Studium enzymů biotransformujících xenobiotika jako nástroj k poznání mechanismu působení karcinogenů a konstrukce kancerostatik nové generace Doc. RNDr. Marie Stiborová, DrSc.
1. Úvod Nádorová onemocnění jsou jedním z nejzávažnějších problémů klinické medicíny. V současné době jsou příčinou úmrtí každého pátého občana ČR a jejich výskyt neustále narůstá (Klener 1996). Tato civilizační choroba navíc postihuje stále nižší věkové ročníky. P
P
Je to dáno zejména oproti minulosti zásadně odlišnou skladbou potravy, která obsahuje převahu cukrů a tuků, ale také stresem a kontaminací složek životního prostředí látkami s kancerogenním účinkem. Nevhodná strava a kancerogeny přítomné ve vodě, ovzduší a potravě způsobují, že se tvoří vyšší počet jednotlivých nádorových buněk, než je pro organismus přirozené. Imunitní systém, který může být stresem a polutanty oslaben, pak není schopen na tuto situaci dostatečně zareagovat. Léčba nádorových onemocnění je komplikována zejména skutečností, že léčbou potřebujeme zcela zničit buňky nikoli cizorodé, jak je tomu například u bakteriálních infekcí, ale tělu vlastní. Nádorové buňky se více či méně liší od normálních buněk, ze kterých vznikly, a proto by teoreticky měly být rozpoznány imunitními mechanismy a eliminovány. Odlišnosti od normálních buněk jsou však buď příliš malé, takže jsou imunitním systémem ignorovány, nebo nádorové buňky využívají mechanismy, které jim umožňují paralyzovat některé zbraně imunitního systému. Ačkoli znalost mechanismu P
P
účinku protinádorového léčiva a jeho osud v organismu by měly být známy dříve, než se
1
lék použije v klinické praxi, jsou tyto údaje u většiny cytostatik doplňovány až dodatečně a jejich použití se tedy zakládá na empiricky získaných údajích o therapeutické účinnosti a toxicitě (Klener 1996). Díky znalosti mechanismu působení protinádorových léčiv se však optimalizuje používání daného léčiva, a navíc může vést k navržení jeho účinnějších derivátů s cíleným účinkem selektivním pro nádorové buňky.
1.1. Nádorová onemocnění Značné rozšíření neoplasmatických transformací ukazuje, že příčiny nádorového zvrhnutí jsou v úzkém vztahu k základním jevům života. Společným jmenovatelem těchto onemocnění jsou genetické změny způsobující porušení regulačních procesů, což následně vede ke ztrátě diferenciace buněk, k jejich nekontrolovatelnému dělení a ke ztrátě tkáňové celistvosti (Klener 1996, Stiborová a Mikšanová 1999). Nádorová onemocnění mohou postihovat všechny mnohobuněčné organismy včetně člověka. Čím je organismus složitější, tím více druhů konečně diferenciovaných buněk obsahuje (člověk asi 200), a tím více potřebuje genů kódujících různé regulační proteiny. Komplexní proces vzniku nádorů je nazýván kancerogenese (nebo karcinogenese). Nová a abnormální tkáň v mnohobuněčném organismu, která se vyznačuje nadměrným autonomním růstem a tím poškozuje celý organismus, se označuje jako nádor či tumor nebo též neoplasma (novotvar). Velmi mnohé (snad všechny) typy buněk se mohou z různých důvodů nádorově zvrhnout. Maligní nádory vzniklé z epiteliálních buněk jsou HPH
P
nazývány karcinomy, nádory vzniklé z podpůrných buněk nebo pojivových tkání jsou označovány jako sarkomy . HPHP
1.1.1. Mechanismus kancerogenese Podstatou bezchybného ontogenetického vývoje a diferenciace buňek každého mnohobuněčného organizmu je průběžná regulace exprese genů v buňkách, tedy regulace transkripce (přepisu DNA do RNA), posttranskripčních úprav, translace (produkce proteinu dle informace obsažené v RNA) a posttranslačních úprav. Geny kódující proteiny, které se zapojují do této regulace (růstové faktory, receptory, proteinkinasy, transkripční faktory), se nazývají protoonkogeny; produkty těchto genů jsou pak označovány jako protoonkoproteiny (Klener 1996). Vedle protoonkoproteinů se P
HHP
na regulaci buněčného cyklu podílí také tumorové supresorové geny,
2
jejichž produkty působí jako přirozená „brzda“ proliferace somatických buněk (Klener 1996).
