SYNTÉZA A ANALÝZA LÉČIV

ČESKÁ FARMACEUTICKÁ SPOLEČNOST ČESKÉ LÉKAŘSKÉ SPOLEČNOSTI J. E. PURKYNĚ

42. konference

SYNTÉZA A ANALÝZA LÉČIV Sborník

2. – 5. září 2013 Velké Karlovice

Česká farmaceutická společnost České lékařské společnosti J. E. Purkyně Sekce syntetických léčiv, Sekce farmaceutické kontroly a bioanalytiky Slovenská farmaceutická spoločnosť Sekcia farmaceutickej chemie, Sekcia farmaceutickej analýzy ve spolupráci s Univerzitou Karlovou v Praze, Farmaceutickou fakultou v Hradci Králové

pořádají ve dnech 2. – 5. září 2013 v prostorách Horského hotelu Soláň ve Velkých Karlovicích

42. konferenci Syntéza a analýza léčiv

pořádaná k 90. narozeninám doc. RNDr. PhMr. Milana Čeladníka, CSc. a k 75. narozeninám doc. RNDr. Jiřího Hartla, CSc.

2

42. konference Syntéza a analýza léčiv je podporována těmito firmami:

3

4

Vážené kolegyně, vážení kolegové,

dovolte mi, abych Vás přivítal na 42. konferenci Syntéza a analýza léčiv.

Konference se opět vrací do Beskyd, do krásného prostředí Velkých Karlovic. Zajištěn je hotel téměř na vrcholu Soláně, což samo o sobě zajišťuje velmi příjemný průběh našeho jednání. Věřím, že toto prostředí bude pro nás pro všechny místem příjemného setkání a klidné prostředí hor, které inspirovalo tolik významných umělců, bude zárukou užitečně a plodně stráveného času.

Vážení přátelé, přeji Vám hezký a příjemný pobyt ve Velkých Karlovicích, a doufám, že konference splní Vaše očekávání a přispěje k další spolupráci nejen mezi učiteli a vědci, ale také mezi institucemi, které zde zastupujeme.

Za organizační výbor konference

Prof. PharmDr. Alexandr Hrabálek, CSc.

5

organizační výbor:

prof. PharmDr. Alexandr Hrabálek, CSc. prof. RNDr. Jiří Klimeš, CSc. prof. PharmDr. Martin Doležal, Ph.D. RNDr. Milan Mokrý, CSc. doc. PharmDr. Milan Nobilis, CSc. doc. RNDr. Veronika Opletalová, Ph.D.

http://www.faf.cuni.cz/SAL2013/

6

Program 42. konference Syntéza a analýza léčiv pondělí 2. 9. 2013 příjezd účastníků v odpoledních hodinách, ubytování, vyvěšení plakátů 17:00

zahájení konference prof. PharmDr. Alexandr Hrabálek, CSc.

17:10

plenární přednáška doc. RNDr. Vladimír Velebný, CSc., Contipro Group, Dolní Dobrouč, ČR Mohou se stát fragmenty hyaluronanu novými aktivními látkami?

18:00

welcome drink

19:00

večeře (jednotné menu)

úterý 3. 9. 2013 7:30 až 9:00

snídaně

9:00 až 10:35

blok přednášek předsedající: prof. PharmDr. Alexandr Hrabálek, CSc.

9:00 až 9:50

plenární přednáška prof. RNDr. Blanka Říhová, DrSc., Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i., Praha, ČR Nanoterapeutika na bázi HPMA s cytotoxickým a imunomodulačním účinkem

9:50 až 10:05

doc. PharmDr. Petr Zimčík, Ph.D., Farmaceutická fakulta UK, Hradec Králové, ČR Pokroky v syntéze fotodynamicky aktivních derivátů ftalocyaninů

10:05 až 10:20 doc. Ing. Katarína Hroboňová, Ph.D., Odd. anal. chémie, FCHPT STU, Bratislava, SR Využitie polymérov s odtlačkom molekuly pri analýze zložitých vzoriek 10:20 až 10:30 PharmDr. Zbyněk Svoboda, PhD., PRO.MED.CS Praha a.s., ČR Prezentace společnosti 10:30 až 11:00 coffee break 11:00 až 12:30 blok přednášek, předsedající: prof. RNDr. Jozef Csöllei, CSc, doc. Ing. Katarína Hroboňová, Ph.D. 11:00 až 11:50 plenární přednáška ing. Jiří Brus, Dr., Ústav makromolekulární chemie AV ČR, Praha, ČR NMR spektroskopie pevného stavu ve farmaceutickém výzkumu: strukturní proměnlivost léčiv

7

11:50 až 12:05 Mgr. Petr Beneš, Ph.D., Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, ČR Protinádorové účinky wedelolaktonu 12:05 až 12:20 Mgr. Petra Pullmannová, Ph.D., Farmaceutická fakulta UK, Hradec Králové, ČR Modely kožnej bariéry pri poruchách metabolizmu ceramidov 12:20 až 14:00 oběd 14:00 až 15:30 blok přednášek předsedající: doc. PharmDr. Milan Nobilis, CSc., RNDr. Mája Polakovičová, Ph.D. 14:00 až 14:50 plenární přednáška doc. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D., Farmaceutická fakulta UK, Hradec Králové, ČR Význam studia ADME 14:50 až 15:05 doc. PharmDr. Milan Nobilis, CSc., Farmaceutická fakulta UK, Hradec Králové, ČR 3-hydroxynabumeton - klíčový meziprodukt v biotransformaci nabumetonu. 15:05 až 15:20 RNDr. Mája Polakovičová, Ph.D., Farmaceutická fakulta UK, Bratislava, SR Využitie metód počítačového dizajnu liečiv pri optimalizácii štruktúr ligandov betaadrenergných receptorov 15:20 až 15:35 Ing. Vladimír Kubíček, CSc., Farmaceutická fakulta UK, Hradec Králové, ČR Vliv lipofility na HPLC separaci benzimidazolových anthelmintik a jejich metabolitů 15:35 až 16:00 coffee break 16:00 až 18:00 POSTEROVÁ SEKCE 19:00 až 24:00 společenský večer, raut, cimbálovka

středa 4. 9. 2013 7:30 až 9:00

snídaně

9:00 až 10:30

blok přednášek přesedající: doc. RNDr. Věra Klimešová, doc. PharmDr. Petr Zimčík, Ph.D.

9:00 až 9:50

plenární přednáška doc. RNDr. Katarína Mikušová, Ph.D., Přírodovědecká fakulta, UK, Bratislava, SR Benzotiazinony - nová nádej pre liecbu tuberkulózy

9:50 až 10:05

PharmDr. Jan Zitko, Ph.D., Farmaceutická fakulta UK, Hradec Králové, ČR Deriváty pyrazinamidu s antimykobakteriální aktivitou

8

10:05 až 10:20 PharmDr Jaroslav Roh, Ph.D., Farmaceutická fakulta UK, Hradec Králové, ČR Nová skupina vysoce účinných antituberkulotik: Substituované 5-benzylsulfanyl-1Htetrazoly a jejich bioisostery 10:20 až 11:00 coffee break 11:00 až 12:30 blok přednášek předsedající: doc. Ing. Martin Pisárčik, CSc., doc. PharmDr. Pavel Mučaji, Ph.D. 11:00 až 11:50 plenární přednáška doc. PharmDr. Pavel Mučaji, Ph.D., Farmaceutická fakulta UK, Bratislava, SR Význam rastlín vo vývoji nových liečiv 11:50 až 12:05 PharmDr. Ondřej Holas, Ph.D., Farmaceutická fakulta UK, Hradec Králové, ČR Deriváty pyrazinamidu jako potenciální inhibitory mykobakteriální enoyl-reduktasy 12:05 až 12:20 doc. Ing. Martin Pisárčik, CSc., Farmaceutická fakulta UK, Bratislava, SR Nízkomolekulové nosiče dna 12:20 až 14:00 oběd volné odpoledne 19:00

večeře

čtvrtek 5. 9. 2013 7:30 až 9:00

snídaně

9:00 až 10:30

blok přednášek předsedající: doc. RNDr. Jiří Pazourek, Ph.D., RNDr. Milan Mokrý, CSc.

9:00 až 9:50

plenární přednáška PharmDr. Miroslav Miletín, Ph.D. Farmaceutická fakulta UK, Hradec Králové, ČR Chemická syntéza a značení nukleových kyselin

9:50 až 10:05

PharmDr. Veronika Nováková, Ph.D. Farmaceutická fakulta UK, Hradec Králové, ČR Senzorické vlastnosti azaftalocyaninů

10:05 až 10:20 PharmDr. Vladimír Garaj, Ph.D., Farmaceutická fakulta UK, Bratislava, SR Generovanie virtuálne knižnice benzénsulfónamidových derivátov obsahujúcich striazín a virtuálny skríning na karboanhydráze IX 10:20 až 10:35 doc. RNDr. Jiří Pazourek, Ph.D., Farmaceutická fakulta VFU Brno, ČR Sledování kinetiky mutarotace monosacharidů a jejich derivátů pomocí HPLC

9

10:35 až 11:00 coffee break 11:00 až 12:00 blok přednášek předsedající: PharmDr. Miroslav Miletín, Ph.D. 11:00 až 11:50 plenární přednáška PharmDr. Marcel Špulák, Ph.D., Farmaceutická fakulta UK, Hradec Králové, ČR Nové biologicky aktivní látky odvozené od chinazolinového skeletu 12:00

Ukončení konference – závěrečné slovo prof. PharmDr. Alexandr Hrabálek, CSc. svěšení plakátů, oběd

10

Přehled příspěvků L – plenární přednáška S – krátké sdělení P – poster L-1 L-2 L-3

L-4 L-5 L-6 L-7 L-8

S-1 S-2 S-3 S-4 S-5 S-6

S-7 S-8 S-9

Velebný Vladímír Mohou se stát fragmenty hyaluronanu novými aktivními látkami? Říhová Blanka Nanoterapeutika na bázi HPMA s cytotoxickým a imuno-modulačním účinkem Brus Jiří NMR spektroskopie pevného stavu ve farmaceutickém výzkumu: strukturní proměnlivost léčiv Pávek Petr ADME jako nástroj v racionálním vývoji léčiv Mikušová Katarína Benzotiazinony – nová nádej pre liečbu tuberkulózy Mučaji Pavel Význam rastlín vo vývoji nových liečiv Miletín Miroslav Chemická syntéza, modifikace a značení nukleových kyselin Špulák Marcel Novel biologically active quinazolines

Zimčík Petr Pokroky v syntéze fotodynamicky aktivních derivátů ftalocyaninů Hroboňová Katarína Use of molecularly imprinted polymers in analysis of complex samples Beneš Petr Protinádorové účinky wedelolaktonu Pullmannová Petra Modely kožnej bariéry při poruchách metabolizmu ceramidov Nobilis Milan 3-Hydroxy nabumeton - klíčový meziprodukt v biotransformaci Nabumetonu Polakovičová Mája Využitie metód počítačového dizajnu liečiv při optimalizácii štruktúr ligandov betaadrenergných receptorov Kubíček Vladimír Vliv lipofility na HPLC separaci benzimidazolových anthelmintik a jejich metabolitů Zitko Jan Deriváty pyrazinamidu s antimykobakteriální aktivitou Roh Jaroslav Nová skupina vysoce účinných antituberkulotik: Substituované 5-benzylsulfanyl-1H-tetrazoly a jejich bioisostery

11

S-10 S-11 S-12 S-13

S-14

P-1

P-2

P-3 P-4 P-5 P-6

P-7 P-8 P-9 P-10 P-11 P-12 P-13 P-14

Holas Ondřej Deriváty pyrazinamidu jako potenciální inhibitory mykobakteriální enoyl-reduktasy Pisárčik Martin Nízkomolekulové nosiče DNA Nováková Veronika Senzorické vlastnosti azaftalocyaninů Garaj Vladimír Generovanie virtuálne knižnice benzénsulfónamidových derivátov obsahujúcich s-triazín a virtuálny skríning na karboanhydráze IX Pazourek Jiří Sledování kinetiky mutarotace monosacharidů a jejich derivátů pomocí HPLC

Bartoš Peter Využitie tandemovej hmotnostnej spektrometrie v predformulačných štúdiách lieku s obsahom rekombinantného α-trombínu Bezáková Lýdia Vplyv rastlinných sekundárnych metabolitov a ich komplexov na aktivitu lipoxygenázy v živočíšnych tkanivách Bureš Jan LC-MS analysis of a putative active form of dexrazoxane - ADR-925 in biological samples Cidlina Antonín Syntéza neperiferně substituovaných ftalocyaninů alkylsulfanylovými jednotkami Čižmárik Jozef Optimalizácia zloženia gélov s chlórhexidínom a benzetónium chloridom Čižmáriková Ružena Syntéza a HPLC-enantioseparácia zlúčenín s predpokladaným beta-1-sympatolytickým účinkom Čonka Patrik New potential antitubercular agents with tetrazole ring modification Daňková Ivana Fytochemická analýza vybraných poloparazitických rostlin čeledi Orobanchaceae Goněc Tomáš Syntéza hydroxynaftalenkarboxamidů Holková Ivana Purifikácia a imunochemické stanovenie lipoxygenázy maku siateho (Papaver somniferum L.) Horáková Renáta Extrakcia synefrínu na tuhej fáze z moča pre GC-MS Hroch Lukáš Modulátory ABAD jako potenciální léčiva Alzheimerovy nemoci Hrušková Kateřina Synthesis and in vitro evaluation of novel aroylhydrazone iron chelators Janďourek Ondřej Mikrovlnami asistovaná syntéza derivátů odvozených od pyrazinkarboxylové kyseliny a jejich biologické hodnocení

12

P-15 P-16 P-17

P-18 P-19

P-20 P-21

P-22 P-23 P-24

P-25 P-26 P-27

P-28 P-29 P-30 P-31 P-32 P-33

Karabanovich Galina Synthesis of heterocyclic compounds with high antimycobacterial activity Kastner Petr Teplotní studie UHPLC separace vybraných léčiv Kollárová Renáta Efekt elicitácie na lipoxygenázovú aktivitu a produkciu sanguinarínu v in vitro kulturách Slncovky kalifornskej Kopečná Monika Synthesis and evaluation of transdermal permeation enhancers based on terpenes Kováčiková Veronika Identification of cDNA encoding secterory phospholipase A2 from opium poppy (Papaver somniferum L.) Kroutil Aleš Syntéza potenciálních antidysrytmik Kubincová Janka Identifikácia katinónov a ďalších psychoaktívnych zložiek legálnych stimulantov chromatografickými a hmotnostno-spektrometrickými metódami Kubínová Renata Biologicky aktivní polyfenoly z Plectranthus forsteri ´Marginatus´ Kuča Kamil Inhibitory cholinesteraz jakozto profylaxe otrav NPL Kuneš Martin Stanovení reaktivátorů acetylcholinesterázy v biologickém materiálu: farmakokinetika oximů HI-6 a K027 u prasat Landová Hana Optimalizace přípravy krycí vrstvy pro bukální mukoadhezivní filmy Macková Anna Inhibícia xantínoxidázy záparom z listov Ligustrum vulgare L. Maráková Katarína Analysis of pheniramine,phenylephrine and paracetamol in urine by on-line combination CEMS/MS Marek Jan Hydrolýza organofosforového pesticidu Metathionu v prostředí micel kationických tenzidů Maruniak Matej Analýza IČ (KBr) spektier derivátov kyseliny fenylkarbámovej Marvanová Pavlína Syntéza analogů arylkarbonyloxyamino-propanolů a jejich kvarterních amoniových derivátů Matuška Marek Meďnaté a zinočnaté komplexy Schiffových zásad ako potencionálne inhibítory ureázy Mokrý Milan Využití SPME v analýze léčiv Mokrý Petr Stanovení acidobazické disociační konstanty pKa derivátů arylkarbonyloxyaminopropanolů pomocí 1H-NMR spektroskopie

13

P-34 P-35

P-36 P-37 P-38 P-39 P-40 P-41 P-42 P-43 P-44 P-45 P-46 P-47

Muselík Jan Pelety s řízeným uvolňováním cukru k prevenci hypoglykémií u diabetiků Nejedlý Tomáš Vývoj a validace UHPLC metody pro stanovení risperidonu a jeho nečistot v substanci a tabletách Němeček Jan Syntéza potenciálních antituberkulotik na základě dusíkatých heterocyklů Némethy Andrej Stereoselektívna syntéza a HPLC-enantioseparácia zlúčenín typu beta-blokátorov Nováková Michaela Využití preparativní chromatografie a HPLC k izolaci a ověření čistoty látek ze složité matrice Opálka Lukáš Synthesis of human skin ceramides A and EO classes Pavlica Jiří Stereoselektivní syntéza derivátů propanolaminu Pechová Iveta Enantioselektívna analýza metadonu a EDDP v sére 14etodou LC-MS/MS Pekárová Mária Preparation of DNA sequence of 12/15-lipoxygenase from rat blood Piešťanský Juraj Optimalizácia separačních podmienok pre CE-MS analýzu vareniklínu v lieku Champix® Pilařová Pavla Vývoj metody stanovení pyroxikamu v plazmě Matúš Pupák Príprava a vlastnosti nových amfifilných zlúčenín Servusová Barbora Syntéza a biologické hodnocení derivátů pyrazinamidu Scholz Walter

Stanovenie hodnôt pka derivátov alkyl benzofuránu pomocou UV/VIS spektrofotometrie P-48

P-49 P-50 P-51 P-52 P-53 P-54

Sichrovská Ĺubica Syntéza látok s potenciálnym beta3-agonistickým pôsobením, obsahujúcich benzénsulfónamidový fragment v molekule Stankovičová Mária Štúdium fyzikálnochemických vlastností a stability potenciálních antiarytmík Stopková Lenka Štúdium rozpustnosti valsartanu I Szotkowská Renata Iontová gelace jako perspektivní metoda přípravy mikročástic Šesták Vít LC-MS/MS study on two novel iron chelating antitumor agents in vivo Šimek Michal Určení distribuce velikosti částic API ve formulované tabletě pomocí hot-stage mikroskopu Špačková Věra Antioxidační a antiflogistická aktivita vybraných druhů rodu Nigella

14

P-55 P-56 P-57 P-58 P-59

P-60 P-61

P-62

Šrámková Ivana Sekvenční injekční analýza jako nástroj pro automatizaci disperzní mikroextrakce Švec Jan Nové poznatky v oblasti ftalocyaninů a azaftalocyaninů Timko Lukáš Syntéza a biologické účinky nových derivátov hexadecylfosfocholínu Tóth Jaroslav Fytofarmakologicky a nutraceuticky významné obsahové látky rastlín čeľade Cactaceae Veizerová Lucia Hodnotenie farmaceuticky aktívnych látok vo viniči pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie Zemek Filip Analýza reaktivátorů acetycholinesterázy v plasmě a mozkové tkáni Pantůčková Pavla Simple and rapid capillary electrophoresis analysis of formate in blood of methanol intoxicated persons Bartošíková Lenka Srovnání ůčinku trihydroxydihydrochalkonu a flavonoidů v experimentu

15

Plenární přednášky

16

L-1

MOHOU SE STÁT FRAGMENTY HYALURONANU NOVÝMI AKTIVNÍMI LÁTKAMI? VELEBNÝ VLADIMÍR, NEŠPOROVÁ KRISTINA Contipro Group s.r.o., 401 Dolní Dobrouč, 561 02 Dolní Dobrouč; [email protected]

Hyaluronan je biopolymer, lineární polysacharid, s poměrně uniformní strukturou, tvořenou opakujícími se disacharidickými podjednotkami. Ty se skládají z kyseliny glukuronové a Nacetyl-glukosaminu. Řetězením těchto podjednotek může se v organismu objevit dlouhý polysacharid s molekulovou hmotností řádově v milionech g/mol až po oligosacharidy s molekulovou hmotností v tisících g/mol. Z literatury je známo, že hyaluronany s vysokou molekulovou hmotností mohou hrát v organismu zcela jinou biologickou roli než jeho oligosacharidy. Vysokomolekulární hyaluronan díky schopnosti tvořit velké množství vodíkových vazeb a díky vysoké hustotě záporných nábojů na své molekule má velkou afinitě k vodě a je schopen udržovat ve svém okolí její zvýšenou koncentraci. Tím vytváří vhodné podmínky pro diferenciaci, proliferaci a migraci buněk, neboť umožňuje difusi různých nízkomolekulárních látky, jako jsou například regulační peptidy a proteiny. Vysokomolekulární hyaluronan tím, že váže velké množství vody a tím, jak je v roztoku organizován, je téměř ideální lubrikační látkou. Proto také v organismu plní funkci mazadla pro všechny klouby. Navíc hyaluronan díky své schopností interagovat s celou řadou buněčných receptorů lokalizovaných na povrchu buněk a určitými aminokyselinovými sekvencemi obsaženými v bílkovinách extracelulární matrix, funguje jednak jako její organizátor a také jako jakási kotva vázající buňky k této matrix (1). Zcela jiná je situace v případě fragmentů hyaluronanu. Bylo ukázáno, že fragmenty hyaluronanu s poměrně velkou molekulovou hmotností, okolo 300 kg/mol, brání produkci mediátoru zánětu osteoartritickými subchondrálními osteoblasty i chondrocyty. Biologické efekty fragmentů hyaluronanu se obecně zesilují a hlavně mění s jejich snižující se molekulovou hmotností. Ukazuje se, že biologicky nejaktivnější jsou fragmenty s molekulovou hmotností do 10 kg/mol, typické oligosacharidy s počtem disacharidických podjednotek do 25. Navíc jejich biologická aktivita je rozmanitá. Oligosacharidy např. stimulují expresi některých cytokinů a chemokinů (např. IL-1β, IL-8, IL-12, TNF-α) a indukují immunofenotypické dozrávání lidských dendritických buněk derivovaných z monocytů. Efekt je velmi specifický pro oligosacharidy hyaluronanu. Fragmenty hyaluronanu s vyšší molekulovou hmotností (80 až 200 a 600 až 1000 kg/mol) ani jiné glykosaminoglykany tento efekt nemají. Zajímavé je, že interakce oligosacharidů s dendritickými buňkami je zprostředkována receptorem TLR4 (2) a interakce s hyaluronanem s vyšší molekulovou hmotností receptorem CD44. Oligosacharidy stimulují i další buňky imunitního systému (alveolární makrofágy) k expresi mRNA pro řadu prozánětlivých chemokinů a cytokinů (3). Zcela opačný efekt má vysokomolekulární hyaluronan.

17

Oligosacharidy hyaluronanu s molekulovou hmotností 3,5 kg/mol v některých nádorových buňkách zvyšují syntézu mRNA pro plasminogen activator (uPA) a jeho receptor (4). uPA proteasa degraduje ECM a může tak hrát jednu z klíčových rolí v metastatické proteolytické kaskádě, která umožňuje invazi nádorů tím, že dělá prostor pro migraci buněk. Oligosacharidy hyaluronanu rovněž zvyšují odštěpování CD44 receptoru z rakovinných buněk a tím zvyšují jejich motilitu, to znamená i jejich metastatický potenciál (5). Nejefektivnější se zdál být oligosacharid s molekulovou hmotností 6,9 kg/mol. Oligosacharidy nemusí hrát pouze negativní roli v regulaci invasivnosti nádoru. V případě melanomu B16F10 vysoká koncentrace oligosacharidů inhibuje růst buněk nejenom v kultuře, nýbrž také in vivo. Krátké fragmenty hyaluronanu, oligosacharidy, mají řadu dalších efektů. Oligosacharid složený ze 3 disacharidických podjednotek, hexamonosacharid, indukuje angiogenesu prostřednictvím upregulace genů časné fáze (c-fos, c-jun, jun-B, Krox-20, Krox-24). Up-regulace je inhibována hyaluronanem s vyšší molekulovou hmotností, pokud je přidáván současně (6, 7). A ve výčtu různých biologických efektů fragmentů hyaluronanu by se dalo pokračovat, protože se zdá, že právě fragmenty této jednoduché molekuly vyskytující se prakticky ve všech tkáních savčích organismu, by se v nedaleké budoucnosti mohly stát zajímavým výchozím materiálem pro tvorbu nových farmaceuticky aktivních sloučenin. Cílem přednášky proto bude ukázat, jak se jednotlivé typy fragmentů hyaluronanu připravují, čistí a charakterizují a jaké efekty jsou v literatuře popsány.

1.

Toole BP. Hyaluronan: from extracellular glue to pericellular cue. Nat Rev Cancer. 2004 Jul;4(7):528-39. PubMed PMID: 15229478. Epub 2004/07/02. eng.

2.

Termeer C, Benedix F, Sleeman J, Fieber C, Voith U, Ahrens T, et al. Oligosaccharides of Hyaluronan activate dendritic cells via toll-like receptor 4. J Exp Med. 2002 Jan 7;195(1):99-111. PubMed PMID: 11781369. Pubmed Central PMCID: 2196009.

3.

Liang J, Jiang D, Jung Y, Xie T, Ingram J, Church T, et al. Role of hyaluronan and hyaluronan-binding proteins in human asthma. J Allergy Clin Immunol. 2011 Aug;128(2):403-11 e3. PubMed PMID: 21570715. Pubmed Central PMCID: 3149736.

4.

Kobayashi H, Suzuki M, Kanayama N, Nishida T, Takigawa M, Terao T. CD44 stimulation by fragmented hyaluronic acid induces upregulation of urokinase-type plasminogen activator and its receptor and subsequently facilitates invasion of human chondrosarcoma cells. Int J Cancer. 2002 Dec 1;102(4):379-89. PubMed PMID: 12402308.

5.

Duterme C, Mertens-Strijthagen J, Tammi M, Flamion B. Two novel functions of hyaluronidase-2 (Hyal2) are formation of the glycocalyx and control of CD44-ERM interactions. J Biol Chem. 2009 Nov 27;284(48):33495-508. PubMed PMID: 19783662. Pubmed Central PMCID: 2785194.

6.

Toole BP, Ghatak S, Misra S. Hyaluronan oligosaccharides as a potential anticancer therapeutic. Curr Pharm Biotechnol. 2008 Aug;9(4):249-52. PubMed PMID: 18691085. Epub 2008/08/12. eng.

18

7.

Deed R, Rooney P, Kumar P, Norton JD, Smith J, Freemont AJ, et al. Early-response gene signalling is induced by angiogenic oligosaccharides of hyaluronan in endothelial cells. Inhibition by non-angiogenic, high-molecular-weight hyaluronan. Int J Cancer. 1997 Apr 10;71(2):251-6. PubMed PMID: 9139851. Epub 1997/04/10. eng.

19

L-2

NANOTERAPEUTIKA NA BÁZI HPMA S CYTOTOXICKÝM A IMUNOMODULAČNÍM ÚČINKEM ŔÍHOVÁ, B. 1, ŠÍROVÁ, M. 1, ETRYCH,T. 1, KOVÁŘ, M. 1, ŠUBR,V. 2, BETKA, J. 1, STROHALM, J. 2, CHYTIL, P. 2, TOMALA, J. 1, ULBRICH,K. 2 1

Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v . i., Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4, rihova @biomed.cas.cz

2Ústav

makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i., Heyrovského nám. 2, 162 06, Praha 6

Většina klinicky používaných chemoterapeutik/cytostatik je systémově toxická. Zabíjejí rychle se dělící buňky a nerozeznávají, jedná-li se o buňku normální (zdravou) či maligně transformovanou (nádorovou). Proto nejvíce ohroženy jsou tkáně/orgány s intenzivní proliferací jako jsou trávicí a imunitní systém a především kostní dřeň z které je denně obnovováno několik milionů krevních elementů. Kromě systémové toxicity mají chemoterapeutika také velmi často toxicitu orgánově specifickou. Nejvíce postižena bývají játra, srdce a ledviny. O léčivech pak říkáme, že jsou myelotoxická, hepatotoxická, kardiotoxická, nefrotoxická a imunotoxická. Klasická chemoterapeutická léčba je proto i značně imunosupresivní. To může být dosti závažné, protože poznatky moderní medicíny potvrzují účast imunitního systému při eliminaci nádorových buněk. Agresivní léčba onkologických pacientů, mnohdy nezbytná, může proto inhibovat nebo jen výrazně omezovat vznik protinádorové imunitní reakce a snížit tak naději pacienta na trvalé nebo alespoň dlouhodobé vyléčení. Teoretické řešení je na první pohled jednoduché. Je třeba připravit takové léčivo, které by působilo pouze na nemocnou tkáň nebo orgán. Tedy podat léčivo směrované. Myšlenka směrovaných léčiv je připisována německému lékaři, nositeli Nobelovy ceny Paulovi Ehrlichovi a vyslovit ji měl na počátku dvacátého století, v roce 1906. Praktické řešení je ale relativně složité, a ačkoliv se mu věnují desítky možná stovky laboratoří po celém světě, skutečných terapeutických výstupů je stále relativně málo. Základem směrovaných léčiv na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) je vodorozpustný vysokomolekulární polymerní nosič na který je kovalentní vazbou (podle okolností amidovou nebo hydrazonovou) připojeno konvenční cytostatikum například antracyklinové antibiotikum doxorubicin. Chemická vazba je volena tak, aby směrované léčivo bylo během transportu farmakologicky neaktivní a aktivovalo se až kontrolovaným intracelulárním uvolňováním až v místě žádaného účinku, a to budˇ proteolýzou v lysozomech (většinou se jedná o účinky katepsinů D, H a L) nebo hydrolýzou při nízkém pH ~ 5.0 v buněčných organelách jako jsou endosomy a lysozomy. Výhody použití směrovaného polymerního nosiče spočívají zejména ve:  zvýšené rozpustnosti navazovaných léčiv, případně zajištění rozpustnosti ve vodě nerozpustných léčiv,  neaktivnosti chemoterapeutika během transportu krevním řečištěm,  pasivní akumulaci makromolekulárního terapeutika v místě účinku (EPR efekt) 20

 možnosti aktivní dopravy léčiva k cílovým nádorovým buňkám pomocí vybraných směrujících molekul specificky rozpoznávajících membránové receptory cílových buněk,  možnosti chránit směrující molekuly, zejména protilátky, před inaktivací (na rozdíl od imunotoxinů),  nižší vedlejší toxicitě, tj. významně snížené nebo dokonce odstraněné myelotoxicitě, hepatotoxicitě, kardiotoxicitě, nefrotoxicitě a imunotoxicitě tj. v potlačení nebo dokonce eliminaci vedlejších účinků klasické chemoterapie,  kontrolovaném uvolňování účinné složky až v cílové buňce,  zvýšené účinnosti in vivo při srovnání směrovaných derivátů a originálních léčiv,  vyšší maximální tolerované dávce (Maximum Tolerated Dose, MTD),  dostatečné aktivitě i vůči mnohočetně rezistentním buňkám (multi-drug resistance; MDR),  prodloužené cirkulaci v krevním oběhu a v důsledku toho i dlouhodobé terapeutické využitelnosti,  snížené imunogenicitě navazovaných proteinů.  a v tom, že směrovaná léčiva jsou nejenom imunoprotektivní, ale dokonce imunomobilizující V této přednášce se budeme věnovat pouze polymerním derivátům doxorubicinu, navázaným hydrazonovou vazbou na polymerní nosič na bázi HPMA. Molekulová hmotnost se pohybuje od 25 – 30 kDa (lineární formy) do 200 kDa (dendrimerní a micelární formy). Jde o deriváty třetí generace. Zjistili jsme, že cytostatická léčba všemi dosud zkoumanými nanoterapeutiky na bázi HPMA současně vyvolává systémovou stimulaci imunitního systému. To se v experimentu projevuje tím, že z onkologického onemocnění vyléčené myši (většinou myší EL 4 T buněčný lymfom, BCL1 B buněčná leukemie, 38C13 B buněčný lymfom) jsou bez léčení rezistentní na další letální dávku nádorových buněk. Pokud by podobné principy byly potvrzeny i u lidských pacientů, mohly by alespoň část z nich ochránit před metastázami a minimální zbytkovou chorobou (minimal-residual disease, MRD) onemocnění, která bývá hlavní příčinou jejich úmrtí. Pozorovaný jev jsme nazvali „na terapii závislá aktivace protinádorové imunitní reakce“. Vyznačuje se závislostí na dávce léčiva a na době, kdy bylo toto léčivo podáno. Obecně platí, že čím agresivnější je léčba, tj. čím vyšší dávka byla podána a čím rychleji došlo k vyléčení, tím je vytvořená protinádorová rezistence nižší. Také terapie, která začne velmi brzo po podání nádorových buněk (3 – 5. den) je sice velmi účinná, ale rezistence na další dávku je nízká. Příliš pozdní léčba, v případě výše uvedených nádorových modelů někdy kolem 16. – 18. dne je nejen málo účinná, ale vyvolává také jen nízkou rezistenci. V experimentu je proto možné vysledovat „vakcinační okno“, dobu kdy je léčba nejúčinnější a současně vyvolává nejvyšší rezistenci k nádoru. Umírající a rozpadající se nádorová buňka představuje pro imunitní systém nebezpečný antigen, na který je třeba reagovat. Je-li ale nádor moc rychle odstraněn buď agresivní, nebo příliš brzo započatou terapií, imunitní systém nemá k dispozici ani dost antigenů a ani dost času na to, aby rozvinul účinnou rezistenci. Pokud terapie začne pozdě, maligní

21

onemocnění je jednak již příliš rozvinuté a imunitní systém vyčerpán na to, aby zajistil dostatečnou obranu. Podíl imunitního systému na konečném výsledku protinádorové léčby lze prokázat porovnáním reakce normálních, konvenčních myší a myší imunodeficientních tzv. nu/nu (při mutaci nude myši trpí omezeným množstvím T lymfocytů, hlavních buněčných elementů účastnících se specifické obranné reakce). Zatím co vhodným výběrem polymerních léčiv lze konvenční myši zcela vyléčit, nu/nu myším lze signifikantně prodloužit život, ale vyléčit je nelze. Tzv. Winnovým neutralizačním testem lze prokázat, že nejdůležitější buněčnou složkou vyvolané systémové rezistence jsou CD8+ T buněčné lymfocyty. Jedním z vážných problémů maligních onemocnění je fakt, že nádorové buňky migrují z místa primárního nádoru a usazují se i ve vzdálených místech postiženého organizmu, kde vytváří metastázy. Testovali jsme proto rychlost uvolňování nádorových buněk do spádových i vzdálených lymfatických uzlin. Zjistili jsme, že v případě EL4 T buněčného lymfomu dochází k masivnímu uvolňování lymfomových buněk až po čtrnácti dnech od inokulace a že terapeutická dávka směrovaného léčiva (doxorubicin-HPMA) tomuto uvolňování, na rozdíl od konvenčního cytostatika, významně brání. Tím podstatně omezuje rozsev onemocnění. Porovnávali jsme citlivost tzv. akutního a chronického myšího nádorového modelu EL 4. Jako akutní model jsme využili běžně používaný laboratorní přístup kdy léčba začíná většinou 8. – 10. dní po podání nádorových buněk, tj. v době kdy nádor začíná růst agresivně. Ta byla porovnána s terapií u myší, které trpěly chronickým onemocněním vyvolaným opakovanou nízkou dávkou lymfomových buněk, které teprve po šesté dávce vyvolaly prokazatelné nádorové bujení. Chronicky nemocné myši (více připomínající lidské pacienty trpící bezpříznakovým maligním onemocněním někdy celá léta) reagovaly na léčbu podstatně hůře, protože 100% vyléčených myši trpících akutním onemocněním odpovídalo jen 40% vyléčených myší s onemocněním chronickým. Uvádí se, že zvýšené množství nádorů u starších lidí je, mimo jiné, způsobeno částečně vyčerpaným imunitním systémem. Testovali jsme proto reakci starších myší (12 měsíců, odpovídající přibližně věku mezi 45 – 50 lety) a myší mladých, běžně používaných v pokusech (8. týdnů, přibližně 18 let). Nezjistili jsme žádné dramatické rozdíly. Kontrolní myši umíraly v rozmezí 30 – 35 dní bez ohledu na stáří. Méně funkční lineární deriváty (Mw = 25 – 30 kDa) měly lepší efekt u mladých myší, účinnější deriváty (Mw ~ 200 kDa) byly srovnatelné u obou věkových skupin. Před několika lety jsme měli možnost jeden z našich dřívějších preparátů (první generace) experimentálně otestovat u lidských pacientů (Fakultní nemocnice Motol, Praha) a skutečně jsme zjistili pozitivní vliv na imunitní systém vážně nemocných pacientů.

