú vaszkuláris sejt adhéziós molekula, TNF-α: tumor nekrózis faktor-α, NO: nitrogén monoxid, IFN-γ: interferon-γ, GM-CSF: granulocita, monocita kolónia stimuláló faktor)
A sejt fő PDE PDE gátlás és cAMP emelkedés hatásai típusa bazofil sejt PDE3,4,5 csökkent hisztamin felszabadulás, IL-4, IL-13 produkció B-limfocita PDE3,4,7 csökkent IgE szintézis, megnövekedett proliferáció dendritikus sejt PDE3,4,5 csökkent citokin produkció endoteliális sejt PDE1,2,3,4,5, csökkent Ca2+ permeabilitás, csökkent citokin 7 produkció, csökkent VCAM-1 és L-szelektin expresszió eozinofil sejt PDE3,4 csökkent CD11b, CD18 expresszió és kemotaxis, csökkent degranuláció és L-szelektin expresszió, csökkent superoxid termelés hízósejt PDE3,4 csökkent citokin produkció és hisztamin felszabadulás makrofág PDE1,3,4,5 csökkent arachidonsav felszabadulás és TNF-α, IL1β, IL-10 produkció monocita PDE3,4 csökkent arachidonsav felszabadulás és leukotrién produkció, csökkent TNF-α produkció, megnövekedett IL-10 produkció, nincs hatása a TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 citokinekre és a superoxid, illetve NO szintekre neutrofil sejt PDE4 csökkent apoptózis, CD11b expresszió, degranuláció, elasztáz és IL-8 szekréció, csökkent leukotrién és szuperoxid generáció T-limfocita PDE1,2,3,4,5, csökkent adhéziós molekula expresszió és 7,8 blastogenezis, csökkent proliferációs válasz és citokin produkció (IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, TNF, GM-CSF), megnövekedett IL-10 produkció Sejttípus
2.4.1.3 A PDE bénítók A PDE gátlók, szelektivitásuktól függően, a cAMP, illetve cGMP szintek emelkedését okozzák, aktiválva a cAMP és cGMP dependens protein kinázokat. A legrégebben és legelterjedtebben alkalmazott PDE gátló a koffein, amely számos élvezeti szer, így a kávé, kóla stb. fontos alkotórésze. A PDE-gátlók orvosi alkalmazása az 1860-as évekre vezethető vissza, amikor Henry Hyde Salter, asthmáról szóló munkájában két erős kávé elfogyasztását javasolta reggelenként asthmás betegeinek. 1957-ben írták le a cAMP-t és hamarosan kiderült, hogy a koffein hatásait a PDE gátlása és a cAMP szint emelése révén fejti ki. A 1970-es évekre derült ki a cAMP
24
szerepe az immunrendszer működésében. Ekkor vált ismertté a PDE gátlók immunmoduláns tulajdonsága is (96). Vannak szelektív és nem-szelektív PDE gátlók. Nem szelektív PDE-gátlók a teofillin, pentoxifillin (PTXf), illetve a terápiásan visszaszorult koffein és a teobromin is. Az utóbbi évtized in vitro és in vivo vizsgálatai során kiderült, hogy a teofillin és a PTXf közismert klinikai hatásai mellett befolyásolhatják az immunválasz erősségét és jellegét is. 2.4.1.3.1 Pentoxifillin 2.4.1.3.1.1 A pentoxifillin in vitro immunmoduláns hatása Érdekes módon a teofillinnel kapcsolatban megfigyelt kettős hatásról (alacsony dózisban serkenti, magas dózisban gátolja az immunválaszt) e vegyület esetében nincsenek adatok. A PTXf in vitro gátolja a fagocitózist, az NK-sejt aktivitást, valamint a superoxid képződést (99). Gátolja a neutrofil degranulációt (100). Egy másik vizsgálatban PTXf jelenlétében kisebb volt a neutrofil sejtek kitapadási képessége, a superoxid képződés és a neutrofil migráció (101). Bessler és mtsai. limfociták csökkent proliferációs válaszát mutatták ki PTXf jelenlétében (99). Mások a TNF-α elválasztás csökkenését írták le PTXf hatására (102). 2.4.1.3.1.2 A pentoxifillin immunmoduláns hatása állatkísérletekben A PTXf szeptikus állatmodellekben a túlélést javította és csökkentette a TNF-α, IL-6, valamint az endotelin-1 szinteket (103). PTXf-nel kezelt koraszülött nyulakban kimutatták, hogy a tüdőmosó-folyadékban a baktériumok proliferációja, a lizozim és a TNF-α szintje alacsonyabb a PTXf-nel nem kezelt csoporthoz képest (104). Mások endotoxinnal, illetve IL-2-vel indukáltak patkányban tüdőkárosodást, és igazolták, hogy PTXf mellett a tüdőkárosodás mértéke kisebb, csökken a tüdőmosó folyadék IL-8 szintje és a szérum IL-6 szintje is (105, 106).
25
2.4.1.3.1.3 A pentoxifillin immunmoduláns hatásai emberben Egészséges emberekben kimutatták, hogy a PTXf csökkenti az endotoxin adására bekövetkező TNF-α-elválasztást (107, 108), illetve a tőlük nyert perifériás mononukleáris sejtek mitogénre adott válaszát, IL-1β, IL-6, IL-8 és a TNF-α termelését (109). Staubach és mtsai. kettős vak, placebo kontrollált vizsgálatban PTXf–nel kezeltek
szeptikus
betegeket.
A
PTXf
kezelés
kedvezően
befolyásolta
a
cardiopulmonalis dysfunctiot és a mortalitást, azonban az endotoxin szint, TNF-α és IL6 szint nem különbözött a PTXf-nel kezelt és kontroll csoport között (110). A perinatálisan adott PTXf is hatékonynak bizonyult. Lauterbach és mtsai. koraszülöttek 1 hetes kor után fellépő sepsisében placebo kontrollált, kettős vak vizsgálatban PTXf kezelést alkalmaztak. A PTXf szignifikánsan csökkentette a TNF-α és IL-6 szinteket, illetve lényegesen javította a túlélést (a PTXf-nel kezelt csoportban 40 betegből 1, míg a placebo csoportban a 38-ból 6 halt meg). A PTXf-nel kezelt csoportban a sepsist kísérő perifériás keringési zavarok, metabolicus acidosis, anuria, oliguria, disseminált intravascularis coagulatio, valamint enterocolitis necrotisans ritkábban fordultak elő (111). Másik vizsgálatukban öt, BPD-ben szenvedő koraszülöttet kezeltek nebulizált PTXf-nel. A kezelés hatására fokozatosan csökkent az oxigén dependencia (112). 2.4.1.3.2 Szelektív PDE bénítók Az immunsejtek elsősorban 3-as és 4-es típusú PDE enzimet tartalmaznak, ezért komoly erőfeszítéseket tesznek olyan szelektív PDE-gátlók kifejlesztése felé, melyek elsősorban immunmoduláns hatásúak. 2.4.1.3.2.1 Szelektív PDE4 gátlók A PDE4 inhibitorok alkalmazásával számos gyulladásos folyamat befolyásolható. Ezek gátolják a T-limfociták PHA-val (phytohemagglutinin) és anti-CD3-mal indukált proliferációját. PDE4 gátlás hatására az IL-5, IFN-γ citokin elválasztás csökkent, az IL4 szint változatlan maradt (113). Schmidt és mtsai. kedvező eredményekről számoltak
26
be allergiás rhinitisben szenvedő betegek szelektív PDE4 gátló roflumilasttal történő kezelése során (114). Compton és mtsai. szelektív PDE4 gátló cilomilast hatását vizsgálták COPD-ben szenvedő betegekben. A FEV1 értéke a kezelés során javult (115). 2.4.1.3.2.2 Szelektív PDE3 gátlók A PDE3 és PDE4 gátló gyógyszerek kedvezőek lehetnek az asthma kezelésében is. Fujimura és mtsai. a szelektív PDE3 gátló cilostazol hatását vizsgálták asthmás betegekben. A FEV1 (1. másodpercre eső kilégzési volumen) és FVC (erőltetett vitálkapacitás) értékét szignifikánsan növelte a cilostazollal végzett kezelés. A PDE bénítók által okozott cAMP emelkedés jól korrelált a TNF-alfa szint csökkenéssel (116). Bardin és mtsai. szelektív PDE3 gátló szert vizsgáltak asthmás egyénekben. Csökkent az allergénre bekövetkező bronchoconstrictor válasz, nőtt a FEV1 értéke (117). Bizonyos indikációkban a teofillint (apnoe esetén) és a PTXf-t (haemorrheologiai zavar esetén) már adják újszülötteknek. A foszfodiészteráz enzim bénítók hatására nő az immunsejtekben a cAMP szint, ami miatt a proinflammatorikus citokinek termelődése csökken. Ez kedvezően befolyásolja a gyulladásos folyamatokat, csökkenti a szöveti károsodás mértékét. Ez a jelenség a már forgalomban lévő nem-szelektív PDE gátlók esetében is megfigyelhető, csakúgy, mint a jelenleg fejlesztés alatt álló szelektív gátlók esetében. Ennek alapján a PDE gátlók alkalmasak lehetnének a kedvezőtlen immunológiai folyamatok befolyásolására különböző klinikai kórállapotokban, így koraszülöttek gyulladásos szövődményeinek a megelőzésében és kezelésében is. 2.4.2 Ösztrogén pótlás 2.4.2.1 Az ösztrogének hatásmechanizmusa
Két intracelluláris ösztrogén receptorcsalád ismert: α és β típusú ösztrogén-receptorok (ER-α, ER-β). Ezek olyan transzkripciós faktorok, amelyek fehérjékhez kötve (pl.: HSP
27
90 család) számos sejtben jelen vannak. (A legtöbb célszervben, illetve célsejtben az ER-α a domináns receptor.) Az ösztrogének intracelluláris receptorukkal komplexet képeznek. A komplex a DNS specifikus hormon-reszponzív elemeihez, vagy egyéb transzkripciós faktorokhoz kötődve fejti ki hatását. Létezik egy, a sejtmembránban elhelyezkedő ösztrogénreceptor is, mely a gyorsan kifejlődő hatásokat közvetíti (118). Ilyen hatás például az intracelluláris Ca2+ koncentráció növekedése a makrofágokban, vagy a nitrogén-monoxid szintézis emelkedése érendothelsejtben (119). A membránlokalizációt bizonyítja az ösztrogén hatására bekövetkező foszfolipáz C és protein kináz C aktiváció is. 2.4.2.2 Ösztrogénpótlás elméleti háttere
Az ösztogének szerepét a gyulladásos folyamatok szabályozásában számos adat bizonyítja. Az ösztrogén alfa receptorának jelenléte elengedhetetlen a thymus fejlődéséhez (120). Egyes autoimmun betegségekben észlelt női dominancia is jelzi, hogy a szervezet immunstátuszát befolyásolhatja az ösztrogén (121). In vitro adatok szerint a terhesség végén mérhető koncentrációban jelen lévő ösztrogének gátolják a B-limfociták antitest termelését, a citotoxikus T-sejteket, és közvetve gátolják a T-helper sejteket, valamint csökkentik a makrofágok citokin termelését (122). Ennek alapján feltételezhető, hogy a hirtelen ösztrogénmegvonás hozzájárulhat a gyulladásos reakció súlyosbodásához. Koraszülöttekben a jelentős ösztrogén-szint csökkenés
korábbi
stádiumban
következik
be,
mint
érett
újszülötteknél.
Koraszülöttekben a fiziológiásan magas in utero ösztrogén- és progeszteronszintek hirtelen és idő előtti megszűnése számos, a menopausát kísérő jellel analóg tünet és kórkép kialakulásához járulhat hozzá. Teoretikusan ezért immunmodulációként alkalmazható
a
korai
posztnatális
időszakban
a
kieső
ösztrogén
pótlása.
Koraszülötteknél a perinatális időszakban gyakoriak a különböző gyulladásos szövődmények. A gyulladásos citokinek termelődését (pl. a TNF-alfa, IL-1, IL-6), melyek központi szerepet játszanak a BPD, PVL (periventricularis leukomalacia) és NEC (enterocolitis necrotisans) pathomechanizmusában (51), az ösztrogének csökkentik (123). Állatkísérletekben az ösztrogén hiperoxiában növelte, normoxiában és
28
hipoxiában pedig csökkentette a VEGF expresszióját (124). Ennek eredményeképpen hipoxiás egerekben csökkent a retinopathia kialakulásának gyakorisága. Az adatok felvetik,
hogy
magzatban
az
ösztrogének
alapvető
hatást
gyakorolnak
az
angiogenezisre. Eddig egyetlen munkacsoport tett kísérletet arra, hogy a koraszülötteket érintő idő előtt ösztrogénszint csökkenést szintetikus ösztrogén adásával ellensúlyozza. Trotter és munkatársai (125, 126) a köldökzsinór artériából és vénából vett vérminták hormonszintjei alapján meghatározták a magzati ösztradiol (E2) és progeszteron szinteket (E2: 2000-6000 pg/ml, progeszteron: 300-600 ng/ml). Kiszámították, hogy ezek eléréséhez intravénásan 2,3 mg/ttkg/nap, transdermalis tapasz formájában pedig 6,68 mg/ttkg/nap E2 adására van szükség. A progeszteron esetében intravénás adagoláskor 21,2 mg/ttkg/nap, transdermalis tapasz adásakor 132,8 mg/ttkg/nap volt a számított dózis. Prospektív vizsgálatukba harminc igen kis súlyú (675±50 g) koraszülött leányt (26,5±2 hét) vontak be. Az újszülötteket két csoportra osztották: közülük 15 részesült hormonpótlásban, amit a születés után néhány órán belül megkezdtek és hat héten keresztül folytattak. A hormonokat kezdetben intravénásan, majd, amikor a vénabiztosítás már nem volt tovább indokolt, transdermalis tapasz útján pótolták. A kezelés biológiai hatékonyságát több paraméter alapján vizsgálták. A súly- és hossznövekedés mellett mérték a szérum E2, progeszteron szintjét, az FSH, LH értékeket. Ultrahanggal kéthetente meghatározták az uterus térfogatát. Elemezték a hüvelykenetet.
Foton-abszorpciós
denzitometriával
mérték
a
csontsűrűséget.
Monitorozták a perinatális szövődményeket. A heti súly- és hossznövekedés medián értéke mind a hormonkezelt, mind a kezeletlen csoport esetében elmaradt az egészséges in utero referenciaértéktől (12,3% , illetve 3,8%), bár a kezelt koraszülöttek súly- és hossznövekedése (11,2% ill 2,8%) valamelyest nagyobb volt a nem kezeltekéhez képest (9,8% , illetve 2,2%). A kezelt csoportban az E2, progeszteron szintje magasabb volt, az FSH és az LH csökkent a kontroll csoporthoz képest. A méh volumene nőtt, míg a kontroll csoportban nem változott. A hüvelycitológiai kenetben a kariopiknotikus és eozinofil sejtek aránya is nőtt. A csontsűrűség, nem szignifikánsan bár, de valamelyest nagyobb volt a hormonpótló kezelésben részesült újszülöttekben. A kontroll csoportban a megfelelő mennyiségű ásványi anyag pótlás ellenére sem volt megfelelő a beépülés
29
aránya. Különösen figyelmet érdemel, hogy a hormonkezelt populációban nem fejlődött ki BPD, szemben a kontroll csoportban észlelt közel 30%-os incidenciával. Az eredmények már ebben a kis létszámú populációban is azt mutatták, hogy 1.
koraszülötteknél is biztosítható az in utero E2 és progeszteron szint exogén E2
és progeszteron pótlással; 2.
az exogén E2 és progeszteron pótlás biológiai hatással rendelkezik;
3.
kedvező irányban, bár nem szignifikánsan befolyásolja a csont ásványianyag
tartalmát; 4.
az ösztrogénszubsztitúció a BPD rizikóját csökkentheti.
2.5 Genetikai polimorfizmusok Az egyetlen nukleotid megváltozásából adódó polimorfizmusok (SNP, régebbi nevükön pontmutációk) a leggyakrabban előforduló polimorfizmusok. Az SNP-k körülbelül 1000 bázispáronként fordulnak elő a humán genomban, számuk mintegy hárommillióra tehető. Ezek legnagyobb részét az SNP Consortium és a Human Genom Project munkájával azonosították. Az adatok nyilvános adatbázisokban hozzáférhetők: dbSNP, SNP Consortium, Human SNP Database stb. A szelektin polimorfizmusok esetében a polimorfizmust az aminosavcsere nevével adják meg. Ez az elnevezésforma helytelen, helyette a nukleotid cserét és annak pozícióját kellene megadni. Tekintettel azonban arra, hogy az irodalomban szinte kivétel nélkül az aminosavcserével jelzik e polimorfizmusokat, én is ezt a gyakorlatot követtem az azonosíthatóság érdekében. 2.5.1 E-szelektin Ser128Arg (A561C) polimorfizmus Az ismert 22 E-szelektin SNP (egy bázist érintő polimorfizmus) -ből ez az egyik leggyakrabban vizsgált polimorfizmus. Az E-szelektin génje az 1-es kromoszóma 1q22q25 régiójában található, 14 exont tartalmaz (127). A Ser128Arg polimorfizmus esetében megfigyelhető szerin-arginin aminosavcserét a 4-es exonban (EGF régió) levő
30
pontmutáció (A561/C nukleotid transzverzió (M24376)) okozza. A polimorfizmus detektálása az egyik módszer a PstI restrikciós enzim alkalmazása (128). Eddigi vizsgálatok szerint a szolubilis E-szelektin plazma szintje (kb. 63 ng/ml) a Ser128Arg SNP esetén nő, a neutrofil és mononucleáris sejtek fokozott rollingját és adhézióját okozva. Mlekusch és mtsai. vizsgálatukban megállapították a Ser128Arg polimorfizmus Eszelektin szintet befolyásoló hatását, melyet a resztenózis kockázataként jelöltek meg. Az E-szelektin plazmaszint a homozigóta (Arg128Arg) és heterozigóta (Ser128Arg) egyedekben magasabb volt a vad típust (Ser128Ser) hordozókéhoz képest (129). Rauchhaus és mtsai. a resztenózis faktoraként vizsgálták az SNP-t, de nem találtak összefüggést a szérumszint és a genotípus között (130). Yoshida és mtsai. a polimorfizmus myocardialis infarctusban betöltött szerepének okaként, az általa megváltoztatott leukocita-endotél kölcsönhatást írják le vizsgálatukban (131). ElMagadmi és mtsai. az E-szelektin 128Arg alléjának nagyobb gyakoriságát figyelték meg SLE-s (systemás lupus erythematosus) betegekben (132). Wenzel és mtsai. a 128Arg mutáns allél nagyobb gyakoriságát mérték fiatal arteriosclerotikus betegekben (133). 2.5.2 P-szelektin Thr715Pro (A2361C) polimorfizmus Az ismert P-szelektin SNP-ékből a Thr715Pro (A/C) polimorfizmus a leggyakrabban vizsgált. A P-szelektin génje 17 exont tartalmaz, az 1-es kromoszóma 1q21-24 régiójában található. A Thr715Pro SNP a 13-as exonban található (komplement kötő domén 9), a mutáció A/C transzverzióval jár (M25322). Detektálására általánosan a BstEII restrikciós enzimmel végzett PCR-RFLP módszert használnak. Feltételezik, hogy a szolubilis P-szelektin plazma szintje a polimorfizmus hordozása esetén lecsökken, ezáltal fejtve ki feltételezett kardiovaszkuláris protektív hatását. Miller és mtsai. vizsgálatukban úgy találták, hogy szolubilis P-szelektin szint alacsonyabb volt a ThrPro és ProPro genotípusokban, mint a ThrThr genotípusban (134). Carter és mtsai. nem találtak összefüggést a polimorfizmus és a myocardialis infarctus kockázata között. Leírták viszont az SNP szolubilis P-szelektin szintet befolyásoló hatását, és a magas szelektin szint dohányos szívbetegekben megfigyelhető
31
gyakoribb előfordulását (135). Barbaux és mtsai. vizsgálatukban beszámoltak a polimorfizmus szelektin szintet befolyásoló hatásáról és az életkorral összefüggő koronária megbetegedésekkel való kapcsolatáról (136). Herrmann és mtsai. is felvetették a Pro715 variáns kardioprotekítv hatását (137). 2.5.3 L-szelektin Pro213Ser (C712T) polimorfizmus A short consensus repeat domént leíró szakasz kódoló régiójában fordul elő Pro213Ser polimorfizmus. A Pro-Ser aminosav csere hátterében C/T nukleotid transzverzió áll, ennek detektálása általában PCR-RFLP módszert használnak, HphI restrikciós enzim alkalmazásával. A polimorfizmus pontos funkcionális jelentősége nem ismert, de az adatok arra utalnak, hogy befolyásolhatja a fehérvérsejt–endotélsejt interakció minőségét. A Pro213 allél hordozását összefüggésbe hozták a diabeteses nephropathia rizikójával (138). 2.5.4 ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus Az ismert ER-α SNP-ékből a PvuII és XbaI polimorfizmusok a leggyakrabban vizsgáltak. Az ER-α génje 6-os kromoszóma hosszú karjának 25.1 régiójában találhatók. A PvuII (IVSI-397T/C, rs2234693) és XbaI (IVS1-351A/G, rs9340799) SNP-k a 2-es exontól 397 és 351 bázispárnyi távolságban vannak negatív irányban az 1es intronban. A PvuII polimorfizmus detektálására a PvuII restrikciós enzimet használják a PCRRFLP vizsgálatok során. A „T” („P”) allél hordozása esetén a B-myb transzkripciós faktor kötőhelye eliminálódik és ez csökkent ER-α expressziót okoz (139). Posztmenopauzás nőkben a „T” („P”) allél hordozást összefüggésbe hozták csökkent ösztradiol (E2) plazma szintekkel. A polimorfizmus által okozott megváltozott ösztrogén hatást a következő indirekt adatok is felvetik: a „T” („P”) allél hordozás megnövekedett osteoporosis (140, 141) és myocardiális infarctus rizikóval (142), csökkent osteoarthritis rizikóval (143), alacsonyabb BMI értékkel (144) és későbbi menopauzával (145) jár.
32
Az XbaI polimorfizmus szerepét is számos kórképben vizsgálták. Az SNP-t összefüggésbe hozták többek között az osteoporosis rizikójával (146), a mellrák (147) és coronaria betegség (148) kockázatával. A vad típusú „A” allél hordozását összefüggésbe hozták megváltozott ösztradiol szintekkel; ennek hátterében azonban elképzelhető, hogy a PvuII polimorfizmussal való kapcsoltsága áll.