P
HHP
Zjednodušeně lze říci, že k maligní transformaci buňky dochází v důsledku změny (mutace) v protoonkogenech a tumorových supresorových genech. Kromě přirozeně P
HHP
vznikajících chyb při replikaci může být DNA poškozena také působením vnějších faktorů. Příklady různých typů poškození DNA jsou uvedeny na obrázku 1.1. (Stiborová a Mikšanová 1999). Mezi hlavní faktory zvětšující pravděpodobnost vzniku nádorů patří faktory fyzikální (radioaktivní, kosmické, UV a Rentgenovo záření; některé druhy velmi jemných pevných částic, např. azbestu nebo sloučenin berylia atd.), dále biologické vlivy (genetické předpoklady a některé viry – odhaduje se, že až 15 až 20 % případů rakoviny je způsobeno onkoviry), a také chemické kancerogeny. V současnosti existuje řada důkazů, že chemické karcinogeny (ať synthetické či látky přírodního původu) hrají v etiologii nádorových onemocnění významnou úlohu. Do lidského organismu se dostávají např. z pracovního nebo životního prostředí, jako součásti potravy nebo jako léčiva. Z více než 600 rozdílných sloučenin, které byly hodnoceny z hlediska karcinogenity Mezinárodní organizací pro výzkum rakoviny (IARC) jich bylo přes padesát ohodnoceno jako karcinogeny vyvolávající nádorová onemocnění u člověka. Klíčovou otázkou je jakým mechanismem karcinogeny do procesů nádorového bujení (kancerogenese) zasahují. I přes bouřlivý rozvoj studia této problematiky není dosud mechanismus karcinogenity některých kancerogenů plně objasněn. Chemické karcinogeny lze podle mechanismu působení rozdělit do tří skupin. První skupinu representují genotoxické karcinogeny, které tvoří kovalentní adukty s DNA. Karcinogeny druhé skupiny způsobují změny struktury molekul DNA jako jsou jednoa dvou-řetězové zlomy (single- and double-strand break). Dále pak změny struktury DNA, které jsou vyvolány bifunkčními činidly způsobující tzv. „cross-linking“ (propojení molekul), a to „DNA-DNA cross-linking“ (intra- i intermolekulární) nebo „DNA-protein cross-linking“. Třetí skupinou jsou epigenetické karcinogeny, které modifikují molekuly DNA nekovalentními interakcemi. Jde např. o látky označované jako interkalátory, které se vmezeřují do dvoušroubovicové struktury DNA (Stiborová a Mikšanová 1999). Z 90 % je působení chemických kancerogenů vázáno na tvorbu kovalentních aduktů (kovalentní vazbu karcinogenů nebo jejich metabolitů na báze nebo deoxyribosu DNA), méně často je modifikací apurinace a apyrimidinace DNA, „cross-linking“, tvorba hydroxyderivátů bází (oxidativní léze vyvolané radikálovými formami kyslíku), vznik cyklických aduktů, interkalátů nebo pyrimidinových dimerů.
