Studium střevní mikroflóry tradičními a molekulárními technikami

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie

Studium střevní mikroflóry tradičními a molekulárními technikami

(Bakalářská práce studijního programu Biologie oboru Obecná biologie - směr Mikrobiologie)

Brno 2010

Tereza Frostová

.

Ráda bych poděkovala svému vedoucímu bakalářské práce panu doc. Ing. Bohuslavu Rittichovi, CSc. za poskytnuté rady, vstřícnost a pomoc při vyhledávání odborné literatury.

Obsah: Úvod.......................................................................................................................................4 1. Cíl práce.............................................................................................................................5 2. Funkční studie....................................................................................................................6 2.1. Bezmikrobní organismy .................................................................................................6 2.2. Bakterie mléčného kvašení..............................................................................................6 3. Mikroflóře přidružená charakteristika................................................................................8 3.1. Degradace beta-aspartyl-glycinu.....................................................................................8 3.2. Konverze bilirubinu na urobilin......................................................................................8 3.3. Metabolismus žlučových kyselin....................................................................................9 3.4. Konverze cholesterolu na koprostanol..........................................................................10 3.5. Degradace mucinu.........................................................................................................10 3.6. Střevní plyny.................................................................................................................11 3.6.1. Těkavé mastné kyseliny.............................................................................................11 3.7. Vliv probiotik na vývoj střevní stěny............................................................................12 4. Molekulárně biologické techniky.....................................................................................15 4.1. Denaturační a teplotní gradientová gelová elektroforéza (DGGE/TGGE)...................16 4.2. Terminální polymorfismus délky restrikčních fragmentů (T-RFLP)............................18 4.3. 454- pyrosekvencování..................................................................................................20 4.4. Metagenomika...............................................................................................................23 4.5. Nová generace sekvencovacích technik........................................................................25 5. Diskuse.............................................................................................................................27 Závěr.. ..................................................................................................................................28 Seznam zkratek ....................................................................................................................29 Seznam literatury…………………………………………………………………………..30

3

Úvod Hlavním cílem studia střevní mikroflóry je zjištění povahy a činnosti bakteriálního společenství v lidském těle a pochopení vlivu bakterií na zdraví člověka. Nově získané poznatky o příznivém vlivu mléčných bakterií na střevní trakt by tak mohly být aplikovány do zdraví prospěšných potravin cíleněji a v mnohem větší míře se záměrem udržovat střevní mikrobní rovnováhu a zlepšovat metabolismus látek ve střevě. Ještě na počátku minulého desetiletí byla většina znalostí o složení, funkci a ovlivňování střevní mikroflóry vnějšími faktory získávána pomocí drahých a časově náročných technik (mikroskopie, kultivace a detekce fermentačních produktů). Tradiční kultivační metody, prováděné na selektivních médiích za definovaných podmínek, podporují růst vybraných skupin bakterií a vyhodnocení se proto vztahují jen na vykultivované mikroorganismy. Nutno zdůraznit, že nedostatek znalostí o celkovém mikrobiálním složení střevního traktu a jeho proměnné adaptaci vzhledem k věku, pohlaví, přijaté potravě a působení jiných faktorů (např. antimikrobiálních léků, užívaní pre/probiotik) je způsoben tím, že jsou vyšetřovány zejména fekální vzorky, neboť přístup do střevního traktu je neinvazivními metodami omezen. Zásadní změnu vnesly do studia mikroorganismů molekulárně biologické metody, pomocí kterých lze identifikovat a studovat i nekultivovatelné mikroorganismy. Pozornost je v tomto směru zaměřena především na RNA malé ribozomální podjednotky. Geny pro 16S a 23S ribozomální RNA obsahují konzervované, variabilní a hypervariabilní sekvence, které jsou vhodné pro studium evoluce bakterií a složení mikrobního společenství. Dalším významným pokrokem v molekulární oblasti bylo zavedení metagenomického přístupu.

4

1. Cíl práce Cílem práce bylo vyhledat a uspořádat informace publikované ve vědecké literatuře, které se týkají zdraví prospěšných mikroorganismů. Pozornost byla zaměřena na molekulárně biologické techniky vhodné pro identifikaci bakterií mléčného kvašení a ostatních probiotických mikroorganismů. Jako zdroje informací byly použity články uveřejněné ve vědeckých časopisech (International Journal of Food Micribiology, Applied and Enviromantal Microbiology, Science, Nature) uložených v databázích Web of Science a Science Direct.

5

2. Funkční studie Koncepce characteristics,

charakteristik MAC)

spojených

s mikroflórou

sleduje metabolity,

které odrážejí

(microflora-associated metabolickou

aktivitu

mikroorganismů. Tato koncepce je použitelná pro studium různých funkcí u člověka a zvířat za fyziologických i patofyziologických podmínek. Metabolické procesy probíhají zřejmě působením subdominantních mikroorganismů nejvíce v ileu. Proto je téměř nemožné zkoumat uvedené lokace tradičními kultivačními technikami. Koncepce charakteristik spojených s mikroflórou byla definována jako záznam anatomických struktur a fyziologických, biochemických nebo imunologických funkcí v organismu, které byly ovlivněny mikroflórou buď anabolickou nebo katabolickou cestou (Midvedt a kol., 1986). O některých z těchto funkcí bude dále zmíněno ve spojitosti s probiotiky. Naopak nepřítomnost funkčně aktivních střevních bakterií je charakteristická pro bezmikrobní zvířata (germ-free animal characteristic, GAC koncepce). Tato charakteristika se vyskytuje u bezmikrobních živočichů, novorozenců a někdy je také uváděna ve vztahu s antimikrobiální terapií.

2.1 Bezmikrobní organismy Myši poskytují vhodný experimentální model, pomocí kterého lze vyšetřovat vliv bakterií na GI trakt zvířat. Odchov bezmikrobních myší byl významným pokrokem pro získávání znalostí o střevních bakteriích. Porovnáním vlastností bez-mikrobních myší s myšmi s normální mikroflórou a s myšmi se záměrně kolonizovanými probiotickými kmeny se prokázalo, že střevní bakterie mají významný vliv na biochemické a morfologické vlastnosti gastronintestinálního taktu.

2.2 Bakterie mléčného kvašení Gram-pozitivní bakterie, které produkují velké množství kyseliny mléčné (více než 1 mmol kyseliny mléčné/100 ml kultury) při fermentaci glukózy - tzv. bakterie mléčného kvašení, jsou členy normální střevní mikroflóry. Termínem bakterie mléčného kvašení se neoznačuje fylogenetická skupina bakterií, ale pouze skupina bakterií, které mají podobné metabolické vlastnosti (Pfeiler a Klaenhammer, 2007). Mezi rody bakterií mléčného

6

kvašení

zahrnujeme

Aerococcus,

Alloiococcus,

Atopobium,

Carnobacterium,

Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Paralactobacillus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus a Weissella. K této skupině jsou často řazeny i rody Bifidobacterium, Gardnerella, Scardovia a Parascardovia a to na základě podobných biochemických a fyziologických vlastností, ačkoliv fylogeneticky patří do kmene Actinobacteria (Pot a Tsakalidou, 2009). Vlastností těchto mléčných a dalších probiotických bakterií je využíváno při produkci zdraví prospěšných potravinových doplňcích. Probiotika jsou živé mikroorganismy přidávané do potravin, které příznivě ovlivňují zdraví konzumenta zlepšením rovnováhy střevní mikroflóry (Fuller, 1989).