33
3. CÉLKITŰZÉSEK 3.1 Genetikai polimorfizmus vizsgálatok 3.1.1 Szelektin polimorfizmusok koraszülöttségben és perinatális kórképekben A szelektinek a gyulladásos folyamatokban alapvető fontosságúak. A gyulladás helyére vándorló fehérvérsejtek környezetükkel az első kontaktust a szelektinek révén teremtik meg. A koraszülésben mind az anyai, mind a magzati oldalt érintő gyulladás fontos szerepet játszik. Vizsgáltuk három, a szelektinmediált kapcsolat minőségét, a szolubilis szelektin szinteket feltételezetten befolyásoló genetikai polimorfizmusok gyakoriságát koraszülötteknél. A perinatális kórképek kialakulásában a FIRS szerepe meghatározó. Az előzőek alapján ezekben a folyamatokban a szelektinek meghatározó szerepet játszanak. Célkitűzésünk annak a vizsgálata volt, hogy az E-, P- és L-szelektin funkcionális polimorfizmusok hordozása összefügg-e a koraszülöttek perinatális morbiditásával. 3.1.2 Szelektin polimorfizmusok jelentősége praeeclampsiában Több adat utal arra, hogy praeeclampsiában a szelektin expresszió mértéke és a szolubilis szelektin szintek megváltoznak. Feltételezik, hogy a placentációban, a citotrofoblaszt invázióban a szelektinek szintén fontos szerephez jutnak; ezek a folyamatok zavart szenvednek praeeclampsiában. Ezért vizsgáltuk az E- és P-szelektin polimorfizmusok előfordulását és összefüggését a kórkép lefolyásával. 3.1.3 ER-α PvuII polimorfizmus jelentősége perinatális kórképekben Számos adat támasztja alá az ösztrogének gyulladásban betöltött szerepét. Az ösztrogének fontossága valószínűsíthető a perinatális szövődmények szempontjából is. Az ösztrogén hatásait részben az ER-α közvetíti. Funkcionális polimorfizmusa befolyásolhatja az ösztrogén hatáserősségét, így közvetve a perinatális szövődményeket és a hátterükben álló gyulladásos folyamatokat. Ezek alapján merült fel az ER-α
34
leggyakrabban vizsgált polimorfizmusának (PvuII) vizsgálata koraszölöttek perinatális szövődményeiben. 3.1.4 ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus jelentősége praeeclampsiában A praeeclampsia patomechanizmusában a gyulladásos folyamat mellett az érrendszer homeosztázisát megzavaró tényezők állhatnak. Az ösztrogének fontos szerepet játszanak a mind a gyulladásos folyamatokban, mind pedig az érrendszer homeosztázisában. Irodalmi adatok alapján az ösztrogének szerepe feltételezhető a praeeclampsia patomechanizmusában. Vizsgáltuk ezért a különféle ösztrogén dependens kórállapotokkal és cardiovascularis betegségekkel egyaránt összefüggésbe hozott ösztrogén receptor-α PvuII és XbaI polimorfizmusokat praeeclampsiában. 3.2 Funkcionális vizsgálatok 3.2.1 PTXf immunmoduláns hatásainak vizsgálata A perinatális szövődmények megelőzése és kezelése szempontjából fontos újabb immunmoduláns szerek bevezetése vagy már egyéb indikációban alkalmazott szerek új indikációban történő alkalmazása. Az egyébként hemorrheológiai zavarokban alkalmazott nem szelektív PDE gátló PTXf a cAMP szint emelésével immunmoduláns tulajdonsággal is rendelkezik. Vizsgáltuk, hogy a PTXf in vitro milyen hatással van a neutrofil granulociták és monociták fagocita és oxidatív gyöktermelő képességére, valamint aktiválhatóságára. 3.2.2 17β-ösztradiol immunmoduláns hatásainak vizsgálata Ismert, hogy az ösztrogének immunmoduláns tulajdonsággal rendelkeznek. Hatásukat a génexpresszió befolyásolása révén, illetve közvetlenül, poszttranszlációs szinten is kifejthetik. In vitro azt vizsgáltuk, hogy az ösztrogének poszttranszlációs szinten fejtenek-e ki hatást a neutrofil granulocita és monocita fagocita és oxidatív gyöktermelő képességére, valamint aktiválhatóságára (L-szelektin és CD11b expresszió alapján).
35
3.2.3 Kapcsolat vizsgálata az L- és P-szelektin polimorfizmus hordozás és expresszió között Genetikai polimofizmus vizsgálataink során felvetődött, hogy a vizsgált génvariánsok hatásukat a szelektin-expresszió változásán keresztül fejthetik ki. Ezért egészséges populációban vizsgáltuk a már korábban vizsgált L- és P-szelektin génpolimorfizmusok és a granulociták és monociták L-szelektin és trombociták P-szelektin expressziója közti kapcsolatot.
36
4. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK 4.1 Betegek 4.1.1 Genetikai polimorfizmus vizsgálatok 4.1.1.1 A szelektin polimorfizmusok és koraszülöttség, perinatális morbiditás kapcsolatának vizsgálata A vizsgálatban részt vevő újszülötteket a Semmelweis Egyetem II. sz. Nőgyógyászati Klinika és az I. sz. Gyermekgyógyászati Klinika Perinatális Intenzív Centrumaiban kezelték. A kórtörténet mellett a betegek nevét, valamint születés idejét és helyét is feljegyeztük. Az adatokat kizárólag arra használtuk, hogy a betegek (PKU) phenilketonuria szűrőpapírjait azonosítsuk. A mintákat ezután anonim módon kezeltük; valamennyi minta sorszámot kapott, a további analízis és adatfeldolgozás során ezeket használtuk a betegek neve helyett. A szülők tájékozott beleegyezésüket adták a szűrőpapírra szárított vérminták diagnosztikus és tudományos célú felhasználásához. A vérmintákat a születést követő 5. napon vagy az oralis tááplálást megkezdését követően vették le anyagcsere-betegség szűrés céljából, majd a Budai Gyermekkórház PKU laboratóriumában tárolták. Ezért azok a koraszülöttek, akik az 5. életnap vagy az oralis táplálás megkezdése előtt haláloztak el, nem kerültek bele a vizsgálatba. A vizsgálatot a Semmelweis Egyetem Tudományos Kutatásetikai Bizottsága jóváhagyta (TUKEB engedély száma: 16/2003). 125 kissúlyú koraszülöttet (≤1500 g) és 156 kontroll, egészséges újszülöttet vontam be a vizsgálatba, akiktől a phenilketonuria szűrésre levett szűrőpapírt kaptam meg DNS izolálás és genotípus meghatározás céljából. A vizsgálat retrospektív jellege miatt az 5. posztnatális életnapon belül elhúnytak nem kerültek be a vizsgálatba. Vizsgáltam a kissúlyú koraszülöttek betegségeinek lefolyását az első posztnatális hét alatt. Feljegyeztem az IRDS, a PDA (nyitott Botallo vezeték), a systemás hypotensio, a korai postnatalis sepsis, az akut veseelégtelenség, a NEC (enterocolitis necrotisans), a BPD és az IVH (intraventricularis hemorrhagia) kialakulását. Az infekció klinikai jeleit és tüneteit - Dollner szerint (149) - hat kategóriába soroltam: pallor és icterus; lethargia, apnoe, bradycardia, irritabilitás és görcsök; tachypnoe és
37
dyspnoe; hypotensio, tachycardia és a mikrocirkuláció zavara; hányás és hasi dystensio; láz, illetve hőmérséklet instabilitás. Sepsisben (legalább 1 tünet jelenléte legalább 3 kategóriában és emelkedett (>10 mg/l) CRP értékek) 36 kissúlyú koraszülött szenvedett. Az akut veseelégtelenség diagnózisa Modi (150) kritériumain alapult: szérum kreatinin >120 μmol/l a második posztnatális napon mérve vagy a szérum urea >9 mmol/l, a diurézis <1,0 ml vizelet / kg(testsúly) /24 óra. Ebben a szövődményben 42 kis súlyú koraszülött szenvedett. NEC-ben 42 kissúlyú koraszülött szenvedett. A diagnózist a Bell-féle kritériumok (151) alapján állítottuk fel (I. stádium: véres széklet és hasi dystensio, II. stádium: intestinalis pneumatosis, III. stádium: bélperforáció). Az IVH diagnózisát 46 esetben állították fel a neurológiai tünetek és a kopony ultrahang alapján. A BPD diagnózisát a nemzetközileg elfogadott kritériumok (152) alapján állítottuk fel: oxigén dependencia az 56. posztnatális életnapon vagy a 36. postmenstruális héten. A koraszülött populációban 24 újszülött szenvedett BPD-ben. Közülük egy újszülött a 34. héten született és részesült oxigénkezelésben a 28. életnapján túl. A többiek a 32. hét előtt születtek és részesültek oxigén terápiában a 36. postmenstruális héten túl. IRDS 65 esetben állt fent, melyet a surfactant adás szükségessége jelzett (legalább kettő dózis az első posztnatális életnapon). PDA az 5. posztnatális életnap után 45 kis súlyú koraszülöttnek volt, melyet a klinikai tünetek és a szívultrahangos vizsgálat alapján diagnosztizáltak. A systemás hypotensio diagnózisát 37 kis súlyú koraszülöttnél állítottak fel az echokardiográfia (bal kamrai alacsony ejekciós frakció) és a homlokon, illetve a szegycsont felett mért megnövekedett kapilláris újratöltődési idő alapján. A kontroll csoportot 156 egészséges újszülött alkotta. A klinikai jellemzők a 3. táblázatban találhatóak.
38
3. táblázat: Klinikai jellemzők a vizsgált populációkban és a perinatális komplikációk előfordulása a vizsgálatban szereplő kis súlyú koraszüköttekben *(p<0,05)
Esetszám Nemi megoszlás (fiúk/lányok) Gesztációs kor (hét) középérték [tartomány] Születési súly (gramm) középérték [tartomány] A koraszülés oka Praeeclampsia (%) Anyai infekció (%) Ismeretlen eredet (%) Prenatálisan szteroidot kapott újszülöttek száma Exogén oxigénpótlásban részesült koraszülöttek száma Oxigénpótlás időtartama (nap) középérték [tartomány] Az alábbi kórképekben megbetegedettek száma Korai postnatalis sepsis (1. posztnatális héten) Akut veseelégtelenség Enterocolitis necrotisans (1-3 stádium) Intraventricularis hemorrhagia (1-4 stádium) Bronchopulmonalis dysplasia Respiratiós distressz syndroma Ductus Botalli persistens (5. napon) Systemás hypotensio (1. posztnatális héten)
Kis súlyú koraszülöttek 125
Kontroll újszülöttek 156
61/64
77/79
29* [24-36] 1200* [510-1500]
40 [37-42] 3500 [2800-4200]
18 (14) 72 (58) 35 (28) 40 107 14 [0-83] 36 42 42 46 24 65 45 37
4.1.1.2 A szelektin polimorfizmusok praeeclampsiában Retrospektív, eset-kontroll vizsgálatunkba 126 súlyos praeeclampsiás állapotos asszonyt vontunk be, akiket 1998-2004 között kezeltek a Semmelweis Egyetem I. sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáján. A súlyos praeeclampsia diagnózisát az Amerikai Szülészeti és Nőgyógyászati Kollégium ajánlása (153) alapján állítottuk fel, melyek a következők voltak: a 20. hét után fellépő perzisztens, legalább 6 órán át fennálló magas vérnyomás (≥160/110 Hgmm) és proteinuria. A proteinuria diagnózisát a 3+ vagy 4+ pozitivitást mutató tesztcsík (legalább két vizeletmintában 4 óránál nagyobb
39
különbséggel gyűjtve), vagy több mint 5000 mg / 24 óra fehérjeűrítés esetén állítottuk fel. Ezek mellett a következő tünetek közül legalább egy jelentkezett: fejfájás, epigastriális fájdalom, dyspnoe, oliguria (vizeletelválasztás ≤400 ml/24 óra), thrombocytopenia (≤100 000/μl), emelkedett májenzim értékek (ALT és AST ≥70 U/l). A HELLP syndroma (hemolízis, emelkedett májenzim értékek, alacsony trombocita szám) kritériumai a következők voltak: LDH>600 U/l, ALT>70 U/l és trombocita szám <100000/ μl. A betegeket a szülés után a 12. hétig követték rendszeresen. A súlyos praeeclampsiás csoportba sorolt nőknél a vérnyomás ez alatt a periódus alatt normalizálódott. Krónikus hypertoniás és terhesség előtt diabeteses egyének a vizsgálatba nem kerültek be. A kontroll csoportot 106 olyan asszony alkotta, akinek terhessége szövődménymentes volt. Rögzítésre került a kórtörténet, az anya életkora, a terhesség előtti BMI (testtömegindex) és a dohányzási szokások. A vizsgálatba vont asszonyok tájékozott beleegyezésüket adták a vizsgálathoz, melyet a Semmelweis Egyetem etikai bizottsága jóváhagyott (No: 148/1998). A vizsgált populáció klinikai jellemzőit a 4. táblázat tartalmazza. A továbbiakban a praeeclampsia elnevezést fogom használni a súlyos praeeclampsia jelőlésére. 4. táblázat: Klinikai jellemzők a praeeclampsiás és kontroll terhes populációkban (BMI: testtömegindex, HELLP syndroma: hemolízissel, emelkedett májenzimekkel és alacsony trombocitaszámmal társult szindróma, *p<0,05)
Esetszám Anya életkora (év) Gesztációs kor (hét) középérték [tartomány] Születési súly (gramm) középérték [tartomány] Terhesség előtti anyai BMI (kg/m2) (átlag ± szórás) Nullipara Eclampsia előfordulása HELLP syndroma előfordulása Hypertonia fellépés ideje (gesztációs hét) középérték [tartomány] Proteiunuria fellépés ideje (gesztációs hét) középérték [tartomány]
Súlyos praeeclampsiás nők 126 28 [14-43] 33 * [22-39] 1460 * [350-2750] 23,86 ± 4,39 *
Kontroll terhes nők 106 27 [18-44] 40 [38-42] 3460 [2650-4700] 22,52 ± 3,99
75 % * 5% 12 % 30 [21-36] 31 [22-37]
46%
40
4.1.1.3 Az ER-α PvuII polimorfizmus perinatális morbiditásban A vizsgálatban részt vevő újszülötteknél a gyűjtés módja megegyezett a 4.1.1.1 részben leírttal. 141 kissúlyú koraszülöttet (<1501 g, 69 fiú, 72 lány) és 167 kontroll, egészséges újszülöttet vontunk be a vizsgálatba. Elemeztük a kissúlyú koraszülöttek kórtörténetét az első posztnatális hét alatt, és rögzítettük a fontosabb szövődményeket (részleteket lsd. 4.1.1.1). A betegek többsége megegyezett a 4.1.1.1 vizsgálatba bevontakkal (a diagnosztikus kritériumokat lásd ugyanott). A kontroll, egészséges csoportot 167 újszülött (86 fiú és 81 lány) alkotta. (A vizsgált populáció jellegzetességeit az 5. táblázat foglalja össze.) 5. táblázat: Klinikai jellemzők a vizsgált populációkban és a perinatális komplikációk előfordulása a vizsgálatban szereplő kis súlyú koraszülöttekben Kis súlyú koraszülöttek Kontroll újszülöttek Fiúk Lányok Fiúk Lányok Esetszám 69 72 86 81 Gesztációs kor (hét) 29 29 39 39 középérték [tartomány] [24-36] [24-37] [38-40] [38-40] Születési súly (gramm) 1200 1180 3480 3440 középérték [tartomány] [640-1500] [510-1500] [3210-3750] [3160-3720] Oxigénpótlás ideje (nap) 12 10 középérték [tartomány] [0-83] [0-80] Az alábbi kórképekben megbetegedettek száma Respiratiós distressz 33 40 syndroma Ductus Botalli persistens 23 27 (5. napon) Systemás hypotensio 17 27 (1. posztnatális héten) Korai postnatalis sepsis 18 23 (1. posztnatális héten) Akut veseelégtelenség 20 19 Enterocolitis necrotisans 22 25 (1-3 stádium) Intraventricularis 26 23 hemorrhagia (1-4 stádium) A proliferatív ROP magas kockázata miatt krioterápiával-fotokoagulációval 105 kissúlyú koraszülöttet (kezelt csoport) kezeltek. A kezelés indikációját adó stádiumbeosztás nemzetközileg elfogadott kritériumok (154) alapján történt. A kontroll
41
(nem kezelt) csoportot 115 kis súlyú koraszülött alkotta, akik nem estek át krioterápián/fotokoaguláción (6. táblázat). 6. táblázat: Klinikai jellemzők a vizsgált populációkban *(p<0,05) Krioterápiával/fotokoagulációval kezelt ROP-os kissúlyú koraszülöttek
Krioterápiával/fotokoagulációval nem kezelt ROP-os kissúlyú koraszülöttek
105
115
70/35
60/55
28,8 ± 3,2
29,2 ±2,9
1160 ± 275
1200 ± 270
15*
7
[0-92]
[0-47]
26*
11
Esetszám Nemi megoszlás (fiú/lány) Gesztációs kor (hét) (átlag ± szórás) Születési súly (gramm) (átlag ± szórás) Oxigénpótlás ideje (nap) középérték [tartomány] Bronchopulmonalis dysplasiában szenvedők (%)
4.1.1.4 Az ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus praeeclampsiában Retrospektív, eset-kontroll vizsgálatunkba 119 súlyos praeeclampsiás és 103 kontroll egyént vontunk be (7. táblázat). A súlyos praeeclampsia diagnózisát és a besorolás jellemzőit lsd. a 4.1.1.2 fejezetben. 7. táblázat: Klinikai jellemzők a praeeclampsiás és kontroll terhes csoportokban (BMI: testtömegindex, *p<0,05)
Esetszám Anya életkora (év) Gesztációs kor (hét) középérték [tartomány] Születési súly (gramm) (átlag ± szórás) Magzati retardáció (esetszám) (%) Terhesség előtti anyai BMI (kg/m2) (átlag ± szórás) Nullipara (%)
Súlyos praeeclampsiás nők 119 28 [24-32] 33 [30-35] * 1565 ±586 * 58 (48,7) 23,76 ± 4,25 *
Kontroll terhes nők 103 28 [25-31] 40 [39-41] 3493 ±534 22,59 ± 4,12
88 *
49
42
4.1.2 Funkcionális vizsgálatok 4.1.2.1 A nem szelektív PDE gátló PTXf immunmoduláns hatásának vizsgálata Vizsgálatunkba 5 egészséges férfit (kor: 28 év [24-33], középérték [tartomány]) vontunk be, akik a vizsgálatot megelőzően 24 órán belül nem fogyasztottak ismerten immunmoduláns hatású élvezeti szert vagy gyógyszert. 4.1.2.2 A 17-β-ösztradiol immunmoduláns hatásának vizsgálata Vizsgálatunkba 5 egészséges férfit (kor: 30 év [28-38], középérték [tartomány]) vontunk be, akik a vizsgálatot megelőzően 24 órán belül nem fogyasztottak ismerten immunmoduláns hatású élvezeti szert vagy gyógyszert. 4.1.2.3 Szelektin génpolimorfizmus és expresszió közötti kapcsolat A vizsgálatba 54 egészséges egyént (33 lány, 21 fiú, 9 év [1-40], középérték [tartomány]) vontunk be, akiktől diagnosztikus célú vérvétel után a vizsgálatból visszamaradt, egyébként megsemmisítésre kerülő vérmintákból dolgoztunk. A vért irreverzibilisen anonimizált módon kezeltük, csak a résztvevők korát és nemét jegyeztük fel. 4.2 Módszerek 4.2.1 DNS izolálás 4.2.1.1 DNS izolálás szűrőpapírra beszárított vérmintából A mérésekhez az újszülöttek PKU szűrésére levett, szűrőpapírra cseppentett vérmintáit használtuk. A DNS izolálás során a szűrőpapírból kivágott, mintegy 10 mm2 felületű mintára 200 μl 5%-os Chelex 100 (Biorad, Germany) oldatot mértünk. Ezután a mintákat előbb 90 percig 56˚C-on, majd 10 percig 100˚C-on inkubáltuk. Az így
43
előkészített mintákat szobahőmérsékletre hűtöttük, majd megkevertük. Végül 8000 gvel 2 percig centrifugáltuk a mintáinkat. A további vizsgálatokig a DNS-t tartalmazó felülúszót -20˚C-on tároltuk. 4.2.1.2 DNS izolálás kisózással 500 μl EDTA-val alvadásgátolt vérben a vörösvértesteket lizáltuk. A fehérvérsejteket centrifugálással (11000 g, 2 perc) nyertük ki. Desztillált vízzel történő mosás és centrifugálás után az üledéket felszuszpendáltuk 80 μl 15x tömény Proteinase Kpufferrel, 30 μl Proteinase K enzimmel (10 mg/ml) (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), 40 µ1 10% SDS (natrium dodecyl-szulfát)-sel és 220 µl desztillált vízzel. A mintákat rázó vízfürdőben inkubáltunk 55 °C-on, 30 percig, majd szobahőmérsékletre hűtöttük. 200 µl telített NaCl oldattal (6 M [mólos]) a fehérjéket precipitáltuk, majd centrifugálással (11000 g, 6 perc) szabadultunk meg tőlük. A felülúszót újabb centrifugálással (11000 g, 3 perc) tovább tisztítottuk. Ezt követően 500 µl izopropanollal a DNS-t precipitáltuk. A DNS precipitátumot centrifugálással (13000rpm, 2 perc) és 1 ml 70%-os alkohollal történő mosással tisztítottuk. A DNS-t 50 µl desztillált vízben oldottuk fel. A DNS koncentrációt optikai denzitás alapján 260 nanométeren mértük meg és a koncentrációt beállítottuk az 50 ng/µl-es értékre. Ebből PCR reakciónként 2 µl-t használtunk. 4.2.2 Polimeráz láncreakció, restrikciós fragment hossz polimorfizmus (PCRRFLP) módszerek protokollja 4.2.2.1 Szelektin polimorfizmusok vizsgálata PCR-rel A vizsgált génpolimorfizmusokat a 8. táblázatban olvasható primerek és amplifikációs protokollok felhasználásával határoztuk meg. A szelektin polimorfizmusok és a praeeclampsia kapcsolatának vizsgálatához proteináz K módszerrel izolált DNS mintát, míg a szelektin polimorfizmusok és perinatális morbiditás kapcsolatának vizsgálatához szűrőpapírból izolált DNS-t használtunk. A PCR elegy összetétele 50 μl végtérfogatra a következő volt: 5,0 µl 1x tömény PCR puffer, 1,0-1,0 µl a megfelelő primerekből (10 pmol), 4,0 µl dNTP (0,2 mmol/l), 4,0 µl
44
