“Sur lies” tehnologija pridelave belih in rdečih vin Permanentno podiplomsko izobraževanje s področja vinarstva za kmetijske svetovalce
Tatjana Košmerl, Mitja Jakončič Ljubljana, 12. maj 2009 1
Avtorja:
Tatjana Košmerl, Mitja Jakončič
Naslov:
“SUR LIES” TEHNOLOGIJA PRIDELAVE BELIH IN RDEČIH VIN: Permanentno podiplomsko izobraževanje s področja vinarstva za kmetijske svetovalce
Založnik:
Univerza v Ljubljani Biotehniška fakulteta Oddelek za živilstvo
CIP – Kataložni zapis o publikaciji Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana 663.221/.222(0.034.2) KOŠMERL, Tatjana Sur lies tehnologija pridelave belih in rdečih vin [Elektronski vir] : permanentno podiplomsko izobraževanje s področja vinarstva za kmetijske svetovalce / Tatjana Košmerl, Mitja Jakončič. - Ljubljana : Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2009 Način dostopa (URL): http://www.bf.uni-lj.si/zivilstvo/o-oddelku/katedre-in-druge-org-enote/za-tehnologije-prehranoin-vino.html ISBN 978-961-6333-76-4 1. Jakončič, Mitja 246344960
Vse pravice pridržane. Ponatis (grafični, elektronski ali mehanski, vključno z razmnoževanjem, snemanjem ali prenosom v bazo podatkov) celote ali posameznih delov ni dovoljen brez pisnega soglasja nosilca avtorskih pravic.
2
Kazalo vsebine stran Delitev vinskih droži
1-14
Polisaharidi
15-24
Manoproteini
25-32
Pozitivni učinek polisaharidov v praksi
33-45
Prispevek avtolize kvasovk
46-47
Potencialni problemi in njihovo preprečevanje
48-50
Beljakovinska stabilnost
51-55
Zaključek
56-57 3
1
Delitev vinskih drož droži •
Grobe ali “težke” droži; velikost = od 100 μm do 2 mm
•
Fine ali “lahke” droži; velikost = od 0,1 do 1 μm
POJMI: •
nega, zorenje, (staranje)
•
kvasovke, droži
•
najobičajnejši izraz: zorenje vina na kvasovkah; (fr. sur lie) 4
1
Grobe drož droži • grobe droži so delci, ki se usedejo (sedimentirajo) na dno posode v 24 urah (brez pektina); •
vino brez pektina (ko je pektin celičnih sten grozdne jagode popolnoma hidroliziran) dobimo z dodatkom encimov v mošt ali drozgo, nadalje v mlado belo vino ob pretoku ali kasneje med stiskanjem rdečega vina; Celična struktura grozdne jagode
stena
mebrana
jedro
vakuola pektin
celična stena fizikalna ovira
antociani tanini
5
2
Rdeč Rdeča vina Po pretoku ali stiskanju so grobe droži sestavljene iz: •
rastlinskega materiala;
•
skupkov kristalov vinskega kamna, odmrlih kvasnih celic, barvnih snovi in izločenih taninov;
•
kosmičev, ki nastajajo pri reakcijah med beljakovinami, polisaharidi in tanini med maceracijo drozge.
Med zorenjem vina (po najmanj dveh pretokih vina) so grobe droži sestavljene iz: •
aglomeratov ali skupkov kristalov vinskega kamna, odmrlih kvasnih in bakterijskih celic, barvnih snovi in izločenih taninov; ti skupki se tvorijo od zadnjega pretoka pri reakcijah kristalizacije in polimerizacije med spojinami, ki so topne v vinu. 6
3
2
kontrola
gumiarabika
jajčni beljak
manoproteini
7
4
Bela in rose vina
Po končani alkoholni fermentaciji so grobe droži sestavljene iz: • rastlinskega materiala, če ni bilo zadostno opravljeno samobistrenje ali razsluz mošta pred alkoholno fermentacijo (NTU več kot 200); • skupkov kristalov vinskega kamna, odmrlih kvasnih celic in izločenih koloidnih delcev; • delcev nezreagiranih čistilnih sredstev (bentonit, kazein, PVPP,...). Med zorenjem vina (po najmanj enem pretoku vina) so grobe droži sestavljene iz: • aglomeratov ali skupkov kristalov vinskega kamna, odmrlih kvasnih celic, izločenih koloidnih delcev, ki se tvorijo v času od zadnjega pretoka vina. 8
5
kontrola
bentonit
PVPP
SiO2+želatina
9
6
3
Nevarnost grobih drož droži • grobe droži se neprestano tvorijo v vinu; • zaradi njihove sestave niso zanimive, ker vplivajo bodisi na rastlinski ali vegetalni karakter vina (po zelenem, travi rastlinski delci), nadalje lahko potencirajo zaznavo trpkosti ali grenek okus (po pecljevini); • v vsaki posamezni fazi zorenja vina je potrebno oceniti njihovo vsebnost (količino) in jih ustrezno odstraniti; z vidika njihove tvorbe se pogostnost odstranjevanja zmanjšuje s časom; vseeno pa je potrebno sistematično redno odstranjevanje vsaj na vsake 3 mesece. 10
7
• Njihova prisotnost omogoča takojšnjo vezavo z dodanim SO2 v vezano obliko, kar izniči antioksidativne in protimikrobne lastnosti prostega ali aktivnega žveplovega dioksida. • Nadalje se z vezavo SO2 in zaščito določenih rodov mikroorganizmov le-ti povežejo v skupke, kar onemogoča njihovo odstranitev; omogoča le njihovo preživetje fermentacije in v nadaljevanju kvar vina. Posebno pozornost je potrebno usmeriti v higieno in učinkovito zaščito pred oksidacijo (s SO2) naslednjih rodov: Brettanomyces, Lactobacillus in Pediococcus. • V primeru predfermentativnega dodatka čistilnih sredstev v mošt ali drozgo (bentonita, kazeina in PVPP) je zaradi nastalega etanola med alkoholno fermentacijo omogočena sprostitev neželenih sestavin s teh sredstev, ki so se na sredstva že absorbirala pred začetkom fermentacije. 11
8
Teoretična vrednost molekularne oblike SO2 = 0,825 mg/l 12
9
4
Fine drož droži • fine droži predstavljajo delci, ki ostanejo suspendirani (raztopljeni) še 24 ur po tem, ko je bilo vino premešano ali pretočeno; • gibanje teh suspendiranih delcev dosežemo s prečrpavanjem, pretokom in mešanjem (fr. bâtonnage).