3
Ačkoliv většina modifikací (DNA aduktů) je z DNA eliminována opravnými mechanismy, některé perzistentní adukty často způsobují permanentní mutace v důležitých genech kontrolujících růst, což resultuje v aberantní buněčný vývoj a kancerogenní procesy. Za klíčové pro iniciaci kancerogenese jsou považovány mutace způsobené karcinogeny v onkogenech a tumorových supresorových genech (antionkogenech). Vzhledem k tomu, že modifikace molekul DNA jsou považovány za kritický krok kancerogenese, jsou hledány postupy, jak je detegovat a jak jejich vzniku zabránit.
Obrázek 1.1. Příklady mechanismů poškození DNA různými vnějšími faktory (Stiborová a Mikšanová 1999)
Většina karcinogenů tvořících adukty s DNA vyžaduje metabolickou aktivaci. Z tzv. pro-karcinogenních forem jsou přeměňovány na formy reaktivní, ultimativní, které tvoří vlastní kovalentní adukty. Za nejdůležitější enzymy aktivující prokarcinogeny na ultimativní karcinogeny jsou považovány monooxygenasy (oxidasy) se smíšenou funkcí lokalizované v endoplasmatickém retikulu a obsahující hemové enzymy, cytochromy P450 (CYP). V některých orgánech (tkáních) chudých na cytochromy P450 pak tuto funkci plní samostatně působící hemové enzymy peroxidasy [nespecifické i specifické - např. myeloperoxidasa, laktoperoxidasa, prostaglandin H synthasa]. V aktivaci jiných karcinogenů hrají úlohu i některé reduktasy [např. NADPH:CYP reduktasa, xanthinoxidasa, NAD(P)H:chinon- oxidoreduktasa (DT-diaforasa)] (Stiborová 2002). Buňka, ve které došlo k mutaci DNA vedoucí k aktivaci onkogenů a deaktivaci tumor supresorových genů a toto poškození DNA nebylo opraveno reparačními enzymy, je označována jako buňka iniciovaná. Pokud iniciovanou buňku nezlikviduje ani imunitní systém, setrvává v organismu do doby, než se v důsledku exposice faktorům s promočním
4
účinkem ještě více změní její genetická informace a dojde k proliferaci buněk s porušenou diferenciací a mezibuněčnou komunikací. Vzniká benigní nádor. Klíčovými faktory promoční fáze (zvýšené proliferace primárně pozměněných buněk) jsou především aktivity proteinkinas a fosfatas a jejich regulace. Růst nádoru ovlivňují i další faktory, zejména produkty onkogenů uvolňované po aktivaci (derepresi) onkogenů buď onkogenním virem nebo jiným kancerogenním podnětem. Takovým dalším podnětem mohou být i oxidativní změny DNA, způsobené radikálovými formami kyslíku. Jejich vznik často resultuje z reakcí (oxidačních i redukčních), kterými jsou karcinogeny nebo další sloučeniny participující na této fázi kancerogenese (tzv. promotory) metabolizovány. V důsledku reakcí katalyzovaných např. prostřednictvím cytochromů P450 je tvorba kyslíkových radikálů součástí reakčního mechanismu. Vznik radikálových forem kyslíku je rovněž podmíněn aktivitami peroxidas, vznikají i při redukčních reakcích některých xenobiotik, např. aromatických nitrosloučenin a chinonů (Stiborová a Mikšanová 1999). Progresní fázi kancerogenese můžeme zjednodušeně přirovnat k fázi iniciační. Procesy modifikace DNA jsou však v progresní fázi razantnější. Ve fázi progrese je maligní transformace buněk finalizována. Působením progresoru se totiž mění dosud částečně kontrolovatelný růst benigního nádoru na růst nekontrolovatelný, vzniká maligní nádor, který infiltruje i do sousedních tkání a likviduje je (Klener 1996). Buňky odštěpené z maligního nádoru se mohou dostat krevními nebo mízními cestami do jiných tkání nebo orgánů, kde se mohou usadit a vytvářet dceřinné nádory (metastázy). Schematické znázornění procesu kancerogenese ukazuje obrázek 1. 2.