MgCl2 (3,2 mmol/l), 2,0 µl genomikus DNS (50 ng/µl), 0,3 µl Taq polimeráz (Invitrogen, California, USA, 10 U/μl), 32,7 µl desztillált víz. A mintákra 2 csepp PCR olaj került és a 8. táblázatban található amplifikációs protokollt használtuk. A felszaporított termékeket 3%-os agaróz gélen, etidium-bromid festéssel (0,4 mg/L) vizualizáltuk UV fény alatt. Ezután a felszaporított termékeket a megfelelő restrikciós enzimekkel hasítottuk, majd újabb elektroforetikus futtatás és UV fénnyel történő vizualizálás után olvastuk le a genotípusokat (4., 5., 6. ábra). 8. táblázat: A szelektin polimorfizmusok vizsgálatakor alkalmazott PCR-RFLP jellemzői (F: forward primer, R: reverse primer, bp: bázispár)
Denaturáció (másodperc) Anelláció (másodperc) Extenzió (másodperc) Végső extenzió (perc) Ciklus szám Primerek
Anellációs hőmérséklet Restrikciós enzim Emésztés Vad és mutáns allél esetén a termék hossza
E-szelektin (Ser128Arg) 30
Vizsgált polimorfizmusok P-szelektin (Thr715Pro) 15
L-szelektin (Pro213Ser) 15
45
30
30
45
30
30
7 40 F: 5’-agaaag aggcaagaac cagact -3’ R: 5’-aaagg cactcagtataa gcaca-3’
7 40 F:5’-ggttgctgttctcaaa gtgattttgggagaa-3’ R: 5’-cctgaagactgg agagtgagttaaatgct-3’
7 40 F: 5’-aaaggcacatggtta tcaag-3’
58 °C
60 °C
R:5’-cacaggtggtttcttca atc-3’ 55 °C
Pst I 10 órán át 37 °C vad típus: 109+84 bp mutáns: 193 bp
BstE II 10 órán át 60 °C vad típus: 256 bp mutáns: 129+127 bp
Hph I 10 órán át 37 °C vad típus: 131+99 bp mutáns: 230 bp
45
ArgArg
300bp 200bp 100bp
SerSer
SerArg
193 bp 300bp 200bp
193bp 109bp 84bp
E-szelektin Ser128Arg amplifikátum
100bp
PstI emésztés után a restrikciós termékek
4. ábra: A vizsgált E-szelektin polimorfizmus gélelektroforetikus képe emésztés előtt és után (SerSe: homozigóta vad genotípus, SerArg: heterozigóta genotíous, ArgArg: homozigóta mutáns genotípus, bp: bázispár)
ThrThr
300bp 200bp 100bp
ThrPro
193 bp 300 bp 200 bp
256bp 129bp +127 bp
100bp
P-szelektin Thr715Pro amplifikatum
BstEII emésztés után a restrikciós termékek
5. ábra: A vizsgált P-szelektin polimorfizmus gélelektroforetikus képe emésztés előtt és után (ThrThr: homozigóta vad genotípus, ThrPro: heterozigóta genotípus, bp: bázispár)
SerSer
300bp 200bp 100bp
193 bp
ProPro
ProSer
300bp 200bp 100bp
L-szelektin Pro213Ser amplifikátum
230bp 131bp 99 bp
HphI emésztés után a restrikciós termékek
6. ábra: A vizsgált L-szelektin polimorfizmus gélelektroforetikus képe emésztés előtt és után (ProPro: homozigóta vad genotípus, ProSer: heterozigóta genotípus, SerSer: homozigóta mutáns genotípus, bp: bázispár)
4.2.2.2 ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus vizsgálata PCR-rel A vizsgálathoz szűrőpapírból izolált DNS-t használtunk. A PCR reakcióelegy összetétele 50 μl végtérfogatra a következő volt: 5,0 µl 1x tömény PCR puffer, 1,0-1,0
46
µl a megfelelő primerekből (10 pmol), 4,0 µl dNTP (0,2 mmol/l), 4,0 µl MgCl2 (3,2 mmol/l), 2,0 µl genomikus DNS (50 ng/µl), 0,3 µl Taq polimeráz (Invitrogen, California, USA, 10 U/μl), 32,7 µl desztillált víz. A mintákra 2 csepp PCR olaj került és a 9. táblázatban jelzett programot használtuk. A felszaporított termékeket 3%-os agaróz gélen, etidium-bromid festéssel (0,4 mg/L) UV fény alatt vizualizáltuk. Ezután a felszaporított termékeket a megfelelő restrikciós enzimekkel hasítottuk, majd újabb elektroforetikus futtatás és UV fénnyel történő vizualizálás után olvastuk le a genotípusokat (7., 8. ábra). 9. táblázat: Az ER- α PvuII és XbaI polimorfizmus vizsgálatakor alkalmazott PCRRFLP jellemzői (F: forward primer, R: reverse primer, ER-α: ösztrogén receptor-α, bp: bázispár) A vizsgált polimorfizmusok ER-α PvuII és XbaI Denaturáció 15 (másodperc) Anelláció 15 (másodperc) Extenzió (másodperc) 30 Végső extenzió (perc) 7 Ciklus szám 40 Primerek F: 5)-CAG-GGT-TAT-GTG-GCA-ATG-AC-3) R: 5)-TAC-CTA-TAA-AAA-TGA-CAA-AAT-GAAAT-3) Anellációs hőmérséklet Restrikciós enzim
50 °C
Emésztés Vad és mutáns allél esetén a termék hossza
10 órán át 37 °C vad allél: 155+100 bp vad allél: 143+112 bp mutáns allél: 255bp mutáns allél: 255bp
PvuII
XbaI
47
Pp 255bp
300bp 200bp 100bp
pp
PP
300bp 200bp
255bp 155bp 100bp
100bp
ER-α PvuII amplifikatum
PvuII emésztés után a restrikciós termékek
7. ábra: A vizsgált ER-α PvuII polimorfizmus gélelektroforetikus képe emésztés előtt és után (PP:homozigóta vad genotípus, Pp: heterozigóta genotípus, pp: homozigóta mutáns genotípus, bp: bázispár)
255bp
XX
xx
Xx
300bp 200bp 100bp
300bp
255bp
200bp
143bp 112bp
100bp
ER-α polimorfizmus amplifikatum
XbaI emésztés után a restrikciós termékek
8. ábra: A vizsgált ER- α XbaI polimorfizmus gélelektroforetikus képe emésztés előtt és után (XX: homozigóta vad genotípus, Xx: heterozigóta genotípus, xx: homozigóta mutáns genotípus, bp: bázispár)
4.2.3 Flow citométeres vizsgálati módszerek 4.2.3.1 17-β-ösztradiol és pentoxifillin hatásának vizsgálata neutrofil granulocita és monocita fagocita képességére A fagocitaképesség vizsgálatát a Phagotest® (Orpegen Pharma, Heidelberg, Németország) segítségével végeztük el. A teszt alkalmas a fagocitozis kvantitatív meghatározására a fehérvérsejtek által bekebelezett, fluoreszcens festékkel jelölt E. coli tartalom alapján. A fehérvérsejtek fagocita képessége alapvető a különféle kórokozók eliminációjához. A gyulladásos sejtek a gyulladás helyére vándorolnak, a kórokozóval kapcsolatot
48
létesítenek. Ezt követi a bekebelezés folyamata, majd az intracelluláris killing, mely részben reaktív oxigéngyök mediált folyamat. Heparinizált teljes vért inkubálunk 37°C-on FITC-jelölt E. coli-val. A negatív kontroll mintát jégen hagyjuk. A fagocitózist a minták jégre helyezésével és a Quenching oldat hozzáadásával állítjuk le. Ez az oldat a nem fagocitált baktériumok fluoreszcens jelölését közömbösíti, lehetővé téve az intracelluláris és extracelluláris baktrériumok közötti diszkriminációt. A vörösvértestektől a lizáló oldat (Lysing solution) és a kétszeri mosási lépéssel (Washing solution) szabadulunk meg. A mérés előtt a mintához adott DNS festék (DNA staining solution) az eukarióta örökítőanyaghoz nagyobb affinitással kötődik, így segít differenciálni a bakteriális aggregátumok és a fagocita sejtek között. 4.2.3.1.1 Mintaelőkészítés Az immunmoduláns hatás vizsgálatára a teljes vért 17-β-ösztradiol és pentoxifillin különféle koncentrációinak jelenlétében inkubáljuk. 100 μl végtérfogatban a heparinizált teljes vérben 20-200-2000 mg/ml pentoxifillin koncentrációt állítunk be, a negatív kontroll csőbe fiziológiás só kerül. 37 °C-on inkubáljuk a mintákat 60 percen át. A 17-β-ösztradiol vizsgálatára 100 μl végtérfogatban 10-10 - 10 -8 és 10-7 M/l gyógyszer végkoncentrációt állítunk be. A negatív kontroll csőbe a 17-β-ösztradiol oldóanyaga, abszolút alkohol kerül. Ezt követően 37 °C-on inkubálunk 6 órán át a mintákat. Mintánként 100 μl, gyógyszerrel előinkubált heparinos vért jéghideg vízfürdőben inkubálunk 10 percen át. A jelölt E. coli baktériumból 20 μl-t adunk a mintákhoz. A kontroll mintát jégen hagyjuk, a teszt mintákat 10 percre 37°C-os vízfürdőbe helyezzük. Az inkubációs idő végén a teszt mintákat egyszerre jégre helyezzük, mellyel a fagocitózist leállítjuk és 100 μl 0 ºC-os Quenching oldatot mérünk hozzájuk. Ezt követi kétszeri mosási lépés a Washing oldattal. A vörösvértesteket 20 percen át lizáljuk a Lysing oldat segítségével, ezt követi újabb kétszeri mosási lépés. Legvégül mintáinkhoz 200 μl DNS festéket adunk (DNA staining oldat) és fénytől védve 10 percen át inkubáljuk jégfürdőben. A mintaelőkészítést követően a mérést 60 percen belül el kell végezni.
49
4.2.3.1.2 Flow citométeres analízis A méréshez kék-zöld tartományban gerjesztő, 488 nm-es hullámhosszú argon-ion lézert tartalmazó FACSAriaTM készüléket és CellQuestTM software-t használtunk. Az adatgyűjtéshez az „élő kaput” (M1) a DNS festékre állítottuk be. Ezzel csak azokat az eseményeket regisztráltuk, amelyek az eukarióta DNS festékre pozitívak voltak, így kiküszöböltük a bakteriális aggregátumokat, melyek a fehérvérsejtekkel azonos méret és granuláltság tulajdonsággal rendelkeztek (9. ábra). 10000 eseményt regisztráltunk mérésenként.
Leukocita
e s e t s z á m Baktérium DNS festék
9. ábra: A DNS festék alapján a leukociták elkülönítése (M1: élő kapu)
Méret és granuláltság alapján a neutrofil granulociták és monociták elkülöníthetők. A fagocitáló sejtek arányát a kapuzott sejtpopulációkon belül az FL1 csatornán detektált FITC pozitív sejtekből határozzuk meg az átlagos fluoreszcens intenzitás (MIF) és az esetszám hányadosa alapján (MIF/esetszám) (10. ábra).
50
Kapu a granulocitákon 0ºC kontroll e s e t s z á m
Inkubáció 10 perc 37ºC
FITC Kapu a monocitákon
0ºC kontroll e s e t s z á m
Inkubáció 10 perc 37ºC
FITC
10. ábra: Granulociták és monociták elkülönítése, fagocitáló sejtek arányának meghatározása (FSC:forward scatter, méret; FITC: fluoreszcens izotiocianát; R1:kapuzott régió; M1 és M2: intenzitás kapuk, SSC:side scatter, granuláltság)
4.2.3.2 17-β-ösztradiol és pentoxifillin hatásának vizsgálata neutrofil granulocita és monocita reaktív oxigéngyök termelő képességére A reaktív oxigéngyök termelő képesség vizsgálatát a Phagoburst® teszt (Orpegen Pharma, Heidelberg, Németország) segítségével végeztük el. A teszt alkalmas az oxidatív burst kvantitatív meghatározására a fehérvérsejtekhez adott fluoreszcens festék oxidatív átalakulása alapján. A fagocitózist követő intracelluláris killing részben reaktív oxigén gyök-mediált folyamat. A teszt tartalmazza a következő anyagokat: a fiziológiás stimulusért felelős, jelöletlen E. coli baktérium, a maximális aktivációt okozó phorbol 12-myristate 13acetate (PMA), mely a protein-kináz C aktivációját okozza és az alacsony stimulusért
51
felelős kemotaktikus peptid, az N-formyl-MetLeuPhe (fMLP). Ezek mellett még a teszt tartalmazza a dihidrorodamin (DHR123, Substrate solution) fluorogén szubsztrátot. A heparinizált teljes vért a fenti aktivátorokkal 37°C-on inkubáljuk, a negatív kontrollként szolgáló mintát nem stimuláljuk. Stimuláció hatására a neutrofil granulociták és monociták reaktív oxigén gyököket (superoxid anion, hidrogén peroxid, hipoklórsav) termelnek, mely a fagoszómában található kórokozók destrukciójához vezet. Az oxidatív burst nyomon követhető a DHR123 festék oxidációs termékének (R123) vizsgálatával. A reakciót a lizáló oldat hozzáadásával állítjuk le, ami a vörösvértestek destrukcióját és a fehérvérsejtek részleges fixációját okozza. A mosási lépés (Washing solution) után a mintákhoz DNS festéket (DNA staining solution) adunk, mely az eukarióta örökítőanyaghoz nagyobb affinitással kötődik, így segít differenciálni a bakteriális aggregátumok és a fagocita sejtek között. 4.2.3.2.1 Mintaelőkészítés Az immunmoduláns hatás vizsgálatára a teljes vért 17-β-ösztradiol és pentoxifillin különféle koncentrációinak jelenlétében inkubáljuk. 100 μl végtérfogatban a heparinizált teljes vérben 20-200-2000 mg/ml pentoxifillin koncentrációt állítunk be, a negatív kontroll csőbe fiziológiás só kerül. A mintákat 37 °C-on inkubáljuk 60 percen át. A 17-β-ösztradiol vizsgálatára 100 μl végtérfogatban 10-10 - 10 -8 és 10-7 M/l gyógyszer végkoncentrációt állítunk be. A negatív kontroll csőbe a 17-β-ösztradiol oldóanyaga, abszolút alkohol kerül. Ezt követően a mintákat 37 °C-on inkubáljuk 6 órán át. Mintánként 100 μl, gyógyszerrel előinkubált heparinos vért jéghideg vízfürdőben inkubálunk 10 percen át. A jelöletlen E. coli baktériumból 20 μl-t mérünk a vérmintákhoz. A negatív kontroll csőbe 20 μl mosó oldat kerül. Az alacsonyan aktiváló csőbe 20 μl fMLP-t (0,005 mM), a magasan aktiváló csőbe 20 μl PMA-t (0,0081 mM) mérünk. A csöveket 10 percen át 37°C-os vízfürdőben inkubáljuk. A mintákhoz 20 μl Substrate solution-t mérünk, melyet újabb 37°C-os vízfürdőben történő inkubálás követ 10 percen át. A mintákat egyszerre szobahőre helyezzük. A vörösvértesteket 20 percen át lizáljuk a Lysing oldat segítségével, ezt követően mossuk. Legvégül 200 μl DNS festéket (DNA staining oldat) adunk mintáinkhoz és fénytől védve 10 percen át
52
inkubáljuk jégfürdőben. A mintaelőkészítést követően 30 percen a mérést meg kell ejteni. 4.2.3.2.2 Flow citométeres analízis A méréshez kék-zöld tartományban gerjesztő, 488 nm-es hullámhosszú argon-ion lézert tartalmazó FACSAriaTM készüléket és CellQuestTM software-t használtunk. Az adatgyűjtéshez az „élő kaput” (M1) a DNS festékre állítottuk be. Ezzel csak azokat az eseményeket regisztráltuk, amelyek az eukarióta DNS festékre pozitívak voltak, így kiküszöböltük a bakteriális aggregátumokat, melyek a fehérvérsejtekkel azonos méret és granuláltság tulajdonsággal rendelkeztek (11. ábra). 10000 eseményt regisztráltunk.
Leukocita e s e t s z á m
Baktérium
DNS festék
11. ábra: A DNS festék alapján a leukociták elkülönítése (M1: élő kapu)
Méret és granuláltság alapján a neutrofil granulociták és monociták kapuzhatóak. A burst aktivitást mutató sejtek arányát a kapuzott sejtpopulációkon belül az FL1 csatornán detektáljuk az átlagos fluoreszcens intenzitás (MIF) és az esetszám hányadosa alapján (MIF/esetszám) (12. ábra). Az FL1 csatorna a fluorogén szubsztrát detektálására alkalmas.
53
Kapu a granulocitákon
e s e t s z á m
Kontroll Stimuláció E. Coli-val
Kapu a granulocitákon
e s e t s z á m
Kontroll Stimuláció PMA-val
FITC
Kapu a monocitákon
e s e t s z á m
Kontroll
FITC
Stimuláció E. Coli-val
FITC
12. ábra: Granulociták és monociták elkülönítése, burst aktivitást mutató sejtarány meghatározása meghatározása (FSC: forward scatter, méret; FITC: fluoreszcens izotiocianát; R1: kapuzott régió; M1 és M2: intenzitás kapuk, SSC: side scatter, granuláltság)
4.2.3.3 17-β-ösztradiol és pentoxifillin hatásának vizsgálata neutrofil granulocita és monocita aktiválhatóság mértékére. Trombocita aktiválhatóság vizsgálata A trombocita aktivációját a granulumaiban tárolódó és ADP stimulusra a felszínre kerülő P-szelektin (CD62P) expresszió fokozódás alapján vizsgáljuk. A neutrofil granulocita és monocita aktivációját a sejtfelszíni CD11b és L-szelektin (CD62L) expresszió változása alapján ítéljük meg. Bakteriális peptid (fMLP) hatására a CD11b expressziója fokozódik, az L-szelektin expresszió csökken. Ahhoz, hogy a mintapreparáció során fellépő aktiválódást minimális szintre csökkentsük, a vörösvértest lizáló lépést kihagytuk és a többszöri mosási lépéseket sem alkalmaztuk.
54
4.2.3.3.1 Minták előkészítése A 17-β-ösztradiol neutrofil granulocita és monocita aktiválhatóságának vizsgálatára 20 μl
citrátos
vér
végtérfogatában
10-10-10-8
és
10-7
M/l-es
17-β-ösztradiol
végkoncentrációt állítunk be. A negatív kontroll csőbe a 17-β-ösztradiol vivőanyaga az abszolút alkohol kerül. Ezt követően 6 órán keresztül inkubálunk 37°C-on. A pentoxifillinnel hasonló módon járunk el. A koncentrációkat ebben az esetben 20-2002000 mg/ml-re állítjuk be és a negatív kontroll csőbe fiziológiás só kerül. Ezt követően 37°C-on, 60 percen át inkubálunk. A trombocita aktiváció vizsgálatára ADP-t mérünk 10 μM végkoncentrációban a megfelelő csövekbe és szobahőmérsékleten, sötétben inkubáljuk 20 percen át. Az immunmoduláns hatású szerekkel előinkubált mintákhoz a neutrofil granulocita és monocita aktiváció vizsgálatára a megfelelő csövekbe fMLP-t mérünk 10-5 M végkoncentrációban és szobahőmérsékleten inkubáljuk 20 percen át. A mintákhoz a következő antitestekből adunk 3-3 μl-t: CD15-FITC (neutrofil-monocita marker), CD14-PerCP (monocita marker), CD42b-APC (aktiváció independens trombocita marker), CD62P-PE (aktiváció dependens trombocita marker), CD62L-PE (fehérvérsejt aktivációs marker), CD11b-MAC-PE-Cy7 (fehérvérsejt aktivációs marker). A kontroll mintához izotípus antitestek kerülnek (PE-IgG1 és PE-Cy7-IgG1). A megfelelő antitestekkel 20 percen át, szobahőmérsékleten, fénytől védve inkubálunk. Végül a mintákat 160 x-ára hígítjuk 1% BSA-t, 0,38% citrátot tartalmazó PBS oldattal. A mérés a mintaelőkészítést követően azonnal megtörténik. 4.2.3.3.2 Flow citométeres analízis A trombocita aktiváció vizsgálata során csak azokat az eseményeket regisztráljuk, amelyek CD42b markerre pozitívak. Ez a marker minden trombocita felszínén megtalálható az aktiváltsági állapottól függetlenül. Ezzel az egyéb zavaró eseményeket kizárjuk. A populáción belül a CD62P markerre pozitív események adják az aktivált trombocita hányadot az átlagos fluoreszcens intenzitás (MIF) és az esetszám hányadosából képezve (MIF/esetszám) (13. ábra).
55
CD42b -APC
CD42b -APC
CD62P-PE
CD62P-PE
Stimuláció nélkül
ADP stimulációval
13. ábra: Az aktivált trombocita hányad meghatározása (a CD42b-APC pozitív populáción belül a CD62P-PE pozitív események adják az aktivált trombocita hányadot-Q2 kvadráns) A neutrofil granulocita és monocita aktiváció vizsgálatakor csak azokat az eseményeket regisztráljuk melyek CD45 markerre pozitívak. Ezzel az egyéb populációktól mentes fehérvérsejt populációhoz jutunk. Ezen belül méret /granuláltság, CD14-CD15 markerek segítségével a neutrofil granulociták és monociták elkülöníthetők. A CD62L és CD11b marker változással az aktivált sejtek aránya mondható meg az átlagos fluoreszcens intenzitás (MIF) és az esetszám hányadosából képezve (MIF/esetszám) (14. ábra).
CD62L-PE
CD62L-PE
CD11b-MAC-PE-Cy7 CD11b-MAC-PE-Cy7
Stimuláció nélkül
fMLP stimuláció után
14. ábra: Fagocita sejtaktiváció meghtaározása (az fMLP stimulációt követően a CD62L pozitív sejtek aránya csökken, míg a CD11b-MAC pozitív sejteké növekszik)
56
4.2.4 Statisztikai elemzés 4.2.4.1 Bevezetés Az egymást kölcsönösen kizáró minőségi vagy discontinuus tulajdonságokat meghatározó géneket alléleknek nevezzük. A betegségért (kóros állapotért) felelős gént mutáns vagy hibás, a szabályos allélját normális („vad típusú”) génnek nevezzük. A genotípus a jelleg létrehozását biztosító genetikai szerkezet. A kategorikus változók összehasonlítására χ2 próbát, ill. ennek speciális esetét a Fischer-egzakt
próbát
használtuk.
A
folytonos
normális
eloszlású
változók
összehasonlítása t-próbával történt. A változók normális eloszlásának meghatározása Kolgomorov-Sminov próbával történt. A nem normális eloszlást követő folytonos változókat Mann-Whitney féle U-próbával hasonlítottuk össze. A folytonos, normális eloszlású változók közötti kapcsolat leírására lineáris regressziót használtunk. A kategorikus függő változók esetén logisztikus regresszióval kerestük a kapcsolatot. A regressziós vizsgálatok során a legfontosabb ismert kockázati tényezőkre korrigáltuk az összefüggést, hogy a független változók önálló hatását vizsgálhassuk. A szignifikancia szint a vizsgálatoknál p<0,05 volt. A számításokat az SPSS 10.0 programcsomaggal (SPSS Inc, Chicago) végeztük 4.2.4.1.1 Allélfrekvencia kiszámítása A gének több változatban léteznek. Az egy nukleotidot érintő változást, melyek előfordulása 1% felett van, polimorfizmusnak nevezzük. Egy adott populációban vizsgáljuk egy polimorfizmus két alléljának gyakoriságát. Legyen a két allél „A” és „G”. Legyen „AA” homozigóta: „x”, „AG” heterozigóta: „y”, „GG” homozygota: „z”. Mennyi a G allél gyakorisága a vizsgált (x+y+z) emberben? Az (x+y+z) embernek összesen 2*(x+y+z) allélja van. Ezekből (x*2+y) az „A” allél. Gyakorisága: (x*2+y) / 2*(x+y+z). A „G” allél gyakorisága = (1- „A”allél gyakorisága).