Makromolekule, ki jih med avtolizo sprostijo kvasne celice: polisaharidi (87-97,9 %); od tega odpade na manozo 89,2 % proteinske ali beljakovinske frakcije (1,3-13 %) 13
10
Rdeč Rdeča, bela in rose vina •
fine droži sestavljajo predvsem neaktivne ali odmrle kvasne celice (proti koncu fermentacije) oziroma celice kvasovk in mlečnokislinskih bakterij (proti koncu biološkega razkisa);
•
v primeru vin, ki so bogata na pektinu ali pa vin, ki so bogata na glukanu (le-tega tvori plesen Botrytis cinerea) odpade delitev vinskih droži na grobe in fine. Zavedati se je namreč treba, da sta omenjena polisaharida prav tako prisotna, torej sta v vinu dobro raztopljena in ne sedimentirata. Zato je potrebna predhodna encimska obdelava za cepitev teh makromolekul (ki igrajo vlogo zaščitnih koloidov in tako le preprečujejo bistrenje in filtrabilnost), bodisi s pektolitičnimi encimi in/ali glukanazami, ki traja v odvisnosti od temperature in vsebnosti teh snovi najmanj 24 ur.
14
11
Način delovanja pektolitičnih encimov
pektinmetilesteraze (PME)
pektinliaze (PL) endo poligalakturoraze (PG)
galakturonska kislina karboksilna kislina metilna skupina
• ocenjuje se, da je v vinu po končani alkoholni fermentaciji med 30100 g kvasovk na liter
• ta količina predstavlja zelo pomemben vir polisaharidov, manoproteinov, aminokislin, nukleinskih kislin in estrov, kar se potencira predvsem predvsem v aromi (vonju in okusu vina), seveda ob predpostavki, da so fine droži zdrave in nevtralne. 15
12
5
SESTAVA CELIČNE STENE KVASOVK vrsta Saccharomyces cerevisiae
poliozidi
celična stena
manoproteini periplazmatski proteini
periplazmatski prostor
plazmina membrana
Sestava:
30-60 % polisaharidov (polimeri β-glukana in manani) 15-30 % proteinov (beljakovin) 5-20 % lipidov (maščob)
16
13
Komponente avtoliziranih kvasovk Dušikove spojine (nukleinske kisline, beljakovine in njihovi razgradni produkti) Maščobe ali lipidi (in njihovi razgradni produkti)
Senzorični vpliv Aroma Okus Velikost mehurčkov in obstojnost pene Aroma Velikost mehurčkov in obstojnost pene
Polisaharidi so sestavljeni iz ene ali običajno več glavnih skupin makromolekul, ki jih najdemo v vsakem vinu, imajo pa svoj izvor v grozdju ali pa jih tvorijo različni mikroorganizmi. Najbolj znani polisaharidi so nedvomno manoproteini, ki jih tvorijo in sprostijo kvasovke vrste Saccharomyces cerevisiae med in po končani primarni alkoholni fermentaciji. Drugo skupino polisaharidov predstavljajo glukani, ki jih tvori plesen vrste Botrytis cinerea. 17
14
Celična stena grozdja
hemiceluloza
pektični polisaharidi strukturni proteini
Polisaharidi celuloza
• • • •
sestavljajo ovoj kvasne celice – celično steno; od leta 1990 dalje so številne raziskave dokazale razliko v količini sproščenih polisaharidov med enološkimi kvasovkami, kar je pospešeno z encimsko aktivnostjo glukanaz in rednim mešanjem; polisaharidi prispevajo direktno k senzorični zaznavi strukture vina (zaokroženost okusa, volumen ali polnost, dolžina pookusa, obstojnost ali perzistenca, obloženost, gladkost, prijetnost, sladkost); fizikalni efekt koloidne mreže se kaže v upočasnitvi ali celo preprečitvi reakcij kristalizacije vinskega kamna, medtem ko je glavni kemijski efekt vezava s tanini, barvili in hlapnimi aromatičnimi snovmi v stabilne komplekse, ki niso več razpoložljivi za reakcije polimerizacije in posledično usedanja, kar delno pojasnjuje tudi beljakovinsko stabilnost belih in rose vin (saj kvasni polisaharidi preprečujejo koagulacijo beljakovin grozdja). 18
15
6
Aminokisline in nukleinske kisline (DNA, RNA) •
so v živilski industriji dobro znane kot ojačevalci arome. Sproščene v vino prispevajo k intenzivnosti okusa in kompleksnosti arome (daljši in obstojnejši pookus). Vino se z njimi obogati le na račun mrtvih kvasnih celic
•
mrtve kvasne celice sprostijo v vino tudi posamezne estre, predvsem estre maščobnih kislin s sladkimi in zeliščniimi ali dišavnimi aromami (etilheksanoat, etiloktanoat)
•
njihova sprostitev časovno sovpada s hidrolizo estrov z bolj cvetličnimi, sadnimi aromami ali aromami po kemikalijah, ki nastanejo kot produkt kvasnega metabolizma med fermetacijo (izoamilacetat, heksilacetat). 19
16