7

3. Mikroflóře přidružená charakteristika (MAC koncepce) 3.1 Degradace beta-aspartyl-glycinu (AG) Přítomnost beta-aspartyl-glycinu signalizuje redukci kolonizace střev střevní mikroflórou. Tento dipeptid byl izolován z bezmikrobních zvířat: jehňata, selata, krysy a myši. To poukazuje na skutečnost, že sekundární střevní proteolytické enzymy hostitele jsou schopné přeměnit proteiny v potravě na AG. Samotný dipeptid je schopen přeměny mikrobními sekundárními proteázami (Welling a kol., 1988). Tedy přítomnost/absence AG reprezentuje jednu GAC/MAC funkci, která je závislá na přítomnosti potravního prekurzoru

hostitelových

sekundárních

proteolytických

enzymech

a

mikrobních

sekundárních proteolytických enzymech. Protože střevní obsah získaný z bezmikrobních zvířat obsahuje AG, je možné sledovat osidlování mikroorganismů v jejich střevě v závislosti na klesajícím množství AG; až nakonec konvenční zvířata začnou tento dipeptid postrádat. Tento jev se také může znovu vyskytnout po antimikrobiální léčbě. Dosud se takový efekt u žádného z podávaných probiotik bezmikrobním živočichům nenašel. Je zřejmé, že funkce je spíše ovlivňována interakcí většího množství různých mikroorganismů, než působením jediného druhu.

3.2 Konverze bilirubinu na urobilin Mikrobní přeměna bilirubinu v lumenu významně přispívá k udržení bilirubinové rovnováhy v séru. U dospělých lidí je bilirubinový metabolismus vysoce efektivní na rozdíl od novorozenců, kteří nemají rozvinutou mikroflóru. Za normálních podmínek je ve stolici dospělého člověka nalézáno malé množství bilirubinu 5-20 mg/den, zatímco urobilin je ve žluči obsažen v množství 50-250 mg/den. Bilirubin je konečným produktem katabolismu hemoglobinu a jiných látek s hemovou skupinou. V játrech podstupuje konjugaci s kyselinou glukuronovou a jako konjugát je vylučován do střev. Přítomná střevní mikroflóra může konjugát rozštěpit a konvertovat na urobilin, který se již nevstřebává střevní stěnou a odchází se stolicí ven. Nicméně přeměna bilirubinu na urobilin se zdá být u střevních mikroorganismů vzácným jevem. Dosud bylo popsáno jen málo mikroorganismů s touto vlastností, několik druhů rodu Clostridium a pouze jeden

8

druh Bacteroides (Vitek a kol., 2006). Bezmikrobní zvířata a novorozenci tuto schopnost přeměny bilirubinu nemají. Vzhledem k významu bilirubinového katabolismu v neonatální žloutence u novorozenců bude hledání bakterií s takovými vlastnostmi přínosné.

3.3 Metabolismus žlučových kyselin Prekurzorem pro syntézu žlučových kyselin je cholesterol, který je v játrech konjugován s aminokyselinami glycinem nebo taurinem. Odtud je dále ve žluči sekretován do střeva, kde napomáhá vstřebávání tuků přes střevní stěnu do enterohepatálního oběhu. Bakterie mléčného kvašení mají schopnost neabsorbované žlučové kyseliny enzymaticky dekonjugovat a zvýšit tak jejich exkreci. Vyloučené žlučové kyseliny musí být nahrazeny novou syntézou ze zásobního cholesterolu uloženého v játrech. V bezmikrobních podmínkách jsou žlučové kyseliny vylučovány jen jako konjugáty. Srovnání množství vyloučeného cholesterolu u konvenčních organismů a bezmikrobních organismů, u kterých bylo podstatně nižší, potvrdilo, že kolonizující bakterie mají vliv na hladinu sérového cholesterolu (Eyssen a kol., 1973). Dekonjugované žlučové kyseliny jsou mnohem méně efektivní při emulgaci tuků přijatých v potravě a při vytváření micel v tenkém střevě, než konjugované žlučové kyseliny. Laktobacilly s hydrolázou žlučových kyselin (bile salt hydrolase, BSH) by proto mohly být zodpovědné za snížení trávení tuků a jejich absorpci ve střevním traktu ( Tannock, 1995). Tento přínos mléčných bakterií ve snižování sérového cholesterolu zastiňuje fakt, že dekonjugované primární žlučové kyseliny jsou v tlustém střevě mikrobně přeměněny na sekundární žlučové kyseliny známé jako rizikové faktory při vzniku rakoviny tlustého střeva (Sanders a kol., 2000). Množství sekundárních kyselin bylo u pacientů s rakovinou tlustého střeva shledáno vyšší než u zdravých lidí (Egert a kol., 2006).

9

3.4 Konverze cholesterolu na koprostanol Přeměna cholesterolu na koprostanol je mikrobní organismu prospěšný způsob, jak eliminovat či redukovat hromadění cholesterolu. Cholesterol je jak endogenního, tak exogenního původu. Endogenní cholesterol je syntetizován hlavně v játrech a v tenkém střevě, exogenní je přijímán v potravinách. Ve střevě je cholesterol reabsorbován, ale existují zde i takové mikroorganismy, které jsou schopny cholesterol dále zpracovat. Schopnost mléčných bakterií in vitro eliminovat cholesterol využitím hydrofobních vlastností membrány anebo jej konvertovat na koprostanol potvrdil ve své práci Lye a kol. (2010). Principem snižování cholesterolu je schopnost bakterií inkorporovat cholesterol do fosfolipidů v membráně nebo jej konvertovat na koprostanol s využitím enzymu cholesterolové reduktázy. Koprostanol je ve střevě absorbován méně ve srovnání s cholesterolem, což vede ke zvyšování exkrece do stolice a následně ke snižování hladiny cholesterolu v krvi. Kmeny bakterií mléčného kvašení s takovými vlastnostmi by mohly být potenciálně využity jako doplňková kultura ve fermentovaných výrobcích s možnými hypocholesterolovými účinky.

3.5 Degradace mucinu Mucin produkovaný ve střevě pohárkovitými buňkami, představuje hlavní organickou komponentu obranné bariéry na povrchu střevního epitelu. Stejně tak má význam jako výživa pro střevní mikroorganismy. Existují důkazy o tom, že mucin a střevní mikroflóra hrají důležitou patofyziologickou roli u střevních obtíží, například při Crohnově chorobě nebo při ulcerózní kolitidě. Střevní mikroorganismy se podílejí na regulaci genové expresi mucinů v epiteliálních buňkách. Commeli a kol. (2008) prokázali, že u konvenčních myší byla produkce mucinu nižší ve srovnání s bezmikrobními myšmi. Zvýšená sekrece mucinu u bezmikrobních myší pravděpodobně kompenzuje deficit střevních bakterií zajišťující ochranu epitelu. Kmeny laktobacillů jsou pro regulaci exprese genů mucinů druhově specifické a ovlivňují složení mukózy. Zásahy vedoucí ke změnám ve složení střevní mikroflóry by mohly strategicky

10

modulovat složení mukózy ve střevním traktu a léčit tak zánětlivé následky sliznic po chemoterapii a radioterapii při léčbě rakoviny.