22

Literatura Říhová, B., Strohalm, J., Kubáčková, K., Jelínková, M., Hovorka, O., Kovář, M., Plocová, D., Šírová, M., Šťastný, M., Rozprimová, L., Ulbrich, K.: Acquired and specific immunological mechanisms co-responsible for efficacy of polymer-bound drugs. J. Control. Rel. 78, 97-114 (2002) Říhová, B.: Immunomodulating activities of soluble synthetic polymer-bound drugs. Adv. Drug Del. Rev. 54, 653-674 (2002) Říhová, B., Strohalm, J., Prausová, J., Kubáčková, K., Jelínková, M., Rozprimová, L., Šírová, M., Plocová, D., Etrych, T., Šubr, V., Mrkvan, T., Kovář, M., Ulbrich, K.: Cytostatic and immunomobilizing activities of polymer-bound drugs: experimental and first clinical data. J. Control. Rel. 91, 1-16 (2003) Kovář, M., Tomala, J., Chmelová, H., Kovář, L., Mrkvan, T., Josková, R., Zákostelská, Z., Etrych, T., Strohalm, J., Ulbrich, K., Šírová, M., Říhová, B.: Overcoming immunoescape mechanisms of BCL1 leukemia and induction of CD8+ T cellmediated BCL1-specific resistance in mice cured by targeted polymer-bound doxorubicin. Cancer Res 68, 9875-9883 (2008) Rihova, B., Kovar, L., Kovar, M, Hovorka, O.: Cytotoxicity and immunostimulation: double attack on cancer cells with polymeric therapeutics Trends in Biotechnology 27, 11-17 (2009) Rihova, B. : Clinical experience with anthracycline antibiotics-HPMA copolymer-human immunoglobulin conjugates. Adv Drug Del Rev 61, 1149 – 1158, 2009 Říhová, B., Kovář, M.: Immunogenicity and immunomodulatory properties of HPMAbased polymers Adv. Drug Del. Rev. 62, 184 – 191, 2010

23

L-3

NMR SPEKTROSKOPIE PEVNÉHO STAVU VE FARMACEUTICKÉM VÝZKUMU: STRUKTURNÍ PROMĚNLIVOST LÉČIV BRUS JIŘÍ Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i., Heyrovského nám. 2, 162 06 Praha 6, Česká Republika; ([email protected], www.imc.cas.cz)

NMR spektroskopie pevného stavu je experimentální metoda, která poskytuje cenné informace o struktuře a dynamice tuhých látek nejrůznějšího charakteru od velmi rigidní anorganických krystalů či skel, přes organické krystaly amorfní polymery, polymerní kompozity až po velmi měkké flexibilní hydrogely. Není proto překvapivé, že své místo nachází i při charakterizací farmaceuticky aktivních systémů. Typickým příkladem možnosti aplikace ss-NMR spektroskopie představuje strukturní charakterizace tuhých disperzí léčiv v polymerních matricích. Strukturní rozmanitost těchto disperzí bude ilustrována na systémech kyseliny acetylsalicylové dispergované v matricích PEG, PVP, pHPMA a PEOx různých molekulových hmotností. Budou demonstrovány nejen možnosti jednotlivých experimentálních technik ss-NMR, jako jsou relaxační či korelační ssNMR experimenty, ale bude provedeno i srovnání s výsledky, které poskytla diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) či rentgenové difrakce (WAXS). Zároveň se pokusíme ukázat vliv polymerní matrice a struktury výsledného produktu na rychlost uvolňování léčiva z polymerní matrice. Strukturní neuspořádanost práškových mikronizovaných či amorfizovaných farmaceutických produktů pak bude demonstrována na příkladu trospia chloridu, kdy se pokusíme ukázat možnosti využití kombinace ss-NMR, FTIR, XRPD a DSC a statistického zpracování dat pomocí faktorové analýzy. Jinou úlohou ss-NMR spektroskopie je asistence při upřesňování úplné krystalové struktury. To je výhodné zvláště pokud se jedná o vícesložkové systémy například sole či kokrystaly.

24

L-4

ADME JAKO NÁSTROJ V RACIONÁLNÍM VÝVOJI LÉČIV PETR PÁVEK Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmakologie a toxikologie, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected]

Cena vývoje léčiva v současné době představuje částku v řádu stomilionů dolarů a trvá 12 a 15 let. Nejdražší jsou především klinické studie ve fázi 2 a 3. Je proto zřejmé, že selhání léčivy v pozdějších fázích vývoje je velmi drahé a farmaceutické firmy hledají přístupy, jak těmto selhání zabránit již v preklinickém vývoji. V devadesátých letech selhalo v důsledku neuspokojivých farmakokinetických parametrů 40% léčiv, což vedlo k intenzivnímu vývoji metod, které jsou schopny předpovídat nepříznivé farmakokinetické vlastnosti vyvíjených látek nebo predikovat jejich lékové interakce. Vznik oboru ADME, pocházející z prvních písmen čtyř fází farmakokinetiky- absorpce, distribuce, metabolismus, a exkrece, snížil na přelomu milénia počet vyřazení látek z klinického vývoje z důvodu nepříznivých farmakokinetických vlastností na 10%. Tyto metody ADME jsou dnes široce používány ve většině farmaceutických firem nebo akademických pracovišť. Přístupy ADME ve vývoji léčiv umožňují především eliminovat neperspektivní kandidáty v raných fázích vývoje léčiva, zvýšit šanci dostat léčivo do klinického testování a snížit celkové náklady uvedení léčiva na trh. Navíc zavádění nových technologií a tzv. high throughput screeningu na robotizovaných zařízeních umožňuje analyzovat celé knihovny látek. V současnosti již nejsou výjimkou screeningové zařízení pro analýzu střevní absorpce, metabolismu látek, lékových interakcí a toxicity kandidátních molekul. Genomické a proteomické přístupy se prosazují i ve vývoji léčiv. Navíc, k dispozici jsou obsáhle databáze látek a léčiv nebo programy pro in silico predikci ADME vlastností kandidátních molekul na bázi jejich chemické struktury. V této přednášce bych chtěl především posluchačům nechat pohlédnout na vývoj léčiv z farmakologické stránky věci, zdůraznit nutnost optimálních farmakokinetických vlastností kandidátní látky a zmínit nejdůležitější metody ADME, které jsou v současnosti používány ve farmaceutických firmách. Především bych chtěl upozornit na některé stereotypy, které provází syntézu a vývoj nových léčiv a upozornit na úskalí, se kterými se může vývoj potencionálních léčiv setkat na úrovni absorpce, metabolismu, distribuce i exkrece. Dále upozorním na rizika lékových interakcí, které jsou stále častější příčinou selhání léčiv ve vývoji nebo stažení léčiv z trhu po registraci i na směrnice a protokoly regulačních orgánů, jak tyto potencionální interakce studovat v rámci preklinického vývoje léčiv. V neposlední řadě bych chtěl nastínit trendy ve vývoji léčiv v oblasti malých molekul i biologik, možné směry, kterými se bude farmakoterapie ubírat v následující dekádě i trendy v ADME metodách při preklinickém vývoji.

25

L-5

BENZOTIAZINÓNY – NOVÁ NÁDEJ PRE LIEČBU TUBERKULÓZY MIKUŠOVÁ KATARÍNA Katedra biochémie, Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Mlynská dolina-CH1,842 15 Bratislava; [email protected]

Tuberkulóza (TBC) v našich končinách nie je príliš rozšírená, skôr je považovaná za ochorenie minulosti. To potvrdzuje aj nedávno uverejnená správa Svetovej zdravotníckej organizácie (World Health Organization, WHO), ktorá konštatuje, že Slovensko s počtom 6,4 chorých na 100 000 obyvateľov nastupuje do tzv. eliminačnej fázy [1]. Z globálneho hľadiska však predstavuje TBC aj v súčasnosti závažný medicínsky problém. Podľa najnovšej štatistiky WHO v roku 2012 pribudlo 8,7 milióna pacientov chorých na TBC, pričom každý deň tomuto ochoreniu podľahlo vyše 3800 ľudí [2]. Závažnou komplikáciou je výskyt mnohonásobne rezistentných foriem TBC, ktoré obmedzujú možnosti terapeutického zásahu. Hoci sa predpokladá, že až jedna tretina svetovej populácie je infikovaná pôvodcom ochorenia – baktériou Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), TBC prepukne len asi u 5% nakazených ľudí, a to častokrát až v prípade zhoršenia zdravotného stavu v súvislosti s vekom alebo znížením imunity. AIDS predstavuje významný rizikový faktor pre rozvoj TBC. Obe ochorenia sa vzájomne podporujú a TBC je najčastejšou príčinou smrti pacientov infikovaných vírusom HIV. Šírenie choroby však podporujú aj zlé sociálne pomery a chudoba, a preto je TBC veľkou záťažou najmä v najzaostalejších krajinách sveta [2]. Aj z týchto dôvodov je vývoj nových liečiv proti TBC jednou z priorít mykobakteriálneho výskumu. Zaujímavosťou je, že na bacil spôsobujúci TBC nepôsobí väčšina bežných antibiotík. Mnohé vlastnosti Mycobacterium tuberculosis sa z hľadiska jeho patogenicity a mimoriadnej odolnosti pripisujú zvláštnej štruktúre bunkovej steny, ktorá sa líši od ostatných bakteriálnych patogénov. Jej kostru vytvára kovalentne viazaný komplex peptidoglykánu, heteropolysacharidu arabinogalaktánu a mastných kyselín s veľmi dlhým reťazcom, nazývaných mykolové kyseliny. Mykolové kyseliny sa v hojnom počte viažu na koncové arabinózy arabinogalaktánu a vo vzájomne paralelnom usporiadaní, kolmom na plazmatickú membránu vytvárajú spolu s ďalšími (tzv. extrahovateľnými) lipidmi na povrchu baktérie relatívne nepriepustnú hydrofóbnu vrstvu – tzv. vonkajšiu membránu, ktorá patogén chráni pred účinkami bežných antibiotík. O kľúčovej úlohe bunkovej steny pre fyziológiu mykobaktérií svedčí aj fakt, že je cieľom pôsobenia najúčinnejších antituberkulotík. Izoniazid zasahuje výstavbu mykolových kyselín a etambutol inhibuje syntézu arabinánovej zložky bunkovej steny. Uvedené liečivá sú špecifické práve pre TBC, pretože ciele ich pôsobenia sa v ostatných patogénnych baktériách nenachádzajú [3]. Do skupiny antituberkulotík účinkujúcich na úrovni bunkovej steny patrí aj nedávno objavený benzotiazinón BTZ038 (2-[2-metyl- 1,4-dioxa-8-azaspiro[4.5]dec-8-yl]-8-nitro-6(trifluórmetyl)-4H-1,3-benzotiazin-4-ón) [4] a niekoľko ďalších molekúl s tým istým 26

molekulovým cieľom pôsobenia - enzýmom DprE1 [5-7], ktorý je súčasťou metabolickej dráhy, produkujúcej kľúčový sacharid mykobakteriálnej bunkovej steny – D-arabinofuranózu (D-Araf). NO2 F3C

S

the most active

O

N

CH3 BTZ-NO2

N O 10526038

O

BTZ038

NHOH

D-Araf je v prírode veľmi zriedkavá a jej metabolický pôvod bol dlho záhadou. Aktivovanou formou D-Araf polymérov v mykobaktériách je CH3 F3Cpre syntézuS arabinánových O much less active BTZ-NHOH sacharidových dekaprenylfosforyl arabinóza (DPA) [8]. Na rozdiel od ostatných aktivovaných N N sa syntetizujú O z príslušných glykozyl nukleotidov, donorov asociovaných s polyprenolmi, ktoré synthesized, O DPA vzniká jedinečnou metabolickou dráhou. Jej prvým krokom not found in vivo je naviazanie ribóza-5-fosfátu 10526046 till now za vzniku dekaprenylfosforyl ribózaz 5-fosforibóza-1-bisfosfátu (PRPP) na dekaprenylfosfát NH2 5-fosfátu, ktorý je následne defosforylovaný na dekaprenylfosforyl ribózu (DPR). DPA vzniká epimerizačnou reakciou na ribóze viazanejS v DPR. Táto reakcia CH3 prebieha prostredníctvom F3C O the lowest active oxidácie ribózy na uhlíku 2‘ a následnej redukcieN výsledného ketoderivátu (DPX) a v čase jej BTZ-NH2 N prebiehajúcej O objavenia bola jediným príkladom epimerizácie na lipidovom nosiči [9]. A práve 10526045 cieľ pre pôsobenie benzotiazinónov. enzým DprE1, ktorý katalyzuje oxidáciuO DPR predstavuje found in blood and urine

Podobne ako všetky doteraz známe antibiotiká, benzotiazinóny (BTZ) boli objavené skríningom na celých bunkách. Hľadanie molekulového cieľa zahŕňalo dva nezávislé genetické prístupy – (i) identifikáciu mykobakteriálneho génu, ktorého expresia z vhodného plazmidu bude mať za následok zvýšenú rezistenciu M. smegmatis voči benzotiazinónom, pričom sa využila kozmidová knižnica M. smegmatis; (ii) hľadanie bodových mutácií v genóme kmeňov M. tuberculosis a M. bovis BCG rezistentných voči BTZ. Obidva prístupy viedli k odhaleniu úlohy génu dprE1 pri vzniku rezistencie týchto kmeňov voči benzotiazinónom. Biochemické experimenty následne potvrdili, že BTZ účinne inhibujú oxidačný krok pri premene DPR na DPA, a teda aj DprE1 ako molekulový cieľ pôsobenia BTZ. Zistilo sa tiež, že pri účinku BTZ hrá kľúčovú úlohu špecifický cysteín v aktívnom mieste DprE1 – rezistentné kmene majú namiesto tejto aminokyseliny glycín alebo serín [4]. Štúdium mechanistických aspektov účinku BTZ poukázalo na zaujímavý fakt – inhibítor sa kovalentne viaže práve na spomínaný cysteín aktívneho miesta enzýmu, avšak jedine v prítomnosti substrátu. Vysvetlením je potreba redukcie nitroskupiny BTZ na príslušný nitrózoderivát, aby došlo k jeho inhibičnému účinku. Zdroj elektrónov pre uvedenú redukciu je kofaktor FADH2 viazaný v aktívnom mieste enzýmu, ktorý sa redukuje pri oxidácii substrátu – DPR. Reaktívny nitrózo-BTZ sa následne kovalentne viaže na cysteín aktívneho miesta DprE1. BTZ teda predstavujú príklad samovražedného inhibítora DprE1 [10]. Tieto výsledky potvrdili aj následné kryštalografické štúdie, v ktorých bola jasne preukázaná prítomnosť kovalentnej väzby medzi inhibítorom a cysteínom v aktívnom mieste enzýmu [11].

27

Dôležitou vlastnosťou BTZ je ich účinnosť v myšacom modele TBC, pričom toxikologické štúdie nepreukázali žiadne nepriaznivé účinky, čím sa tieto látky stávajú vhodnými kandidátmi pre vývoj nového liečiva proti TBC. V súčasnosti sa modifikované BTZ nachádzajú v predklinickom štádiu vývoja a ostáva dúfať, že sa prespektívne stanú novou možnosťou pre záchranu pacientov chorých na TBC. Literatúra 1. http://www.unric.org/en/images/stories/2013/PDF/TBM_newsletter_March_2013.pdf 5.6.2013 2. http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/index.html 5.6.2013 3. V. Jarlier, H. Nikaido. FEMS Microbiol Lett 123: 11-8, 1994. 4. V. Makarov, G. Manina, K. Mikušová, U. Möllmann, et al. Science 324:801-4, 2009. 5. T. Christophe, M. Jackson, H.K. Jeon, D. Fenistein, et al. PLoS Pathogens 5:e1000645, 2009. 6. S. Magnet, R.C. Hartkoorn, R. Székely, J. Pató, et al. Tuberculosis (Edinb) 90:354–360, 2010. 7. S.A. Stanley, S. Schmidt Grant, T. Kawate, N. Iwase, et al. ACS Chem Biol 7: 1377-84, 2012. 8. B. A. Wolucka, M. R. McNeil, E. de Hoffmann, T. Chojnacki, and P. J. Brennan. J Biol Chem 269: 23328-35, 1994. 9. K. Mikušová, H. Huang, T. Yagi, M. Holsters, D. et al. J Bacteriol 187:8020-5, 2005. 10. C. Trefzer, H. Škovierová, S. Buroni, A. Bobovská, et al. J Am Chem Soc 134:912-5, 2012. 11. J. Neres, F. Pojer, E. Molteni, L. R. Chiarelli, et al. Sci Transl Med 4: 150ra121, 2012. Časť tohto výskumu bola podporená grantmi FP7 EC n°260872 (MM4TB) a DO7RP-0015-11 (APVV).

28

L-6

VÝZNAM RASTLÍN VO VÝVOJI NOVÝCH LIEČIV MUČAJI PAVEL Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra farmakognózie a botaniky, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava; [email protected]

Prednáška sa zaoberá súčasnými trendmi a postavením rastlinných zdrojov ako potenciálnych liečiv. WHO odhaduje, že 80% svetovej populácie ľudí primárne využíva prostriedky tradičnej medicíny v zdravotnej starostlivosti. Výber rastlinného druhu sa uskutočňuje na základe: a) empiricky získaných poznatkov a používania v ľudovom liečiteľstve (etnomedicína / etnofarmakológia) b) botanickej príbuznosti rastlín vybraných podľa bodu a) alebo dostupnosti analyzovaného materiálu c) existencie či neexistencie údajov o bioaktivite resp. o obsahových látkach. Treba konštatovať, že viac ako 100 prírodných zlúčenín je v súčasnosti v klinickom skúšaní a rovnaký počet je v predklinickom štádiu. Platí pritom aj konštatovanie, že proces vývoja nového lieku je dlhý, finančne náročný a neistý. Multidisciplinárny prístup zahrňujúci výskum nových prírodných zdrojov (vrátane morských živočíchov) v kombinácii s obmenami molekúl prostredníctvom kombinatórnej chémie a prostredníctvom manipulácie procesov biosyntézy (kombinatórna biosyntéza) a génového inžinierstva sa zatiaľ javí ako najlepšie riešenie pri hľadaní nových liečiv prírodného pôvodu.

29

L-7

CHEMICKÁ SYNTÉZA, MODIFIKACE A ZNAČENÍ NUKLEOVÝCH KYSELIN MILETÍN MIROSLAV 1, KOPECKÝ KAMIL 1, NOVÁKOVÁ VERONIKA 1, ZIMČÍK PETR 1 Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové, [email protected] 1 Univerzita

Funkcionalizované syntetické oligonukleotidy představují objekt intenzívního zájmu v oblasti přírodních věd, ale i nanotechnologií a příbuzných oborů. Jsou s nimi spojené pokroky v oblasti genetické diagnostiky i terapeutických přístupů, jako jsou antisense a antigene technologie. Vývoj stále spolehlivějších a efektivnějších metod modifikace syntetických i nativních nukleových kyselin je proto důležitou interdisciplinární záležitostí na pomezí molekulární biologie, chemie a fyzikální chemie. Modifikace nukleových kyselin je možné provádět: A. Na různých místech molekuly:

1) modifikace fosfátové vazby 2) modifikace na cukru 3) modifikace celé backbone (fosfát i cukr)

4) modifikace na basi 5) navázání modifikující molekuly na 3´ nebo 5´ konec oligonukleotidu

B. V různých fázích přípravy: 1) přímo v průběhu syntézy 2) postsynteticky vázané ještě na pevné fázi 3) postsynteticky volně v roztoku po odštěpení z pevné fáze Všechny tyto pozice a fáze mají své výhody ale i určitá omezení. Přednáška se podrobněji zabývá možnými přístupy, chemickými metodami a typy reagencií, používanými pro modifikaci syntetických oligonukleotidů a možnostmi využití azaflocyaninových barviv v této oblasti. 30

L-8

NOVEL BIOLOGICALLY ACTIVE QUINAZOLINES ŠPULÁK MARCEL 1, MIKUŠEK JIŘÍ 1, VOPRŠÁLOVÁ MARIE 2, POUROVÁ JANA 2, PÁVEK PETR 2, NOVÁK ZDENĚK 1, KUNEŠ JIŘÍ 1, POUR MILAN 1 Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Department of Inorganic and Organic Chemistry, Heyrovského 1203, 500 02 Hradec Králové; [email protected] 1

Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Department of Pharmacology and Toxicology, Heyrovského 1203, 500 02 Hradec Králové 2

Among the possible approaches in the drug discovery process, the one derived from natural products modification has made many unique and vital contributions to the field. This can be applied to plant Justicia adhatoda L. (Acanthaceae) which has been used extensively in Ayurvedic medicine for respiratory disorders treatment for over 2000 years.1 The plant contains several alkaloids, the main and most known is (-) vasicinone (1) (Fig. 1).

We replaced the C-ring with a simple alkyl chain capable of mimicking a cycle leading to a quinazoline scaffold with N3 (3), C4-S (4), C4-O (5) or C4-N (6) as the sites of its attachment.2 The synthesis was carried out using straightforward, high-yielding chemistry starting from 3,4-dihydroquinazoline-4-one (2).

To correctly assign the structure, 13C NMR shifts of the –Z–CHn– (Z = O, N, S) fragment are necessary; resonances in the 45-55 ppm range are indicative of N3-alkylation. Interestingly, the

31

treatment of quinazoline 2 with p-TsCl afforded the N3-tosylated compound, whose reaction with an amine yielded the corresponding N3-alkyl derivative 3. The bronchodilatory effect of almost all derivatives was higher than that of theophylline. The 4-alkylsulfanyl analogues 4 displayed the most pronounced effect and were more potent than their alkoxy (5) and alkylamino (6) counterparts, with ED50 in the micromolar range. The screening of cytostatic activity and acute toxicity of selected compounds showed promising results. Secondly, since the structure of alkaloid (-)vasicinone (1) contains nitrogen in the proximity of a chiral center, screening of some of the quinazolines (7) derived from this heterocycle as potential organocatalyst is another attractive possibility.

Unfortunately, all efforts to employ these compounds as ligands for asymmetric synthesis have not yet been successful. The attempts involved classical aldolisation and Henry reaction. It should be noted that the highly hydrophilic character of the quinazolines 7 limits the choice of suitable solvents to DMF and MeOH. The last part of the talk deals with the activity of some quinazoline derivatives towards CAR receptor. The human constitutive androstane receptor (CAR, NR1I3) is one of the key regulators of xenobiotic and endobiotic metabolism. The unique properties of human CAR, such as the high constitutive activity and the complexity of signaling, as well as the lack of robust and predictive cell-based assays, have hindered the discovery of selective human CAR ligands. Random screening revealed that 2-(3-methoxyphenyl)quinazolin-4-ol (8) displayed interesting activity as a ligand for this receptor. Synthesis of two series was carried out, employing the same alkylation conditions, leading to 4-alkoxy- (9) and 4-alkylsulfanyl-2-(3methoxyphenylquinazolines (10). Some compounds of the class are more potent ligand of human CAR than prototype human CAR ligand CITCO in transient transfection CARresponsive gene reporter assays in HepG2 cells. The compounds also activated human CAR in assembly assay and induce expression of CYP2B6 mRNA in human primary hepatocytes and in HepG2 cells transfected with CAR expression construct.

1. Claeson, U. P. et al. J. Ethnopharmacol. 2000, 72(1-2), 1. 2. Špulák, M. et al. Tetrahedron, 2013, 69, 1705.

32

Krátká sdělení

33

S-1

POKROKY V SYNTÉZE FOTODYNAMICKY AKTIVNÍCH DERIVÁTŮ FTALOCYANINŮ ZIMČÍK PETR 1, MILOSLAV MACHÁČEK 2, TOMÁŠ ŠIMŮNEK 2, VERONIKA NOVÁKOVÁ 3, ANTONÍN CIDLINA 1 Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected], web: http://portal.faf.cuni.cz/Groups/Azaphthalocyaninegroup/ 1

Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv

2

Katedra biochemie

3

Katedra biofyziky a fyzikální chemie

Fotodynamická terapie je metodou léčby nádorových a v menší míře i nenádorových onemocnění, která využívá kromě léčiva ještě aktivující složku – světlo. Energie světelného záření je pohlcena chromoforním systémem léčiva, zde nazývaného fotosensitizér (photosensitizer, PS), které je předá kyslíku. Z něho se poté vytváří silně reaktivní částice – singletový kyslík. Ten následně ničí důležité biomolekuly v buňkách, což vede k porušení jednotlivých buněčných struktur a v konečném důsledku ke smrti takto zasažené buňky. I přesto, že v současné době je na trhu několik PS, je vývoj nových účinnějších a méně toxických derivátů stále výzvou.

Ftalocyaniny (phthalocyanines, Pc) patří mezi jeden z velmi nadějných strukturních typů. Díky absorpci při delších vlnových délkách (> 670 nm), vysokému extinkčnímu koeficientu (> 200 000 M-1 cm-1) a silné produkci singletového kyslíku (  0,5) jsou prakticky optimálními látkami z hlediska fotofyzikálního a spektrálního. V přednášce budou rozebírány vlastnosti kationických Pc obsahujících kvarternizované dusíky na periferních substituentech (viz obr. výše), které byly připraveny v naší laboratoři i na spolupracujícím pracovišti prof. Saada Makhseeda v Kuvajtu. Po syntéze těchto nových potenciálních PS a stanovení základních fotofyzikálních parametrů bylo přistoupeno k hodnocení fotodynamické aktivity po ozáření (λ > 570 nm, 12.4 mW/cm2, 11.2 J/cm2) in vitro na několika buněčných nádorových liniích (HeLa, SK-MEL-28, HCT 116). Vlastní toxicita látek byla testována na myších fibroblastech 3T3. Některé ze zkoumaných látek vykázaly výbornou fotodynamickou aktivitu s hodnotami EC50

34

v řádech desítek nM a současně nízkou toxicitu bez ozáření až do koncentrace v řádu stovek M. Změny na buňkách po fotodynamickém působení jsou snadno pozorovatelné i v jejich morfologii (viz. obr. níže). Některé z takto zkoumaných Pc jsou dobrými kandidáty pro hlubší studium mechanismu fotodynamického působení na subcelulární úrovni.

světlo, kyslík, Pc 1

HeLa buňky po inkubaci (12 hod) s kationickým Pc 1 před ozářením (vlevo) a po ozáření (vpravo).

C e ll u la r v i a b il it y , % o f c o n t r o l

P h o to to x ic ity ( H e L a c e lls )

D a r k to x ic ity ( 3 T 3 c e lls ) T C50 = 395 M

E C 5 0 = 3 6 .7 n M 100

75 TC50 / EC50 = 10762

50

25

0

0.001

0.01

0.1

1

10

100

1000

c , M

Srovnání fotodynamického účinku a toxicity bez ozáření u kationického Pc 1. Spolufinancováno Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. Registrační číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/30.0061

35

S-2

USE OF MOLECULARLY IMPRINTED POLYMERS IN ANALYSIS OF COMPLEX SAMPLES HROBOŇOVÁ KATARÍNA, SPEVAK ANDREA, SPIŠSKÁ ĽUBICA Institute of analytical chemistry, Faculty of chemical and food technology, Slovak university of technology in Bratislava, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovak Republic; [email protected]

The clean-up step prior to the analysis is necessary to separate analytes from other matrix constituents. The most widely used sample preparation technique (clean-up and preconcentration) has been Soxhlet extraction, solvent extraction and solid phase extraction (SPE) of obtained extract. The typical solid phase extraction sorbents have more times lack selectivity for target analyte and this is problematic for selective extraction of analytes from complex matrices. Molecularly imprinted polymers (MIPs) are tailor-made materials with a predefined selectivity for a given analyte or closely related compounds for which they were synthesized. These materials were obtained by polymerizing functional and cross-linking monomers around a template molecule, leading to a highly cross-linked three-dimensional network polymer. The monomers are chosen according to their ability to interact with the functional groups of the template molecule. After polymerization template molecule is extracted and binding sites with shape, size, and functionalities complementary to the target analyte are established. The resulting imprinted polymers are stable, robust, and resistant to a wide range of pH, solvents, and temperature. MIPs are widely applied as bulk or thin layer films materials. Bulks MIP are used as stationary phases in HPLC, electrochromatography and as sorbents for SPE. MIPs as thin films are suited for sensing purpose. [1] Coumarins are benzo-α-pyrone derivatives, and constitute an important group of natural products. Many of their analogues are found to be biologically active and have been proven to exhibit pharmacological activity. Modern chemical and pharmaceutical studies have revealed that the important compounds of plant are coumarins which mainly include simple coumarins. In presented work the influence of the composition of polymerization mixture on binding capacities of polymers were studied. Umbelliferone was used as the template for imprints formation. The polymers were prepared by using methacrylic acid as monomer, ethylene glycol dimethacrylate as initiator, azo-N,N,9-diisobutyronitrile as cross linking agent, and ethanol, acetonitrile or chloroform as porogen. The polymers were prepared by noncovalent approach by bulk polymerization. The evaluation of sorbents was made by a) the determination of sorption capacity of polymers for umbelliferone prepared in polar and nonpolar porogens, b) the study of the influence of umbelifferone solvent on binding capacity of polymers, s) the study of the selectivity of polymers, and c) the optimization of MIP-SPE procedure. The nature of porogen and sample solvent were studied to achieve the maximal sorption capacity. The polymer prepared in chloroform as porogen was capable of specific bind 269.3

36

µg of umbelliferone (for 100 mg of polymer), which is the sufficient capacity for plant samples analysis. [2] The selectivity of polymer was evaluated on the basis of structurally related compounds (umbelliferone, daphnetin, herniarin). These compounds are derivatives of coumarin and are characteristic of a kind of analogue with different hydrophobicity and smaller or larger molecular volume. The UV spectra of supernatant demonstrated that the polymer prepared for template umbelliferone was selective for this molecule and two tested structurally related compounds (daphnetin, and herniarin) over the underivatized molecule of coumarin. The results showed that MIP could be used as group recognition sorbent. The prepared molecularly imprinted polymer was applied to selective sorption of umbelliferone from water plant extracts (archangel, camomile, levander) and propolis samples. The extracts were analysed by HPLC method with spectrophotometric and fluorescence detection. The extraction recovery on MIP obtained for umbelliferone spiked tested samples were more than 70 % for plant samples and more than 50 % for propolis samples with RSD less than 15 %. The values of recovery, inter- and intra-day precisions demonstrate the suitability of prepared polymer for MIP-SPE procedure. The results indicated that off-line SPE extraction procedure was a suitable method for cleaning up and selective enriching of coumarins from the complex matrices. Acknowledgements. This study was financially supported by the Scientific grant agency of the Ministry of Education of the Slovak Republic and of Slovak Academy of Sciences (grant no. 1/0164/11). References [1] Tamayo, F.G., Turiel, E., Martin-Esteban, A.: J. Chromatogr. A, 1152 (2007) 32-40. [2] Hroboňová, K., Spevak, A., Spišská, Ľ., Lehotay, J., Čižmárik J.: Chem. Pap. 67/5 (2013) 477-483.

37

S-3

PROTINÁDOROVÉ ÚČINKY WEDELOLAKTONU BENEŠ PETR, NEHYBOVÁ TEREZA, KNOPFOVÁ LUCIA, ŠMARDA JAN Ústav experimenální biologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno; [email protected]

Wedelolakton je přírodní polyfenolická látka izolovaná již v roce 1956 z extraktu rostliny Wedelia calandulaceae. Následně byl identifikován i v extraktech dalších rostlin z čeledi Asteraceae (Eclipta alba a Eclipta prostrata). V tradiční asijské a jihoamerické medicíně jsou produkty těchto rostlin používány pro léčbu septického šoku, jaterních onemocnění, virových infekcí a hadích uštknutí. Od roku 2007 však byla publikována řada studií, která ukázala, že wedelolakton inhibuje růst a indukuje apoptózu nádorových buněk odvozených od karcinomů prostaty, adenomu hypofýzy, myelomu a neuroblastomu. Protinádorové účinky wedelolaktonu byly přisouzeny především jeho schopnosti inhibovat aktivitu androgenového receptoru (AR) a kinázy IKK, klíčového regulátoru aktivace transkripčního faktoru NFκB. V naší studii jsme zjistili, že wedelolakton inhibuje růst a indukuje apoptózu linií odvozených od karcinomu prsu v μM koncentracích nezávisle na jeho schonosti inhibovat aktivitu AR a IKK. Zjistili jsme, že wedelolakton zastavuje buněčnou replikaci a působí jako katalytický inhibitor DNA topoizomerázy IIα. Inhibiční účinek wedelolaktonu na topoizomerázu IIα a jeho cytotoxický účinek na nádorové buňky je snížený v prostředí s redukčními činidly. V závislosti na prostředí se wedelolakton může chovat jako pro/antioxidant. Wedelolakton je oxidován měďnatými ionty za vzniku reaktivních radikálů, které indukují tvorbu zlomů a AP míst v DNA. Cytotoxicita wedelolaktonu vůči všem dosud testovaným nádorovým liniím byla zvýšená v prostředí simulujícím mikroprostředí solidních nádorů – tedy v podmínkách hypoxie i acidózy. Kromě účinků μM koncentrací jsme se zabývali také účinkem koncentrací nanomolárních. Zjistili jsme, že v nanomolárních koncentracích wedelolakton stimuluje růst nádorových buněk pozitivních pro expresi estrogenových receptorů (ER) a že tento účinek je inhibován antagonisty ER. Wedelolakton rovněž transaktivuje promotor řízený ERresponzivními elementy a indukuje expresi endogenních ER-regulovaných genů. Uvedené výsledky rozšiřují znalosti o mechanismu působení wedelolaktonu na nádorové buňky a ukazují na široké spektrum jeho účinků. Teprve další studie však pomohou posoudit možné využití wedelolaktonu a jeho derivátů v možné prevenci/terapii nádorových onemocnění. Práce byla podporována projekty NT-13441 Grantové agentury České reubliky a "IntegRECAMO: Intelectual Anchor" (CZ.1.07/2.3.00/20.0097) zprostředkovaným Regionalním centrem aplikované molekulární onkologie (RECAMO; CZ.1.05/2.1.00/03.0101).

38

S-4

MODELY KOŽNEJ BARIÉRY PRI PORUCHÁCH METABOLIZMU CERAMIDOV PULLMANNOVÁ PETRA 1, ŠKOLOVÁ BARBORA 1, PALÁT KAREL 1, ZBYTOVSKÁ JARMILA1,2, VÁVROVÁ KATEŘINA 1 1

Katedra anorganickej a organickej chémie, 1Katedra farmaceutickej technológie, Farmaceutická

fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Prahe, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové, Česká republika; [email protected] 2Ústav

organickej technológie, Fakulta chemickej technológie, Vysoká škola chemicko-technologická v

Prahe; Technická 5, 166 28 Praha 6 – Dejvice, Česká republika.