57
4.2.4.1.2 Hardy-Weinberg egyensúly és számítása Egy ideális populációban minden egyed azonos valószínűséggel párosodhat bármely más ellentétes nemű egyeddel. Az allélgyakoriság a gamétákban lévő allélek gyakoriságától függ. Vizsgáljuk egyetlen lókusz két alléljának („A” és „a”) gyakoriságát két egymást követő generációban. Az első generációban legyen „A” allél relatív gyakorisága „p”(A), „a” allélé pedig „q”(a). A két relatív gyakoriság összege 1, tehát p=(1–q). Egy gaméta vagy az egyik, vagy a másik allélt hordozza, így az „A” allélt hordozó gaméták gyakorisága „p”, az „a” allélt hordozó gaméták gyakorisága „q”. Az egyes genotípusok létrejöttének valószínűsége és így arányuk a populációban a következőképpen várható: p2(AA) + 2pq(Aa) + q2(aa) = 1 azaz (p+q)2 = 1. Ideális populációban az utódnemzedékben az allélek gyakorisága azonos a szülői nemzedék allélgyakoriságával. Az allélgyakoriságok állandóságának tételét Hardy-Weinberg egyensúlynak nevezik. Az egyensúlytól való eltérést Khi-négyzet (χ2) teszttel számoljuk. χ2 = Σ (kapott érték - várt érték)2/várt érték. A várt értékeket a két allél gyakoriságából és az összallél számból számoljuk. A kapott értékeket a genotipizálás során nyert adatok szolgáltatják. Ha a χ2 értékhez tartozó szignifikancia szint kisebb, mint 0,05, akkor eltérés van a Hardy-Weinberg egyensúlytól. 4.2.4.1.3 Power analízis A statisztikai power a vizsgálat erejét mutatja meg. Alkalmas arra, hogy a kimutatandó különbséghez megadjuk a szükséges mintaszámot, vagy fordított esetben egy adott mintaszámnál
meghatározzuk
a
legkisebb
kimutatható
különbség
mértékét.
Vizsgálatainkban a poweranalízist a Statistica 6.0-s szoftverrel végeztük. Vizsgálatainkban 100-200 fős populáció állt rendelkezésre, kétszeres különbség kimutatását tűztük ki célul. Az α értéket 0,05-ként, a β értéket (power) 0,8-ként definiáltuk. A poweranalízis alapján vizsgálataink 20-30%-os különbségek kimutatására voltak alkalmasak.
58
4.2.4.2 A szelektin polimorfizmusok és a koraszülés, perinatális morbiditás kapcsolata A születési súlyt és a gesztációs kort Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze. A kategorikus adatokat (allélfrekvencia, rizikófaktorok) χ2 teszttel vagy Fisher-exact próbával hasonlítottuk össze. Logisztikus regresszióanalízist alkalmaztunk a vizsgált génvariánsoknak a BPD-re és korai postnatalis sepsisre kifejtett független hatásának vizsgálatára, figyelembe véve a rizikófaktorok meglétét (rizikófaktorok lásd 9. táblázat). A szignifikancia határa p<0,05 volt. Az oxigén szupplementáció időtartamát log-transzformáltuk, majd az így normalizált értékekkel analizáltuk a genotípusok és a lélegeztetés összefüggését. Stepwise többszörös regresszióanalízist használtunk a gesztációs kor, a genotípusok és a perinatális komplikációk, mint független változók és az oxigén szupplementáció, mint függő változó összefüggésének vizsgálatára. 4.2.4.3 A szelektin polimorfizmusok és praeeclampsia kapcsolata A kategorikus változókat (allélfrekvencia, genotípus eloszlás) χ2 teszttel hasonlítottuk össze a praeeclampsiás és kontroll, terhes nőkben. Logisztikus regresszióval vizsgáltuk a polimorfizmusok független hatását a praeeclampsia kialakulására figyelembe véve a rizikófaktorok jelenlétét. Az adjustáló rizikófaktorok a következőek voltak: terhesség előtti testtömeg-index (BMI), nulliparitás, az anya életkora és dohányzás. A hipertónia és a proteinúria idejét log-transzformáltuk, majd az így normalizált értékekkel vizsgáltuk a genotípusok, rizikófaktorok és a hipertónia és proteinúria idejének összefüggését többszörös lineáris regresszió analízissel. A függő változókat a hipertónia és proteinúria fellépésének ideje adta. 4.2.4.4 Az ER-alfa PvuII polimorfizmus és perinatális morbiditás kapcsolata Folytonos változók (születési súly, gesztációs kor) esetén megvizsgáltuk, hogy a változók normális eloszlást követnek-e. A normalitás vizsgálata Kolgomorov-Smirnoff
59
próba segítségével történt. A folytonos változók nem követtek normális eloszlást, ezért a mediánjaik összehasonlítására Mann-Whitney U tesztet alkalmaztunk. A diszkrét változók (allélfrekvencia, rizikófaktorok) összehasonlítására χ2 próbát vagy Fisher-egzakt tesztet használtunk. A koraszülött és kontroll csoport, valamint a koraszülött csoporton belül a perinatális morbiditás alapján képzett csoportok genotípus eloszlásait és allélfrekvenciáit szintén χ2 próbával, illetve Fischer egzakt teszttel hasonlítottuk össze. Logisztikus regresszió analízis segítségével vizsgáltuk az egyes genotípusok és allélhordozás független hatását az ARF, NEC, IVH, systemás hypotensio, PDA, korai postnatalis sepsis, IRDS, BPD kialakulására, figyelembe véve a rizikófaktorok jelenlétét. A regresszióanalízis során a megfelelő rizikótényezőkkel korrigáltunk (10. táblázat). Az oxigén szupplementáció időtartamát log-transzformáltuk, majd az így normalizált értékekkel analizáltuk a genotípusok, allélhordozás és a lélegeztetés összefüggését. Stepwise többszörös regresszió analízist használtunk a gesztációs kor, a genotípusok és a perinatális komplikációk, mint független változók és az oxigén szupplementáció, mint függő változó összefüggésének vizsgálatára. 10. táblázat: A perinatális szövődményekre alkalmazott korrigáló tényezők (IRDS- respiratiós distressz syndroma, PDA- ductus Botalli persistens, ARF-akut veseelégtelenség, NECenterocolitis necrotisans, IVH- intraventricularis hemorrhagia, BPD- bronchopulmonalis dysplasia)
Perinatális szövődmény ARF NEC IVH Systemás hypotensio PDA Korai postnatalis sepsis IRDS BPD Lélegeztetés hossza
Adjustáló tényezők Gesztációs kor, korai postnatalis sepsis, NEC, IRDS, PDA, systemás hypotensio Gesztációs kor, korai postnatalis sepsis, PDA, systemás hypotensio Gesztációs kor Gesztációs kor, PDA, IRDS, korai postnatalis sepsis Gesztációs kor, systemás hypotensio Gesztációs kor, NEC Gesztációs kor, prenatális szteroid kezelés Gesztációs kor, NEC, IRDS, IVH, systemás hypotensio, PDA Gesztációs kor, NEC, IRDS, IVH, systemás hypotensio, PDA
A ROP és polimorfizmus kapcsolat vizsgálatakor allélfrekvenciát és allélhordozást számoltunk. A születési súlyt, a gesztációs kort Mann-Whitney próbával hasonlítottuk
60
össze. A kategórikus adatokat (allélfrekvencia, rizikófaktorok) χ2-próbával vagy Fisheregzakt teszttel hasonlítottuk össze. Logisztikus regresszióanalízis segítségével vizsgáltuk az egyes genotípusok és allélhordozás független hatását a kezelést igénylő ROP kialakulására, figyelembe véve a rizikófaktorok meglétét. A korrigáló rizikófaktorok a következők voltak: nem, gesztációs kor, oxigén szupplementáció ideje. 4.2.4.5 Az ER-alfa PvuII és XbaI polimorfizmus és praeeclampsia kapcsolata A folytonos változók normalitását Kolgomorov-Smirnoff próbával vizsgáltuk. A normál eloszlású folytonos változók összehasonlítására t-próbát, a nem normál eloszlásúakhoz Mann-Whitney U-tesztet használtunk. χ2 teszttel hasonlítottuk össze a kategorikus változókat a praeeclampsiás és kontroll csoportok között. Többszörös logisztikus regressziót alkalmaztunk az egyes genotípusok független hatásának vizsgálatára a praeeclampsia kialakulására, figyelembe véve a rizikófaktorok (anya életkora, terhesség előtti BMI, dohányzás, nulliparitás) meglétét. 4.2.4.6-4.2.4.7 A nem szelektív PDE gátló pentoxifillin és 17-β-ösztradiol immunmoduláns hatása A pentoxifillin és 17-β-ösztradiol különféle koncentrációjának hatását az általunk vizsgált imunfunkciókra nézve Friedman-teszttel vizsgáltuk. 4.2.4.8 Polimorfizmus és funkció közötti kapcsolat vizsgálata A trombocita P-szelektin aktiválás nélküli denzitását, ADP stimulációt követő denzitást, valamint a változás mértékét Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a különféle Pszelektin genotípussal bíró egyénekben. A neutrofil granulocita és monocita aktiválás nélküli L-szelektin denzitását, fMLP stimulációt követő denzitását, valamint a változás mértékét szintén Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a különféle L-szelektin genotípussal bíró egyénekben.
61
5. EREDMÉNYEK 5.1 Genetikai polimorfizmus-vizsgálatok 5.1.1 Szelektin polimorfizmusok koraszülöttségben és perinatális kórképekben A vizsgált allélok esetén minden csoportban teljesült a Hardy-Weinberg egyensúly. A vizsgált E -és P-szelektin polimorfizmusok genotípus-eloszlása nem különbözött a kis súlyú koraszülött és egészséges, kontroll újszülött csoportok között (11. táblázat). A mutáns L-szelektin allél (213Ser) hordozás azonban gyakrabban fordult elő a kis súlyú koraszülött csoportban (OR [95% CI]: 1,20 [1,03-1,40] p=0,045). Nem találtunk összefüggést az L-szelektin polimorfizmus és a koraszülöttség oka között. A mutáns L-szelektin allél prevalenciája a praeeclampsia miatt koraszülött csoportban 0,17, az anyai infekció következtében koraszülöttekben 0,20, az egyéb/ismeretlen okból koraszülött csoportban 0,19 volt. 11. táblázat: A szelektin polimorfizmusok genotípus eloszlásai (* OR [95% CI]: 1,20 [1,03-1,40] p=0,045)
Esetszám
Kis súlyú koraszülöttek 125
Egészséges újszülöttek 156
E-szelektin Ser128Arg SerSer/SerArg/ArgArg (mutáns allél prevalenciája) P-szelektin Thr715Pro ThrThr/ThrPro/ProPro (mutáns allél prevalenciája) L-szelektin Pro213Ser ProPro/ProSer/SerSer (mutáns allél prevalenciája)
0,66/0,31/0,03 (0,18) 0,78/0,22/0,0 (0,11) 0,65/0,32/0,03* (0,19)
0,76/0,22/0,02 (0,13) 0,79/0,19/0,02 (0,12) 0,78/0,20/0,02 (0,12)
Egyik vizsgált szelektin polimorfizmus sem mutatott összefügést a korai postnatalis sepsissel, az oxigén kezelés hosszával és a BPD kockázatával. Az L-szelektin ProPro/ProSer/SerSer genotípus eloszlása hasonló volt a BPD-ben szenvedő és nem szenvedő kis súlyú koraszülöttekben (0,71/0,21/0,08 vs. 0,63/0,35/0,02, ns.). A fontosabb rizikótényezőkre korrigálva a mutáns L-szelektin allélt (213Ser) hordozó kis súlyú koraszülöttekben a BPD gyakrabban (OR [95% CI]: 2,45 [1,01-5,95], p=0,04) fordult elő.
62
5.1.2 Szelektin polimorfizmusok praeeclampsiában A vizsgált allélokra vonatkozóan teljesült a Hardy-Weinberg egyensúly. Vizsgáltuk, hogy a szelektin polimorfizmusok hordozása hogyan befolyásolja a praeeclampsia rizikóját, lefolyását. A genotípus-eloszlás megegyezett a praeeclampsiás és egészséges terhes csoportban (12. táblázat). Nem volt különbség a praeeclampsia kockázati tényezőire való korrekciót követően sem. 12. táblázat: A szelektin polimorfizmusok genotípus eloszlása a praeeclampsiás és kontroll terhes populációkban Súlyos praeeclampsiás Egészséges terhes nők terhes nők Esetszám 126 106 P-szelektin Thr715Pro 0,87 / 0,12 / 0,01 0,80 / 0,19 / 0,01 ThrThr/ThrPro/ProPro (0,075) (0,10) (mutáns allél prevalenciája) E-szelektin Ser128Arg 0,69 / 0,28 / 0,03 0,79 / 0,21 / 0,00 SerSer/SerArg/ArgArg (0,17) (0,1) (mutáns allél prevalenciája) A praeeclampsiás csoporton belül a hypertonia fellépésének idejét több tényező (anya életkora, dohányzás, terhesség előtti BMI) mellett a mutáns 715Pro P-szelektin allél hordozása is befolyásolja; ennek jelenlétekor a hypertonia mintegy 2 héttel korábban lépett fel (13. táblázat). 13. táblázat: Többszörös lineáris regressziós analízis (“B”: nyers regressziós koefficiens, “beta”: standardizált regressziós koefficiens, BMI: testtömegindex)
Függő változó: hipertónia fellépés ideje (gesztációs hét) Független változók
P-szelektin 715Pro allél E-szelektin 128Arg allél Anya életkora Nulliparitás Dohányzás Terhesség előtti BMI
B
-2,05 0,35 -0,21 -0,73 -0,09 -0,15
B érték 95%-os konfidencia intervalluma -3,93 - -0,18 -0,96 - 1,67 -0,32 - -0,10 -2,19 - 0,73 -0,18 - -0,003 -0,28 - -0,01
63
béta
-0,19 0,05 -0,36 -0,09 -0,18 -0,19
p
0,034 0,602 <0,001 0,327 0,045 0,038
A proteinuria fellépésének ideje, a gesztációs kor, születési súly, eclampsia és HELLP syndroma nem mutatott összefüggést egyik vizsgált polimorfizmus hordozásával sem. 5.1.3 Az ER-α PvuII polimorfizmus perinatális kórképekben A vizsgált allélokra vonatkozóan teljesült a Hardy-Weinberg egyensúly. Nem találtunk különbséget a genotípus eloszlásban a koraszülött (PP/Pp/pp genotípus: 30/69/42) és egészséges újszülött csoportok (PP/Pp/pp genotípus: 42/75/50) között (14. táblázat). Lányok esetében nem volt összefüggés a perinatális szövődmények kockázata és az ERα PvuII polimorfizmus hordozása között. Fiúkban az ER-α PvuII polimorfizmus „p” allélját hordozók között a NEC (OR [95% CI]: 0,24 [0,07-0,83]) és a PDA (OR [95% CI]: 0,24 [0,05-0,97]) előfordulása ritkább volt. A „p” allélt hordozó fiúkban az oxigénpótlás iránti igény mintegy 34 órával volt rövidebb (többszörös regressziós analízis, béta = -0,35 p=0,0018). Az IVH vonatkozásában a „pp” genotípus azonban fokozta a kockázatot (OR [95% CI]: 4,39 [1,15-16,82]), ugyancsak fiú populációban. 14. táblázat: Klinikai jellemzők és ER-α PvuII polimorfizmus genotípus eloszlása (IRDS- respiratiós distressz syndroma, PDA- ductus Botalli persistens, ARF-akut veseelégtelenség, NEC enterocolitis necrotisans, IVH- intraventricularis hemorrhagia, *p<0,05 )
Kis súlyú koraszülöttek Lányok (n=72) Fiúk (n=69) gesztációs kor, középérték [tartomány]:
IRDS PDA (5. napon) Systemás hypotensio (1. héten) Sepsis (1. héten) ARF NEC (1-3 stádium) IVH (1-4 stádium)
gesztációs kor ,középérték [tartomány]:
29 hét [24-36]
29 hét [24-36]
születési súly, középérték [tartomány]:
születési súly, középérték [tartomány]:
1200 gramm [640-1500] szövődmény szövődmény van nincs (n, [PP/Pp/pp]) (n, [PP/Pp/pp]) 33 [9/13/11] 36 [9/16/11] 23 [3/11/9]* 46 [15/18/13] 17 [5/9/3] 52 [13/20/19]
1180 gramm [510-1500] szövődmény szövődmény van nincs (n, [PP/Pp/pp]) (n,[PP/Pp/pp]) 40 [6/25/9] 32 [6/15/11] 27 [5/16/6] 45 [7/24/14] 27 [4/16/7] 45 [8/24/13]
18 [5/9/4] 20 [4/10/6] 22 [10/7/5]*
51 [13/20/18] 49 [14/19/16] 47 [8/22/17]
23 [5/13/5] 19 [3/11/5] 25 [2/18/5]
49 [7/27/15] 53 [9/29/15] 47 [10/22/15]
26 [9/12/5]*
43 [9/17/17]
23 [5/13/5]
49 [7/27/15]
64
ROP-os populáció esetén nem találtunk kapcsolatot a genotípus és a szövődmény kockázata között sem lányoknál, sem fiúknál (15. táblázat). 15. Táblázat: ER-α PvuII polimorfizmus genotípus eloszlás (ER-α: ösztrogén receptor-α, ROP: koraszülöttek retinopáthiája) Krioterápiával/fotokoagulációval Krioterápiával/fotokoagulációval kezelt ROP-os, nem kezelt ROP-os kissúlyú koraszülöttek kissúlyú koraszülöttek
Esetszám ER-α PvuII PP/Pp/pp
105 0,18 /0,45 / 0,37 (0,41)
115 0,21 / 0,52 / 0,27 (0,47)
(mutáns allél frekvencia)
5.1.4 Az ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus praeeclampsiában Az ER-α PvuII és XbaI polimorfizmusok genotípus eloszlásai Hardy-Weinberg egyensúlyban voltak. Nem volt különbség a genotípus eloszlásban a vizsgált csoportok között (16. táblázat). Ha azonban a genotípusok együttes hordozását vizsgáltuk, akkor a „PP”/ „XX” genotípus kombináció gyakrabban fordult elő a praeeclampsiás csoportban a kontroll csoporttal összehasonlítva (24,4% vs. 9,7%, p=0,003) (17. táblázat). A „PP”/„Xx” kombináció viszont ritkábban fordult elő a praeeclampsiás csoportban (5,0% vs. 18,5%, p=0,002). A haplotípus analízis kimutatta, hogy a homozigóta P-X haplotípus függetlenül az egyéb kockázati tényezőktől növeli a praeeclampsiára való kockázatot (OR [95% CI]: 4,36 [1,65-11,53], 18. táblázat). Kimutattuk azt is, hogy a praeeclampsiás csoportban a „xx” genotípus mellett kisebb a magzati retardáció kockázata (OR [95% CI]: 0,23 [0,07-0,73]) (19. táblázat). 16. táblázat ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus genotípus eloszlásai
Esetszám ER-α PvuII PP / Pp / pp (mutáns allél prevalenciája) ER-α XbaI XX / Xx / xx (mutáns allél prevalenciája)
Preeclampsiás, terhes nők 119 0,31 / 0,47 / 0,22 (0,45) 0,32 / 0,52 / 0,16 (0,42)
65
Egészséges terhes nők 103 0,31 / 0,51 / 0,18 (0,43) 0,24 / 0,62 / 0,14 (0,45)
17. táblázat ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus genotípus kombinációi (ER-α: ösztrogén receptor-α, *p=0,003, OR [95% CI]: 4,36 [1,65-11,53], ** p=0,002, OR [95% CI]: 0,17 [0,06-0,53])
Esetszám Genotípus kombináció PP / XX PP / Xx PP / xx Pp / XX Pp / Xx Pp / xx pp / XX pp / Xx pp / xx
Súlyos preeclampsiás Egészséges terhes terhes nők nők 119 103 N (%) 29 (24,4) * 10 ( 9,7) 6 ( 5,0) ** 19 (18,4) 2 ( 1,7) 3 ( 2,9) 8 ( 6,7) 12 (11,7) 48 (40,3) 36 (35,0) 0 ( 0,0) 5 ( 4,9) 1 ( 0,8) 3 ( 2,9) 8 ( 6,7) 9 ( 8,7) 17 (14,4) 6 ( 5,8)
18. táblázat ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus P-X haplotípus hordozók és nem hordozók (ER-α: ösztrogén receptor-α, * p=0,03, OR [95% CI]: 5,64 [1,83-17,38])
Esetszám Homozigóta P-X hordozók Heterozigóta P-X hordozók Nem hordozók
Súlyos preeclampsiás terhes nők 119 29 (24,4%) * 62 (52,1%) 28 (23,5%)
Egészséges terhes nők 103 10 ( 9,7%) 67 (65,1%) 26 (25,2%)
19. táblázat ER-α XbaI polimorfizmus genotípus eloszlása magzati retardációval és nélküle szövődött praeeclampsiában (ER-α: ösztrogén receptor-α, *p=0,011, OR [95% CI]: 0,23 [0,07-0,73])
Esetszám ER-α XbaI XX genotípus ER-α XbaI Xx genotípus ER-α XbaI xx genotípus
Praeeclampsia magzati retardáció nélkül 61 15 (24.6%) 31 (50.8%) 15 (24.6%)
66
Praeeclampsia magzati retardációval 58 23 (39.7%) 31 (53.4%) 4* (6.9%)
5.2 Funkcionális vizsgálatok 5.2.1 Pentoxifillin immunmoduláns hatásainak vizsgálata A nem szelektív foszfodiészteráz gátló pentoxifillinnek nem volt hatása a neutrofil granulociták és monociták CD11b, L-szelektin denzitására (20. táblázat), fagocita és reaktív oxigéntermelő képességére (burst képesség) (21. táblázat). 20. táblázat: PTXf hatása a neutrofil granulociták és monociták aktiválhatóságára (Ne: neutrofil granulocita, Mo: monocita, PTXf: pentoxifillin, fMLP: N-formyl-MetLeuPhe, MIF-átlagos fluoreszcens intezitás, M: mól) 10-5 M fMLP stimulációval
Stimuláció nélkül
PTXf in vitro dózisa (mg/ml)
CD11b denzitás (MIF/esetszám) középérték [tartomány]
L-szelektin denzitás (MIF/esetszám) középérték [tartomány]
0
20
200
2000
0
20
200
2000
Ne
28,8 [19,548,0]
27,1 [15,756,8]
25,0 [19,260,5]
22,5 [14,763,0]
83,0 [63,794,6]
83,5 [78,2111,6]
73,2 [65,1108,3]
69,8 [48,7122,5]
Mo
162,1 [102,7385,6]
250,5 [91,1266,9]
163,7 [93,3259-2]
104,8 [99,5212,2]
189,3 [135,9325,2]
284,4 [147,1303,8]
174,7 [107,9255,9]
169,5 [135,3325,2]
Ne
35,6 [26,154,9]
40,4 [24,657,7]
41,2 [28,757,0]
37,4 [24,255,9]
3,5 [1,94,5]
2,6 [2,4-4,8]
3,2 [2,34,2]
3,7 [2,83,9]
Mo
74,3 [67,2230,9]
90,7 [56,8232,5]
88,9 [43,8195,5]
83,2 [54,1139,3]
28,0 [12,874,4]
32,5 [18,742,4]
27,0 [25,745,0]
23,6 [18,474,4]