• na senzoričnem nivoju se to odraža kot sozvočje primarnih ali sortnih arom grozdja s fermentacijskimi in zorilnimi aromami ⇒ sladke, začimbne in dišavne arome • v primeru zorenja rdečih, belih in rose vin v lesenih posodah pa sproščeni estri iz lahkih droži značilno prispevajo k integraciji aromatičnih snovi vina in lesa • ker poteka časovno v istem času na eni strani sproščanje želenih spojin (aminokislin, nukleinskih kislin in estrov), na drugi strani pa neželenih žveplovih spojin kot glavnih predstavnikov reduktivnih arom, nikakor ne smemo pozabiti na ustrezno mešanje lahkih droži, ki so sestavljene predvsem iz mrtvih kvasnih celic. 20
17
Nevarnost finih drož droži • med alkoholno fermentacijo vinskih kvasovk vrste Saccharomyces cerevisiae lahko nastanejo senzorično zaznavne količine žveplovih spojin; • tudi v nadaljevanju zorenja vina obstaja velika nevarnost, da se v primeru statičnih finih droži (torej brez mešanja) dodatno tvorijo žveplove spojine in kovinski okus vina; • nastanek žveplovih spojin je praktično identičen pri živih in mrtvih kvasnih celicah, dejanksko pa je nevarnost pri slednjih še večja (kritične so lahke droži, ujete v usedlino na dnu posode); zato je nujno potrebno ustrezno mešanje celotnih droži in redno odstranjevanje grobih droži, če so le-te v preveliki količini.
21
18
7
• Z mikrobiološkega stališča lahko žive celice kvasovk rodov Brettanomyces in Pichia tvorijo dodatno žveplove spojine in t.im. animalne vonjave in okuse (po sladkem, zrelem mesu), kar pa je povezano z neustrezno higieno (v kleti in na opremi) • vzrok za njihovo preživetje je hitra vezava aktivnega (prostega) SO2 z veliko maso kvasovk vrste Saccharomyces cerevisiae, dodatno pa se med njihovo avtolizo sprostijo hranilne snovi, ki jih izkoriščajo rodovi kvasovk kvarljivk in oksidativnih kvasovk za svojo rast • razvoj in preživetje rodu Brettanomyces je favorizirano predvsem v prisotnosti velike količine lahkih droži • tudi mlečnokislinske bakterije najdejo v takšnih vinih zadosti hranil za svojo rast, kar omogoča njihov metabolizem citronske kisline in posameznih aminokislin ob povečani dodatni tvorbi ocetne kisline in biogenih aminov; tako mrtve kot žive celice mlečnokislinskih bakterij predstavljajo omenjeno nevarnost, kar lahko omejimo in preprečimo le z ustreznim žveplanjem (pravočasnim in zadostnim). 22
19
Vloga polisaharidov med vinifikacijo vina • polisaharidi so sestavljeni iz ene ali običajno več glavnih skupin makromolekul, ki jih najdemo v vsakem vinu, imajo pa svoj izvor v grozdju ali pa jih tvorijo različni mikroorganizmi • najbolj znani polisaharidi so nedvomno manoproteini, ki jih tvorijo in sprostijo kvasovke vrste Saccharomyces cerevisiae med in po končani primarni alkoholni fermentaciji. Drugo skupino polisaharidov predstavljajo glukani, ki jih tvori plesen vrste Botrytis cinerea.
23
20
Polisaharidi vina Vsa vina vsebujejo polisaharidi, ki se razlikujejo glede na izvor in jih uvrščamo v tri skupine: 1. polisaharidi grozdja: predstavniki te skupine so predvsem pektin in polisaharidi (arabani, galaktani, arabino-galaktani), z molekulsko maso 40-250 kDa. Prispevajo k večji viskoznosti vina, zato je pogosto potrebna uporaba pektolitičnih encimov za izboljšanje bistrenja in filtracije 2. polisaharidi plesni: glavni predstavnik so dobro znani glukani plesni Botrytis cinerea. Te makromolekule so linearne, z molekulsko maso 1.000 kDa in najpogosteje povzročajo filtracijske probleme, ki jih uspešno odpravimo z uporabo ustreznih encimskih preparatov (glukanaz). 3. polisaharidi kvasovk: to skupino predstavljajo linearne molekule beta-glukani (z molekulsko maso 25-270 kDa) in globularne ali kroglaste molekule manoproteini (z molekulsko maso 10-450 kDa). Zaradi svoje tridimenzionalne strukture je značilnost manoproteinov, da ne povzročajo filtracijskih problemov. 24
21
8
Pomen polisaharidov kvasovk • Polisaharidi se sproščajo med alkoholno fermentacijo in nadalje med zorenjem vina na kvasovkah zaradi avtolize kvasnih celic. • Značilno je, da se različni sevi vinskih kvasovk med seboj razlikujejo po sposobnosti tvorbe polisaharidov. • Torej je količina sproščenih polisaharidov v vinu odvisna od seva kvasovk, kot tudi od pogojev fermentacije in zorenja ali staranja vina. • Pri višji temperaturi se sprosti značilno več polisaharidov (npr. primerjava med 35 in 22 ºC). Nadalje se tudi pri mešanju vina (npr. dvigovanje droži ali “angl.: battonage, fr.: bâtonnage”) sprosti večja količina polisaharidov.
