SUMMARY Cardiovascular diseases are a major cause of morbidity and mortality in western and developed muntlries. Because a diversity of risk markers is related with ibs prevarl~ence,wrdiovascular diseases have a mwltifactorial aetiology. Some of these risk markers such as an unfavourable lipoprotein profile, increased t~hrombotic tendency, inlcreased oxidative stress and law-grade inflammation can be affeclted by changing total fat or fafatty acid intake. In the past, redlwction of the dietary fat intake has beeln tlhe major focus of dietary recommendatioins to lower ca~rdiovascular disease risk. Iln the last decades, evide~nceis accumulating that an exchange of harmful fatty ai~idsby fatty acidis wilth more beneficial effects rather than a redluction in total fat. intake decreases cardialvascular disease risk more effectively. Dependent on their structure and function, fatty acids exelrt differential effects on ca~rdiovascularrisk markers. In this thesis, the edfecfs of fatty acids - in particular of thle C"1 fatty acids stearic acid, olleic acid, and linoleic acid and of conjugated li~nole~ic acids (GLA) - on card~iovasculardisease risk markers have been describled. Also effects on fatty ac1iddesat~~ration and elongation were investigated. Earlier studies have suggested comparable effects of stearic acid - a saturated OF fatty acid - and oleic acid - a cis-rnonoun~saturatedfatfy acid - on the distr~butio~n cholesterol over the various lipoproteins, which are the major translpor"tersof llipids in the blood and differentially affiect cardiovascular risk. In addition, other studies have foiunld similar effects of oleic acid alnd linoleic acid - a cis-polyunsaturated fatty acid. 96 true, than these three C18 fatty acids should have comparable effects on the serum lipoprotein profile. We therefore initiated a crossover study with 45 healthy non-smoking human subjects. Each participant consumed in random order each 05 thle 3 dlifferent diets dulring three 5-week periods. Diets provided 38% of energy from fat of which 80% was supplied by the experirnen~tal fats. These fats were lncorporated into bread, marg~arlnes,and cakes. The nutrient composition of the diets did not differ, except far a 7% difference in energy intake provided by stearic, oleic, or linoleic acids. Except far the effects on the selrum lipoprotein profile, allso other cardiovascular risk markers (th~rombotictendency, li~pidperoxidation, and inflarnrnati~on) were studied. Only small differences in the effects of stearic, oleic, and linolelc acids were observed on lipid and lipoprotein concentrations. Changes in the concentrations of LDL and anti-atherogenic HDL cholesterol concentrations were less the ath~erog~enic than expected from earlier studies. Stearic, oleic, and linoleic acids did also not differ in their effects on lipoprotein particle sizes, another risk marker of cardiovascu~llardiseases. Based on these findings and other studies from the
literature, the most favourable lipoprotein profile is achieved when a mixture of cisunsaturated fatty acids replaces in particular palmitic and myristic acids two saturated fatty acids - and frans fafly acids in the diet. With respect to thrombotic tendency, eadier studies have suggested prothrombotic effects of stearic acid. Mare recent studies, however, could not confirm these unbeneficial effects of stearic add on platelet aggregation. coagulatian, and fibrinolysis. We also found no different effects of stearic, oleic, and linoleic acids on coagwlation and fibnnolytic factors. Stearic acid decreased platekt volumes compared with oleic or linoleic acids. Larger platelets are associated with
-
increased cardiovascular risk. Qn the other hand, ex yfvo platelet aggregation in nIen was affected unbeneficial by stearic acid relative to Yinoljeic acid, Therefore, our results do not indicate that stearic acid is thrombogenic compared with oleic and linoleic acids. The atheragenicity of lipid particles is largely increased by lipid peroxidation. With increasing degree of unsaturatlon of fatty acids, lipid peroxidation is expected to increase. In our study, no different effects of sliearlc, oleic, and linoleic acids were observed on the urinary excretion of the Fa-isoprostanes8-iso-prostaglandin F,, and d5-keto-dihydro-prostaglandin F2u5 which are biomarkers of respectively nonenzymatic and enzymatic lipid peroxidation. In contrast, results from studies using in vitro methods to measure hDL susceptibility to oxidation suggest that linoleic acid is more readily oxidised than cis-monounsaturated or saturated fatty acids. The in llsivo relevance of this latter method is, however, limited. Several inflammatory risk markers may be involved In the development of cardiovasclular diseases. High sensitivity C-reactive protein (hsCRP) is a circulating acute phase reactant 'that reflects systemic inflammation. Stearic, oreic, and linoleic acids did not differ in th~eireffects on this marker. The effects of these C18 fatlty acids on multiple immunomadulakory rnoillecules were simultaneousYy detected by the use of antibody arrays. However, results were not consistent and future studies are needed to address the effects of fatty acids on the cytokine profile into lTor@ detail. In conclusion, differences between the effects of the C18 fatty aci,ds stearic, oleic. and linoleic acids on the serum lipoprotein profile are less than was predicted based on earlier studies. Effects on other cardiovascular risk markers were also marginal Whether the effects on cardiovascular disease risk itself are comparable, is unknown. For food applications, the use of stearic acid may be preferred over that of myristic and palmitic acids - two saturated fatty acids in the diet - and of trans fany acids from hydrogenated oils.
