Studium genetické diverzity jírovce s rozdílnou rezistencí ke klíněnce jírovcové

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Studium genetické diverzity jírovce s rozdílnou rezistencí ke klíněnce jírovcové Bakalářská práce

Vedoucí práce:

Vypracoval:

Ing. Tomáš Vyhnánek, Ph.D.

Václav Bačovský Brno 2013

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Studium genetické diverzity jírovce s rozdílnou rezistencí ke klíněnce jírovcové vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne 30.4.2013 podpis ……………………………

Poděkování Poděkovat srdečně chtěl bych Ing. Tomášovi Vyhnánkovi, Ph.D., za vedení, připomínky a rady cenné, při pronikání do tajů genetických udělené.

Za poskytnutou konzultaci, při množení in vitro a kultivaci, velký dík patří Ing. Heleně Vlašínové, Ph.D. Rodině mé pak poděkování patří, za podporu během studování, i za chvíle se mnou strastiplné, když tvoření se zdálo bezvýchodné. V neposlední řadě však, vděčí tato práce pak, Ing. Josefu Mertelíkovi, CSc. a doc. Ing. Haně Šefrové, Ph.D., Ing. Janě Šedivé, Ph.D. a Mgr. Markétě Pospíškové, Ph.D.

Abstrakt Klíněnka jírovcová (Cameraria ohridella) je velice invazivní druh, který se během čtvrt století rozšířil po celé Evropě. Hostitelskou dřevinou v případě klíněnky je rod Aesculus. Protože dochází k závažnému poškození listové aparatury hostitelských dřevin housenkami klíněnky jírovcové, snižuje se obranyschopnost napadených jedinců, na kterých dochází následně k rozvoji některých patogenů. Kombinace těchto faktorů vede následně k masovému úhynu stromů, kdy nejvíce postiženy jsou A. hippocastanum a A. turbinata, především v Západní Evropě. V roce 1998 byl nalezen J.Mertelíkem rezistentní klon, který byl patentován jako kultivar Mertelik06. V této práci byla posuzována genetická variabilita u vybraných zástupců rodu Aesculus s rozdílnou rezistencí ke klíněnce jírovcové pro zjištění schopnosti jírovců vyrovnat se s invazivním tlakem klíněnky jírovcové. K posuzování polymorfizmu u A. hippocastanum, A. turbinata somatické

embryogeneze

a

organogeneze

a 10 jedinců odvozených cestou

byla

použita

metoda

amplifikace

mikrosatelitních oblastí. Zjištěná data vykazují i přes poměrně malou velikost analyzovaného souboru určitou genetickou diverzitu, když byla zjištěna hodnota polymorfního informačního obsahu v rozmezí 0,00 – 0,71 (průměr 0,43). Zároveň byla nalezena shoda na molekulární úrovni mezi in vitro kulturami a jejich donorovým jedincem. Tento výsledek potvrzuje vhodnost této metodiky pro ověřování stability a ověřování původu explantátových kultur. Klíčová slova: Aesculus, rezistence, genetická variabilita, mikrosatelity, polymorfizmus

Abstract Horse-chestnut leaf miner (Cameraria ohridella) spread in about 25 years over the whole of Europe proving to be one of the most invasive moth kind. Major hosting plant to Cameraria ohridella showed to be Aesculus genus; the common Aesculus hippocastanum being the most often. Because horse-chestnut larvae inflict serious damage to leaf apparatus of its hosts, these are losing their immunity and hence are subject to number of diseases. All these factors combined lead to mass extinction of host trees of which the most afflicted are A. hippocastanum and A. turbinata in western Europe. In 1998 J.Mertelik found a resistant clone patented later as cultivar Mertelik06. In my work I describe and compare genetic variability of selected representatives of genus Aescullus with different resistance levels to horse-chestnut leaf miner larvae and aim to discover the ability of horse-chestnut trees to cope with invasive pressure of Cameraria ohridella. To analyse the polymorphism of A. hippocastanum, A. turbinata and other 10 specimen derived with somatic embryogenesis and organogenesis, amplification of microsatelite fields was used. Despite relatively small size of analysed volume of data, the results show certain genetic diversity ranging from 0.00-0.71 (0,43 in average). At the same time, correspondence on molecular level was found between cultures in vitro and the donor which proves this method to be appropriate to verify stability and origin of explant cultures. Key words: Aesculus, resistence, genetic variability, microsatelite, polymorphism

Obsah 1 Úvod............................................................................................................................. 8 2 Literární přehled .......................................................................................................... 9 2.1 Klíněnka jírovcová ............................................................................................... 9 2.1.1 Systematické zařazení .................................................................................. 9 2.1.2 Bionomie druhu ............................................................................................ 9 2.1.2.1 Vajíčko .................................................................................................. 9 2.1.2.2 Housenka ............................................................................................ 10 2.1.2.3 Kukla....................................................................................................11 2.1.2.4 Imago .................................................................................................. 12 2.1.2.5 Generační cyklus klíněnky během roku ............................................. 13 2.1.3 Předpokládaný původ a šíření .................................................................... 14 2.1.4 Dynamika populace klíněnky ..................................................................... 15 2.1.5 Faktory způsobující mortalitu klíněnky a její možná regulace .................. 16 2.2 Hlavní hostitelská dřevina klíněnky – rod jírovec (Aesculus L.)....................... 19 2.2.1 Systematické zařazení rodu Aesculus ......................................................... 19 2.2.2 Charekteristika rodu Aesculus a vybraných druhů ..................................... 19 2.2.2.1 Jírovec maďal (Aesculus hippocastanum) a jeho využití ................... 19 2.2.2.2 Jírovec japonský (Aesculus turbinata) ................................................ 21 2.2.2.3 Klon jírovce maďalu M06 .................................................................. 21 2.2.3 Škodlivost klíněnky na rodu Aesculus ....................................................... 23 2.2.4 Rezistence a obranné mechasnimy rodu Aesculus před klíněnkou ............ 27 2.3 Genetická diverzita............................................................................................. 29 2.3.1 Význam genetické diverzity ....................................................................... 29 2.3.2 Původ jírovce maďalu a jeho vliv na druhově genetickou diverzitu .......... 30 2.3.3 Genetická diverzita na úrovni DNA .......................................................... 32 2.3.4 Mikrosatelity jako nástroj pro studium genetické diverzity ....................... 33 2.3.4.1 Charakteristika mikrosatelitů .............................................................. 33 2.3.4.2 Funkce mikrosatelitů .......................................................................... 34 2.3.4.3 Využití mikrosatelitů u rostlin ............................................................ 35 2.4 Technika explantátových kultur ......................................................................... 37 2.4.1 Vegetativní množení u A. hippocastanum .................................................. 37 3 Cíle bakalářské práce ................................................................................................. 38 4 Materiál a metodika ................................................................................................... 39 4.1 Materiál pro analýzy DNA ................................................................................. 39 4.2 Analyzovaný materiál ........................................................................................ 40 4.3 Metodika ............................................................................................................ 41 4.3.1 Izolace DNA ............................................................................................... 41 4.3.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR) ........................................................ 42 4.3.3 Příprava gelů a elektroforéza ...................................................................... 44 4.3.3.1 Agarózové gely ................................................................................... 44 4.3.3.2 Polyakrylamidové gely a vizualizace konečných produktů................ 44 4.3.3.3 Průběh elektroforézy........................................................................... 45 4.3.3.4 Barvení výsledných produktů ............................................................. 45 4.3.4 Hodnocení výsledků ................................................................................... 46 5 Výsledky a diskuze .................................................................................................... 47

5.1 Optimalizace nasedání primerů .......................................................................... 47 5.2 Vyhodnocení analýz u jednotlivých SSR markerů ............................................. 47 5.3 Hodnocení genetické diverzity u rodu Aesculus ................................................ 49 6 Závěr .......................................................................................................................... 51 7 Seznam publikovaných prací ..................................................................................... 53 8 Seznam použité literatury .......................................................................................... 54 Seznam obrázků ............................................................................................................. 63 Seznam tabulek .............................................................................................................. 63 Seznam grafů ................................................................................................................. 63

1

Úvod

V posledních letech jsme svědky šíření mnoha nových druhů rostlin i živočichů na našem území. K tomuto šíření docházelo i v minulosti mnohem pomaleji. S rozvojem lidské společnosti člověk měnil životní prostředí a introdukoval nové druhy do míst, kde se původně nevyskytovaly nebo již vymizely (reintrodukce). K introdukci docházelo a dochází často pasivně s přepravou potravin, kulturních rostlin, vlnou, dřevinami a dalšími materiály na dopravních prostředcích. V případě jedinců rodu Aesculus L. (např. A. hippocastanum) docházelo v Evropě k záměrné reintrodukci z počátku zejména pro okrasné vlastnosti. Šíření klíněnky jírovcové (Cameraria ohridella Deschka & Dimić, 1986) člověk urychlil, když byla zavlečena do Horního Rakouska. Klíněnka jírovcová tak nemusela překonávat hornatý terén Balkánského poloostrova. Dnes je již tento drobný motýl znám po celé Evropě jednak pro jeho rychlou invazi, ale i pro jeho poškození na hostitelských dřevinách. Housenky klíněnky často poškozují celý listový aparát, což vede ke snížení imunity stromů. Následná kombinace masového žíru a napadení patogeny vede k úhynu hostitelských dřevin. Obecně nejefektivnějším způsobem ochrany rostlin je přirozená rezistence. Proto bylo v roce 1997 zahájeno prověření existence jedinců rodu Aesculus odolných ke klíněnce jírovcové. V roce 2006 byl úspěšně patentován rezistentní kultivar Mertelik06, na kterém dochází k zastavení vývoje housenek, listový aparát zůstává funkční a dřeviny mají více energie na obranu před patogeny (Mertelík & Kloudová, 2009). Schopnost živých organismů vyrovnat se změnou svého ekotopu z velké části určuje genetická diverzita. Právě na genetické proměnlivosti závisí, zda daný druh dokáže překlenout nepříznivé období nebo zda se např.dokáže vyvinout v odolnějšího jedince, proto je studium genetické diverzity důležité a to zejména u ohrožených druhů. Ke studiu genetické diverzity se velmi často využívá SSR markerů, které mají velkou oblibu především díky jejich vysokému stupni polymorfizmu a jejich kodominantnímu charakteru. Jsou proto účinným nástrojem pro odhad genetické rozmanitosti.

8

2 Literární přehled 2.1 Klíněnka jírovcová 2.1.1 Systematické zařazení Dle přítomnosti sosáku, stavby křídel a pohlavních orgánů je klíněnka jírovcová řazena do následujícího taxonomického zařazení: Říše: Animalia – Živočichové Kmen: Arthropoda – Členovci Třída: Insecta – Hmyz Řád: Lepidoptera – Motýli Nadčeleď: Gracillarioidea – Vzpřímenky Čeleď: Gracillariidae –Vzpřímenkovití Podčeleď: Lithocolletinae – Klíněnkovití Rod: Cameraria – Klíněnka Druh: Cameraria ohridella – Klíněnka jírovcová Dnes je u nás klíněnka zastoupena 71 druhy rodu Phyllonorycter a jedním druhem rodu Cameraria (Šefrová, 1999). 2.1.2 Bionomie druhu Pro klíněnku jírovcovou, tak jako pro ostatní motýly, je typická holometabolie neboli proměna dokonalá. Larvální stadium nemá základy křídel, má jiný typ ústního ústrojí než imago a homonomní článkování těla (Šefrová, 2006). 2.1.2.1 Vajíčko Ploché životaschopné vajíčko (obr. 1) klíněnky jírovcové je mírně oválné s malými prohlubněmi, průhledné, světlé až mléčné barvy a velikostně se pohybuje v rozmezí 0,35 – 0,45×0,25 – 0,30×0,05 mm. Životaschopná vajíčka jsou pevně přitmelena k povrchu listu, mrtvá mají přizvednuté okraje a postupně mohou odpadnout (Nováková, 2008). Samičky pařící se bezprostředně po vylíhnutí kladou ihned vajíčka vždy na svrchní stranu listů do malých prohlubní podél postraních žilek hostitelských rostlin, při čemž samičky nerozlišují velikost listů a stáří dřeviny. Průměrný počet kladených vajíček se

9

pohybuje okolo 20 – 40. Doba líhnutí trvá při umělých, tj.optimálních podmínkách za teploty 23°C 4 – 6 dní, za normálních podmínek se tato doba pohybuje okolo 4 – 12 dní (Trandžík, 2005).

Obr. 1 – Vajíčko klíněnky jírovcové (Nováková, 2008) 2.1.2.2 Housenka Klíněnka jírovcová prodělává ve svém larválním stadiu 6 instarů (Mrkva, 1999) nebo také někteří autoři uvádějí rozlišení jejího vývoje na 4 instary a 2 fáze předkukly (Samek, 2007). Správně by se však mělo uvádět pouze 6 instarů (Šefrová, ústní sdělení). Během celého vývoje zůstává housenka (obr. 2) plochá, zřetelně článková. Tělo je dorsoventrálně zploštělé a může nabývat barvy bílé, našedlé nebo nažloutlé. Cranium, které je velmi nápadité, je hnědé (Šefrová, 2002).

Obr. 2 – Housenka klíněnky jírovcové, uprostřed housenky hnědé nápadné cranium (Nováková, 2008) Hlava je z počátku prognátní a má trojúhelníkovitý tvar (první čtyři instary). Ústní ústrojí je pro ni specifické. Kusadly narušuje houbový a palisádový parenchym, z něhož 10

si vytváří kašovitou hmotu, kterou nasává. Housenka si vyžírá miny horizontálně, náhodnému porušení pokožky listů potom brání mohutný horní a spodní pysk. Ihned po vylíhnutí se housenka zavrtává do listu a vytváří jednoduché chodbičky nazývané miny. Ty postupně během svého vývoje rozšiřuje. Tak je chráněna před vnějšími vlivy (Šefrová, 1999). Velikost housenky se během jednotlivých instarů mění, celková velikost se pohybuje v rozmezí 0,5 – 6 mm. V důsledku růstu se tvoří nová pokožka, původní praská a může být nalezena v minách jako exuvie, které bývají téměř nepoškozeny pohybem housenek. Rovněž díky příjmu tekuté potravy, lze v minách nalézt specifické černé kašovité výkaly (Nováková, 2008). Jak již bylo zmíněno, housenka prodělává 6 instarů, při čemž rozdíl je především ve velikosti hlavy a typu ústního ústrojí. Během 1 – 2.instaru dochází k největší úmrtnosti housenek, což se projeví zhnědnutím miny. Ve 3.instaru přijímají nejvíce potravy (Šefrová, 2002). První a druhý, třetí a čtvrtý instar lze rozlišit na základě šířky crania, druhý a třetí však bezpečně rozeznat nelze. V 5.instaru se již velikost crania téměř neliší od 4.instaru (Nováková, 2008) a zároveň dochází k přeměně kousacího ústního ústrojí ve snovací zařízení, ale housenky jsou v malé míře stále schopny potravu přijímat. V posledním vývojovém stadiu si housenka tvoří bílý zámotek, který ji chrání během vývoje před vnějšími vlivy a nastává tak fáze kukly. Během vývoje housenky prochází morfologickou proměnou, proto se nazývá tento typ vývoje nadproměna nebo-li také hypermetabolie (hypermetamorfóza). Za vnějších podmínek trvá vývoj housenky 22 – 45 dní, v umělých podmínkách 20 – 35 dní (Šefrová, 2002). 2.1.2.3 Kukla Kukla (obr.3) klíněnky jírovcové je polovolná, dlouhá 3,8 – 4,4 mm a je červenohnědého zbarvení. Velikost těla se pohybuje od 3,3 do 3,6 mm, při čemž větší délky dosahují spíše samice. U jedinců líhnoucích ještě tentýž rok je kukla neúplná, nemá stříbřité víčko u povrchu listové epidermis. Přezimující jedinec má kuklu úplnou se stříbřitým víčkem a pevnou. Dospělec se líhne pomocí ostrého trnu na předním konci kukly, díky němuž proráží jak samotnou kuklu, tak svrchní pokožku listu a vzniká tak vstupní brána pro některé patogeny. Při líhnutí kukla praská na hlavové a hrudní části. Po vylíhnutí zůstává kukla viditelná ve vytvořeném otvoru v listu (Nováková, 2008). Stadium kukly trvá 12 – 17 dní za umělých podmínek, za normálních trvá vývoj 15 – 20 11

dní (Trandžík, 2005).