25
22
Eksocelularni polisaharidi kvasovk •
•
manoproteini predstavljajo 80 % vseh eksocelularnih polisaharidov: sestavljeni so iz 90 % manoze in 10 % beljakovin. Takoj po alkoholni fermentaciji ta frakcija vsebuje tudi manjše količine glukoze, ki pa po nekaj mesecih zorenja izgine. Območje molekulske mase kvasnih eksocelularnih polisaharidov je zelo široko, od 100.000 do več kot 2.000.000 Da. Povprečna molekulska masa je ocenjena na 250.000 Da. Manoproteine tvorijo linearne peptidne verige, na katere so pritrjene krajše verige do štiri molekul manoze. glukomanoproteini predstavljajo le 20 %: sestavljeni so iz 25 % glukoze, 25 % manoze in 50 % beljakovin. Molekulska masa glukomanoproteinov je mnogo manjša, le od 20.000 do 90.000 Da. Splošna molekulska zgradba izločenih manoproteinov je zelo podobna zgradbi manoproteinov v celični steni.
26
23
Makromolekule, ki jih med avtolizo sprostijo kvasne celice, so sestavljene iz: • polisaharidov (97,9 %); od tega odpade na manozo 89,2 % • proteinske ali beljakovinske frakcije (1,3 %)
Po drugih avtorjih je vsebnost proteinske frakcije ocenjena med 11-13 %, preostalih 87-89 % pa odpade na polisaharide, od katerih je v odvisnosti od seva kvasovk manoze od 88-91 %, glukoze pa 9-12 %. Obe delitvi pa potrjuje dejstvo, da so sproščeni polisaharidi kvasovk predvsem predstavniki manoproteinov. 27
24
9
Manoproteini •
Manoproteini so polisaharidi, ki gradijo celično steno kvasovk. Zgrajeni so iz 100 do 1000 monosaharidnih enot. V vino preidejo med alkoholno fermentacijo, večja količina pa v času zorenja na kvasovkah.
• • • •
V vinarstvu so zelo pomembni zaradi številnih učinkov: zmanjšujejo možnost pojava beljakovinske nestabilnosti zmanjšujejo tvorbo vinskega kamna preprečujejo pojav rožnate barve belih vin (angl. pinking) zmanjšujejo trpkost vin.
•
Manoproteini imajo tudi pomembno vlogo pri zaščiti vina pred oksidacijo, ter tako pripomorejo k ohranitvi arome in barve vina. 28
25
Izvor manoproteinov v vinu • • • •
•
Manoproteini so polisaharidi, ki jih sintetizirajo kvasovke vrste Saccharomyces cerevisiae med alkoholno fermentacijo in so sestavni del zunanjega dela celične stene. V vinu lahko manoproteini izvirajo tudi iz kvasovk Saccharomyces bayanus, ki jih izločajo med ali po končani fermentaciji. Kvasovke izločijo beljakovine, ki jih v glavnem predstavljajo manoproteini z visoko molekulsko maso. Poskus z mlečnokislinskimi bakterijami vrste Oenococcus oeni, kot virom manoproteinov v vinu, tega ni potrdil. Izločanje manoproteinov iz celične stene kvasovk vrste Saccharomyces cerevisiae je povezano s poroznostjo celične stene; največje povečanje koncentracije koloidov v fermentirajočem moštu je značilno za obdobje najštevilčnejše populacije kvasovk, kar sovpada z največjo prepustnostjo celične stene kvasovk. Kvasovke vrste Saccharomyces cerevisiae med alkoholno fermentacijo izločajo manoproteine od sredine eksponencialne faze do začetka stacionarne faze rasti. Med alkoholno fermentacijo kvasovke sprostijo manoproteine kot neporabljene gradnike celične stene. 29
26
• Sprostitev manoproteinov je posledica encimskega delovanja med avtolizo. β-glukanaze, ki so prisotne v celični steni, ohranijo svojo aktivnost tudi nekaj mesecev po odmrtju kvasnih celic in zaradi njihovega delovanja se manoproteini sprostijo v vino. Polisaharidi, ki se pri tem sprostijo, lahko v vinu kasneje reagirajo s fenoli, kar zmanjšuje intenzivnost in odtenke barve belih vin. • Študije so pokazale, da ima N-glikoziliran manoprotein z molekulsko maso 31.800 Da, ki predstavlja fragment invertaze Saccharomyces cerevisiae, večji toplotnostabilizacijski učinek na beljakovine belih vin kot gumiarabika ali ostali visokomolekularni manoproteini. • Prisotnost koloidov grozdja vpliva na sintezo in/ali sproščanje manoproteinov iz kvasovk med alkoholno fermentacijo. 30
27
10
Vloga manoproteinov med vinifikacijo Manoproteini in tartratna stabilnost • Sproščeni manoproteini imajo pozitiven vpliv na tartratno stabilnost oziroma stabilnost na izločanje vinskega kamna. • Mehanizem delovanja najverjetneje temelji na kompetitivni inhibiciji, ki omejuje tvorbo kristalov vinskega kamna. • Ta spoznanja so potrjena tudi v praksi, kjer npr. pri nekajmesečnem zorenju belih vin na kvasovkah ni potrebna hladna stabilizacija vina, ker so le-ta relativno tartratno stabilna. 31
28
Manoproteini in beljakovinska stabilnost • Dokazano je bilo, da imajo manoproteini značilen vpliv na beljakovinsko (proteinsko) stabilnost belih in rose vin. • Naravno prisotni ali dodani manoproteini omogočajo bistveno manjšo potrebno količino bentonita za dosego beljakovinske stabilnosti belih in rose vin. • To tudi pomeni, da se bistveno manj majhnih molekul aromatičnih snovi vina veže in odstrani iz vina z bentonitom. 32