Desaturation and allongation enzymes might be regulated differently by the individual fatty acids. As almost all1 human studfes reported the effects of a mixture of C M isomers, we have in~vestigatedthe isomer-specific effects of the two most carnmoln CLA isomers - cis-Q,tsana-1I ((&,PI I ) and fr-ans-IO,c.Js-12 (t110,c112) CLA on fatty acid desat~uratianand elongation. In a double-blind, placebo-controlled study w ~ f hparallel design, 25 healthy overweight: men and women consumed daily a dietary su~pplementproviding 3 g o.f hrg~h-oleicsunflower oil[ (plambo) during the first 6 weeks of the trial (run-in period). After randomisation, one group (0= 7) contlinlued ta consume the placebo dairy product daily for the next 1%weeks of the study (inteweratilon period). The second ( 0 = 9) and third (n = 91 groups consulmed the daisy product with 3 g of purified c9,tll CLA or 3 g of flh3,c12 CLA, respectively. Dietary supplemen~tscontaining GLA were provided as an acidified drinkable dlairy product. Compared wi~th&,tl l CLA, tIlO,c12 CLA lowered the ratio of C18:ln-9 to Cl8:O in plasma phospholipidls, suggesting a decreased A 9 desaturat~ionindex bud the Cl6:ln-7 to C16:O ratio was not affected. Both CLA isomers decreased the A6 desatwration index as calculated from the ratio of C18:3n-6 plus C2Q:31n-6to C"18:2n-6. MRNA expressions OF desaturases and elongase in peripheral bl~ood mon~on~uclear cellls (PBMC) were, however, not affected. Hence, effects on desatwratioin indilces were not reflected by changes at the transcriptional level. It ils unknown, however, whether mRNA expressions or activities of desaturases and elanglases in PEMC reflect those in the liver, the major organ for desaturation and ellongation of fatty acids. Therefore, it is interesting to identify the si~m~ilarities and differences in the molecular effects of fatty acids on fatty acid metabolism in PBMC, in the liver or other tissues.