Bariérovú funkciu ľudskej kože zabezpečujú kožné lipidy, ktoré vypĺňajú medzibunkový priestor v najvrchnejšej vrstve pokožky – v stratum corneum (SC). Medzi lipidy SC patria ceramidy (CER), voľné mastné kyseliny (MK), cholesterol (CHOL) a približne 5% (hmotn.) cholesterol sulfátu (CHS). Ceramidy tvoria heterogénnu skupinu 9 typov a z hľadiska hmotnosti majú v lipidoch SC najväčšie zastúpenie. Usporiadanie lipidov v stratum corneum je lamelárne, ich presná organizácia však nie je doteraz úplne objasnená. Ceramidy vznikajú zo svojich hydrofilnejších prekurzorov enzymatickým štiepením. Sfingomyelin (SM) je prekurzor dvoch typov ceramidov (NS a AS), ktoré vznikajú hydrolytickým štiepením SM enzýmom kyslou sfingomyelinázou (aSMase). Zmeny v zložení a štruktúrnom usporiadaní kožných lipidov sprevádzajú rôzne kožné ochorenia. Pokles aktivity sfingomyelinázy bol zistený pri atopickej dermatitíde a NiemannPickovej chorobe. Podľa práce Schmuth a kol. [1] vedie aplikácia inhibítora kyslej sfingomyelinázy na zvieracom modely k akumulácii SM v stratum corneum a predpokladá sa, že tento je zodpovedný za pozorovanú zvýšenú priepustnosť kožnej bariéry. Skúmali sme vplyv akumulácie SM ako možného následku nízkej aktivity kyslej sfingomyelinázy na biofyzikálne vlastnosti a permeabilitu in vitro modelu kožnej bariéry. Ekvimolárna zmes CER NS/MK/CHOL a 5% (hmotn.) CHS sa pokladá za vhodný model na štúdium kožnej bariéry. Ako markery permeácie sme použili elektrickú impedanciu (odráža priepustnosť beriéry pre ióny) a flux modelových liečiv teofylínu a indometacínu. Zámena časti CER NS za SM v študovanom rozsahu nezvyšovala permeabilitu modelových lipidových membrán a nahradenie až 25% CER NS sfingomyelínom nemalo signifikantný vplyv na vybrané biofyzikálne vlastnosti. Pri 50 a viac percentnom nahradení CER NS sfingomyelínom sme pozorovali vymiznutie ortorombického usporiadania lipidov. V ďalšom kroku sme sa rozhodli použiť komplexnejší model kožnej bariéry. Z ľudského SC sme pomocou stĺpcovej chromatografie izolovali ceramidovú frakciu (CER SC), v ktorej

39

boli detekované všetky typy ľudských kožných ceramidov vrátane veľmi dlhých ωacylceramidov. Ekvimolárna zmes CER SC/MK/CHOL a 5% (hmotn.) CHS predstavovala kontrolnú vzorku, v ďalších vzorkách sme 25 - 100% CER SC nahradili sfingomyelínom. Pozorovali sme signifikantné zvýšenie straty vody cez modelové membrány v prítomnosti SM. Permeabilita membrán pre teofylin bola signifikantne zvýšená pri 25 a 50% nahradení CER SC sfingomyelínom. Ostatné sledované biofyzikálne vlastnosti boli porovnateľné s predchádzajúcim modelom. Porovnanie výsledkov naznačuje model-dependentné správanie sa modelových liečiv pri permeačných experimentoch. Uvedené zistenia indikujú, že jednoduchá zmes lididov nie je univerzálnym modelom kožnej bariéry. Výsledky ďalej naznačujú, že permeabilita membrán pre modelové liečivá nekoreluje so sledovanými biofyzikálnymi parametrami. [1] M. Schmuth, M.Q. Man, F. Weber, W. Gao, K.R. Feingold, P. Fritsch, P.M. Elias, W.M. Holleran, Permeability barrier disorder in Niemann-Pick disease: sphingomyelin-ceramide processing required for normal barrier homeostasis, J. Invest. Dermatol., 115 (2000) 459–466. Práca bola finančne podporená operačným programom ECOP, registračné číslo CZ.1.07/2.3.00/30.0061, Zvýšenie kapacity vedecko-výzkumných týmov Univerzity Karlovej prostredníctvom nových pozic pre absolventov doktorandských štúdií a Grantovou agentúrou Českej republiky (13-23891S).

40

S-5

3-HYDROXYNABUMETON – KLÍČOVÝ V BIOTRANSFORMACI NABUMETONU

MEZIPRODUKT

NOBILIS MILAN 1, MIKUŠEK JIŘÍ 1, SZOTÁKOVÁ BARBORA 1, JIRÁSKO ROBERT 2, HOLČAPEK MICHAL 2, CHAMSEDDIN CHAMSEDDIN 3, JIRA THOMAS 3, KUČERA RADIM 1, KUNEŠ JIŘÍ 1, POUR MILAN 1 Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové, Česká republika; [email protected] 1Univerzita

2Univerzita

Pardubice, Fakulta chemicko technologická, Studentská 573, CZ- 532 10 Pardubice, Česká republika 3Ernst-Moritz-Arndt-University,

Institute of Pharmacy, F.-L.-Jahn-Str. 17, D-1748 Germany

Nesteroidní protizánětlivé proléčivo nabumeton je po orálním podání metabolizováno v játrech převážně na 6-methoxy-2-naftyloctovou kyselinu (6-MNA), která je zodpovědná za farmakologický efekt. Od roku 1984 [1] dosud nebyly odhaleny žádné metabolické intermediáty mezi nabumetonem a 6-MNA, které by objasňovaly průběh této konverze. V naší recentní studii [2] byl nabumeton inkubován s potkaními a lidskými mikrosomálními frakcemi jater. Byly objeveny doposud nepopsané metabolity první fáze biotransformace. K objasnění jejich struktury byly využity chirální LLE–HPLC–PDA a achirální LLE–UHPLC–MS/MS analýzy. Nejvíce zastoupený metabolit s elementárním složením C15H16O3 (podle LC-MS), byl identifikován jako 3-hydroxy-4-(6-methoxynaftalen-2-yl)butan-2-on (3-hydroxynabumeton, viz schema) a jeho totožnost byla potvrzena syntézou této látky. Pokud byl nabumeton inkubován s potkaní nebo lidskou jaterní mikrosomální frakcí, pak byl hlavním produktem biotransformace 3-hydroxynabumeton, ale 6-MNA v této biomatrici nebyla detekována. Na druhé straně, když byl 3-hydroxynabumeton inkubován s izolovanými potkaními hepatocyty, hlavním metabolitem byla 6-MNA. Z těchto experimentů vyplývá, že 3-hydroxy nabumeton je chybějícím mezičlánkem v přeměně nabumetonu na 6-MNA. O

O

O CH3

CH3

OH OH H3CO

H3CO

nabumetone

3-hydroxy nabumetone

[1] R.E. Haddock et al., Xenobiotica 14 (1984) 327–337 [2] M. Nobilis et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 80 (2013) 164-172

41

H3CO

6-MNA

S-6

VYUŽITIE METÓD POČÍTAČOVÉHO DIZAJNU LIEČIV PRI OPTIMALIZÁCII ŠTRUKTÚR LIGANDOV BETAADRENERGNÝCH RECEPTOROV POLAKOVIČOVÁ MÁJA 1, GARAJ VLADIMÍR 2, ČIŽMÁRIKOVÁ RUŽENA 1

Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra chemickej teórie liečiv, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava; [email protected] 1

Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra farmaceutickej chémie, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava 2

Stimulácia β-adrenergných receptorov (β-AR) endogénnymi katecholamínmi reguluje širokú škálu biologických procesov od kontraktility myokardu, vaskulárneho a bronchiálneho tonusu hladkého svalstva až po glukózový a lipidový metabolizmus. Ligandy β-AR tvoria širokú triedu liečiv využívaných pri terapii rôznych druhov ochorení. Agonisty β1-adrenergných receptorov (β1-AR) sa používajú pri náhlom srdcovom zlyhaní, agonisty β2-adrenergných receptorov (β2-AR) sú indikované pri liečbe astmy, a agonisty β3-adrenergných receptorov (β3AR) sú študované ako potenciálne antiobeziká a antidiabetiká, aj ako nové liečivá pri dysfunkcii močového mechúra. Najpočetnejšou terapeutickou skupinou sú beta-blokátory, antagonisty, inverzné, alebo čiastočné agonisty β-AR používané pri kardiovaskulárnych ochoreniach. Dlhodobé užívanie beta-blokátorov potvrdilo v klinických štúdiách preventívny vplyv na recidívu a progresiu rakoviny prsníka a pankreasu. Stimulácia β-AR a ich signálnych dráh aktivuje rast a angiogenézu niektorých typov tumorov, čím sa môžu stať perspektívnym cieľom vývoja liečiv aj v oblasti liečby rakoviny. Neočakávané boli tiež výsledky niektorých prierezových epidemiologických štúdií, ktoré dokázali pozitívny efekt liečby beta-blokátormi na rozvoj Alzheimerovej choroby, kde sa tieto receptory taktiež môžu stať novou cieľovou skupinou liečiv. Štruktúrne patria β-AR k A-triede trans-membránových receptorov viazaných s Gproteínom (GPCR). Vzhľadom na veľkú konformačnú nestabilitu je ich kryštalizácia a objasnenie 3D štruktúry veľmi náročné. Z približne 800 geneticky kódovaných GPCR je doteraz vyriešená priestorová štruktúra len pre 12 týchto receptorov, medzi ktorými sú aj štruktúry β1-AR a β2-AR s rôznymi ligandami. Za úspechy v oblasti kryštalizácie a mechanizmu pôsobenia β-AR bola v r. 2012 udelená Nobelova cena za chémiu prof. Lefkowitzovi a prof. Kobilkovi [1]. Významný pokrok v oblasti štruktúrnej a molekulovej biológie GPCR umožnil aplikovať metódy počítačovej chémie a dizajnu liečiv pri návrhu a optimalizácii štruktúr nových liečiv a pri skúmaní mechanizmu ich pôsobenia. Metódami 3D-QSAR a virtuálneho HTS boli navrhnuté a pripravené nové účinnejšie a selektívnejšie štruktúry derivátov salbutamolu a fenoterolu, agonistov β2-AR. Metóda fragmentového skríningu bola použitá pri identifikácii nových arylpiperazínových štruktúr-

42

lídrov β1-AR. Metódou kombinačného HTS boli identifikované štruktúry synergických agonistov adenozínového A2A a β2-AR ako silné stimulátory liečiv mnohopočetného myelómu. Pri skúmaní mechanizmu pôsobenia metóda molekulovej dynamiky ako jediná metóda umožňuje sledovanie rozpoznávacích mechanizmov pri interakcii ligandu s proteínom a sledovanie konformačných zmien vedúcich k aktivácii, alebo inhibícii receptora na atomárnej úrovni. Ukázalo sa, že konformácia, ktorú nadobúda β2-AR v neaktívnom stave po naviazaní neutrálneho antagonistu alprenololu nie je totožná s konformáciou po naviazaní inverzného agonistu karazololu, mierne rozdielnu konformáciu vykazoval tiež komplex s podvojným agonistom karvedilolom. Všetky tri liečivá patria k neselektívnym blokátorom β-AR a rozdiely v priestorovej konformácii komplexov receptora podmieňujú rozdielne postranslačné modifikácie receptora a rozdiely vo farmakologickom profile týchto liečiv. Napriek tomu, že liečivá - ligandy β-AR sa používajú v klinickej praxi vyše 50 rokov, len málo z nich je dostatočne selektívnych, najmä vzhľadom k β1-AR. V prípade beta-blokátorov je ich selektivita k β1-AR spojená s menším rizikom nežiaducich účinkov. Aj beta-blokátory druhej generácie, napr. metoprolol, bisoprolol, celiprolol, považované za kardioselektívne vo vyšších dávkach selektivitu strácajú. Boli pripravené a sú komerčne dostupné vysoko β1selektívne blokátory, LK 204-545 a ICI 89-406, ktoré však boli vzhľadom na ich vysokú vnútornú sympatomimetickú aktivitu vylúčené z ďalšieho klinického testovania. Všetky kryštálové štruktúry receptorov β-AR majú naviazané len neselektívne ligandy, otázka rozdielov v selektívnom väzbovom móde a štruktúrnych determinantov selektivity ligandov ostáva zatiaľ nezodpovedaná. Na hľadanie väzbového módu selektívnych blokátorov LK 204-545, ICI 89-406 a zlúčeniny {5-(propoxymetyl)-2-[2-hydroxy-3-(3,4-dimetoxyfenetylamino)propoxy]fenyl}etanónu (PHEP), pripravenej a farmakologicky testovanej na našej fakulte sme použili metódu molekulového kotvenia do β1-AR a β2-AR [2]. Všetky tri kotvené štruktúry poskytovali dodatočné interakcie s aminokyselinami v oblasti mimobunkových slučiek vstupu do receptora v porovnaní s interakciami neselektívnych ligandov v kryštálových štruktúrach β-AR ako je znázornené na obr 1.

Obr.1 Poloha selektívneho blokátora PHEP (červený) vypočítaná flexibilným molekulovým kotvením porovnaná s polohou neselektívneho karazololu (sivý) v kryštálovej štruktúre β1-AR so selektívnymi interakciami nekonzervovaných aminokyselín (žlté) mimobunkového priestoru receptora.

Oblasť mimobunkových slučiek patrí k najmenej konzervovaným oblastiam v GPCR a napriek podobnej priestorovej polohe v β1-AR aj β2-AR študované selektívne ligandy vstupovali do

43

interakcií s rozdielnymi aminokyselinami v tejto oblasti. Väzbový mód PHEP s interagujúcimi aminokyselinami v β1-AR a β2-AR je na znázornený na obr.2

Obr.2 Väzbový mód PHEP s najbližšími interagujúcimi aminokyselinami v kavite β1-AR (vpravo) a β2-AR (vľavo). Terminálny metoxyfenylový reťazec PHEP vstupuje v β1-AR do silnej hydrofóbnej interakcie s ILE, v β2AR je hydrofóbna interakcia oslabená prítomnosťou HIS v danej polohe aminokyselinového reťazca.

Metódy počítačového dizajnu liečiv, v našej práci použitá metóda molekulového kotvenia, objasnili štruktúrne elementy ligandov aj beta-adrenergných receptorov ktoré môžu určovať podtypovú selektivitu beta-blokátorov. Závery našej práce sú v zhode s publikovanými výsledkami molekulovo-dynamických štúdií aj experimentálnymi prácami v oblasti selektivity ďalších GPCR [3] a môžu byť použité pri návrhu štruktúr selektívnejších beta-blokátorov.

Literatúra: 1. Rasmussen S.R.F., DeVree B.T., Zou Y. et al.: Nature 477, 2011, p.549-555 2. Polakovičová M, Čižmáriková R.: Acta Fac. Pharm. Univ. Comen. LIX, 2012, (2), p.44-53 3. Peeters M.C., Van Westen G.P., Li Q., et al.: Trends Pharmacol. Sci. 32, 2011, p.35-42

Práca vznikla vďaka podpore grantu MŠ SR VEGA 1/0743/13

44

S-7

VLIV LIPOFILITY NA HPLC SEPARACI BENZIMIDAZOLOVÝCH ANTHELMINTIK A JEJICH METABOLITŮ KUBÍČEK VLADIMÍR, PLEVÁKOVÁ MAGDALENA, PALIČOVÁ JITKA Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra biofyziky a fyzikální chemie, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected]

Při metabolismu léčiv, je běžné, že parentní látka se svou lipofilitou značně liší od příslušných metabolitů. To může působit potíže při separaci parentní látky a metabolitů pomocí HPLC v klasickém uspořádání (stacionární fáze C18; mobilní fáze: voda (pufr) + ACN (MeOH)). Vzhledem k separačnímu mechanismu na stacionární fázi C18 je sice obecně vhodné, aby se separované látky lišily svou lipofilitou, ale pokud je rozdíl v lipofilitách příliš velký, je izokratická metoda prakticky nepoužitelná. Řešení je buď použití gradientu, což může být někdy obtížné, nebo ve změně stacionární fáze. Při výzkumu rezistence střevních parazitů vůči benzimidazolovým anthelmintikům byly separovány parentní látky flubendazol, albendazol a fenbendazol od svých metabolitů. Lipofility jednotlivých látek byly jednak vypočítány příspěvkovou metodou, jednak stanoveny jako kapacitní faktory látek v separačním systému, ve kterém stacionární fáze (C18) představovala lipofilní vrstvu a mobilní fáze (voda + MeOH) představovala vrstvu hydrofilní. Dosažené výsledky ukazují, že v případě flubendazolu, kdy je rozdíl hodnot lipofility flubendazolu a metabolitu (redukovaného flubendazolu) relativně malý, je možné provádět izokratickou separaci na stacionární fázi C18. Větší rozdíl v lipofilitách je již u u albendazolu a jeho metabolitů (albendazol sulfoxid, albendazol sulfon) a izokratická eluce na stacionární fázi C18 je řadou autorů popisována jako obtížná. Proto byla použita orthogonální stacionární fáze, pentafluorofenylová, v izokratickém modu. Míra odlišnosti (orthogonality) stacionárních fází byla stanovena výpočtem pomocí „hydrophobic-subtraction“ modelu. Pentafluorofenylová stacionární fáze se osvědčila i v případě separace fenbendazolu a jeho metabolitu oxfendazolu. Avšak u této dvojice je rozdíl lipofilit už tak velký, že bylo nutné využít gradientu.

45

S-8

DERIVÁTY PYRAZINAMIDU S ANTIMYKOBAKTERIÁLNÍ AKTIVITOU ZITKO JAN 1, SERVUSOVÁ BARBORA 1, PATEROVÁ PAVLA 2, MANDÍKOVÁ JANA 1, DOLEŽAL MARTIN 1 Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected] 1

Ústav klinické mikrobiologie, Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Sokolská 581, 500 03 Hradec Králové 2

Pyrazinamid (pyrazin-2-karboxamid, PZA) je antituberkulotikem první volby a součástí všech základních terapeutických režimů tuberkulózy. Přestože je klinicky využíván již od 50. let 20. století, jeho mechanismus účinku není prozatím plně objasněn. Nespecifický účinek je vázán na intracelulární akumulaci kyseliny pyrazin-2-karboxylové (POA), jež vzniká přeměnou proléčiva PZA katalyzovanou mykobakteriální pyrazinamidasou. Specifickým účinkem některých derivátů PZA je inhibice FAS I1, mykobakteriálního enzymu klíčového pro syntézu mastných kyselin buněčné stěny mykobaktéria. U POA byla prokázána in vitro inhibice transtranslace2, tj. procesu uvolnění a recyklace zastavených ribozomů při defektní proteosyntéze. V poslední době se naše laboratoř zaměřila na syntézu potenciálních antituberkulotik odvozených od 5-chlor a 6-chlorpyrazin-2-karboxamidu (5-Cl-PZA; 6-Cl-PZA). Připravené látky byly testovány na in vitro antimykobakteriální aktivitu vůči Mycobacterium tuberculosis H37Rv, M. avium a dvěma kmenům M. kansasii. Tabulka 1 uvádí přehled strukturních typů připravených sloučenin s uvedením nejlepších hodnot antimykobakteriální aktivity (MIC) v dané skupině s případnými hodnotami in vitro cytotoxicity testované na buněčné linii HepG2 (hepatocelulární nádorové linii). Anilidy 5-Cl-POA (skupina 1 v tab. 1) vykázaly dobrou aktivitu, která ovšem byla spojena s významnou cytotoxicitou (nízký SI index). Zavedením methylenového spojovacího můstku do struktury 1 za vzniku N-benzylderivátů (2) dochází k významnému snížení aktivity.3 Náhradou atomu chloru ve struktuře 1 alkylamino substituentem dochází k výraznému snížení cytotoxicity za zachování aktivity (3). Z jednoduchých alkylaminoderivátů PZA s volnou karboxamidovou funkcí (4,5) vykázaly aktivitu pouze struktury s dlouhým alifatickým řetězcem (heptylamino a oktylamino deriváty). Mnohé z připravených látek vykázaly i aktivitu vůči atypickým mykobakteriálním kmenům (hlavně M. kansasii), které jsou vůči PZA rezistentní. Další závislosti mezi strukturou a antimykobakteriální aktivitou diskutovaných derivátů PZA budou diskutovány v rámci prezentace s nastíněním nově zamýšlených obměn struktury PZA.

46

Tabulka 1: Strukturní typy připravených sloučenin s uvedením nejlepší reprezentativní hodnoty MIC [µg.ml-1] vůči M. tbc H37Rv a index selektivity založený na in vitro cytotoxicitě vůči HepG2 buněčné linii. Strukturní typ

R, Ak

MIC [µg.ml-1]

SI

1

CH3, C2H5, i-C3H5, X, CF3, NO2, OH, OCH3, COOH, CN

0,78 – 6,25

3–7

2

X, CF3, NO2, OCH3

12,5 – 25

-

3

R: H, Cl Ak: methyl až oktyl

R = H: 0,78 – 3,13 R = Cl: 12,5*

43 – 50

4

Ak: methyl až oktyl

Ak = heptyl, oktyl 6,25 – 12,5*

5–9

5

Ak: propyl až oktyl

Ak = heptyl, oktyl 1,56 a 25*

26

-

6,25 – 12,5

775 – 1550

PZA

* významná aktivita pouze u derivátů s heptylem a oktylem Literatura: 1. Sayahi, H.; Zimhony, O.; Jacobs, W. R., Jr.; Shekhtman, A.; Welch, J. T. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21, 4804. 2. Shi, W.; Zhang, W.; Jiang, X.; Yuan, H.; Lee, J. S.; Barry, C. E.; Wang, H. H.; Zhang, W. H.; Zhang, Y. Science. 2011, 333, 1630. 3. Servusová, B.; Vobicková, J.; Paterová, P.; Kubíček, V.; Kuneš, J.; Doležal, M.; Zitko, J. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2013, 23, 3589.

Tato publikace je výsledkem implementace projektu: „Podpora vytváření, rozvoje a mobility kvalitních výzkumně-vývojových týmů na Univerzitě Karlově“, registrační číslo CZ.1.07/2.3.00/30.0022, podporovaným operačním programem Vzdělávání pro konkurenceschopnost (OP VK) a financovaným z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu České republiky. Publikace byla rovněž podpořena Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy ČR (SVV-2013-267-001).

47

S-9

NOVÁ SKUPINA VYSOCE ÚČINNÝCH ANTITUBERKULOTIK: SUBSTITUOVANÉ 5BENZYLSULFANYL-1H-TETRAZOLY A JEJICH BIOISOSTERY KARABANOVICH GALINA 1, ROH JAROSLAV 1, NĚMEČEK JAN 1, SMUTNÝ TOMÁŠ 2, VICHEREK PETR 1, STOLAŘÍKOVÁ JIŘINA 4, DUFKOVÁ IDA 3, PÁVEK PETR 2, KLIMEŠOVÁ VĚRA 1, HRABÁLEK ALEXANDR 1 Katedra anorganické a organické chemie, 2 Katedra farmakologie a toxikologie, 3 Katedra biologických a lékařských věd, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected] 1

Oddělení bakteriologie a mykologie, Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě, Partyzánské náměstí 7, 702 00 Ostrava 4

V rámci této práce byla syntetizována série 1-substituovaných-5-(benzylsulfanyl)-1H-tetrazolů se specifickou substitucí na benzylu a byla stanovena in vitro antimykobakteriální aktivita. Díky výborným výsledkům, kdy minimální inhibiční koncentrace několika derivátů dosáhly hodnot 1 µM proti M. tuberculosis, byly vyvinuty metody syntézy vybraných analogů a provedena rozsáhlá strukturně-aktivitní studie (Obr. 1).

Obr. 1. Obecný vzorec studovaných sloučenin U všech připravených látek byla stanovena in vitro antimykobakteriální aktivita proti 4 sbírkovým kmenům mykobakterií, u vybraných látek pak navíc vůči šesti multidrugresistentním kmenům mykobakterií, osmi bakteriálním a osmi fungálním kmenům. Nejnadějnější látky byly hodnoceny z hlediska cytotoxicity na izolovaných lidských hepatocytech a vybraných buněčných liniích.

Tato práce vznikla za podpory Univerzity Karlovy v Praze (Projekt SVV 267 001)

48

S-10

DERIVÁTY PYRAZINAMIDU JAKO POTENCIÁLNÍ INHIBITORY MYKOBAKTERIÁLNÍ ENOYL-REDUKTASY ONDŘEJ HOLAS 1, BARBORA SERVUSOVÁ 1, JAN ZITKO 1, MARTIN DOLEŽAL 1 Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected] 1

Tuberkulóza zůstává jedním z předních světových infekčních onemocnění nejen v rozvojových zemích. Téměř jedna třetina populace je nositelem latentní formy nákazy, to je potenciálně nebezpečným zdrojem nákazy. Rezistentní kmeny Mycobacterium tuberculosis a možnost nosokomiální nákazy jsou v současné době vysoce problematické. M. tuberculosis, M. avium, v menší míře M. kansasii a M. intracelulare jsou často spojovány s úmrtím HIV/AIDS pacientů. Počet těchto úmrtí dosahuje ročně až tří milionů. Současná terapie se sestává z kombinace antituberkulotik první volby pyrazinamidu, rifampicinu, isoniazidu, streptomycinu a ethambutolu podávaných po dobu šesti měsíců. Tato léčiva jsou schopna zabít pouze aktivně metabolizující buňky mykobakteria. Tzv. spící formy mykobakteria jsou k této léčbě málo citlivé, což významně zvyšuje schopnost rezistence některých kmenů. Tato fakta činí vývoj nových, lépe tolerovaných léčiv, s nižším výskytem rezistence a schopností ničit latentní formy mykobakteria ještě důležitější [1]. Pyrazinamid (PZA) je důležitá sterilizující antimykobakteriální sloučenina, která pomáhá zkrátit dobu trvání současné standardní terapie. Mechanismus účinku PZA není dodnes uspokojivě vysvětlen, přestože je intenzivně studován. Bylo prokázáno, že kyselina pyrazinkarboxylová (POA) je účinnou formou PZA. POA je schopna ovlivňovat některé životně důležité pochody a narušovat tak integritu mykobakteriálních buněk. Velkou výhodou použití PZA je jeho účinnost při nízkém pH v lézích M. tuberculosis. Bylo prokázáno, že některé deriváty (např. 5-chlorpyrazinamid) jsou schopny inhibovat mastných kyselin ovlivněním komplexu FAS I a II), které se podílejí na syntéze mykolových kyselin mykobakteriální buněčné stěny. FAS I se podílí na syntéze mykolových kyselin s krátkým řetězcem. FAS II zprostředkovává syntézu mykolových kyselin s dlouhým řetězcem. Jedním z klíčových enzymů FAS II je enoyl-ACP-reduktasa (InhA, E.C.1.3.1.9). Některé inhibitory InhA se používají jako antimykobakteriální léčby (isoniazid, ethionamid, triklosan) [2]. Cílem této molekulárně modelovácí studie několika sérií derivátů pyrazinamidu a pyrazinanilidu bylo ověřit inhibici InhA jako možný mechanismus působení těchto sloučenin. Pro samotné výpočty byl použit software AutoDock Vina 1.1.2. Lamarckovský genetický algoritmus (Amber Force Field) byl použit pro nalezení nejvhodnější prostorové orientace léčiva v aktivním místě enzymu. Vyhodnocení vazebné energie komplexu enzym inhibitor bylo provedeno pomocí Autodock Vina [3]. Struktura mykobakteriální InhA byl připraven z krystalové struktury (pdb no: 4DRE) pomocí AutoDock Tools 1.5.4. Molekulární modely

49

ligandů byly připraveny pomocí Java Molecule Editor a minimalizovány pomocí UCSF Chimera 1.6.2. Pro vizualizaci a analýzu enzym-ligand interakcí byl použit 1.5 PyMOL. Výsledky dockingu více než 150 sloučenin naznačují vliv π-π interakcí aromatické části inhibitoru s Phe 41 a tvorbu vodíkové vazby s Gly 96 Ser 20 a Ser 94. Vliv substituce anilidické části náhrady inhibitoru bude předmětem dalšího zkoumání. Výsledky byly porovnány se známými inhibitory. Některé sloučeniny vykazují afinitu k aktivnímu místu InhA srovnatelnou s isoniazidem a vyšší než triklosan.

[1] WHO Report 2009 - Global Tuberculosis Report. Geneva: WHO Press, 2012. [2] Ngo, S.C.; Zimhony, O.; Chung, W.J.; Sayahi, H.; Jacobs, W.R.; Welch, J.T. Antimicrob. Agents Chemother. 2007, 51, 2430-2435 [3] Trott, O.; Olson, A. J. J. Comp. Chem. 2010, 31, 455-461 The study was supported by the European Social Fund and the state budget of the Czech Republic. Project no. CZ.1.07/2.3.00/20.0235, the title of the project: TEAB; Charles University in Prague. Project no. PRVOUK P4

0 Drug Development and Study

50

S-11

NÍZKOMOLEKULOVÉ NOSIČE DNA PISÁRČIK MARTIN, POLAKOVIČOVÁ MÁJA, DEVÍNSKY FERDINAND Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra chemickej teórie liečiv, Kalinčiakova 8, 83232 Bratislava; [email protected]

Génová terapia je nový spôsob liečby ochorení v prípadoch, keď tradičná terapia je často nepostačujúca. Génová terapia je druh experimentálnej liečby, kde poškodené gény s nesprávnou funkciou sú opravené novými aplikovanými génmi. Najjednoduchšia forma génovej terapie je zavedenie chýbajúceho alebo zmeneného génu do bunkového jadra. Problémom etablovania sa génovej terapie ako liečby chorôb je efektívne zavedenie DNA do bunkového jadra (transfekcia). Génová terapia sa zaoberá účinným prenosom liečiv do bunkového jadra a tým musí riešiť problém rozpustnosti liečiva a účinok liečiva pred jeho metabolizáciou [1]. Zavedenie génu do bunky môže prebiehať prostredníctvom virálneho alebo nevirálneho prenosu. Použitie virálneho vektora na zavedenie génu do bunky je veľmi účinné, ale existuje vysoká pravdepodobnosť vytvorenia silnej imunologickej reakcie. Použitie virálnych vektorov je obmedzené aj veľkosťou plazmidu, ktorý je nosičom génu [2]. Transfekcia nevirálnym nosičom Ako sľubné riešenie sa ukazuje génová terapia prostredníctvom nevirálnych, nosičov, ktorá je založená na schopnosti polyaniónu DNA viazať malé molekuly. Významnú úlohu tu zohrávajú katiónové povrchovoaktívne nosiče, tenzidy. Výhodou nevirálnych vektorov je, že nevytvárajú imunologickú odpoveď, nie sú limitované veľkosťou génu, ktorý môžu uzavrieť, sú relatívne lacné a ľahko produkovateľné. Hlavná nevýhoda nevirálnych vektorov spočíva v ich nízkej účinnosti transfekcie [2]. Pred vstupom do jadra sa musí DNA dostať do bunky. DNA sa dostane do bunky až po kondenzácii vhodnými látkami. Použitím klasických katiónových nosičov sa kondenzácia reťazca dosahuje kombináciou elektrostatických a hydrofóbnych interakcií. Preto prvým a nevyhnutným krokom pri prechode DNA bunkovou membránou je vytvorenie komplexu nukleovej kyseliny s katiónovým nosičom. Prechod komplexu cez bukovú membránu sa pravdepodobne realizuje tzv. endocytózou, ktorý predstavuje riadené vnorenie komplexu DNA do bunkovej membrány a jeho obalenie časťou bunkovej membrány, čím sa vytvorí útvar nazývaný endozóm. DNA vo vnútri bunky sa z komplexu s nízkomolekulovým nosičom uvoľňuje a prechádza jadrovou membránou: Celý proces je zobrazený nasledujúcou grafickou schémou [1].

51

Komplex DNA – nízkomolekulový nosič V dôsledku komplexácie s nízkomolekulovým katiónovým nosičom (ktorým sú najčastejšie molekuly tenzidu) prechádza DNA z formy vystretého reťazca do tzv. guľovej globuly, nastáva takzvaná kondenzácia alebo kompakcia DNA. Experimenty potvrdili účinnú kondenzáciu DNA katiónovými jednoreťazcovými a predovšetkým dvojreťazcovými bisamóniovými, tzv. gemini tenzidmi [2]. Uvoľnenie DNA z komplexu s nízkomolekulovým nosičom Veľmi dôležitým procesom je uvoľnenie alebo dekondenzácia DNA z komplexu s nízkomolekulovým nosičom. Pretože kladne nabitý katiónový nosič viaže DNA v komplexe relatívne pevnými príťažlivými elektrostatickými silami, jej uvoľnenie z komplexu musí nastať v dôsledku ďalších vonkajších faktorov v prostredí bunky, resp. pridaním ďalších látok indukujúcich uvoľnenie. V tejto oblasti panuje ešte veľa nevyriešených otázok. Na základe súčasných experimentov sa účinné uvoľnenie DNA z komplexu predpokladá depolymerizáciou polyamidoamínov ako katiónových nosičov DNA a účinkom ďalších látok prítomných v komplexe ako sú napr. chitózany a cyklodextríny [3] . Literatúra 1. A. Kirby, P. Camilleri, J.B.F.N. Engberts, M.C. Feiters, R.J.M. Nolte, O.Söderman, M. Bergsma, P.C. Bell, M.L. Fielden, C.L. García Rodríguez, P. Guédat, A. Kremer, C. McGregor, C. Perrin, G. Ronsin, M.C.P. van Eijk. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (2003) 144 8–1457. 2. S.D.Wettig, R.E. Verrall, M. Foldvari. Current Gene Therapy, 8 ( 2008) 9-23. 3. J. Carlstedt, D. Lundberg, R.S. Dias, B. Lindman. Langmuir 28 (2012) 7976−7989.

52

S-12

SENZORICKÉ VLASTNOSTI AZAFTALOCYANINŮ NOVÁKOVÁ VERONIKA, ZIMČÍK PETR Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected]

Azaftalocyaniny (AzaPc) jsou planární makrocyklické molekuly s unikátními absorpčními a fotofyzikálními vlastnostmi. Díky rozsáhlému systému konjugovaných vazeb jsou schopny absorbovat světlo delších vlnových délek (přes 650 nm) a následně ho vyzářit ve formě fluorescence. Z tohoto důvodu se staly předmětem našeho zájmu pro využití v oblasti fluorescenčních senzorů. Principem jejich senzorických vlastností je zhášení fluorescence vlivem tzv. intramolekulárního přenosu náboje (ICT) mezi periferní aminoskupinou a makrocyklickým systémem. Toto zhášení probíhá pouze v případě, je-li k dispozici volný elektronový pár na periferním dusíku („OFF stav“ senzoru). Pokud je však tento volný elektronový pár použit na vazbu vodíku nebo kationtu kovu, dojde k zablokování ICT a tedy k obnovení fluorescence („ON stav“). Po studiu různých aspektů ovlivňujících účinnost ICT (počet donorových alkylaminových skupin a substituentů v jejich blízkosti, apod.) byly připraveny dvě série AzaPc. První skupina byly deriváty citlivé k pH prostředí (pH senzory)1, u druhé skupiny derivátů pak byla testována citlivost ke kationtům kovů (senzory pro Na+, K+; viz obr. níže)2. V obou sériích byl pozorován vysoký nárůst fluorescence okyselením roztoku až 110× (u pH senzorů), respektive přidáním analytu až 11× (senzory pro Na+, K+). Připravené senzory mají výrazný poměr fluorescence mezi OFF-ON stavem, jejich velkou výhodou je absorpce a emise při delších vlnových délkách, které neinterferují s endogenními chromofory v biologickém materiálu. Práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury České republiky (P207/11/1200).