Obr. 3 – Kukla klíněnky jírovcové, trn na proximálním konci kukly (Nováková, 2008) 2.1.2.4 Imago Dospělec klíněnky jírovcové (obr. 4) je drobný denní motýl s velikostí těla 2,4 – 4 mm.

Obr. 4 – Imago klíněnky jírovcové (Nejezchlebová, 2011) Rozpětí křídel 6 – 10 mm se v průběhu života může měnit vlivem ulamování jejich koncových částí. Velké, dobře vyvinuté, složené oči jsou umístěny po stranách pohyblivé hlavy, která je orthognátní a užší než hruď. Typickým znakem jsou nitkovitá, do hněda zbarvená jemná kroužkovitá tykadla dosahující na konec zadečku. Hruď má stejně jako křídla zlatooranžové zabarvení s bílými proužky. Černé lemování okolo bílých příček a klínků na křídlech je důležitým znakem pro rod Cameraria a důležitým

12

rozlišovacím znakem od druhů rodu Phyllonorycter, které mají klínky bez tmavého lemu nebo se nachází na vnitřní straně. Přední pár křídel je větší, zádní křídla, složená na zadohrudi jsou velmi nenápadná. Oba páry křídel jsou zašpičatělé a kromě šupinek nesou i lesklé šedobílé třásně. Pokud imago sedí, obemykají křídla zadeček, který je lesklý, stříbrošedý a široce přisedlý k zadohrudi. Dlouhé kráčivé nohy jsou bílošedé s třásněmi a tmavými kroužky. Odhadovaný život dospělce je asi 4 týdny (Šefrová, 2002). 2.1.2.5 Generační cyklus klíněnky během roku Na území České republiky vytváří klíněnka jírovcová 2 – 3 generace za rok, ale jen první dvě jsou pravděpodobně schopny v našich podmínkách úplného vývoje (Samek, 2007). Vývoj však začíná počátkem lihnutím imag přezimující generace, které ve fázi kukly vstoupily do diapauzy a následně do hibernace, a tak mohly přečkat zimní období. Tato přezimující generace může být označována jako první, při čemž právě ona zakládá první generaci daného roku. Imaga se začínají líhnout pokud průměrná denní teplota dosáhne 10°C. Termín líhnutí a tím i termín rojení je ovlivněn jak výškou teplot, tak i teplotní dynamikou. Na samotný termín rojení má vliv nadmořská výška a šířka, kdy se změnou nadmořské výšky o 100 m a posunem o jeden stupeň na sever dochází ke zpoždění rojení o 3 – 4 dny (Mrkva, 1999). Rojení může probíhat během celého dne, za slunečného počasí dosahuje maxima v odpoledních hodinách mezi 12 – 16.hodinou. Imaga během rojení mohou vysedávat na různých tmavých svislých plochách, nejčastěji na hostitelské dřevině. Samičky přezimující generace osídlují nejdříve listy spodních pater (důsledek přezimování v opadlém listí), během roku dochází následně ke kolonizaci koruny stromu rovnoměrně. Při líhnutí zimující generace dochází nejdříve k líhnutí samců. Od 5.dne se sexuální index mění ve pospěch samiček (Nováková, 2008). K prvnímu rojení dochází přibližně v našich podmínkách od druhé poloviny dubna do první poloviny května, k druhému rojení první generace dochází od poloviny června do první poloviny července. Druhá generace se rojí od druhé poloviny srpna do začátku září. Zhruba 30 – 99% housenek první generace dokončuje vývoj ještě ten samý rok, druhá generace zakládá třetí z 20 – 40% případů, ostatní jedinci přechází do diapauzy a pokládají tak základ přezimující generaci (Šefrová, 2002). Procento jedinců přecházejících do diapauzy a dokončujících vývoj ještě tentýž rok je hlavně ovlivněno mírou poškození 13

listového aparátu hostitelské dřeviny a teplotou. Druhá generace trpí již značnou mortalitou, proto většina přechází do diapauzy, obzvláště pokud byla vysoká početnost první generace. Třetí generace je typická vysokou úmrtností preimaginálních stadií, vývoj probíhá jen u malého procenta vykladených vajíček. Naopak, pokud přezimující a první generace byla málo početná, druhá a třetí generace se projevuje vysokou početností (Kindl et al., 2002). Při nadměrném nakladení vajíček na list v laboratorních podmínkách došlo k diapauze kukel u 99%. Toto přizpůsobení zamezuje nadměrné mortalitě a zároveň umožňuje optimální využití listového aparátu hostitelské dřeviny (Šefrová, 2002). 2

Na jeden list o průměrné délce 20 cm a ploše 110 cm může být až 50 přezimujícíh kukel. Mortalita přezimujících kukel se pohybuje okolo 5 – 40%, ale neovlivňuje zásadně populaci další rok (Samek, 2003a). 2.1.3 Předpokládaný původ a šíření Místo původu klíněnky jírovcové je dnes stále nejasné. Předpokládalo se, že do Evropy byla zavlečena z jiného kontinentu. V úvahu připadala hlavně Amerika, kde se vyskytuje okolo 53 druhů rodu Cameraria, a Asie, kde se vyskytuje několik příbuzných druhů hostitelské dřeviny. V potaz se brala i možnost, že klíněnka mohla přejít na jírovec z javoru klenu (Acer pseudoplatanus) (Skuhravý, 2006). Poslední studie však ukazují, že místo původu klíněnky jírovcové bude nejpravděpodobněji v pohoří Pindus na Balkánském poloostrově, kde byly nalezeny miny na listech uložených v archivech již roku 1879 a následně byly provedeny i DNA analýzy sloužící ke zjištění nových genotypů (Lees et al., 2011). V Evropě byla poprvé Cameraria ohridella zpozorována 1984 v Makedonii u Ohridského jezera a popsána 1986 (Tomczyk et al., 2007). Zavlečena do střední Evropy byla zřejmě již o rok později, ale zjištěna byla až v roce 1989. V ČR byla pozorována v roce 1993 na jižní Moravě (Šefrová, 2007) a do roku 1997 osídlila celou Českou republiku. Dnes se rozšířila po celé střední a z větší části západní Evropy, kde v roce 2003 byla evidována na území jihozápadní Francie a na Britském souostroví u Oxfordu (za 20 let urazila více než 2000 km) (Skuhravý, 2006). Výskyt byl již hlášen také ve Španělsku a Švédsku (Gilbert et al., 2005). Ve východní Evropě obsadila klíněnka celou Ukrajinu po hranice Litvy. Rovněž obsáhla celý Balkánský poloostrov a Moldávii, ve 14

větší míře se vyskytuje na jih od 42.severní rovnoběžky a o jediněle dosahuje až k Římu a Neapoli (Skuhravý, 2006), kde je limitující pěstování jírovce maďalu a v tomto směru bylo tudíž dosaženo mezní hranice (Nejezchlebová, 2011). Prognostickým modelem šíření klíněnky jírovcové se zabývá Gilbert et al. (2005). Doporučuje rozvrstvený model šíření tohoto motýla, vzniklý na základě dat sesbíraných během invaze v Německu a ve Francii. V dalších státech lze využít k předpovědi místa a času výskytu klíněnky. Masová erupce klíněnky je umožněna hlavně její aktivitou a anemochorním transportem (Šefrová, 2007), který probíhal z Makedonie a Horního Rakouska koncentricky téměř bez odchylek. Rychlost je omezena schopností nalézt nebo se zachytit o hostitelský porost. To je důvodem, proč jsou nejdříve nalezena nová ohniska v zámeckých parcích, jírovcových alejích a velkých městech. Zpomalující efekt mají hlavně horské masívy a geografické překážky. Důležitý je rovněž i pasivní transport dopravními prostředky, kdy jeden list s dostatečným počtem min stačí pro založení nové populace. Gilbert et al. (2005) popisuje tento faktor dokonce jako jeden z hlavních. Samotné šíření klíněnky jírovcové je prozatím limitováno zejména dvěma faktory. Prvním důležitým faktorem je přítomnost hostitelské dřeviny, mezi které kromě jírovce maďalu (Aesculus hippocastanum) patří i některé další druhy rodu Aesculus a Acer. Na druhu Acer klíněnka minuje pouze za nedostatku potravy a považuje se proto za nepravděpodobné, že by na těchto dřevinách docházelo k další invazi. Tedy možnost, že by klíněnka mohla přejít na jírovec z rodu Acer je málo pravděpodobná. Jírovec je však pěstován na širokém území, které zahrnuje v Evropě severní Skotsko, jižní část Skandinávského poloostrova, na severovýchodě Petrohrad a dále území zasahující až do Střední Asie. Na jihu dál od Říma se tato dřevina vyskytuje ojediněle. Proto je zde přirozený předpoklad, že klíněnka postihne i uvedené oblasti. Druhým, neméně důležitým faktorem, jsou klimatické podmínky, kdy s rostoucí nadmořskou výškou klesá početnost populace. V ČR dochází k výraznému úbytku i k absenci min již při výšce 600 – 800 m. n. m. a průměrné teplotě za vegetační období 14,0 – 14,5°C (Nováková, 2008). 2.1.4 Dynamika populace klíněnky Napadení jírovců klíněnkou a jednotlivé rozdíly jsou dány zejména atraktivitou stromů pro kladoucí samičky, kdy hraje roli současné zakladení listů vajíčky, obranyschopnost, 15

která však není korelována s atraktivitou a podmínky stanoviště (mikro– a mezoklima) (Šefrová, 2007). Na stromech rostoucích ve stejných podmínkách byly zjištěny rozdíly v mortalitě housenek, která se pohybuje v rozmezí 8 – 50% (Trandžík, 2005). Významné jsou také až 10 násobné rozdíly v hustotě zakladení listů vajíčky. Např. na Aesculus carnea dochází k masovému zakladení, ale zároveň téměř ke stoprocentnímu úhynu vajíček, což jen potvrzuje, že obranyschopnost není v korelaci s atraktivitou (Nejezchlebová, 2011). Za chladného a deštivého počasí rovněž dochází k úhynu dospělých jedinců, snižuje se počet nakladených vajíček a roste počet neoplozených. Tyto faktory mají dopad na početnost a nárůst populace (Akimov et al., 2006). Populační dynamika je však zachována diapauzujícími kuklami, které se objevují v každé generaci a to v množství, které je závislé na množství potravy. Větší počet diapauzujících kukel se projeví následující rok velkým počtem rojících se jedinců (Samek, 2003b), ale nemůže zřejmě dojít k gradačnímu kolapsu jako u některých druhů jako např.u bekyně velkohlavé (Lymantria dispar Linnaeus, 1758) nebo bekyně mnišky (Lymantria monacha Linnaeus, 1758). U bekyně mnišky gradace začíná během let s pěkným počasím bez extrémů s kvalitní potravou. Početnost roste v prvních 3 – 4 letech. Po nich následuje úbytek potravy a snížení její kvality, značný nárůst antagonistů a pád gradace je dovršen polyedrií (virové onemocnění larválních stadií). Obnova kvality potravy trvá okolo 4 let a celý cyklus se tím prodlužuje na 10 let (Šefrová, 2006). Přestože u klíněnky jsou často ke konci druhé generace zdroje potravy zcela vyčerpány, k pádu gradace nedochází a to díky schopnosti kukel prologance diapauzy na tři a více let. 2.1.5 Faktory způsobující mortalitu klíněnky a její možná regulace V ekosystémech, které jsou uměle vytvářeny nebo ovlivňovány člověkem, dochází velmi často k nekontrolovatelnému kolísání populační hustoty, kterým každoroční gradace druhu Cameraria ohridella bezesporu je. K regulaci takových druhů se často využívá pesticidů, které mají spíše negativní dopad na životní prostředí. Proto je snaha využívat spíše cíleně biologickou ochranu. Drobní predátoři a hmyzí parazitoidi mají často růst populace a střídání generací blízké vývojovému cyklu hostitele. Proto dokáží velmi účinně regulovat rychlost množení populace (Laštůvka et al., 2004). Pro minující škůdce je velmi častá přítomnost parazitoidů, méně často větších 16

predátorů a mikroorganismů. U klíněnky je tomu však naopak, kdy procento parazitace dosahuje většinou 1 – 5%, někteří autoři uvádějí dokonce i 35%. Tyto rozdíly jsou však dány velmi často abundancí parazita a také stanovištěm (Klug et al., 2008). Nejčastěji se jedná o polyfágní druhy ektoparazitoidních chalcidek z čeledi Eulophidae zejména Pnigalio agraules Walker (1839), Minotetrastichus frontalis Ness (1834) a Cirrospilis vittatus Walker (1833) a dva druhy lumčíků, Pholetesor circumscriptus Ness (1834) a Colastes braconius Haliday (1833). Pouze krátkodobý vliv má napadení vajíček klíněnky larvami zlatooček (Chrysopa spp.) (Čapek, 1999). Skutečnost, že doposud nebyl nalezen žádný více adaptovaný parazitoid podporuje spíše mimoevropský původ klíněnky.