3.6 Střevní plyny Hlavními plyny vyskytující se v tlustém střevě jsou oxid uhličitý, vodík a metan. Jsou to produkty anaerobního metabolismu sacharidů a proteinů. Oxid uhličitý může být hostitelského i mikrobiálního původu; produkce metanu byla detekována téměř u poloviny lidské populace světa. Střevní plyny mohou individuálně rozvíjet těžké problémy u osob trpící nerovnováhou střevní mikroflóry. Rozdílná pre/probiotika byla těmto pacientům podávána s jak pozitivním, tak i negativním výsledkem.

3.6.1 Těkavé mastné kyseliny Nevstřebané složky tráveniny opouštějí tenké střevo a v tlustém střevě podléhají bakteriální fermentaci. V trávenině obsažené sacharidy a proteiny mohou být jak potravního, tak endogenního původu. Zatímco fermentací sacharidů (např. polysacharidy v rostlinných

buňkách,

enzymem

alfa-amylásou

neštěpitelný

škrob,

neškrobové

polysacharidy) vznikají zdraví prospěšné těkavé mastné kyseliny (TMK, C2-C6) a laktát, proteinová fermentace produkuje toxické metabolity (např. látky obsahující síru, amoniak). Zjednodušeně lze říci, že k fermentaci sacharidů dochází v proximální části a k fermentaci proteinů v distální části tlustého střeva (Guarner a Malagelada, 2003). Vzhledem k tomu, že rakovina tlustého střeva a zánětlivá onemocnění střev (inflammatory bowel desease, IBD) se primárně vyskytují v distální části tlustého střeva, lze předpokládat úzkou souvislost mezi toxickými metabolity a vznikem těchto onemocnění (Egert a kol., 2006). Z těkavých mastných kyselin jsou nejčastěji střevní mikroflórou produkovány butyrát, propionát a acetát. Hrají důležitou funkci při zpětném vstřebávání sodíkových iontů a vody v tlustém střevě. Množství produkovaných kyselin záleží na druhu přítomné mikroflóry, substrátu a době střevní pasáže. Nicméně u různých živočišných druhů se zjištěné hodnoty lišily, zejména v důsledku složení potravy a různé fyziologii živočichů - například u polygastrických nebo monogastrických zvířat. Produkce a absorpce těkavých mastných

11

kyselin je závislá na složení tráveniny ve střevě. Většina kyselin je snadno absorbována; acetát je po vstupu do periferní cirkulace metabolizován periferními tkáněmi. Kyselina máselná je hlavním zdrojem energie pro střevní buňky a kyselina propionová je dále metabolizována v játrech. Těkavé mastné kyseliny, obzvláště kyselina máselná, zlepšují růst laktobacillů a bifidobakterií.

3.7 Vliv probiotik na vývoj střevní stěny Dlouhou dobu se předpokládalo, že vývojový program GI traktu je geneticky zakódován tak, aby geny byly během maturace exprimovány v již předem definovaném čase. Současné studie ovšem ukazují, že intestinální mikrobiota se podílí na řízení genové exprese vysíláním signálů geneticky predisponovaným buňkám. Bezmikrobní organismy mají inhibovaný vývoj střev, k reinicilaizaci vývoje dochází až po inokulaci bakteriálními kmeny. Předpokladem pro takovou přeměnu je schopnost hostitelských buněk přijímat signály od bakterií. Lze tedy říci, že rezidentní bakterie jsou nutné pro vývoj střev. Glykokonjugáty představují regulační mechanismy funkčních a morfologických změn střevního traktu. U konvenčních organismů jsou epiteliálními buňkami produkovány fukosylované glykany zajišťující přirozený vývoj střevní stěny. Epiteliální buňky střevního traktu bezmikrobních myší tento konjugát neprodukují a vývoj střevní stěny inhibuje. Po inokulaci těchto myší kmenem Bacteroides thetaiotamicron, který je obvyklý symbiont střevního traktu člověka a myší, došlo indukci fukosylovaného glykanu a dokončil se funkční a strukturální vývoj střevního traktu. (Bry a kol., 2006). (viz Obr. 1)

12

Obr. 1 (a) Stěna tenkého střeva v postnatálním období: 21 dnů po narození. Vlevo: u konvenčních organismů. Vpravo: u bezmikrobních organismů. (b) Stěna tenkého střeva dospělých jedinců. Vlevo: nedokončený vývoj u bezmikrobních organismů. Vpravo: kompletní vývoj podporovaný produkcí fukosylovaného glykanu po inokulaci kmenem Bacteriodes thetaiotaomicron. (Upraveno podle Hooper a kol., 2004)

Angiogenin-4 (Ang4) je protein produkovaný Panethovými buňkami v epitelu střev, jehož exprese je regulována v postnatálním vývoji. Funkcí tohoto mikrobicidního proteinu je chránit epitel hostitele před patogeny. U konvenčních myší se exprese Ang4 brzy po skončení kojení zvyšuje a rychle dorůstá na hodnoty dospělých jedinců. Na rozdíl od bezmikrobních myší, kde množství Ang4 nikdy nedosáhne srovnatelných hodnot. To poukazuje na bakteriální indukci exprese tohoto proteinu. Bakteriální interakce s Panethovými buňkami tedy přispívá k vytváření intestinálního antimikrobiálního arsenálu hostitele (Hooper a kol., 2004)

13

Výraznou morfologickou změnu indukují endogenní bakterie při angiogenezi v klcích střev. Ve srovnání s konvenčními myšmi byly kapiláry v klcích bezmikrobních myší nedostatečně rozvinuty a zakrslost přetrvávala až do dospělosti. Hypotéza, že střevní bakterie jsou vyžadovány pro úplný vývoj střevního traktu, byla úspěšně potvrzena v experimentu, ve kterém byly bezmikrobní myši inokulovány kmenem Bacteroides thetaiotaomicron (Hooper a kol., 2004).