1

V. Novakova, M. Miletin, K. Kopecky, P. Zimcik, Chem. Eur. J. 2011, 17, 14273

2

V. Novakova, L. Lochman, I. Zajícová, K. Kopecky, M. Miletin, K. Lang, K. Kirakci, P. Zimcik, Chem. Eur. J. 2013, 19, 5025.

53

S-13

GENEROVANIE VIRTUÁLNEJ KNIŽNICE BENZÉNSULFÓNAMIDOVÝCH DERIVÁTOV OBSAHUJÚCICH S-TRIAZÍN A VIRTUÁLNY SKRÍNING NA KARBOANHYDRÁZE IX GARAJ VLADIMÍR Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra farmaceutickej chémie, Odbojárov 10, 831 04 Bratislava; [email protected]

Všetky bunky exprimujú viacero izoenzýmov karboanhydrázy (CA). Nádorové bunky exprimujú membránové CA IX a CA XII, ktorých expresia je riadená hipoxiou indukovaným faktorom (HIF). CA IX má vyššiu extracelulárnu aktivitu ako CA XII a zatiaľ čo expresia HIF-1α a CA IX v nádoroch koreluje s úmrtnosťou pacientov, význam CA XII je menej zjavný [1]. Potvrdilo sa, že inhibícia CA IX spomaľuje rast aj metastazovanie hypoxických nádorov. Keďže niektoré benzénsulfónamidy s s-triazínovým jadrom sa ukázali ako inhibítory CA IX s vysokou afinitou a selektivitou [2], uskutočnil som virtuálnu kombinatorickú prípravu ďalších takýchto derivátov a vytvorenú knižnicu obsahujúcu vyše 8 mil. molekúl som dokoval do aktívneho miesta CA IX. Výsledkom sú látky, ktoré by po chemickej syntéze mohli pri biologickom testovaní ukázať ešte vyššiu inhibičnú účinnosť a selektivitu. NH R N

O [CH 2]n NH

S H2N

N N

O n=0,1,2

NH R

Práca bola uskutočnená vďaka grantovej podpore VEGA 1/0743/13.

Zoznam použitej literatúry: 1. Chiche, J. et al.: Hypoxia-Inducible Carbonic Anhydrase IX and XII Promote Tumor Cell Growth by Counteracting Acidosis through the Regulation of the Intracellular pH. Cancer Research 69 (1), 2009, p. 358-368 2. Carta, F. et al.: Sulfonamides incorporating 1,3,5-triazine moieties selectively and potently inhibit carbonic anhydrase transmembrane isoforms IX, XII and XIV over cytosolic isoforms I and II: Solution and X-ray crystallographic studies. Bioorganic & Medicinal Chemistr, 19 (10), 2011, p. 3105-3119

54

S-14

SLEDOVÁNÍ KINETIKY MUTAROTACE MONOSACHARIDŮ A JEJICH DERIVÁTŮ POMOCÍ HPLC PAZOUREK JIŘÍ Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně, Farmaceutická fakulta, Ústav chemických léčiv, Palackého 1-3, 612 42 Brno, [email protected]

Sacharidy představují velmi důležitou součást jak přírodních, tak syntetických léčiv i přirozenou složku potravy člověka. Proto jejich analýza představuje významnou část metod analytické chemie. Hydrofilní interakční kapalinová chromatografie (HILIC, Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) se mj. používá pro separaci sacharidů, obvykle na aminopropylsilylové stacionární fázi, která však neumožňuje separaci anomerů [1]. Typické pro HILIC je použití polární stacionární fáze a mobilní fáze s velkým obsahem organické fáze (např. 70-90% acetonitrilu). Obtížnost identifikace sacharidů představuje především existence řady isomerů, které jsou navíc velice polární. Oba tyto důvody limitují možnosti LC-MS. Přesto již byla popsána metoda umožňující separaci a identifikaci anomerů i jejich pyranosové a furanosové formy u monosacharidů pomocí HPLC [2]. Dalším analytickým problémem také může být absence vhodného chromoforu pro citlivou UV-detekci. Refraktometrický detektor neumožňuje pracovat s gradientovou HPLC; zde je možným řešením použití ELSD (Evaporative light scattering detector). V tomto případě však bylo dosaženo separace anomerů na polární koloně Lichrosphere100 DIOL (Merck) v módu HILIC s použitím detektoru ELSD. Metoda je velice rychlá (retenční čas monosacharidů do 4 minut) a proto opakovaný nástřik čerstvě připraveného roztoku umožňuje monitorovat kinetiku mutarotace, např. glukosy či N-acetyl-glukosaminu. Pomocí kalibrace lze přepočítat získané signály na množství forem anomerů a vyčíslit rychlostní konstanty mutarotace. Tuto rychlou a relativně jednoduchou metodu lze tedy použít pro přímé sledování mutarotace monosacharidů jako alternativu k obvykle používaným, ale technicky i finančně mnohem náročnějším analýzám směsí pomocí např. NMR nebo výjímečně dostupným separačním metodám např. LC-NMR.

55

Obr.1 Série chromatogramů při časovém měření vodného roztoku N-acetyl-glukosaminu, c=2 mg/ml. Kolona Lichrosphere100 DIOL (Merck) 150x4 mm, MF=acetonitril/voda (90:10), t=25°C. Měření byla prováděna zhruba v šestiminutových intervalech po dobu jedné hodiny. Klíčová slova: kinetika mutarotace, identifikace isomerů, HILIC. Literatura 1. 2.

Verhaar, L. A. T., Kuster, B. F. M., J. Chromatogr. A 1982, 234, 57-64. Pazourek, J.: J. Sep. Sci. 33(6-7), 2010, 974 – 981.

56

Postery

57

P-1

VYUŽITIE TANDEMOVEJ HMOTNOSTNEJ SPEKTROMETRIE V PREDFORMULAČNÝCH ŠTÚDIÁCH LIEKU S OBSAHOM REKOMBINANTNÉHO α-TROMBÍNU BARTOŠ PETER 1, MURÁNYI ANDREJ 1,2, ŠNAUKO MARIÁN 1, ČULÁKOVÁ VIERA1 1

hameln rds a.s., Horná 36, 900 01, Modra, [email protected];

Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra galenickej farmácie, Odbojárov 10, 821 08, Bratislava 2

ÚVOD, CIEĽ Trombín je serínová proteáza s nezastupiteľným miestom v procese hemokoagulácie. Katalyzuje premenu fibrinogénu na fibrín, pomocou aktivácie faktora XIII napomáha zosieťovaniu fibrínový vlákien a aktivuje trombocyty. Rekombinantný ľudský trombín (rhTrombín) má porovnateľnú účinnosť a bezpečnostný profil ako trombín hovädzí či ľudský avšak nižšie riziko vzniku imunologickej reakcie, či prenosu patogénov krvnej plazmy. rhTrombín pozostáva z dvoch reťazcov, navzájom spojených jednoduchou disulfidovou väzbou, pričom podlieha špecifickej autokatalýze za vzniku niekoľkých degradačných produktov. Hmotnostná spektrometria sa bežne používa pri vývoji proteínových liečiv na charakterizáciu ich primárnej štruktúry a stanovenie molekulovej hmotnosti. Cieľom práce bolo zavedenie a optimalizácia metódy LC/MS na kvalitatívne stanovenie trombínu a jeho degradačných produktov pre potreby predformulačného skríningu jeho stability. VÝSLEDKY, ZÁVER Vzorky rekombinantného ľudského trombínu s rôznym pH podrobené tepelnej záťaži a opakovanému zmrazovaniu/rozmrazovaniu boli analyzované metódou reverznofázovej kvapalinovej chromatografie s hmotnostne selektívnou detekciou pomocou ionizácie elektrosprejom (LC-ESI-MS). Separácia sa uskutočnila na chromatografickej kolóne Zorbax 300SB-C-8. Získané dáta sa podrobili softvérovej dekonvolúcii a stanovili sa molekulové hmotnosti hlavných degradačných produktov. Zavedená metóda je vhodná na potvrdenie totožnosti trombínu a stanovenie molekulových hmotností jeho rozkladných produktov. V spojení s UV detekciou umožňujúcou aj kvantitatívne stanovenie je efektívnym nástrojom pri vývoji lieku s obsahom rhTrombínu. Táto práca vznikla s podporou projektu „Priemyselný výskum nových liečiv na báze rekombinantných proteínov“, kód ITMS: 26240220034. Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ. LITERATÚRA Lane, D.A. Philippou, H. Huntington, J.A: Directing thrombin. Blood (2005); 106: 2605-2612 P.D. Bishop, K.B Lewis, J. Schultz, K. M. Walker: Semin Thromb Hemost. 32 (2006); Suppl 1:86

58

P-2

VPLYV SEKUNDÁRNYCH METABOLITOV RASTLÍN A ICH KOMPLEXOV NA AKTIVITU LIPOXYGENÁZY V ŽIVOČÍŠNYCH TKANIVÁCH BEZÁKOVÁ LÝDIA 1, BAUEROVÁ KATARÍNA 2, OBLOŽINSKÝ MAREK 1, HOFFMAN PETER 1, PEKÁROVÁ MÁRIA 1, BUKVIAR MARTIN 1, KOŠŤÁLOVÁ DANIELA 3, VEVERKA MIROSLAV 4 Katedra bunkovej a molekulárnej biológie liečiv, Farmaceutická fakulta, Univerzita Komenského, Kalinčiakova 8, 832 32 Bratislava, Slovenská republika, e-mail: [email protected] 1

2 Ústav

experimentálnej farmakológiea toxikológie, SAV, Dúbravská cesta 9, 841 04 Bratislava, Slovenská republika 3 Oddelenie

výživy a hodnotenia potravín, Ústav biochémie, výživy a ochrany zdravia , Fakulta chemickej a potravinárskej technológie Slovenskej technickej univerzity, Radlinského 9, 812 37, Bratislava, Slovenská republika 4Bel

Novamann s.r.o Kollárovo nám. 9 811 07 Bratislava, Slovenská republika

Lipoxygenázy (LOXs) patria do génovej rodiny dioxygenáz s obsahom nehemového železa v aktívnom mieste katalytickej domény. LOXs zodpovedajú za oxygenáciu polynenasýtených mastných kyselín za vzniku hydroperoxidových derivátov. U cicavcov je optimálnym substrátom LOX kyselina arachidónová, na báze polohovej špecifity dvojnej väzby rozlišujeme pre živočíšne tkanivá špecifické izoenzýmy LOX (5-LOX, 8-LOX, 12-LOX, 15-LOX). Hydroperoxidy kyseliny arachidónovej (HpETE) sú základom pre biosyntézu mediátorov zápalových, alergických, nádorových a degeneratívnych patologických dejov. Preto jednou z možností terapeutického ovplyvnenia týchto procesov je aj zníženie expresie LOX prostredníctvom jej inhibície. Výraznými inhibítormi LOX sú aj sekundárne rastlinné metabolity – polyfenoly. Pri ich uplatnení v terapii je však nevýhodou ich nízka biologická dostupnosť. Keďže polyfenoly majú afinitu k fosfolipidom, jednou z ciest zvýšenia biologickej dostupnosti je komplexácia ich molekúl do fosfolipidových vezikúl nazývaných fytozómy. V in vivo experimentoch sme sledovali vplyv vyvolania adjuvantnej artritídy na zvýšenie expresie LOX v cytozolovej aj mikrozomálnej frakcii tkaniva pečene potkana. V cytozolovej frakcii v skupine s experimentálne navodenou adjuvantnou artritídou sa zvýšila aktivita LOX takmer dvojnásobne oproti kontrole. Zároveň sme sledovali mieru zníženia aktivity LOX v jednotlivých experimentálnych skupinách zvierat, ktorým bol počas 28 dní podávaný metotrexát, N-feruloylserotonín (NFS) a ich kombinácia. U metotrexátu sme pozorovali výrazné zníženie aktivity LOX z hodnoty 282,35 kat.ml-1 na hodnotu 180,26 kat.ml-1, avšak pri súčasnom podávaní NFS nastala potenciácia inhibičného účinku. Podobné tendencie boli pozorované aj v prípade mikrozomálnej frakcie. V in vitro pokusoch sme sledovali vplyv komplexácie flavonoidu kvercetínu do fytozómových vezikúl na jeho antilipoxygenázovú aktivitu oproti voľnému kvercetínu. Porovnávali sme mieru inhibičnej aktivity voľného

59

kvercetínu a dvoch fytozómových komplexov fosfolipid:kvercetín 2:1. Zaznamenali sme výrazné zvýšenie antilipoxygenázovej aktivity fytozómových komplexov kvercetínu oproti voľnému kvercetínu. Hodnota IC50 fytozómových komplexov sa pohybovala v rozsahu 5,99.107 mol.l-1 až 1,30.10-6 mol.l-1, kým hodnota IC50 voľného kvercetínu bola 9,01.10-6 mol.l-1 až 1,05.10-5 mol.l-1 .

Úloha bola riešená za podpory grantu VEGA 1/0885/13 a VEGA 2/0045/11

60

P-3

LC-MS ANALYSIS OF A PUTATIVE ACTIVE FORM OF DEXRAZOXANE - ADR-925 IN BIOLOGICAL SAMPLES BURES JAN 1, VAVROVA ANNA 1, JIRKOVSKY EDUARD 2, LENCOVA OLGA 2, SIMUNEK TOMAS 1, STERBA MARTIN 2, KLIMES JIRI 1, KOVARIKOVA PETRA 1 1Faculty

of Pharmacy in Hradec Kralove, Charles University in Prague; [email protected]

2Faculty

of Medicine in Hradec Kralove, Charles University in Prague

ADR-925 is considered to be a pharmacologically active metabolite of a cardioprotective drug dexrazoxane (DEX). The generally accepted theory suggests that ADR-925 formed by an enzymatic bioactivation of DEX inside cardiomyocytes and its iron chelation ability is responsible for the drug cardioprotection. However, growing scientific evidence suggests the potential involvement of other mechanisms (e.g. inhibition of topoisomerase II by parent DEX or ADR-925). Hence further investigations are needed to disclose DEX mechanism of cardioprotection. The aim of this study was to utilize LC-MS to asses concentration of ADR-925 in neonatal isolated cardiomyocytes (NVCM) after incubation with this compound in vitro and to analyze samples (plasma, heart) taken from a preliminary in vivo experiment with ADR-925. The analyses were performed on chromatographic column Synergi Polar-RP using a mobile phase composed of 2 mM ammonium formate and methanol in a gradient mode. 1,3-diaminopropane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid was used as an internal standard. All biological samples were treated by precipitation with methanol. The method was validated for the analysis of ADR-925 within the range of 7-70 pmol in 106 NVCM, 8-100 µM in cell media, 5-100 µM in rabbit plasma and 2-100 pmol/mg in heart tissue. ADR-925 (100 µM) was incubated with NVCM for 24 hours. Samples were taken in selected intervals and analyzed. In preliminary in vivo experiment 60 mg/kg of ADR-925 was administered i.v. to three rabbits. Furthermore, two of them were injected with additional 60 mg/kg of this compound either s.c. or i.p. in 90 and 210 minutes of the experiment. Plasma samples were taken in different time intervals while heart tissue samples were analyzed at the end of the experiment (360 min). This study provided information regarding penetration of ADR-925 to cardiomyocytes in vitro and the resulted concentration time-profile will be compared to those obtained from incubation with DEX. The analysis of samples from in vivo study allowed getting first data about the concentration of ADR-925 in plasma and heart followed its administration to rabbits and will be used to set up comprehensive pharmacokinetic experiment. All acquired data will be utilized in further complex investigation aimed at understanding of mechanism of DEX/ADR cardioprotection. This study was supported by Czech Science Foundation (project No. 13-15008S) and SVV 267001.

61

P-4

SYNTÉZA NEPERIFERNĚ SUBSTITUOVANÝCH FTALOCYANINŮ ALKYLSULFANYLOVÝMI JEDNOTKAMI CIDLINA ANTONÍN 1, NOVÁKOVÁ VERONIKA 2, ZIMČÍK PETR 1 Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected] 1

Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra biofyziky a fyzikální chemie, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové 2

Ftalocyaniny (Pc) jsou planární makrocyklické molekuly s unikátními fotofyzikálními a fotochemickými vlastnostmi, které lze úspěšně ovlivňovat polohou a typem periferních substituentů a druhem centrálního kationtu kovu. Tato práce se zabývá přípravou Pc s různými alkylsulfanylovými jednotkami (terc-butyl, n-butyl, pentan-3-yl) vázaných v neperiferních alfa polohách makrocyklu (Obrázek 1). Prvním krokem práce byla syntéza prekurzorů, 3,6-disubstituovaných ftalonitrilů, pro následnou cyklotetramerizaci. Prekurzory byly připraveny nukleofilní substitucí 3,6-ditosylftalonitrilu s příslušným alkylthiolátem. Cyklotetramerizační reakce byla provedena pomocí butanolátu hořečnatého jako iniciátoru reakce. Takto připravené hořečnaté komplexy Pc byly hodnoceny z hlediska jejich spektrálních vlastností. U Pc substituovaného terc-butylsulfanylovými skupinami byl pozorován výrazný hypsochromní posun absorpčního maxima (Obrázek 2), který je pravděpodobně způsoben předpokládanou torzí makrocyklu [1]. Tento jev bude dále zkoumán.

Absorbance (a.u.)

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 400

600 nm, 

Obrázek 1.

Obrázek 2.

Reference: 1. Chambrier I., Cook J. M., Wood T. P. Chem. Commun., 2000, 2133–2134.

62

800

P-5

OPTIMALIZÁCIA ZLOŽENIA GÉLOV S CHLÓRHEXIDÍNOM A BENZETÓNIUM CHLORIDOM ČIŽMÁRIK JOZEF 1, VITKOVÁ ZUZANA 2, HERDOVÁ PETRA 2, OREMUSOVÁ JARMILA 3, HALÁSOVÁ JANA 2 1

Katedra farmaceutickej chémie, Farmaceutická fakulta, Univerzita Komenského, Bratislava; [email protected]

2 Katedra

galenickej farmácie, Farmaceutická fakulta, Univerzita Komenského, Bratislava

3 Katedra

fyzikálnej chémie liečiv, Farmaceutická fakulta, Univerzita Komenského, Bratislava

Príspevok je zameraný na štúdium vplyvu katiónového tenzidu zo skupiny kvartérnych amóniových solí na tokové vlastnosti a liberáciu chlórhexidínu z gélov. Vo funkcii gélotvornej látky bol použitý chitosan (CHIT) v koncentrácii 2,5%. Liečivo chlórhexidín (CHX), ktorý patrí medzi antimikrobiálne pôsobiace látky bolo použité v koncentrácii 0,1%. Benzetónium chlorid (BZCl) - katiónový tenzid bol pridávaný do hydrogélov v koncentrácii 0,1% - 1%. Gélotvorná látka sa dispergovala v 1% roztoku kyseliny mliečnej, ktorý zabezpečil optimálne slabo kyslé prostredie. Liberácia liečiva sa hodnotila počas 3 hodín na základe kumulovaných uvoľnených množstiev. Namerané hodnoty pH hydrogélov sa pohybovali v rozmedzí (5,66 – 5,98), vhodným na dermálnu aplikáciu. Z hľadiska tokových vlastností gélov bol zistený tixotropný charakter sústav. Pre študovaný hydrogél sa ako najmenej vyhovujúci ukázal prídavok benzetónium chloridu v koncentrácii 1%. Efektívne dosiahnutie liberácie s takmer maximálnym uvoľneným liečivom bolo zabezpečené prítomnosťou benzetónium chloridu v koncentrácii 0,1%. Na základe dosiahnutých výsledkov sa stanovil gél s optimálnym zložením: 2,5% CHIT + 0,1% CHX + 0,1% BZCl. Tento výskum bol podporený grantom VEGA č. 1/0024/11 a grantom FaF UK 3/2013. Kľúčové slová: chlórhexidín – chitosan – benzetónium chlorid – liberácia – tokové vlastnosti.

63

P-6

SYNTÉZA A HPLC-ENANTIOSEPARÁCIA ZLÚČENÍN S PREDPOKLADANÝM BETA-1-SYMPATOLYTICKÝM ÚČINKOM ČIŽMÁRIKOVÁ RUŽENA 1, NÉMETHY ANDREJ 1, HROBOŇOVÁ KATARÍNA 2, VALENTOVÁ JINDRA 1 1Univerzita

Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta , Katedra chemickej teórie liečiv, Kalinčiakova 8, 821 08 Bratislava, [email protected] 2 Slovenská

technická Univerzita v Bratislave, Fakulta chemickej a potravinárskej chémie Ústav analytickej chémie, Radlinského 9, 812 37 Bratislava.

Úvod: V skupine beta-adrenolyticky účinkujúcich zlúčenín v hydrofilnej časti molekuly okrem izopropylovej a terc-butylovej skupiny vyššiu kardioselektivitu zabezpečuje i objemná 3,4-dimetoxyfenetylová skupina (1). Cieľ: V rámci štúdia vzťahu štruktúry a účinku bolo cieľom doplniť predchádzajúcu sériu zlúčenín odvodenú od 2- alebo 4-hydroxyfenyletanónu a 2-alebo a 4-hydroxymetylpropan-1ónu s 3,4-dimetoxyfenetylom v bázickej časti molekuly, ktoré vykazovali v porovnaní s celiprololom vysokú kardioselektivitu (2). Metodika: Pri syntéze nových zlúčenín sa osvedčil 4-stupňový syntetický postup založený na reakcii pripravených oxiránov s 3,4-dimetoxyfenetylamínom. Finálne zlúčeniny boli izolované vo forme voľných báz a solí s kyselinou fumárovou. Ich čistota bola overená chromatografiou na tenkej vrstve a štruktúra bola potvrdená vyhodnotením spektier (1H-NMR, 13C-NMR, IČ, UV). U pripravených zlúčenín bola sledovaná HPLC enantioseparácia na viacerých chirálnych kolónach. Na delenie bola použitá i frakčná kryštalizácia založená na diastereoizomérnych soliach s kyselinou ditoluylvínnou. Výsledky a záver: V práci boli pripravené nové deriváty s 3,4-dimetoxyfenetylom v hydrofilnej časti molekuly. Z HPLC delenia na chirálnych kolónach (Chiralpak AD, teikoplanin, vankomycín). Boli vypočítané chromatografické charakteristiky Pripravené zlúčeniny vykazovali lepšiu enantioseparáciu na chirálnych kolónach s chirálnym selektorom typu makrocyklických antibiotík. 1. Jackman, G.P., Iakovidis, D., Nero, T. L.: Eur. J.Med. Chem. 37, 2002, 731- 741. 2. Čižmáriková R., Račanská R., Hroboňová K., Lehotay J., Ághová Z., Halešová D.: Pharmazie 58, 2003, 237-241. Práca vznikla vďaka podpore Európskeho projektu Centrum excelentnosti bezpečnostného výskumu kód ITMS: 26240120034.

64

P-7

NEW POTENTIAL ANTITUBERCULAR AGENTS WITH TETRAZOLE RING MODIFICATION ČONKA PATRIK 1, ROH JAROSLAV 1, HRABÁLEK ALEXANDR 1 1Charles

University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Department of Inorganic and Organic Chemistry, Heyrovského 1203, 50005 Hradec Králové, Czech Republic; [email protected]

The investigation for new antituberculotics is an important task for medicinal chemistry nowadays. We focused our effort to synthesis of 1-alkyl-5-benzylsulfanyl-1H-tetrazoles 1 and 2-alkyl-5-benzylsulfanyl-2H-tetrazoles 2 (Figure 1). These compounds exhibit high antimycobacterial activity.

Figure 1. Antimycobacterially active compounds In this work, derivatives with various side chains on tetrazole ring, which are probably responsible for the pharmacokinetics, were prepared and their antimycobacterial activity were evaluated.

The work was supported by the European Social Fund and the state budget of the Czech Republic. Project no. CZ.1.07/2.3.00/30.0061

65

P-8

FYTOCHEMICKÁ ANALÝZA VYBRANÝCH POLOPARAZITICKÝCH ROSTLIN ČELEDI OROBANCHACEAE DAŇKOVÁ IVANA, JIRCHOVSKÁ MICHAELA Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně, Farmaceutická fakulta, Ústav přírodních léčiv, Palackého 1-3, 612 42 Brno; [email protected]

Čeleď Orobanchaceae (zárazovité) zahrnuje v současném pojetí dvě morfologicky málo podobné skupiny rodů parazitických rostlin. K tradičním holoparazitickým rodům čeledi (např. rod Orobanche) byly na základě molekulárních analýz připojeny i parazitické rostliny původně řazené do čeledi Scrophulariaceae (krtičníkovité)[1]. V současné době tedy čeleď Orobanchaceae obsahuje jak nezelené, plně parazitické rostliny (kromě již zmíněné zárazy také např. rod Lathraea), tak rostliny poloparazitické (např. rody Bartsia, Euphrasia, Melampyrum, Odontites, Pedicularis, Rhinanthus, aj.). Práce je zaměřena na srovnávací analýzu obsahových látek čtyř poloparazitických rostlin uvedené čeledi, a to Melampyrum nemorosum L., Melampyrum sylvaticum L., Rhinanthus major L. a Euphrasia rostkoviana HAYNE. Dle údajů známých z literatury byly u všech zmíněných rostlin identifikovány iridoidní glykosidy, u některých z nich pak byla prokázána přítomnost flavonoidních a fenylpropanových sloučenin. Z usušených a oddělených částí zkoumaných rostlin byly jednotným způsobem připraveny methanolické extrakty a tyto byly podrobeny analýze pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi ve spojení s DAD. Identifikace látek byla prováděna na základě porovnání retenčního času a UV-VIS spektra s údaji v dostupné knihovně spekter a následně metodou společného nástřiku se standardem. Bylo zjištěno, že chemické složení extraktů je do určité míry podobné, ale liší se výrazně kvantitativně. U všech zkoumaných rostlin byla potvrzena přítomnost iridoidního glykosidu aukubinu, nejvyšší obsah této látky jsme zaznamenali v extraktu kořene M. sylvaticum. V extraktech R. major a E. rostkoviana jsme zjistili přítomnost fenylpropanoidního glykosidu akteosidu, nejvyšší obsah této látky byl v případě R. major v extraktu kořene, u E. rostkoviana v extraktu listu. U stejných rostlin se pravděpodobně nachází další fenylpropanoidní glykosid isoakteosid. Nově identifikovanou látkou byla také kyselina benzoová, která je dle našich výsledků zastoupena u tří analyzovaných druhů, a to u M. nemorosum, M. sylvaticum a R. major. Zmínka o výskytu kyseliny benzoové byla v literatuře nalezena ze zkoumaných rodů prozatím jen u Melampyrum arvense L., akteosid byl doposud identifikován pouze u rostlin rodu Euphrasia L.[2],[3] [1] THE ANGIOSPERM PHYLOGENY GROUP. Botanical Journal of the Linnean Society 141, pp. 399–436 (2003) [2] KIRMIZIBEKMEZ, H. et al. Phytotherapy Research 25 (1), pp. 142-146 (2010) [3] BLAZICS, B. et al. Journal of Chromatographic Science 49 (3), pp. 203-208 (2011)

66

P-9

SYNTÉZA HYDROXYNAFTALEN KARBOXAMIDŮ GONĚC TOMÁŠ, KOS JIŘÍ Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně, Farmaceutická fakulta, Ústav chemických léčiv, Palackého 1-3, 612 43 Brno; [email protected]

Úvod: Amidy kyseliny salicylové vykázaly celou řadu zajímavých biologických účinků – antimikrobiální, antiparazitální, antivirotický, antineoplastický, chelatační a herbicidní. Mezi cyklická analoga salicylanilidů můžeme řadit také hydroxynaftalenkarboxamidy. Cíl: Cílem práce bylo optimalizovat syntézu amidů kyseliny 2-hydroxy-1-naftoové, 1-hydroxy2-naftoové a 3-hydroxy-2-naftoové s aromatickou, alifatickou a alicyklickou substitucí na dusíku.

OH H N

R

O R: monosubstituované aniliny, alifatické aminy, alicyklické aminy, piperidin, pyrolidin Obr.1 Obecná struktura syntetizovaných látek

Metodika: Přítomnost hydroxyskupiny na naftalenovém jádře přináší obtíže v podobě možnosti její substituce halogenem, případně možnosti její reakce s jinými činidly (esterifikace, alkylace). Bylo proto vyzkoušeno větší množství metod přímé syntézy, případně s využitím chránících skupin. Výsledky: Průběh a výtěžky u jednotlivých metod byly značně rozdílné pro substituované aniliny, alifatické aminy a alicyklické aminy. Pro každou z těchto skupin byla optimalizována jiná metoda. Závěr: Byly nalezeny optimální způsoby syntézy jednotlivých typů hydroxynaftalen karboxamidů a syntetizováno více než sto nových látek s potenciální biologickou aktivitou.

67

P-10

PURIFIKÁCIA A IMUNOCHEMICKÉ STANOVENIE LIPOXYGENÁZY MAKU SIATEHO (PAPAVER SOMNIFEUM L.) HOLKOVÁ IVANA, BEZÁKOVÁ LÝDIA, BILKA FRANTIŠEK Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta,Katedra bunkovej a molekulárnej biológie liečiv,Kalinčiakova 8, 832 32 Bratislava; [email protected]

Mak siaty (Papaver somniferum L.) je vzhľadom na jedinečnú schopnosť tvorby ópiových alkaloidov farmaceuticky veľmi významný. Jednou z možností ako ovplyvniť endogénny obsah týchto látok v produkčných rastlinách je ovplyvnenie signálnych dráh, ktorých súčasťou je aj enzým lipoxygenáza. V práci sme sa zamerali na purifikáciu a charakterizáciu tohto enzýmu. Lipoxygenáza (LOX, EC 1.13.11.12) patrí do skupiny dioxygenáz. Je kľúčovým enzýmom v oktadekánovej (tzv. lipoxygenázovej) metabolickej ceste aktivovanej počas vývinu rastlín, a tiež v odpovedi rastlín na biotický alebo abiotický stres. Prostredníctvom niekoľkých purifikačných krokov - vysoľovania síranom amónnym, hydrofóbnej chromatografie (PhenylSepharose CL-4B), iónovovýmennej chromatografie (Q-Sepharose) a afinitnej chromatografie (linoleyl-aminopropyl agarose) sme z klíčnych rastlín maku siateho izolovali LOX. Prostredníctvom SDS polyakrylamidovej gélovej elektroforézy za denaturovaných podmienok a imunoblotingu sme stanovili relatívnu molekulovú hmotnosť na 81 kDa. Úloha bola riešená za podpory grantu FaF UK/21/2012 a FaF UK/17/2013.

68

P-11

EXTRAKCIA SYNEFRÍNU NA TUHEJ FÁZE Z MOČA PRE GC-MS HORÁKOVÁ RENÁTA, KUBINCOVÁ JANKA, DEVÍNSKY FERDINAND Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra chemickej teórie liečiv, Kalinčiakova 8, 832 32 Bratislava; [email protected]

Úvod: Synefrín, nazývaný aj oxedrín, je sympatomimetický alkaloid nachádzajúci sa v Citrus aurantium. Vykazuje rôzne typy farmakologickej aktivity ako je vazokonstrikcia, zvyšovanie krvného tlaku a relaxácia bronchiálneho svalstva. Extrakt z Citrus aurantium získaný z olúpaného ovocia v súčasnosti nadobudol značnú popularitu pri liečbe obezity ako alternatíva ku efedrínovým alkaloidom, ktoré boli zakázané z dôvodu nežiaducich účinkov, ktoré vyvolávali v organizme. Nové produkty sú označované ako „ephedra free“ a zvyčajne obsahujú extrakt z Citrus aurantium štandardizovaný na 3-6 % synefrínu. Cieľ: Vývoj extrakčnej metódy na tuhej fáze pre synefrín z biologického materiálu moč na SPE kolónkach Strata® Screen-C v rozmedzí pH = 6 – 12. Metodika: Na vyhodnotenie biologických vzoriek po extrakcii na tuhej fáze a následnej derivatizácii trifluóracetanhydridom v etylacetáte sa použila metóda GC-MS. Spracovávala sa vzorka 2 ml moča, do ktorej sa pridal synefrín, kofeín a dva vnútorné štandardy metylkofeín a difenylamín. Následne sa vzorka upravila na požadovanú hodnotu pH pomocou 2, 3 a 4 ml 0,1 M roztoku KH2PO4 s pH = 6 a 0,1 M K2HPO4 s pH = 10 a 11. Výsledky: Extrakčnej účinnosti predchádzala identifikácia zlúčenín, stanovenie ich retenčných časov. Následne sa stanovili extrakčné účinnosti synefrínu pri jednotlivých pH moča pre oba použité vnútorné štandardy (IS). Najlepšie výsledky pri IS metylkofeín tabuľka 1, difenylamín tabuľka 2. Tabuľka 1 Tabuľka 2 pH 6 10 11 12

Extrakč. účinnosť 43,1 % 14,9 % 46,4 % 15,9 %

pH 11 12

Extrakč. účinnosť 46,4 % 80,8 %

Záver: Najvyššia extrakčná účinnosť pre stanovenie synefínu v biologickej vzorke moč sa dosiahla 80,8 %, kde sa na úpravu vzorky použil tlmivý roztok 0,1 M K2HPO4 v objeme 4 ml pri vnútornom štandarde difenylamín. Práca vznikla s podporou grantu Centra excelentnosti bezpečnostného výskumu kód ITMS: 26240120034.

69

P-12

MODULÁTORY ABAD JAKO POTENCIÁLNÍ LÉČIVA ALZHEIMEROVY NEMOCI HROCH LUKÁŠ 1, BENEK ONDŘEJ 2, GUNN-MOORE FRANK 3, MUSÍLEK KAMIL 4 Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected] 1

Univerzita obrany, Fakulta vojenského zdravotnictví, Katedra toxikologie, Třebešská 1575, 500 01 Hradec Králové, Česká republika 2

3

University of St. Andrews, School of Biology, Medical and Biological Sciences Building, North Haugh, St. Andrews KY16 9TF, United Kingdom Univerzita Hradec Králové, Přírodovědecká fakulta, Katedra Chemie, Rokitanského 62, 500 03 Hradec Králové, Česká republika; [email protected] 4

Alzheimerova nemoc (AD) je jedno z nejčastějších neurodegenerativních onemocnění postihující starší populaci. Patogeneze AD je dlouho spojována s tvorbou extracelulárních plaků beta-amyloidu (Aβ). Dnes je známo, že významnou roli hraje také přítomnost intracelulárně lokalizovaného Aβ. Uvnitř buňky Aβ interaguje s řadou proteinů a narušuje jejich normální funkci. Jedním z postižených enzymů je mitochondriální enzym amyloid-vázající alkohol dehydrogenasa (ABAD), u kterého byla potvrzena přímá vazba s Aβ. Poškození ABAD přispívá k narušení homeostáze buňky a následně vede k jejímu zániku. Inhibice vazby ABAD-Aβ a ovlivnění aktivity ABAD představuje potenciální cíl v terapii AD. Cílem práce je syntéza a studium série sloučenin, disubstituovaných derivátů thiomočoviny. Základní struktura byla odvozena z již popsaného inhibitoru ABAD, frentizolu. Benzothiazolový fragment byl nahrazen za indolový fragment s další variabilní substitucí na thiomočovinovém skeletu. Byla navržena a připravena série 20 sloučenin, potenciálních modulátorů ABAD. Nové sloučeniny byly připraveny ve dvou krocích (Schéma 1). Identita a čistota sloučenin byla potvrzena pomocí 1H a 13C NMR, MS-ESI, elementární analýzy a teploty tání. V rámci spolupráce s University of St. Andrews bude provedeno in vitro testování sloučenin. Hodnocena bude schopnost ovlivnění aktivity ABAD a inhibice vazby ABAD-Aβ. U nejvíce potentních sloučenin bude provedena molekulárně modelovací studie.