21. táblázat: PTXf hatása neutrofil granulociták és monociták fagocita és burst funkciójára (Ne-neutrofil granulocita, Mo-monocita, MIF-átlagos fluoreszcens intezitás, PTXf: pentoxifillin) PTXf in vitro dózisa (mg/ml)
Burst képesség (MIF/esetszám) középérték [tartomány] Fagocita képesség (MIF/esetszám) középérték [tartomány]
Ne Mo Ne Mo
0 94,2 [90,8-95,8] 83,2 [73,4-90,9] 61,0 [59,4-70,6] 51,4 [47,9-56]
67
20 92,4 [92,1-94,1] 75,6 [74,7-84,9] 66,3 [63,0-73,3] 60,8 [53,4-68,7]
200 92,8 [90,5-96,8] 82,3 [61,3-89,0] 76,7 [69,8-84,5] 68,0 [60,8-75,4]
2000 90,7 [90,2-96,3] 73,0 [67,1-90,0] 79,7 [76,4-83,7] 73,3 [77,8-79,3]
5.2.2 17β-ösztradiol immunmoduláns hatásainak vizsgálata A 17β-ösztradiolnak nem volt hatása a neutrofil granulociták és monociták CD11b, Lszelektin denzitására (22. táblázat), fagocita és reaktív oxigéntermelő képességére (burst képesség) (23. táblázat). 22. táblázat: 17β-ösztradiol aktiválhatóságára
hatása
a
neutrofil
granulociták
és
monociták
(Ne: neutrofil granulocita, Mo: monocita, MIF: átlagos fluoreszcens intezitás, fMLP: N-formylMetLeuPhe, M: mól) 10-5 M fMLP stimulációval
Stimuláció nélkül
Ösztradiol in vitro dózisa 0
10-10 M
10-8 M
10-7 M
0
10-10 M
10-8 M
10-7 M
CD11b denzitás (MIF/esetszám) középérték [tartomány]
Ne
6,5 [5,411,7]
5,8 [4,912,8]
7,2 [4,713,4]
6,0 [3,011,0]
12,6 [10,213,8]
11,6 [3,214,7]
10,6 [6,014,4]
11,1 [9,614,6]
Mo
12,7 [9,113,4]
11,9 [7,714,3]
12,8 [8,219,0]
10,4 [7,714,6]
16,0 [14,217,9]
16,1 [14,118,3]
15,4 [9,719,0]
13,7 [12,717,6]
L-szelektin denzitás (MIF/esetszám) középérték [tartomány]
Ne
2,6 [1,82,8]
2,6 [1,52,7]
2,1 [1,52,7]
2,0 [1,62,7]
2,2 [1,63,7]
2,2 [1,63,5]
2,6 [1,53,2]
2,3 [1,63,1]
Mo
39,9 [10,375,4]
35,2 [10,647,3]
20,0 [12,220,5]
32,6 [15,663,8]
10,9 [8,214,0]
9,5 [7,714,1]
11,8 [8,919,3]
8,8 [7,123,9]
23. táblázat: 17β-ösztradiol hatása neutrofil granulociták és monociták fagocita és burst funkciójára (Ne-neutrofil granulocita, Mo-monocita, MIF-átlagos fluoreszcens intezitás, M: mól) 17β-ösztradiol in vitro dózisa Burst képesség (MIF/esetszám) középérték [tartomány] Fagocita képesség (MIF/esetszám) középérték [tartomány]
Ne Mo Ne Mo
0 12,3 [11,5-16,8] 15,9 [11,0-16,7] 12,4 [10,9-21,7] 17,1 [14,0-21,3]
68
10-10 M 12,9 [11,2-15,2] 15,9 [11,6-17,1] 14,6 [12,1-19,6] 15,5 [13,5-28,7]
10-8 M 12,8 [12,2-14,2] 15,9 [12,1-16,9] 14,3 [11,7-20,4] 14,8 [11,3-17,2]
10-7 M 13,1 [12,2-13,8] 15,9 [13,0-18,7] 14,8 [12,5-24,2] 14,6 [13,0-21,1]
5.2.3 Kapcsolat vizsgálata a polimorfizmus és funkció között Az általunk vizsgált egészséges populációban a P-szelektin Thr715Pro és L-szelektin Pro213Ser polimorfizmusok megoszlása a 24. táblázatban található. 24. táblázat: A vizsgált polimorfizmusok genotípus eloszlása P-szelektin L-szelektin Thr715Pro polimorfizmus Pro213Ser polimorfizmus Esetszám 54 54 Genotípus ThrThr ThrPro ProPro ProPro ProSer SerSer N (%) 44 (81) 9 (17) 1 (2) 40 (74) 13 (24) 1 (2) Nem volt összefüggés sem a P-szelektin Thr715Pro polimorfizmus és a trombocita Pszelektin expresszió, sem pedig az L-szelektin Pro213Ser polimorfizmus és a neutrofil granulocita és monocita L-szelektin expressziója között stimuláció nélkül vagy azt követően sem (25. táblázat). 25. táblázat: A vizsgált polimorfizmusok hatása a neutrofil granulociták, monociták és trombociták aktiválhatóságára (MIF-átlagos fluoreszcens intezitás, M: mól, ADP: adenozin difoszfát, fMLP: N-formyl-MetLeuPhe)
(MIF/esetszám) középérték[tartomány] Trombocita P-szelektin denzitás stimuláció nélkül Trombocita P-szelektin denzitás 10μM ADP stimulációra Neutrofil L-szelektin denzitás stimuláció nélkül Neutrofil L-szelektin denzitás 10-5M fMLP stimulációra Monocita L-szelektin denzitás stimuláció nélkül Monocita L-szelektin denzitás 10-5M fMLP stimulációra
P-szelektin Thr715Pro polimorfizmus
L-szelektin Pro213Ser polimorfizmus
ThrThr
ThrPro
ProPro
ProPro
ProSer
SerSer
3,2 [0,9-124,6]
2,8 [1,4-7,0]
6,4
2,8 [0,9-26,9]
4,3 [1,3-124,6]
19,1
9,0 [0,7-19,4]
10,9 [1,4-14,3]
12,6
9,0 [0,7-19,4]
10,3 [1,717,3]
14,3
2,0 [1,2-4,3]
1,7 [1,4-2,6]
1,4
1,9 [1,2-4,3]
2,0 [1,2-3,4]
2,0
1,7 [0,7-8,8]
1,4 [1,1-3,6]
1,4
1,5 [0,7-16,3]
1,7 [1,0-6,2]
1,1
18,8 [2,3-309,3]
19,6 [7,3-67,5]
4,4
19,9 [2,3-309,3]
13,1 [4,0-97,7]
18,4
27,6 [4,3-361,4]
34,2 [2,3-79,3]
12,4
31,9 [2,3-361,4]
20,9 [4,3-111,1]
20,3
69
6. MEGBESZÉLÉS 6.1 Genetikai polimorfizmus vizsgálatok 6.1.1 A szelektin polimorfizmusok és koraszülöttség, perinatális morbiditás kapcsolata A szelektin expresszió mértékére és a szolubilis szelektin szintekre irodalmi adatok szerint a gyulladásos stimulus mellett genetikai polimorfizmusok is hatással vannak. A megváltozott szelektin szintek állhatnak annak a hátterében, hogy a szelektinpolimorfizmusok hordozása és egyes betegségek között kapcsolatot mutattak ki. Az Eszelektin Ser128Arg polimorfizmus mutáns allél hordozása befolyásolja a leukocitaendotélsejt kapcsolat erősségét (131, 133), fokozza a koagulációs hajlamot (155) és az atherosclerotikus érbetegség súlyosságát (156). A P-szelektin gén Thr715Pro polimorfizmus mutáns alléljának hordozása csökkent szérum szolubilis szelektin szintekkel (136) és a myocardialis infarctus rizikójának csökkenésével jár (137). Az L-szelektin Pro213Ser polimorfizmusa a rövid, ismétlődő konszenzus 1-es domén szakaszt érinti. A polimorfizmus pontos funkcionális hatása ismeretlen. Kapcsolatba hozták diabeteses nephropathiával és a fehérvérsejt - endotélsejt interakció erősségével (138, 157). Számos adat támasztja alá az adhéziós molekulák jelentőségét terhességben. A placentában az adhéziós molekulák, így az E-, P- és L-szelektin expressziója igen magas. A megfelelő expresszió elengedhetetlen az implantációhoz és a placenta fejlődéséhez (36). L-szelektin hiányában a citotrofoblaszt invázió zavart szenved, terhesség nem jön létre (38). Szövődményes terhességekben is leírták az L-szelektin szintek eltérését (37). Különösen sokat vizsgálták a praeeclampsiát is, melyben az Lszelektin szint eltérés mellett magasabb szolubilis E- és P-szelektin szinteket mértek (158, 159). Felvetettük, hogy a szelektin-expressziót meghatározó genetikai polimorfizmusok összefügghetnek a koraszülöttség kockázatával. Ezt a hipotézist az E- és P-szelektin polimorfizmusok vonatkozásában nem tudtuk igazolni.
70
A mutáns L-szelektin allél hordozás azonban a koraszülött populációban gyakrabban fordult elő, tehát hordozása rizikótényezőnek tekinthető. Ezt az összefüggést először mutattuk ki az irodalomban. A vizsgálat korlátai közé tartozik, hogy az anyai genotípusok a vizsgálat retrospektív jellege miatt nem ismertek. Az újszülött genotípusa szoros összefüggést mutat a szülőkével (az allélok felét az apától, másik felét az anyától kapja a gyermek), így lehet, hogy a gyermek esetében a koraszülöttséggel kapcsolatban kimutatott összefüggés virtuális és inkább az anya / apa genotípusa a felelős. Ennnek igazolására további, a szülők genotipizálását is elvégző vizsgálatokra van szükség. Nem volt kapcsolat a polimorfizmus hordozás és a koraszülöttség oka között; lehet, hogy ennek a kis esetszám az oka. Érdemesnek tartottuk ezért az egyik legfontosabb anyai szövődmény, a praeeclampsia esetében külön is vizsgálni a szelektinek jelentőségét (lásd. 6.1.2 részt). A szelektinek irodalmi adatok alapján fontos szerepet játszanak az olyan perinatális komplikációkban, mint a korai postnatalis sepsis és a BPD. Koraszülöttek köldökzsinórvéna endotél sejtjein csökkent P-szelektin expressziót találtak. Ez egyéb tényezők mellett hozzájárulhat a csökkent neutrofil granulocita extravazációhoz és a különféle infekciók iránti megnövekedett fogékonysághoz (39). Buhrer és mtsai. akut bakteriális infekcióban szenvedő újszülötteknél a köldökzsinórvér granulocitáinak és monocitáinak csökkent L-szelektin expresszióját találták (40). Ezekkel a megfigyelésekkel szemben mi nem találtunk összefüggést a vizsgált polimorfizmusok és a korai postnatális sepsis között. A szelektinek a tüdőt érintő gyulladásos folyamatokban (BPD) is fontos szerepet játszanak. A neutrofil sejtek alveolusokba történő vándorlása több lépésben megvalósuló folyamat. Ennek első lépése a szelektinek által kialakított laza kapcsolat. A köldökzsinór- és perifériás vérben mért magasabb szolubilis E-szelektin szintek (41, 42), valamint a csökkent plazma L-szelektin szintek (44, 45) prediktív értékűnek bizonyultak a BPD szempontjából. A dexamethazon kezelés részben az L-szelektin expresszióra kifejtett hatásán keresztül is befolyásolhatja a BPD lefolyását (46). Mindezek alapján felvetettük, hogy a szelektinek esetében a kapcsolat erősségét befolyásoló funkcionális polimorfizmusoknak szerepe lehet a BPD patogenezisében. Betegeinknél nem találtunk összefüggést az E- és P-szelektin polmorfizmusok és a BPD
71
kockázata között, azonban az L-szelektin mutáns allél hordozása összefüggést mutatott a BPD-vel. Vizsgálatunkban tehát az L-szelektin polimorfizmus hordozás a koraszülöttségre és a BPD-re egyaránt hajlamosított. 6.1.2 A szelektin polimorfizmusok és praeeclampsia kapcsolata A praeeclampsia az anyai és magzati morbiditás és mortalitás egyik fő kockázati tényezője, pontos patomechanizmusa máig nem ismert. Kialakulása szempontjából rizikófaktor az anya életkora, a nulliparitás, az obesitas stb (153). A gyulladásos teória szerint a terhességre bekövetkező fokozott immunválasz fontos szerepet játszik a praeeclampsia kialakulásában. A szelektinek – elsősorban az E és P szelektin – szerepét számos irodalmi adat támasztja alá. Megnövekedett szolubilis E- és P-szelektin szintek és
trombocita
P-szelektin
expresszió
található
praeeclampsiával
szövődött
terhességekben (78-84). A praeeclempsia esetében ismert az egyéni hajlam; ennek szerepét a közelmúltban egy másik vizsgálat kapcsán mi is igazoltuk (160). Eset-kontroll vizsgálatunkban összesen 683 súlyos praeeclampsiás és kontroll terhes nő megkérdezése kapcsán kiderült, hogy a súlyos praeeclampsiás nők familiáris anamnézisében gyakrabban fordult elő korai előfordulású cardiovascularis szövődmény. Ez a jelenség tehát a súlyos praeeclampsia rizikójának tekinthető. Az egyéni hajlam jelentősége miatt intenzíven vizsgálják a genetikai polimorfizmusok hordozását ebben a betegségben is. Számos polimorfizmust hoztak összefüggésbe a praeeclampsia rizikójával. Korábban egy kutatás foglalkozott szelektin polimorfizmussal praeeclampsiában. Freeman és mtsai. (161) az általunk is vizsgált E-szelektin polimorfizmus szerepét elemezte praeeclampsiában. A kisebb betegcsoportban (n = 42) nem találtak összefüggést az E-szelektin Ser128Arg polimorfizmusa és a praeeclampsia rizikója között. Mi egy nagyobb esetszámú, jobban karakterizált, súlyos preeclampsiás populációban határoztuk meg ennek és egy P-szelektin polimorfizmusnak a hordozását. A P-szelektin Thr715Pro polimorfizmus hordozása az irodalmi adatok szerint csökkent szolubilis P-szelektin szinttel és csökkent myocardialis infarctus rizikóval jár. Érdekes módon a polimorfizmus hordozása nem védett a praeeclampsiával szemben, sőt, a
72
hipertónia fellépése átlagosan mintegy 2 héttel korábban következett be, azaz úgy tűnik, hogy a polimorfizmus fokozza a betegség súlyosságát. A
látszólagos
ellentmondás
oka
lehet
a
szolubilis
P-szelektin
gyulladásos
folyamatokban betöltött kettős szerepe. A szolubilis P-szelektin amellett, hogy a trombocita és endotélsejt aktiváció markere és szintje számos kórképben emelkedik, gyulladásgátló tulajdonsággal is rendelkezik. A szolubilis forma, akárcsak a membránhoz kötött típus, képes ligandjához, a P-szelektin glikoprotein ligand-1-hez (PSGL-1)
kötődni.
Ezáltal
a
szolubilis
P-szelektin
mintegy
“versenyez”
a
membránkötött P-szelektinnel az előbb említett ligandért (162). Ha a szolubilis forma szintje emelkedik, akkor a PSGL-1 lefedésével csökken a P-szelektin-PSGL-1 kapcsolaton keresztül megvalósuló fehérvérsejt-endotélsejt kapcsolat kialakulásának valószínűsége. Talán a 715Pro P-szelektin allél hordozás, ami az anti-inflammatorikus szolubilis P-szelektin szintet csökkenti, így közvetve proinflammatorikus hatású. Ezt a teóriát a szolubilis P-szelektin szintek monitorozása alapján lehetne igazolni, erre azonban a vizsgálat retrospektív jellege miatt nem volt lehetőség. A kérdés megválaszolása további funkcionális vizsgálatokat igényelne. Eredményeink hátterében az is állhat, hogy a P-szelektin génje közel helyezkedik el az V. faktoréhoz. Egy nemrégiben megjelent meta-analízis a Leiden mutáció szerepét bizonyította praeeclampsiában (163). Az általunk vizsgált P-szelektin gén az V. faktor génjével szoros közelségben van, így nem kizárható, hogy az összefüggés más kapcsolt gén, például az V. faktor zavart működésének (Leiden-mutáció) köszönhető és független a szolubilis P-szelektin szintektől. 6.1.3 Az ER-alfa PvuII polimorfizmus és perinatális morbiditás A vizsgált polimorfizmusnak igen sok kórképben vizsgálták jelentőségét. Számos irodalmi adat a „p” allél, illetve a „pp” genotípus fokozott ösztrogén hatását bizonyítja. Liu és mtsai. (164) a „pp” genotípussal bíró egyénekben magasabb csontásványianyag- tartalmat mért. Wang és mtsai. (165) a „p” allél, Salmen és mtsai. (166) a „pp” genotípus protektív szerepét írta le a csonttömeg csökkenéssel szemben. Stavrou és mtsai. (167) azt találták, hogy a „PP” genotípussal bíró egyénekben a menarche később következett be. Kitawaki és mtsai. (168) leírták, hogy különféle
73
ösztrogén-dependens
kórállapotok,
mint
az
endometriosis,
adenomyosis,
leiomyomatosis „PP” genotípusúakban ritkábban fordul elő. Más irodalmi adatok viszont a „p” allél és „pp” genotípus relatív ösztrogén „érzéketlenségét” támasztják alá. Ho és mtsai. (169) a „PP” genotípussal rendelkező pre- és posztmenopauzális egyénekben magasabb csontásványianyag-denzitást találtak. Salmen és mtsai. egy további vizsgálatukban a posztmenopauzális hormonpótlásban részesülő „pp” genotípussal rendelkező nőkben a törések rizikójának emelkedését találták. Ezt a „pp” genotípus, relatív hormon-inszenzitivitást okozó hatásával magyarázták. Az irodalmi adatok, tehát igen ellentmondásosak. A bizonytalanságok ellenére mégis ez az a polimorfizmus, amit a leggyakrabban vizsgálnak, illetve amivel kapcsolatban felmerült, hogy az ösztrogén hatását befolyásolhatja. Koraszülés esetén az ösztrogénszintek idő előtti csökkenése hozzájárulhat a különféle perinatális szövődmények kialakulásához, mely az ösztrogénnek az immunfolyamatokra kifejtett hatásaival magyarázható. Statisztikai adatok azt mutatják, hogy a fiú koraszülöttek mortalitása, morbiditása magasabb, mint a leány koraszülötteké (170). Ennek hátterében a szexuálszteroidok szintjében megmutatkozó különbségek állhatnak (171, 172). Vizsgálatunkban az ER-α PvuII polimorfizmusa csak fiúkban mutatott összefüggést a különféle perinatális szövődményekkel. Ez arra utal, hogy az ösztrogén hatáserősségét befolyásoló polimorfizmus csak az alacsonyabb ösztrogénszintekkel bíró fiú koraszülöttekben nyilvánul meg klinikailag jelentős mértékben. Potenciálisan ez magyarázattal szolgálhat a perinatális kórképek nemtől függő megjelenésére. Kimutattuk, hogy a heterozigóta hordozók a leginkább védettek a perinatális morbiditással szemben. Bár e kórképeknél az ösztrogén kóroki szerepét nem tisztázták, illetve csak egy klinikai megfigyelés utal arra, hogy az ösztrogénpótlás megelőzi a kialakulásukat, az ösztrogén szerepe – különösen a nemi különbségek ismeretében – nem zárható ki. Mivel az eddigi vizsgálatok a „pp” illetve a „PP” genotípusokat hozták kapcsolatba a megváltozott ösztrogén-érzékenységgel, ezért eredményeink esetleg arra utalnak, hogy „pP” genotípus esetén lehet a legkiegyenlítettebb az ösztrogén hatása. Természetesen ez csak hipotézis, melyet funkcionális vizsgálatokkal kell igazolni.
74
A ROP a gyermekkori látáscsökkenés és vakság vezető oka a fejlett országokban. Prevalenciája az intenzív ellátás fejlődésével egyre növekszik. Az igen kis súlyú koraszülöttek mintegy 50%-a mutatja a ROP valamilyen tünetét és 10%-uk már kezelést igénylő ROP-ban szenved. A számos kóroki tényező közül az éretlenség, illetve oxigéntoxicitás az egyik legfontosabb, de az egyéni hajlam is fontos szerepet játszik a betegségben. Számos genetikai polimorfizmust hoztak kapcsolatba a betegség kialakulásával. Állatkísérletes
vizsgálatok
eredményei
alapján
a
ROP
kialakulásában
az
ösztrogénhiány is szerepet játszik. Ösztrogén receptor-α számos szövetben jelen van, többek között megtalálható a retina erein is (173). Állatkísérletekben az ösztrogén hyperoxiában
növelte,
normoxiában
és
hypoxiában
pedig
csökkentette
a
neovaszkularizációt serkentő VEGF expresszióját (99). Az ösztrogénkezelt hypoxiás egerekben csökkent a retinopathia kockázata. Az ösztrogén jelentősége miatt vizsgáltuk az ER-α PvuII polimorfizmust ROP-ban. Eredményeink azt mutatják, hogy ez nem függ össze a ROP rizikójával, legalábbis az általunk vizsgált betegek esetében. Mivel az ösztrogén-genotípus nemtől függő hatást mutatott a koraszülöttek egyéb morbiditásaival kapcsolatban, illetve a fiúk hajlamosabbak ROP-ra, felvetődik, hogy fiúkban van-e összefüggés a szövődmény és a polimorfizmus között. A vizsgálatban szereplő 72 ROP-os fiú közül IV-V-s stádiumú ROP-ban csak 14-en szenvedtek; ez a kis betegszám, pedig nem teszi lehetővé az ER-α PvuII polimorfizmus és az igen súlyos ROP közti kapcsolat vizsgálatát fiú alpopulációban. 6.1.4 Az ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus és praeeclampsia Több vizsgálat foglalkozott az ösztrogén receptor egyes polimorfizmusainak vizsgálatával praeeclampsiában. Malamitssi-Puchner és mtsai. (174) nem találtak összefüggést az általuk vizsgált ER-α 1-es és 2-es exonjában található polimorfizmus és a praeeclampsia között. Tempfer és mtsai. (175) több polimorfizmust vizsgáltak praeeclampsiában. Az V-ös faktor Leiden mutáció, a NOS 3 T768C, a NOS 3 Glu298Asp és az ER-α PvuII polimorfizmusainak kombinációja összefüggést mutatott a praeeclampsiával. Maruyama és mtsai. (176) az ER-β egy polimorfizmusát (rs928554) vizsgálták praeeclampsiában. A praeeclampsiás csoporton belül összefüggést azokban
75
tudtak kimutatni, akiknek familiaris anamnézise a cardiovascularis megbetegedésekre pozitív volt. Vizsgálatunkban azt találtuk, hogy a PvuII és XbaI polimorfizmus „P-X” haplotípus hordozása a súlyos praeeclampsia rizikóját fokozza. Az XbaI polimorfizmus „xx” genotípusa pedig a magzati retardáció rizikóját csökkenti súlyos praeeclampsiásokban. Az intronikus polimorfizmusok fenotípusbeli hatásukat többféle mechanizmuson keresztül
valósíthatják
meg.