14

4. Molekulárně biologické techniky Molekulárně biologické metody umožňují analyzovat strukturu a funkci střevní mikroflóry a identifikovat její složky. Jejich předností je analýza mikrobního společenství bez předchozí kultivace. S rostoucím zájmem o studium nekultivovatelných bakterií roste i počet kultivačně nezávislých metod. Současný rozvoj sekvenačních technik umožňuje lepší porozumění vztahu mezi střevní mikroflórou a fyziologií hostitele. V posledním desetiletí je vědecký zájem zaměřen spíše na analýzu bakteriálních společenství než na zkoumání jednotlivých bakteriálních druhů a jejich zařazení do bakteriálního rodu (Norin a kol., 2009). Takový přístup je žádaný při studiu vlivu potenciálních probiotických bakterií v gastrointestinálním traktu (GIT). Kromě toho jsou zástupci některých rodů mikroorganismů spojováni se záněty střev a s ulcerózní kolitidou. Jedním ze závažných úkolů je také potvrzení hypotézy, že populační změny mikroorganismů způsobují onemocnění a nejsou jen odrazem nemocného stavu (Tannock, 2008). Rozvoj molekulárních metod poskytuje mikrobiologům širokou škálu nových technik pro studium diversity mikrobních společenství (Furrie, 2006). Nejčastěji jsou pro tuto analýzu využívané geny kódující RNA malé ribosomální podjednotky. Fylogenetický marker 16S rDNA, stejně tak 23S rDNA představují vhodné geny pro studium bakteriální diverzity a evoluce, a fylogenetickou analýzu ( Van de Peer a kol., 1993). Gen kódující 16S rRNA obsahuje shodné sekvence společné pro všechny organismy prokaryotického typu a rovněž sekvence, které jsou specifické pro určitou skupinu nebo druhy bakterií. Hypervariabilní sekvence, které jsou jedinečné pro určité druhy, bývají obsaženy ve variabilní oblasti. Stanovením výskytu a množství variant tohoto genu jsou získávány profily střevního společenství, které se mezi sebou porovnávají. Techniky přímého sekvenování amplikonů 16S rDNA a mikročipy jsou vhodné pro přímou fylogenetickou identifikaci a kvantifikaci. Naproti tomu fingerprintové molekulární techniky DGGE, TGGE a T-RFLP jsou vhodné zejména pro: detekci dominantních druhů, studium dynamických změn ve složení

bakteriální komunity, studium účinků

antimikrobiální léčby na střevní mikroflóru a pro sledování vlivů pre/probiotik v čase. Jejich výhodou je, že jsou časově nenáročné a jsou vhodné pro rutinní provádění.

15

Pro kvantifikaci bakteriálních druhů slouží metoda PCR v reálném čase, dot-blot hybridizace, fluorescenční in situ hybridizace. Využití těchto metod znesnadňuje fakt, že počet genů kódující 16S rRNA je různý u různých bakteriálních druhů. Navíc je zpracováván

genetický materiál taxonomické skupiny, která se vyskytuje jen

v dostatečném množství, což se při izolaci malého množství DNA stává překážkou. Významně vyšší citlivost nabízí 454- pyrosekvencování kratších, ale variabilnějších oblastí amplikonů 16S rDNA a umožňuje detekci i malého množství bakterií. Stejně tak speciálně upravenými mikročipy s DNA oligonukleotidovými sondami připravenými podle sekvence 16S rRNA, lze kvantitativně detekovat procentuálně velmi nízce zastoupené bakterie. Týká se to těch bakterií, pro něž jsou na mikročipu k dispozici odpovídající sekvence DNA sondy (Palmer, 2006). U technik, které jsou závislé na předchozí PCR amplifikaci, je nutno brát v úvahu možné zkreslení výsledků specificitou primerů a podmínkami, za kterých PCR reakce probíhá. Tomuto zkreslení lze předejít tzv. shotgun sekvenováním genomu (Raes, 2007).

4.1 Denaturační a teplotní gradientová gelová elektroforéza Denaturační gradientová gelová elektroforéza (DGGE) a teplotní gradientová gelová elektroforéza (TGGE) jsou separační techniky, které umožňují rozlišení dvouřetězcových molekul DNA identické velikosti, které se liší v sekvencích a v bodu tání. Metoda DGGE byla poprvé použita pro detekci jednobodových substitučních mutací. Bylo zjištěno, že molekuly DNA divokého typu a molekuly DNA s jednou substituovanou bází mohou migrovat v gradientu vzestupné koncentrace denaturačních činidel (močovina a formamid) v oddělených bandech (Fischer a Lerman, 1983). Vlastní separace je založená na elektroforetické mobilitě částečně denaturované dsDNA v gelu. Produkty PCR, které se liší sekvencemi, mají různé body tání. V tomto bodě dochází k denaturaci dsDNA a DNA fragmenty zaujímají určitou odlišnou pozici na gelu. Technika TGGE je založená na stejném principu; místo chemického denaturačního činidla je použit lineární teplotní gradient. Technika DGGE je zdokonalena přidáním tzv. GC-svorky, což je sekvence se 40-70 páry guaninu a cytosinu, přisyntetizovaná na 5´ konec jednoho z PCR-primerů. Touto modifikací se zamezí

16

úplnému rozdělení dsDNA na jednořetězcové formy, zvýší se rozlišovací schopnost a umožní se detekce téměř všech substitucí bází v DNA molekule. První práce popisující složení komplexní mikrobiální populace analyzované s použitím uvedené techniky byla publikována v roce 1993 (Muyzer a Waal, 1993). Pro identifikaci neznámých druhů jsou amplifikovány úseky 16S rDNA použitím univerzálních primerů, které umožňují amplifikovat DNA všech bakterií přítomných ve vzorku. Jeden z těchto primerů lze využít v kombinaci s dalším primerem specifickým pro určitý bakteriální rod. U známých druhů se pro identifikaci využívají druhově specifické primery. Produkty PCR poté migrují denaturačním gelem za vzniku pásu, který lze detekovat. Pro srovnání DGGE/TGGE profilů jsou gely skenovány a poté vypočteny statistické podobnosti. K vyhodnocení výsledků lze využít shlukovou (klastrovou) analýzu, která se používá ke konstrukci dendrogramů demonstrujících vztah mezi DGGE profily (Zoetendal a kol., 2002; Saarela a kol., 2007; Zhang a kol., 2007).

Zoetendal a kol. (2002)

porovnávali složení biopsie střev se vzorky získanými ze stolice kombinací primerů specifických pro doménu Bacteria a rod Lactobacillus u lidí. Výsledné amplikony stejné délky, lišící se sekvencemi specifickými pro daný druh, separovali metodou DGGE. Zjistili, že laktobacillové složení v tlustém střevě se u 6 z 10 vyšetřovaných vzorků podobá laktobacillovému složení ve stolici.

Výhodou metod DGGE/TGGE, ve srovnání s jinými fingerprintovými metodami, je možnost izolace separovaných produktů PCR z gelu a jejich využití pro další analýzu. Zástupci analyzovaného bakteriálního společenství se identifikují pomocí sekvencování nebo hybridizací se sondou. Naopak nevýhodami této techniky je podle O´Toole (2010) relativně nízká rozlišovací schopnost, nemožná dodatečná fylogenetická identifikace a možné zkreslení výsledků PCR metodou. Metody DGGE a TGGE lze také kombinovat s jinými postupy, aby se dosáhlo zvýšení analytické přesnosti. Pro studium bakteriální diverzity metodou DGGE lze např. použít DNA knihovny (Burr a kol., 2006). Současná a nejnovější metoda je metoda TTGE, která je dalším pokrokem v DGGE/TGGE koncepci a která kombinuje vliv močoviny a teplotního gradientu při denaturaci a separaci molekul DNA. Tato technika byla použita pro charakterizaci bifidobakterií ve vzorcích střev spolu s kompetitivní PCR, což umožnilo stanovení a

17

odhad množství těchto bakterií (Mangin a kol., 2006). TTGE byla použita při zkoumání profilu bakterií z biopsie tlustého střeva a rekta po amplifikaci DNA s využitím metody amplifikace s vytěsňováním řetězce (MDA, multiple displacement amplification) (Monstein a kol., 2005).