29
Manoproteini in tanini • Nekateri polisaharidi imajo sposobnost vezave s tanini (model interakcij med polisaharidi in tanini), kar se pozitivno odraža na zmanjšanju trpkosti vina. • Kvasovke, ki tvorijo več polisaharidov, omogočajo pridelavo bolj polnega vina (z več telesa), zaookroženega okusa in značilno boljšo barvno stabilnostjo. 33
30
11
Manoproteini in aromatične snovi • Številne raziskave so dokazale sposobnost manoproteinov pri stabilizaciji aromatičnih snovi vina, predvsem naslednjih spojin: etilheksanoat, izoamilacetat, heksanol in beta-ionon. • To je vsekakor odvisno od narave aromatične snovi (hidrofne, hidrofilne, ionske,...), interaktivna moč pa se povečuje s hidrofno naravo aromatične snovi: etilheksanoat > beta-ionon > heksanol. 34
31
Manoproteini in biološki razkis • Manoproteini imajo pozitiven učinek tudi na začetek, potek in dokončanje biološkega razkisa (jabolčnomlečnokislinske fermentacije, MLF). • Začetek in dokončanje MLF je bistveno hitrejše v vinih, kjer je primarna alkoholna fermentacija potekla s kvasovkami, ki so naravno tvorile večje količine polisaharidov. 35
32
Pozitivni uč učinek polisaharidov v praksi • Vinarje predvsem zanima praktična aplikacija oziroma uporabnost polisaharidov, ki se odraža v boljši kakovosti vina in večji sprejemljivosti pri potrošniku. • Nedvomno je prispevek polisaharidov pozitiven v celokupno boljši kakovosti vina, predvsem v okusu in nadalje v stabilnosti vina. • S tega stališča je pomemben trud vinarjev, da povečajo vsebnost polisaharidov v pridelanih vinih, kar pa je možno doseči na različne načine. 36
33
12
1. Izbira seva vinskih kvasovk • Sevi vinskih kvasovk se med seboj značilno razlikujejo po tvorbi ekstracelularnih polisaharidov. • Pridelana vina s kvasovkami, ki tvorijo več polisaharidov, so značilno ocenjena kot mehkejša, z več telesa in boljšim okusom (npr. Lalvin ICV-D254, Lalvin CY3079 and Lalvin BM45). • Prav tako je pri nekaterih sevih (Lalvin D254 in Lalvin BM45) dosežena boljša stabilnost barve pri vinifikaciji rdečih vin.
37
34
Tvorba ekstracelularnih polisaharidov s 27 različnimi komercialnimi sevi kvasovk vrste Saccharomyces cerevisiae Štev. Koncentracija Štev. Koncentracija kvasovke polisaharidov (mg/L) kvasovke polisaharidov (mg/L) 1
62
15
22
2
47
16
81
3
90
17
75
4
46
18
89
5
48
19
88
6
40
20
79
7
37
21
72
8
51
22
73
9
15
23
73
10
56
24
78
11
23
25
71
12
56
26
87
13
24
27
144
14
53
38
35
2. Uporaba encimskih preparatov 2.a Uporaba encimskih preparatov beta-glukanaz • Ti encimi delujejo na celične stene kvasovk in tako prispevajo k sprostitvi manoproteinov. • Njihovo delovanje naravno poteka tudi med avtolizo kvasnih celic s pomočjo endogenih encimov kvasovk (endoglukanaz), ki so locirane v vakuolah celic. • Komercialni encimski preparati (npr. Lallemand MMX) pa pospešijo avtolizo kvasovk, pri čemer so pridelana vina bistveno bolj kompleksna, z več telesa in boljšo tartratno stabilnostjo. 39
36
13
Shematski prikaz celične stene vinskih kvasovk
Legenda: β-D-glukani se sintetizirajo iz citoplazmine membrane in tvorijo prečno povezano mrežo s hitinom; manoproteini (MP) so izpotavljeni zunanji površini celice; delovanje encimov β-(1,3)- in β-(1,6)-D-glukanaz na celično steno kvasovk je označeno s puščicama; hidroliza β-D-glukanov omogoča sprostitev manoproteinov 40 v vino
37
2.b Uporaba mešanih encimskih preparatov pektinaz beta-glukanaz • Sproščanje manoproteinov se značilno pospeši in poveča tudi z mešanico encimskih preparatov: npr. pektinaz iz plesni Aspegillus niger in ß-(1-3)-D-glukanaz iz plesni vrste Trichoderma harzianum, ki jo dodamo v vino pred začetkom zorenja v leseni posodi. • Skupna količina sproščenih manoproteinov je od pet do osemkrat večja v primerjavi z neencimsko obdelanim vinom, ta rezultat pa je lahko dosežen že v 2-3 mesecih namesto običajnih 8-10 mesecev zorenja. • Vina prav tako odlikuje kakovost, zaokroženost okusa, kompleksnost arome in njena nadgradnja in vkomponiranost s komponentami lesa. 41
38
3. Zorenje vina na kvasovkah • Številne so prednosti podaljšanega zorenja belih vin na kvasovkah ali vinskih drožeh po končani alkoholni fermentaciji. • Pravilno in redno dvigovanje droži (“battonage”) nadalje stimulira sproščanje polisaharidov, kar se pozitivno odraža na okusu in telesu vina. • Vpliv “battonagea” je pri belih in rdečih vinih podoben. 42
39
14
• Značilnost vinskih kvasovk vrste Saccharomyces cerevisiae je, da pripadajo askomicetam, skupini gliv, katerih celična stena je zgrajena iz β-(1,3)-glukana in hitina, pretežno pa iz manoproteinov ali proteoglikanov, katere predstavljajo v 5-20 % peptidi in v 80-95 % verige iz manoze.