Fokozhatják,
vagy
csökkenthetik
a
génátírást,
befolyásolhatják az RNS splicing-ját. A PvuII polimorfizmus a B-myb transzkripciós faktor kötöhelyén található, mely a génátírást fokozza. A „P” allél esetén a transzkripciós faktor kötése zavart szenved, ezáltal csökken a génátírás sebessége, azaz az ER-α expressziója. Ez relatív ösztrogén hiányt okoz. Az XbaI polimorfizmus pontos funkcionális jelentősége nem ismert, de a vizsgálati csoportban összefüggést mutatott a magzati retardációval és kombinációban a PvuII polimorfizmussal a súlyos praeeclampsia rizikóját befolyásolta. Az ösztrogéneknek számos érrendszeri hatása van. Gyors, nongenomikus és lassabb, genomikus hatással vasodilatációt (177) okoznak, fokozzák az endotélsejtek osztódását (178) érsérülés után. Feltételeztük, hogy a polimorfizmussal együtt járó relatív ösztrogén deficit vasoconstrictióhoz vezet a szisztémás és uteroplacentáris keringésben és így közvetve a polimorfizmus hatással lehet a praeeclampsia és magzati retardáció kockázatára. Érdekes módon egy korábbi vizsgálatban szintén a PvuII és XbaI polimorfizmusok „PX” haplotípusa mutatott összefüggést a myocardialis infarctussal és ischaemias szívbetegséggel postmenopausás nőkben (179). A praeeclampsiának és cardiovascularis betegségeknek, pedig több, közös rizikófaktora van, úgymint a túlsúly, hiperlipidaemia, megnövekedett inzulin rezisztencia (180). Patomechanizmusukban is több közös tényező lelhető fel: oxidatív stressz, endoteliális sérülés, gyulladás. Ismert, hogy a családi
anamnézisben
előforduló
szív-érrendszeri
megbetegedések
növelik
a
praeeclampsiára való hajlamot és maga a praeeclampsia is rizikótényező a későbbi cardiovascularis megbetegedések szempontjából.
76
6.2 Funkcionális vizsgálatokkal kapcsolatos megbeszélés In vitro vizsgáltuk, hogy a pentoxifillin és 17-β-ösztradiol szuboptimális, terápiás és a terápiást többszörösen meghaladó dózisban befolyásolja-e a neutrofil granulociták és monociták CD11b és L-szelektin expresszióját, reaktív oxigéngyök és fagocita funkcióját, illetve a trombocita P-szelektin expresszióját. Részben azért ezeket a funkciókat vizsgáltuk, mert az irodalmi adatok, ill. saját genetikai polimorfizmusméréseink felvetették, hogy ezek fontos szerepet játszhatnak a perinatális gyulladásos szövődményekben. A pentoxifillint már adják a perinatológiai gyakorlatban, a terápiásan adott ösztrogén esetében pedig Trotter és mtsai. mutattak ki fontos immunmoduláns hatást koraszülötteknél.(lásd. 2.4.2.2 részt). 6.2.1 – 6.2.2 A nem szelektív PDE gátló pentoxifillin és 17-β-ösztradiol immunmoduláns hatásainak összefüggései Az irodalomban a PDE gátló PTXf és 17-β-ösztradiol immunmoduláns hatásaira vonatkozó adatok ellentmondásosak (26. táblázat). Dunzendorfer és mtsai. vizsgálatában a PTXf-nek nem volt hatása a spontán ill. fMLP stimuláció melletti reaktív oxigéngyök termelésre neutrofil granulocitákban (181). Chang és mtsai. azt tapasztálták, hogy a PTXf előkezelés fokozta a PMA (phorbol-12 mirisztát-13 acetát) stimulált reaktív oxigéngyök termelést a mononukleáris sejtekben, azonban ezt a hatást neutrofil granulocitákban nem tudták kimutatni (182). Mások in vivo alkalmazott PTXf hatását tanulmányozták és kimutatták, hogy a PTXf csökkenti a neutrofil granulociták reaktív oxigéngyök termelését (183). További vizsgálatok a PTXf dózis-dependens
hatásáról
számolnak
be.
Felnőttek
és
újszülöttek
neutrofil
granulocitáinak reaktív oxigéngyök termelése alacsonyabb PTXf koncentráció mellett emelkedett, magasabb koncentráció mellett csökkent (184). Az utóbbi alapján a PTXf, mint immunmoduláns szer egyaránt alkalmazható lehetne a károsodott neutrofil funkció helyreállítására, valamint túlzott aktivitás esetén annak gátlására. Egy nemrég publikált metaanalízis eredménye szerint neonatális sepsisben alkalmazott PTXf a teljes mortalitást csökkentette (185).
77
Az eltérő eredményekre a vizsgált populációk közötti eltérések, az alkalmazott dózis és stimuláló ágens, valamint a kiváltott hatás vizsgálatára alkalmazott módszer különbözősége adhat magyarázatot. Az irodalomban fellelhető vizsgálatok legtöbbször mindössze egy-egy hatást vizsgálnak. Mi szimultán módon több hatást, kétféle sejttípuson vizsgáltunk, több PTXf dózis mellett. Érdekes módon in vitro egyik sejtfunkció esetében sem tudtunk, egyik sejttípuson sem hatást kimutatni, annak ellenére, hogy a PTXf hatását elsősorban poszttranszlációs szinten, a cAMP szint emelése révén fejti ki. Ennek oka egyelőre nem ismert. 26. táblázat: PTXf és 17β-ösztradiol hatása a fagocita funkcióra, oxigéngyök termelő képességre, CD11b és L-szelektin expresszióra az irodalmi adatok alapján (expr.: expresszió)
CD11b expr. L-szelektin expr.
Fagocita aktivitás Neutrofil granulocita
Pentoxifillin
Ösztradiol
2,0 mmol/L csökkenti(186) csökkenti (187) -
-
0,001 mg/ml fokozza (189) 0,001-0,1 mg/ml nincs hatása 0,1-1,0 mg/ml csökkenti dózis dependens módon csökkenti (108) 0,1 mg/ml fokozza 2,0 mg/ml csökkenti (184) 0,001 mg/ml fokozza 0,001-0,1 mg/ml nincs hatása 0,1-1 mg/ml csökkenti (186)
Burst aktivitás
CD11b expr. L-szelektin expr. Fagocita aktivitás Monocita Burst aktivitás
in vivo fokozza (az aktiválhatóságot csökkenti) (188) állatkísérletben csökkenti (190)
dózis dependens módon csökkenti (187) 0,1 mg/ml fokozza 2,0 mg/ml csökkenti (184) csökkenti (194) csökkenti (187) 0,001 mg/ml fokozza 0,001-0,1 mg/ml nincs hatása 0,1-1,0 mg/ml csökkenti (186) dózis dependens módon csökkenti (187) 0,001 mg/ml fokozza 0,001-0,1 mg/ml nincs hatása 0,1-1,0 mg/ml csökkenti (186) dózis dependens módon csökkenti (187)
78
csökken (hosszú hatás) (191)
fokozza (193) nincs hatása széles konc. tarományban (193) csökkenti (195) -
-
6.2.3 Polimorfizmusok és funkció közötti kapcsolat vizsgálata Több irodalmi adat számol be a P-szelektin Thr715Pro polimorfizmus és szolubilis Pszelektin szintek közötti összefüggésről. Ennek hátterében a polimorfizmusnak a membránkötésért felelős régiót érintő hatása állhat. Ez megváltoztathatja a kötés erősségét, így a különféle aktiváló ágensek hatására a molekula megváltozott mértékben hasadhat le a felszínről. A szolubilis P-szelektin szintekkel kapcsolatos összefüggések vetették fel a sejtfelszíni P-szelektin expresszió és a polimorfizmus vizsgálatát. Nem találtunk kapcsolatot e polimorfizmus és a trombocita sejtfelszíni P-szelektin expressziója között. Az L-szelektin vizsgált polimorfizmusának hatásáról kevés irodalmi adat áll rendelkezésünkre. Vizsgáltuk ezért a Pro213Ser polimorfizmus kapcsolatát az Lszelektin expresszió mértékével. Nem találtunk összefüggést a neutrofil granulocita és monocita L-szelektin expresszió és az L-szelektin Pro213Ser polimorfizmusa között.
79
7. TÉZISEK Eredményeim alapján az alábbi új megállapításokat tettem: 1.
A mutáns L-szelektin allél (213Ser) hordozás gyakoribb koraszülötteknél. Ennek jelenléte kissúlyú koraszülöttekben a BPD rizikóját függetlenül fokozza.
2.
Praeeclampsiában a hipertónia fellépésének idejét több tényező (anya életkora, dohányzás, terhesség előtti BMI) mellett a mutáns 715Pro P-szelektin allél hordozása befolyásolja.
3.
Nincs különbség az ER-α PvuII polimorfizmus genotípus eloszlásában a koraszülöttek és egészséges újszülöttek között. A polimorfizmus-hordozás és a morbiditás közötti kapcsolat nemtől függ: lányok esetében nem áll fenn. Fiúknál ezzel szemben a „p” allélt hordozók között a NEC és a PDA előfordulása ritkább, az oxigénpótlás iránti igény rövidebb. A „pp” genotípus viszont fokozza az IVH kockázatát. A ROP kockázatára nincs a polimorfizmusnak hatása.
4.
Nincs különbség az ösztrogén receptor-α PvuII és XbaI polimorfizmus genotípus eloszlásában a praeeclampsiás és kontroll csoport között. A „PP”/„XX” genotípus kombináció gyakrabban fordul elő súlyos praeeclampsiában. A homozigóta P-X haplotípus - függetlenül az egyéb kockázati tényezőktől - növeli a súlyos praeeclampsia kockázatát. Praeeclampsiásoknál „xx” genotípus mellett kisebb a magzati retardáció kockázata.
5.
Sem a pentoxifillinnek, sem a 17β-ösztradiolnak nincs hatása a neutrofil granulociták és monociták CD11b, L-szelektin denzitására, fagocita és reaktív oxigéntermelő (burst) képességére.
6.
A P-szelektin Thr715Pro polimorfizmus jelenléte nem befolyásolja a trombocita P-szelektin
expresszióját.
Nincs
kapcsolat
az
L-szelektin
Pro213Ser
polimorfizmus és a neutrofil granulocita, monocita L-szelektin expressziója között sem.
80
8. ÖSSZEFOGLALÁS PhD munkám során az E-, L- és P-szelektin gén, valamint az ösztrogén-receptor-α gén polimorfizmusok
kapcsolatát
vizsgáltam
perinatális
morbiditással
kis
súlyú
koraszülöttekben, valamint a súlyos praeeclampsia kockázatával. Retrospektív vizsgálatunk során 125 kis súlyú koraszülött bevonásával, szárított vércsepp mintából, polimeráz
láncreakció,
restrikciós
fragment
hossz
polimorfimus
módszerrel
meghatároztuk az E-szelektin Ser128Arg, a P-szelektin Thr715Pro és az L-szelektin Pro213Ser polimorfizmusokat. Kimutattuk, hogy a mutáns L-szelektin allél (213Ser) hordozás koraszülöttségre hajlamosíthat, emellett fokozhatja BPD kockázatát is. Súlyos praeeclampsiás nőknél igazoltam, hogy a mutáns 715Pro P-szelektin allélt hordozókban a hipertónia korábban lépett fel. Ennek hátterében talán a polimorfizmusnak az antiinflammatorikus hatású szolubilis P-szelektin szintet csökkentő hatása állhat. Összefüggést mutattam ki koraszülött fiúknál az ösztrogén receptor-α (ER-α) PvuII polimorfizmus hordozás és az enterocolitis necrotisans, a ductus Botalli persistens, az oxigénpótlás iránti igény, valamint az intraventricularis hemorrhagia kockázata között. Ilyen kapcsolatot csak fiúknál találtunk, lányoknál nem. Ennek hátterében a hormonszintekben
megmutatkozó
különbségek
állhatnak
(fiúkban
alacsonyabb
ösztrogén szint). Praeeclampsiás nőknél is vizsgáltam az ER-α polimorfizmusait. A genotípusok együttes hordozását tanulmányozva a „PP”/„XX” genotípus kombináció gyakrabban fordult elő a praeeclampsiás csoportban, a „xx” genotípus mellett, pedig kisebb volt a magzati retardáció kockázata. Az eredmény hátterében állhat, hogy a „P” allél jelenléte esetén csökken az ER-α expressziója, ami teoretikusan relatív ösztrogén deficithez vezet. Ez a szisztémás és uteroplacentáris keringés rezisztenciáját fokozva szerepet játszhat a praeeclampsia patomechanizmusában. A perinatális gyulladásos állapotot immunmoduláns szerekkel befolyásolni lehet. Elővizsgálataim során mértem a foszfodiészteráz enzim gátló pentoxifillin (PTXf), illetve a 17β-ösztradiol hatásait neutrofil granulocitán és monocitán. A vizsgált szereknek nem volt hatása a CD11b és L-szelektin expresszióra, illetve a fagocita és reaktív oxigéngyök termelő képességre az általunk vizsgált in vitro rendszerben.
81
9. SUMMARY During my PhD work I investigated the association between the polymorphisms of the E-, P, L-selectin and estrogen receptor-α (ER-α) genes and perinatal morbidity and preeclampsia. We enrolled 125 low birth weight infants in our retrospective study and we determined the Ser128Arg polymorphism of the E-selectin, the Thr715Pro polymorphism of the P-selectin and the Pro213Ser polymorphism of the L-selectin genes from dried blood samples with PCR-RFLP method. We showed that carrier state of the mutant (213Ser) L-selectin allele increases the risk of prematurity and bronchopulmonary displasy. In women with preeclampsia we found that the presence of the 715Pro P-selectin allele was associated with an earlier onset of hypertension. In the background could stand, that this polymorphism decreases the soluble P-selectin level, which has anti-inflammatory properties. We showed an association between the PvuII polymorphism of the ER-α gene and necrotising
enterocolitis,
ductus
Botalli
persistens,
the
lenght
of
oxygen
supplementation and intraventricular hemorrhagia in low birth weight boys. In girls we found no associations. Theoretically, the PvuII polymorphism could be clinically significant only in male neonates, who have lower estrogen levels. This could be one of the explanation for the sex dependency of the perinatal complication. We also investigated the role of the PvuII and XbaI polymorphisms of the ER-α gene in preeclampsia. The „PP”/„XX” genotype combination occured frequently in severe preeclamptic patients and the „xx” genotype was associated with lower risk for fetal growth restriction. In the background could stand, that in case of the „P” allele, the binding site of the B-myb transcription factor is eliminated, therefore the expression of the ER-α decreases. The relative estrogen deficit increases the resistency of the uterine vessels, which is part of the patomechanism of preeclampsia. The perinatal inflammatory process could be therapeutically influenced by immunomodulatory drugs. In my field of research I have collected preliminary data about the direct effect of phosphodiesterase enzyme inhibitor pentoxifylline and estradiol on the L-selectin, CD11b expression, phagocyte and burst function of neutrophile granulocytes and monocytes. These drugs had no effect on the investigated immune functions in our in vitro system.
82
10. TÁBLÁZAT ÉS ÁBRAJEGYZÉK 10.1 Táblázatok jegyzéke 1. táblázat:
Szelektinek
2. táblázat:
Az immunsejtekben előforduló PDE típusok és szerepük
3. táblázat:
Klinikai
jellemzők
a
vizsgált
populációkban
és
a
perinatális
komplikációk előfordulása a vizsgálatban szereplő kis súlyú koraszülöttekben 4. táblázat:
Klinikai jellemzők a praeeclampsiás és kontroll terhes populációkban
5. táblázat:
Klinikai jellemzők a vizsgált populációkban és a perinatális komplikációk előfordulása a vizsgálatban szereplő kis súlyú koraszüköttekben
6. táblázat:
Klinikai jellemzők a vizsgált populációkban
7. táblázat:
Klinikai jellemzők a praeeclampsiás és kontroll terhes csoportokban
8. táblázat:
A szelektin polimorfizmusok vizsgálatakor alkalmazott PCR-RFLP jellemzői
9. táblázat:
Az ER- α PvuII és XbaI polimorfizmus vizsgálatakor alkalmazott PCRRFLP jellemzői
10. táblázat:
A perinatális szövődményekre alkalmazott korrigáló tényezők
11. táblázat:
A szelektin polimorfizmusok genotípus eloszlásai
12. táblázat: A
szelektin
polimorfizmusok
genotípus
prevalenciája
a
súlyos
praeeclampsiás és kontroll terhes populációkban 13. táblázat: Többszörös lineáris regressziós elemzés 14. táblázat:
Klinikai jellemzők és ER-α PvuII polimorfizmus genotípus eloszlása
15. táblázat:
ER-α PvuII polimorfizmus genotípus eloszlás
16. táblázat:
ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus genotípus eloszlásai
17. táblázat:
ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus genotípus kombinációi
18. táblázat: ER-α PvuII és XbaI polimorfizmus P-X haplotípus hordozók és nem hordozók 19. táblázat: ER-α XbaI polimorfizmus genotípus eloszlása magzati retardációval és nélküle szövődött praeeclampsiában
83
20. táblázat:
PTXf hatása a neutrofil granulociták és monociták aktiválhatóságára
21. táblázat: PTXf hatása neutrofil granulociták és monociták fagocita és burst funkciójára 22. táblázat: 17β-ösztradiol
hatása
a
neutrofil
granulociták
és
monociták
aktiválhatóságára 23. táblázat: 17β-ösztradiol hatása neutrofil granulociták és monociták fagocita és burst funkciójára 24. táblázat:
A vizsgált polimorfizmusok genotípus eloszlása
25. táblázat: A vizsgált polimorfizmusok hatása a neutrofil granulociták, monociták és trombociták aktiválhatóságára 26. táblázat: PTXf és 17β-ösztradiol hatása a fagocita funkcióra, oxigéngyök termelő képességre, CD11b és L-szelektin expresszióra az irodalmi adatok alapján 10.2 Ábrák jegyzéke 1. ábra:
Szelektinek az adhézióban
2. ábra:
Az E-szelektin szerkezete
3. ábra:
Az adenozin jelentősége a gyulladásos folyamatban
4. ábra:
A vizsgált E-szelektin polimorfizmus gélelektroforetikus képe emésztés előtt és után
5. ábra:
A vizsgált P-szelektin polimorfizmus gélelektroforetikus képe emésztés előtt és után
6. ábra:
A vizsgált L-szelektin polimorfizmus gélelektroforetikus képe emésztés előtt és után
7. ábra:
A vizsgált ER- α PvuII polimorfizmus gélelektroforetikus képe emésztés előtt és után
8. ábra:
A vizsgált ER- α XbaI polimorfizmus gélelektroforetikus képe emésztés előtt és után
9. ábra:
A DNS festék alapján a leukociták elkülönítése
10. ábra:
Granulociták és monociták elkülönítése, fagocitáló sejtek arányának meghatározása
84
11. ábra:
A DNS festék alapján a leukociták elkülönítése
12. ábra:
Granulociták és monociták elkülönítése, burst aktivitást mutató sejtarány meghatározása
13. ábra:
Az aktivált trombocita hányad meghatározása
14. ábra:
Fagocita sejtaktiváció meghatározása
85
11. IRODALMI HIVATKOZÁSOK 1.
Juliano RL. (2002) Signal transduction by cell adhesion receptors and the cytoskeleton: functions of integrins, cadherins, selectins, and immunoglobulinsuperfamily members. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 42: 283-323.
2.
Kansas GS, Wood GS, Engleman EG. (1985) Maturational and functional diversity of human B lymphocytes delineated with anti-Leu-8. J Immunol, 134: 3003-3006.
3.
Kansas GS, Wood GS, Fishwild DM, Engleman EG. (1985) Functional characterization of human T lymphocyte subsets distinguished by monoclonal anti-Leu-8. J Immunol, 134: 2995- 3002.
4.
Lewinsohn DM, Bargatze RF, Butcher EC. (1987) Leukocyte-endothelia1 cell recognition: Evidence of a common molecular mechanism shared by neutrophils, lymphocytes, and other leukocytes. J Immunol, 138: 4313-4321.
5.
Jung TM, Dailey MO. (1990) Rapid modulation of homing receptors induced by activators of protein kinase C. Receptor shedding due to accelerated proteolytic cleavage at the cell surface. J Immunol, 144: 3130-3136.
6.
Berg M, James SP. (1990) Human neutrophils release the Leu-8 lymph node homing receptor during cell activation. Blood, 76: 2381-2388.
7.
Schleiffenbaum BE, Spertini 0, Tedder TF. (1992) Soluble L-selectin is present in human plasma at high levels and retains functional activity. J Cell Biol, 119: 229- 238.
8.
Kahn J, Ingraham RH, Shirley F, Migaki GI, Kishimoto TK. (1994) Membrane proximal cleavage of L-selectin: Identification of the cleavage site and a 6-M transmembrane peptide fragment of L- selectin. J Cell Biol, 125: 461-470.
9.
Bevilacqua MP, Stengelin S, Gimbrone MA Jr, Seed B. (1989) Endothelial leukocyte adhesion molecule I : An inducible receptor for neutrophils related to complement regulatory proteins and lectins. Science, 243: 1160-1165.
10.
Schindler U, Baichwal VR. (1994) Three NF-kappa B binding sites in the human E-selectin gene required for maximal tumor necrosis factor alpha-induced expression. Mol Cell Biol, 14: 5820-5831.
86
11.
Ghersa P, van Huijsduijnen RH, Whelan J, DeLamarter F. (1992) Labile proteins play a dual role in the control of endothelial leukocyte adhesion molecule-1 (ELAM-I) gene regulation. J Biol Chem, 267: 19226-19232.
12.
von Asmuth EJU, Smeets EF, Ginsel LA, Onderwater JJM, Leeuwenberg JFM, Buurman WA. (1992) Evidence for endocytosis of E-selectin in human endothelial cells. Eur J Immunol, 22: 2519-2526.
13.
McEver RP, Beckstead JH, Moore KL, Marshal-Carlson L, Bainton DF. (1989) GMP-140, a platelet alpha granule membrane protein, is also synthesized by vascular endothelial cells and is localized in Weibel-Palade bodies. J Clin Invest, 84: 92-99.
14.
Berman CL, Yeo EL, Wencel-Drake JD, Furie BC, Ginsberg MH, Furie B. (1986) A platelet alpha granule membrane protein that is associated with the plasma membrane after activation. J Clin Invest, 78: 130-137.
15.
Hsu-Lin S-C, Berman C, Furie B, August D, Furie B. (1984) A platelet membrane protein expressed during platelet activation and secretion. J Biol Chem, 259: 9121-9126.
16.
Green SA, Setiadi H, McEver RP, Kelly RB. (1994) The cytoplasmic domain of P-selectin contains a sorting determinant that mediates rapid degradation in lysosomes. J Cell Biol, 124: 435-448.
17.
Ishiwata N, Takio K, Katayama M, Watanabe K, Titani K, Ikeda Y, Handa M. (1990) Alternatively spliced isoform of P-selectin is present in vivo as a soluble molecule. J Biol Chem, 265: 21381-21385.
18.
Atherton A, Bom GVR. (1972) Quantitative investigation of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leukocytes to blood vessel walls. J Physiol, 222: 447-474.
19.
Bradley LM, Watson SR, Swain SL. (1994) Entry of naive CD4 T cells into peripheral lymph nodes requires L-selectin. J Exp Med, 180: 2401-2406.
20.
Arbones ML, Ord DC, Ley K, Ratech H, Maynard-Curry C, Otten G, Capon DJ, Tedder TF. (1994) Lymphocyte homing and leukocyte rolling and migration are impaired in L-selectin (CD62L) deficient mice. Immunity, 1: 247-260.
87
21.
Ley K, Bullard D, Arbones ML, Bosse R, Vestweber D, Tedder TF, Beaudet AL. (1995) Sequential contribution of L- and P-selectin to leukocyte rolling in vivo. J Exp Med, 181: 669-675.
22.
Mulligan MS, Miyasaka M, Tamatani T, Jones MJ, Ward PA. (1994) Requirement for L-selectin in neutrophil-mediated lung injury in rats. J Immunol, 152: 832-840.
23.
Tedder TF, Steeber DA, Pizcueta P. (1995) L-selectin-deficient mice have impaired leukocyte recruitment into inflammatory sites. J Exp Med, 181: 22592264.
24.