70

Schéma 1

Příprava substituovaných indolyl thiomočovin.

Práce je spolufinancovaná Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. Registrační číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0235, název projektu: TEAB.

71

P-13

SYNTHESIS AND IN VITRO EVAUATION OF NOVEL AROYLHYDRAZONE IRON CHELATORS KATEŘINA HRUŠKOVÁ1, ELIŠKA MACKOVÁ2, LUCIE KOLBABOVÁ2, KATEŘINA PRAVDÍKOVÁ2, TOMÁŠ ŠIMŮNEK2, KATEŘINA VÁVROVÁ1 Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, 1Department of Inorganic and Organic Chemistry; [email protected] 2Department of Biochemical Sciences

For years aroylhydrazone iron chelators have been studied for their cardioprotective effect. Aroylhydrazones are tridentate chelators binding free intracellular Fe ions and therefore protect cardiomyocytes from reactions leading to formation of free radicals where iron stands as a catalyst. SIH (salicylaldehyde isonicotinoylhydrazone) showed cardioprotective effect as well as advantageous pharmacokinetic properties. Nevertheless it suffers from low stability in plasma1. Our research group previously prepared a number of SIH analogs with increased stability and pronounced cardioprotective effect along with low toxicity2. Some of the analogs also possess a promising antiproliferative activity3. The goal of our current work is to synthesize new aroylhydrazones based on our previous results in order to enhance their cardioprotective and antiproliferative effects. The current syntheses cover modifications of both ketone and hydrazide part of the molecule. Regarding the former, we aimed at ketones with nitro group in various positions on the phenyl ring and ketones with elongated or branched alkyl chain. For the evaluation of the influence of the hydrazide we prepared more lipophilic hydrazides and products with different nitrogen heterocycles. All final products will be subjected to studies of their chelation potential, stability, own toxicity, cardioprotective and antiproliferative activities.

This study was supported by Charles University projects 299511, SVV 265 001 and SVV 265 004. 1. 2. 3.

Šimůnek, T., et al. SIH - a novel lipophilic iron chelator - protects H9c2 cardiomyoblasts from oxidative stress-induced mitochondrial injury and cell death J. Moll. Cell. Cardiol. 2005, 39, 345. Hrušková K., et al. Chem. Res. Toxicol., 2011, 24, 290-302. Macková E., et al.: Methyl and ethyl ketone analogs of salicylaldehyde isonicotinoyl hydrazone: Novel iron chelators with selective antiproliferative action. Chem-Biol Interact, 2012, 197, 69-79.

72

P-14

MIKROVLNAMI ASISTOVANÁ SYNTÉZA DERIVÁTŮ ODVOZENÝCH OD PYRAZINKARBOXYLOVÉ KYSELINY A JEJICH BIOLOGICKÉ HODNOCENÍ JANĎOUREK ONDŘEJ 1, DOLEŽAL MARTIN 1, PATEROVÁ PETRA 2, KRÁĽOVÁ KATARÍNA 3, KUBÍČEK VLADIMÍR 1 Farmaceutická Fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze, Heyrovského 1203, 50005 Hradec Králové, Česká Republika; [email protected] 1

Ústav klinické mikrobiologie, Fakultní nemocnice Hradec Králové, Sokolská 581, 50005 Hradec Králové, Česká Republika 2

Chemický ústav, Fakulta přírodních věd, Komenského Univerzita, Mlynská Dolina Ch-2, 84215 Bratislava, Slovenská Republika 3

Ačkoliv celkový počet onemocnění od roku 2006 klesá, je tuberkulóza (TBC) dnes opět považována za hrozbu pro celý svět. Její ústup začal totiž převyšovat stále větší výskyt mykobakteriálních kmenů rezistentních vůči současné terapii. Tato situace v poslední době vyústila k tomu, že se podařilo izolovat kmeny totálně rezistentní ke všem známým používaným léčivům. Tento fakt spolu s pandemií HIV onemocnění, která stále více ovlivňuje rozšiřování TBC tuberkulózy, vede ke snahám o nalezení nového léčiva, které splní požadavky na účinnost a bezpečnost v rámci terapie. Tato práce se zabývá studiem sloučenin odvozených od pyrazinamidu či pyrazinkarboxylové kyseliny jakožto léčiva první volby v rámci terapie TBC. Tato poměrně malá molekula je vhodná k chemickým obměnám díky svým vlastnostem typickým pro pyrazinový kruh. Dvě výchozí sloučeniny 3-chloropyrazin-2-karboxamid a 5-chloro-6-methylpyrazin-2,3dikarbonitril byly připraveny podle předem ověřených postupů a následně byly podrobeny aminodehalogenační reakci spolu s různě na jádře substituovanými aniliny. Tato reakce byla prováděna v mikrovlnném reaktoru s fokusovaným polem za předem optimalizovaných podmínek. Látky takto získané byly nejprve charakterizovány pomocí 1H, 13C NMR a IČ spektroskopií, elementární analýzou, teplotou tání a parametry lipofility (log P vypočtená, log k měřená) a poté následovaly biologické testy. Jednalo se o stanovení antituberkulotické účinnosti proti 4 kmenům mykobakterií s isoniazidem jako standardem a stanovením IC50. Dále pak antibakteriální a antifungální skrínink na aktivitu proti 8 kmenům bakterií a 8 kmenům hub s použitím 5 antibiotik a 4 antimykotik jako standardů. Zde se stanovovala IC95 pro bakterie a IC80 či IC50 pro houby. Jako poslední se hodnotila herbicidní aktivita a to jako inhibice fotosyntetického elektronového transportu v chloroplastech získaných z rostliny Spinacea oleracea. Stanovovala se IC50 a jako standard se použil komerčně dostupný herbicid Diurone® (DCMU).

73

Ze získaných výsledků se pokusíme vyvodit vztahy mezi strukturou a aktivitou připravených látek. Tato práce je spolufinancovaná Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. Registrační číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0235, název projektu: TEAB, dále pak Ministerstvem zdravotnictví ČR IGA NZ 13346, Ministerstvem vzdělání, mládeže a tělovýchovy ČR SVV-2013-265-001 a Grantovou Agenturou Univerzity Karlovy B-CH/710312.

74

P-15

SYNTHESIS OF HETEROCYCLIC COMPOUNDS WITH HIGH ANTIMYCOBACTERIAL ACTIVITY KARABANOVICH GALINA 1, ROH JAROSLAV 1, VÁVROVÁ KATEŘINA 1, STOLAŘÍKOVÁ JIŘINA 2, KLIMEŠOVÁ VĚRA 1, HRABÁLEK ALEXANDR 1 1Charles

University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Department of Inorganic and Organic Chemistry, Heyrovského 1203, 50005 Hradec Králové, Czech Republic; [email protected] 2

Regional Institute of Public Health, Department for Diagnostic of Mycobacteria, 702 00 Ostrava, Czech Republic.

Despite the reduction of new tuberculosis cases and death in the last years as it was referred in Global Tuberculosis Report 2012, these numbers remain enormous. It emphasizes the importance of the synthesis of new effective antituberculotics. In our previous work we found that tetrazole heteroaromates (1, Figure 1) bearing electronwithdrawing group (EWG)-substituted benzyl moiety exhibited high in vitro activities against Mycobacterium tuberculosis My 331/88, with minimum inhibitory concentrations (MIC) of 1-4 µM.

Figure 1. Antimycobacterially active heteroaromatic. Recently, we synthesized series of 2-alkyl/aryl-5-alkylsulfanyl-1,3,4-oxadiazoles together with 1,3,4-thiadiazole analogs (2, Figure 1). Results of antimycobacterial evaluation showed excellent efficiency of the substances with oxadiazole and thiadiazole core, with MIC values from 0.03 to 0.5 µM. Antimycobacterial activity of these compounds considerably depends on the position of two EWG groups on benzyl moiety, while the substituent in position 2 plays only the minor role. This project was supported by the Charles University in Prague (SVV 267 001)

75

P-16

TEPLOTNÍ STUDIE UHPLC SEPARACE VYBRANÝCH LÉČIV KASTNER PETR 1, BURDOVÁ KATEŘINA 1, PILAŘOVÁ PAVLA 1, KLIMEŠ JIŘÍ 1 Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farm. chemie a kontroly léčiv, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected] 1

UHPLC je v současnosti jednou z nejprogresivnějších modifikací kapalinové chromatografie s velkou separační schopností a rychlostí, která by mohla být ještě potencována využitím netradičně vysokých teplot. Cílem práce bylo na sedmi vybraných rutinně používaných HPLC metodách sledovat vliv zvyšování teploty na separace látek různé chemické povahy (kyselé, neutrální či bazické). HPLC metody, které naše laboratoř rutinně používá, byly převedeny do UHPLC modifikace. Analýzy byly provedeny na UHPLC koloně Kinetex C18, 1,7μm, 150 x 2,10 mm, Phenomenex s instrumentací Nexera firmy Shimadzu, která umožňuje použít pro separace teplotu až 130°C. Teplota kolony byla testována v rozsahu 25°C až 130°C. Výrobcem garantovaná teplotní stabilita kolony je do 60°C. To, že kolona nepodléhá tepelné degradaci, bylo ověřeno porovnáním hodnot chromatografických parametrů získaných před a po tepelné zátěži kolony. U všech testovaných látek podle očekávání docházelo k výraznému zkracování retence se zvyšující se teplotou. Současně s tím docházelo k poklesu separačního faktoru a rozlišení píků. Faktor symetrie nebyl výrazně a jednoznačně ovlivněn. Pořadí píků zůstalo zachováno až na dvě dvojice látek. V obou případech se jednalo o iontově párovou chromatografii, a to kyselých látek (stanovení příbuzných látek pikosulfátu sodného) i bazických léčiv (změna pořadí eluce folkodinu-hydrochloridu a ethylmorfinu-hydrochloridu). Závěrem lze konstatovat, že při vysokých teplotách je nutno počítat se snížením separační účinnosti. Vysoká teplota při separaci vede k používání mobilních fází s nižší eluční sílou, a to přináší úsporu organických rozpouštědel. S rostoucí teplotou se navíc snižuje viskozita mobilní fáze, a tedy zpětný tlak na koloně, což umožňuje dále zkrátit analýzu zrychlením průtoku. Opatrnost je na místě u látek, které se vlivem vysokých teplot rozkládají.

76

P-17

EFEKT ELICITÁCIE NA LIPOXYGENÁZOVÚ AKTIVITU A PRODUKCIU SANGUINARÍNU V IN VITRO KULTÚRACH SLNCOVKY KALIFORNSKEJ KOLLÁROVÁ RENÁTA, OBLOŽINSKÝ MAREK, HOLKOVÁ IVANA, BALAŽOVÁ ANDREA, VERONIKA KOVÁČIKOVÁ Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra bunkovej a molekulárnej biológie liečiv, Kalinčiakova 8, 832 32 Bratislava; [email protected]

Slncovka kalifornská (Eschscholtzia californica CHAM.) je jednoročná bylina z čeľade Papaveraceae, ktorá je zaujímavá z hľadiska obsahu sekundárnych metabolitov – alkaloidov. Najvýznamnejším alkaloidom je sanguinarín pre jeho antimikrobiálne, antiboxidačné a protizápalové účinky 1.

sanguinarín

V experimente sme pozorovali efekt biotického a abiotického elicitora na lipoxygenázovú aktivitu a na produkciu benzofenantridínového alkaloidu sanguinarínu v in vitro kulturách slncovky kalifornskej. Biotickým elicitorom bola fytopatogénna huba Botrytis cinerea a ako abiotický elicitor sme použili metyljasmonát. Taktiež sme sledovali vplyv rôznej dĺžky elicitácie (10, 24, 48 a 72 hodín) na aktivitu LOX a tvorbu sanguinarínu. Oba elicitory výrazne zvyšovali aktivitu LOX oproti kontrolným vzorkám, ktoré neboli elicitované. Taktiež nastal nárast produkcie sanguinarínu v elicitovaných suspenzných kultúrach. Vplyv biotického elicitora bol v oboch prípadoch nižší ako efekt metyljasmonátu. 1. CHO, H.Z., SON, S.Y., RHEE, H.S., YOON, S.Y., LEE-PARSONS, C.W., PARK, J.M.: Synergic effects of sequential treatment with methyl jasmonate, salicylic acid and yeast extract on benzophenanthridine alkaloid accumulation and protein expression in Eschscholtzia californica suspension cultures. J Biotechnol, 135, 2008, č. 1, s. 117 – 122.

Táto práca bola podporená grantom FaF UK/13/2013.

77

P-18

SYNTHESIS AND EVALUATION OF TRANSDERMAL PERMEATION ENHANCERS BASED ON TERPENES KOPECNA MONIKA 1, VAVROVA KATERINA 1, ROH JAROSLAV 1 Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Department of inorganic and organic chemistry, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected] 1

Transdermal drug delivery has many advantages over the conventional routes. However skin is very effective barrier and most of drugs cannot get across it in sufficient amounts. Nowadays there are many ways how to overcome this barrier and deliver drugs into systemic circulation. One of them is to use permeation enhancers, it means substances which increase skin permeability for a short time. Among others some natural terpenes or synthetic derivatives of amino acids such as dodecylester of 6-(dimethylamino)hexanoic acid (DDAK) are proved permeation enhancers (1). The aim of this work was to combine these two structures and to study the effects of the prepared substances on skin permeability. First we prepared esters of 6-(dimethylamino)hexanoic acid with selected terpenes (menthol, citronellol, linalool, farnesol and borneol) by a two-step reaction. In the first step we prepared esters of terpenic alcohols with 6-bromohexanoic acid. Consequently bromine was exchanged for dimethylamino group. Then we studied permeation-enhancing activity of the prepared substances using Franz cells. We use the human skin as a model membrane and two model drugs (theophylline and hydrocortisone) as markers of permeability. After the permeation experiments we studied concentration of model drugs in the skin. As a standard DDAK was used. DDAK increased flux of theophylline and hydrocortisone 23 and 37times respectively, and concentration of model drugs in skin five times. None of the prepared esters showed higher activity than DDAK for theophylline. Nevertheless citronellol ester increased flux of more lipophilic hydrocortisone 66times and borneol ester even 70times To conclude we identified new potential permeation enhancers by combining structure of amino acid derivatives and terpene alcohols. This study was supported by the Czech Science Foundation (13-23891S) and Charles University in Prague (GAUK 1404213 and SVV 267 001)

1. Novotný J., Kovaříková P., Novotný M., Janůšová B., Hrabálek A., Vávrová K.. Dimethylamino acid esters as biodegradable and reversible transdermal permeation enhancers: Effects of linking chain length, chirality and polyfluorination. Pharm. Res. 2009, 26, 4, 811-821

78

P-19

IDENTIFICATION OF cDNA ENCODING SECRETORY PHOSPHOLIPASE A2 FROM OPIUM POPPY (PAPAVER SOMNIFERUM L.) KOVÁČIKOVÁ VERONIKA1, HEILMANN MAREIKE 2, OBLOŽINSKÝ MAREK 1, HEILMANN INGO 2 1Department

of Cellular and Molecular Biology of Drugs, Faculty of Pharmacy, Comenius University in Bratislava,Kalinčiakova 8, 832 32 Bratislava, Slovakia; [email protected] 2Department

of Cellular Biochemistry, Institut of Biochemistry and Biotechnology, Martin-LutherUniversity,Kurt-Mothes Str.3, 06120 Halle (Saale), Germany

Phospholipases A2 (phosphatide 2-acylhydrolase, EC 3.1.1.4, PLA2) catalyze the hydrolysis of a fatty acyl ester bond at the sn-2 position of glycerophospholipids to release free fatty acids and lysophospholipids [1]. PLA2s are very important proteins of signal transduction pathways in animal and plant cells [2]. Lipid-derived signaling molecules have emerged as important factors controlling plant growth and development as well as plant adaptation to a changing environment [1]. Opium poppy, Papaver somniferum L. (Papaveraceae) is one of the most important pharmaceutical plants because of alkaloids production. So far, the impact of lipidderived signals on the production and accumulation of valuable plant secondary metabolites has not been explored in depth. Poppyseed plants were growing and RNA was prepared at different time points. The RNA was reverse transcribed to cDNA and the cDNA used as a template for PCR-based amplification of candidate sequence using a degerated primer strategy. A cDNA encoding plant secretory phospholipase A2 (sPLA2) was isolated from poppy seedlings (harvested on 2., 3., 4. and 5. day of growing). The cDNA encodes a mature protein of 159 amino acid residues with a putative signal peptide of 31 residues. The mature form of PsPLA2 has 12 cysteines, Ca2+ binding loop and catalytic site domain that are commonly conserved in plant.

Key words: phospholipase A2 – opium poppy – phospholipid signaling

1. LEE, H.Y. - BAHN, S.C. - SHIN, J.S. - HWANG, I. - BACK, K. - DOELLING, J.H. RYU, S.B.: Multiple forms of secretory phospholipase A2 in plants. In Prog. Lipid Res., 44, 2005, s. 52 – 67.

2. MANSFELD, J.: Plant phospholipases A2: perspektives on biotechnological applications. Biotechnol. Lett., 31, 2009, s. 1373 – 1380.

79

P-20

SYNTÉZA POTENCIÁLNÍCH ANTIDYSRYTMIK KROUTIL ALEŠ 1, CSÖLLEI JOSEF 1 Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně, Farmaceutická fakulta, Ústav chemických léčiv, Palackého 1-3, 612 43 Brno; [email protected] 1

Cílem práce bylo připravit látky s potenciálmí antidysrytmickou aktivitou, jejichž struktury navazují na látky dříve připravené. U těchto látek není vyloučena ani antimikrobiální aktivita. Byly syntetizovány látky na bázi alkylesterů kyseliny 4-(2-amino)-1-hydroxyethyl fenylkarbamové. Jako výchozí látka byl použit 4-aminoacetofenon. Reakcí s příslušným chloridem esteru kyseliny uhličité by připraven karbamát (1), který byl následně bromován na alfa uhlíku acetofenonové skupiny. Reakcí tohoto bromderivátu s příslušným sekundárním aminem byl připraven aminoketon (2), který byl v dalším kroku převeden na sekundární alkohol (3) pomocí NaBH4. Připravené látky byly charakterizovány pomocí IR a NMR spekter, čistota byla sledována pomocí TLC. O O

R

O

1

O

2

N

O R

R

NH

R

1

1

O

2

NH

OH

R

2

N R

O R

1

O

3

NH

R1: methyl-; ethyl-; propyl-; butyl-; isopropyl R2: ethyl-; methyl R3: butyl-

80

3

3

P-21

IDENTIFIKÁCIA KATINÓNOV A ĎALŠÍCH PSYCHOAKTÍVNYCH ZLOŽIEK LEGÁLNYCH STIMULANTOV CHROMATOGRAFICKÝMI A HMOTNOSTNO-SPEKTROMETRICKÝMI METÓDAMI. KUBINCOVÁ JANKA 1, FUKNOVÁ MÁRIA 2, HORÁKOVÁ RENÁTA 1, PECHOVÁ IVETA 1, DEVÍNSKY FERDINAND 1 chemickej teórie liečiv, Farmaceutická fakulta, Univerzita Komenského, Kalinčiakova 8, 832 32 Bratislava 1 Katedra

2 Oddelenie

chémie a toxikológie, KEU PZ Bratislava

Výroba, distribúcia a užívanie psychoaktívnych látok majú svoj vývoj a podliehajú zmenám. Medzi mladými ľuďmi rastie popularita užívania tzv. dizajnérskych drog. Sú to látky typu syntetických katinónov, teda fenyletylamínov. Dôležitým ukazovateľom pôvodu substancie je obsah príbuzných látok. Vznikajú pri samotnej výrobe ako vedľajšie produkty syntetickej reakcie a pre dané laboratórium sú zvyčajne špecifické. Môžu tiež zohrávať významnú úlohu pri synergickom účinku toxických látok. Z toho vyplýva, že dôležitým predmetom pri sledovaní obsahu katinónov je ich spoľahlivá analýza. V súčasnosti sa neustále vyvíjajú nové postupy analýzy týchto látok, ktoré sú založené najmä na chromatografických separáciách s následnou MS detekciou. V tejto práci sme sa zamerali na vývoj metódy vhodnej pre analýzu nasledujúcich katinónov, kde R1, R2, R3, R4, R5 sú subsituenty, ktoré sa môžu obmieňať v základnej štruktúre

(ako napr. H, metyl, etyl, 3,4-metyléndioxy, metoxy, 4-F, 3-F, pyrolidino substituenty). Riešenie problému identifikácie si vyžadovalo kombinovanie separačných techník GC a HPLC v spojení s priamou identifikačnou technikou EI-MS resp. ESI-Orbitrap. Kľúčové slová: psychoaktívne látky, katinóny, HPLC-ESI-Orbitrap, GC-EI-MS.

Táto práca vznikla vďaka podpore v rámci OP Výskum a vývoj pre projekt: Centrum excelentnosti bezpečnostného výskumu, kód ITMS: 26240120034 spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

81

P-22

BIOLOGICKY AKTIVNÍ POLYFENOLY Z PLECTRANTHUS FORSTERI ´MARGINATUS´ KUBÍNOVÁ RENATA, RACZOVÁ ANNA Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Farmaceutická fakulta, Ústav přírodních léčiv, Palackého 1/3, 612 42 Brno; [email protected]

Plectranthus forsteri ´Marginatus´ Benth., molice forsterova, je rostlina pocházející z oblastí jižní Afriky. U nás se hojně pěstuje jako balkonová rostlina. Druhy rodu Plectranthus jsou v lidovém léčitelství využívány zejména k léčbě infekcí, vzhledem k obsahu antibakteriálně účinných abietánových diterpenů. Kromě abietánů se v rostlině nacházejí také polyfenoly (kyselina rozmarýnová, nepetoidin A a B)1. Pro izolaci nepetoidinů z extraktu preparativní HPLC byla zvolena metoda gradientové eluce s počáteční koncentrací mobilních fázi 50 % ACN a 50 % 0,2% HCOOH. Vzhledem ke struktuře nepetoidinu A a nepetoidinu B, lišící se polohou hydroxylové skupiny, se látky nepodařilo rozdělit a byly vyizolovány ve směsi. Antioxidační aktivita byla srovnána se standardy kyselinou rozmarýnovou a Troloxem C. Z výsledků je patrné, že antioxidační aktivita kyseliny rozmarýnové je vyšší než Troloxu C, směs nepetoidinů má aktivitu srovnatelnou s Troloxem C, přičemž hodnoty EC50 se pohybují v rozmezí 3,4 – 9 -amylázy byla zvolena jako standard akarbóza, která se u nás využívá v terapii diabetes mellitus II. typu. -glukosidázy a srovnatelně inhibovaly -amylázu. Ze získaných výsledků je patrné, že nepetoidiny jsou vynikající antioxidanty a patří tedy mezi přírodní látky s nejvyšší in vitro antioxidační aktivitou vůbec. Vzhledem k tomu, že vykazují -g -amylázu, mají velký potenciál při terapii diabetes mellitus II. typu, kde mohou také předcházet vzniku pozdních komplikací diabetu, způsobených volnými kyslíkovými radikály.

Literatura: 1. Kubínová R., Švajdlenka E., Schneiderová K., Hanáková Z., Dall'Acqua S., Farsa O.: Polyphenols and diterpenoids from Plectranthus forsteri ´Marginatus´. Biochem. Syst. Ecol. 49, 2013, 39-42.

82

P-23

INHIBITORY CHOLINESTERAZ JAKOZTO PROFYLAXE OTRAV NPL CHOLINESTERASE INHIBITORS AS PROPHYLAXIS AGAINST NERVE AGENTS MUSILEK KAMIL 1-3, KUNES MARTIN 3, JUN DANIEL 1,3, ZDAROVA-KARASOVA JANA 1,3, SEPSOVA VENDULA 1,3, KORABECNY JAN 1,3, HRABINOVA MARTINA 1, KUCA KAMIL 1-3 1

University of Defence, Faculty of Military Health Sciences, Department of Toxicology and Centre of Advanced Studies, Trebesska 1575, 500 01 Hradec Kralove, Czech Republic 2

University of Hradec Kralove, Faculty of Science, Department of Chemistry, Rokitanskeho 62, 50003 Hradec Kralove, Czech Republic 3

University Hospital, Sokolska 581, 500 05 Hradec Kralove, Czech Republic

Quaternary compounds have been used and studied as cholinesterase inhibitors and reactivators for several decades. Among them, the carbamate inhibitors (e.g. pyridostigmine bromide) are used as organophosphate pre-treatment strategy in many countries. Such carbamate compounds cause serious side-effects (e.g. gastro-intestinal) that originate from their covalent interactions with cholinesterases. The novel quaternary compounds were designed as simple bispyridinium, bisquinolinium and bisisoquinolinium analogues. They showed non-competitiveinhibitory ability towards hAChE in vitro that was further rationalized by molecular modeling studies. The toxicity (LD50) and protective ratio against soman induced toxicity of selected novel compounds was determined. Some of the prepared compounds formerly showed both inhibition of cholinesterases and modulation of muscarinic or nicotinic receptors that take crucial part in animal survival after organophosphate induced toxicity. The receptor studies are currently in progress.

This work was supported by the long term development plan of the Faculty of Military Health Sciences and University hospital (Hradec Kralove, Czech Republic).

83

P-24

STANOVENÍ REAKTIVÁTORŮ ACETYLCHOLINESTERÁZY V BIOLOGICKÉM MATERIÁLU: FARMAKOKINETIKA OXIMŮ HI-6 A K027 U PRASAT DETECTION OF ACETYLCHOLINESTERASE REACTIVATORS IN BIOLOGICAL SAMPLES: PHARMACOKINETICS OF OXIMES HI-6 AND K027 IN PIG KUNES MARTIN 3, ZDAROVA-KARASOVA JANA 1,3, ZEMEK FILIP 1, KVETINA JAROSLAV 3, PAVLÍK MICHAL 1, JUN DANIEL 1,3, BURES JAN 3, KUCA KAMIL 1-3 1

University of Defence, Faculty of Military Health Sciences, Department of Toxicology and Centre of Advanced Studies, Trebesska 1575, 500 01 Hradec Kralove, Czech Republic 2

University of Hradec Kralove, Faculty of Science, Department of Chemistry, Rokitanskeho 62, 50003 Hradec Kralove, Czech Republic 3

University Hospital, Sokolska 581, 500 05 Hradec Kralove, Czech Republic

Oximes HI-6 dimethansulphonate (HI-6 DMS) and K027 are promising acetylcholinesterase reactivators with wide spectrum of therapeutic activity against to nerve agents and commercial utilization. K027 is a novel oxime derived from HI-6 and trimedoxime structure with relatively low toxicity. The main aim of our work was to describe pharmacokinetic profiles of two HI-6 DMS and K027 after its intramuscular and intravenous administration. Pigs were cannulated (under general anasthesia) into vena cava via vena jugularis externa a day before experiment. Blood samples for analysis were collected from this permanent cathether after oximes administration. The main pharmacokinetic parameters are comparable after HI-6 DMS and K027 i.m. administration. Comparable pharmacokinetic parameters were in the most of pharmacokinetic parameters. Significant differences were found in Cmax and Tmax. Both these parameters are important in case of emergency when rapidity and avaibility is cornerstone for success of treatment. This work was supported by the long term development plan of the Faculty of Military Health Sciences, project CZ.1.05/3.1.00/10.0213 and research grant IGA NT/14270 (Ministry of Health, Czech Republic).

84

P-25

OPTIMALIZACE PŘÍPRAVY KRYCÍ VRSTVY PRO BUKÁLNÍ MUKOADHEZIVNÍ FILMY LANDOVÁ HANA, VETCHÝ DAVID, GAJDZIOK JAN, JUŘENOVÁ LADISLAVA Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Farmaceutická fakulta, Ústav technologie léků, Palackého tř. 1/3, 612 42 Brno; [email protected]

Bukální mukoadhezivní filmy jsou jednou z nových perspektivních lékových forem jak pro systémovou, tak lokální terapii. Díky okamžitému vstřebávání systémově podávaných léčiv přes bukální sliznici do horní duté žíly nedochází ke snížení účinku před vstupem do systémové cirkulace metabolizací v játrech či enzymatické degradaci v gastrointestinálním traktu, čímž se zvyšuje biologická dostupnost léčiv. Při lokální terapii různých onemocnění sliznice dutiny ústní mukoadhezivní filmy výrazně prodlužují oproti standardním lékovým formám (ústní vody, gely, pasty) dobu setrvání v místě aplikace a díky krycímu efektu také brání další iritaci lézí. Navíc má tato léková forma jednoduchou a bezbolestnou aplikaci, čímž se zlepšuje „compliance“ pacientů a dochází k zefektivnění farmakoterapie [1]. Cílem experimentu byla optimalizace přípravy krycí vrstvy, která dobu setrvání filmu v místě aplikace významným způsobem prodlužuje, a hodnocení fyzikálně-chemických vlastností připravených dvouvrstvých filmů (mechanická odolnost a doba setrvání in vitro). Různé krycí vrstvy se připravily metodou odpařování rozpouštědla z 5% ethanolických disperzí pěti druhů ethylcelulosy (N7, N10, N14, N22, N100) s různým přídavkem plastifikátoru dibutylsebakátu. Krycí vrstvy se nanášely na mukoadhezivní vrstvu ze sodné soli karmelosy připravenou metodou odpařování rozpouštědla. U připravených filmů se stanovila hmotnostní stejnoměrnost, povrchové pH a pomocí optické analýzy tloušťka filmů. Pomocí texturometru se provedla tahová zkouška a zkouška odolnosti proti protržení a v upraveném přístroji na rozpad tablet se měřila doba setrvání filmu in vitro na umělé bukální sliznici. Vyšší koncentrace dibutylsebakátu použitá v krycí vrstvě obecně nezlepšovala mechanické vlastnosti filmu, avšak výrazně zlepšovala jejich vzhled, flexibilitu a prodlužovala dobu setrvání filmu in vitro, přičemž nejdelší dobu setrvání vykazovaly vzorky s ethylcelulosou typu N22 a N100. Dobrých výsledků při tahové zkoušce nebo zkoušce odolnosti filmu proti protržení dosahovala krycí vrstva z ethylcelulosy typu N22 a N100 s nižší koncentrací dibutylsebakátu. Připravené filmy měly vyhovující pH pro použití filmu v dutině ústní a vybrané vzorky byly dále podrobeny testování in vivo. [1] Landová H., Daněk Z., Gajdziok J., Vetchý D., Štembírek J. Mucoadhesive films as perspective oral dosage form, Čes. Slov. Farm. 2013; 62, 4-11. Tento projekt byl realizován za finanční podpory z prostředků státního rozpočtu prostřednictvím Ministerstva zdravotnictví ČR (projekt ev. č. NT11396).

85

P-26

INHIBÍCIA XANTÍNOXIDÁZY ZÁPAROM Z LISTOV LIGUSTRUM VULGARE L. MACKOVÁ ANNA 1, NAGY MILAN 1, MUČAJI PAVEL 1 Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra farmakognózie a botaniky, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava; [email protected] 1

Rastlinný druh Ligustrum vulgare L. z čeľade Oleaceae sa celé stáročia používal v miestnej medicíne európskej, čínskej a japonskej komunity. Obsahové zložky prítomné v listoch L. vulgare L. – flavonoidy, fenylpropanoidy, sekoiridoidné glykozidy a ich aglykóny vykazujúce antioxidačné a protizápalové účinky indikujú použitie listov drogy v liečbe hepatitídy, hypertenzie, reumatizmu a lokálnych zápalových ochorení. Intracelulárne oxidačné poškodenie tkanív reaktívnymi kyslíkovými radikálmi (ROS) vedúce k poškodeniu biomolekúl sacharidovej, bielkovinovej, lipidovej povahy a DNA spôsobujú často chronický priebeh týchto procesov. Inhibíciou enzýmu xantínoxidázy vedúcej k vzniku a redukcii ROS sme sledovali mieru využitia vodného záparu z listov L. vulgare L. pri zápalových procesoch v organizme. Keďže enzým xantínoxidáza (xantínoxidoreduktáza) hrá dôležitú úlohu v katabolizme purínov, jej katalytickým pôsobením dochádza buď k tvorbe peroxidu vodíka : hypoxantín (xantín) + H2O + O2 → xantín (kys. močová) + H2O2 alebo k tvorbe superoxidového aniónu: hypoxantín (xantín) + H2O + 2O2 → xantín (kys. močová) + O2•‒ + 2H+. Nami sledovaná miera inhibície tohto enzýmu je teda opodstatnená. Inhibičná aktivita sa stanovovala za podmienok in vitro výpočtom percenta inhibície enzýmu z grafického znázornenia a následne zistením inhibičnej aktivity IC50 v koncentračnom rozmedzí (0,19 – 1,5 mg.ml-1) použitého inhibítora. Nami získané výsledky boli porovnané s dostupnou literatúrou.

86

P-27

ANALYSIS OF PHENIRAMINE, PHENYLEPHRINE AND PARACETAMOL IN URINE BY ON-LINE COMBINATION CE-MS/MS KATARÍNA MARÁKOVÁ, JURAJ PIEŠŤANSKÝ, PETER MIKUŠ, LUCIA VEIZEROVÁ, JAROSLAV GALBA Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava; [email protected]

The present work illustrates possibilities of CE-ESI-QqQ hyphenation for the simultaneous identification of the drugs with different structures (pheniramine, phenylephrine, and paracetamol) in human urine after per-oral administration of the pharmaceutical preparation. In addition, based on the CE separation selectivity and the appropriate settings of QqQ (identifier product ion, quantifier product ion, parent ion), the CZE-ESI-QqQ method was applied at the same time also for (i) the investigation of potential weak associates of the drugs, as well as (ii) monitoring of predicted (targeted) compounds derived from the original drugs, e.g. drug impurities or metabolites (when standards of targets are missing). The profiles indicated that pheniramine and paracetamol can be determined directly in the unpretreated urine samples while phenylephrine was detected at the LOD concentration level. A 20-fold sample dilution and 5 nL injection volume were chosen as the optimum experimental parameters. A presence of potential weak associates (presence of glucuronideparacetamol associate) of the drugs was indicated in biological samples. Obviously, the information value is depending on an appropriate prediction of targets. From this point of view information from a different MS/MS technique such as quadrupoleTOF (QTOF) (that is more suitable for the analysis of unknown/nontargeted compounds than QqQ) can be very useful.

Aknowledgments: This work was done in the Toxicological and antidoping center (TAC) supported by grants VEGA 1/0664/12, KEGA 031UK-4/2012, UK/274/2013, UK/75/2013, FaF UK/35/2013, FaF UK/54/2013.