• β-(1,3)-glukan in hitin sta netopni komponenti celične stene, medtem ko so manoproteini delno topni in se sproščajo med rastjo kvasovk in alkoholno fermentacijo. 43
40
• • •
• • •
Takoj po zaključeni alkoholni fermentaciji se zmanjša živost kvasnih celic in začne se njihova avtoliza (razkroj, razpad). Avtoliza kvasovk je zelo počasen in kompleksen pojav, v katerega so vključeni hidrolitični encimi, kot so to predvsem proteaze, nukleaze, lipaze in glikanaze. Pod vplivom delovanja teh endogenih encimov hidrolaz se sprostijo v vino komponente citoplazme (peptidi, aminokisline, nukleotidi, kratkoverižne maščobne kisline) in celične stene (manoproteini) kvasne celice. Te spremembe v sestavi vina so združene z izboljšanjem senzoričnih lastnosti vina, kar se odraža predvsem v boljšem občutku v ustih ter bolj kompleksni aromi. Z nadaljnjim zorenjem vina na drožeh se pokažejo tudi tehnološke izboljšave (tartratna in beljakovinska stabilnost) v povezavi s sprostitvijo specifične frakcije manoproteinov. Značilnost »finih« droži je tudi absorpcija kisika, kar omogoča počasno in kontrolirano oksidacijo med zorenjem vina. 44
41
•
Vsi omenjeni pozitivni učinki in izboljšanja zaradi spontane avtolize kvasovk potekajo zelo počasi med zorenjem vina na drožeh, tradicionalno v lesenih hrastovih sodih, s tedenskim premešavanjem oziroma dvigovanjem droži (»battonage«).
•
Prav količina sproščenih manoproteinov med zorenjem vina se uporablja kot splošni marker za spontano avtolizo kvasovk med zorenjem.
•
V tradicionalnih postopkih se sprosti manj kot 50 mg/L manoproteinov v desetih mesecih. V kolikor je po tem času celična stena še vedno nespremenjena, to predstavlja oviro za difuzijo drugih komponent kvasovke v vino, kar zelo omeji siceršnje prednosti takšnega zorenja.
•
V takšnih primerih je bilo večkrat dokazano, da je kinetika sprostitve manoproteinov neodvisna od seva kvasovk, čeprav so si mnenja različnih tujih avtorjev o tem nasprotujoča. 45
42
15
• Pozitiven vpliv polisaharidov se nadalje kaže v izboljšanju barvnih parametrov in zmanjšanju vsebnost reaktivnih taninov, zlasti v belih vinih. • Pri zorenju belih vin na kvasovkah v lesenih sodih, se nadaljuje sprostitev manoproteinov, ki so sposobni reakcije in vezave s fenolnimi spojinami vina, kot tudi s tanini, ekstrahiranimi iz lesa. • Po nekajmesečnem zorenju belega vina v sodih je značilno manjša vsebnost rumenih barvil, skupni polifenolni indeks in manjša vsebnost reaktivnih taninov, ki se hitro in zelo radi oksidirajo v prisotnosti molekularnega kisika. • Tako pridelana vina so tako mehkejša v okusu in zato bolj pitna. 46
43
• Zorenje belih vin na kvasovkah se nadalje pozitivno odraža na zmanjšanju občutljivosti vina na oksidativno rožnato obarvanje (angl. pinking). • To se običajno kaže v spremembi barve vina v sivo-rožnat odtenek že pri rahli oksidaciji vina pri postopkih stabilizacije ali stekleničenja vina. • Temu so zlasti podvržena mlada bela vina, npr. sauvignon, zato jih je potrebno ustrezno zaščiti pred oksidacijo in spremembami barve. • Žal pa spojine ali spojin, ki bi bile vključene v popolno zaščito pred tem pojavom, še ne poznamo. 47
44
4. Fermentacija rdečega mošta (drozge) pri višjih temperaturah • Pri višjih temperaturah je znana obsežnejša sprostitev manoproteinov kvasovk. • Pri tem ne smemo pozabiti, da je pri višjih temperaturah (več kot 30 ºC) tudi nastala koncentracija etanola lahko kritična za delovanje in preživelost kvasnih celic. • Tudi postfermentativna maceracija (vino v kontaktu z jagodnimi kožicami) po končani alkoholni fermentaciji značilno prispeva k povečani sprostitvi manoproteinov. 48
45
16
Prispevek avtolize kvasovk 1. polisaharidi prispevajo k zaokroženosti in polnosti okusa (volumen) 2. manoproteini se vežejo z antociani in tanini, kar poveča stabilnost barve in zmanjša trpkost 3. sproščene hranilne snovi iz odmrlih kvasnih celic služijo za rast mlečnokislinskih bakterij (tvorba diacetila – povečanje viskoznosti, kremnosti) 4. vezava določenih aromatičnih hlapnih komponent v polisaharidno mrežo omogoča večjo stabilnost sadnih arom, ki so zaščitene pred oksidacijo 5. reakcija proteolize omogoča hidrolizo beljakovin do aminokislin, ki so prekurzorji aromatičnih snovi (večja kompleksnost arome), in posameznih peptidov (povečanje vsebnosti dušikovih spojin) 49
46
6.