4.2 Terminální polymorfismus délky restrikčních fragmentů (T-RFLP) Terminální polymorfismus délky restrikčních fragmentů (T-RFLP) je technika založená na PCR, která poskytuje fingerprint komplexních mikrobních společenství např. společenství, která se vyskytují v GI traktu. Umožňuje studovat množství a rovnováhu dominantních zástupců určité mikrobiální komunity a navzájem srovnávat různé vzorky. V práci (Norin a kol., 2009) byly popsány změny ve složení bakteriálních společenství pod vlivem léčby. Během amplifikace je využíván fluorescenčně značený primer, který se zabudovává do amplikonu a umožňuje jeho detekci. Po PCR amplifikaci 16S rDNA genů jsou amplikony podrobeny štěpení pomocí restrikčních endonukleáz. Z naštěpených amplikonů jsou detekovány jen koncové restrikční fragmenty (TRF) s fluorescenční značkou. Různé organismy mají obvykle cílová místa pro restriktázu na různých místech 16S rDNA. Výsledkem jsou proto koncové restrikční fragmenty o různé velikosti. Restrikční fragmenty lze analyzovat jak pomocí polyakrylamidového gelu, tak pomocí kapilární gelové elektroforézy. Délky fragmentů (v počtu párů bází) a množství (šířka píku a oblasti) fluorescenčně značených koncových restrikčních fragmentů jsou vypočítány automatickým programem určeným pro tuto fragmentační analýzu. Použití vhodného velikostního standardu v každém běhu zaručuje reprodukovatelnost metody. Data získaná z T-RFLP jsou ve formě elektroforeogramu. Pro srovnání musí být metoda standardizovaná s ohledem na vliv různého množství DNA amplikonů. Toho lze docílit výpočtem relativního množství jednotlivých terminálních restrikčních fragmentů (TRF), takže oblast každého píku u elektroforeogramu je normalizovaná vzhledem k celkovému množství analyzované DNA ve vzorku. Prahová hodnota je obvykle nastavená tak, že TRF fragmenty, kterých je ve vzorků relativně málo (<0,5%), bývají vyřazeny z dalších statistických analýz s cílem redukovat vliv pozadí.

18

V současné době nejběžnějším způsobem analýzy dat T-RFLP jsou multivarietní statistické analytické metody jako jsou analýza hlavních komponent (PCA - principal components analysis, PCA), korespondenční analýza (correspondence analysis, CA) (Wang a kol., 2004; Jernberg a kol., 2007) nebo shluková analýza (cluster analysis) (Jernberg a kol., 2005). Některé studie pro analýzu společenství vystačí jen s informacemi o přítomnosti nebo absenci dat (Sakata a kol., 2005). Nicméně údaje zpracované v relativním množství jsou mnohem citlivější a poskytují více informací o malých změnách v bakteriálním složení. TRFL-P je dále využíváno pro monitorování specifických bakterií v komplexních společenstvích a pro rychlé a přesné srovnání většího počtu vzorků bakteriálních komunit, čehož se využívá při diagnostice. Pro amplifikaci se využívají jak univerzální 16S rDNA primery, tak primery specifické pro více rodů/druhů. Při použití univerzálních primerů musí bakterie v analyzovaném vzorku patřit do jednoho z dominantního druhu, tedy měly by být ve vysoké koncentraci jinak nemohou být detekovány. Dále terminální restrikční fragment (TRF) specifické bakterie musí mít délku, která je jedinečná. Potenciálně zdraví prospěšný vliv probiotik přítomných v potravinových výrobcích byl analyzován metodou T-RFLP (Jernberg a kol., 2005). Pomocí analýzy hlavních komponent s využitím T-RFLP dat s univerzálními primery bylo zjištěno, že narušení mikroflóry vlivem přijímání antibiotika clindamycinu bylo dlouhodobější u jedinců, kteří probiotika nepřijímali. Kromě toho pomocí specifických primerů pro laktobacilly se ukázalo, že tyto probiotické kmeny dominovaly ve společenství během celé doby konzumace probiotik. Předpokládaná identita různých terminálních restrikčních fragmentů (TRF) může být ověřena srovnáním s jednotlivými klony DNA

knihovny, připravené ze stejného

materiálu. Kromě toho mohou být jednotlivé TRF porovnány podle své velikosti s informacemi uloženými v bioinformatických databázích. V těchto databázích existují sekvence nejrůznějších rDNA genů, v nichž může být provedeno in silico stěpení 16S rDNA (Maidak a kol., 1999). Nicméně síla T-RFLP analýzy nespočívá v identifikaci mikroorganismů. Technika je vhodnější pro rychlý skríning mnoha vzorků a pro srovnávání jejich změn v čase. Wang (2004) použil tuto metodu jako vhodnou strategii pro srovnávání změn bakteriálního složení během vývoje střevní mikroflóry u dětí v závislosti na čase. Výsledky T-RFLP analýzy zpracoval statisticky pomocí analýzy hlavních komponent.

19

4.3 454- pyrosekvencování Existuje několik sekvenačních metod, které jsou využívány pro studium diverzity mikroflóry GI traktu. Tradiční DNA sekvenační technika dle Sangera je vhodná pro malý počet vzorků. Nicméně při sekvencování tisíců vzorků z jednoho individua, které je třeba provést pro získání dostatečných údajů o diverzitě jeho mikroflóry, je Sangerova technika ekonomicky nevýhodná. Se současným rozvojem genomiky se objevují nové metody, které lze využít pro rychlé a levné sekvencování velkého počtu vzorků z různých biologických nik. Tento přístup umožňuje studovat komplexní bakteriální populace na úrovni jednotlivých druhů. Inovovanou metodou sekvencování je pyrosekvencování. Základem pyrosekvenační technologie je nově konstruovaný DNA sekvenovací přístroj, který byl vyvinut v Královském Institutu Technologií ve Stockholmu (Švédsko) a představuje převrat v genomice. Přístroj umožňuje provést 300 000 paralelních sekvenačních reakcí za dobu kratší než 3 hodiny. V průkopnické práci, publikované v časopise Nature Marguliesem a kol., (2005), bylo popsáno využití této technologie při sekvencování bakteriálního genomu v jediném experimentu, který by jinak při použití tradiční kapilární sekvenační technologie trval týdny až měsíce. Postup této metody (viz Obr. 2) je založen na rozštěpení DNA na kratší fragmenty (a) a připojení adaptérů A a B (b). Takto speciálně upravené adaptéry umožňují přisednutí primerů a amplifikaci DNA pomocí DNA-polymerázy. Fragmenty jsou poté připojeny ke speciálnímu nosiči (kuličce) (c). Po přidání hydroxidu sodného dojde k denaturaci DNA. Nosiče s jedním vláknem jsou odstraněny a zbylá jednořetězcová DNA je amplifikována emulsní PCR (v kapkách oleje) v přítomnosti dalšího speciálního nosiče, na nějž se jednořetězcová DNA navázala. Konečným produktem je nosič (kulička) s mnoha připojenými amplifikovanými dvouřetězcovými DNA. Na pikotitrační destičce jsou dále kuličky umístěny do jamek tak, aby každé jamce připadla jedna kulička (e). Pyrosekvencování začíná po přidání pyrosekvenační směsi. Hlavní složky směsi tvoří: enzym luciferáza, sulfuryláza, DNA-polymeráza, nukleotidy, luciferin a APS (adenosin 5´fosfosulfát) (f). Vyhodnocení probíhá tak, že čtečka snímá každou jamku v průběhu syntézy DNA a deteguje signál ve formě světelné emise.