Obr. 5 – Parazitoidi klíněnky jírovcové, a)Pnigalio agraules, b)Colastes braconius, c)Minotetrachicus frontalis, d)Colastes braconius (Nováková, 2008) Z velkých predátorů dokáží velmi výrazně ovlivnit počet sýkory (Parus spp.), které jsou schopny zahubit 50 – 90% kukel první a druhé generace, a tím ovlivnit početnost přezimující generace následující rok (Trandžík, 2005). Kromě regulace, vyvolané nedostatkem potravy a nepříznivým počasím, zůstává nejúčinnější nadále chemická ochrana a dokonalé odstranění opadu listí, čímž se oddaluje samotný opad listů další rok o 10 – 20 dní. Z chemických přípravků jsou velmi účinné látky zabraňující syntéze chitinu Dimilin a Nomolt (účinné látky diflubenzuron a teflubenzuron) (Ware, 2000), které se doporučuje aplikovat nejlépe v době vývoje housenek 1.generace. První generace 17

napadá strom od spodu, proto stačí udělat ošetření do výšky 5 m. Při dalších ošetřeních je nutné zasáhnout celou korunu, ale není vhodná letecká aplikace, kdy jsou zasaženy okolní porosty. Úspěšnost jednotlivých ošetření závisí především na komplexnosti zásahu v dané lokalitě, kdy jeden neošetřený strom slouží jako nové ohnisko. Včasné načasování nebo zda insekticid zasáhne spodní či svrchní stranu listů není důležité, protože konečná mortalita zůstává stejná. Doporučovaný kontaktní přípravek Karate, používaný proti dospělcům, nemá významný regulační vliv (Šefrová, 2007). Velmi účinné se projevily insekticidy rozváděné pomocí transportního systému dřeviny, což se stalo základem technologie injektážování do kmene stromů. Do floému a xylému je injektováno malé množství látky, která je rozváděna do jednotlivých orgánů rostliny. Využívá se např.NeemAzal – U a NeemAzal – T. Oba insekticidy zastavují vývoj housenek mezi 2 – 3.instarem, přičemž by mělo stačit jedno ošetření během celé vegetace. Výhodou je malá spotřeba insekticidu a jednoduchost aplikace. Nevýhodou je však vysoká cena, drastičnost ošetření a vznik možné brány pro patogenní organismy (Nejezchlebová, 2011). Na početnost první generace Tomczyk et al. (2007) doporučuje použití výtažků z rostliny Polyscias filicifolia B. především v jarních měsících. Výtažek přerušuje líhnutí přezimující generace a dochází ke snížení početnosti vajíček na listech v jarních obdobích. V těle hmyzu se také vytvářejí specifické chemické látky, nazývané feromony. Jsou přenášeny

vzduchem

nebo

umísťovány

na

předměty

a

slouží

k

přenosu

intraspecifických nebo interspecifických informací. Syntetických sexuálních feromonů se využívá k monitorování škůdce a prognóze, tj.zda se škůdce vyskytuje, jak početně a kdy vrcholí jeho let. Kindl et al. (2002) využíval v letech 2000 – 2001 syntetický feromon lákající samečky klíněnky jírovcové ke zjištění početnosti jednotlivých populací na jednotlivých lokalitách v Evropě a ke zjištění maxima rojení během průběhu vegetační doby. Tento monitorovací systém doporučuje pro detekci tohoto škůdce v oblastech ležících na rozhrání jeho rozšíření a zároveň pro studium populační hustoty. Skuhravý (2006) uvádí, že sexuální feromony se také využívají ke zmatení samečků po nastolení vysoké koncentrace v ovzduší a také ve feromonových lapačích. Tyto lapače jsou schopny za sezonu nachytat 50 – 90 tisíc samečků, ale snížení početnosti další je rok je zanedbatelný.

18

2.2 Hlavní hostitelská dřevina klíněnky – rod jírovec (Aesculus L.) 2.2.1 Systematické zařazení rodu Aesculus Řiše: Plantae – Rostliny Oddělení: Magniliophyta – Rostliny krytosemenné Třída: Rosopsida – Vyšší dvouděložné rostliny Řád: Sapindales – Mýdelníkotvaré Čeleď: Hyippocastanaceae – Jírovcovité Rod: Aesculus – Jírovec 2.2.2 Charekteristika rodu Aesculus a vybraných druhů Do rodu Aesculus patří opadavé stromy, méně často keře. Typické jsou silné letorosty a pupeny, které jsou přes klidové období chráněny lepivým slizem. Dlouze řapíkaté listy jsou vstřícné a dlanitě 5 – 9 četné. Květy rozkvétají v různých barvách (bílá, růžová, červená nebo žlutá), vzpřímená lata má kuželovitý nebo válcovitý charakter. Květní kalich je zvonkovitý nebo trubkovitý a srostlolupenný, koruna však volnolupenná a korunní lístky mají nehet. Počet tyčinek je 5 – 9 a často vyčnívají z květu. Plodem je kožovitá tobolka, která je na povrchu ostnitá nebo hladká a ve zralosti puká třemi chlopněmi. Uvnitř se nachází 1 – 3 velká semena se širokou jizvou. Je to významný sadovnický rod, pěstovaný jako solitéra nebo v poslední době také častěji v jírovcových alejích (Koblížek, 2006). Keřovité druhy se vysazují na větších travnatých plochách, slaběji rostoucí druhy a kultivary jsou pěstovány ve větších zahradách. Do rodu Aesculus patří celá řada druhů. Ze Severní Ameriky a jižní Asie pochází na 25 druhů a 1 druh z jihovýchodní Evropy. Předmětem našeho dosavadního výzkumu jsou ale druhy uvedené dále v textu. 2.2.2.1 Jírovec maďal (Aesculus hippocastanum) a jeho využití Dříve, dnes už jen lidově, nazývaný koňský kaštan je až 30 m vysoký strom s temně šedou odlupující se borkou a bohatě rozvětvenou korunou. Nápaditě lesklé a lepivé pupeny jsou velké, pod nimi lze pozorovat velkou podkovovitou jizvu. Listy 5 – 9 četné jsou typické přisedlými lístky, dlouhé 10 – 25 cm a světle zelené na počátku vegetace. Oboupohlavné a souměrné květy (obr. 6) kvetou v měsících květen – červen a mají složená květenství. Květy sestávají z 4 – 5 bílých, červenožlutě skvrnitých 19

okvětních plátků ze kterých vyčnívá 7 nerovnoměrně dlouhých tyčinek, nad nimiž je uložen svrchní semeník s jednoduchou čnělkou. Plodem je ostnitá tobolka v průměru 3 – 6 cm většinou s 1 velkým hladkým semenem. Rozšířen je především na východní části Balkánu a v Malé Asii (Klika, 1947; Koblížek, 2006).

Obr. 6 – Aesculus hippocastanum, květenství a listy (Horáček, 2007) Jírovec maďal je vysazovaný především pro dekorativní listy, květy a plody. Hojně je využíván jako přirozený zdroj potravy spárkaté zvěře v lesním hospodářství, proto bývá vysazován do lesních celků jako plodonosná dřevina. Velmi významný se stal v rozsáhlých oborách, kde se intenzivně chovají jeleni, daňci a mufloni, kteří jsou významnou ekologickou a ekonomickou součástí lesního hospodářství (Mertelík et al., 2010). Dřevo je krémově bílé barvy s nepravidelnými zrny. Po vysušení má velmi dobrou trvanlivost a dobrou zpracovatelnost. Pro lehké opracování je využíváno jako surovina pro výrobu všelijakých drobných předmětů každodenního využití (Russel, 2005). Semena jsou cenným zdrojem látek ve farmacii, kde jsou využívána pro svůj terapeutický účinek. Jejich výtažky či některé izolované složky tvoří základ mnohých léčiv. Hlavní účinek mají produkty sekundárního metabolismu. Saponin escin a flavonoidy spazmolyticky rozšiřují tepny a snižují krevní srážlivost. Mají protizánětlivé a antiedemické účinky, které jsou důsledkem zlepšené cirkulace a zmenšení

20

propustnosti kapilárních stěn pro vodu. Přípravky se využívají při periferních poruchách krevního oběhu, při křečových a lymfatických žilách, při hemeroidech a oběhových poruchách. Kumarin (eskulin a

eskulentin) je složkou opalovacích krémů. Byly

zaznamenány případy otravy, které se projevují zvracením, bolestmi hlavy, při předávkování semeny dochází i ke smrti (Nejezchlebová, 2011). 2.2.2.2 Jírovec japonský (Aesculus turbinata) Jírovec japonský (obr. 7) je 20 – 30 m vysoký strom s elipsoidní korunou. Listy 5 – 7 četné mají podlouhlé lístky, které jsou 20 – 30 cm dlouhé, na žilnatině jsou chlupaté a na rubu nasivělé. Květy jsou žlutavě bílé s červenou skvrnou, mají 1,5 cm průměr a latu dlouhou 15 – 25 cm. Kožovitá tobolka má hruškovitý tvar, průměr okolo 5 cm a na povrchu je bradavčitá. Nejvíce je rozšířena v Japonsku, v podhorských a horských lesích (Koblížek, 2006).

Obr. 7 – Aesculus turbinata (orig.V.Bačovský) 2.2.2.3 Klon jírovce maďalu M06 Klon HZR1357 A. hippocastanum je patentově chráněný pod názvem Mertelik06 (M06) a s číslem 296896 (Mertelík & Kloudová, 2006). V roce 1998 byl Východních Čechách nalezen jírovec maďal vykazující vysokou rezistenci ke klíněnce jírovcové. Listová aparatura byla daleko méně poškozena než na ostatních stromech. Velké miny se vyskytovaly pouze ojediněle a byly spíše malé s

21

nerovnými okraji jako výsledek rezistentního chování. Rezistence byla ověřována v letech 2001 – 2003 u 25 kontejnerovaných roubovanců M06 na podnožích semenáčů jírovce maďalu ve skleníkových a polních podmínkách za silné infestace klíněnkou jírovcovu. Jako kontrola byly použity mladé semenáče naroubované A. hippocastanum bez rezistence. Zároveň bylo testováno udržení rezistence i za stresových podmínek vyvolaných nedostatkem vody. Tento abiotický stres je velmi častý ve městských zástavbách. Téměř na polovině rostlin M06 se objevily atypické miny. Na druhé polovině se objevily jak atypické, tak i běžné miny, ale konečné poškození bylo vždy menší než na kontrolních rostlinách. Na kontrolních vzorcích se vytvořily pouze běžné miny a vývoj kukel byl dokončen. Rezistentní chování donorového stromu bylo prokázáno stejně jako na roubovaných rostlinách (Mertelík et al., 2004). V letech 2004 – 2008 proběhlo u stejných rostlin další hodnocení, a tak v průběhu 8 vegetačních obdobích bylo rezistentní chování potvrzeno u všech hodnocených rostlin. Rezistence kultivaru M06 je definována: „Rezistentní chování klonu M06 jírovce maďalu spočívá v odumření stadií larev klíněnky jírovcové v důsledku žíru jeho listových pletiv“ (Mertelík & Kloudová, 2009). Housenky tak nedokončují vývoj, miny zůstávají malé a nedochází k tak masivnímu poškození listové aparatury (obr. 8).

Obr. 8 – Srovnání chování nerezistetního Aesculus hippocastanum a klonu M06 (orig.J.Mertelík) Odumírání larev začíná již během prvního a druhého instaru, v období počátku žíru 22

palisádového parenchymu. Minování se zastavuje ve stadiu drobné miny s poutkem o velikosti cca 1 mm. Počátek tvorby min má u klonu M06 stejný průběh jako u min na nerezistentních semenáčích. V některých případech vývoj housenek pokračuje, ale miny jsou netypické a k odumření dochází nejpozději ve 3.instaru. Na špatně vyvinutých nevyzrálých listech ve vrcholových částech rostlin nebo u listů na výhonech prorůstajících z úžlabních pupenů může docházet výjimečně k dokončení vývoje housenek. Počet vytvořených min není v korelaci s rezistencí, ale je závislý na infestaci rostlin klíněnkou. Vliv lokality na odolnost není zjištěn (Mertelík & Kloudová, 2009). Podstata odumírání housenek je objasněna v kapitole 2.2.4. Využití rezistence kultivaru M06 spočívá v jeho výsadbě v krajině, v parcích a alejích a ve snížení infestace již napadených jedinců klíněnky jírovcové (Mertelík, ústní sdělení). K rychlému a komerčnímu množení tak vzácného materiálu M06 se využívá technika explantátových kultur (kapitola 2.4), kde byla rovněž vyvinuta certifikovaná metoda organogeneze a somatické embryogeneze. Šedivá et al. (2011) využívají při indukci cestou organogeneze stonkových, listových a kořenových explantátů, přičemž tvorba nových výhonů byla pozorována u všech explantátů v počtu 1 – 10 výhonů. Ze somatické embryogeneze navozené z květních explantátů byla regenerace ještě vyšší a to 10 – 60 embryí na explantát. 2.2.3 Škodlivost klíněnky na rodu Aesculus Hlavní invazní rostlinou a dominantním hostitelem pro druh Cameraria ohridella je A. hippocastanum. Na dalších zástupcích dochází k různě silnému napadení, především u A. carnea a A. pavia. Na jedincích A. parviflora, A. indica a A. glabra samičky kladou vajíčka, ale mortalita housenek je téměř 100%. Gilbert et al. (2005) uvádí, že Cameraria ohridella může v některých případech minovat i na některých zástupcích rodu Acer. Jedná se především o Acer platanoides L. a Acer pseudoplatanus L. Tyto dřeviny ale nejsou tak těžce poškozovány a nedochází na nich k invazím, mortalita housenek se pohybuje okolo 60 – 80%. Napadení jírovců klíněnkou se projeví minami na listech, housenky pak tvoří zejména v palisádovém parenchymu miny, které mají kulovitý, výběžkatý nebo oválný charakter. Pod svrchní listovou epidermis se postupně tvoří vzduchová kapsa, která je postupem času při pohledu z vrchu patrnější a má špinavě bílé zabarvení patrně vlivem 23

výkalů na dně miny. Pokud dojde k úmrtí housenky, mina hnědne, při nekrotickém a celkovém hnědnutí listu se jedná o oxidaci okolních pletiv nebo o napadení houbou Guignardia aesculi. Postupně dochází ke snížení plochy asimilačního aparátu a často k úplné defoliaci. Nebyl prokázán vliv napadení klíněnkou na délkový a tloušťkový přírůst kmene a letorostů. Ve prospěch jírovců hraje hned několik faktorů. K celkovému a intenzivnímu poškození listů dochází až od července, přičemž masivního žíru jsou nejdéle ušetřeny nejsvrchnější části koruny. Při poškození palisádového parenchymu je potom stále schopen částečné asimilace houbový parenchym, pokud však nedošlo také k jeho poškození (Samek, 2006). Vlivem defoliace či redukce listové plochy klíněnkou by však mohlo docházet ke snížení růstu kořenů. Bláha & Hnilička (2007) uvádí, že u víceletých druhů během přirozené defoliace (nástupem zimy a přechodem do dormance) je v okolí kořenového aparátu stále vyšší teplota, která podporuje buněčné dýchání, přičemž dochází k odčerpávání zásobních látek a odumírání kořenů. Zároveň defoliace může mít značný vliv na transpirační tok. Chybí jakákoliv práce zabývající se touto problematikou u jírovce maďalu. Při napadení klíněnkou dochází vlivem změny vodního režimu postižených stromů k redukci hmotnosti semen, tedy i jejich výnosu jako krmiva pro spárkatou zvěř. Při poškození listové plochy 75% dochází ke snížení sušiny u plodů a semen o 50%. V oborách Soutok, Moravský Krumlov, Bulhary a Klentice zabírá jírovec plochu 216 ha. Odhad ztrát vzniklých redukcí výnosu semen a dokrmováním zvěře je tedy významný. Zároveň se mění i kvalita, která může mít vliv na parametry a vitalitu růstu semenáčů (Mertelík et al., 2010). Samotné napadení klíněnkou, i když vysoké, nevede k úhynutí napadených stromů nebo doposud nebyl hlášený žádný případ (Šefrová, 2007). Při úplném opadu listů následuje v září a v říjnu vývoj nových, jírovce mohou kvést a část pupenů v zimě odumírá. Klíněnka však přímo (vývoj housenek, kdy vytváří ostrým trnem na kukle otvor ve svrchní pokožce listů) či nepřímo (změna vodního systému rostliny vlivem defoliace, značné omezení fotosyntézy) oslabuje odolnost svých hostitelů, kdy mohou být jírovce napadány řadou patogenů. Tehdy jsou jírovce ohroženy na životě. Vytvořený otvor v listech při líhnutí imag se stává vstupní branou pro některé houbové patogeny. Tito patogeni často vyvolávají skvrnitosti listů a řadí mezi 24

vřeckovýtrusé houby. V průběhu svého vývojového cyklu vytvářejí anamorfní stadium (nepohlavní, konidie), které se vyvíjí ještě tentýž rok. Teleomorfní (vřeckaté, pohlavní) stadium se vytváří přes zimu na opadaném listí a na jaře je primárním zdrojem infekce (Pešková & Soukup, 2009). Mezi nejvýznamější vřeckatou houbu v poslední době patří zejména Guignardia aesculi a padlí Erysiphe flexuosa. Jejich význam roste s postupným rozšiřováním klíněnky jírovcové (Skuhravý, 2006). G. aesculi je původcem skvrnitosti listů (obr. 9) jírovců. Listy se kroutí, svinují a předčasně opadávají. Skvrny jsou na listech červeno – tmavohnědé a jsou ohraničeny listovou nervaturou. Houba vytváří dvě odlišná stadia, Phyllosticta sphaeropsoidea a Leptodothiorella

aesculicola.