odmrle kvasne celice tudi sproščajo estre zlasti maščobnih kislin s senzoričnimi deskriptorji sladko/sadno, kar sovpada s časom hidrolize med fermentacijo nastalih estrov s prijetno sladko/začimbno/sadnimi aromi 7. z vezavo fenolov lesa in organskih kislin se povečuje senzorična zaznava sladkosti; dodatno se spremeni sestava estrov in ekstrahiranih aromatičnih snovi lesa) 8. omogočeno je spontano čiščenje vina ob istočasnem zmanjšanju intenzivne rumene barve belih vin 9. dosežena je beljakovinska stabilnost vin, ki preprečuje polimerizacijo taninov, barvil in hlapnih snovi, kar je pospešeno pri višjih temperaturah, podaljšanem času zorenja vina in ustreznem mešanju droži (npr. enkrat tedensko) 10. dosežena je lahko tudi tartratna stabilnost, saj so sproščeni manoproteini zaviralci kristalizacije kalijevega hidrogentartrata (vinskega kamna) 11. zmanjšanje intenzivnosti barve je posledica velike notranje površine kvasnih celic, na katero se vežejo nestabilna barvila 50
47
Potencialni problemi in njihovo prepreč preprečevanje • Z redno senzorično analizo vina med podaljšanim zorenjem spremljamo predvsem tvorbo reduktivnih arom, predvsem H2S, merkaptanov ali intenzivne arome po kvasovkah (yeasty aromas), do česar pride lahko pri nerednem mešanju oziroma dvigovanju sicer zdravih vinskih droži, kar je povezano s procesi gnitja. • Korektivni ukrepi: rahel zračni pretok in ustrezno žveplanje • Pri preveč oksidativnem mešanju pa se lahko obratno kot v zgornjem primeru tvori večja vsebnost acetaldehida in ocetne kisline, torej oksidativne arome, zato je še kako pomembna ustrezna zaščita z molekularno obliko SO2, ki je funkcija pH vina. 51
48
17
Pogostnost meš mešanje Splošna priporočila: nekateri začnejo z mešanjem vsake 23 dni v zaključni fazi alkoholne fermentacije (s tem je preprečena zastrupitev kvasovk), čeprav je običajen začetek takoj po končani alkoholni fermentaciji: • prvih šest mesecev 1-2 krat tedensko, • nato enkrat tedensko prve 4 tedne, • naslednjih 6 tednov na vsakih 14 dni, • kasneje pa le enkrat mesečno. Običajno zorenje na kvasovkah poteka skupno 8-10 mesecev, v izjemnih primerih pa tudi 18-24 mesecev. 52
49
Posebni primeri pogostnosti mešanja • enkrat tedensko mešanje prvih 12-24 mesecev, dokler v celoti ne poteče biološki razkis, • nato v nadaljevanju pa le občasno (po potrebi glede na senzorično analizo). • Drugi vinarji zagovarjajo potrebno mešanje na 7-10 dni v prvih 4 mesecih, nato pa le enkrat mesečno.