87

P-28

HYDROLÝZA ORGANOFOSFOROVÉHO PESTICIDU METATHIONU V PROSTŘEDÍ MICEL KATIONICKÝCH TENZIDŮ MAREK JAN 1,2, JANOŠCOVÁ PETRA 1, CABAL JIŘÍ 3, DOLEŽAL MARTIN 1 Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected] 1

Univerzita Obrany, Fakulta vojenského zdravotnictví, Katedra epidemiologie, Třebešská 1575, 500 01 Hradec Králové 2

Univerzita Obrany, Fakulta vojenského zdravotnictví, Katedra toxikologie, Třebešská 1575, 500 01 Hradec Králové 3

Úvod Principu micelární katalýzy je při rozkladu toxických esterů využíváno od 50. let minulého století. K rozkladu jsou nejčastěji využívány kationické tenzidy, které jsou schopny účinně koncentrovat na povrchu svých micel anionty s nukleofilní reaktivitou. K rozkladu substrátů byly z počátku využívány tenzidy, jejichž molekuly byly tvořeny jen kationickou hydrofilní doménou (alkylamonia, alkylpyridinia aj.) a lipofilním alkylovým řetězcem [1]. Později bylo zjištěno, že hydrolýzu významně urychlují nukleofilní funkční skupiny zabudované přímo do struktury molekuly tenzidu [2]. Cíl a metodika Cílem autorů této práce bylo prozkoumat vliv jednotlivých strukturních rysů tenzidů (délka lipofilního alkylu, začlenění hydroxylových skupin do struktury a začlenění aromatické domény do struktury tenzidu) ve vztahu k substrátu, pro nějž je typické, že tzv snadno odstupující funkční skupina je jeho nejlipofilnější částí, což je typické pro většinu látek typu organofosforových pesticidů. Diskuze a závěr Byla testována hydrolytická účinnost řady kationických tenzidů při rozkladu organofosforového pesticidu metathionu. Všechny testované tenzidy zvyšovaly rychlost rozkladu metathionu, což bylo důkazem probíhající micelární katalýzy. U některých látek byl patrný pokles rychlosti hydrolýzy při nejvyšších koncentracích, což bylo důsledkem jevu nazývaného efekt prázdných micel. Nejvyšší hydrolytické výkonnosti bylo dosaženo u tenzidů, které v molekule obsahovaly ionizovatelné hydroxylové skupiny. Zcela kromobyčejnou výkonnost vykazoval farmaceuticky využívaný tenzid benzoxonium.

88

Citace [1]

Marek J.; Stodulka P.; Cabal J.; Soukup O.; Pohanka M.; Korabecny J.; Musilek K.; Kuca K. Preparation of the Pyridinium Salts Differing in the Length of the N-Alkyl Substituent. Molecules 2010. 15[3], 1967-1972.

[2]

Tiwari, S.; Ghosh, K. K.; Marek, J.; Kuca, K. Functionalized surfactant mediated reactions of carboxylate, phosphate and sulphonate esters. Journal of Physical Organic Chemistry 2010, 23 (6), 519-525.

Poděkování Práce byla spolufinancovaná Dlouhodobým záměrem rozvoje organizace 1011 a Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. Registrační číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/30.0061

89

P-29

ANALÝZA IČ (KBr) SPEKTIER DERIVÁTOV KYSELINY FENYLKARBÁMOVEJ ŠORALOVÁ STANISLAVA 1, MARUNIAK MATEJ 1, GRÓF MARTIN 2, DOROTÍKOVÁ SANDRA 2, SEDLÁROVÁ EVA 1 Katedra farmaceutickej chémie, Farmaceutická fakulta, Univerzita Komeského v Bratislave, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava; [email protected] 1

Ústav fyzikálnej chémie a chemickej fyziky, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Slovenská technická univerzita, Radlinského 9, 812 37 Bratislava 2

Infračervené spektrá látok, s pracovným označením (4a1-4d1) (Obr.1) v strednej oblasti 4000400 cm-1 boli namerané pomocou FTIR prístroja značky Nicolet NEXUS 470. V tuhom stave sa vzorky merali KBr technikou. N O

N

N

.HCl

OH

Vybračnú analýzu pre zlúčeninu 4a1 môžeme popísať nasledovne. O–H a N–H valenčné vibrácie R = -CH3, môžeme očakávať vo vibračnom spektre ako N O -CH2CH3, najvyššie módy nad 3100 cm-1. Ostrý pás pri 3400 H cm-1 bude pravdepodobne prislúchať O–H stretching O-R -CH2CH2CH3, vibrácii. Vibračný mód pri 3220 cm-1 môžeme -CH2CH2CH2CH3 priradiť N–H stretching vibrácii, kde je aminovodík intermolekulárne viazaný. Najvyššie frekvencie v oblasti C–H valenčných vibrácií patria =C–H stretching vibračným módom benzénového a pyridínového kruhu, ktoré sa nachádzajú pri 3120-3040 cm-1. Asymetrické a symetrické stretching vibrácie -CH3 a -CH2- skupín sa nachádzajú pod =C–H módom, pričom asymetrické valečné vibrácie metylesterovej skupiny môžu zasahovať do oblasti =C–H vibrácii. Pás pri 1720 cm-1 môžeme priradiť C=O valenčnej vibrácii esterovej skupiny. Pásy pri 1630, 1610, 1545 a 1510 cm-1 budú prislúchať skeletovým vibráciam aromatických kruhov a C=N valečnej vibrácii. Vibrácie v oblasti 1480-1360 cm-1 budú pravdepodobne prislúchať deformačným vibráciám –CH3, >CH2 a >CH- skupín.

Poďakovanie: APVV-0339-10, Vega 1/0289/12, Grat FaF UK 53/2013

90

P-30

SYNTÉZA ANALOGŮ ARYLKARBONYLOXYAMINOPROPANOLŮ A JEJICH KVARTERNÍCH AMONIOVÝCH DERIVÁTŮ MARVANOVÁ PAVLÍNA, PADRTOVÁ TEREZA, MOKRÝ PETR Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně, Farmaceutická fakulta, Ústav chemických léčiv, Palackého 1-3, 612 43 Brno

Úvod: Antagonisté β-adrenergních receptorů patří pro své pozitivní kardiovaskulární účinky již více než 50 let k hojně využívaným léčivům v terapii řady kardiologických indikací. V terapii akutních stavů se využívají tzv. ultrakrátce působící β-blokátory, jejichž velmi krátký plazmatický poločas snižuje riziko projevů nežádoucích účinků klasických β-blokátorů [1]. Kromě β-adrenolytického účinku vykazují tyto sloučeniny i účinek antiarytmický. Ten zůstává i po převedení těchto látek na kvarterní amoniovou sůl, zatímco β-adrenolytická aktivita se ztrácí, což v konečném důsledku vede znovu ke snížení nežádoucích účinků spojených s β-adrenolytickou aktivitou [2]. Cíl: Cílem projektu je syntéza a strukturní analýza řady nových derivátů arylkarbonyloxyaminopropanolů s potenciální β-adrenolytickou a antiarytmickou aktivitou s ultrakrátkým účinkem a jejich převedení na kvarterní amoniové deriváty, u kterých předpokládáme vymizení β-adrenolytického účinku se zachováním antiarytmické aktivity. Metodika: V první části byla řešena syntéza derivátů arylkarbonyloxyaminopropanolů (struktura I) několika syntetickými cestami a následně její optimalizace. Druhá část projektu byla zaměřena na syntézu kvarterních amoniových derivátů (struktura II), které byly syntetizovány z příslušných arylkarbonyloxyaminopropanolů N-alkylací. Finální sloučeniny byly podrobeny strukturní analýze a jejich čistota ověřena chromatograficky. Výsledky a závěr: V rámci řešeného projektu byla připravena série nových sloučenin typu arylkarbonyloxyaminopropanolů včetně jejich kvarterních amoniových derivátů. Podařilo se optimalizovat jednotlivé kroky syntézy. Struktura všech finálních sloučenin byla potvrzena dostupnými metodami strukturní analýzy (NMR, IR). U syntetizovaných sloučenin bude dále testována biologická aktivita. OH O

O

OH H N

R

2

O

R

3

X

+

O

N R

3

R

2

R1 = -NHCOOR; -OCH2CH2OR R2 = -CH(CH 3)2; -C(CH 3)3; -CH2CH2OPhOCH3

R

1

(I)

R

1

R3 = -CH3; -CH2CH3

(II)

91

Reference [1] JANOTA, T. Ultrakrátce působící beta-blokátory v intenzivní medicíně. Medicína po promoci. 2008, Suppl. 3 Hypert, 45. [2] FOKEN, H. et al. Synthese und pharmakologische Eigenschaften von Pranolium und seinen optischen Isomeren. Pharmazie. 1990, 45(3), 180 – 183.

92

P-31

MEĎNATÉ A ZINOČNATÉ KOMPLEXY SCHIFFOVÝCH ZÁSAD AKO POTENCIONÁLNE INHIBÍTORY UREÁZY MATUŠKA MAREK, VALENTOVÁ JINDRA, VARÉNYI SAMUEL, KOHÚTOVÁ MÁRIA, DEVÍNSKY FERDINAND 1Farmaceutická

fakulta Univerzity Komenského v Bratislave; Katedra chemickej teórie liečiv, Kalinčiakova 8, 832 32 Bratislava; [email protected]

Ureázy sú metaloenzýmy hydroláz obsahujúce v aktívnom mieste nikel. Za fyziologických podmienok v ľudskom organizme katalyzuje hydrolýzu močoviny na oxid uhličitý a amoniak1: Zvýšená aktivita ureázy najmä pri infekciách ureolytickými baktériami sa patologicky prejavuje zvýšeným bázického prostredia, tvorbou amoniaku, ktorý je toxický a nepriaznivo pôsobí na organizmus poškodením slizníc gastrointestinálneho traktu. Inhibítory ureázy z radu anorganických zlúčenín majú aj medicínske použitie v terapii duodenálnych vredov a pri infekcii ureolytickou baktériou Helicobacter pylori2. Antiureázový účinok vykazujú aj komplexy Schiffových zásad kovových prvkov. Cieľom práce bolo hodnotenie antiureázovej aktivity zinočnatých a meďnatých komplexov salicyladehydu, 3-metoxysalicylaldehydu, aminokyselín a dusíkatých zásad ako napr: imidazolu, 1-metylimidazolu, 2-metylimidazolu, 4-metylimidazolu, 3,5-dimetylpyrazolu. Inhibícia enzýmu ureázy sa hodnotila spektrofotometrickou metódou in vitro. Takmer všetky testované meďnaté komplexy vykazovali výraznú antiureázovú aktivitu s hodnotou IC50 rádovo nižšiu ako mala acetohydroxámová kyselina a v niektorých prípadov ako glutaraldehyd, ktoré sa používali ako štandardy inhibície ureázy. U zinkových komplexov a samotných ligandov vrátane spomenutých dusíkových zásad sa nepozorovala inhibícia ureázy. Meďnaté komplexy Schiffových zásad s rastúcim kruhom aminokyseliny napr. odvodenej od kyseliny od β-aminobutánovej γ-aminobutánovej prejavovali vyššiu antiureázovú aktivitu ako komplexy odvodené od alfa s aminokyselín.

Práca bola podporená grantom FaF UK/49/2013 a APVV 020210.

1

James E. Board: A Comprehensive Survey of International Soybean research. Genetics, Physiology and nitrogen Relationship. Chapter 15, 2012, 317 – 339. 2 Malgorzata Palka: Helicobacter pylori Infection and Undiagnosed Dyspepsia in Dyspeptic Populations Under 45 of Age Tested by ELISA, Urease Breath Test and Helicotest. Department of Family Medicine, Jagiellonian University Medical College, Kraków, Poland. 2012, 3 – 18.

93

P-32

VYUŽITÍ SPME V ANALÝZE LÉČIV MOKRÝ MILAN, SOCHOR JAROSLAV, JUŘÍČKOVÁ MARKÉTA Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected]

Solid-phase microextraction (SPME) je jedna z nejmodernějších metod používaných k úpravě biologických vzorků před vlastní analýzou (Flanagan et al. 2006) a lze ji kombinovat jak s plynovou (GC), tak i kapalinovou (HPLC) chromatografií (Spietelum et al. 2010). SPME umožňuje současnou extrakci a prekoncentraci látek z biologické matrice. V této práci byla SPME ve spojení s HPLC využita pro stanovení kyseliny tiaprofenové v krvi. Cílem práce bylo vypracovat postup izolace tiaprofenové kyseliny z plné krve a metodu následně využít pro její stanovení. Vzorky plné krve byly nejprve zředěny vodou, která podpořila hemolýzu erytrocytů a tím I rychlejší uvolnění kyseliny. Izolace probíhala za laboratorní teploty, sorpce i desorpce byly silně závislé na pH prostředí a vzorek bylo nutno intenzivně míchat, aby výtěžek byl co nejvyšší. Pro extrakci bylo použito vlákno potažené polydimethylsiloxan/divinylbenzenem (PDMS/DVB), pH 3,0. Sorpce probíhala 20 min a desorpce 15 min, což je obojí relativně dlouho, např. ve srovnání s SPE, ale výhodou SPME je velmi malá spotřeba organických rozpouštědel a rychlé ustanovování rovnováhy mezi sorpcí a desorpcí. Jako vnitřní standard byl použit naproxen. Metoda byla validována. Byla ověřena přesnost, správnost, linearita I selektivita a stanoveny limity detekce a kvantifikace. HPLC stanovení probíhalo s využitím stacionární fáze C 18 a mobilní fáze ve složení methanol a 0,01 M fosfátový pufr v poměru 60:40 (v/v) při pH 3,0. Po celou dobu izolace byl vzorek stabilní, nedocházelo k žádnému rozkladu. Výhodou vypracované metody je velmi malá spotřeba vzorku, ale i organických rozpouštědel.

Literatura: 1. Flanagan R.J., Morgan P.E., Spencer E.P., Whelpton R. Micro-extraction techniques in analytical toxicology: short review. Biomedical Chromatography 20 (6-7), 530-538 (2006) 2. Spietelum A., Pilarczyk M., Kloskowski A., Namiesnik J. Current trends in solid-phase microextraction (SPME) fibre coatings. Chemical Society Review 39 (11), 4524-4537 (2010)

94

P-33

STANOVENÍ ACIDOBAZICKÉ DISOCIAČNÍ KONSTANTY pKa DERIVÁTŮ ARYLKARBONYLOXYAMINOPROPANOLŮ POMOCÍ 1H-NMR SPEKTROSKOPIE MOKRÝ PETR 1, STRÁNSKÁ ALENA 1, TENGLER JAN 1,2 1 Veterinární

a farmaceutická univerzita v Brně, Farmaceutická fakulta, Ústav chemických léčiv, Palackého 1-3, 612 43 Brno; [email protected] 2

Medis International a.s., Průmyslová 16, 747 23 Bolatice

Úvod: Chování léčiv v organizmu je velmi často závislé na jejich acidobazických vlastnostech. Acidobazické vlastnosti molekuly léčiva lze kvantifikovat pomocí disociační konstanty pKa, která vyjadřuje rovnováhu mezi disociovanou a nedisociovanou formou molekuly léčiva. Hodnoty pKa léčiva jsou tak jedním z klíčových parametrů pro předpovídání jejich farmakodynamických i farmakokinetických vlastností (rozpustnost, absorpci, distribuci, metabolizaci i vylučování léčiva). V dnešní době existuje již celá řada metod pro stanovení pKa. Mezi nejběžnější metody patří potenciometrická titrace a UV/Vis spektrofotometrie. Novějšími metodami jsou kapilární zónová elektroforéza (CZE), HPLC s reverzní fázi (RP-HPLC) a 1HNMR[1]. Cíl: Cílem této práce bylo rozvinout metodiku experimentálního stanovení acidobazické disociační konstanty pKa pomocí 1H-NMR spektroskopie pro léčiva ze skupiny beta-adrenolytik. Metodika: Vlastní stanovení pKa bylo založeno na závislosti chemických posunů vybraných 1H jader na pH. Experimentálně stanovené hodnoty pKa byly získané ve směsi deuterovaných rozpouštědel a proto byly následně ještě přepočítány pro vodné prostředí. Získané hodnoty byly porovnány s hodnotami predikovanými výpočetním softwarem. Výsledky a závěr: Stanovení pKa bylo provedeno u osmi látek syntetizovaných na VFU Brno, derivátů arylkarbonyloxyaminopropanolů uvedené struktury - potenciálních ultrakrátce působících β-blokátorů. K ověření metodiky byly též použity dva komerčně dostupné β-blokátory – bisoprolol a celiprolol. Těsnost závislosti mezi chemickým posunem sledovaných 1 H jader a pH charakterizovaná koeficientem determinace R2 byla velmi vysoká (R2 = 0,999). Získané hodnoty pKa byly mírně vyšší než hodnoty získané výpočetním softwarem. OH O

O

O

H N

O

R

R

1

R1 = -CH(CH3)2; -C(CH3)3 R2 = -CH3; -CH2CH3

2

[1] Babić, S.; Horvat, A. J. M.; Mutavdžić Pavlović, D. ; Kaštelan-Macan, M. Determination of pKa values of active pharmaceutical ingredients. Trends Analyt. Chem. 2007, 26(11), 1043 – 1061.

95

96

P-34

PELETY S ŘÍZENÝM UVOLŇOVÁNÍM CUKRU K PREVENCI HYPOGLYKÉMIÍ U DIABETIKŮ MUSELÍK JAN 1, FRANC ALEŠ 1, NEUMANN DAVID 2 1

Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně, Farmaceutická fakulta, Ústav technologie léků,

Palackého tř. 1/3, 612 42 Brno; [email protected] 2

Fakultní nemocnice Hradec Králové, Dětská klinika, Sokolská 581, 500 05 Hradec Králové

Hypoglykémie vzniká při nepřiměřeném poměru mezi aplikovaným inzulinem (případně efektem perorálního antidiabetika), výdejem energie a množstvím požitých sacharidů. Většinu hypoglykemických příhod je možné odhadnout, protože vznikají chybnými rozhodnutími při léčbě. Některé hypoglykémie však vycházejí z možností léčby a režimovými opatřeními se dají vyřešit jen obtížně. Patří sem zejména noční hypoglykémie, která je charakterizovaná maximem účinku v době, kdy je fyziologicky nejnižší potřeba inzulinu (Somógyiho fenomén). Dále hypoglykémie při sportu, která není možné pravidelně přerušovat - kolektivní sporty. Dále je to hypoglykémie malých dětí, které jedí neochotně a nepravidelně. Současná dostupná řešení nabízí i vývoj nových inzulinových analog. Cílem práce je vývoj lékové formy s obsahem pelet se zpožděným uvolňováním glukosy. Lékovou formu tvoří inertní jádro ve formě pelety s obsahem glukosy, případně jiného sacharidu, obalené membránou, která uvolňuje glukosu až s časovým odstupem při průchodu gastrointestinálním traktem. Pelety mohou být smíseny s polotuhou či tekutou potravou, resp. dispergovány v nápoji a požity spolu s potravou. Výsledný přípravek bude uvolňovat glukosu v rozdílném definovaném čase. Za vhodné časy lze považovat podle diabetologické praxe čas např. 2, 3, 4 a 5 hodin. Tím bude možné docílit bezpečné hladiny krevního cukru po potřebnou dobu (např. noc) bez narušení denního režimu diabetika. V rámci řešení projektu se připravily pelety s vhodnými fyzikálními parametry (hustota, velikost, tvar, mechanická odolnost), které se následně obalily polymerním filmem metodou spodního nástřiku ve fluidní vrstvě. Základem hodnocení obalených pelet je metoda disoluce. Koncentrace uvolněné glukosy byla stanovena metodou HPLC. Podařilo se připravit pelety se zpožděným uvolňováním, které začínají uvolňovat glukosu až po 120, 240 resp. 360 minutě.

Tato práce vznikla v rámci projektu IGA MZ č. 14479/2013, Příprava lékové formy s řízeným uvolňováním glukosy k prevenci hypoglykemických stavů.

97

P-35

VÝVOJ A VALIDACE UHPLC METODY PRO STANOVENÍ RISPERIDONU A JEHO NEČISTOT V SUBSTANCI A TABLETÁCH. NEJEDLÝ TOMÁŠ 1, PILAŘOVÁ PAVLA 1, KASTNER PETR 1, BLAŽKOVÁ ZUZANA 1, KLIMEŠ JIŘÍ 1. Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected] 1

Cílem této studie bylo vyvinout novou, rychlou a citlivou UHPLC metodu s UV detekcí pro simultánní stanovení risperidonu a jeho čtyř příbuzných látek přítomných v tabletách a substanci. Risperidon je léčivou látkou patřící do skupiny atypických antipsychotik a je nejčastěji používaným léčivem při léčbě schizofrenie, bipolární afektivní poruchy a dalších poruch chování u mladých lidí do 17 let.[1] Studie je založena na hlavních nečistotách stanovených v USP35 a Ph. Eur. 7 (Impurity A, B, C a E). Příprava vzorků z tablet byla velmi rychlá a skládala se z extrakce do organického rozpouštědla s využitím ultrazvuku a filtrace přes 0,22 µm membránový filtr. Vyvinutá metoda je založena na inovativní UHPLC instrumentaci, která poskytuje vysokou účinnost separace ve velmi krátkém čase analýzy. Výsledná metoda využívá optimalizované gradientové eluce s použitím RP-18 chromatografické kolony (100 mm x 3,5 mm, 1,7 µm) Thermo Scientific. Mobilní fáze se skládala z 60mM pufru s octanem amonným o pH 6,8 a acetonitrilu. Průtoková rychlost byla optimalizována na 0,5 ml / min a analýza probíhala při teplotě 40 ° C. Vlnová délka pro UV detekci byla nastavena na 260 nm. Vyvinutá metoda umožňuje zkrácení času analýzy až 4× a spotřebovává 22× méně rozpouštědel v porovnání s metodou stanovenou v USP35 pro stanovení příbuzných látek risperidonu v tabletové lékové formě využívající HPLC systém. Tato metoda byla validována v souladu s požadavky ICH směrnic a to v parametrech selektivita, linearita, přesnost, správnost a citlivost.

Finanční podpora: Karlova univerzita v Praze, projekt SVV 267001

[1] Lincová, D.; Farghali, H.; Základní a aplikovaná farmakologie, second edition, Galén, Czech Republic, 2007, ISBN 978-80-7262-373-0, str. 181

98

P-36

SYNTÉZA POTENCIÁLNÍCH ANTITUBERKULOTIK NA BÁZI DUSÍKATÝCH HETEROCYKLŮ NĚMEČEK JAN 1, KARABANOVICH GALINA 1, ROH JAROSLAV 1, VÁVROVÁ KATEŘINA 1, STOLAŘÍKOVÁ JIŘINA 2, KLIMEŠOVÁ VĚRA 1, HRABÁLEK ALEXANDR 1 Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra anorganické a organické chemie, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected] 1

2

Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě, Partyzánské nám. 7, 702 00 Ostrava

V naší pracovní skupině se podařilo připravit látky, které vykazují vysokou antituberkulotickou aktivitu, vyšší než standardně používaný isoniazid (Obr. 1).

Obr. 1 Strukturní typy antituberkuloticky aktivních látek Cílem této práce bylo studium vlivu záměny jedné elektronakceptorové skupiny (EWG) za elektrondonorovou na antituberkulotickou aktivitu. Z tohoto důvodu byly připraveny dvě série látek, jednak s volnou aminoskupinou v poloze 3 a dále pak s jejím acetyl derivátem. U všech připravených látek byla stanovena jejich in vitro antimykobakteriální aktivita proti čtyřem kmenům mykobakterií. (Schéma 1).

Schéma 1. Syntéza cílových látek

Tato práce vznikla za podpory Univerzity Karlovy v Praze (Projekt SVV 267 001)

99

P-37

STEREOSELEKTÍVNA SYNTÉZA A HPLC-ENANTIOSEPARÁCIA ZLÚČENÍN TYPU BETA-BLOKÁTOROV NÉMETHY ANDREJ, ČIŽMÁRIKOVÁ RUŽENA, VALENTOVÁ JINDRA Univerzita Komenského, Farmaceutická fakulta, Katedra chemickej teórie liečiv, Kalinčiakova 8, 83232 Bratislava; [email protected]

Úvod: Beta-blokátory aryloxyaminopropanolového typu obsahujú vo svojej štruktúre stereogénne centrum na druhom uhlíku propanolového reťazca. Jednotlivé enantioméry sa odlišujú farmakokinetickými a farmakodynamickými vlastnosťami. Ich štúdium je podmienené získaním čistých enantiomérov stereoselektívnou syntézou alebo separáciou z racemátu pomocou vhodných metód. Cieľ: Cieľom práce bola stereoselektívna syntéza modelovej molekuly aryloxyaminopropanolu odvodenej od 4-hydroxypropiofenónu metódou hydrolytického kinetického rozlíšenia enantiomérov oxiránového medziproduktu a potvrdenie stereoselektívnej čistoty pomocou HPLC na chirálnej stacionárnej fáze. Metodika: Hydrolytické rozlíšenie epoxidu bolo uskutočnené použitím Jacobsenovho katalyzátora, ktorý predstavuje komplex [N,N’-Bis(3,5-di-terc-butyl- salicylidén)-1,2II cyklohexándi-amináto(II-)]Co , kde organický ligand môže byť v konfigurácii (R,R) alebo (S,S). Epoxidová skupina príslušnej enantiomérnej formy substrátu je v priebehu procesu hydrolyzovaná na diol a do reakcie postupuje ďalej nehydrolyzovaný enantiomér epoxidu. Reakciou získaného epoxidu s izopropylamínom sa pripravila finálna zlúčenina. Čistota produktu bola overená pomocou TLC. HPLC analýza produktu bola uskutočnená na polysacharidovej chirálnej stacionárnej fáze Chiralpak AD. Štruktúra produktu bola potvrdená metódami 1H NMR , 13C NMR, IČ, a UV spektier. Záver: V rámci dlhodobého štúdia chirálnych aspektov zlúčenín typu aryloxyaminopropanolov bol stereoselektívnou syntézou pripravený (R)-(+)1-{4-[2-hydroxy-3-(izopropylamino)propoxy]fenyl}propán-1-ón s vysokou čistotou a relatívne vysokým výťažkom. Enantiomérna čistota bola overená metódou HPLC na chirálnych stacionárnych fázach. Hroboňová, K., Lehotay, J., Čižmáriková, R., Armstrong, D. W.: J. Liq. Chrom. Rel. Tech. 24,(15), 2001, 2225–2237. Valentová, J., Čižmáriková, R., Bui, T. T. T., Drake, A. F., Hutt, A. J.: Chromatographia 58, (11– 12), 2003, 733–740. Schaus, S. E., Brandes, B. D., Larrow, J. F., Tokunaga, M., Hansen, K. B., Gould, A. E., Furrow, M. E., Jacobsen, E. N.: J. Am. Chem. Soc. 124 (7), 2002, 1307–1315. Práca vznikla vďaka podpore Európskeho projektu Centrum excelentnosti bezpečnostného výskumu kód ITMS: 26240120034 a vďaka výskumnému grantu Univerzity Komenského UK190/2013.

100

P-38

VYUŽITÍ PREPARATIVNÍ CHROMATOGRAFIE A HPLC K IZOLACI A OVĚŘENÍ ČISTOTY LÁTEK ZE SLOŽITÉ MATRICE NOVÁKOVÁ MICHAELA 1 , PAVLA VLASÁKOVÁ1, JANA NETUŠILOVÁ1, HANA TEICHMANNOVÁ1 1

Výzkumný ústav organických syntéz, č.p.296, 533 54 Rybitví; [email protected]

Hlavním cílem práce byl vývoj izolační techniky pro získání vedlejších složek v chemických produktech a přírodních extraktech. Metodou HPLC byl stanoven obsah biologicky aktivních látek a vedlejších produktů z dodaných surovin. Metoda byla vyvinuta tak, aby byla možná její aplikace pro následnou izolaci minoritních složek metodou preparativní chromatografie. K izolaci látek ze vzorku byla použita semi-preparativní chromatografie s UV/VIS detekcí. Základem izolace vybraných složek ze směsi byla především znalost složení výchozích surovin. Vlastní izolace probíhala ve třech krocích. Prvním krokem byla izolace dané látky pomocí preparativní chromatografie, druhým krokem bylo odsolení získaných frakcí membránovou separací a následné odpaření vzorku pro získání složky v pevném stavu. Po získání požadovaného množství sledované látky byla provedena identifikace a kvantifikace pomocí technik MS, NMR a HPLC-DAD, CE. V případě analytických standardů biologicky aktivních látek je často velkým problémem jejich mizivá dostupnost na trhu, popř. příliš vysoké ceny za jejich minimální množství. Z tohoto důvodu je vhodná až nutná příprava standardů takovýchto látek přímo na daném pracovišti.

101

P-39

SYNTHESIS OF HUMAN SKIN CERAMIDES A AND EO CLASSES OPÁLKA LUKÁŠ 1, VÁVROVÁ KATEŘINA 1 Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Department of Inorganic and Organic Chemistry, [email protected] 1

The primary function of the skin is to provide resistance of the body against water loss and penetration of exogenous substances, such as toxins or bacteria. The main skin barrier is situated into stratum corneum, the top layer of the skin. It is composed of corneocytes (flat cells) and the lipidic matrix surrounding them. Lipids, filling the intercellular space of stratum corneum, are composed of equimolar mixture of ceramides, cholesterol and free fatty acids. Twelve structure types of ceramides occur in the skin. These types are derived from 4 aminoalcohols – sphingosine (S), phytosphingosine (P), 6-hydroxysphingosine (H) and dihydrosphingosine (DS). Primary amino group of these aminoalcohols is acylated by nonsubstituted acid (N), alpha-hydroxy acid (A) or omega-hydroxy acid esterified with linoleic acid (EO). The aim of our work is to prepare ceramides of the A and EO classes, because these are not commercially available, and to study their barrier properties. Synthesis of ceramides of type A started from lignoceric acid (tetracosanoic), which was alphabrominated and the bromine substituted by hydroxyl. The racemic mixture of alpha-hydroxy acids was separated enzymatically using lipase. Unfortunately, only S-isomer was obtained this way, but not the natural R-isomer. Currently, we are working on another synthetic procedure. Synthesis of ceramides of type EO started from 16-bromohexadecanoic acid, which was converted into protected omega-hydroxy aldehyde by series of reactions. This was the first fragment for the Wittig reaction. The second fragment was obtained also from 16-bromohexadecanoic acid by converting it to phosphonium salt. After the Wittig reaction, the unsaturated product was methylated, hydrogenated and unprotected to obtain 32-hydroxydotriacontanoic acid. Currently we are optimizing the conditions of the hydrogenation of the double bond. Then, the obtained acid will react with linoleic acid to form an ester. After the reaction with sphingoid base, this ester will provide a ceramide type EO. This work was supported by the Czech Science Foundation (207/11/0365 and 13-23891S) and by Charles University (SVV 267 001)

102

P-40

STEREOSELEKTIVNÍ SYNTÉZA DERIVÁTŮ AMINOPROPANOLU PAVLICA JIŘÍ, MOKRÝ PETR Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně, Farmaceutická fakulta, Ústav chemických léčiv, Palackého 1-3, 612 42 Brno; [email protected]

Aminopropanolový fragment je hlavním strukturním prvkem celé řady β-blokátorů. Ty nabízí pozoruhodně široké spektrum terapeutického použití, především v terapii kardiovaskulárních chorob. β-blokátory aminopropanolového typu jsou chirální, což představuje důležitý faktor v jejich farmakologickém hodnocení. Cílem práce je příprava látek, jež by vyhovovaly strukturním požadavkům kladeným na β-blokátory, přičemž je myšleno i na otázku enantiomerního složení syntetizovaných derivátů. Syntetické postupy vycházejí s kyseliny 4-hydroxybenzoové. Stěžejním krokem je alkylační esterifikace draselné soli příslušné karboxylové kyseliny pomocí glycidyl tosylátu. Dle povahy glycidyl tosylátu (Rac, R, S) jsou připravovány buď racemáty nebo látky vykazující enantiomerní nadbytek. Při otevření epoxydového kruhu reakcí s amínem zůstává enantiomerní nadbytek zachován. Příspěvek představí souhrn syntetických postupů a výsledků, jak je naznačeno v úvodním schematu. Diskutovány budou i možnosti a pokroky v analýze enantiomerního složení daných látek.

Tato práce byla realizovaná za podpory grantu IGA VFU 75/2012/FAF

103

P-41

ENANTIOSELEKTÍVNA ANALÝZA METADÓNU A EDDP V SÉRE METÓDOU HPLC-MS/MS PECHOVÁ IVETA, KUBINCOVÁ JANKA, VALENTOVÁ JINDRA Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra chemickej teórie liečiv, Kalinčiakova 8, 832 32 Bratislava; [email protected]

Úvod: Metadón, je syntetický opioid úspešne používaný v substitučnej terapii závislosti na opiátoch a k tlmeniu chronických bolestí. Na rozdiel od prírodných opiátov, ktoré existujú vo forme čistých enantiomérov, syntetický metadón sa používa prevažne ako racemát. Jeho terapeutický efekt závisí od sérovej hladiny aktívneho R-enantioméru. Hladina vylúčeného EDDP v sére môže slúžiť na určenie metabolických odlišností medzi jednotlivými pacientmi a odhaliť porušenie pri dodržovaní terapeutického režimu. Cieľ: Stanovenie hladiny enantiomérov metadónu a jeho hlavného metabolitu EDDP vo vzorkách séra pacientov liečených zo závislosti na opiátoch. Korelácia hladiny enantiomérov metadónu v sére s terapeutickou dávkou a sledovanie stereoselektívneho profilu metabolizmu metadónu. Metodika: Na stanovenie enantiomérov metadónu a jeho hlavného metabolitu EDDP sa použila metóda HPLC v spojení s tandemovou MS/MS detekciou. Na izoláciu analytov z biologického materiálu sa použila extrakcia na tuhej fáze. Sérové hladiny enantiomérov metadónu a EDDP sa hodnotili vypracovanou metódou na súbore 48 pacientov (15 žien, 31 % a 33 mužov, 69 %), ktorí boli 1 rok v metadónovom udržiavacom programe. Priemerná denná dávka racemického metadónu bola 62,9 mg a pohybovala sa v rozpätí 0,5 – 260 mg. Vzorky séra sa odoberali 24 hodín po podaní dennej dávky metadónu. Výsledky: Zistila sa signifikantná korelácia dávky a sérovej hladiny pre celý súbor pacientov. Pre závislosť (R)-metadónu na dávke: r = 0,54 (p < 0.01), pre (R)-EDDP: r = 0,53 (p < 0.01). Oveľa vyššia korelácia sa však zistila, ak sa súbor pacientov rozdelil na dve skupiny, t.j. pacientov s dávkou metadónu v rozpätí 0,5 – 20 mg a pacientov s dávkou 20 – 260 mg. V oboch súboroch pacientov korelačné koeficienty pre R-enantioméry metadónu aj EDDP stúpli na hodnotu r > 0,7 (p < 0.01). Záver: Analýzou vzoriek séra u pacientov liečených z drogových závislosti sa zistili signifikantné korelácie u biologicky účinného (R)-metadonu a jeho metabolitu (R)-EDDP s dávkou, čo umožňuje v klinickej praxi objektívne určiť optimálnu terapeutickú dávku pri metadónovej substitučnej liečbe. Práca vznikla s podporou grantu Centra exelentnosti bezpečnostného výskumu kód ITMS: 26240120034.