Samenvatting
Hart- en vaatziekten vormen een belangrijke oorzaak van ziekte en sterfte in westelrse en ontwikkelde landen. Olmdat vele risicomerkers gerelateerd zijn aan de prevallentie, hebben hart- en vaatziekten een multifactoriële etiologie. Sommige lipoproteYnenplrofrel, verhoogde risicomerkers zoals een ongunstig ihrornboseneiging, verhoogde oxidatieve stress en een laag-gradige chronische ontsteking warden b6învloed door een verandering in de totale vet- of vetzuwrlnname. In het verleden werd in voed~ingsadwiezenom het risico op hart- en vaatziekten te verlagen vooral de nadruk gelegd ep het reduceren van de vetin~name.In dle laatste decennia bestaan er echter steeds meer bewiijzsn dat een uitwisseling van ongezonde vetzuren door vetzuren met gunstige effecten tot een lager risico op harit- en vaatdekten leidt dan het verlagen van de totale vetinname. Vetzu~renhelbben afhankelijk van structulwr en fu~nctieverschillende effecten op risicomerkers voor kart- en vaatziekten. In dit proefschrift rijn vooral de effecten van de C18 vekuren - stearinezuur, oliezulur, linolzuulr en geconjugeerd linolzuur (CU)op ris~icomerkersvoor hort- en vaatziekten beschrevenl. Ook zijn de effecten op de desaturatie en elongatie van vetzuren onderzocht. Eerdere stlwd~iessuggereerden vergelijkbare effecten van stearinesu~ur- een verzadi~gdvetzuur - en oliezu~ur- een cis enkelvoudig onverzadigd vetzuur - op de verdellirug van cholesteral over de verschillende lipoprateïine~n. Dit zijn de belangrijkste transporters wan cholesterol in het bloed en ze beïnvloeden het risico op hart- en vaatziekten versclhillend. Bovendien hebben andere stud~ies vergelijkbare effecten van oliezuur eln l~inlolzuwr- een cis meervoudig onverzadigd vetzuulr - gevonden. Indien dit klopt, dan zow~den deze drie C18 vetzuren vargellijkbare effecten op h~etserum Ilpicaiproteïnenlprofiel hebiben. De effecten van steari~nszuur,oliezuur en linelzuur we~rdenonderzocht in een cross-over studie met 45 gezonde, niet-rokende proefpersonen. IElke deelnernelr g~ebruikte de 3 verschillende voedilnglen in willekeurige vollgorde gedureinde drie perioden van 5 weken. De! voedingen bevatten 3% energieprocenten vetten, waarvan 60% werd geleverd door experimenielle vetten. Deze wetten werden verwerkt in brood, malrgari~neen cake. Belhalve een verschil van 7% i~nde energie inname van stearinezuur, oliezuur of llinolzwur, was de voolrgeschreven voedingssamerustelling wan de drie voedingen gelijk. Naast de effecten op het serum li~paprotei~nenprofiel, werden ook andere risicomerkers van hart- en vaatziekten (thromboseneiging, l~ipidenperoxidalie en in~flammatie)bestludeerd. Slechts kleine verschillen werden waargenomen in de effecten van stearinezuur, oliezuur en linolzuur op de lipiden- en lipoprot~inenconcentrai2ies. De veranderingen
in de concentraties van de atherogene LDL en nkt-atherogene HDL cholesterohoncentraties waren kleiner dan werd verwacht op basis van de eerdere studies. Stearinezuur, oliezuur en Iinolzuor verschilden ook niet in de effecten op de deeltjesgrootte van de ilipoproteïnen, een andere risicomerker van hart- en vaatziekten. Gebaseerd op deze bevirudlngen en andere studies in de literatuur. wordt het meest gunstige lipoproteïnenpro8el bereikt wanneer palmitbnezuur en myristinezuur - 2 verzadigde vetzuren - en trans vetzuren in de voeding warden verwangen door een mengsel wan cis-onverzadigde weburen. Met betrekking tol d@rhrom'bi~seneig~ing hebben eerdere studies gesuglgsreerd dat stearhesuur pr0thrombotisic:he effecten heeft. Meer recentere studies hebben deze nadelige effecten van stearinezulur op de bloedplaatje~aggriegati~, stolling en fibrino'lyse niet bevestigd. In onze sitwdie verschilden de effecten van stearinezuur, oliezuur en linolzuur op factoren betrokken bij de stolling en fibrinolyse ook niet. In vergelijking met voedingen rijk aan oliezuur en linolzuur, verlaagde stearinezuur heil volume van de bloedplaa'ljes. Grotere bloedplaatjes zijn geassocieerd met een hoger risico op hart- en vaatziekten. Aan de andere kant werd de ex vivo bloedplaatjesaggregatie in mannen nadelig be'u'nwloed door stearinezuur tenl opzichte van linolzuur. Daarom duiden onze resultaten er niet op dat stearinezuur thrombogener is dan oliezuur of linolzuur. De atherogenitelt van lipidendeeltjes wordt sterk vergroot door lipidenperoxidatie. De gledachte is dat onverzadigde vetzuren de kans op lipidenperoxidatie vergroten. Echter, de effecten van stearinezuur, oliezuur en linolzuur op de excvsetie in de urine wan de F2-i,soprostanen,8-isa-prostaglandine FZn(8-iso-PGFZa)en 15-keto-dihydroprostaglandine (Z5-K-IDW-PGF2,1), die biomerkers rijn voor respectievelijk nietenzymatische eni enzymatische lipidenperoxidatie, waren niet verschillend. Dit is in tegenslpraak met de resultaten van studies waarin in vitm methoden werden om de oxideerbaarheid van LDL door metaalionen te meten. In deze studies is gevonden dat linolzu~u~r eerder geoxideerd wordt dan cis-enkelvoudig~ on\re~adigde of verzadigde vetzuren. De in vivo relevantie van deze laatsigenoemde methoden is echter beperkt. verschillende ontstekingsmerkers kunnen betrokken zijn b'ij de onwikkeling van had- en vaaibiekten. Het C-reactieve prote'ine cCRRSis een circulerend acute faSe eiwit, dat bij ontstekingen sterk verhoogd is. Stearinezuur, oliezuur en linolzuur verschilden niet in hun effecten op deze risicomerker. De effecten van deze C18 vetzuren op andere eiwitten betrokken bij een immuunreacle werden gedetecteerd met behulp van antilichaam arrays. De resultaten waren echter moeilijk te interpreteren en toekomstige studies zijn noodzakelijk om de effeden wan vetzuren op Tiet cytokinenprofiel in detail te ondesrcleken.