K

nejsilnějším

infekcím

dochází

v

letech

s

dlouhotrvajícím vlhkým počasím koncem jara a začátkem léta. Houba se rozšířila v Evropě po roce 1950. Nekrózámi na listech a jejich opadem působí G. aesculi negativně i na klíněnku snižováním množství dostupné potravy (Pešková & Soukup, 2009). Tento patogen byl zaznamenán na následujících zástupcích rodu Aesculus – carnea, flava, hippocastanum, neglecta, parviflora, pavia a turbinata (Pastirčáková et al., 2009). E. flexuosa je původcem padlí (obr. 10) na jírovcích a vytváří na obou stranách listů bílé mycelium. Později se vytvářejí žlutá nebo světle hnědá chasmothecia (tj.kleistothecia), která v plné zralosti mají černou barvu. Ty vytvářejí dvě stadia, dlouhé a krátké, přičemž rozdíl je v jejich zakončení a velikosti. Uvnitř se nachází několik askospor, konidie jsou cylindrické (Tozlu & Demirci, 2010). Vlivem snížení fotosyntézy se snižuje odolnost k zatím nejzávažnější chorobě na jírovcích „bleeding canker“ (obr. 11). Choroba byla popsána poprvé roku 1970 ve Velké Británii a jejím původcem byly někteří zástupci rodu Phytophthora. Počet napadených jedinců byl však zanedbatelný. Začátkem 21. století došlo k nárůstu tohoto onemocněni a bylo zjištěno, že původcem je gram negativní bakterie Pseudomonas syringae pv. aesculi, pocházející z Indie a zavlečená do Evropy zřejmě semeny. Onemocnění se vyskytuje zejména v západní Evropě. Jen v Anglii touto chorobou trpí na 70% stromů jírovce maďalu. Tato choroba má na svědomí již tisíce stromů (Green et al., 2009). Onemocnění se projevuje rezavě zbarvenou tekutinou vytékající z popraskané kůry, vyblednutím listů a jejich následným opadem. Odumírající floém větví a kmene má za následek odumření stromů (Steele et al., 2010).

25

Obr. 9 – List Aesculus turbinata, světlejší skvrny jsou způsobeny housenkami klíněnky jírovcové, původcem malých skvrn je houba Guignardia aesculi, pro kterou jsou charakteristické ostře ohraničené tmavě hnědé skvrny (orig. V.Bačovský)

Obr. 10 – Erysiphe flexuosa, poškození listové aparatury (Kunca A., 2010)

Obr. 11 – Pseudomonas syringae pv. aesculi, poškození jírovců bakterií – a)„bleeding canker“ na kmeni, b)černající prasklá sněť na letorostu, c)sezóní poškození listů a letorostů s černající uvadlou špičkou (Green et al., 2009)

26

2.2.4 Rezistence a obranné mechasnimy rodu Aesculus před klíněnkou Rezistence znamená schopnost hostitele odolávat nebo klást odpor patogennímu agens, případně zmenšit nebo překonat účinky jeho působení (Kůdela et al., 1989). Při napadení rostliny patogenem se vytváří specifický vztah patogen – rostlina (hostitel), přičemž dochází k četným interakcím, které mají rozdílné dopady na oba účastníky tohoto vztahu. Aby mohl v tomto systému přežít hostitel i patogen, tedy obligátní parazit, musí být systém v rovnováze. Pokud v populaci patogena převládne rasa, která napadá většinu jedinců v populaci příslušného hostitele, je v populaci hostitele selekčně zvýhodněn odolný genotyp k napadající rase. Tento genotyp se rozšíří, pokud nepodlehne nově vzniklé virulentní rase. Vztah patogen – hostitel lze aplikovat i na škůdce, kdy se jedná o vztah fytofág – hostitel. Rostliny reagují na přítomnost hmyzu třemi mechanismy – nonprefernce, antibiózou a tolerancí. Nonpreference znamená, že fytofág se takovým rostlinám vyhýbá nebo je nevyhledává jako svoje prostředí pro žír, reprodukci a skrýš (např.světle zelené odrůdy hrachu jsou pro mšice méně lákavé než modrozelené). Při antibióze rostliny inhibují růst, zpomalují vývoj a mohou způsobit až uhynutí fytofága. V toleranci se rostliny vyvíjejí i v přítomnosti populace hmyzu, která by na netolerantní odrůdě působila ztráty (tj.nejsou jimi tak ovlivňovány). U rostlin se vytváří nejrůznější morfologické, fyziologické a fenologické adaptace, které mají ochranný charakter, omezují konzumaci fytofágy a vůči konkrétním druhům vedou k rezistenci, která má za následek často tvrdou selekci. Fytofágové si naopak vytváří mechanismy k prolomení této ochrany a ovlivňují napadené rostliny různým způsobem, který se odvíjí od způsobu života, početnosti i na vitalitě hostitele. Vliv fytofágů na rostliny je zesílen působením dalších faktorů, jako je např.imisní zátěž. Morfologickou ochranu u rostlin zajišťují žahavé a žláznaté trichomy, výrůstky pokožky. V případě rodu Aesculus (nikoli vlivem klíněnky) došlo např. k vytvoření pevného obalu semen, který má navíc na povrchu různé trny nebo bradavice. Pupeny jsou při rozkvětu silně pokryty trichomy. Rostliny se brání proti fytofágům také vytvářením toxických a inhibičních látek, kvalitativního (alkaloidy, glykosidy, saponiny, flavonoidy, terpenoidy a silice) nebo kvantitativního (celulóza, lignin, taniny) charakteru. Tyto látky se buď nacházejí již v pletivech nebo se začínají syntetizovat teprve při zvýšené konzumaci (Šefrová, 2006). U jednotlivých druhů rodu Aesculus 27

byly objeveny látky kvalitativního charakteru, které vedou k vysoké hladině rezistence, která se projevuje antibiózou. Jsou to produkty sekundárního metabolismu a jedná se především o kyselinu chlorgenovou, ze saponinů o escin a glykosidy. Escin se nachází u A. hippocastanum zejména v semenech, ale v malé míře byl nalezen i v listech. Vysoká hladina rezistence klonu M06 A. hippocastanum je zřejmě způsobena vyšší hladinou diglykosidu kvercetinu, který se v menší míře nachází i v semenáčích A. hippocastanum. A. turbinata je velmi náchylný na napadení klíněnkou a jako jeho obranná reakce se předpokládala tvorba drúz šťavelanu vápenatého. Nebyl však prokázán vliv drúz na klíněnku jírovcovou (Nejezchlebová, 2011). U náchylných jedinců rodu Aesculus se jedná prozatím o toleranci za významnému poklesu výnosu semen. Možnosti ochrany jírovců jsou podrobněji rozepsány v kapitole 2.1.5. Jako nejúčinnější ochrana se jeví systémové insekticidy, rozváděné transportním systémem rostliny, a látky zabraňující syntéze chitinu. Velmi účinné je i mechanické odstranění spadlých listů, ve kterých zimují diapauzující jedinci. K odstranění však musí dojít co nejdříve, jinak hrozí vypadnutí kukel z listů a metoda se stává neúčinnou. Vitalitu stromů zlepšuje doplňování živin a závlaha především v letních měsících zejména v městských výsadbách. Všechna uvedená ochranná opatření mají pouze dočasný charakter a z dlouhodobého hlediska jsou nevýhodná. Vzhledem k dnešnímu rozšíření klíněnky jírovcové napříč Evropou nemají také významný regulační vliv na její početnost. Škodlivý vliv klíněnky spočívá především v oslabení vitality stromů, které jsou následně náchylnější vůči některým patogenům, při čemž kombinací těchto faktorů dochází k odumírání stromů. Proti houbovým a bakteriálním patogenům existuje celá řada přípravků s velmi uspokojivým účinkem. Stromy jsou však každoročně vystaveny masovému žíru klíněnky a každý rok je oslabena jejich odolnost, je opatření také pouze dočasné. Jako možná ochrana se jeví využití rezistentního klonu M06, kdy stromy netrpí takovým žírem a listová aparatura zůstává funkční do konce vegetační doby. Stromy tedy nemusí vynakládat energii na vyrovnání ztráty listové plochy a mají více energie pro boj s patogeny. Přímá ochrana z dlouhodobého hlediska je vyšlechtění rostlin odolných nebo 28

imunních k uvedeným závažným patogenům. Velmi účinné by bylo využití transgenose, kdy proti houbovým patogenům se do rostlin vnášejí geny kódující často chitinásy, glukanásy a ribosomy inaktivující proteiny. Proti bakteriím jsou velmi účinné lytické proteiny mající celou řadu vlastností. Například Salaminy (1998) uvádí, že geneticky modifikovaná jabloň, do níž byl vnesen gen kódující chitinásu, vykazovala vysokou míru rezistence k padlí jabloňovému (Venturia inaequalis). Geneticky modifikované organismy však mají v Evropě velmi malé uplatnění a téměř nulovou oblibu u veřejnosti. Vyhnánek et al. (2013) zdůrazňuje další studium diverzity, rezistence a množení rezistentních genotypů.

2.3 Genetická diverzita Genetická diverzita znamená genetickou různorodost a je do jisté míry určována původem jednotlivých druhů. Z obrovského množství druhů je každý adaptován k zaplnění svého místa, uvnitř každého druhu se potom v rámci vývoje objevuje citlivější úroveň adaptace populací na jednotlivých stanovištích. Rostliny, tak jako každý živý organismus, reagují na pomalé přírodní změny a v každé generaci se vytváří jedinci, u nichž může dojít k rekombinaci genů, přičemž mají jiný stupeň adaptace na momentální prvky prostředí (Chloupek, 2008). V průběhu historie naší planety se měnily a mění i dnes jednotlivé složky prostředí. Tyto změny měly za následek selekci, kdy buď došlo k přizpůsobení nebo k vyhynutí daného druhu nebo jeho populací. Tento proces urychlil člověk, když přešel od kočovného způsobu života k zemědělskému, kdy došlo k rychlým změnám přírodního prostředí, a tak některé druhy vyhynuly. Postupně si také domestikoval jednotlivé druhy rostlin i zvířat a introdukoval je do míst, kde se dříve nenacházely (Harris, 2005). Při introdukci zároveň docházelo i k zavlečení dalších druhů, kterým nové, často výhodnější

prostředí (bez přirozených nepřátel)

umožnilo velmi rychlý rozvoj.

Takovým příkladem je distribuce druhu A. hippocastanum a zavlečení motýla C. ohridella (Laštůvka & Krejčová, 2000). 2.3.1 Význam genetické diverzity V minulosti docházelo k úbytku druhů mnohem pomaleji a tento úbytek byl v určité

29

rovnováze s vývojem druhů nových. S rozpínáním a vývojem lidské společnosti se vymírání druhů značně urychlilo. Hlavní důvod tak masového vymírání, jako se děje dnes, je zejména nadměrné využívání těchto druhů, invaze druhů cizích a jejich introdukce, globální změny klimatu a jeho chemické znečištění. Tyto a mnoho dalších faktorů vedou ke ztrátě a fragmentaci původních lokalit, kde se druhy vyskytovaly. Dnešní postavení člověka nejenom že ohrožuje mnoho druhů a ničí přírodní zdroje, ale také ohrožuje existenci nás samotných. Proto je dnes prosazována tzv. teorie udržitelného rozvoje (TUR). Principem TUR je požadavek na hospodaření s přírodními zdroji tak, aby bylo možné uspokojit současné potřeby lidí způsobem, který neublíží přírodním společenstvům a který bere v úvahu potřeby dalších generací. Genetická diverzita se řadí mezi přírodní zdroje a jejím studiem se zabývá biologie ochrany přírody. Po přijetí Úmluvy o biologické rozmanitosti v roce 1992 na konferenci Organizace spojených národů o životním prostředí a rozvoji konané v Rio de Janeiru se stala biodiverzita a zvláště její ochrana velmi významnou. Tato dohoda byla ratifikována 179 státy a ČR v roce 1993. Poklesem velikosti jednotlivých populací, z důvodů uvedených na začátku této kapitoly, klesá genetická diverzita. Pospíšková (2005) uvádí, že snižování genetické diverzity vede k vymizení některých forem genů, přičemž dochází často ke genetickému posunu (některé alely začnou v populaci převažovat a jiné zase ztrácet). Populace s nízkou diverzitou se hůře vyrovnávají se změnami prostředí, klesá jejich životnost a schopnost reprodukce (viz.kapitola 2.2.3). Vysoká genetická proměnlivost je pro adaptaci druhu na nové změny prostředí nezbytná. Druhy s malou genetickou variabilitou jsou daleko více ohroženy zánikem. Kůdela et al. (1989) popisuje udržování vysoké genetické diverzity jako nezbytný předpoklad pro přežití populací hostitelů a patogenů (fytofágů). Studium genetické diverzity je potřeba začínat včas, protože je v souvislosti s její ochranou. Získané poznatky jsou využívány v ochraně ohrožených druhů. 2.3.2 Původ jírovce maďalu a jeho vliv na druhově genetickou diverzitu Současná geografická distribuce druhů je zejména ovlivněna ekologickými i historickými událostmi. Geografické rozšíření populací jírovce maďalu v Evropě bylo nejvíce ovlivněno událostmi na konci čtvrtohor (Prada et al., 2011). Velké ochuzení 30

přírodního bohatství způsobily opakující se glaciály (doby ledové), při nichž musely teplomilnější organismy ustupovat směrem na jih, kde vrchol jednotlivých glaciálů přečkávaly v tzv. refugiích (útočištích), které v Evropě představují Balkánský, Apeninský a Pyrenejský poloostrov. To ovšem neznamená, že jediná útočiště se vyskytovala pouze na jihu. Některá refugia se vyskytovala i na hranicích území, které byly pokryty ledem ve Střední a Východní Evropě. Bývají označována jako „cryptic northern refugia“ (Bhagwat & Willis, 2008). V interglaciálech (doby meziledové) se během opakovaných migrací dostávaly druhy z refugií nazpět, ale některé nestihly pokračovat dostatečně rychle a došlo k jejich vyhynutí. Jako příklad lze uvést jinan (Ginkgo), douglasku (Pseudotsuga), cypřišek (Chmeacyparis), zerav (Thuja) a tisovec (Taxodium). Důvodem je postavení jednotlivých pohoří, která jsou v Evropě (Pyreneje, Karpaty a Alpy) postavena téměř rovnoběžkově a pro migraci v obou směrech (sever – jih) představují silnou bariéru, zatímco v Severní Americe nebo Východní Asii pohoří chybí nebo jsou více méně postavena vertikálně s poledníky. Proto měly doby ledové daleko silnější vliv v Evropě (Hájek et al., 2004). Rod jírovec se vyvinul ve Východní Asii a rozdělil se do jednotlivých populací v Severní Americe a v Evropě. Většina těchto populací vyhynula vlivem periodického opakování glaciálů. Ve čtvrtohorách se rod jírovec vyskytoval v Evropě pouze na Balkánském poloostrově. Pomocí analýz z pylových vzorků bylo zjištěno, že právě v útočištích Balkánu v pohoří Pindus má jírovec své centrum původu a diverzity, odkud na počátku 16. století došlo k distribuci napříč celou Evropou. Na začátku 18.století došlo ke znovuobjevení jírovce v jeho domovské lokalitě. Hawkins popsal v roce 1806 jírovec maďal v pohoří Pindus jako velmi starou dřevinu, nacházející se ve smíšených porostech společně s bukem, vykazující širokou adaptaci na horské podmínky. K distribuci jírovce po Evropě došlo ale již v 16. století. První semena jírovce dorazila do Evropy přes Benátky a Vídeň, které tou dobou byly významnými centry pro obchod s Východem. Během jednoho století byl jírovec maďal rozšířen po celé Evropě především pro svůj estetický vzhled. Proto jej lze nalézt hlavně v parcích, zahradách nebo ve městech jako mohutný monumentální strom úctyhodného věku (Prada et al., 2011). V Severní Americe, do které byl dovezen v polovině 19.století, se tento okrasný strom netěší tak velké oblibě a není tak významný jako v Evropě (Heinrich et al., 2005). Výše uvedené události vedly ke značné genetické a demografické stabilitě uvnitř 31