20

Obr. 2 Schéma pyrosekvencování s využitím pikotitrové destičky. Zdroj: http://www.dkfz.de

21

Bioluminometrické sekvenování (Obr. 3) je založeno na detekci anorganického pyrofosfátu PPi uvolněného během inkorporace deoxinukleotidu do řetězce. V dalších krocích je pyrofosfát enzymem sulfurylázou konvertován na ATP, který je nezbytný pro činnost luciferázy. Štěpení luciferinu enzymem luciferázou je doprovázeno emisí světelného záření. Záření je úměrné množství DNA a počtu začleněných nukleotidů. Detekční systémem zpracovává signály ve formě píků (Agah, 2004).

Obr. 3 Bioluminometrické sekvencování – schéma (upraveno dle Agah, 2004)

Před několika lety bylo popsáno použití pikotitrové destičky pro charakterizaci mikroflóry sekvencováním odpovídajících úseků 16S rDNA (Sogin a kol., 2006). Postup spočívá v extrakci DNA mikroflóry z biopsie nebo fekálního vzorku, poté se úsek 16S rDNA amplifikuje pomocí PCR s použitím universálních 16S primerů a osekvenuje na pikotitrové destičce. Stejně jako výše popsané molekulární techniky i tato technika umožňuje pomocí univerzálního páru primerů amplifikovat úsek 16S prakticky z jakékoliv bakterie. Amplikon zahrnuje jedno nebo

několik variabilních míst umožňujících

identifikaci bakteriálního druhu nebo fylotypu sekvencováním. Sekvencování variabilní oblasti o délce sto bází je ve většině případů dostačující pro identifikaci bakteriálního druhu nebo rodu.

22

454-pyrosekvencování nabízí paralelní analýzu většího počtu jednotlivých vzorků s omezenou manipulací při jejich zpracování a bez potenciálního klonování. Metoda umožňuje zařadit mikroorganismy do tzv. operačních taxonomických jednotek (operational taxonomic units, OTUs) až na úroveň rodu nebo na nižší úroveň. Tato technika byla úspěšně použita při analýze mikrobiálního obsahu v hrdle, žaludku a ve fekálních vzorcích. Bylo získáno 51 869 anotovaných přepisů reprezentujících 609 operačních taxonomických jednotek (OTU), které patřily 14-ti fylotypům. Mikroorganismy zpracované klastrovou analýzou podle míst odběru ukázaly na význam selekčního tlaku při osídlování biologických nik (Andersson a kol., 2008).

4.4 Metagenomika Metagenomika je definována jako věda zabývající se biologickou diverzitou. Je založena na analýze genomů příbuzných, ale ne zcela identických mikrobních populací za použití genetických a molekulárních technik. Celkové metagenomické studie umožňují porozumět dynamice mikrobního společenství a zahrnují analýzy nukleotidových sekvencí, struktury, regulace a funkce (Handelsman a kol., 1998). Metagenomický přístup začíná izolací celkové genomové DNA z prostředí nebo klinického vzorku. Schéma je uvedeno na Obr. 4. Heterologní DNA ze vzorku je klonována do vektoru a transformována do hostitelské bakterie; soubor výsledných transformantů je definován jako metagenomická knihovna. Poté následuje skríning knihovny klonů. Pomocí skríningu lze vyhledávat biologicky aktivní látky jako např. různé enzymy nebo antibiotika. K detekci konzervovaných genů, které představují fylogenetické markery, lze použít metodu PCR nebo DNA/DNA hybridizaci. Jedná se např. o geny jako je 16S rDNA, recA, rpoB apod. Geny, které ohraničují fylogenetické markery, mohou být také sekvencovány. Získané informace přinášejí další poznatky o fyziologii a ekologii daného klonu. Běžné také je, že metagenomická knihovna je sekvencována pro identifikační účely. Předností metagenomického přístupu pro funkční analýzu klonů je, že umožňuje identifikaci genů, aniž by bylo zapotřebí jejich sekvenční analýzy. Bariérou však v tomto postupu zůstává nedostatečně prostudovaná heterologní exprese genů izolovaných

23

z organismů z různého prostředí. Ne vždy totiž dochází k expresi genů po transformaci do hostitelských bakterií. Přenesení úseku genetické informace (DNA) z bakterií, které nejsou kultivovatelné, do hostitelských bakterií, které lze kultivovat, umožňuje dlouhodobě uchovávat a využívat tuto DNA pro různé účely. I částečná informace má význam pro studium diverzity, fyziologii a genetiky nekultivovatelných bakterií. Metagenomické přístupy byly aplikovány pro studium společenství lidských střevních mikroorganismů. Gill a kol. (2006) zjistili mikrobiální genomovou a genetickou diversitu a identifikovali některé odlišné funkční atributy, které byly nalezeny v mikrobiomu lidského střeva. Náhodným sekvencováním celého genomu, sekvenční identifikací fylotypů a funkční analýzou klonů metagenomické knihovny dvou zdravých lidí byly definovány některé geny kódující funkční vlastnosti střevní mikrobiální komunity (Gill a kol., 2006). Autoři Manichanh a kol. (2006) navzájem porovnali dvě metagenomické knihovny (každá s 25 000 klony). Jedna byla konstruovaná s využitím genomové DNA zdravých osob a druhá z pacientů nemocných Crohnovou chorobou (CD). Knihovny byly použity pro konstrukci makročipů. Analýza mikrobiální diverzity byla provedena

hybridizačním

skríningem

s využitím

16S

rDNA,

sekvencováním

a

fylogenetickou analýzou. Výsledná data byla zpracována s využitím bioinformatických databází. U pacientů nemocných Crohnovou chorobou se prokázala snížená diverzita fekálních mikrobiotů. Metagenomické výsledky byly potvrzeny fluorescenční hybridizací in situ..

24

Obr. 4 Schéma metagenomické analýzy. Zdroj: (Handelsman a kol., 2004)

4.5 Nové generace sekvenačních technik Od započetí řešení projektu lidského genomu (Human Genome Project) v roce 1990 se sekvenační techniky výrazně zdokonalily. Příští generace sekvenačních technik budou vyžadovat výpočetní řešení procesu masivního sekvencování, které bude zahrnovat manipulaci s velkou škálou dat, automatizovanou kontrolu jejich kvality a zaznamenávání,

25

fylogenetické analýzy vybraných genů a genových rodin. Zcela odděleně bude probíhat kompletování genomů mnoha metagenomicky analyzovaných a sekvencovaných mikroorganismů ve střevní mikroflóře. Plně automatizované sestavování genomů mnoha souběžně sekvencovaných mikroorganismů klade důraz na výpočetní postupy. Bude třeba: nejen modifikovat postupy vyhodnocování souborů dat ale vypracovat i de novo algoritmy, zavést binární kódy pro třetí generaci sekvencování, kde čtyři digitální nukleotidové sekvence budou konvertovány do binárního kódování za účelem zjednodušení výpočtu a v neposlední řadě vyvinout nové metody přípravy vzorků pro analýzu, zejména postupů s využitím magnetických nosičů. Ty totiž umožňují namnožení určitých úseků genomu pomocí cíleného vychytávání s využitím DNA/DNA hybridizace.