1.2. Enzymy metabolizující xenobiotika (karcinogeny) Metabolická přeměna xenobiotik (toxikantů, karcinogenů, léčiv) vstupujících do organismu je do určité míry určena jejich rozpustností ve vodě či tucích. Látky lipofilního charakteru, které procházejí membránami a může tedy docházet k jejich kumulaci v organismu, nemohou být z těla vyloučeny přímo, ale musí být nejdříve přeměněny na látky s vyšší polaritou. Tyto hydrofilnější metabolity nemusí být jen netoxické, biologicky inertní látky. V závislosti na chemické struktuře daného xenobiotika a enzymovém systému, který přeměňuje danou látku v organismu, se naopak může jednat o látky značného biologického významu. Místo detoxifikace dané látky tedy dochází k její aktivaci. Takovou metabolickou aktivaci vyžaduje řada léčiv, ale aktivováno je též 98 % genotoxických kancerogenů (Stiborová 2002).
5
Obrázek 1. 2. Schéma vícestupňového procesu kancerogenese (Stiborová a Mikšanová 1999)
Procesy detoxikační a aktivační (v pozitivním i negativním smyslu) nelze od sebe vzájemně oddělit – tentýž enzym může být angažován např. v detoxikaci jedné chemické látky a přitom zvyšovat toxicitu látky jiné. Mezi oběma směry metabolismu existují velice složité vztahy rovnováhy, které mohou být v důsledku působení zevních i vnitřních faktorů snadno vychýleny na tu či onu stranu. Biotransformace xenobiotik u různých organismů není totožná. Pro daný organismus jsou důležité integrita a směr metabolismu xenobiotika, které určují stupeň toxicity tohoto xenobiotika pro daný organismus. U živočichů dochází k biotransformaci xenobiotik ve dvou fázích. V první fázi, nazývané derivatizační, dochází ke zvýšení polarity xenobiotika. Ve druhé fázi biotransformace dochází ke konjugaci těchto polarisovaných molekul s endogenními látkami (kyselina glukuronová, glycin, taurin, aktivní sulfát, glutathion, cystein, aktivní acetát atd.) (Stiborová 2002).
P
P
Mezi enzymy katalyzující derivatizační reakce xenobiotik patří jednak enzymy mikrosomální frakce (subcelulární systém získaný destrukcí endoplasmatického retikula při homogenizaci buněk), tak cytosolu (tímto pojmem je označován roztok cytoplasmy a isolačního pufru). Klíčovým enzymovým systémem I. fáze biotransformace je mikrosomální systém monooxygenas se smíšenou funkcí (MFO) obsahující cytochrom P450. V druhé fázi biotransformace označované také jako konjugační jsou na funkční skupiny vytvořené v derivatizační fázi vázány malé hydrofilní molekuly. Tímto krokem se
6
ještě zvýší polarita původně hydrofobní molekuly a usnadní se tím její vyloučení z organismu. Exkrece nejčastěji probíhá močí a žlučí. Za výraznou součást antikancerogenních procesů je považován enzym glutathion-S-transferasa, která je schopna vázat reaktivní metabolity, zvláště pak epoxidy, a katalyzovat jejich vazbu s glutathionem. γ-Glutamylový zbytek je odštěpen P
P
v ledvinách a glycylový v játrech (méně často se tvoří konjugáty přímo s cysteinem za katalysy transpeptidasou); cysteylový zbytek je dále acetylován za vzniku merkapturové kyseliny, která již může být vyloučena močí. Glutathion a cystein jsou považovány za “scavengery” (vychytávače) cizorodých látek.