53
50
Beljakovinska stabilnost Na izboljšanje beljakovinske stabilnosti belih vin med zorenjem vina na kvasovkah močno vplivajo naslednji parametri: • čas zorenja na kvasovkah, • količina droži, • Velikost in starost sodov • frekvenca mešanja usedline. Večjo beljakovinsko stabilnost dosežemo z uporabo rabljenih, kot pa novih sodov in pri večji frekvenci dvigovanja usedline. 54
51
18
• Izboljšana beljakovinska stabilnost vin ima velik pomen, saj zmanjša porabo bentonita v postopku čiščenja vina. • Sproščeni manoproteini tudi pospešujejo stabilizacijo vina na vinski kamen. • Dodatno pa encimi, sproščeni iz kvasovk, lahko hidrolizirajo glukozide in tako sprostijo v vino aromatične komponente. • Z izvajanjem mešanja usedline (fr. battonage) med zorenjem na kvasovkah se izognemo nizkemu redoks potencialu usedline in preprečimo posledični nastanek nezaželenih žveplovih vonjev, ker omogočamo zadostno aeracijo. • Zdi se, da usedlina absorbira ali metabolizira merkaptane. 55
52
• Mlada vina, ki jih pustimo na drožeh, postajajo z zorenjem vse manj motna. • Za dosego beljakovinske stabilnosti takih vin porabimo manjše količine bentonita. • Kvasovke nestabilnih beljakovin ne asimilirajo, niti jih ne adsorbirajo. Nestabilne beljakovine postanejo termostabilne v prisotnosti določenih koloidov-manoproteinov. • Tako lahko postavimo hipotezo, da so določeni manoproteini, ki se sprostijo z avtolizo v vino med zorenjem na kvasovkah, sposobni zmanjšati toplotno občutljivost (termolabilnih) beljakovin. • Vina, zorena na kvasovkah, imajo manjši potencial za nastanek motnosti in zahtevajo manjše količine bentonita za dosego beljakovinske stabilnosti kot vina, ki smo jih pretočili z droži in so vsebovala enake začetne koncentracije beljakovin. 56
53
•
•
•
•
•
Za pospešeno bistrenje mošta (OENO 11/2004) in vina (OENO 12/2004) je dovoljena uporaba encimskih preparatov: poligalakturonaze, pektinliaze, pektinmetilesteraze in/ali β-glukanaze, ki s svojo aktivnostjo katalizirajo razgradnjo pektina, polisaharidov in β-glukanov, ki jih tvorijo plesni. Pri maceraciji grozdja (OENO 13/2004) se v drozgo dodajajo naslednji encimski preparati: poligalakturonaze, pektinliaze, pektinmetilesteraze, celulaze in hemicelulaze, ki s svojo aktivnostjo katalizirajo razgradnjo polisaharidov celične stene grozdne jagode. Namen encimske obdelave je pospešitev postopka maceracije, ekstrakcije barvnih in fenolnih snovi ter aromatičnih snovi iz jagodne kožice. Za izboljšanje filtrabilnosti mošta (OENO 14/2004) in vina (OENO 15/2004) na podlagi specifične hidrolize koloidov je dovoljen dodatek naslednjih encimov: poligalakturonaze, pektinliaze, pektinmetilesteraze in/ali βglukanaze, ki s svojo aktivnostjo katalizirajo razgradnjo pektina, polisaharidov in β-glukanov, ki jih tvorijo plesni. Za sprostitev aromatičnih snovi (glikoziliranih prekurzorjev) iz jagodne kožice in s tem povečanje aromatičnega potenciala je dovoljen dodatek encimskih preparatov z beta-glikozidazno aktivnostjo v mošt (OENO 16/2004) oziroma v vino (OENO 17/2004). Med zorenjem vina na kvasovkah je dovoljen dodatek encimov predvsem z β-glukanazno aktivnostjo (OENO 18/2004), ki katalizirajo razgradnjo celičnih sten kvasovk in s tem pospešijo sprostitev topnih sestavin kvasovk 57 v vino ter istočasno povečajo koloidno stabilnost vina. 54
19
• •
•
•
Kot enološki kodeks (OENO 26/2004) so obravnavani tudi manoproteini kvasovk Saccharomyces cerevisiae, ki so ekstrahirani iz celičnih sten s fizikalno-kemijskimi ali encimskimi metodami. Za monoproteine je značilna različna struktura, odvisna od molekulske mase, nadalje stopnja in vrsta glikozilacije ter nenazadnje velikost. V odvisnosti od metode ekstrakcije imajo manoproteini kvasovk različen vpliv na tartratno ali beljakovinsko stabilnost vina. Za manoproteine je značilno, da so topni v vodi in netopni v alkoholnih raztopinah (že pri 1 vol.% etanola). Njihovo učinkovitost na tartratno stabilizacijo (učinkovitostni test) preverimo s potrebno količino, ki zadrži kristalizacijo kalijevega hidrogentartrata v alkoholni raztopini. Pri tem testu ne smejo biti prisotni kristali v raztopinah, ki vsebujejo manoproteinov 400 mg/L. Predpisan je tudi učinkovitostni test za beljakovinsko stabilizacijo: po dodatku bovin serum albumina (BSA) v vzorec vina (kontrola) in drugi vzorec vina z dodatkom manoproteinov sledi membranska filtracija (0,45 μm), segrevanje obeh vzorcev v vodni kopeli 80 °C/30 min in ohlajanje na sobni temperaturi 45 minut. Razlika v izmerjeni motnosti med kontrolnim in z manoproteini treniranim vzorcem mora biti najmanj 50 %. V koncentracijskem območju manoproteinov od 0–200 mg/L s tem testom določimo potrebno količino manoproteionov za njihovo učinkovitost na beljakovinsko stabilizacijo. 58
55
Zaključ Zaključek Z izkoriščanjem sproščenih sestavin kvasovk pri vinifikaciji vin je dosežena: • večja “tartratna” stabilnost • večja beljakovinska stabilnost • zmanjšanje trpkosti vina in pridelava bolj polnega vina (z več “telesa”) zaokroženega okusa in boljšo barvno stabilnostjo • boljša aromatika • pozitiven učinek na dokončanje biološkega razkisa
59
56
HVALA ZA POZORNOST
Foto: Mitja Jakončič 60
57
20