populací jírovce maďalu. Je to především lidský vliv na jeho distribuci, kdy nové stromy nejsou vysazovány náhodně a nedochází tak k volné alelové rekombinaci. Druhým významným faktorem, který ovlivnil tuto stabilitu, je časová distribuce a poměrně dlouhý růst. Jírovec maďal tak mohl vytvořit ne více než 10 generací. Tím je do určité míry limitována možnost jeho genetické rekombinace. Značná stagnace genetické diverzity jírovce maďalu může být pro tento druh nebezpečím. 2.3.3 Genetická diverzita na úrovni DNA Genetická diverzita je spojena s genetickým polymorfizmem. Genetický polymorfismus neboli také genetická proměnlivost znamená existenci více variant genů (alel). Genetickou proměnlivost lze pozorovat na úrovni morfologických znaků (barva a tvar), pomocí biochemických metod (izoenzymy, zásobní proteiny) a na úrovni molekulární (DNA). Za polymorfní se označuje každá frekvence genů, k níž existuje alespoň jedna alternativa. Jako polymorfní se označuje takový lokus, u kterého frekvence nejpočetnější alely dosahuje nejvýše 95%. Existence ojedinělých a vzácných alel je dána mutacemi, které jsou však brzy eliminovány náhodným driftem nebo selekcí (Pospíšková, 2005). Mutace jsou prvotní příčinou genetické proměnlivosti a probíhají na různých úrovních genetické informace. Postihují jednotlivé nukleotidy, skupiny nukleotidů nebo mohou mít vliv na opakování určitých variabilních sekvencí v genomu. Dle toho se rozlišují mutace bodové, segmentové a repetitivní. Mutace mohou mít i větší rozsah, kdy se přestavují celé chromozomy, dochází k duplikaci genů a k tvorbě genových rodin. Dochází rovněž ke změnám v počtu chromozomů, k haploidizaci nebo naopak k polyploidizaci. Při stanovení DNA polymorfizmu se hodnotí změny vzniklé bodovými nebo repetetivními mutacemi. Rozdíly při hodnocení genetické proměnlivosti na úrovni DNA nejsou ovlivněny jako u morfologických znaků vnějšími podmínkami. Genetický polymorfismus má velmi široké využití. Používá se k mapování genomu, stanovení vazby genů a při studiu evoluce druhů (Spandana et al., 2012), v genetice populací při stanovení genetické variability a struktury populací (Thomas et al., 2008) a vzdáleností a míry diferenciace mezi populacemi (Prada et al., 2011). DNA plymorfizmus lze využít při diagnostice patogenů rostlin a živočichů (Hwang et al., 2013). Ve šlechtění se pomocí polymorfizmu hledají možné vazby polymorfních alel s 32

užitkovými vlastnostmi, v zemědělství lze určovat čistotu a pravost odrůdy rostlin (Chloupek, 2008) nebo k identifikaci explantátových kultur a určení jejich donorových rostlin (Vyhnánek et al., 2013). 2.3.4 Mikrosatelity jako nástroj pro studium genetické diverzity Pro studium genetické diverzity se dnes používá celá řada nástrojů, od systematické biologie a morfo – taxonomie až po moderní molekulární techniky (Christelová, 2011). Velmi často používaná metoda je analýza mikrosatelitových lokusů. Důvodem, proč jsou tak hojně využívány ke sledování genetické diverzity, je vysoký stupeň polymorfizmu, rovnoměrné zastoupení v celém genomu a kodominantní charakter. Navíc vyžadují minimální množství DNA a jsou poměrně snadno reprodukovatelné. 2.3.4.1 Charakteristika mikrosatelitů Mikrosatelitové markery jsou tandemové krátké opakující se motivy DNA. V literatuře se uvádějí často pod zkratkami SSR (simple sequence repeats), SRTs (short tandem reapeats), VNTRs (variable number of tandem repeats) nebo SSLP (simple sequence length polymorphism). Poprvé byly popsány roku 1980, jejich přesná funkce je však stále nejasná (Chambers & MacAvoy, 2000). Jejich analýza se řadí mezi metody lokusové a amplifikační. To znamená, že se sleduje pouze určité definované místo (lokus) v genomu a dochází k namnožení DNA fragmentů. Mikrosatelity jsou přítomné v celém genomu prokaryotických a eukaryotických organismů. Více se vyskytují v nekódujícíh oblastech, jako jsou telomery, subtelomery a heterochromatin u centromer (Tóth et al., 2000). Délka mikrosatelitových markerů se pohybuje v rozmezí 1 – 6 bp (pair base=párů bazí) v počtu 5 – 40 bp opakujících se jednotek, celková délka obvykle nepřesahuje 100 bp (Ježíšková & Bednář, 2004). Dle délky repetice se mikrosatelity dělí na mononukleotidové (nejvíce frekventovaný je sled A/T), dinukleotidové (30 – 60% mikrosatelitů v genomu; u rostlin převažuje nejčastěji motiv AC/GT), trinukleotidové (převažující v exonech u obratlovců CCG/GGC a AGC/TCG, u rostlin AAC/TTG a AAG/TTC) (Li et al., 2004) nebo tetra-, penta až hexanukleotidové (velmi vzácné). Pokud mikrosatelit obsahuje pouze jeden motiv a není nikde přerušen, jedná se o dokonalý (perfect) mikrosatelit. Neúplný (imperfekt) mikrosatelit je přerušen jednou bazí. Složené (compound) sestávají se ze dvou a více mikrosatelitů s rozdílným typem repetice. Posledním typem SSR markerů 33

jsou přerušované (interrupted), které nenásledují strukturu repetice. Mikrosatelity se vyskytují v rostlinném genomu především v UTR (untranslated region) nebo v regulačních oblastech, kde jsou ale méně časté než u živočichů. U rostlin se mikrosatelit delší než 20 bp vyskytuje průměrně na každých 23,3 kb, zatímco u živočichů se nachází jeden mikrosatelit na každých 6 kb (Pospíšková, 2007). Jak již bylo zmíněno v úvodu této kapitoly, mikrosatelity mají kodominantní charekter a vysoký stupeň polymorfizmu. Kodominantní charakter umožňuje rozlišení homo- a heterozygota (u heterozygotů lze rozlišit produkty obou alel). Vysoký stupeň polymorfizmu je dán rozdíly v počtu opakujících se jednotek. To znamená, že se nacházejí např.v rámci jedné populace v různých variantách. Příklad dvou různých alel: 1.alela – ATATATATAT (10 opakování) 2.alela – ATATATATATATAT (14 opakování) Opakování základního motivu mikrosatelitů se v porovnání s frekvencí genových mutací mění poměrně rychle. Provan et al. (1999) uvadí rychlost 10-3 až 10-4 na lokus na generaci, u Pinus torreyana C. v chloroplastové DNA dokonce 10-5. Tóth et al. (2000) vidí jako hlavní příčiny vzniku a nestability mikrosatelitů tzv. „DNA polymerase slippage“ (sklouznutí DNA polymerázy) během replikace a rekombinaci. Samotné sklouzávání DNA polymerázy však nestačí ke změnám uvnitř jednotlivých taxonů. Zde hrají významnou roli enzymy a proteiny, které se účastní replikace, postranskripčních oprav a modelování chromatinu. 2.3.4.2 Funkce mikrosatelitů SRR markery jsou nerovnoměrně rozmístěny napříč protein – kódujícími oblastmi. Vyskytují se jak v exonech, tak i v intronech. Mnohé studie poukazují, že rozmístění mikrosatelitů není v genomu náhodné. Dlouho byly považovány za funkčně neutrální nebo méně důležité, ale v poslední době byla dokázána jejich významnost (obr. 12) (Pospíšková, 2007). Jejich prodlužování nebo zkracování vede k získání nové nebo ke ztrátě funkce určitého genu. Variace mikrosatelitů v 5´ – UTR mohou regulovat expresi genů zasahující do transkripce a translace. Rozpínání SSR markerů v 3´ – UTR způsobuje skouznutí v transkripci (transcription slippage) a vytváří množství mRNA, která se akumuluje v jaderné oblasti. Tato mRNA může přerušit opětovné spojování řetězců po replikaci a potencionálně narušuje i buněčné funkce. SSR obsažené v 34

nekódujících oblastech ovlivňují také transkripci, spojování mRNA a její transport do cytoplazmy. Tyto změny mohou v konečném důsledku způsobovat fenotypové změny (Li et al., 2004). Mutace, probíhající u SSR (zmíněné v předchozí kapitole), postupně mění DNA. Dochází ke změnám, které jsou často opraveny MMR (missmatach repair; systém opravující chyby během exprese genů, tj.během replikace, transkripce a translace) (Chloupek, 2008). Mutace, které uniknou systému MMR, vytvářejí nové alely, které se stávají novými potencionálními nosiči nových vlastností. Ty se často projeví ve fenotypu daného organismu.

Obr. 12 – funkce mikrosatelitů uvnitř exonů a intronů, 5´UTR a 3´UTR oblastí (Li et al., 2004) 2.3.4.3 Využití mikrosatelitů u rostlin Mnohostranné využití mikrosatelitů a jejich obliba při studiu DNA polymorfizmu je jejich vysoká variabilita. Jejich metodika je dobře zvládnuta, ale nastávají potíže při zpracování a hodnocení dat. Tyto potíže jsou způsobeny tím, že biologie a tzv.„life cycle“ (vznik, vývoj a zánik) nejsou doposud prozkoumány do hloubky a tyto poznatky nejsou vneseny do statistických metod (Chambers & MacAvoy, 2000; Chloupek, 2008). Vývoj nových mikrosatelitů je značně nákladný, a proto jsou hojně využívány především u druhů hospodářsky významných. 35

Oblasti mikrosatelitů se vyskytují v jaderné, chloroplastové a mitochondriální DNA. U rostlin jsou využívány chloroplastové mikrosatelity lišící se nižší rychlostí mutací a uniparentálním způsobem dědičnosti. Chloroplasty jedince jsou děděny obvykle od matky (u nahosemenných rostlin jsou chloroplasty děděny paternálně) (Pospíšková, 2007). Určení mateřských linií touto cestou se využívá při směru šíření určitého druhu v postglaciálním období. Gugerli et al. (2001) využil tento způsob ke zjištění šíření u druhů Pinus cembra L., P.sibirica L. a P.pumila P. v Evropě a Asii. Mikrosatelity odvozené od EST (expressed sequence tag) sekvencí, tj.databází kódujících oblasti genomu, mohou mít vazbu s geny pro hospodářsky významné znaky. Jsou více konzervativní (nižší substituční rychlost) a tím mají i nižší stupeň polymorfizmu. Tyto markery hrají významnou roli v konzervační biologii, protože jsou vázány se znaky důležitými pro adaptaci a přežití mikroorganismů (Christelová, 2011). K tvorbě genetických map se mohou využít mikosatelity na chromozomální úrovni. Zatím byly vytvořeny u hospodářsky významných druhů rostlin jako u pšenice, sóji, kukuřice, ječmene a vinné révy (Austin et al., 2001). Pomocí mikrosatelitů lze provádět analýzy příbuzenských vztahů mezi jedinci, kdy se zkoumá variabilita určitého lokusu u všech studovaných jedinců.. Mikrosatelitové lokusy jsou variabilní v počtu opakování základního motivu, ale potomci je dědí od obou rodičů dle Mendelovské dědičnosti. Potomek dědí pouze ty alely, které mají jeho rodiče, pokud nedojde k mutaci daného úseku. Využití SSR markerů pro zjištění paternity spočívá především v určení konkrétních alel daného úseku u potomků a jejich potencionálních rodičů, tedy zda potomci mají opravdu takové alely, které jsou některou z možných kombinací alel potencionálních rodičů. U rodu Aesculus se zabývá tímto studiem Vyhnánek et al. (2013). Na úrovni populací je možné sledovat analýzou mikrosatelitových lokusů reprodukční chování, genetickou diverzitu a efektivní velikost populace. Je možné hodnotit genetickou stabilitu v in vitro podmínkách u populací vzniklých somatickou embryogenezí. Mikrosatelity se monitorují genetické změny při dlouhodobém uchovávání semen nebo při dlouhodobé in vitro kultivaci. Studuje se rozšíření populací daného druhu, jak se překrývají i jak jsou izolované. Umožňují hodnotit rozšíření populací určitého druhu, jejich překryti nebo izolaci, vzájemnou genetickou diferenciaci a zda dochází mezi těmito populacemi k toku genů nebo ke genetickému posunu 36

(Geburek, 1997). Je zřejmé, že mikrosatelity se těší velké oblibě. Jejich využití je daleko širší než to, které jsem zde uvedl. Není ale předmětem této práce shrnout využití SSR markerů, proto jsem uvedl pouze ty významější a ty, které se dotýkají mojí studije.

2.4 Technika explantátových kultur Explantátové kultury představují aseptické (chorob prosté) pěstování oddělených a izolovaných částí z mateřských rostlin (explantátů) za umělých podmínek in vitro (Kováč, 1992). Podstata explantátových kultur je založená na tom, aby se z části mateřské rostliny podařilo v podmínkách in vitro vypěstovat větší počet rostlin. Části mateřských rostlin se odebírají in vivo. Rostliny, na rozdíl od živočichů, diferenciací nedegenerují, a proto je možný přechod specializovaných buněk, pletiv a orgánů do meristematického stavu, kde dochází k intenzivnímu buněčnému dělení a následné cytodiferenciaci, regeneraci pletiv, orgánů Prostřednictvím

aplikovaných

a celých rostlin (Novák, 1990).

fytohormonů

je

možné

indukovat

následný

morfogenetický proces explantátové kultury (Ďurkovič & Krajňáková, 2010). Rostlinné explantáty zahrnují tedy zejména izolaci buněk, pletiv a orgánů. Tyto části rostlin se posléze kultivují v řízených a přesně definovaných podmínkách. V nové rostliny mohou být kultivovány vegetační vrcholy, postranní pupeny, části stonků, listů, kořenů a reprodukční části jako mikrospory, vajíčka, embrya, semena, spóry i jednotlivé buňky a protoplasty. Během kultivace však může dojít vlivem způsobu morfogeneze a opětné diferenciace nebo mutací ke změně genetické informace (Kováč, 1992). 2.4.1 Vegetativní množení u A. hippocastanum Výhodou in vitro metod je namnožení rostlinného materiálu v poměrně krátkém časovém úseku. Vyhnánek et al. (2013) doporučují pro využití kultivaru M06 množení pomocí explantátových kultur a následnou výsadbu rezistentních odrůd do krajiny a parků. Vejsadová et al. (2009) uvádí, že u A. hippocastanum lze regeneraci rostlinného materiálu dosáhnout dvěma způsoby, organogenezí nebo embryogenezí. V této práci byl použit materiál vzniklý somatickou embryogenezí a organogenezí, která se stala osvědčenou metodou zejména u listnatých dřevin.