Simon SI, Rochon YP, Lynam EB, Smith CW, Anderson DC, Sklar LA. (1993) B2 integrin and L selectin are obligatory receptors in neutrophil aggregation. Blood, 82: 1097-1106.
25.
Mayadas TN, Johnson RC, Raybum H, Hynes RO, Wagner DD. (1993) Leukocyte rolling and extravasation are severely compromised in P-selectindeficient mice. Cell, 74: 541-554.
26.
Bosse R, Vestweber D. (1994) Only simultaneous blocking of the L- and Pselectin completely inhibits neutrophil migration into mouse peritoneum. Eur J Immunol, 24: 3019-3024.
27.
Larsen E, Celi A, Gilbert GE, Furie BC, Erban JK, Bonfanti R, Wagner DD, Furie B. (1989) PADGEM protein: A receptor that mediates the interaction of activated platelets with neutrophils and monocytes. Cell, 59: 305-312.
28.
Moore KL, Thompson LF. (1992) P-selectin (CD62) binds to subpopulations of human memory T lymphocytes and natural killer cells. Biochem Biophys Res Commun, 186: 173-181.
29.
de Gaetano G, Cerletti C, Evangelista V. (1999) Recent advances in plateletpolymorphonuclear leukocyte interaction. Haemostasis, 29: 41–49.
30.
Goodarzi K, Goodarzi M, Tager AM, Luster AD, von Andrian UH. (2003) Leukotriene B4 and BLT1 control cytotoxic effector T cell recruitment to inflamed tissues. Nat Immunol, 4: 965–973.
31.
McEver RP, Cummings RD. (1997) Perspectives series: cell adhesion in vascular biology. Role of PSGL-1 binding to selectins in leukocyte recruitment. J Clin Invest, 100: 485-491.
88
32.
Li G, Kim YJ, Mantel C, Broxmeyer HE. (2003) P-selectin enhances generation of CD14CCD16C dendritic-like cells and inhibits macrophage maturation from human peripheral blood monocytes. J Immunol 171: 669-677.
33.
Olofsson AM, Arfors K-E, Ramezani L, Wolitzky BA, Butcher EC, von Andrian UH. (1994) E selectin mediates leukocyte rolling in interleukin- 1 treated mesentery venules. Blood, 84: 2749-2758.
34.
Labow MA, Norton CR, Rumberger JM, Lombard-Gilloly KM, Shuster DJ, Huhhard J, Bertko R, Knaack PA, Terry RW, Harbison ML, Kontgen F, Stewart CL, McIntyre KW, Will PC, Burns DK, Wolitzky BA. (1994) Characterization of E-selectin-deficient mice: Demonstration of overlapping function of the endothelial selectins. Immunity, 1: 709-720.
35.
Milstone DS, Redline RW, O'Donnell PE, Davis VM, Stavrakis G. (2000) Eselectin expression and function in a unique placental trophoblast population at the fetal-maternal interface: regulation by a trophoblast-restricted transcriptional mechanism conserved between humans and mice. Dev Dyn, 219: 63-76.
36.
Kruse A, Merchant MJ, Hallmann R, Butcher EC. (1999) Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol, 29: 1116-1126.
37.
Genbacev OD, Prakobhol A, Foulk RA, Krtolica AR, Ilic D, Singer MS, et al. (2003) Trophoblast L-selectin-mediated Adhesion at the maternal-fetal interface. Science, 299: 405-408.
38.
Zhou Y, Damsky CH, Fisher SJ. (1997) Preeclampsia is associated with failure of human cytotrophoblasts to mimic a vascular adhesion phenotype. One cause of defective endovascular invasion in this syndrome? J Clin Invest, 99: 21522164.
39.
Lorant DE, Li W, Tabatabaei N, Garver MK, Albertine KH. (1999) P-Selectin Expression by Endothelial Cells Is Decreased in Neonatal Rats and Human Premature Infants. Blood, 94: 600-609.
40.
Buhrer C, Graulich J, Stibenz D, Dudenhausen JW, Obladen M. (1994) Lselectin is down-regulated in umbilical cord blood granulocytes and monocytes of newborn infants with acute bacterial infection. Pediatr Res, 36: 799-804.
89
41.
Ramsay PL, O'Brian Smith E, Hegemier S, Welty SE. Early clinical markers for the development of bronchopulmonary dysplasia: soluble E-selectin and ICAM1. (1998) Pediatrics, 102: 927-932.
42.
Kim BI, Lee HE, Choi CW, Jo HS, Choi EH, Koh YY, et al. (2004) Increase in cord blood soluble E-selectin and tracheal aspirate neutrophils at birth and the development of new bronchopulmonary dysplasia. J Perinat Med, 32: 282-287.
43.
Koehne PS, Wagner MH, Willam C, Sonntag J, Buhrer C, Obladen M. (2002) Soluble intercellular cell adhesion molecule-1 and L-selectin plasma concentrations and response to surfactant in preterm infants. Pediatr Crit Care Med, 3: 23-28.
44.
Ballabh P, Simm M, Kumari J, Krauss AN, Jain A, Califano C, et al. (2004) Neutrophil and monocyte adhesion molecules in bronchopulmonary dysplasia, and effects of corticosteroids. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed, 89: F76-83.
45.
Ballabh P, Kumari J, Krauss AN, Shin JJ, Jain A, Auld PA, et al. (2003) Soluble E-selectin, soluble L-selectin and soluble ICAM-1 in bronchopulmonary dysplasia, and changes with dexamethasone. Pediatrics, 111: 461-468.
46.
Waisman D, Van Eeden SF, Hogg JC, Solimano A, Massing B, Bondy GP. (1998) L-selectin expression on polymorphonuclear leukocytes and monocytes in premature infant: reduced expression after dexamethasone treatment for bronchopulmonary dysplasia. J Pediatr, 132: 53–56.
47.
Toti P, Felice Cl. (2001) Chorioamnionitis and fetal/neonatal brain injury. Biol Neonate, 79: 201-204.
48.
Yoon BH, Romero R, Kim KS és mtsai. (1999) A systemic fetal inflammatory response and the development of bronchopulmonary dysplasia. Am J Obstet Gynecol, 181: 773-779.
49.
Chaiworapongsa T, Romero R, Kim JC és mtsai. (2002) Evidence for fetal involvement in the pathologic process of clinical chorioamnionitis. Am J Obstet Gynecol, 6: 1178-1182.
50.
Park JS, Romero R, Yoon BH és mtsai. The relationship between amniotic fluid matrix metalloproteinase-8 and funisitis. (2001) Am J Obstet Gynecol, 185: 1156-1161.
90
51.
Gomez R, Romero R, Ghezzi F és mtsai. (1998) The fetal inflammatory response syndrome. Am J Obstet Gynecol. 179: 194-202.
52.
Arias F, Victoria A, Cho K, Kraus F. (1997) Placental histology and clinical characteristics of patients with preterm premature rupture of membranes. Obstet Gynecol, 89: 265–271.
53.
Hillier SL, Martius J, Krohn M, Kiviat N, Holmes KK, Eschenbach DA. (1988) A
case-control
study
of
chorioamnionic
infection
and
histologic
chorioamnionitis in prematurity. N Engl J Med, 319: 972–978. 54.
Russell P. (1979) Inflammatory lesions of the human placenta. I. Clinical significance of acute chorioamnionitis. Am J Diagn Gynecol Obstet, 1: 127–137.
55.
Romero R, Gomez R, Ghezzi F, Yoon BH, Mazor M, Edwin SS, Berry SM. (1998) A fetal systemic inflammatory response is followed by the spontaneous onset of preterm parturition. Am J Obstet Gynecol, 179: 186-193.
56.
Jobe AH, Ikegami M. (1998) Mechanism initiating lung injury in the preterm. Early Hum Develop, 53: 81-94.
57.
Lyon A. (2000) Chronic lung disease of prematurity. The role of intra-uterine infection. Eur J Pediatr, 159: 798-802.
58.
Gaudet LM, Smith GN. (2001) Cerebral palsy and chorioamnionitis: the inflammatory cytokine link. Obstet Gynecol Surv, 56: 433-436.
59.
Hauth JC, Ewell MG, Levine RJ, Esterlitz JR, Sibai B, Curet LB, Catalano PM, Morris CD. (2000) Pregnancy outcomes in healthy nulliparas who developed hypertension. Calcium for Preeclampsia Prevention Study Group. Obstet Gynecol, 95: 24–28.
60.
Roberts JM, Taylor RN, Musci TJ, Rodgers GM, Hubel CA, McLaughin MK (1989) Preeclampsia: an endothelial cell disorder. Am J Obstet Gynecol, 161: 1200-1204.
61.
Friedman EA, Neff RK. (1978) Hypertension-hypotension in pregnancy. Correlation with fetal outcome. JAMA, 239: 2249-2251.
62.
Browne JCM, Veall N. (1953) The maternal placental blood flow in normotensive and hypertensive women. J Obstet Gynaecol Br Emp, 60: 141147.
91
63.
Li J, Hu HY, Zhao YN. (1992) Serum angiotensin-converting enzyme-activity in pregnancy- induced hypertension. Gynecol Obstet Invest, 33: 138-141.
64.
Leung PS, Tsai SJ, Wallukat G, Leung TN, Lau TK. (2001) The upregulation of angiotensin II receptor AT(1) in human preeclamptic placenta. Mol Cell Endocrinol, 184: 95-102.
65.
Barden AE, Herbison CE, Beilin LJ, Michael CA, Walters BN, Van Bockxmeer FM. (2001) Association between the endothelin -1 gene
Lys198Asn
polymorphism blood pressure and plasma endothelin-1 levels in normal and preeclamptic pragnancy. J Hypertens, 19: 1775-1782. 66.
Lyall F, Bulmer JN, Kelly H, Duffie E, Robson SC (1999) Human trophoblast invasion and spiral artery transformation. The role of nitric oxide. Am J Pathol, 154: 1105-1114.
67.
Yoshimura T, Yoshimura M, Tabata A, Shimasaki Y, Nakayama M, Miyamoto Y, Saito Y, Nakao K, Yasue H, Okamura H. (2000) Association of the missense Glu298Asp variant of the endothelial nitric oxide synthase gene with severe preeclampsia. J Soc Gynecol Invest, 7: 238-241.
68.
Visser W, Beckmann I, Bremer H. (1994) Bioactive tumour necrosis factor α in preeclamptic patients with and without the HELLP syndrome. Br J Obstet Gynaecol, 101: 1081-1082.
69.
Hefler LA, Tempfer CB, Gregg AR. (2001) Polymorphisms within the interleukin-1 beta gene cluster and preeclampsia. Obstet Gynecol, 97(5 Pt 1): 664-668.
70.
Nagy B, Toth T, Rigo J Jr, Karadi I, Romics L, Papp Z. (1998) Detection of factor V Leiden mutation in severe pre-eclamptic Hungarian women. Clin Genet, 53: 478-481.
71.
Roberts, JM, Taylor RN, Musci TJ, Rodgers GM, Hubel CA, McLaughlin MK, (1989) Am J Obstet Gynecol, 161: 1200-1204.
72.
Germain SJ, Sargent IL, Redman CWG. (2002) C-reactive protein and the maternal inflammatory response in normal pregnancy and pre-eclampsia. Hypertens Pregnancy, 21 (Suppl.): 150-153.
92
73.
Redman CWG, Sacks GP, Sargent IL. (1999) Preeclampsia, an excessive maternal inflammatory response to pregnancy. Am J Obstet Gynecol 180: 499506.
74.
Sacks GP, Sargent IL, Redman CWG. (1999) An innate view of human pregnancy. Immunol Today, 20: 114-118.
75.
Vince GS, Starkey PM, Austgulen R, Kwiatkowski D, Redman CWG. (1995) Interleukin-6, tumour necrosis factor and soluble tumour necrosis factor receptors in women with pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol, 102: 20-25.
76.
Muttukrishna S, North RA, Morris J, Schellenberg JC, Taylor RS, Asselin J, Ledger W, Groome N, Redman CWG. (2000) Serum inhibin A and activin A are elevated prior to the onset of pre-eclampsia. Hum Reprod, 15: 1640-1645.
77.
Dekker GA, Sibai BM. (1998) Etiology and pathogenesis of preeclampsia: Current concepts. Am J Obstet Gynecol, 179: 1359-1375.
78.
Aydin S, Benian A, Madazli R, Uludağ S, Uzun H, Kaya S. (2004) Plasma malondialdehyde, superoxide dismutase, sE-selectin, fibronectin, endothelin-1 and nitric oxide levels in women with preeclampsia. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 113: 21-25.
79.
Bersinger NA, Smárason AK, Muttukrishma S, Groome NP, Redman CW. (2003) Women with preeclampsia have increased serum levels of pregnancyassociated plasma protein A (PAPP-A), inhibin A, activin A, and soluble Eselectin. Hypertens Pregnancy, 22: 45-55.
80.
Holthe MR, Staff AC, Berge LN, Lyberg T. (2004) Defferent levels of platelet activation in preeclamptic, normotensive pregnant, and nonpregnant women. Am J Obstet Gynecol, 190: 1128-1134.
81.
Karalis I, Nadar SK, Yemenei EA, Blann AD, Lip GYH. (2005) Platelet activation in pregnancy-induced hypertension. Thromb Res, 116: 377-383.
82.
Kim S-Y, Ryu H-M, Yang JH, Kim M-Y, Ahn H-K, Lim H-J, Shin JS, Woo HJ, Park SY, Kim YM, Kim JW, Cho EH. (2004) Maternal serum levels of VCAM1, ICAM-1 and E-selectin in preeclampsia. J Korean Med Sci, 19: 688-692.
83.
Yoneyama Y, Suzuki S, Sawa R, Miura A, Doi D, Otsubo Y, Araki T. (2002) Plasma nitric oxide levels and the expression of P-selectin on platelets in preeclampsia. Am J Obstet Gynecol, 187: 676-680.
93
84.
Chaiworapongsa T, Romero R, Yoshimatsu J, Espinoza J, Kim YM, Park K, Kalache K, Edwin S, Bujold E, Gomez R. (2002) Soluble adhesion molecule profile in normal pregnancy and pre-eclampsia. J Matern Fetal Neonatal Med, 12: 19-27.
85.
Zeisler H, Jirecek S, Hohlagschwandtner M, Knofler M, Tempfer C, Livingston JC. (2002) Concentrations of estrogens in patients with preeclampsia. Wien Klin Wochenschr, 114: 458-461.
86.
Innes KE, Byers TE. (1999) Preeclampsia and breast cancer risk. Epidemiology, 10: 722-732.
87.
Dubey RK, Gillespie DG, Imthurn B, Rosselli M, Jackson EK, Keller PJ. (1999) Phytoestrogens inhibit growth and MAP kinase activity in human aortic smooth muscle cells. Hypertension, 33: 177–182.
88.
Barchiesi F, Jackson EK, Gillespie DG, Zacharia LC, Fingerle J, Dubey RK. (2002) Methoxyestradiols mediate estradiol-induced antimitogenesis in human aortic SMCs. Hypertension, 39: 874–879.
89.
Crews JK, Khalil RA. (1999) Antagonistic effects of 17-estradiol, progesterone, and testosterone on calcium entry mechanisms of coronary vasoconstriction. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 19: 1034 –1040.
90.
Kobayashi T, Tokunaga N, Isoda H, Kanayama N, Terao T. (2001) Vasospasms are characteristic in cases with eclampsia/preeclampsia and HELLP syndrome: proposal of an angiospastic syndrome of pregnancy. Semin Thromb Hemost, 27: 131-135.
91.
Svedas E, Nisell H, Vanwijk MJ, Nikas Y, Kublickiene KR. (2002) Endothelial dysfunction in uterine circulation in preeclampsia: can estrogens improve it? Am J Obstet Gynecol, 187: 1608-1616.
92.
Vedernikov YP, Saade GR, Belfort MA, Wen TS, Garfield RE. (2001) The effect of 17beta-estradiol on isolated omental arteries from preeclamptic women. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 95: 46-51.
93.
Barnes PJ, Adcock IM. (2003) How do corticosteroids work in asthma ? Ann Intern Med, 139: 359-370.
94
94.
Halliday HL, Ehrenkranz RA, Doyle LW. (2003) Early postnatal (<96 hours) corticosteroids for preventing chronic lung disease in preterm infants. Cohrane Database Syst Rev, 1: CD001146
95.
Essayan DM, Huang SK, Undem BJ, Kagey-Sobotka A, Lichtenstein LM. (1994) Modulation of antigen- and mitogen-induced proliferative responses of peripheral blood mononuclear cells by nonselective and isozyme selective cyclic nucleotide phosphodiesterase inhibitors. J Immunol 153: 3408-3416.
96.
Essayan DM. (2001) Cyclic nucleotide phosphodiesterase. J Allergy Clin Immunol, 108: 671-680.
97.
Sitkovsky MV. (2003) Use of the A2A adenosine receptor as a physiological immunosupressor and to engineer inflammation in vivo. Biochemical Pharmacology, 65: 493-501.
98.
Sullivan GW, Linden J, Buster BL, Scheld WM. (1999) Neutrophil A2A adenosine receptor inhibits inflammation in a rat model of meningitis: synergy with the type IV phosphodiesterase inhibitor, rolipram. J Infect Dis, 180:15501560.
99.
Bessler H, Gilgal R, Djaldetti M, Zahavi I. (1986) Effect of pentoxifylline on the phagocytic activity, cAMP levels, and superoxide anion production by monocytes and polymorphonuclear cells. J Leukoc Biol, 40: 747-754.
100.
Tegtmeyer FK, Heilemann A, Reiss I, Fischer T. (2002) Inhibition of meconium induced activation of granulocytes from neonates and adults by pentoxyphylline. Klin Pediatr, 214: 347-352.
101.
Sullivan GW, Carper HT, Novick WJ Jr, Mandell GL. (1988) Inhibition of the inflammatory action of interleukin-1 and tumor necrosis factor (alpha) on neutrophil function by pentoxifylline. Infect Immun, 56: 1722-1729.
102.
Strieter RM, Remick DG, Ward PA, Spengler RN, Lynch JP, Larrick J, Kunkel SL. (1988) Cellular and molecular regulation of tumor necrosis factor-alpha production by pentoxifylline. Biochem Biophys Res Commun, 155: 1230-1236.
103.
Schade UF. (1990) Pentoxifylline increases survival in murine endotoxin shock and decreases formation of tumor necrosis factor. Circ Schock, 31: 171-181.
95
104.
Mah MP, Aeberhard EE, Gilliam MB, Shermann MP. (1993) Effects of pentoxifylline on in vivo leukocyte function and clearance of group B streptococci from preterm rabbit lungs. Crit Care Med, 21: 712-20.
105.
Ishizaka A, Hatherill JR, Harada H,Yonemaru M, Hoffmann H, Zheng H, O’Hanley PT, Raffin TA. (1989) Prevention of interleukin 2-induced acute lung injury in guinea pigs by pentoxifylline. J Appl Physiol, 67: 2432-7243.
106.
Michetti C, Coimbra R, Hoyt DB, Loomis W, Junger W, Wolf P. (2003) Pentoxifylline reduces acute lung injury in chronic endotoxemia. J Surg Res, 115: 92-99.
107.
Zabel P, Schonharting MM, Schade UF. (1991) Effects of pentoxifylline in endotoxinemia in human volunteers. Prog Clin Biol Res, 367: 207-213.
108.
Zabel P, Wolter DT, Schonharting MM, Schade UF. (1989) Oxpentifylline in endotoxaemia. Lancet, 2: 8678-8679.
109.
Neuner P, Klosner G, Schauer E, Pourmojib M, Macheiner W, Grunwald C, Knobler R, Schwarz A, Luger TA, Schwarz T. (1994) Pentoxifylline in vivo down regulates the release of IL-1 beta, IL-6, IL-8 and tumour necrosis factoralpha by human peripheral blood mononuclear cells. Immunology, 83: 262-267.
110.
Staubach KH, Schroder J, Stuber F, Gehrke K, Traumann E, Zabel P. (1998) Effect of pentoxifylline in severe sepsis: results of a randomized, double-blind, placebo-controlled study. Archives of Surgery, 133: 94-100.
111.
Lauterbach R, Pawlik D, Kowalczyk D, Ksycinski W, Helwich E, Zembla M. (1999) Effect of the immunomodulating agent, pentoxifylline, in the treatment of sepsis in prematurely delivered infants: A placebo-controlled, double-blind trial. Crit Care Med, 27: 807-814.
112.
Lauterbach R, Szymura-Oleksiak J. (1999) Nebulized pentoxifylline in successful treatment of five premature neonates with bronchopulmonary dysplasia. Eur J Pediatr, 158: 607.
113.
Souness JE, Aldous D, Sargent C. (2000) Immunosupressive and antiinflammatory effects of cyclic AMP phosphodiesterase (PDE) type 4 inhibitors. Immunopharmacology, 47: 127-162.
114.
Schmidt BM, Kusma M, Feuring S, Timmer WE, Neuhause M, Bethke T, Stuck BA, Harmann K, Wehling M. (2001) The phosphodiesterase 4 inhibitor
96
roflumilast is effective in the treatment of allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol, 108: 530-536. 115.
Compton CH, Gubb J, Nieman R, Edelson J, Amit O, Bakst A, Ayres JG, Creemers JP, Schultze-Wernighaus G, Brambilla C, Barnes NL. (2001) International Study Group: Cilomilast, a selective phosphodiesterase-4 inhibitor for treatment of patients with chronic obstructive pulmonary disease: a randomized, dose-ranging study. Lancet, 358: 265-270.
116.
Fujimura M, Kamio Y, Myou S, Hashimoto T, Matsuda T. (1997) Effect of a phosphodiesterase 3 inhibitor, cilostazol, on bronchial hyperresponsivness in elderly patients with asthma. Int Arch Allergy Immunol, 114: 379-384.
117.
Bardin P, Dorward M, Lampe F, Franke B, Holgate ST. (1998) Effect of selective phosphodiesterase 3 inhibition ont he early and late asthmatic responses to inhaled allergen. Br J Clin Pharmacol, 45: 387-391.
118.
Benten WP M, Stephan C, Lieberherr M, Wunderlich F. (2001) Estradiol signaling via sequestrable surface receptors. Endocrinology, 142: 1669-1677.
119.
Levin, E. R. (2001) Invited review: Cell localisation, physiology, and nongenomic actions of estrogen receptors J Appl Physiology, 91: 1860-1867.
120.
Staples JE, Gasiewicz TA, Fiore NA, Lubahn DB, Korach KS, Silverstone AE. (1999) Estrogen receptor-alfa is necessary in thymic development and estradiolinduced thymic alterations J Immunol, 163: 4168-4174.
121.
Falus, A.: Az immunológia élettani és molekuláris alapjai Semmelweis Kiadó, Budapest, 1996.
122.
Cutolo M, Seriolo B, Villaggio B, Pizzorni C, Craviotto C, Sulli A. (2002) Androgens and estrogens modulate the immune and inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Ann N Y Acad Sci, 966: 131-42.
123.
Das C, Kumar VS, Gupta S, Kumar S. (2002) Network of cytokines, integrins and hormones in human trophoblast cells. J of Reprod Immunol, 53: 257-268.
124.
Miyamoto N, Mandai M, Takagi H, Suzuma K, Koyama S, Otani A, Oh H, Honda Y. (2002) Contrasting effect of estrogen on VEGF induction under different oxygen status and its role in murine ROP, Invest Ophtalmol Vis Sci, 43: 2007-2014.