26

5. Diskuse S rostoucím výskytem vážných onemocnění střevního traktu roste též význam hlubšího studia vztahů mezi hostitelem a střevní mikroflórou. K pochopení přesného významu funkce střevní mikroflóry je podstatné zjistit detailní informace o jejím složení v různém věku a za různých fyziologických a patofyziologických podmínek. Molekulární metody zatím plně nenahradily tradiční kultivační metody, a to z toho důvodu, že informace o růstových požadavcích a fyziologických podmínkách kultivace přináší stále převážně tradiční kultivace. Nástup éry molekulárních metod v 80. letech a s ním související

rozvoj

biologických

statistických

programů

pro

zpracování

dat

a

bioinformatických databází, které uchovávají obrovské množství molekulárních dat byl přelomový. Nejen že zrychlil tempo zpracování dat, ale umožnil také identifikaci a kvantifikaci střevní mikroflóry prostřednictvím její genetické informace. Velký důraz je kladen na sekvencování DNA mikroorganismů získaných z komplexních vzorků, a na analýzu těchto sekvencí. Analýzu usnadňují bioinformatické nástroje, které jsou schopny zpracovatovat velké databáze sekvencí. Znalosti sekvencí DNA jsou nezbytné pro konstrukci mikročipů a pro profilování genomických knihoven. Nejnovější molekulární metody, využívající nanotechnologických čipů, výrazně urychlily zpracování velkého množství izolovaného biologického materiálu. S revoluční myšlenkou reverzního postupu přichází metagenomický přístup, ve kterém od znalosti genetické informace přecházíme k charakterizaci organismu.

27

Závěr Pozitivní vliv střevní mikroflóry na správný funkční a strukturální vývoj gastrointestinálního traktu byl v mnoha experimentech potvrzen využitím molekulárních metod. V důsledku toho se posunula hranice o představách působení mikroorganismů v gastrointestinálním traktu. V několika experimentech bylo potvrzeno, že techniky TRFLP jsou vhodné pro rychlé porovnání složení více bakteriálních vzorků, DGGE/TGGE metoda spolehlivě odděluje řetězce DNA o identické velikosti a poskytuje tak vhodný základ pro další analýzu a že metoda 454- pyrosekvencování je schopna rychle zpracovat velké množství genetického materiálu. Díky zdokonalení citlivosti molekulárních technik je nyní možné zaznamenávat i subdominantní bakteriální druhy, které jsou zastoupené v nízkých koncentracích. Současně s využitím sekvenačních technik lze urychlit identifikaci bakterií. Tyto inovace vedou k hlubšímu pochopení funkcí střevní mikroflóry a přinášejí lepší znalosti o působení probiotických bakterií aplikovaných do zdraví prospěšných potravin.

28

Seznam zkratek: MAC- mikroflóře přidružení charakteristika GAC- germ-free animal characteristic TMK- těkavé mastné kyseliny AG- beta- aspartyl- glycin PCR- polymerázová řetězová reakce (ang. polymerase chain reaction) APS - adenosin 5´fosfosulfát BSH- hydroláza žlučových kyselin (ang. bile salt hydrolase) ATP- adenozin trifosfát GI- gastrointestinální trakt IBD- zánětlivá onemocnění střev ( ang. inflammatory bowel desease, IBD) TRF- terminální restrikční fragment OTUs- operační taxonomická jednotka ( ang. operational taxonomic units) Ang4- angiogenin-4

29

Seznam literatury: Agah, A., Aghajan, M., Mashayekhi, F., Amini, S., Davis, R. W., Plummer, J. D., Ronaghi, M., Griffin, P. B. (2004): A multi-enzyme model for pyrosequencing. Nucl. Acids Res. 32: e166. Andersson, A. F., Lindberg, M., Jakobsson, H., Bäckhed, F., Nyrén, P., Engstrand, L. (2008): Comparative analysis of human gut microbiota by barcoded pyrosequencing. PLoS. Biol. 3: e2836. Bry, L., Falk, P. G., Midtvedt, T., Gordon, J. I. (1996): A model of host-microbial interactions in an open mammalian ecosystem. Science. 273:1380-1383. Burr, M. D., Clark, S. J., Spear, C. R., Camper, A. K. (2006): Denaturing gradient gel electrophoresis can rapidly display the bacterial diversity contained in 16S rDNA clone libraries. Microb. Ecol. 51: 479-486. Comelli, E. M., Simmering, R., Faure, M., Donnicola, D., Mansourian, R., Rochat, F., Corthesy-Theulaz, I., Cherbut,C. (2008): Multifaceted transcriptional regulation of the murine intestinal mucus layer by endogenous microbiota. Genomics. 91: 70-77. Egert, M., de Graaf, A. A., Smidt, H., de Vos W. M., Venema, K. (2006): Beyond diversity: functional microbiomics of the human colon. Trends Micobiol.14: 86-91. Eyssen, H. (1973): Role of gut microflora in metabolism of lipids and sterols. Proc. Nutr. Soc. 32: 59–63. Fischer, S. G., Lerman, L. S. (1983): DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: Correspondence with melting theory. Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 1579-1583. Fuller, R.(1989): Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 5: 365-378. Furrie, E. (2006): A molecular revolution in the study of intestinal microflora. Gut.55: 141143. Guarner, F., Malagelada, J. R. (2003): Gut flora in health and desease. Lancet. 361:512519 Gill, S. R., Pop, M., DeBoy, R. T., Eckburg, P. B., Turnbaugh, P. J., Samuel, B. S., Gordon, J. I., Relman, D. A., Fraser-Liggett, C. M., Nelson, K. E. (2006): Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312: 1355-1359. Handelsman, J. (2004): Metagenomics: Application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68: 669-685.