37

3 Cíle bakalářské práce 1) Studium genetické diverzity u rodu Aesculus s využitím explantátových kultur 2) Genetická analýza a její vyhodnocení u vybraných zástupců rodu Aesculus pomocí mikrosatelitních markerů včetně genotypů vyznačujících se rozdílnou rezistencí ke klíněnce jírovcové

38

4

Materiál a metodika

Práce probíhaly v laboratoři molekulární genetiky Ústavu biologie rostlin Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a v laboratoři analýzy DNA ve Výzkumném ústavu Silva Taroucy pro krajinu a okrasné zahradnictví, v.v.i. Obě laboratoře jsou dostatečně vybaveny pro zvolenou metodiku. Výzkum byl podpořen Ministerstvem zemědělství České republiky v rámci projektu NAZV QH81101 s názvem Preventivní ochrana nových výsadeb Aesculus hippocastanum s využitím klonu Mertelik06 rezistentního ke Cameraria ohridella. 4.1 Materiál pro analýzy DNA První rostlinný materiál byl odebrán již v roce 2011 pro testování úspěšnosti nasedání primerů (kapitola 6.1). Soubor pro tyto účely čítal 3 vzorky, přičemž každý vzorek byl zastoupen 2x pro kontrolu. Jednalo se o A. turbinata (AeT) a A. hippocastanum (AeHEMB a AeH EA) (tab. 1). Navážka jednotlivých vzorků byla 0,100 g a celý tento materiál byl pro výše uvedené účely spotřebován. Rostlinný materiál pro DNA analýzy (tab. 1) byl odebrán v Brně na jaře 16. 4. 2012 a v Průhonicích 15. 8. 2012. Hmotnost jednotlivých vzorků se pohybovala v rozmezí 0,100 g – 0,150 g v závislosti na velikosti listu, ze kterých byly odebírány. Všechny vzorky byly následně uloženy při –70°C do hlubokomrazícího boxu do doby další manipulace v laboratoři molekulární genetiky Ústavu biologie rostlin Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. Donorový strom AeT se nachází u Arboreta a botanické zahrady Mendelovy univerzity na souřadnicích 49°12'57.775"N, 16°36'53.206"E. Donorové stromy Aeh DM a AeH DN jsou pěstovány na pokusných plochách VÚKOZ, v.v.i., kde jsou rovněž kultivovány explantátové kultury AEH EMP a AeH ENP v laboratoři explantátových kultur. AeH EMB, AeH ENB a AeH EA byly odebrány v laboratoři explantátových kultur Ústavu biologie rostlin Agronomické fakulty MENDELU.

39

Tab. 1 – Seznam odebíraných vzorků Genotyp

Označení

Specifikace odběru

Specifikace

Počet

Hmotnost

vzorků jednoho vzorku A. turbinata

AeT

Donorový strom

Pupen, následná preparece

6

0,150 g

7

0,150 g

Mladé listy i řapíky

3

0,150 g

Mladé listy i řapíky

4

0,100 g

Pupen, následná preparece

7

0,150 g

Mladé listy bez řapíků

3

0,150 g

Mladé listy i řapíky

2

0,150 g

Mladé listy bez řapíků

3

0,100 g

mladých lístů A.

Aeh DM

Donorový strom

Pupen, následná preparece mladých lístů

hippocastanum M06

AeH EMB In vitro kultura, (organogeneze) AEH EMP In vitro kultura, (somatická embryogeneze)

A.

AeH DN

Donorový strom

mladých lístů

hippocastanum AeH ENB In vitro kultura, (organogeneze) AeH EA

In vitro kultura, (organogeneze)

AeH ENP

In vitro kultura (organogeneze)

4.2 Analyzovaný materiál Pro analýzy DNA byl vytvořen soubor (tab. 2) 13 vzorků. Jeden genotyp tvořil Aesculus turbinata Blume a další dva tvořily donorové rostliny Aesculus hippocastanum, od kterých bylo odvozeno 10 klonů v podmínkách in vitro metodou organogeneze a somatické embryogeneze v laboratoři VÚKOZ, v.v.i. a v laboratoři explantátových kultur Ústavu biologie rostlin Agronomické fakulty MENDELU.

40

Tab. 2 – Rostlinný materiál pro DNA analýzy Druh

Genotyp

Označení vzorků Původ

Počet vzorků

A. turbinata

AT

AeT

(AT) A.

1

Mendelovy univerzity, Brno AH

AeH DM

(M06)

Pokusné plochy VÚKOZ, v.v.i.,

1

Průhonice

hippocastanum Mertelik06 (AH)

Arboretum a botanická zahrada

AeH EMB

Pokusné plochy VÚKOZ, v.v.i.,

1

Průhonice AEH EMP 1 – 4

Pokusné plochy VÚKOZ, v.v.i.,

4

Průhonice AH

AeH DN

Pokusné plochy VÚKOZ, v.v.i.,

1

Průhonice AeH ENB

Pokusné plochy VÚKOZ, v.v.i.,

1

Průhonice AeH ENP 1- 3

Pokusné plochy VÚKOZ, v.v.i.,

3

Průhonice AeH EA

Hardeg, Rakousko, lokalita u hranic

1

NP Thayatal Vysvětlivky: AF – Laboratoř explantátových kultur Ústavu biologie rostlin Agronomické fakulty Mendelovi univerzity v Brně, VÚKOZ, v.v.i. - Výzkumný ústav Silva Taroucy pro krajinu a okrasné zahradnictví, NP – Národní park

4.3 Metodika 4.3.1 Izolace DNA DNA byla izolována z předem navážených vzorků, které byly uloženy v hlobokomrazícím boxu. Samotná DNA byla získána dvěma způsoby. Ze vzorků odebraných v Brně byla DNA izolována pomocí kitu DNeasy® Plant Mini (Qiagen), který byl optimalizován zvýšením navážky z původních 0,100 g na 0,150 g kvůli značnému množství trichomů na listech pocházejících z donorových rostlin. Při izolaci byl dodržen postup pro izolaci rostlinných pletiv DNeasy® Plant Handbook. DNA ze vzorků získaných z Průhonic byla izolována kitem Invisorb Spin Plant Mini (Stratec Molecular), kde bylo postupováno podle příslušného manuálu. Kvantita a kvalita 41

získané DNA byla provedena pomocí UV–spektrofotometru Picodrop (East Port). Na kontrolu byly použity 2,0 μl od každého vzorku, jako slepý vzorek byl použit pufr v němž byla na závěr izolace DNA již rozpuštěna. Z poměru absorbance při vlnové délce 260 nm a 280 nm byla zjištěna vysoká kvalita i kvantita DNA. V průběhu následujících analýz byla izolovaná DNA uchovávána v chladu při teplotě 4°C. 4.3.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Reakční směs pro polymerázovou řetězovou reakci udává tabulka 3. Tato směs byla připravena do 1,50 ml mikrozkumavky a rozpipetována do 0,20 ml PCR zkumavek po 24,0 μl. Do každé PCR zkumavky bylo následně přidáno 1,0 μl templátové DNA (analyzovaný vzorek). Celý obsah, tj. 25,0 μl, byl promíchan mikropipetou nasáváním a vypouštěním roztoku do PCR zkumavky. Všechny takto připravené zkumavky byly umístěny do komory termocykleru T3 (Biometra), kde byl spuštěn odpovídající program s přednastaveným časovým a teplotním profilem reakce (tab. 4). Profil reakce a primery (tab. 5) byly převzaty z Minami et al. (1998), přičemž byly vybrány ty, které vykazovaly největší stupeň polymorfizmu u A. turbinata. Tab. 3 – Složení PCR reakce Složky reakce

1 vzorek

dd H2O

16,80 μl

Pufr

5,0 μl

dNTP

0,10 μl

Primer F

1,0 μl

Primer R

1,0 μl

Taq polymeráza

0,10 μl 24,0 μl

Celkem

Zkratky: dd H2O – deionizovaná voda; dNTP – dinukleotid trifosfát; Primer F – forward primer; Primer R – reverse primer; Taq – Thermus aquaticus

42

Tab. 4 – Časový a teplotní profil PCR PCR

Teplota

Časový

(°C)

průběh

Iniciační denaturace

94

9 min

Denaturace

94

30 s

Annealing (nasedání

52

primerů)

54

Počet opakování

25x

55 Elongace (prodlužování)

72

60 s

Konečné prodlužování

72

7 min.

Tab. 5 – Sekvence používaných primerů (Minami et al., 1998) Označení primeru

Sekvence primeru

Teplota nasedání primeru

AT3D6

F:5'-AAT ACC AAA CTG CCC TTC AT-3'

52°C

R:5'-TTT CCA TTG GCT ACA TAA CT-3' AT5D2

F:5'-AAT CCA TTT GAC GAG TTT TA-3'

52°C

R:5'-GTA AAA GAG GCA GAC ACA GT-3' AT6D2

F:5'-ATG TAA CTC TGG GTG CTG TC-3'

52°C

R:5'-AGT TCT GTC AAT GTG TAT CA-3' AT6D8

F:5'-CAT ACC TAT AAG ACC AAA CA-3'

52°C

R:5'-TCC TCA TCG CAA AGA CTA AT-3' AT7D8

F:5'- GAC CGT CTC ACT CTT ACT TA-3'

52°C

R:5'-AGA TAA CCA TTT CCC AAT CA-3' AT6D12

F:5'-GGC TCC ATC TCT CAA GTG AA-3'

55°C

R:5'-TTC TTC CTC TTT CTC CTT AC-3' AT7D1

F:5'-ATG GGT GTG ATT TGT GAG TG-3'

55°C

R:5'-CTA ATG TGG AGG TAA GGT CT-3' AT5D10

F:5'-AGT AGA GCT GTG CCT GTA AC-3' R:5'-TAC TTC TTT CAA GGA GAC TC-3' Zkratky: F – forward primer, R – reverse primer

43

54°C

4.3.3 Příprava gelů a elektroforéza Kontrola produktů izolované DNA, předběžná kontrola výsledků po PCR a dělení fragmentů

po

PCR

byly

prováděny

elektroforézou

na

agarózovém

nebo

polyakrylamidovém gelu. Vzhledem k tomu, že všechny nukleové kyseliny nesou stejně velký záporný náboj, migrují fragmenty v elektrickém poli k anodě a rychlost migrace je závislá na jejich velikosti. 4.3.3.1 Agarózové gely Kontrola izolované DNA a výsledků po PCR byla prováděna na 1% a 1,5% agarózovém gelu s využitím elektroforéz Agagel Standard a Agagel Maxi (Biometra). Pro 1,0% gel (Agagel Standard) bylo 7,0 ml 50x koncetrovaného pufru TAE (trishydroxymethyldiaminomethan, ledová kys.octová, EDTA – disodium) rozmícháno ve 335,0 ml destilované vody v odměrném válci. Ze vzniklého roztoku bylo odlito do láhve s hrdlem 60,0 ml, do kterých bylo přidáno 0,60 g agarózy (Biotech), celý obsah byl promíchán a přiveden k varu (čirý roztok). Láhev s čirým roztokem se následně ochladila pod tekoucí vlažnou vodou za stálého míchání. Předposledním krokem bylo přidání 1,0 μl ethidium bromidu v digestoři a rozlití celého obsahu do předem připravených elektroforetických desek, na kterých se umístil na přední stranu hřebínek na jamky, do kterých se pipetoval vzorek pro separaci. Po 15 bylo možné gel použít pro vlastní elektroforézu. Pro gel 1,5% (Agagel Maxi) je postup stejný, pouze se liší v objemu používaných látek. V 1 891,40 ml se rozmíchá 38,60 ml pufru TAE (50x koncentrovaný). Následně se odlije 270,0 ml do láhve s hrdlem a přidá se 4,20 g agarózy. Vzniklý roztok se opět přivede k varu. V digestoři se přidá 1,50 μl ethidium bromidu a opět se nechá 15 – 20 minut utuhnout. Ethidium bromid je silně karcinogenní látka, proto je nutno zacházet s gelem po jeho přidání velmi opatrně a dodržovat zásady bezpečnosti práce. Vizualizace DNA na agarózových gelech proběhla pod UV lampou transiluminátoru Ultraviolet (UltraLum Inc.) a byla zaznamenána kamerou CCTV (Panasonic). 4.3.3.2 Polyakrylamidové gely a vizualizace konečných produktů Na polyakryamidovém gelu bylo prováděno dělení fragmentů po PCR ke zjištění velikosti amplikonů pro detekci genetické diverzity uvnitř u vybraných druhů rodu 44

Aesculus a zároveň byla ověřena i paternita explantátových kultur a jejich donorových rostlin. Složení gelů uvádí tabulka 6. Tab. 6 – Složení polyakrylamidového gelu Složky

Objem

destil.H2O

34,650 ml

TBE (10x

5,0 ml

koncentrované)

AKRYL/BIS

10,0 ml

TEMED

334,0 μl

APS (10%)

334,0 μl

Zkratky: TBE – trisbáze (=trishydroxymethyldiaminomethan; Biotech), kys.boritá, EDTA – disodium (Biotech); AKRYL/BIS – akrylamid/bisakrylamid; TEMED – tetramethylendiamin (Biotech); APS – amonium persulfát (Biotech)

Jednotlivé složky v tabulce 6 je nutné přidávat v pořadí, v jakém jsou uvedeny, protože persíran amonný (APS) začíná polymerační reakci, která je velmi rychlá. Proto je nutné nachystat el.desky již předem. 4.3.3.3 Průběh elektroforézy Elektroforéza probíhala na agarózovém gelu při napětí 70 V. Na polyakrylamidových gelech byla elektroforéza prováděna ve dvou časových fázích. V první fázi probíhala při 100 V po dobu 10 minut. Následně bylo napětí zvýšeno na 300 V po dobu 60 – 100 minut v závislosti na velikosti separovaných amlikonů. 4.3.3.4 Barvení výsledných produktů Vizualizace produktů na polyakrylamidových gelech byla prováděna dusičnanem stříbrným (AgNO3) (tab. 7).