P
Výkaly jsou vylučovány například konjugáty látek fenolické povahy se sulfátem nebo konjugáty karboxylových kyselin s glycinem nebo taurinem. Touto cestou také dochází k vyloučení kyseliny cholové, která je finálním produktem degradace endogenních steroidních látek. Také v II. fázi biotransformace však může dojít k aktivaci xenobiotika na toxičtější sloučeninu. Tak je tomu např. u konjugátů se sulfátem vznikajících z N-hydroxylovaných aromatických aminů účinkem sulfotransferas (sulfát musí být pro konjugační reakci nejprve aktivován na 2’-(nebo 3’-)fosfoadenosin-5’-fosfosulfát - PAPS) či N-cetyltransferas. Konjugát sulfátu (acetátu) s N-hydroxysloučeninami (z první fáze biotransformace) je v kyselém prostředí moči nestabilní a rozpadá se za vzniku nitreniového (event. karbeniového) iontu; vzniká tedy elektrofil reagující s DNA a proteiny (Stiborová 2002). Většina biotrasnformačních enzymů vykazuje značnou inducibilitu. Mnoho xenobiotik indukujících enzymy I. fáze metabolické přeměny je schopno současně indukovat i enzymy fáze konjugační. Obecně je však indukce enzymů I. fáze vyšší a lze tedy předpokládat určitou nerovnováhu mezi rychlostí vzniku reaktivních meziproduktů a rychlostí jejich inaktivace konjugací. Existují však i látky nebo komplexní faktory, které výlučně nebo převážně indukují enzymy II. fáze (přirozené látky v rostlinné stravě). Je evidentní, že faktory stimulující konjugační enzymy mají nesmírný protektivní význam.
P
1.2.1. Mikrosomální monooxygenasový systém (MFO systém) Mikrosomální monooxygenasový systém je soubor enzymů katalyzující celou řadu oxidačních, oxygenačních, popř. redukčních reakcí, přičemž využívá především molekulární kyslík. Je též nazýván systémem oxidas se smíšenou funkcí (mixed function
7
oxidases = MFO systém). Má tři základní složky: flavoproteinový enzym NADPH:cytochrom P450 reduktasu která slouží jako dělič elektronového páru, hemthiolátový enzym cytochrom P450 a jeho neméně důležitou součástí je též biologická membrána. Membránové lipidy způsobují konformační změny cytochromu P450 zvyšující jeho afinitu k substrátu, stimulují tvorbu funkčně aktivního komplexu cytochrom P450-NADPH:cytochrom P450 reduktasa a jsou “zásobárnou” uložených hydrofobních substrátů cytochromu P450. Fakultativně může MFO systém obsahovat také cytochrom b 5 P
P
B
a NADH:cytochrom b 5 reduktasu.
B
B
B
Název cytochrom P450 neoznačuje produkt pouze jednoho genu. Dnes je známo kolem 1000 různých genů pro enzymové formy cytochromu P450. Tyto formy jsou na základě podobnosti aminokyselinové sekvence, tedy nikoli na základě podobnosti substrátů, rozděleny do rodin (sekvenční homologie větší než 40 %) a podrodin (homologie větší než 60 %). Současná nomenklatura cytochromů P450 byla zavedena Nebertem a spolupracovníky (Nelson et al. 1996). Pro cytochrom P450 se používá zkratka CYP , za ní následuje číslo označující rodinu (např. CYP 1 ), písmeno označující podrodinu
U
U
U
U
(CYP1 A ) a poslední číslo označuje konkrétní gen (CYP1A 1 - geny bývají označovány U
U
U
U
kurzívou) či enzym (CYP1A 1 ). U
U
V roce 1999 bylo odhadováno, že člověk má ve svém genomu 50 druhů isoforem CYP, v současné době (hlavně díky dokončení sekvenace lidského genomu) je známo 57 isoforem cytochromů P450, u třech z nich je navíc možný alternativní sestřih. Také bylo identifikováno 58 pseudogenů (tedy nefunkčních kopií) CYP. Geny pro CYP jsou roztroušeny na všech lidských chromosomech s výjimkou chromosomu Y. Cytochromy P450 přítomné v lidském organismu jsou klasifikovány do 17 rodin.