30

Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy J., Goodman, R. M. (1998): Molecular biological access to the chemistry of unknow soil microbes: a new frontier for natural products. Chem. Biol. 5: R245-249 Hooper, L. V. (2004): Bacterial contributions to mammalian gut development. Trends Microbiol. 12: 129-134. Jernberg, C., Sullivan, A., Edlund, C., Jansson, J. K. (2005): Monitoring of antibioticinduced alterations in the human intestinal microflora and detection of probiotic strains by use of terminal restriction fragment length polymorphism. Appl. Environ. Microbiol. 71: 501-506. Jernberg, C., Löfmark, S., Edlund, C., Jansson, J. K. (2007): Long-term ecological impacts of antibiotic administration on the human intestinal microbiota. ISME J. 1:56-66. Lye, H. S., Rusul, G., Liong, M. T. (2010): Removal of cholesterol by lactobacilli via incorporation and conversion to coprostanol. J. Dairy Sci. 93: 1383-1392. Maidak, B. L., Cole, J. R., Parker, C. T., Garitty, G. M., Larsen, N., Li, B., Lilburn, T. G., McCaughey, M. J., Olsen, G. J., Overbeek, R., Pramanik, S., Schmidt, T. M., Tiedje, J. M., Woese, C. R. (1999): Nucl. Acids Res. 27: 171-173. Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E., Attiya, S., Bader, J. S., Bemben, L. A., Berka, J., Braverman, M. S., Chen, Y., Chen, Z., Dewell, S. B., Du, L., Fierro, J. M., Gomes, X. W., Godwin, B. C., He, W., Helgesen, S., Ho, C. H., Irzyk, J. P., Jando, S. C., Alenquer, M. L. I., Jarvie1, T. P., Jirage, K. B., Kim, J. B., Knight, J. R., Lanza, J. R., Leamon, J. H., Lefkowitz, S. M., Lei, M., Li, J., Lohman, K. L., Lu, H., Makhijani, V. B., McDade1, K. E., McKenna1, M. P., Myers, E. W., Nickerson, E., Nobile, J. R., Plant, R., Puc, B. P., Ronan, M. T., Roth, G. T., Sarkis, G. J., Simons, J. F., Simpson, J. W., Srinivasan, M., Tartaro, K. R., Tomasz, A., Vogt, K. A., Volkmer, G. A., Wang, S. H., Wang, Y., Weiner, M. P.,Yu, P., Begley, R. F., Rothberg, J. M. (2005): Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437: 376-380. Manichanh, C., Rigottier-Gois, L., Bonnaud, E., Gloux, K., Pelletier, E., Frangeul, L., Nalin, R., Jarrin, C., Chardon, P., Marteau, P., Roca, J., Dore, J. (2006): Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn´s desease revealed by a metagenomic approach. Gut. 55: 205-211. Mangin, I., Suau, A., Magne, F., Garrido, D., Gotteland, M., Neut, C., Pochart, P., (2006): Characterization of human intestinal bifidobacteria using competitive PCR and PCRTTGE. FEMS Microbiol. Ecol. 55: 28-37. Midtvedt, T., Carlsted–Duke, B., Hoverstad, T., Lingaas, E., Norin, E., Saxerholt, H., Steinbakk, M. (1986): Influence of peroral antibiotics upon the biotransformatory activity of the intestinal microflora in healthy subjects. Europ. J. Clin. Invest. 16: 11-17. Monstein, H. J., Ollson, C., Nilsson, I., Grahn, N., Benoni, C., Ahrné, S. (2005): Multiple displacement amplification of DNA from human colon and rectum biopsies: Bacterial profiling and identification of Helicobacter pylori-DNA by means of 16S rDNA-based TTGE and pyrosequencing analysis. J. Microbiol. Methods. 63: 239-247.

31

Muyzer, G., de Waal, E. C., Uitterlinden, A. G. (1993): Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 59: 695-700. Norin, E., Jernberg, C., Nilsson, H., Engstrand, L. (2009): Studies of the intestinal microflora by traditional, functional and molecular techniques. In: Ljungh Ä., Wadström T. (eds.), Lactobacillus Molecular Biology: From genomics to probiotics, 83-92. Caister Academic press, Nortfolk. O´Toole, P. W., Claesson, M. J. (2010): Gut microbiota: Changes throughout the lifespan from infancy to elderly. Int. Dairy J. 20: 281-291. Palmer, C., Bik, A. M., Eisen, M. B., Eckburg, P. B., Sana, T. R., Wolber, P. K., Relman, D. A., Brown, P. O. (2006): Rapid quantitative profiling of complex microbial populations. Nucl. Acids Res. 34: e5. Pfeiler, E. A., Klaenhammer, T. R. (2007): The genomics of lactic acid bacteria. Trends Microbiol. 15: 546-553. Pot, B., Tsakalidou E. (2009) : Taxonomy and metabolism of Lactobacillus. In: Ljungh Ä., Wadström T. (eds.), Lactobacillus molecular biology: From genomics to probiotics, 3-58. Caister Academic Press, Nortfolk.

Raes, J., Foerstner, K. U., Bork, P. (2007): Get the most out of your metagenome: computational analysis of environmental sequence data. Curr. Opin. Microbiol. 10: 490498. Saarela M., Maukonen J., von Wright A., Vilpponen-Salmela, T., Patterson, A. J., Scott, K. P., Hämynen, H., Mätto, J., (2007): Tetracycline susceptibility of the ingested Lactobacillus acidophilus LaCH-5 and Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12 strains during antibiotic/probiotic intervention. Int. J. Antimicrob. Agents.29:271-280. Sakata, S., Tanooka, T., Ishizeki, S., Takada, M., Sakamoto, M., Fukuyama, M., Benno, Y. (2005): Culture-independent analysis of fecal microbiota in infants, with special reference to Bifidobacterium species. FEMS Microbiol. Lett. 243: 417-423. Sanders, M. E.(2000): Considerations for use of probiotic bacteria to modulate human health. J. Nutr. 130: 384S-390S. Sogin, M. L., Morrison, H. G., Huber, J. A.,Welch, D. M., Huse, S. M., Neal, P. R., Arrieta, J. M., Herndl, G. J. (2006): Microbial diversity in the deep sea and the underexplored “rare biosphere“. Proc. Natl. Acad. Sci. 32: 12115-12120. Tannock, G. W. (1995): Microecology of the gastrointestinal tract in relation to lactic acid bacteria. Int. Dairy J. 5: 1059-1070. Tannock, G. W. (2008): The search for disease-associated compositional shifts in bowel bacterial communities of humans. Trends Microbiol. 16: 488-495. Van de Peer, Y., Neefs, J. M., de Rijk, P., de Wachter, R. (1993): Evolution of Eukaryotes as deduced from small ribosomal subunit RNA sequences. Biochem. Syst. Ecol. 21: 43-55.

32

Vítek, L., Majer, F., Muchová, L., Zelenka, J., Jirásková, A., Branný, P., Malina, J., Ubik, K. (2006): Identification of bilirubin reduction products formed by Clostridium perfringensis isolated from human neonatal fecal flora. J. Chromatogr. B. 833: 149-157. Wang, M., Ahrné, S., Antonsson, M., Molin, G. (2004): T-RFLP combined with principal component analysis and 16S rRNA gene sequencing: an effective strategy for comparison of fecal microbiota in infants of different ages. J. Microbiol. Methods. 59: 53-69. Welling, G. W., Meijer-Severs, G. J. (1988): Beta-aspartylglycinease activity, a microflora-associated characteristic (MAC); its presence in different strains of anaerobic bacteria. Microb. Ecol. Health Dis. 1: 45-49. Zhang, M., Liu, B., Zhang, Y., Wei, H., Zhao, L. (2007): Structural shifts of mucosaassociated Lactobacilli and Clostridium leptum subgroup in patients with ulcerative colitis. J. Clin. Microbiol. 45: 496-500. Zoetendal, E. G., von Wright, A., Vilpponen-Salmela, T., Ben-Amor, K., Akkermans, A.D. L., de Vos, W. M. (2002): Mucosa-associated bacteria in the human gastrointestinal tract are uniformly distributed along the colon and differ from the community recovered from feces. Appl. Environ. Microbiol. 68: 3401-3407.

Elektronické zdroje: http://www.dkfz.de

33