45

Tab. 7 – Složení jednotlivých roztoků pro vizualizaci Fixační roztok

AgNO3

Vývojka

41,60 ml ethanolu

2,0 g dusičnanu

10,0 ml 37%

sříbrného

formaldehydu

2,0 ml kys.octové

1000,0 ml destil.H2O 22,20 g NaOH

356,40 ml

730,0 ml destil.H2O

destil.H2O

Celý proces barvení probíhal v digestoři za mírného třepání. Po ukončení elektroforézy byl gel přenesen ze skleněných desek do nádoby s fixačním roztokem, kde byl inkubován po dobu 1 minuty. Poté byl přenesen do nádoby s roztokem dusičnanu stříbrného, kde probíhalo navázání stříbra 3 minuty. Následně byl gel 3x promyt v destilované vodě a přenesen do nádoby s vývojkou v digestoři (odpařování formaldehydu). Po 10 minutách došlo k vizualizaci produktů. Gely byly přeneseny na fólii, zataveny a oskenovány. Při teplotě 4°C mohou být gely dlouhodobě skladovány. 4.3.4 Hodnocení výsledků Výsledky analýz byly vyhodnocovány pomocí binární matice, kde 1 znamená přitomnost produktu a 0 jeho absenci. Tato matice byla zpracována statistickým softwarem FreeTree verze 9.1 (Hampl et al., 2001) pomocí UPGMA (Unweight Pair Group Method with Arithemetic Mean) s využitím Jaccardova koeficientu podobnosti (Jaccard, 1908). Do podoby dendogramu byly výsledky přeneseny softwarem TreeView verze 1.6 (Page, 1996). Pro každý mikrosatelit byly vypočteny hodnoty DI (diversity index), PI (probability index) a PIC (polymorfní informační obsah) dle Russell et al. (1997):

Kde n je počet alel, pi znamená četnost i-té alely a pj zastupuje četnost j-té alely. 46

5 Výsledky a diskuze 5.1 Optimalizace nasedání primerů U amplifikace mikrosatelitových oblastí metodou PCR může docházet po vizualizaci ke zjištění velkého množství nespecifikých produktů. Úspěšnost PCR reakce je ovlivňována celou řadou faktorů jako je koncentrace a čistota jednotlivých složek reakce nebo teplotní a časový profil denaturace DNA. Ondroušková (2011) uvádí v případě tvorby nespecifických produktů jako první krok upravení teploty nasedání primerů, přičemž teplota se musí upravit pro každý primer jednotlivě. Tento proces je po časové i materiální stránce náročný, proto bylo při této studii k testování nasedání primerů dle Minami et al. (1998) přistoupeno s předstihem již na podzim 2011. Námi vybrané primery nevytvářily nespecifické produkty, proto nebylo nutné upravovat teplotní nebo časový profil PCR reakce nebo její složení. 5.2 Vyhodnocení analýz u jednotlivých SSR markerů V rámci genetických analýz byl detekován jeden SSR marker, který poskytoval uniformní spektrum apmlikonů u všech analyzovaných vzorků (AT3D6). U A. turbinata (AeT) se vyskytovala nejvyšší heterozygotní konstituce 62,5% a to u SSR markerů AT6D12, AT7D1, AT5D10 (obr. 13), AT6D8 a AT7D8. Jedinci A. hippocastanum a jejich regeneranti (AeH DN, AeH ENB, AeH ENP 1 – 3, AeH EA) nesouhlasili s profilem rostliny označené jako donor explantátové kultury. Velikost amplikonů AeH ENB a AeH ENP 1 – 3 byla však stejná. Tato shoda značí, že explantátové kultury odvozené cestou organogeneze, ačkoli kultivované na jiných místech (MENDELU a VÚKOZ, v.v.i.), byly odvozeny od stejného donorového stromu. U této skupiny se heterozygotní profily vyskytovaly kromě AeH EA pouze u dvou SSR markerků, AT6D2 a AT7D1. AeH EA vykazoval heterozygotnost pouze u AT6D2. Jedinci A. hippocastanum M06 a jejich regeneranti (AeH DM, AeH EMB, AEH EMP 1 – 4) již korespondovaly s donorem explantátové kultury. Heterozygoti u této skupiny byli pozorováni pouze u SSR markeru AT6D2. U SSR markeru AT7D8 byly detekovány dvě zóny produktů o velikosti 130 bp a 80 – 100 bp (tab. 8) u všech analyzovaných jedinců kromě AeT. Zóna 130 bp byla shodná pro všechny analyzované genotypy a odpovídala průměrné velikosti 126 bp, kterou zjistili u A. turbinata Minami et al. (1998). Tato

47

primerová sekvence nasedala v genomu námi analyzovaných genotypů na dvě místa. Pro další práci bude vhodné provést sekvenční analýzu těchto produktů a jejich srovnání. Tab. 8 – Vyhodnocení jednotlivých SSR markerů SSR marker Velikost (bp) Počet alel

DI

PI

PIC

AT3D6

290

1

0,0

1,0

0,0

AT5D2

240 – 280

4

0,60

0,21

0,55

AT5D10

220 – 260

3

0,36

0,43

0,33

AT6D2

260 – 300

5

0,76

0,06

0,74

AT6D8

120 – 140

3

0,26

0,57

0,24

AT6D12

120 – 160

4

0,37

0,39

0,36

AT7D1

160 – 200

4

0,70

0,11

0,66

AT7D8

80 – 100,130

4

0,60

0,09

0,60

3,5

0,46

0,36

0,43

Průměr

Zkratky: DI – diverzity index, PI – pravděpodobnost identity, PIC – polymorfní informační obsah

Obr. 13 – Polyakrylamidový gel, primer AT5D10 (1, 14 – velikostni marker po 20 bp; 2, 3 – AeT; 3, 4 – AeH DM; 5, 6 – AeH DN; 7, 8 – AeHEMB; 9, 10 – AeH ENB; 11, 12 – AeH EA)

48

5.3 Hodnocení genetické diverzity u rodu Aesculus V analyzovaném souboru bylo celkem detekováno 28 alel, v průměru 3,5 alely na lokus. Minami et al. (1998) detekovali 18 alel na lokus při studiu genetické variability 43 jedinců A. turbinata při použití deseti SSR markerů, z toho osm SSR markerů s nejvyšší variabilitou bylo aplikováno v této bakalářské práci. Isagi et al. (2007) zjistili při amplifikaci šesti stejných mikrosatelitových oblastí 19,3 alel na lokus u 221 jedinců při studiu genetické struktury A. turbinata. Thomas et al. (2008) detekovali stejnými SSR markery od 15 do 35 alel na lokus u 24 populací (391 jedinců) A. flava, A. pavia a A. sylvatica a jejich kříženců. Je evidentní, že zjištěné hodnoty jsou v porovnání s jinými autory nízké. Tento rozdíl je způsoben především velikostí souboru a jeho nízkou variabilitou. Tato skutečnost je potvrzena i průměrnými hodnotami statistických ukazatelů pro jednotlivé SSR markery: DI 0,46; PI 0,36 a PIC 0,43 (tab. 8). Na základě dendogramu (obr. 14) lze konstatovat, že došlo ke statisticky významnému rozlišení analyzovaných genotypů do dvou shluků I. a II. Statisticky průkazná shoda rezistentních vzorků kultivaru Mertelik06 (AeH DM) s jeho explantátovou kulturou kultivovanou ve VÚKOZ, v.v.i. v Průhonicích a MENDELU v Brně (AeH EMB a AeH EMP 1 – 4) lze hodnotit jako pozitivní výsledek pro prokazování pravosti rostlinného materiálu odvozeného in vitro. Genotyp Mertelik06 se však nacházel i ve společném podshluku (I.A) s explantátovou kulturou, která byla v Brně odvozena z donorového stromu pocházejícího z okolí Hardegu v Rakousku (AeH EA). Tento strom opakovaně ve dvou vegetačních obdobích nevykazoval symptomy napadení housenkami klíněnky jírovcové, i když její vajíčka byla na listech zjištěna. Pro experiment se však nepodařilo získat vzorek DNA donorového stromu. Vyhnánek et al. (2013) také nevylučují skutečnost, že tento strom nebyl na ochranu proti klíněnce ošetřen, ale zároveň uvádějí, že vzhledem k volnému výskytu stromu v krajině v blízkosti hranic národního parku je ošetření nepravděpodobné. Také je nutné zvážit možnost časového úniku klíněnce a vlivu prostředí na možnou infestaci. V případě dalších analýz DNA u tohoto jedince by bylo vhodné tyto skutečnosti ověřit. Zajímavou skutečností je, že A. turbinata (AeT) se nacházel ve shluku II. s náchylným donorem A. hippocastanum (AeH DN) ke klíněnce jírovcové, přičemž Nejezchlebová (2011) uvádí, že na A. turbinata dochází k podobné nebo často i k masivnější infestaci klíněnkou než na A. hippocastanum. 49

Genotyp AeH DN nevykazuje vysoký stupeň podobnosti se vzorky explantátové kultury vedené v Brně a v Průhonicích (AeH ENB a AeH ENP 1 – 3) nacházejících se v podshluku I.B. Dodatečně bylo zjištěno, že explantátové kultury byly odvozeny pracovníky VÚKOZ, v.v.i. z více náchylných jedinců (donorových stromů). Tato skutečnost mohla způsobit, že analyzovaný jedinec tak neodpovídá explantátové kultuře. Získané výsledky umožňují dodatečně verifikovat, který z náchylných stromů je skutečným donorem pro explantátové kultury.

Obr. 14 – Dendogram podobnosti, analyzované genotypy rodu Aesculus Zkratky: AeH DM – Ae. hippocastanum (donor), Mertelík; AeH EMB – Ae. hippocastanum (explantát, Brno), Mertelík; AeH EMP1-P4 – Ae. hippocastanum (explantát, Průhonice), Mertelík; AeH EA – Ae. hippocastanum (explantát, Rakousko); AeH DN – Ae. hippocastanum (donor, náchyný); AeH ENB – Ae. hippocastanum (explantát, náchylný, Brno); AeH ENP1-P3 – Ae. hippocastanum (explantát, náchylný, Průhonice);AeT – Ae. turbinata (kontrola)

50

6

Závěr

Tato práce byla zaměřena na studium genetické diverzity u rodu Aesculus a rezistence u vybraných

druhů.

Předložené

výsledky

potvrzují

vhodnost

metody

analýzy

mikrosatelitových lokusů ke sledování stability explantátových kultur určených pro mikropropagaci ekologicky cenných genotypů a pro identifikaci explantátových kultur odvozených z donorových jedinců A. hippocastanum, tj.pro rodičovskou analýzu testovaných jedinců. Výše uvedené tvrzení je založeno na základě shody regenerantů odvozených in vitro s donorovým stromem A. hippocastanum Mertelik06. Skutečnost, že donorový strom A. hippocastanum nachylný ke klíněnce jírovcové nekoresponduje s explantátovými kulturami, potvrzuje jenom správnost této metodiky. Navíc výsledky uvedené v této práci nyní umožňují dohledání a identifikaci donorového jedince. Shoda zjištěná u rezistentních vzorků z donorového stromu kultivaru Mertelik06 a z něj vytvořené explantátové kultury je jednoznačným přínosem a bude uplatněna pro prokazování pravosti při praktickém sledování rezistentního chování a biologických vlastností klonového potomstva tohoto kultivaru Stabilita explantátových kultur byla prokázána u všech testovaných SSR markerů, když byla zjištěna stejná velikost amplikonů u explantátových kultur odvozených cestou organogeneze ze stejného donorového rostlinného materiálu nerezistetního A. hippocastanum a u explantátových kultur získaných metodou somatické embryogeneze a organogeneze odvozených od A. hippocastanum M06. Pro produkční in vitro množení kultivaru Mertelik rezistentního ke klíněnce jírovcové byla vypracována certifikovaná metodika (Šedivá et al., 2012), s cílem urychlení jeho praktického použití v cílených výsadbách jírovců v ČR včetně obor s intenzivním chovem spárkaté zvěře. Hodnocení in vitro namnožených rostlin bude probíhat jak experimentálně v řízených podmínkách, tak dlouhodobě v podmínkách přirozené infestace klíněnkou jírovcovou na různých stanovištích budoucích cílených výsadeb. Možnost spolehlivého laboratorního prokázání pravosti rostlinného materiálu při vyhodnocování případných rozdílů je z metodického hlediska nezbytná. Metoda s použitím SSR markerů je přínosem pro spolehlivé prokázání pravosti vysazeného materiálu jak z hlediska biologického, tak z hlediska právní ochrany.

51

Analyzovaný soubor i přes jeho velikost vykazuje určitou genetickou diverzitu, ale variabilita je v porovnání s ostatními autory nízká. V případě podrobnějšího studia genomu rodu Aesculus, např. fylogenetických studií nebo studia vnitrodruhové variability spojených s rezistencí ke klíněnce jírovcové bude však výhodnější použít sekvenční analýzy (Harris et al., 2009) nebo analýzu délkového polymorfizmu amplifikovaných fragmentů (Prada et al., 2011). Zajímavé by bylo také v rámci dalších prací srovnat explantátové kultury s jejich donory a stabilitu znovu introdukovaných jedinců z explantátových kultur. V rámci vlastní studie jsem také narazil na absenci publikací zabývající se vlivem klíněnky jírovcové na přírůstek kořenů a také chybí jakákoli práce hodnotící komplexní vliv vnějších a stresových podmínek na náchylnost jedinců rodu Aesculus ke klíněnce jírovcové (Mertelík, ustní sdělení). Získané poznatky během řešení bakalářské práce chci využít v rámci dalšího studia při zpracování diplomové práce, která by měla na předloženou práci navazovat.

52

7

Seznam publikovaných prací

V souvislosti s předkládanou prací a problematikou byly publikovány následující výsledky: Vyhnánek T., Bačovský V., Vlašínová H., Havel L., Šedivá J. & Mertelík J., 2013: Studium genetické variability u zástupců rodu Aesculus L. pomocí SSR markerů. Zprávy lesnického výzkumu, In Press.

53

8 Seznam použité literatury Akimov I.A., Zerova M.D., Narolsky N.B., Nikitenko G.N., Sviridov S.V., Kohanets A.M. & Babidoritch M.M., 2006: Biology of horse chestnut leaf – mining moth, Cameraria ohridella (Lepidoptera, Gracillarildae), in Ukraine. Communication 2. Vestnik Zoologii, 40: 321 – 332 s.

Austin F.D., Lee M. & Veldboom R.L., 2001: Genetic mapping in maize with hybrid progeny across testers and generations: plant height and floweing. Theoretical and Applied Genetics, 102: 163 – 176 s. Ježíšková I. & Bednář J., 2004: Využití SSR markerů pro zlepšení technologické jakosti sladovnického

ječmene.

Datábaze

online

[cit.

2013-02-27].

Dostupné

na:

http://mnet.mendelu.cz/mendelnet2004/obsahy/biorost/jeziskova.pdf

Bhagwat A.S. & Willis J.K., 2008: Species persistence in northerly glacial refugia of Europe: a matter of chance or biogeographical traits? Journal of Biogeography, 35, 464 – 482 s. Bláha L.& Hnilička F., 2007: Růst významu vlastností kořenů v měnících se klimatických podmínkách střední Evropy, s. 13 – 20. In: Bláha L. (eds.): Vliv abiotických a biotických stresorů na vlastnosti rostlin 2007. Sborník příspěvků z konference 21 – 22.3.2007. VÚRV v.v.i Praha – Ruzyně, ČZU v Praze, Praha, 549 s. Čapek M., 1999: Parazitoidi klíněnky jírovcové. In Laštůvka Z. (ed.): Klíněnka jírovcová. Veronica 13/2 : 7 s.

DNeasy® Plant Handbook, 2006: Protocol, Qiagen, 53 s. Ďurkovič J. & Krajňáková J., 2010: Mikropropagácia drevín v podmienkach in vitro. Technická univerzita vo Zvolene, Zvolen, 88 s.

54

Geburek T., 1997: Isozymes and DNA markers in gene conservation of forest trees. Biodiversity & Conservation, 6: 1639 – 1654 s. Gilbert M., Guichard S., Freise J., Grégoire J.-C., Hetland W., Straw N., Tilbury C. & Augustin S., 2005: Forecasting Cameraria ohridella invasion dynamics in recently invaded countries: from validation to prediction. Journal of Applied Ecology, 42, 805 – 813 s. Green S., Laue B., Fossdal G.C., A´Hara W.S. & Cottrell E.J., 2009: Infection of horse chestnut (Aesculus hippocastanum) by Pseudomonas syringae pv. aesculi and its detection by quantitative real – time PCR. Plant Pathology, 58, 731 – 744 s.