P
P
Metabolismu xenobiotik se účastní cytochromy P450 pouze tří z těchto rodin: CYP1,
CYP2 a CYP3 (v menší míře též rodina CYP4). Ostatní rodiny participují na biosynthese steroidů, cholesterolu či žlučových kyselin, na metabolismu mastných kyselin, kyseliny arachidonové apod.. Aktivity jednotlivých lidských forem cytochromu P450 vykazují značné interindividuální rozdíly, způsobené zejména dvěma faktory, genetickým polymorfismem (změna genotypu) a změnou exprese genu (změna fenotypu). Dokonalé poznání metabolických aktivit a specifity jednotlivých forem napomáhá jednak k účelnější farmakotherapii (modulace účinku léčiva, snížení jeho vedlejších účinků), ale také k prevenci rizika rakoviny (zjišťování genetických dispozic u jedinců exponovaných různým cizorodým látkám apod.)
8
1.2.2. Cytoplasmatické derivatizační enzymy 1.2.2.1. Peroxidasy Peroxidasy (donor:hydrogenperoxid oxidoreduktasy) jsou enzymy katalyzující detoxifikaci peroxidu vodíku (případně organických peroxidů) za současné oxidace jiné látky. Oxidovanými substráty, ať již původu endogenního či xenobiotika, mohou být jak látky organické (typicky fenoly a aromatické aminy) (Stiborová et al. 2000), tak anorganické (halogenidy). Peroxidasy jsou většinou hemoglykoproteiny s kovalentně vázaným hemem b, pátým ligandem železa je dusík histidylového zbytku apoproteinu (Stiborová et al. 2000). Typickou vlastností peroxidas je katalysa velkého množství různých typů reakcí, kterými substráty přeměňuje. Hemové peroxidasy je možno na základě sekvenční homologie rozdělit do dvou superrodin: do první superrodiny patří hemové peroxidasy hub, rostlin a bakterií, druhou superrodinu tvoří peroxidasy živočišné. Ty se vyskytují zejména v kostní dřeni, mozku a myelinových pochvách nervů (myeloperoxidasa), v buňkách štítné žlázy (jodoperoxidasa), která se zde účastní biosynthesy hormonů), v močovém měchýři a semenných váčcích [prostaglandinendoperoxidsynthasa (PES, PHS), participující na biosynthese prostaglandinů, tromboxanů a prostacyklinů]. V buňce jsou peroxidasy lokalizovány zejména v cytoplasmě, ale aktivita peroxidas byla zjištěna i v endoplasmatickém retikulu a Golgiho aparátu. Typickými reakcemi, které jsou katalyzovány peroxidasami jsou jednoelektronové oxidace. Radikály, které vznikají v průběhu oxidace substrátů často reagují s dalšími látkami přítomnými v roztoku jako např. s O 2 a řadou dalších nízkomolekulárních látek. B
B
Některé rovněž ochotně napadají nukleofilní centra biologických makromolekul (hlavně proteinů a nukleových kyselin). Právě pro enzymy dosti netypická vlastnost peroxidas, tedy uvolňování silně reaktivních meziproduktů do roztoku, kde pak tyto reagují bez jakékoliv enzymové katalysy, může být s výhodou využita při studiu metabolismu xenobiotik těmito enzymy. Není totiž vždy potřeba pracovat jen s určitou zájmovou, často jen obtížně dostupnou peroxidasou, stačí použít jinou, snáze dostupnou peroxidasu (např. křenová peroxidasa), pokud je také schopna dostatečně efektivně oxidovat příslušný substrát na radikálové meziprodukty. Spektrum získaných produktů nebo například aduktů s DNA je pak, v důsledku absence enzymové kontroly nad radikálovými reakcemi probíhajícími v roztoku, s vysokou pravděpodobností identické jako u reakcí katalyzovaných ostatními peroxidasami.