104

P-42

PREPARATION OF DNA SEQUENCE OF 12/15LIPOXYGENASE FROM RAT BLOOD PEKÁROVÁ MÁRIA 1, CHRISTOPH UFER 2, HARTMUT KÜHN 2, HOFFMAN PETER 1, OBLOŽINSKÝ MAREK 1, BEZÁKOVÁ LÝDIA 1 1 Comenius

University in Bratislava, Faculty of Pharmacy, Department of cellular and molecular biology of drugs, Kalinčiakova 8, 832 32 Bratislava, Slovakia; [email protected] 2

Institute of Biochemistry, Clinics Charité, Charitéplatz 1/Virchowweg 6, 10117 Berlin, Germany

Introduction: Lipoxygenases (LOXs) catalyze a typical redox reaction in which the oxidation state of metal factor is changing from Fe2+ to Fe3+ and the eicosanoids are formed. An atomic or molecular oxygen is incorporating into the structure of polyunsaturated fatty acid (PUFA) while this reaction. LOXs are involved in the biosynthesis of proinflammatory mediators as leukotrienes and lipoxines (1). They take part in cell differentiation, carcinogenesis and pathogenesis of atherosclerosis and osteoporosis and are involved in the disorders of glucose metabolism, diabetes mellitus and play very important role in homeostasis of a human organism (2). Aim: Preparation of a sequence of LOX from mRNA isolated from rat blood based on the methods of reverse transcription. Materials and methods: LOX mRNA was extracted from rat blood by ISOLATE II RNA Mini Kit. Preparation of cDNA from mRNA was performed by reverse transcription reaction with Premium-Reverse Transcriptase. Primers for rat LOX were projected in DNAssist software with using a known sequence of rat LOX in NCBI database and further amplified DNA for rat LOX was loaded on agarose gel. DNA extracted from the gel was transformed to a cloning vector and then to competent cells. Results and discussion: DNA of rat LOX extracted from competent cells was subjected to fast digestion with two different restriction enzymes and loaded on agarose gel to identify the positive clones via bands with size of approximately 2000bp (base pairs). DNA sample was sequenced and compared to the known sequence of leukocyte rat LOX with similarity of 99,8%. Conclusion: The present study showed presence of genetic information for rat lipoxygenase in mRNA isolated from rat blood which was demonstrated by visualisation in agarose gel using specific restriction enzymes and with comparison of the prepared sequence to the database. References: (1) IVANOV, I. et al. 2011. Tight association of N-terminal and catalytic subunits of rabbit 12/15-lipoxygenase is important for protein stability and catalytic activity. In Biochim. Biophys. Acta, 2011, 1811, s. 1001-1010 (2) HAMMEL, M. et al. 2004. Structural Flexibility of the N-terminal b-Barrel Domain of 15-Lipoxygenase-1 Probed by Small Angle X-ray Scattering. Functional Consequences for Activity Regulation and Membrane Binding. In J. Mol. Biol, 2004, 343, s. 917-929

This project was supported by “Grant Univerzity Komenského č. UK/234/2013”

105

P-43

OPTIMALIZÁCIA SEPARAČNÝCH PODMIENOK PRE CE-MS ANALÝZU VARENIKLÍNU V LIEKU CHAMPIX® PIEŠŤANSKÝ JURAJ 1, MARÁKOVÁ KATARÍNA 1, VEIZEROVÁ LUCIA 1, GALBA JAROSLAV 1, MIKUŠ PETER 1 Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta v Bratislave, Katedra farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava; [email protected] 1

Fajčenie ako spoločensky akceptovaná forma závislosti je jedným z hlavných predispozičných faktorov zhoršujúcich zdravie človeka a zvyšujúcich jeho chorobnosť a úmrtnosť. Efektívny spôsob odvykania od fajčenia predstavuje terapia vareniklínom – liečivom cielene vyvinutým pre osoby trpiace nikotínovou závislosťou. Popri hlavnom farmakologickom účinku má vareniklín viaceré nežiaduce účinky, preto je jeho výdaj viazaný na lekársky predpis. V špeciálnych prípadoch je potrebné monitorovanie jeho hladín v telových tekutinách. Popri bežných konvenčných chromatografických metódach hodnotenia daného liečiva sa ako perspektívna metóda javí byť kapilárna elektroforéza (CE), a to na základe iónogénneho charakteru liečiva samotného. Spojenie CE s vysokocitlivými a selektívnymi detekčnými technikami (napr. hmotnostná spektrometria – MS) tak môže predstavovať efektívny analytický nástroj hodnotenia vareniklínu v rozličných matriciach (lieková forma, telové tekutiny). Práca bola uskutočnená v Toxikologickom a antidopingovom centre Farmaceutickej fakulty UK s podporou grantu VEGA 1/0664/12, KEGA 031UK-4/2012, grantov UK 75/2013 a 274/2013 a grantov Farmaceutickej fakulty UK 35/2013 a 54/2013.

106

P-44

VÝVOJ METODY STANOVENÍ PIROXIKAMU V PLAZMĚ PILAŘOVÁ PAVLA 1, KASTNER PETR 1, KUŽELOVÁ KRISTÝNA 1, JAROSLAV SOCHOR 1, KLIMEŠ JIŘÍ 1 v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected] 1UK

Práce se zabývá vývojem HPLC metody pro stanovení piroxikamu v plazmě s využitím solid phase mikroextraction (SPME). Piroxikam je oxikamové nesteroidní antiflogistikum a analgetikum, které zmírňuje zánětem vyvolané bolesti a otoky a zároveň inhibuje ADP-indukovanou agregaci trombocytů. Cílem práce byla optimalizace podmínek analýzy piroxikamu a jeho vnitřního standardu isoxikamu a zároveň podmínek izolace těchto látek z plazmy s pomocí SPME. Izolace byla prováděna na vlákně s vrstvou polydimethylsiloxan/divinylbenzen. Byly testovány různé doby adsorpce, desorpce, úprava pH plazmy popř. vysolování. Při HPLC analýze testovaných látek byly zkoumány různé složení, poměry, rychlosti průtoku mobilní fáze, teploty na koloně při použití stacionární fáze C18. Vybrané podmínky izolace zahrnovaly 20 min sorpce 1,5 ml králičí plasmy okyselené kyselinou mravenčí a 20 min desorpce do 200 µl methanolu. Získaný extrakt byl hodnocen optimalizovanou metodou s mobilní fází acetonitril a voda upravená kyselinou mravenčí na pH 2,5 (40 : 60), průtokem 1 ml.min-1, teplotou na koloně 40 °C, nástřikem 20 µl a detekcí při 333 nm viz Obr. Dále byly testovány vybrané validační parametry; byla ověřena linearita, selektivita, LOQ a LOD.

uV 500

piroxikam

450

400

350

300

isoxikam

250

200

150

100

50

0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

Obr. Charakteristický chromatogram spikované plazmy po SPME

107

8.5

9.0

9.5

min

P-45

PRÍPRAVA A VLASTNOSTI NOVÝCH AMFIFILNÝCH ZLÚČENÍN PUPÁK MATÚŠ 1, PECHOVÁ IVETA1, KARLOVSKÁ JANKA2, BUKOVSKÝ MARIÁN3, DEVÍNSKY FERDINAND1 Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra chemickej teórie liečiv, Kalinčiakova 8, 832 32 Bratislava; [email protected] 1

Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra fyzikálnej chémie liečiv, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava 2

Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra bunkovej a molekulárnej liečiv , Kalinčiakova 8, 832 32 Bratislava 3

Úvod: Organické amfifilné tenzidy (QUAT) predstavujú heterogénnu skupinu bioaktívnych molekúl využívaných aj vo farmácii (antiseptiká, dezinficienciá). Cieľ: Kvantifikácia vzájomných vzťahov fyzikálno-chemických vlastností a biologickej aktivity

nových

QUAT,

N-(2-(3-cyklohexylureido)etyl)-N-alkyl-N,N-

dimetylamóniumbromidov, pomocou QSAR (Kubínyiho bilineárny model [1]). Metodika: QUATy sa získali dvojstupňovou reakciou, štruktúra bola potvrdená IČ, 1H a 13C NMR spektrami. Hodnoty kritickej koncentrácie tvorby miciel (cK) sa získali meraním zmien elektrickej vodivosti vodných roztokov, hodnoty clogP sa získali metódou RP HPLC. Citlivosť mikroorganizmov Staphylococcus aureus, Escherichia coli a Candida albicans voči študovaným QUAT (AMA) sa zistila mikrodilučným testom a vyjadrila sa ako minimálna biocídna koncentrácia (MBC). Výsledky: Všetky pripravené QUAT vykázali rôznu mieru AMA v závislosti od kmeňa mikroorganizmu a substitúcie amóniového dusíka. Hodnoty MBC najúčinnejších QUAT sa pohybujú v rozmedzí 1 – 7 µmol.l-1. Záver: Potvrdil sa nelineárny priebeh závislostí log1/MBC od cK [2] resp. log 1/MBC od clogP; známy ako cut-off efekt [3]. [1] Devínsky, F. et al.: QSAR in Design of Bioactive Compounds. Ed. J. R. Prous, Barcelona, 1992, s. 233-247. [2] Devínsky, F. et al. Tenside Deterg. 22, 1985, s. 233-247 [3] Balgavý, P, Devínsky, F. Advan. Coll. Inetrface. Sci. 66, 1996, s. 23-63

108

P-46

SYNTÉZA A BIOLOGICKÉ HODNOCENÍ DERIVÁTŮ PYRAZINAMIDU SERVUSOVÁ BARBORA 1, ZITKO JAN 1, PATEROVÁ PAVLA 3, KUBÍČEK VLADIMÍR 2 a DOLEŽAL MARTIN 1 Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected] 1

Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra biofyziky a fyzikální chemie, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové 2

Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Ústav klinické mikrobiologie, Fakultní nemocnice Hradec Králové, Sokolská 581, 500 05 Hradec Králové 3

Tuberkulóza patří i v 21. století mezi nejčastější infekční onemocnění, které společně s HIV představuje závažný zdravotnický a socioekonomický problém nejen v zemích třetího světa. V roce 2011 bylo diagnostikováno přibližně 8,7 mil. nových případů a následkům infekce podlehlo 1,4 mil. nemocných.1 Mezi základní komplikace terapie patří častý rozvoj rezistence a ko-infekce s HIV, které zdůrazňují potřebu nových léčiv. I z tohoto důvodu je vývoj nových antituberkulotik dlouhodobě součástí evropských výzkumných projektů, např. 7. rámcový projekt (výzva HEALTH-2007-2.3.2: HIV/AIDS, malaria and tuberculosis (citace) či „The Stop TB Strategy“, globální plán WHO pro období 2006-2015. Jedním z antituberkulotik, používaných v iniciální fázi terapie, je pyrazinamid (PZA), který se významnou měrou podílí na zkrácení celkové doby terapie.1, 2 Cílem tohoto projektu je modifikace PZA, konkrétně syntéza a biologické hodnocení derivátů odvozených od 5- a 6-chlorpyrazin-2-karboxamidu, ve kterých byl chlor v poloze 5- nebo 6- substituován odpovídajícím alkylaminem. V rámci in vitro testování antimykobakteriální aktivity byly použity 4 kmeny – Mycobacterium tuberculosis H37Rv, M. kansasii a 2 různé kmeny M. avium. Vybrané deriváty byly navíc hodnoceny i z hlediska cytotoxicity. Nejvyšší in vitro antimykobakteriální aktivita proti M. tuberculosis H37Rv ve srovnání s PZA (MIC = 6.25-12.5 µg/mL) byla zjištěna pro 6-oktylaminopyrazin-2-karboxamid (MIC = 1,56 µg/mL), který současně vykázal i aktivitu proti kmenů primárně rezistentním k PZA. Základní vztahy mezi strukturou a účinkem byly stanoveny.

109

Citace: 1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2012. WHO/HTM/TB/2012.6. 2. HEALTH-2007-2.3.2: HIV/AIDS, malaria and tuberculosis, dostupná: http://cordis.europa.eu/fp7/dc/index.cfm?fuseaction=UserSite.FP7CallSummaryPage&call_id=63. 3. World Health Organization. The Stop TB Strategy, WHO/HTM/TB/2006.368. Tento projekt byl spolufinancován z grantů: GAUK B-CH/710312, IGA NT 13346 (2012) a SVV-2013-267-001. Publikace je spolufinancovaná Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. Registrační číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0235, název projektu: TEAB.

110

P-47

STANOVENIE HODNÔT PKA DERIVÁTOV ALKYL BENZOFURÁNU POMOCOU UV/VIS SPEKTROFOTOMETRIE SCHOLZ WALTER 1, STANIČÁROVÁ ANNA 1, MARUNIAK MATEJ 1, SEDLÁROVÁ EVA 1, CSÖLLEI JOZEF 2 Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra farmaceutickej chémie, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava; [email protected] 1

Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně, Farmaceutická fakulta, Ústav chemických léčiv, Palackého 1-3, 612 42 Brno 2

Abstrakt Úvod: Veľká skupina liečiv používaných v dnešnej praxi má charakter slabých kyselín alebo slabých zásad. Pomer disociovanej a nedisociovanej formy toho istého liečiva je v prostredí rôzneho pH odlišný. Tento pomer vyjadruje vyjadruje disociačná konštanta, ktorej význam spočíva predovšetkým v tom, že podmieňuje schopnosť liečiva pri jeho prestupe membránami. Cieľ: Cieľom práce je stanovenie disociačnej konštanty benzofuránových derivát kyseliny karbámovej pomocou UV/VIS spektrofotometrie. Metodika: Benzofuránové deriváty kyseliny karbámovej s pracovným označením 24/1, 24/1E, 24/2 a 24/2E boli vystavené prostrediu tlmivých roztokov s pH v rozmedzí 5,0 – 8,0 pripravených podľa Mellvainea. Takto pripravené roztoky boli zmerané pomocou UV/VIS spektrofotometra. Zo zistených hodnôt absorbancie sa zostrojila závislosť absorbancie od pH prostredia a vypočítali sa príslušné hodnoty pKA. Výsledky: Boli stanovené hodnoty disociačných konštánt 4 benzofuránových derivátov kyseliny karbámovej. Záver: Predstavili sme potenciálnu metódu na stanovenie disociačnej konštanty látok s pKA v rozmedzí 5,0 – 8,0 pomocou UV/VIS spektrofotometrie a univerzálnych tlmivých roztokov pripravených podľa Mellvainea.

Poďakovanie: Grant UK 389/2013

111

P-48

SYNTÉZA LÁTOK S POTENCIÁLNYM BETA-3-AGONISTICKÝM PÔSOBENÍM, OBSAHUJÚCICH BENZÉNSULFÓNAMIDOVÝ FRAGMENT V MOLEKULE SICHROVSKÁ ĽUBICA 1, MALÍK IVAN 1, SEDLÁROVÁ EVA 1, CSÖLLEI JOZEF 1,2 Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra farmaceutickej chémie, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava 1

Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně, Farmaceutická fakulta, Ústav chemických léčiv, Palackého 1-3, 612 42 Brno 2

Úvod: Prostredníctvom aktivácie beta-3-adrenergného receptorového podtypu dochádza k stimulácii hydrolýzy triglyceridov, ktorá je asociovaná s oxidáciou novouvoľnených mastných kyselín. Cieľ: Cieľom práce je príprava zlúčenín s potenciálne beta-3-agonistickým pôsobením, t.j. látok upravujúcich metabolizmus tukov. Metodika: Projekcia zlúčenín s pracovným označením BL-14S2 – BL-44S2 vychádzala zo štruktúrnych požiadaviek, ktoré sú charakteristické pre deriváty ovplyvňujúce beta-3adrenergné receptory, t.j. spomínané substancie sa vyznačujú prítomnosťou aromatického systému, ktorý je naviazaný na 2-hydroxypropán-1,3-diylový reťazec prostredníctvom éterovej väzby a ich bázická časť je tvorená (substituovaným) 2-fenyletylamínovým fragmentom. Syntéza nových potenciálnych liečiv vychádzala z alkylesterov (metyl – butyl) kyseliny 3-[(2,3-epoxy)-propoxy]fenylkarbámovej a ako bázická zložka bol použitý 4-(2-aminoetyl)benzénsulfónamid. Po vzniku príslušných báz boli finálne zlúčeniny izolované vo forme solí po reakcii s éterovým roztokom chlorovodíka. Výsledky: Bola pripravená séria 4 zlúčenín vo forme hydrochloridov s predpokladanou aktivitou na beta-3-adrenergných receptoroch. Čistota takto pripravených solí bola overená pomocou hmotnostnej spektroskopie. Záver: Predstavili sme detailný pohľad na syntézu veľmi perspektívnej skupiny liečiv. Novo syntetizované zlúčeniny sa vyznačujú jedinečnou štruktúrou a pre svoju predpokladnú beta-3agonistickú aktivitu môžu byť cenným prínosom pri liečbe obezity.

112

P-49

ŠTÚDIUM FYZIKÁLNOCHEMICKÝCH VLASTNOSTÍ A STABILITY POTENCIÁLNYCH ANTIARYTMÍK STANKOVIČOVÁ MÁRIA, BEZÁKOVÁ ŽELMÍRA, MALÍK IVAN Univerzita Komenského, Farmaceutická fakulta, Katedra farmaceutickej chémie, ul. Odbojárov 10, 832 32 Bratislava; [email protected]

Úvod: Nové potenciálne liečivá, bázické estery kyseliny 2-, 3-, 4-alkoxyfenylkarbámovej so substituovaným N-fenylpiperazín-1-ylovým fragmentom s preukázanou miernou antiarytmickou aktivitou sú charakteristické vysokou lipofilitou a povrchovou aktivitou (1,2). Predpokladá sa, že na základe chemickej štruktúry a vlastností sa tieto látky budú v organizme odlišne transportovať do orgánov a budú sa rozdielne správať pri hydrolýze. Cieľ práce: Štúdium stability metódou chemickej kinetiky a vyhodnotenie výsledkov vo vzťahu k štruktúre a fyzikálnochemickým parametrom. Metodika: Alkalická hydrolýza študovaných látok prebiehala vo vodno-etanolovom roztoku hydroxidu sodného (0,1 mol/l). Koncentrácia etylalkoholu bola 50 % v/v. Priebeh hydrolýzy sme sledovali spektrofotometricky v ultrafialovej a viditeľnej oblasti spektra pri teplotách 50 °C, 55 °C, 60 °C a 70 °C Výsledky: Pre dvanásť látok z tejto skupiny sme stanovili hodnoty rýchlostných konštánt alkalickej hydrolýzy pri štyroch teplotách a hodnoty aktivačnej energie. V rámci štúdia vzťahov štruktúra – fyzikálnochemické vlastnosti – reaktivita sme tieto hodnoty korelovali s parametrami charakterizujúcimi ich štruktúru, ako aj s hodnotami fyzikálnochemických parametrov. Záver: Rýchlosť hydrolýzy študovaných látok závisí od substitúcie N-fenylpiperazín-1ylového fragmentu, ako aj od polohy a veľkosti substituenta na benzénovom kruhu. Literatúra: 1. Malík, I., Sedlárová, E., Csöllei, J., Račanská, E., Čižmárik, J., and Kurfürst, P.: Scient. Pharm. 72, 283 – 291, (2004). 2. Malík, I., Sedlárová, E., Andriamainty, F., Csöllei, J.: Čes. Slov. Farm. 54, 235-239, (2005).

113

P-50

ŠTÚDIUM ROZPUSTNOSTI VALSARTANU I STOPKOVÁ LENKA, BEZÁKOVÁ ŽELMÍRA Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra farmaceutickej chémie, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava; [email protected], [email protected]

Úvod: Valsartan patrí do skupiny liečiv nazývaných sartany, ktoré pôsobia ako selektívne antagonisty angiotenzínu II na jeho AT1 receptoroch. Valsartan je liečivo lipofilného charakteru, v molekule obsahuje dve kyslé funkčné skupiny, pri rôznych hodnotách pH sa vyskytuje v nedisociovanej forme (pH < 1,60) ako monoanión a ako dianión (pH > 6,7). Hodnota pKa=4,70 prislúcha ionizácii tetrazolového kruhu, karboxylovej skupine prislúcha hodnota pKa=3,60. Valsartan je ľahko rozpustný v metanole, etanole, acetonitrile, ale naopak ťažko rozpustný vo vode pri laboratórnej teplote 25 °C (0,18 g/l), vo fosforečnanovom tlmivom roztoku (pH=8,0) je rozpustnosť dianiónu 16,8 g/l [1,2]. Cieľ: Cieľom práce bolo štúdium rozpustnosti valsartanu v rozsahu hodnôt pH 2,2 – 8,0 za rôznych experimentálnych podmienok. Metodika: Rozpustnosť substancie valsartanu sme študovali v závislosti od hodnoty pH prostredia (pH 2,2 – 8,0) v tlmivých roztokoch pripravených podľa McIlvainea samotných, v tých istých tlmivých roztokoch upravených na konštantnú iónovú silu chloridom draselným (I=0,5) a v tlmivých roztokoch s prídavkom katiónaktívneho tenzidu cetyltrimetylamóniumbromidu, ktorého koncentráciu sme zvolili tak, aby bola vyššia ako je jeho kritická micelová koncentrácia (CMC=8,8.10-4 mol.dm-3). Rozpustnosť sme študovali v závislosti od času trepania pri 25 °C. V pravidelných časových intervaloch sme odobrali vzorky, ktoré sme vyhodnocovali spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke λmax=249 nm a zo získaných hodnôt absorbancie sme vypočítali rozpustnosť valsartanu S (log S). Výsledky: Na základe získaných hodnôt absorbancie z dvoch paralelných meraní a z rovnice lineárnej závislosti f A= c (μg/ml) sme vypočítali hodnotu log S. Z výsledkov vyplynulo, že rozpustnosť valsartanu sa zvyšuje so stúpajúcou hodnotou pH tlmivého roztoku. Záver: Naše experimenty potvrdili, že so stúpajúcou hodnotou pH tlmivého roztoku rozpustnosť valsartanu narastá, úprava roztoku na konštantnú iónovú silu rozpustnosť valsartanu neovplyvňuje, prídavok tenzidu CTAB ovplyvňuje rozpustnosť len nepatrne. Práca bola podporená Grantom UK 223/2013. [1] SAYDAM, M., TAKKA, S. Fabad J. Pharm. Sci – 32, 2007, 185 – 196. [2] TOSCO, P., et. al. Helvetica Chimica Acta – 91, 2008, 468 – 482.

114

P-51

IONTOVÁ GELACE JAKO PERSPEKTIVNÍ METODA PŘÍPRAVY MIKROČÁSTIC SZOTKOWSKÁ RENATA, KEJDUŠOVÁ MARTINA, DVOŘÁČKOVÁ KATEŘINA Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Farmaceutická fakulta, Ústav technologie léků, Palackého tř. 1/3, 612 42 Brno; [email protected]

Mikročástice jsou v posledních letech předmětem studia po celém světě. Tato léková forma s velikostí jednotlivých částic v rozmezí několika jednotek až stovek mikrometrů nabízí ve srovnání s běžnými lékovými formami celou řadu výhod – zajištění optimální terapeutické koncentrace léčiva v krevní plazmě, minimalizaci nežádoucích účinků, zvýšení compliance pacienta (ochota pacienta přizpůsobit se léčebnému režimu stanovenému lékařem) a také možnému maskování nepříjemné chuti nebo zápachu léčivých látek. Rozvoj mikročástic se objevuje zejména v 60. letech, kdy se využívají např. k maskování nepříjemné chuti či zápachu léčiv, ochraně citlivých látek před vzdušným kyslíkem, vlhkostí nebo světlem, bezpečnému zacházení s toxickými látkami atd. Metoda iontové gelace se v posledních letech jeví jako velmi slibná metoda enkapsulace. Řadí se mezi fyzikální síťovací metody, tedy metody založené na elektrostatických interakcích mezi řetězci polymeru. Jedná se o relativně jednoduchou, rychlou a levnou techniku, jejíž největší předností jsou zejména mírné procesní podmínky bez výraznějších změn pH či teploty. Prakticky tato metoda spočívá v protlačování kapek disperze polymeru do roztoku s opačně nabitými vícemocnými ionty, kde okamžitě po styku s hladinou dochází k jejich zesíťování. Cílem experimentální části byla optimalizace přípravy matricových mikročástic metodou vnější iontové gelace za použití karmelosy sodné soli (Blanose®) a alginátu sodné soli jako modelových polymerů a různě koncentrovaného roztoku chloridu měďnatého v roli síťovacího činidla. Pomocí stereoskopického a optického mikroskopu byly hodnoceny morfologické vlastnosti připravených mikročástic, byl stanoven faktor sféricity a vypočítán ekvivalentní průměr. Následně byl spektrometricky stanoven obsah mědi v jednotlivých šaržích a suspenzní metodou byla testována protimikrobní aktivita vůči některým kmenům bakterií – Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus a Klebsiella pneumoniae.

115

P-52

LC-MS/MS STUDY ON TWO NOVEL IRON CHELATING ANTITUMOR AGENTS IN VIVO SESTAK VIT 1, SUPRUNOVA VLASTA 1, STARIAT JAN 1, KLIMES JIRI 1, STANISLAV MICUDA 2, DES R. RICHARDSON 3, KOVARIKOVA PETRA 1 1

Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove, Department of Pharmaceutical Chemistry and Drug Analysis, Heyrovskeho 1203, 500 05 Hradec Kralove, Czech Republic; [email protected] 2

Charles University in Prague, Faculty of Medicine in Hradec Kralove, Department of Pharmacology, Simkova 870, 50038 Hradec Kralove, Czech Republic 3

University of Sydney, Department of Pathology and Bosch Institute, Iron Metabolism and

Chelation

Program, NSW 2006, Australia The WHO has classified cancer as the major cause of death worldwide. The aim of the scientific efforts is to overcome the resistance of tumors towards the current chemotherapy while lowering its toxicity. The systematic investigation of iron metabolism of neoplasmas led to the development of novel thiosemicarbazone iron-chelating compounds, which exhibit a powerful yet selective anti-tumor effect. Structure-activity-relationship analysis within this group showed that di(2-pyridyl)ketone thiosemicarbazones possess the most convenient efficacy/toxicity characteristics and di(2-pyridyl)ketone-4,4-dimethyl-3-thiosemicarbazone (Dp44mT) and di(2-pyridyl)ketone-4-cyclohexyl-4-methyl-3-thiosemicarbazone (DpC) were selected as the lead compounds. Especially DpC seems to have a high potential to be promoted from the preclinical investigations to a clinical trial. Thus it is crucial to describe the pharmacokinetic characteristics of both compounds. The objective of this work was to obtain preliminary data on the fate of Dp44mT and DpC in vivo after intravenous administration to rats using LC-MS. An analytical LC-MS/MS method was developed for this purpose. The analyses were performed on an Acquity UPLC® BEH C18 (2.1 x 50 mm, 1.7 μm, Waters) column with 2 mM ammonium formate and acetonitrile as a mobile phase. An ion trap mass spectrometer coupled with ESI+ was utilized as a detection technique. Both compounds (Dp44mT and DpC) were administered in a mixture of saline:PEG:ethanol (5:4:1) at a dose of 2 mg/kg (n = 2). Plasma, urine and bile samples were taken in predefined time intervals. The samples were treated with either SPE or dilution with acetonitrile. A single demethylated metabolite of Dp44mT as well as the formamidrazone and semicarbazone metabolites of DpC were detected in these experiments. In addition concentration-time profiles of both parent compounds in plasma were obtained. The results of this study will be utilized to properly design the upcoming more comprehensive pharmacokinetic study. This study was supported by the grants GAUK 903113 and IGA NT 12403-3/ 2011.

116

P-53

URČENÍ DISTRIBUCE VELIKOSTI ČÁSTIC API VE FORMULOVANÉ TABLETĚ POMOCÍ HOT-STAGE MIKROSKOPU ŠIMEK MICHAL 1, GRÜNWALDOVÁ VERONIKA 2, KRATOCHVÍL BOHUMIL 1 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Ústav chemie pevných látek, Technická 5, 166 28 Praha 6; [email protected] 1

2

Zentiva k.s., U Kabelovny 130, 102 37 Praha 10

Úvod: Většina vyráběných a distribuovaných léčivých přípravků jsou pevné lékové formy, a proto je velký zájem o zlepšení analytických postupů a také o vývoj nových metod analýzy farmaceutické pevné fáze. Velikost částic účinné látky (API) má velký vliv na výrobu a chování lékové formy v organismu, a proto je důležité odhalit distribuci velikosti částic API originálního přípravku již v raném stádiu vývoje generika. Aby bylo možné hodnotit jednotlivé částice, je nutné tabletu vhodným způsobem desintegrovat. Desintegrovanou tabletu je možné analyzovat pomocí hot-stage mikroskopie, polarizační mikroskopie a dalšími technikami.[1] Cíl: Cílem práce bylo nalezení vhodných podmínek přípravy prášku z tablety, které vedou k zachování částic API v jejich původní velikosti a následně ověřit použití hot-stage mikroskopie při analýze distribuce velikosti částic modelových vzorků. Metodika: Desintegraci tablety je možné provést mechanicky nebo pomocí kapalného média. Při mechanickém způsobu jsou proměnnými parametry: výchozí velikost částic, doba a síla tření. V druhém způsobu desintegrace je to objem použitého média, jeho pH, polarita a také doba kontaktu s kapalinou. Výsledky: Pro oba způsoby desintegrace byly experimentálně nalezeny optimální parametry, které umožní připravit prášek z tablety při minimálním ovlivněním velikosti částic API. Protože velkou většinu pomocných a účinných látek nelze barevně ani morfologicky rozlišit, bylo potřeba využít jiných rozdílných vlastností. Hot-stage mikroskopie umožňuje pozorovat částicový systém za současné změny teploty, a tedy rozlišení na základě rozdílných bodů tání. Závěr: Pro zachování původní velikosti částic API po desintegraci tablety na prášek je důležité dodržení postupů vyvinutých v této práci. Rozdílné body tání jednotlivých komponent umožňují rozlišit částice API od zbytku složek v prášku a následně vyhodnotit jejich distribuci velikosti částic.

[1] Korandia V. S. et al. Comprehensive Characterisation of the Innovator Product: Targeting Bioequivalent Generics. Journal of Generic Medicines 2005 (2) 335

117

P-54

ANTIOXIDAČNÍ A ANTIFLOGISTICKÁ AKTIVITA VYBRANÝCH DRUHŮ RODU NIGELLA ŠPAČKOVÁ VĚRA, HOŠEK JAN, BARTÍKOVÁ KRISTINA, KOŽÍŠKOVÁ DITA, ZELOVÁ HANA, MADEJA MICHAL VFU Brno, Farmaceutická fakulta, Ústav přírodních léčiv, Palackého 1-3, CZ-612 43 Brno; [email protected]

Moderní medicína je úspěšná převážně v léčbě akutních chorob. V oblasti chronických zánětlivých onemocnění jako např. Crohnova choroba či diabetes mellitus 2. typu nedosahuje zcela uspokojivých výsledků. Přírodní léčiva se v tomto pohledu jeví jako zajímavé alternativy ke klasické léčbě. Zajímavou skupinou rostlin užívanou mimo jiné při zánětlivých potížích jsou rostliny rodu Nigella (Ranunculaceae). V této práci byla porovnávána aktivita druhů N.sativa, damascena, hispanica a orientalis. Antioxidační aktivita byla měřena metodou DPPH. Jako standard byl použit trolox. Aktivita hexanových extraktů byla v porovnání s methanolickými prakticky zanedbatelná. Z methanolických extraktů pak bylo nejlepších výsledků dosaženo u N. sativa. Z hlediska rostlinných částí pak byly nejaktivnější extrakty z kořene a listu.

TEAC

NS

ND

NO

NH

Ethanolické Trolox (g/100g suchého extraktu) kořen

8.19

3.00

1.05

5.35

stonek

5.83

2.70

0.67

5.53

list

6.09

5.00

0.98

5.82

květ

3.58

3.70

1.58

4.59

Antiflogistická aktivita byla měřena metodou ELISA. Na makrofázích byla sledována produkce prozánětlivého cytokinu TNFα. Jako standard byl použit prednison. Výraznější aktivita zde byla zjištěna u hexanových extraktů. Nejnižší hodnota byla zjištěna u extraktu listu N. hispanica. Nejlepších hodnot bylo dosaženo i celkově u N. hispanica, kde všechny extrakty byly aktivnější než standard, a N. damascena, kde všechny extrakty z nadzemních částí vykázaly vyšší aktivitu než prednison.

118

NS

ND

NO

NH

Hexanové

TNFα (pg/ml)

kořen

783.1684

795.4

1717.445 554.6236

stonek

350.7336

168.05

1108.08 552.6327

list

756.202

488

1221.766 113.2724

květ

984.7591

405.05

vehikulum

1240.835 1240.933 1241.02 1240.835

prednison

581.9546

581.9

896.9

174.4835

582.0941 581.9546

Z výsledků vyplývá, že neexistuje přímá vazba mezi antioxidačními a antiflogistickými vlastnostmi těchto extraktů.

119

P-55

SEKVENČNÍ INJEKČNÍ ANALÝZA JAKO NÁSTROJ PRO AUTOMATIZACI DISPERZNÍ MIKROEXTRAKCE I. ŠRÁMKOVÁ, H. SKLENÁŘOVÁ, B. HORSTKOTTE, P. SOLICH Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra analytické chemie, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected]

Disperzní mikroextrakce z kapaliny do kapaliny (DLLME) [1] je extrakční metoda založená na systému dvou organických rozpouštědel: extrakčního rozpouštědla o co nejnižším objemu, a rozpouštědla disperzního. Úlohou disperzního rozpouštědla je rozptýlení extrakčního činidla ve vodném vzorku, a tím významné zvýšení plochy mezifáze. Účinnost extrakce v porovnání s klasickou extrakcí z kapaliny do kapaliny se tak výrazně zvýší. Sekvenční injekční analýza (SIA) je nízkotlaká průtoková technika charakterizována vysokou opakovatelností měření bez potřeby dosažení rovnovážného stavu, a to díky programovatelnosti a synchronizaci jednotlivých kroků. Cílem práce bylo vyvinout automatizovanou metodu s využitím DLLME pro stanovení thiokyanatanů (SCN-) a propofolu v biologickém materiálu. SCN- ionty v lidských slinách byly stanoveny spektrofotometricky po vytvoření komplexu s astrafloxinem a následné extrakci [2]. Přímá fluorescenční detekce po předchozí extrakci byla využita v případě stanovení propofolu v séru. Obě analýzy byly provedeny automaticky s využitím dvouventilového systému SIA. U obou stanovení se podařilo dosáhnout detekční limity odpovídající koncentracím v reálných vzorcích, krátký celkový čas analýzy (SCN-: 4 min, propofol: 7 min) a výbornou opakovatelnost (SCN-: < 2,8 %; propofol: < 2,1 %). Využití SIA umožnilo vyvinout dvě plně automatizované metody pro stanovení různých analytů v biologickém materiálu s nízkou spotřebou činidel a organických rozpouštědel. Díky dvouventilovému systému se zamezilo problémům způsobeným použitím vodné a organické fáze v systému (šum detektoru).

[1] M. Rezaeea, Y. Assadia, M.- R. Milani Hosseinia, E. Aghaeea, F. Ahmadia, S.Berijania, J. Chromatogr. A 2006, 116, 1-9. [2] C. C. Acebal, H. Sklenářová, J. Škrlíková, I. Šrámková, V. Andruch, I. S. Balogh, P. Solich, Talanta 2012, 96, 107-112. Poděkování Práce je spolufinancovaná Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. TEAB, registrační číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0235.

120

P-56

NOVÉ POZNATKY V OBLASTI FTALOCYANINŮ A AZAFTALOCYANINŮ ŠVEC JAN 1, ZIMČÍK PETR 1 Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové; [email protected] 1

Ftalocyaniny a azaftalocyaniny jsou látky schopné absorbovat světelo ve viditelné oblasti spektra. Systém konjugovaných vazeb jim nejen dodává nejčastěji zelenou barvu, ale i umožňujě fluorescenci, tvorbu singletového kyslíku, popřípadě zhášení fluorescence.1 Konkrétní vlastnosti ftalocyaninů a azaftalocyaninů jsou ovlivňovány periferními substituenty a také typem koordinovaného centrálního kationtu. V této práci bude porovnávána příprava a vlastnosti série ftalocyaninů nesoucí na periferii bazické skupiny, jako jsou terciární aminy nebo pyridin-3-yl. V práci bude také diskutována příprava ftalocyaninu a azaftalocyaninu, kde byl v jednom případě zvolen pro ftalocyaniny netradiční centrální kobaltnatý kation.