Gugerli F., Senn J., Anzidei M., Madaghiele A., Büchler U., Sperisen C. & Vendramin G.G., 2001: Chloroplast microsatellites and mitochondrial nad1 intron 2 sequences indicate congruent phylogenetic relationships among Swiss stone pine (Pinus cembra), Siberian stone pine (Pinus sibirica), and Siberian dwarf pine (Pinus pumila). Molecular Ecology, 10: 1489 – 1497 s. Hampl V., Pavlíček A. & Flegr J., 2001: Construction and bootstrap analysis of DNA fingerpriting-based phylogenetic trees with a freeware program FreeTree: Application to Trichomonad parasites. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51: 731 – 735 s. Hájek J., Hotový J., Koutecký P. & Matějů J., 2004: Úvod do biogeografie. Institut dětí a mládeže MŠMT, Praha, 100 s. Harris R.D., 2005: Origins and Spread of Agriculture, s. 13 – 26. In: Prance G. & Nesbitt M. (eds.), The cultural history of plants. Routledge, New York, 452 s. Harris A., Xiang Q.Y. & Thomas D., 2009: Phylogeny, origin, and biogeographic history of Aesculus L. (Sapindales) – an update from combined analysis of DNA sequences, morphology, and fossils. Taxon, 58: 108 – 126 s.

55

Heinrich M., Pieroni A. & Bremner P., 2005: Plants as Medicines, s. 205 – 238. In: Prance G. & Nesbitt M. (eds.), The cultural history of plants. Routledge, New York, 452 s. Horáček P., 2007: Aesculus hippocastanum – listy a květy. Databáze online [cit. 201303-06]. Dostupné na: http://databaze.dendrologie.cz/obrazek.php?obrazek=9374

Hwang H.S., Shin G.W., Chung B., Na J. & Jung G.Y., 2013: Multiplex and quantitative pathogen detection with high – resolution capillary electrophoresis – based single – strand conformation polymorphism. Methods in Molecular Biology, 919: 155 – 163 s.

Chambers K.G. & MacAvoy S.E., 2000: Microsatellites:consensus and controversy. Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 126: 455 – 476 s. Chloupek O., 2008: Genetická diverzita, šlechtění a semenářství. Academia, Praha, 312 s. Christelová P., 2011: Analýza genetické diverzity a evoluce genomu banánovníku. Dizertační práce, Přírodovědecká fakulta Univerzity Palacekého v Olomouci, Olomouc, 190 s.

Invisorb® Spin Plant Mini Kit, 2011: Protocol, Stratec Molecular, 18 s.

Isagi Y., Saito D., Kawaguchi H., Tateno R. & Watanabe S., 2009: Effective pollen dispersal is enhanced by the genetic structure of an Aesculus turbinata population. Journal of Ecology, 95: 983 – 990 s.

Jaccard P., 1908: Nouvelles recherches sur la distribution florale. Bulletin Del La Societé Vaudoise Des Scientes Naturelles, 44: 223 – 270 s.

56

Kindl J., Kalinová B., Freise J., Heitland W., Augustin S., Guichard S., Avtzis N. & Svatoš A., 2002: Monitoring the population dynamics of the horse chestnut leafminer Cameraria ohridella with a synthetic pheromone in Europe. Plant Protection Science, 38: 131 – 138 s. Klika J., 1947: Lesní dřeviny – lesnická dendrologie. Československá matice lesnická v Písku, Písek, 395 s.

Klug T., Meyhöfer R., Kreye M. & Hommes M., 2008: Native parasitoids and their potential to control the invasive leafminer, Cameraria ohridella DESCH. & DIM. (Lep.: Gracillariidae). Bulletin of Entomological Research, 98: 379 – 387 s. Koblížek J., 2006: Jehličnaté a listnaté dřeviny našich zahrad a parků. SURSUM, Tišnov, 560 s. Kováč J., 1992: Explantátové kultury rostlin. Univerzita J.E.Purkyně, Ustí nad Labem, 146 s. Kunca A., 2010: Diseases – Foliage Diseases. Databáze online [cit. 2013-03-06]. Dostupné na: http://www.invasive.org/browse/catthumb.cfmcat=16&Area=4&aut=2311 5 Kůdela V., Bartoš P., Čača Z., Dirlbek J., Frič F., Lebeda A., Šebesta J., Ulrychová M, Valášková E. & Veselý D., 1989: Obecná fytopatologie. Academia, Praha, 388 s. Laštůvka Z., Gaisler J., Šťastná P. & Pelikán J., 2004: Zoologie pro zemědělce a lesníky. KONVOJ, spol. s.r.o., Brno, 264 s. Laštůvka Z. & Krejčová P., 2000: Ekologie. KONVOJ, spol.s.r.o.; Brno, 185 s.

57

Lees C.D., Lack W.H., Rougerie R., Hernandez-Lopez A., Raus T., Avtzis D.N., Augustin S. & Lopez-Vaamonde C., 2011: Tracking origins of invasive herbivores through herbaria and archival DNA: the case of the horse-chestnut leaf miner. Frontiers in Ecology and the Environment, 9: 322 – 328 s.

Li Ch.Y., Korolo B.A., Fahima T. & Nevo E., 2004: Microsatellites within genes: structure, function, and evolution. Molecular Biology and Evolution, 21: 991 – 1007 s. Mertelík J. & Kloudová K., 2006: Klon Aesculus hippocastanum Mertelik06 s rezistentním chováním ke Cameraria ohridella. Databáze online [cit. 2013-02-12]. Dostupné

na:

http://www.isvav.cz/resultDetail.do;jsessionid=EA4C20DC890B2AFA096 58A9EDB850726?rowId=RIV%2F00027073%3A_____%2F06%3A%230000828!RIV 11-MZP-00027073 Mertelík J. & Kloudová K., 2009: Výsledky sledování rezistentních projevů Aesculus hippocastanum (klon M06) ve vztahu k infestaci klíněnkou jírovcovou (Cameraria ohridella) v období 2001 – 2008. Acta Pruhoniciana, 93: 11 – 14 s. Mertelík J., Kloudová K. & Stejskal J., 2010: Problematika uplatnění klonu jírovce maďalu M06 s rezistentním chováním ke klíněnce jírovcové jako plodonosného stromu v oborách s intenzivním chovem spárkaté zvěře. Acta Pruhoniciana, 94: 9 – 12 s. Mertelík J., Kloudová K. & Vanc P., 2004: Occurrence of Aesculus hippocastanum with high degree of resistance to Cameraria ohridella in the Czech republic. Acta Fytotechnica Et Zootechnica, Special Number, Proceedings of the XVI. Slovak an Czech Plant Protection Conference organised at Slovak Agricultural University in Nitra, Slovakia, Vol 7, 204 s.

Minami E., Isagi Y., Kaneko Y. & Kawaguchi H, 1998: Polymorphic microsatellite markers in Japanese horse chestnut Aesculus turbinata Blume. Molecular Ecology, 7: 1613 – 1621. 58

Mrkva R., 1999: Přízrak klíněnky jírovcové obchází Evropou. In Laštůvka Z. (ed.): Klíněnka jírovcová. Veronica 13/2 : 5 – 11 s. Nejezchlebová M., 2011: Studium podstaty rezistence rodu Aesculus vůčí klíněnce jírovcové (Cameraria ohridella). Diplomová práce, Lednice, 89 s. Novák F.J., 1990: Explantátové kultury a jejich využití ve šlechtění rostlin. Academia ČAV, Praha, 208 s. Nováková P., 2008: Bionomie klíněnky jírovcové (Cameraria ohridella) a jejích přirozených nepřátel z řádu blanokřídlých (Hymenoptera: Chalcidoidea); možnosti obrany. Dizertační práce, Praha, 144 s. Ondroušková J., 2011: Studimu genetické variability tritikale mikrosatelitními markery. Diplomová práce, MENDELU Brno, 77 s.

Page R.D.M., 1996: TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers. Computer Applications in the Biosciences, 12: 357 – 358 s. Pastirčáková K., Pastirčák M., Celar F. & Shin.H.D., 2009: Guignardia aesculi on species of Aesculus: New records from Europe and Asia. Mycotaxon, 108: 287 – 296 s. Pešková V. & Soukup F., 2009: Skvrnitosti listů houbového původu. Lesnická Práce (ČTK), 11: 3 s. Pospíšková M., 2007: Genetická analýza populací topolu černého (Populus nigra). Dizertační práce, Praha, 75 s.

Prada D., Velloza M.T., Toorop E.P. & Pritchard W.H., 2011: Genetic population structure in horse chestnut (Aesculus hippocastanum L.): effects of human-mediated expansion across Europe. Plant Species Biology, 26: 43-50 s. 59

Provan J., Soranzo N., Wilson J.N., Goldstein B.D. & Powell W., 1999: A low mutation rate for chloroplast microsatellites. Genetics, 153: 943 – 947 s.

Russell J., Fuller J., Young G., Thomas B., Taramino G., Macaulay M., Waugh R. & Powel W., 1997: Discriminating between barley genotypes using microsatellite markers. Genome, 40: 442 – 450 s. Russel T., 2005: Wood, s. 315 – 333. In: Prance G. & Nesbitt M. (eds.), The cultural history of plants. Routledge, New York, 452 s.

Salamini F., 1998: Biotechnology and molecular biology in practical horticulture, s. 17 – 42. In: L.H.W. van der Plas (eds.): Proceedings of the XXV International Horticultural Congress. Acta Horticulturae, číslo 520, Leuven, 2000 s. Samek T., 2003a: Bionomie, ekologie a škodlivost klíněnky jírovcové (Cameraria ohridella Deschka & Dimić) a možnosti tlumení její početnosti. Dizertační práce, MZLU v Brně, Brno , 150 s.

Samek T., 2003b: Diapause of Cameraria ohridella Deschka et Dimic and its impact on the species population dynamics. Journal of Forest Science, 49: 252-258 s. Samek T. (ed.), 2006: Příspěvek k objasnění škodlivosti klínenky jírovcové. Databáze online ČTK [cit. 2013-01-09]. Dostupné na: http://www.silvarium.cz/lesnicka-prace-c11-04/prispevek-k-objasneni-skodlivosti-klinenky-jirovcove Samek T. (ed.), 2007: Populační dynamika klíněnky jírovcové. Databáze online ČTK [cit.

2013-01-09].

Dostupné

na:

http://www.silvarium.cz/lesnicka-prace-c-5-

01/populacni-dynamika-klinenky-jirovcove Skuhravý V.(ed.), 2006: Klíněnka jírocvcová v roce 2004. Databáze online ČTK [cit. 2013-01-09]. Dostupné na: http://www.silvarium.cz/lesnicka-prace-c-7-04/klinenkajirovcova-v-roce-2004 60

Spandana B., Reddy V.P., Prasanna G.J., Anuradha G. & Sivaramakrishnan S., 2012: Development and characterization of microsatellite markers (SSR) in sesamum (Sesamum indicum L.) species. Applied Biochemistry and Biotechnology, 6: 1594 – 1607 s.

Steele H., Laue B.E., MacAskill G.A., Hendry S.J. & Green S., 2010: Anylysis of the natural infection of European horse chestnut (Aesculus hippocastanum) by Pseudomonas syringae pv. aesculi. Plant Pathology, 6: 1005 – 1013 s. Šedivá J., Vejsadová H., Vlašínová H., Mertelik J. & Kloudová K., 2011: Způsoby in vitro regenrace u Aesculus hippocastanum L. Acta Pruhoniciana, 99: 127 – 130 s. Šedivá J., Mertelík J. & Kloudová K., 2012: Mikropropagace jírovce maďalu (Aesculus hippocastanum L.). Certifikovaná metodika č.11/2012-057: 14 s. Šefrová H., 1999: Klíněnky - zajímavá skupina drobných motýlů a jejich šíření. In Laštůvka Z. (ed.): Klíněnka jírovcová. Veronica 13/2 : 2 – 4 s. Šefrová H., 2002: Invazní druhy klíněnek v Evropě - biologie, šíření, význam a ochrana hostitelských dřevin (Insecta, Lepidoptera, Gracillariidae). Dizertační práce, MZLU v Brně, Brno, 113 s. Šefrová H., 2006: Rostlinolékařská ENTOMOLOGIE. KONVOJ, spol.s.r.o., Brno, 258 s. Šefrová H., 2007: Nové druhy škůdců a změny škodlivosti hmyzích druhů v posledních desetiletích, s. 31-37. In: Bláha L. (eds.): Vliv abiotických a biotických stresorů na vlastnosti rostlin 2007. Sborník Příspěvků Z Konference 21-22.3.2007. VÚRV v.v.i Praha – Ruzyně, ČZU v Praze, Praha, 549 s.

61

Thomas T.D., Ahedor R.A., Williams F.Ch., dePamphilis C., Crawford J.D. & Xiang Q.Y., 2008: Genetic analysis of a broad hybrid zone in Aesculus (Sapindaceae): is there evidence of long – distance pollen dispersal? International Journal of Plant Science, 169: 647 – 657 s.

Tomczyk A., Kropczyńska D., Ptak A., Marija T., Shumlo N., Oreshnikov A., Nosov A. & Furmanowa M., 2007: Effect of Polyscias filicifolia bailey extracts on the behavior of the miner Cameraria ohridella Deschka and Dimic on horse chestnut trees. Acta Biologica Cracoviensia, Series Botanica 49: 55 – 60 s. Tóth G., Gáspári Z. & Jurka J., 2000: Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and anylysis. Genome Research, 10: 967 – 981 s.

Tozlu E. & Demirci E., 2010: First report of powdery mildew of Aesculus hippocastanum caused by Erysiphe flexuosa in Turkey. Australasian Plant Disease Notes, 5: 61 – 62 s. Trandžík P., 2005: Dynamika početnosti klíněnky jírovcové a její přirození nepřátelé v okolí Piešťan. Diplomová práce, MZLU v Brně, Lednice, 52 s. Vejsadová H., Šedivá J., Vlašínová H., Havel L., Mertelík J. & Kloudová K., 2009: Indukce organogeneze u jírovce maďalu (Aesculus hippocastanum L.). Zprávy lesnického výzkumu, 54: 286 – 292 s. Vyhnánek T., Bačovský V., Vlašínová H., Havel L., Šedivá J. & Mertelík J., 2013: Studium genetické variability u zástupců rodu Aesculus pomoci SSR markerů. Zprávy lesnického výzkumu, In Press.

Ware W.G., 2000: The pesticides book. Thompson publications, California, 418 s.

62

Seznam obrázků: Obr. 1 – Vajíčko klíněnky jírovcové Obr. 2 – Housenka klíněnky jírovcové Obr. 3 – Kukla klíněnky jírovcové Obr. 4 – Imago klíněnky jírovcové Obr. 5 – Parazitoidi klíněnky jírovcové Obr. 6 – Aesculus hippocastanum Obr. 7 – Aesculus turbinata Obr. 8 – Srovnání chování nerezistetního Aesculus hippocastanum a klonu M06 Obr. 9 – List Aesculus turbinata Obr. 10 – Erysiphe flexuosa Obr. 11 – Pseudomonas syringae pv. aesculi Obr. 12 – funkce mikrosatelitů uvnitř exonů a intronů Obr. 13 – Polyakrylamidový gel

Seznam tabulek: Tab. 1 – Seznam odebíraných vzorků Tab. 2 – Rostlinný materiál pro DNA analýzy Tab. 3 – Složení PCR reakce Tab. 4 – Časový a teplotní profil reakce Tab. 5 – Sekvence používaných primerů Tab. 6 – Složení polyakrylamidového gelu Tab. 7 – Složení jednotlivých roztoků pro vizualizaci Tab. 8 – Vyhodnocení jednotlivých SSR markerů

Seznam grafů: Graf 1 – Dendogram podobnosti

63