9
1.2.2.2. NAD(P)H:chinonoxidoreduktasa Cytoplasmatický enzym NAD(P)H:chinonoxidoreduktasa (DT-diaforasa), je flavoprotein katalyzující dvouelektronové redukce chinonů a chinoidních sloučenin na hydrochinony (bez tvorby radikálů). Jako donor elektronů může využívat s obdobnou efektivitou NADH i NADPH. Enzym je homodimer, v každém aktivním centru má jednu prosthetickou skupinu FAD. Chinoidní sloučeniny, vznikající například biotransformací benzenu či benzo[a]pyrenu, se mohou kovalentně vázat na DNA, RNA nebo proteiny. NAD(P)H:chinonoxidoreduktasa katalyzuje dvouelektronové redukce chinonů na hydrochinony, které jsou následně inaktivovány CDP-glukuronosyltransferasami. Vedle P
P
redukce chinonů redukuje NAD(P)H:chinonoxidoreduktasa rovněž jiná nízkomolekulární xenobiotika, kupříkladu nitrosloučeniny a azobarviva. Aktivita tohoto enzymu bývá P
zvýšena v nádorových buňkách (Stiborová 2003).
P
P
NAD(P)H:chinonoxidoreduktasa je také účinnější za anaerobních podmínek, které jsou typické pro maligně transformované buňky (Patterson et al. 1999). Na příkladu některých karcinogenních látek studovaných v laboratořích katedry biochemie PřF UK je v následujících kapitolách ukázán význam studia enzymů biotransformujících xenobiotika pro poznání mechanismu chemické karcinogenese a pro vývoj nových protinádorových léčiv.
2. 1. Využití studia oxidačních reakcí katalyzovaných cytochromy P450 a peroxidasami k poznání mechanismu působení karcinogenního azobarviva Sudanu I V poznání mechanismu působení karcinogenního azobarviva 1-fenylazo2-hydroxynaftalenu (Sudanu I, Solvent Yellow 14), hrála v prvé fázi výzkumu klíčovou úlohu specifikace jednotlivých isoforem cytochromu P540 a peroxidas participujících na jejich oxidaci a řešení mechanismů reakcí jimi katalyzovaných. Dále pak detekce a charakterizace aduktů tvořených z reaktivních metabolitů studovaných látek s DNA. Sudan I je karcinogenem vyvolávajícím nádory jater a močového měchýře u experimentálních zvířat (myš, potkan, králík) (IARC 1975), jeho karcinogenní efekt pro lidský organismus však není dosud znám. Sudan I je i kontaktním alergenem (pro člověka a morče). V experimentech na morčatech byla zjištěna silná kožní alergenicita Sudanu I 10
a je zajímavé, že podobné účinky na kůži měl i metabolit Sudanu I, 4´-OH Sudan I. Ve styku s kůží člověka může Sudan I vyvolat “sensitizaci” (zcitlivění kůže na jiné sloučeniny) a/nebo alergickou reakci (kontaktní dermatitidu). Ta může přetrvávat ještě několik měsíců po přerušení kontaktu s alergenem (Stiborová 2003). Působení Sudanu I a jeho derivátů jsou vystaveny nejen pracovníci chemických provozů jeho výroby a zpracování, ale i daleko větší část lidské populace. Především používáním materiálů barvených Sudanem I a jeho deriváty, jako jsou např. rozpouštědla, oleje, tuky, vosky, čistící prostředky, tiskařská barviva (IARC 1975). Navíc, zájem o vliv této sloučeniny na lidský organismus vzrostl enormně před několika měsíci (únor 2005). Denní tisk ve Spolkové republice Německo a Velké Britanii přinesl šokující informace. Sudan I je opět používán k barvení potravin. A to i přesto, že bylo jeho používání k barvení potravin vzhledem k jeho karcinogenitě zakázáno