Op basis wan deze bevindinglen concluderen wij dat dle verschillen in de effecten van de C181 v~tzurenstearinezuur, olliezuur en linolzuur op het lipoprote'inenprofiel kleiner zrjn dan verwacht wit eerdiere studies. De effecten ap andere risimmerkiers voor hart- en vaatziekten zijn ook gering, iCYf de effedesi op het risico op hart- en vaatzielktenzelf look vergelijkbaar zijn, is nog onbekend. Voor voedingstoepassingen kan echter worden gesteld dat het toepassen van stearinezuur de voorkeur heeft boven hlet toepassen van rnyristine- en palmitinezuuu - twee verzadigde vetzuren in de voeding - en die van trans vetzuren uit gehydrogeneerde oliën. Desaturatie en elongatie en~zymenworden verschillend gereguleerd door de individuele ve'dzu~ren.Omdat bijna alle humane studies de effecten van een mengsel van CLA Isomeren hebben gerapporteerd, hlebben wij de isomeer-specifieke en effecten van dle twee meest voorkomende C M isomeren - cis-9,Erc~ns-l1(&,t1l) trans-+l 0,cjs-IZ (t1icl),cl2) CL4 - onderzocht op de desaturatie en elongatie van vetzuren. Iln een dubbelblinde, placebo-gecon~traleerdestudie met een parallel desi~gn,gebruilkten 25 gezonde mannen eln vrouwen met overgewicht gedurende de eerste 6 weken van de studie (run-in periode) dagellika een voedingssupplemenldat 3 gram zonnebloemolie met een hoog gehalte oliezuur (placebo) bevatte. Na randomisatie bleef &&n groep (n = J) het placebo zuivelproduct dagelijks gebruiken voor de daaropvolgemde 18 weken valn de studie (interventieperiode). De tweede (n = 9) en derde (n = 9)groep consumeerden een zuivelproduct met respectievelijk 3 gram ~9,511C M of t10,c'lZ C M . In vergelijking met ~9,i111C M verlaagde de fl0,c12 CLA isomeer de C18:l n9fC18:O ratio in plasma fosfolipiden, du~ide~nd op een vermiinderde A9 desaturatie activiteit. De C16:in-7$rCIl6:XP ratio werd echter niet beTnvloed. Beide CILA isomeren ~t?rla~i(pdlen de A6 desaturatie index, die werd berekend uit de ratio wan C18:3n-B en C20:3n-6 ten opzichte van C18:2n-6. De mRWA expressie van desaturases en elongase in perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) werd echter niet beÏnvloed. Hl~erui~tt volgt dat de effecten alp de desaturatie indices niet werden weerspiegeld door veranderingen op transcription~eelnivo. Het is echter onbekend of de mRNA exlpressies van dasaiurases en elongases in PBMC een weerspiegeli~ngzijn van desaturatie en elongatie in de lever, dat het bellangrijkste orgaan is voor de desaturatie en elongatille van vetzuren. Daarom is het van belang om ~erschille~n en overeenkomsten te identificeren in de moleculaire effecten van vetztzurern op het m~etabolism~e in PBMG en in de lever of andere weefsels.