1

Zimčík P. Chem. Listy 106, 275-282 (2012)

Spolufinancováno Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. Registrační číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/30.0061

121

P-57

SYNTÉZA A BIOLOGICKÉ ÚČINKY NOVÝCH DERIVÁTOV HEXADECYLFOSFOCHOLÍNU. LUKÁŠ TIMKO 1, MILOŠ LUKÁČ 1, MÁRIA GARAJOVÁ 2, MARTIN MRVA 2, FRANTIŠEK ONDRISKA 3, JANKA KARLOVSKÁ 4,5, FERDINAND DEVÍNSKY 1 1 Univerzita

Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra chemickej teórie liečiv, Kalinčiakova 8, 832 32 Bratislava; [email protected]

2 Univerzita

Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra zoológie, Mlynská dolina B-1, 842 15 Bratislava

3 HPL

spol. s.r.o., Oddelenie parazitológie, Istrijská 20, 841 07 Bratislava Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra fyzikálnej chémie liečiv, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava

4 Univerzita

5 Univerzita

Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, NMR laboratórium, Odbojárov 10, 832 32

Bratislava

Úvod: Hexadecylfosfocholín (HPC, miltefosín) je štandardnou látkou skupiny alkylfosfocholínov (APCs), ktoré sú na základe štruktúry zaraďované medzi zwitteriónové tenzidy. APCs sa vyznačujú antineoplastickými, antimykotickými a antiprozoálnymi účinkami. Ciele: a) Syntéza 12 nových APCs odvodených od hexadecylfosfocholínu líšiacich sa od seba dĺžkou alkylových reťazcov viazaných na dusík a fosfát. b) Stanovenie antiprotozoálnych účinkov pripravených APCs na druhoch Acanthamoeba lugdunensis a Acanthamoeba quina. Metodika: Zlúčeniny boli pripravené trojstupňovou syntézou. Kľúčovým krokom bola reakcia primárneho alkoholu s chloridom fosforylu a následne s amóniovou soľou. Amóniová soľ bola pripravená z terciárneho aminoalkoholu. Antiprotozoálna účinnosť APCs bola testovaná v šiestich koncentráciách a vyhodnocovaná po 1, 24 a 48 hodinách. Koncentrácia potrebná na kompletnú eradikáciu trofozoitov (vegetatívna forma améb) po 48 hodinách bola určená ako minimálna trofocídna koncentrácia (MTC). Výsledky: Pre druh A. lugdunensis dosiahli pripravené zlúčeniny lepšie výsledky antiprotozoálnej aktivity ako štandard (HPC), ktorého MTC je rovná 250 µM. Najnižšiu MTC dosiahli zlúčeniny C2-C15 a C6-C11, ktoré boli štyrikrát účinnejšie ako štandard. Účinnosť APCs na A. quina bola rovnaká, resp. nižšia, ako u miltefosínu (125 µM). Látkou účinnejšou ako štandard bola C2-C15, ktorej MTC mala hodnotu 62,5 µM. Záver: Pripravené APCs majú antiprotozoálnu aktivitu porovnateľnú, resp. lepšiu, ako štandardná látka miltefosín. Z hľadiska aktivity na oba druhy améb je najúčinnejšou zlúčeninou C2-C15 substituovaná etylom na fosfáte a pentadecylom na amóniovom dusíku. Výskum bol podporený grantmi: UK/161/2013, VEGA 1/0600/11, VEGA 1/0796/12 a UK/547/2013

122

P-58

FYTOFARMAKOLOGICKY A NUTRACEUTICKY VÝZNAMNÉ OBSAHOVÉ LÁTKY RASTLÍN ČEĽADE CACTACEAE CZIGLE SZILVIA, TÓTH JAROSLAV Univerzita Komenského v Bratislava, Farmaceutická fakulta, Katedra farmakognózie a botaniky, Odbojárov 10, SK-832 32 Bratislava; [email protected] 1

V rámci čeľade kaktusovitých (Cactaceae) existuje cca 250 rodov a viac než 2000 druhov. Kaktusy poznáme predovšetkým ako izbové rastliny. Vo viacerých regiónoch Ameriky a Ázie sú kaktusy dôležitou súčasťou potravy (napr. opunciové figy, pitaya). Jedinými kaktusmi využívanými v modernej medicíne sú opuncie (napr. o. figová, Opuntia ficus-indica (L.) Mill., ako aj O. streptacantha). Uplatnenie našli v doplnkovej liečbe diabetes mellitus a zvýšenej hladiny cholesterolu. V súčasnosti sú aj iné plody kaktusov častým objektom vedeckého výskumu, napr. pre obsah rastlinných farbív tzv. betalaínov [1]. Epifytické kaktusy rodu Epiphyllum Haw. (epifylum) sa nazývajú aj listové kaktusy. V súčasnosti síce nie je známe ich (fyto)farmakologické využitie, ale výskum v tejto oblasti sa rozbieha. Niektoré druhy kaktusov obsahujú psychoaktívne látky, preto našim cieľom bola fytochemická analýza plodov rodu Epiphyllum, vylúčenie ich toxicity a potvrdenie ich antioxidačnej aktivity. V plodoch dvoch hybridov kaktusu z rodu Epiphyllum Haw. [2] sa sledovala prítomnosť alkaloidov bežnými fytochemickými metódami a antioxidačná, resp. scavengerová aktivita spektrofotometricky. Z našich výsledkov vyplýva, že plody rodu Epiphyllum neobsahujú alkaloidy. Sú bohaté na dusíkaté zlúčeniny – betalaíny, ktoré môžu simulovať falošne pozitívne výsledky reakcie na alkaloidy. Antioxidačná aktivita vodných extraktov plodov sa potvrdila, viaže sa pravdepodobne na obsah fenolov a rastlinných pigmentov.

1. ERDELSKÁ, O. – STINTZING, F. 2011. Phytochemical and morphological evaluation of flowers and fruits from Epiphyllum hybrids during development. In Biologia. ISSN 0006-3088, 2011, vol. 66, no. 5, p. 1-7. 2. ERDELSKÁ, O. – OVEČKA, M. 2004. Senescence of unfertilised flowers in Epiphyllum hybrids. In Biologia Plantarum. ISSN 0006-3134, 2004, vol. 48, no. 3, p. 381-388.

123

P-59

HODNOTENIE FARMACEUTICKY AKTÍVNYCH LÁTOK VO VINIČI POMOCOU VYSOKOÚČINNEJ KVAPALINOVEJ CHROMATOGRAFIE VEIZEROVÁ LUCIA 1, DOKUPILOVÁ SVETLANA, MARÁKOVÁ KATARÍNA, PIEŠŤANSKÝ JURAJ, GALBA JAROSLAV, MIKUŠ PETER Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Toxikologické a antidopingové centrum a Katedra farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava [email protected] 1

Listy a plody viniča obsahujú široké spektrum farmaceuticky aktívnych látok ako napr. fenolické zlúčeniny, biogénne amíny, vitamíny, polysacharidy, aminokyseliny, minerály atď., ktoré sa vyznačujú mnohými biologickými účinkami a sú súčasťou viacerých výživových doplnkov. Analýze týchto látok nielen vo viniči, ale i v iných typoch matrice, bola preto venovaná značná pozornosť. Najbežnejšou analytickou metódou je vysokoúčinná kvapalinová chromatografia s obráteným systémom fáz, ktorá však nie je vhodná pre skupiny polárnych látok ako napr. vo vode rozpustné vitamíny alebo biogénne amíny. Ako vhodné riešenie sa javí využitie hydrofilnej interakčnej chromatografie HILIC, ktorá umožňuje analýzu práve polárnych látok. Na vytvorenie farmaceuticky aktívnych profilov viničových odrôd bola pre zlúčeniny typu polyfenolov využitá oktadecylová stacionárna fáza. Na simultánnu analýzu vo vode rozpustných vitamínov B bola využitá stacionárna fáza na báze permanentného zwitteriónu sulfobetaínového typu (ZIC-HILIC), ktorá poskytuje selektivitu pre separáciu neutrálnych, iónových, bázických i kyslých hydrofilných analytov. Mobilná fáza pozostávala z ACN a tlmivého roztoku mravčan amónny/kyselina mravčia pH=3,1 resp. octan amónny/kyselina octová pH=6,0. Detekcia bola uskutočnená pomocou DAD resp. MS (QTOF) detektora. Databáza farmaceuticky aktívnych profilov viničových odrôd môže v budúcnosti poslúžiť na biotechnologickú prípravu liečiv resp. nutraceutík.

Práca bola uskutočnená v Toxikologickom a antidopingovom centre FaF UK a na Katedre farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie FaF UK s podporou projektov VEGA 1/0664/12, KEGA 031UK-4/2012, APVV-0550-11, FaF UK/35/2013 a FaF UK/54/2013.

124

P-60

ANALÝZA REAKTIVÁTORŮ ACETYCHOLINESTERÁZY V PLASMĚ A MOZKOVÉ TKÁNI ZEMEK FILIP 1, ZDAROVA-KARASOVA JANA 2, DRTINOVA LUCIE 1, SPILOVSKA KATARINA 1, MAREK JAN 1, KUCA KAMIL 3 1

Katedra toxikologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany Hradec Králové, Třebešská 1575, 500 01 Hradec Králové

2

Katedra veřejného zdravotnictví, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany Hradec Králové, Třebešská 1575, 500 01 Hradec Králové

3

Centrum biomedicínského výzkumu, Fakultní nemocnice Hradec Králové, Hradec Králové

Organofosforové sloučeniny (OF) byly v minulosti používány jak pro vojenské účely jako nervově paralytické látky (NPL, např. tabun, sarin, soman, VX), tak i v zemědělství jako pesticidy (např. paraoxon, chlorpyrifos, diazinon). Mechanismus jejich účinku spočívá v ireverzibilní inhibici enzymu acetylcholinesterasy (AChE, EC 3.1.1.7). Léčba otrav OF je založena na podání reaktivátoru AChE oximového typu společně s parasympatolytikem atropinem a antikonvulzivem diazepamem. Mezi nejčastěji používané reaktivátory AChE patří obidoxim, trimedoxim, pralidoxim, methoxim a asoxim (HI-6). Žádný z dosud známých reaktivátorů není schopen uspokojivě reaktivovat AChE inhibovanou všemi typy OF. Cílem práce bylo analyzovat a kvantifikovat přítomnost nově připravených oximů v biologickém materiálu. Potkanům kmene Wistar byly i. m. aplikovány nové sloučeniny a poté k analýze odebrána plazma a mozek, Zároveň byly provedeny studie vaznosti testovaných látek na plasmatické proteiny, se zaměřením na albumin. Schopnost vazby byla hodnocena pro jednotlivé oximy v odpovídajících Cmax. Laboratorním potkanům byly aplikovány (i. m.) terapeutické dávky (5 % LD50) K027 (7,5 mg/kg) a trimedoximu (22,3 mg/kg). Vzorky se odebíraly 60. min. po i. m. aplikaci. Mozky byly ještě rozděleny na bazální ganglia, frontální kůru a pontomedularní oblast. Mozková tkáň byla důkladně opláchnuta ve fosfátovém pufru, aby se zabránilo křížové kontaminaci z krve. Následovala deproteinizace vzorků a měření pomocí HPLC. Maximální koncentrace K027 v plazmě byla 20,327 μg (± 1,87), v bazálních gangliích 51,92 ng (± 3,18), ve frontální kůře: 112,40 ng (± 24,75) a v pontomedularní oblasti: 112,50 ng (± 0,55). Trimedoxim byl používán jako standard. Jeho maximální plazmatická koncentrace byla 4,84 ng (± 0,29), v bazálních gangliích: 41,47 ng (± 15,54), ve frontální kůře: 124,80 ng (± 16,19) a v pontomedularní oblasti: 70.72 ng (± 59,53). Vaznost testovaných sloučenin nepřekročila 5 %, což bylo očekávané vzhledem k jejich struktuřeVelká výhoda této metody je schopnost detekce i velmi nízkých koncentrací oximů nejen v krvi, ale také v různých částech mozku, což nám umožňuje přesnější stanovení distribuce v jednotlivých kompartmentech, a tak i možnost získávat důležité údaje pro jejich bezpečné použití. Projekt byl podporován Dlouhodobým záměrem rozvoje organizace 1011.

125

P-61

SIMPLE AND RAPID CAPILLARY ELECTROPHORESIS ANALYSIS OF FORMATE IN BLOOD OF METHANOL INTOXICATED PERSONS PAVLA PANTŮČKOVÁ, PAVEL KUBÁŇ*, PETR BOČEK Institute of Analytical Chemistry of the Academy of Sciences of the Czech Republic, v. v. i., Veveří 97, CZ-60200 Brno, Czech Republic; [email protected]

Formate is primarily responsible for the toxicity in methanol poisonings since it is the major metabolite of methanol dehydrogenation in human bodies. We describe a cheap, disposable sample pretreatment device with planar supported liquid membrane (SLM) for automated pretreatment and analysis of formate in undiluted whole blood and serum samples. A commercial capillary electrophoresis (CE) instrument was in-line coupled to this sample pretreatment device. All analytical procedures except for filling the pretreatment device with donor and acceptor solutions, were performed fully automatically. The disposable pretreatment device required only µL volumes of blood sample and organic solvent per extraction. Good repeatability of peak areas ( 7.7%) and migration times ( 1.5%), linear relationship (r2 = 0.998 – 0.999) and limits of detection ( 35 µM) were achieved. The overall analytical process including blood withdrawal, filling the SLM device with respective solutions, extraction of blood sample, injection into separation capillary and CE separation of formate from other anions took less than 4 min. Direct determination of elevated formate concentrations in undiluted serum samples of a methanol intoxicated patient proved the method to be practical and useful. The described method is compatible with currently commercially available CE instrumentation. Extraction devices are disposable, minimum sample handling/consumption, and short extraction/analysis times show that the developed method might be attractive for rapid diagnosis of methanol poisoning in clinical and toxicological laboratories.

Financial support from the Academy of Sciences of the Czech Republic (Institute Research Funding RVO:68081715) and the Grant Agency of the Czech Republic (Grant No. 1305762S) is gratefully acknowledged.

126

P-62

SROVNÁNÍ ŮČINKU TRIHYDROXYDIHYDROCHALKONU A FLAVONOIDŮ V EXPERIMENTU BARTOŠÍKOVÁ LENKA1, NEČAS JIŘÍ1, BARTOŠÍK TOMÁŠ2, PAVLÍK MARTIN2, FRÁŇA PETR3 1Univerzita

Palackého v Olomouci, Lékařská fakulta, Ústav fyziologie, Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc; [email protected] 2 Fakultní nemocnice u Sv. Anny v Brně, Anesteziologicko-resuscitační klinika, Pekařská 53, 656 91 Brno 3 Fakultní nemocnice u Sv. Anny v Brně, II. interní klinika, Pekařská 53, 656 91 Brno

Úvod: 2´, 3, 4´- trihydroxydihydrochalkon je syntetická látka. Osajin a pomiferin jsou hlavní obsahové látky Maclura pomifera, Moraceae. Cílem studie bylo porovnat antidiabetický a antioxidační efekt testovaných látek u navozeného alloxanového diabetu v experimentu. Metodika: Zvířata byla rozdělena do 5 skupin (n = 10). Skupinám léčeným byl podáván chalkon (skupina 1), osajin (skupina 2), resp. pomiferin (skupina 3) v dávce 10 mg/kg v 0,5% roztoku Avicelu perorálně 1x denně, skupině placebo byl podáván pouze roztok Avicelu. Intaktní skupina byla bez zákroku a bez medikace. Byly stanoveny: hladina glukózy v séru na začátku a konci experimentu, ztráty glukózy a bílkovin močí, diuréza, antioxidační enzymy, celková antioxidační kapacita a hladina malondialdehydu, a to na konci experimentu. Byly odebrány vzorky ledvinné tkáně a pankreatu pro histopatologické vyšetření. Získané hodnoty sledovaných laboratorních parametrů byly zpracovány pomocí tabulkového procesoru Microsoft Excel a statisticky vyhodnoceny, hodnota p ≤ 0,05 byla považována za signifikantní. Výsledky – viz tabulka:

Léčená skupina 1 Léčená skupina 2 Léčená skupina 3 Placebo skupina Intaktní skupina

Glukóza v séru (mmol/l)

SOD (U/ml)

GSHPx (μkat/l)

AOC (mmol/l)

MDA (mmol/l)

Diuréza (ml/den)

Glykosurie (mmol/l)

10,15 ± 1,05 **

227,93 ± 13,47

1188,20 ± 91,41 * 1193,20 ± 94,06 • 1245,13 ± 89,31 •• 1079,32 ± 79,91 1821,60 ± 55,07

0,81 ± 0,05 *

3,84 ± 0,36 **

15,40 ± 0,35 **

2,29 ± 0,32 **

0,94 ± 0,05 ••

1,28 ± 0,49 ••

2,19 ± 0,45 ••

0,85 ± 0,05 • 0,77 ± 0,08 1,20 ± 0,06

1,29 ± 0,49 •• 5,37 ± 0,64 1,01 ± 0,05

16,50 ± 0,25 •• 14,50 ± 0,35 •• 28,45 ± 1,25 12,45 ± 0,45

9,12 ± 0,93 •• 8,62 ± 1,43 •• 20,35 ± 0,45 4,92 ± 0,72

202,10 ± 5,64 •• 207,15 ± 10,31 •• 233,64 ± 8,47 58,82 ± 2,76

Vysvětlivky ** p ≤ 0,01 léčená chalkonem vs placebo * p ≤ 0,05 léčená chalkonem vs placebo

1,17 ± 0,45 •• 3,55 ± 0,53 1,13 ± 0,54

Ztráty bílkovin močí (g(l) 0,94 ± 0,27 ** 0,93 ± 0,37 •• 0,83 ± 0,37 •• 1,56 ± 0,25 0,43 ± 0,16

•• p ≤ 0,01 léčená osainem, resp. pomiferinem vs placebo • p ≤ 0,05 léčená osainem, resp. pomiferinem vs placebo

Závěr: Výsledky biochemického vyšetření ukazují na srovnatelný antidiabetický a antioxidační efekt obou flavonoidů, resp. na efekt chalkonu. Histopatologické nálezy s těmito výsledky korelují pouze částečně. Klíčová slova: chalkon, osajin, pomiferin, diabetes mellitus, antioxidační efekt

127

Přehled účastníků a příspěvků

125

Andriamainty Fils ………………………………………………bez příspěvku Bartl Tomáš……………………………………………………….bez příspěvku Bartoš Peter ……………………………………………………………………..P-1 Bartošíková Lenka…………………………………………………………….P-62 Beneš Luděk………………………………………………………bez příspěvku Beneš Petr……………………………………………………………………….…S-3 Bezáková Lýdia………………………………………………..P-2, P-10, P-42 Brus Jiří………………………………………………………………………………L-3 Bureš Jan……………………………………………………………………………P-3 Cidlina Antonín…………………………………………………………..S-1, P-4 Csöllei Jozef……………………………………………………P-20, P-47, P-48 Čižmárik Jozef…………………………………………………………………….P-5 Čižmáriková Ružena……………………………………………S-6, P-6, P-37 Čonka Patrik………………………………………………………………………P-7 Daňková Ivana……………………………………………………………………P-8 Galba Jaroslav…………………………………………………P-27, P-43, P-59 Garaj Vladimír…………………………………………………..S-6, S-13, P-57 Goněc Tomáš……………………………………………………………………..P-9 Habala Ladislav………………………………………………….bez příspěvku Holas Ondřej…………………………………………………………………….S-10 Holková Ivana………………………………………………………….P-10, P-17 Horáková Renáta…………………………………………………….P-11, P-21 Hrabálek Alexandr……………………………………..S-9, P-7, P-15, P-36 Hroboňová Katarína…………………………………………………….S-2, P-6 Hroch Lukáš……………………………………………………………………..P-12 Hrušková Kateřina…………………………………………………………….P-13 Janďourek Ondřej…………………………………………………………….P-14 Karabanovich Galina…………………………………………S-9, P-15, P-36 Kastner Petr……………………………………………………P-16, P-35, P-44 Klimešová Věra……………………………………………… S-9, P-15, P-36 Kollárová Renáta………………………………………………………………P-17 Kopečná Monika………………………………………………………………P-18 Kováčiková Veronika……………………………………………….P-17, P-19 Kroutil Aleš………………………………………………………………………P-20 Kubásková Marcela…………………………………….MERCK MILLIPORE Kubíček Vladimír……………………………………………….S-7, P-14, P-46 Kubincová Janka……………………………………………..P-11, P-21, P-41 Kubínová Renata………………………………………………………………P-22 Kuča Kamil……………………………………………………………….P-23, P-60 Kuneš Martin…………………………………………………………P-23, P-24 Landová Hana…………………………………………………………………..P-25

126

Macková Anna………………………………………………………………….P-26 Malíček Oldřich…………………………………………………………MANEKO Malík Ivan………………………………………………………………..P-48, P-49 Maráková Katarína…………………………………………P-27, P-43, P-59 Marek Jan…………………………………………………………………………P-28 Martincová Iva ……………..SOTAX Pharmaceutical Testing s.r.o. Maruniak Matej………………………………………………………P-29, P-47 Marvanová Pavlína…………………………………………………………..P-30 Matuška Marek………………………………………………………………..P-31 Mikušová Katarína………………………………………………………………L-5 Miletín Miroslav………………………………………………………………….L-7 Mokrý Milan………………………………………………………………….…P-32 Mokrý Petr…………………………………………………….P-30, P-33, P-40 Mučaji Pavel……………………………………………………………..L-6, P-26 Murányi Andrej………………………………………………………………..P-1 Muselík Jan………………………………………………………………………P-34 Nejedlý Tomáš………………………………………………………………….P-35 Němeček Jan………………………………………………………………S-9,P-36 Nešporová Kristina...………………………………………………………….L-1 Némethy Andrej…………………………………………………………P-6,P-37 Nobilis Milan………………………………………………………………………S-5 Nováková Michaela………………………………………………………….P-38 Nováková Veronika……………………………………….L-7, S-1, S-12,P-4 Opálka Lukáš…………………………………………………………………….P-39 Padrtová Tereza……………………………………………………………….P-30 Pantůčková Pavla……………………………………………………………..P-61 Pávek Petr…………………………………………………………… L-4, L-8, S-9 Pavlica Jiří…………………………………………………………………………P-40 Pazourek Jiří…………………………………………………………….S-14, P-40 Pechová Iveta…………………………………………………..P-21,P-41,P-45 Pekárová Mária………………………………………………………….P-2,P-42 Piešťanský Juraj…………………………………………………P-2, P-43,P-59 Pilařová Pavla………………………………………………….P-16, P-35,P-44 Pisárčik Martin………………………………………………………………….S-11 Polakovičová Mája……………………………………………………..S-6,S-11 Pošvec Zdeněk ………………SOTAX Pharmaceutical Testing s.r.o. Procházková Dana………………………………………….SIGMA-ALDRICH Prýma Jaroslav…………………………………………………..bez příspěvku Puč Vojtěch………………………………………………………..bez příspěvku Pullmanová Petra……………………………………………………………….S-4 Pupák Matúš…………………………………………………………………….P-45

127

Roh Jaroslav……………………………………….S-9, P-7, P-15,P-18,P-36 Říhová Blanka……………………………………………………………………..L-2 Servusová Barbora…………………………………………….S-8, S-10,P-46 Scholz Walter……………………………………………………………………P-47 Sichrovská Ľubica……………………………………………………………..P-48 Stankovičová Mária………………………………………………………….P-49 Stopková Lenka………………………………………………………………..P-50 Zbyněk Svoboda………………………………………………….PRO.MED.CS Szotkowská Renata…………………………………………………………..P-51 Šesták Vít………………………………………………………………………….P-52 Šimek Michal……………………………………………………………………P-53 Špačková Věra………………………………………………………………….P-54 Špulák Marcel…………………………………………………………………….L-8 Šrámková Ivana………………………………………………………………..P-55 Švec Jan……………………………………………………………………………P-56 Velebný Vladimír………………………………………………………………..L-1 Timko Lukáš……………………………………………………………………..P-57 Tóth Jaroslav…………………………………………………………………….P-58 Veizerová Lucia………………………………………………………..P-43,P-59 Vybíralová Zuzana………………………………………………bez příspěvku Zajíčková Renata………………………………………MERCK MILLIPORE Zemek Filip………………………………………………………………P-24, P-60 Zimčík Petr…………………………………………. L-7, S-1, S-12, P-4, P-56 Zitko Jan……………………………………………………………S-8, S-10, P-46

128

Adresář účastníků

129

Doc. Mgr. Fils Andriamainty, PhD. Katedra farmaceutickej chémie Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

ing. Jiří Brus, Dr. Ústav makromolekulární chemie Akademie věd České republiky Heyrovského nám. 2 162 06 Praha 6 [email protected] Mgr. Jan Bureš Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

PharmDr. Tomáš Bartl, Ph.D. Synthon s.r.o. Brněnská 32 678 17 Blansko [email protected] RNDr. Peter Bartoš, PhD. hameln rds a.s. Horná 36 900 01 Modra [email protected]

Mgr. Antonín Cidlina Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

MUDr. PharmDr. Lenka Bartošíková, Ph.D. Ústav fyziologie Univerzita Palackého v Olomouci Lékařská fakulta Hněvotínská 3 775 15 Olomouc [email protected]

Prof. RNDr. Jozef Csöllei, CSc. Ústav chemických léčiv Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně Farmaceutická fakulta Palackého tř. 1/3 612 42 Brno [email protected]

Prof. RNDr. Luděk Beneš, DrSc. důchodce [email protected] Mgr. Petr Beneš, Ph.D Ústav experimentální biologie Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Kotlářská 2 611 37 Brno [email protected]

Prof. RNDr. Jozef Čižmárik, Ph.D. Katedra farmaceutickej chémie Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

doc. RNDr. Lýdia Bezáková, CSc. Katedra bunkovej a molekulárnej biológie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

doc. RNDr. Ružena Čižmáriková, CSc. Katedra chemickej teórie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

130

RNDr. Patrik Čonka, Ph.D. Katedra anorganické a organické chemie Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

PharmDr. Ondřej Holas, Ph.D. Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

PharmDr. Ivana Daňková Ústav přírodních léčiv Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně Farmaceutická fakulta Palackého tř. 1/3 612 42 Brno [email protected]

Mgr. Ivana Holková, PhD. Katedra bunkovej a molekulárnej biológie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

Ing. Bc. Jaroslav Galba Katedra farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

Ing. Renáta Horáková, PhD. Katedra chemickej teórie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

PharmDr. Vladimír Garaj, PhD Katedra farmaceutickej chémie Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

Prof. PharmDr. Alexandr Hrabálek, CSc. Katedra anorganické a organické chemie Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

PharmDr. Tomáš Goněc, Ph.D. Ústav chemických léčiv Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně Farmaceutická fakulta Palackého tř. 1/3 612 42 Brno [email protected]

doc. Ing. Katarína Hroboňová, PhD. Oddelenie analytickej chemie Slovenská technická univerzita v Bratislave Fakulta chemickej a potravinárskej chémie Radlinského 9 812 37 Bratislava [email protected]

Ing. Ladislav Habala, PhD. Katedra chemickej teórie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

Mgr. Lukáš Hroch Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

131

Mgr. Kateřina Hrušková Katedra anorganické a organické chemie Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

Mgr. Monika Kopečná Katedra anorganické a organické chemie Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

Mgr. Ondřej Janďourek Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

PharmDr. Veronika Kováčiková Katedra bunkovej a molekulárnej biológie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

Ing. Galina Karabanovich Katedra anorganické a organické chemie Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

Mgr. Aleš Kroutil Ústav chemických léčiv Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně Farmaceutická fakulta Palackého tř. 1/3 612 42 Brno [email protected]

PharmDr. Petr Kastner, Ph.D. Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

Ing. Marcela Kubásková Merck Millipore Na Hřebenech II 1718/10 140 00 PRAHA 4 [email protected] Ing. Vladimír Kubíček, CSc. Katedra biofyziky a fyzikální chemie Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

Doc. RNDr. Věra Klimešová, CSc. Katedra anorganické a organické chemie Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

RNDr. Janka Kubincová, PhD. Katedra chemickej teórie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

PharmDr. Renáta Kollárová Katedra bunkovej a molekulárnej biológie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

132

PharmDr. Renata Kubínová, Ph.D. Ústav přírodních léčiv Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně Farmaceutická fakulta Palackého tř. 1/3 612 42 Brno [email protected]

PharmDr. Katarína Maráková, PhD. Katedra farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

Prof. Ing. Kamil Kuča, Ph.D. Centrum biomedicínského výzkumu Fakultní nemocnice Hradec Králové Sokolská 581 500 05 Hradec Králové [email protected]; [email protected]

PharmDr. Jan Marek, Ph.D. Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

RNDr. Martin Kuneš, Ph.D. Centrum biomedicínského výzkumu Fakultní nemocnice Hradec Králové Sokolská 581 500 05 Hradec Králové [email protected]

Ing. Iva Martincová SOTAX Pharmaceutical Testing s.r.o. Průmyslová 1306/7 102 00 Praha 10 [email protected]

Mgr. Hana Landová Ústav technologie léků Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně Farmaceutická fakulta Palackého tř. 1/3 612 42 Brno [email protected]

PharmDr. Matej Maruniak Katedra farmaceutickej chémie Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

PharmDr. Anna Macková Katedra farmakognózie a botaniky Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

Mgr. Pavlína Marvanová Ústav chemických léčiv Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně Farmaceutická fakulta Palackého tř. 1/3 612 42 Brno [email protected]

Ing. Oldřich Malíček Maneko spol. s. r. o. Na Pískách 71 160 00 Praha 6 [email protected]

Mgr. Marek Matuška Katedra chemickej teórie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

PharmDr. Ivan Malík, PhD. Katedra farmaceutickej chémie Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

133

Doc. RNDr. Katarína Mikušová, PhD. Katedra biochémie Univerzita Komenského v Bratislave Prírodovedecká fakulta Mlynská dolina CH-1 842 15 Bratislava [email protected]

Doc. Mgr. Jan Muselík, Ph.D. Ústav technologie léků Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně Farmaceutická fakulta Palackého tř. 1/3 612 42 Brno [email protected]

PharmDr. Miroslav Miletín, Ph.D. Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

Mgr. Tomáš Nejedlý Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové 500 05 Hradec Králové [email protected] Mgr. Jan Němeček Katedra anorganické a organické chemie Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

RNDr. Milan Mokrý, CSc. Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

Mgr. Andrej Némethy Katedra chemickej teórie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

Mgr. Petr Mokrý, Ph.D. Ústav chemických léčiv Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně Farmaceutická fakulta Palackého tř. 1/3 612 42 Brno [email protected]

Mgr. Kristina Nešporová Contipro-Group s.r.o. 561 02 Dolní Dobrouč 401 [email protected]

doc. PharmDr. Pavel Mučaji, PhD. Katedra farmakognózie a botaniky Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

Doc. PharmDr. Milan Nobilis, CSc. Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

PharmDr. Andrej Murányi hameln rds a.s. Horná 36 900 01 Modra [email protected]

Ing. Michaela Nováková, Ph.D. Výzkumný ústav organických syntéz 533 54 Rybitví 296 [email protected]

134

PharmDr. Veronika Nováková, Ph.D. Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

doc. RNDr. Jiří Pazourek, Ph.D. Ústav chemických léčiv Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně Farmaceutická fakulta Palackého tř. 1/3 612 42 Brno [email protected]

Mgr. Lukáš Opálka Katedra anorganické a organické chemie Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

Ing. Iveta Pechová, PhD. Katedra chemickej teórie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

Mgr. Tereza Padrtová Ústav chemických léčiv Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně Farmaceutická fakulta Palackého tř. 1/3 612 42 Brno [email protected]

PharmDr. Mária Pekárová Katedra bunkovej a molekulárnej biológie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

RNDr. Pavla Pantůčková, PhD. Ústav analytické chemie AV ČR, v. v. i. Veveří 967/97 602 00 Brno [email protected]

PharmDr. Juraj Piešťanský Katedra farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

Doc. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D. Katedra farmakologie a toxikologie Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

Mgr. Pavla Pilařová, Ph.D. Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

Mgr. Jiří Pavlica Ústav chemických léčiv Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně Farmaceutická fakulta Palackého tř. 1/3 612 42 Brno [email protected]

Doc. Ing. Martin Pisárčik, CSc. Katedra chemickej teórie liečív Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

135

RNDr. Mája Polakovičová, PhD. Katedra chemickej teórie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

PharmDr. Jaroslav Roh, Ph.D. Katedra anorganické a organické chemie Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

Ing. Zdeněk Pošvec SOTAX Pharmaceutical Testing s.r.o. Průmyslová 1306/7 102 00 Praha 10 [email protected]

Prof. RNDr. Blanka Říhová, Ph.D., D.Sc. Division of Immunology and Gnotobiology Institute of Microbiology ASCR v.v.i Vídeňská 1083 142 00 Praha [email protected]

RNDr. Dana Procházková Sigma-Aldrich Mládeže 4 169 00 Praha 6 [email protected]

Mgr. Barbora Servusová Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

RNDr. Jaroslav Prýma Synthon s.r.o. Brněnská 32 678 17 Blansko [email protected]

Mgr. Walter Scholz Katedra farmaceutickej chémie Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

Ing. Vojtěch Puč Synthon s.r.o. Brněnská 32 678 17 Blansko [email protected]

PharmDr. Ľubica Sichrovská Katedra farmaceutickej chémie Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

Mgr. Petra Pullmannová, Ph.D. Katedra anorganické a organické chemie Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

Stankovičová Mária Katedra farmaceutickej chémie Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

Mgr. Matúš Pupák Katedra chemickej teórie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

136

Mgr. Lenka Stopková Katedra farmaceutickej chémie Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

Mgr. Ivana Šrámková Katedra analytické chemie Heyrovského 1203Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

PharmDr. Zbyněk Svoboda, PhD. PRO.MED.CS Praha a.s. Telčská 1 140 00 Praha-4-Michle [email protected]

Mgr. Jan Švec, Ph.D. Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

Mgr. Renata Szotkowská Ústav technologie léků Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně Farmaceutická fakulta Palackého tř. 1/3 612 42 Brno [email protected]

Doc. RNDr. Vladimír Velebný, CSc. Contipro-Group s.r.o. 561 02 Dolní Dobrouč 401 [email protected] Mgr. Lukáš Timko Katedra chemickej teórie liečiv Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Kalinčiakova 8 832 32 Bratislava [email protected]

Mgr. Vít Šesták Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

Mgr. Jaroslav Tóth, PhD. Katedra farmakognózie a botaniky Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

Ing. Michal Šimek Ústav chemie pevných látek Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Technická 5 166 28 Praha [email protected] PharmDr. Věra Špačková Ústav přírodních léčiv Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně Farmaceutická fakulta Palackého tř. 1/3 612 42 Brno [email protected]

PharmDr. Lucia Veizerová, PhD. Katedra farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie Univerzita Komenského v Bratislave Farmaceutická fakulta Odbojárov 10 832 32 Bratislava [email protected]

PharmDr. Marcel Špulák, Ph.D. Katedra anorganické a organické chemie Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

RNDr. Zuzana Vybíralová PRO.MED.CS Heyrovského 1207 500 03 Hradec Králové [email protected]

137

RNDr. Renata Zajíčková Ph.D. Merck Millipore Na Hřebenech II 1718/10 140 00 PRAHA 4 [email protected] Mgr. Filip Zemek Katedra toxikologie a Centrum pokročilých studií Univerzita obrany v Brně Fakulta vojenského zdravotnictví v Hradci Králové Třebešská 1575 500 01 Hradec Králové [email protected] Doc. PharmDr. Petr Zimčík, Ph.D. Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected] PharmDr. Jan Zitko, Ph.D. Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Heyrovského 1203 500 05 Hradec Králové [email protected]

138

Sekce sponzorů a vystavovatelů

139

140

141

142

143