97
125.
Trotter A, Maier L, Grill HJ, Kohn T, Heckmann M, Pohlandt F. (1999) Effects of postnatal estradiol and progesterone replacement in extremely preterm infants. J Clin Endocrinol Metab, 84: 4531-4535.
126.
Trotter A, Maier L, Grill HJ, Wudy SA, Pohlandt F. (1999) 17Beta-estradiol and progesterone supplementation in extremely low-birth-weight infants. Pediatr Res, 45: 489-493.
127.
Collins T, Williams A, Johnston GI, Kim J, Eddy R, Shows T, Gimbrone MA Jr, Bevilacqua MP. (1991) Structure and chromosomal location of the gene for endothelial-leukocyte adhesion molecule 1. J Biol Chem, 266: 2466–2473.
128.
Ye SQ, Usher D, Virgil D, Zhang LQ, Yochim SE, Gupta RA. (1999) PstI Polymorphism Detects the Mutation of Serine128 to Arginine in CD 62E Gene a Risk Factor for Coronary Artery Disease. J Biomed Sci, 6: 18–21.
129.
Mlekusch W, Exner M, Schillinger M, Sabeti S, Mannhalter C, Minar E, Wagner O. (2004) E-Selectin and restenosis after femoropopliteal angioplasty: prognostic impact of the Ser128Arg genotype and plasma levels. Thromb Haemost, 91: 171–179.
130.
Rauchhaus M, Gross M, Schulz S, Francis DP, Greiser P, Norwig A, Weidhase L, Coats AJ, Dietz R, Anker SD, Glaser C. (2002) The E-selectin SER128ARG gene polymorphism and restenosis after successful coronary angioplasty. Int J Cardiol, 83: 249–257.
131.
Yoshida M, Takano Y, Sasaoka T, Izumi T, Kimura A. (2003) E-selectin polymorphism associated with myocardial infarction causes enhanced leukocyteendothelial interactions under flow conditions. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 23: 783-788.
132.
El-Magadmi M, Alansari A, Teh LS, Ordi J, Gul A, Inanc M, Bruce I, Hajeer A. (2001) Association of the A561C E-selectin polymorphism with systemic lupus erythematosus in 2 independent populations. J Rheumatol, 28: 2650–2652.
133.
Wenzel K, Stahn R, Speer A, Denner K, Glaser C, Affeldt M, Moobed M, Scheer A, Baumann G, Felix SB. (1999) Functional characterization of atherosclerosis-associated Ser128Arg and Leu554Phe E-selectin mutations. Biol Chem, 380: 661–667.
98
134.
Miller MA, Kerry SM, Dong Y, Strazzullo P, Cappuccio FP. (2004) Association between the Thr715Pro P-selectin gene polymorphism and soluble P-selectin levels in a multiethnic population in South London. Thromb Haemost, 92: 1060– 1065.
135.
Carter AM, Anagnostopoulou K, Mansfield MW, Grant PJ. (2003) Soluble Pselectin levels, P-selectin polymorphisms and cardiovascular disease. J Thromb Haemost, 1: 1718–1723.
136.
Barbaux SC, Blankenberg S, Rupprecht HJ, Francomme C, Bickel C, Hafner G, Nicaud V, Meyer J, Cambien F, Tiret L. (2001) Association between P-selectin gene polymorphisms and soluble P-selectin levels and their relation to coronary artery disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 21: 1668–1673.
137.
Herrmann SM, Ricard S, Nicaud V, Mallet C, Evans A, Ruidavets JB, Arveiler D, Luc G, Cambien F. The P-selectin gene is highly polymorphic: reduced frequency of the Pro715 allele carriers in patients with myocardial infarction. Hum Mol Genet, 7: 1277–1284.
138.
Kamiuchi K, Hasegawa G, Obayashi H, Kitamura A, Ishii M, Yano M, Kanatsuna T, Yoshikawa T, Nakamura N. (2002) Leukocyte–endothelial cell adhesion molecule 1 (LECAM-1) polymorphism is associated with diabetic nephropathy in type 2 diabetes mellitus. J Diabetes Complications, 16: 333–337.
139.
Herrington DM, Howard TD, Brosnihan KB, McDonnell DP, Li X, Hawkins GA, Reboussin DM, Xu J, Zheng SL, Meyers DA, Bleecker ER. (2002) Common estrogen receptor polymorphism augments effects of hormone replacement therapy on E-selectin but not C-reactive protein. Circulation, 105: 1879–1882.
140.
van Meurs JB, Schuit SC, Weel AE, van der Klift M, Bergink AP, Arp PP, Colin EM, Fang Y, Hofman A, van Duijn CM, van Leeuwen JP, Pols HA, Uitterlinden AG. (2003) Association of 50 estrogen receptor alpha gene polymorphisms with bone mineral density, vertebral bone area and fracture risk. Hum Mol Genet, 12: 1745–1754.
141.
Ioannidis JP, Ralston SH, Bennett ST, Brandi ML, Grinberg D, Karassa FB, Langdahl B, van Meurs JB, Mosekilde L, Scollen S, Albagha OM, Bustamante M, Carey AH, Dunning AM, Enjuanes A, van Leeuwen JP, Mavilia C, Masi L,
99
McGuigan FE, Nogues X, Pols HA, Reid DM, Schuit SC, Sherlock RE, Uitterlinden
AG.
(2004)
Differential
genetic
effects
of
ESR1
gene
polymorphisms on osteoporosis outcomes. J Am Med Assoc, 292: 2105–2114. 142.
Schuit SC, Oei HH, Witteman JC, Geurts van Kessel CH, van Meurs JB, Nijhuis RL, van Leeuwen JP, de Jong FH, Zillikens MC, Hofman A, Pols HA,Uitterlinden AG. (2004) Estrogen receptor alpha gene polymorphisms and risk of myocardial infarction. J Am Med Assoc, 291: 2969–2977.
143.
Bergink AP, van Meurs JB, Loughlin J, Arp PP, Fang Y, Hofman A, van Leeuwen JP, van Duijn CM, Uitterlinden AG, Pols HA. (2003) Estrogen receptor alpha gene haplotype is associated with radiographic osteoarthritis of the knee in elderly men and women. Arthritis and Rheumatism, 48: 1913–1922.
144.
Deng HW, Li J, Li JL, Dowd R, Davies KM, Johnson M, Gong G, Deng H, Recker RR. (2000) Association of estrogen receptor-alpha genotypes with body mass index in normal healthy postmenopausal, Caucasian women. J Clin Endocrinol Met, 85: 2748–2751.
145.
Weel AE, Uitterlinden AG, Westendorp IC, Burger H, Schuit SC, Hofman A, Helmerhorst TJ, van Leeuwen JP, Pols HA. (1999) Estrogen receptor polymorphism predicts the onset of natural and surgical menopause. J Clin Endocrinol Met, 84: 3146–3150.
146.
Mitra S, Desai M, Khatkhatay MI. (2006) Association of estrogen receptor alpha gene polymorphisms with bone mineral density in postmenopausal Indian women. Mol Genet Metab, 87: 80-87.
147.
Shin A, Kang D, Nishio H, Lee MJ, Park SK, Kim SU, Noh DY, Choe KJ, Ahn SH, Hirvonen A, Kim JH, Yoo KY. (2003) Estrogen receptor alpha gene polymorphisms and breast cancer risk. Breast Cancer Res Treat, 80: 127-131.
148.
Lu H, Higashikata T, Inazu A, Nohara A, Yu W, Shimizu M, Mabuchi H. (2002) Association of estrogen receptor-alpha gene polymorphisms with coronary artery disease in patients with familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 22: 817-823.
149.
Dollner H, Vatten L, Linnebo I, Zanussi GF, Laerdal A, Austgulen R. (2001) Inflammatory mediators in umbilical plasma from neonates who develop early onset sepsis. Biol Neonate, 80: 41–47.
100
150.
Modi N. Disorders of the kidney and urinary tract. Textbook of Neonatology, Edinburgh, Churchill- Livingstone, 1999, pp 1009–1037.
151.
Bell MJ, Ternberg JL, Feigin RD, Keating JP, Marshall R, Barton L, Brotherton T. (1978) Neonatal necrotizing enterocolitis: therapeutic decisions based upon clinical staging. Ann Surg, 187: 1–7
152.
Jobe
AH,
Bancalari
E.
(2001)
Bronchopulmonary
dysplasia.
NICHD−NHLBI−ORD Workshop. Am J Respir Crit Care Med, 163: 17231729. 153.
ACOG Practice Bulletin No 33. (2002) Diagnosis and management of preeclampsia and eclampsia. Obstet Gynecol, 99: 159-167.
154.
Prepared by an international committee. (1984) An international classification of retinopathy of prematurity. Br J Ophthalmol, 68: 690–697.
155.
Jilma B, Marsik C, Kovar F, Wagner OF, Jilma-Stohlawetz P, Endler G. (2005) The single nucleotide polymorphism Ser128Arg in the E-selectin gene is associated with enhanced coagulation during human endotoxemia. Blood, 105: 2380-2383.
156.
Ghilardi G, Biondi ML, Turri O, Guagnellini E, Scorza R. (2004) Ser128Arg gene polymorphism for E-selectin and severity of atherosclerotic arterial disease. J Cardiovasc Surg, 45: 143-147.
157.
Maruya E, Saji H, Seki S, Fujii Y, Kato K, Kai S, Hiraoka A, Kawa K, Hoshi Y, Ito K, Yokoyama S, Juji T. (1998) Evidence that CD31, CD49b, and CD62L are immunodominant minor histocompatibility antigens in HLA identical sibling bone Marrow transplants. Blood, 92: 2169-2176.
158.
Zeisler H, Livingston JC, Schatten C, Tempfer C, Knofler M, Husslein P. (2001) Serum levels of adhesion molecules in women with pregnancy-induced hypertension. Wien Klin Wochenschr, 113: 588-592.
159.
Acar A, Altinbas A, Ozturk M, Kosar A, Kirazli S. (2001) Selectins in normal pregnancy, pre-eclampsia and missed abortus. Hematologia (Budap), 31: 33-38.
160.
Janos Rigo Jr, Tamas Bosze, Zoltan Derzsy, Laszlo Derzbach, Andras Treszl, Levente Lazar, Gabor Sobel, Barna Vasarhelyi. (2006) Family history of earlyonset cardiovascular disorders is associated with a higher risk of severe preeclampsia. Eur J of Obstet Gynecol Reprod Biol, 128: 148-151.
101
161.
Freeman DJ, McManus F, Brown EA, Cherry L, Norrie J, Ramsay JE, Clark P, Walker ID, Sattar N, Greer IA. (2004) Short- and long-term changes in plasma inflammatory markers associated with preeclampsia. Hypertension, 44: 708-714.
162.
Gamble JR, Skinner MP, Berndt MC, Vadas MA. (1990) Prevention of activated neutrophil adhesion to endothelium by soluble adhesion protein GMP140. Science, 249: 414-417.
163.
Lin J, August P. (2005) Genetic thrombophilias and preeclampsia: a metaanalysis. Obstet Gynecol, 105: 182-192.
164.
Liu J. Zhu X. Dai M. Jiang L. Xu M. Chen J. (2003) Estrogen receptor gene polymorphism and bone mineral density in Chinese postmenopausal women. Chinese Medical Journal, 116: 364-367.
165.
Wang Q, Huang Q, Zhou Q. (2000) The relationship between bone mineral density and polymorphism of the estrogen receptor gene in Chinese healthy menopausal women Zhonghua Nei Ke Za Zhi, 39: 743-745.
166.
Salmen T, Heikkinen AM, Mahonen A, Kroger H, Komulainen M, Saarikoski S, Honkanen R, Maenpaa PH. (2000) Early postmenopausal bone loss is associated with PvuII estrogen receptor gene polymorphism in Finnish women: effect of hormone replacement therapy. J Bone Miner Res, 15: 315-321.
167.
Stavrou I, Zois C, Ioannidis JP, Tsatsoulis A. (2002) Association of polymorphisms of the oestrogen receptor alpha gene with the age of menarche. Hum Reprod, 17: 1101-1105.
168.
Kitawaki J, Obayashi H, Ishihara H, Koshiba H, Kusuki I, Kado N, Tsukamoto K, Hasegawa G, Nakamura N, Honjo H. (2001) Oestrogen receptor-alpha gene polymorphism is associated with endometriosis, adenomyosis and leiomyomata. Hum Reprod, 16: 51-55.
169.
Ho AY, Yeung SS, Kung AW. (2000) PvuII polymorphisms of the estrogen receptor alpha and bone mineral density in healthy southern Chinese women. Calcif Tissue Int, 66: 405-408.
170.
Stevenson DK, Verter J, Fanaroff AA, Oh W, Ehrenkranz RA, Shankaran S, Donovan EF, Wright LL, Lemons JA, Tyson JE, Korones SB, Bauer CR, Stoll BJ, Papile LA. (2000) Sex differences in outcomes of very low birthweight
102
infants: the newborn male disadvantage. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed, 83: 182-185. 171.
Bidlingmaier F, Strom TM, Dorr HG, Eisenmenger W, Knorr D. (1987) Estrone and estradiol concentrations in human ovaries, testes, and adrenals during the first two years of life. J Clin Endocrinol Metab, 65: 862-867.
172.
Troisi R, Potischman N, Roberts J, Siiteri P, Daftary A, Sims C, Hoover RN. (2003) Associations of maternal and umbilical cord hormone concentrations with maternal, gestational and neonatal factors. Cancer Causes Control, 14: 347355.
173.
Wickham LA, Gao J, Toda I, Rocha EM, Ono M, Sullivan DA. (2000) Identification of androgen, estrogen and progesterone receptor mRNAs in the eye. Acta Ophthalmol Scand, 78: 146-153.
174.
Malamitsi-Puchner A, Tziotis J, Evangelopoulos D, Fountas L, Vlachos G, Creatsas G, Sekeris CE, Moutsatsou P. (2001) Gene analysis of the N-terminal region of the estrogen receptor alpha in preeclampsia. Steroids, 66: 695-700.
175.
Tempfer CB, Jirecek S, Riener EK, Zeisler H, Denschlag D, Hefler L, Husslein PW. (2004) Polymorphisms of thrombophilic and vasoactive genes and severe preeclampsia: a pilot study. J Soc Gynecol Investig, 11: 227-231.
176.
Maruyama A, Nakayama T, Sato N, Mizutani Y, Furuya K, Yamamoto T. Association study using single nucleotide polymorphisms in the estrogen receptor beta (ESR2) gene for preeclampsia. (2004) Hypertens Res, 27: 903-909.
177.
Guo X, Razandi M, Pedram A, Kassab G, Levin ER. (2005) Estrogen induces vascular wall dilation: mediation through kinase signaling to nitric oxide and estrogen receptors α and β. J Biol Chem, 280: 19704–19710.
178.
Krasinski K, Spyridopoulos I, Asahara T, van der Zee R, Isner JM, Losordo DW. (1997) Estradiol accelerates functional endothelial recovery after arterial injury. Circulation, 95: 1768–1772.
179.
Schuit SC, Oei HH, Witteman JC. (2004) Estrogen receptor alpha gene polymorphisms and risk of myocardial infarction. JAMA, 291: 2969-2977.
103
180.
Roberts JM, Pearson GD, Cutler JA, Lindheimer MD. (2003) Summary of the NHLBI Working Group on Research on Hypertension During Pregnancy. Hypertens Pregnancy, 22: 109-127.
181.
Dunzendorfer S, Schratzberger P, Reinisch N, Kahler CM, Wiedermann CJ. (1997) Pentoxifylline differentially regulates migration and respiratory burst activity of the neutrophil. Ann N Y Acad Sci, 832: 330-340.
182.
Chang FY, Shaio MF. (1996) Pentoxifylline pretreatment enhances the oxidative burst activity of human peripheral blood mononuclear cells. Microbiol Immunol, 40: 787-790.
183.
Oismuller C, Mayer N, Micksche M, Steltzer H, Hammerle AF. (1995) In vivo modulation of human neutrophil function by pentoxifylline in patients with septic syndrome. Shock, 4: 161-165.
184.
Krause PJ, Maderazo EG, Contrino J, Eisenfeld L, Herson VC, Greca N, Bannon P, Kreutzer DL. (1991) Modulation of neonatal neutrophil function by pentoxifylline. Pediatr Res, 29: 123-127.
185.
Haque K, Mohan P. (2003) Pentoxifylline for neonatal sepsis. Cochrane Database Syst Rev, 4: CD004205.
186.
Lall RN, Loomis W, Melbostad H, Hoyt DB, Lane T, Coimbra R. (2006) Phosphodiesterase inhibition attenuates stored blood-induced neutrophil activation: a novel adjunct to blood transfusion. J Am Coll Surg, 202: 10-17.
187.
Coimbra R, Loomis W, Melbostad H, Tobar M, Porcides RD, Hoyt DB. (2004) LPS-Stimulated PMN Activation and Proinflammatory Mediator Synthesis is Downregulated by Phosphodiesterase Inhibition: Role of Pentoxifylline. J Trauma, 57: 1157-1163.
188.
Chen H, Chen Y, Tian W, Lei S, Peng R. Effects of estradiol and isoflavoid on the expression of adhesion molecules on neutrophils. (2001) Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao, 32: 27-31.
189.
Josaki K, Contrino J, Kristie J, Krause P, Kreutzer DL. (1990) Pentoxifyllineinduced modulation of human leukocyte function in vitro. Am J Pathol, 136: 623-630.
104
190.
Magnusson U. (1991) In vitro effects of prepartum concentrations of oestradiol17 beta on cell-mediated immunity and phagocytosis by porcine leukocytes. Vet Immunol Immunopathol, 28: 117-126.
191.
Abrahams VM, Collins JE, Wira CR, Fanger MW, Yeaman GR. (2003) Inhibition of human polymorphonuclear cell oxidative burst by 17-beta-estradiol and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Am J Reprod Immunol, 50: 463-472.
192.
Chiang K, Parthasarathy S, Santanam N. (2004) Estrogen, neutrophils and oxidation. Life Sci, 75: 2425-2438.
193.
Winters KR, Meyer E, Van Merris VM, Van Den Broeck WL, Duchateau L, Burvenich C. (2003) Sex steroid hormones do not influence the oxidative burst activity of polymorphonuclear leukocytes from ovariectomized cows in vitro. Steroids, 68: 397-406.
194.
Elbim C, Lefebvre M, Hakim J, Gougerot-Pocidalo MA. (1995) Effects of pentoxifylline on human polymorphonuclear neutrophil responses to TNF in whole blood. Eur Cytokine Netw, 6: 113-120.
195.
Bekesi G, Kakucs R, Varbiro S, Racz K, Sprintz D, Feher J, Szekacs B. (2000) In vitro effects of different steroid hormones on superoxide anion production of human neutrophil granulocytes. Steroids, 65: 889-894.
105
12. ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT, KÖZLÉSRE ELFOGADOTT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Derzbach L, Bokodi G, Treszl A, Vásárhelyi B, Nobilis A, Rigó J Jr. Selectin polymorphisms and perinatal morbidity in low birth weight infants. Acta Paediatrica 2006 Oct;95(10):1213-7. (IF: 1,277) Derzbach L, Balogh A, Bokodi G, Vásárhelyi B, Rigó J Jr. The Ser128Arg E-selectin and Thr715Pro P-selectin polymorphisms and severe preeclampsia. The Journal of Reproductive Medicine (in press) (IF: 0,835) Derzbach L, Treszl A, Balogh A, Vasarhelyi B, Tulassay T, Rigo J J. Gender dependent association between perinatal morbidity and estrogen receptor-alpha Pvull polymorphism. J Perinat Med. 2005;33(5):461-2. (IF: 0,899) Molvarec A, Vér A, Fekete A, Rosta K, Derzbach L, Karádi I, Rigó J Jr. Association between estrogen receptor-α (ESR1) gene polymorphisms and severe preeclampsia. Hypertension Research (in press) (IF:2,7) Rigo J Jr, Boze T, Derzsy Z, Derzbach L, Treszl A, Lazar L, Sobel G, Vasarhelyi B. Family history of early-onset cardiovascular disorders is associated with a higher risk of severe preeclampsia. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2006;128: 148-151. (IF: 1,141) Derzbach L, Balogh A, Nobilis A, Vasarhelyi B. Foszfodiészteráz gátlás, potenciális eszköz koraszülöttek gyulladásos szövődményeinek megelőzésére és kezelésére. Gyermekgyógyászat 2004. 55. évf. 6. szám, 641-649.
106
13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetet szeretnék mondani Tulassay Tivadarnak, aki létrehozta azt a szellemi műhelyt, ahol három évet tölthettem el nappali ösztöndíjas kutatóként. Ez a szellemi műhely biztosította számomra azt az intellektuális környezetet, ahol elsajátíthattam azt a korszerű kutatási módszertant, ami elengedhetetlenül fontos az orvosi kutatások nemzetközi szintű műveléséhez. Témavezetőm, Vásárhelyi Barna irányítása alatt végeztem PhD munkámat. Bevont az Intézetben már folyó tudományos témákba, illetve önálló kutatási feladatokkal látott el. Segítségével tanultam meg a helyes kérdésfelvetés, adatgyűjtés, elemzés és az értékelés módszereit. Köszönetet szeretnék mondani Vannay Ádámnak és Kozma Gergőnek a munkám során felmerülő technikai problémák megoldásában. Köszönöm Bokodi Gézának és Treszl Andrásnak az adatgyűjtésben és a statisztikai számításokban nyújtott segítségüket. Köszönöm PhD hallgató társaimnak: Bányász Ilonának, Rusai Krisztinának, Szebeni Beának, Balogh Ádámnak munkám során nyújtott baráti segítségüket. Hálás vagyok Bernáth Máriának vizsgálataim során nyújtott kitűnő technikai, baráti segítségéért. Külön köszönettel tartozom Bokodi Gézának, aki mindig segítségemre volt. A flow citométeres vizsgálatok, statisztikai számítások nélküle nem jöhettek volna létre. A kutatócsoport a Semmelweis Egyetem I.sz. Gyermekgyógyászati Klinikán önálló részlegként dolgozik. Ez ad egyedülálló lehetőséget arra, hogy a vizsgálatok során kapott eredmények mögött a klinikusok segítségével ne csak a száraz adatot, hanem a beteget is láthassuk. Ezt a szemléletmódot segítették elő a rendszeres klinikuskutató találkozók, ahol a klinikus munkatársak gyakorlati észrevételei új megvilágításba helyezték eredményeinket. Különösen Fekete Andrea, Körner Anna, Arató András, Reusz György, Szabó András, Szabó Attila és Szabó Miklós ezirányú segítségét köszönöm. A vizsgálatok természetesen nem történhettek volna meg más klinikákkal, kutatóintézetekkel való szoros együttműködés nélkül. Nobilis András és munkatársai a II.sz. Nőgyógyászati Klinikáról a kora- és újszülöttmintákat biztosították; Rigó János a
107
preeclampsiás vizsgálat mintáit biztosította. Segített a helyes kérdésfelvetésben, és a publikációnk megírásában. PhD munkámat igen sokat segítette, hogy valamelyes technikai gyakorlattal már a kezdetekkor rendelkeztem. Ezt Lakatos Péter (I.sz. Belgyógyászati Klinika) irányítása mellett, tudományos diákkörösként sajátítottam el.
108
14. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT, KÖZLÉSRE ELFOGADOTT CIKKEK KÜLÖNLENYOMATA
109