již v roce 1975. Je používán k barvení některých potravin produkovaných italskými firmami, konkrétně omáček užívaných k těstovinovým jídlům v zemích Europské unie. Azobarviva patří do velké skupiny karcinogenů, které pro svůj karcinogenní efekt vyžadují metabolickou aktivaci (produkci reaktivních metabolitů iniciujících poškození DNA tvorbou kovalentních aduktů s DNA). Sudan I je metabolizován především v játrech, a to prostřednictvím oxidačních i redukčních reakcí. Oxidace Sudanu I in vivo (králík, potkan) resultuje ve tvorbu hydroxylovaných metabolitů, a to v poloze 4 benzenového kruhu a poloze 6 naftalenové části jeho molekuly. Hydroxylace na atomech uhlíku aromatických kruhů Sudanu I byly donedávna také považovány za reakce detoxikační. Oba nalezené deriváty jsou totiž z organismu ve formě sulfátů či glukosiduronátů rovněž snadno vylučovány (Childs a Clayson 1966). In vitro jsou ze Sudanu I tvořeny i dihydroxyderiváty 4´,6-dihydroxySudan I a 3´,4´-dihydroxy-Sudan I a produkt oxidačního štěpení azoskupiny Sudan I, benzendiazoniový ion (Obr. 2.1.). Výše uvedené oxidace Sudanu I in vitro jsou katalyzovány mikrosomálními subcelulárními systémy jater laboratorního potkana obsahujícími cytochromy P450. Vedle mikrosomálních cytochromů P450 je Sudan I oxidován in vitro i dalšími enzymy, peroxidasami. V tomto případě reakce probíhají jednoelektronovými oxidacemi (primárně je tvořen naftoxyradikál Sudanu I) (Stiborová 2003). V průběhu oxidačních reakcí katalyzovaných oběma enzymovými systémy je Sudan I aktivován na reaktivní metabolity, které se kovalentně vážou na nukleové kyseliny (DNA, tRNA), polydeoxyribonukleotidy a proteiny in vitro a na DNA in vivo. Sudan I je tedy
11
karcinogenem působícím genotoxickým mechanismem. Reaktivní metabolit Sudanu I, který je tvořen oxidační reakcí katalyzovanou cytochromy P450 byl naším výzkumem odhalen. Jedná se o benzendiazoniový ion, vznikající oxidačním štěpením azoskupiny. Jednoznačně jbylo prokázáno, že benzendiazoniový ion reaguje se zbytky guaninu v DNA za tvorby stabilního aduktu, jehož struktura byla určena jako 8-(fenylazo)guanin (Obr. 2.1.). Zjištěný adukt může být zodpovědný za iniciaci karcinogenního procesu vyvolaného Sudanem I v jednom z cílových orgánů, játrech, neboť byl nalezen v DNA jater potkanů vystavených působení Sudanu I (Stiborová 2003). Adukty nalezené v DNA močového měchýře laboratorních potkanů exponovaných Sudanu I neodpovídají 8-(fenylazo)guaninovému aduktu nalezenému po aktivaci Sudanu I cytochromy P450 (Stiborová et al. 1999). V tomto dalším cílovém orgánu musí tedy být za iniciaci kancerogenese zodpovědné metabolity jiné než je benzendiazoniový ion. Adukty Sudanu I v DNA močového měchýře vznikají jednoelektronovými (radikálovými) oxidacemi Sudanu I a jeho derivátů peroxidasami. Z metabolitů zodpovědných za tvorbu aduktů generovaných peroxidasami byl dosud určen pouze jeden. Jde o radikál tvořený z primárního naftoxylového radikálu delokalisací elektronů v konjugovaném systému molekuly (Stiborová 2003). H
Peroxidase 4'
DNA, RNA and protein adducts
(CYP3A)
CYP1A1
N
(CYP3A)
Sudan I
CYP1A1 Peroxidase
O
N
N
H HO
N
HO N
+
Benzendiazonium Naphthalene-1,2-diol ion
O
N
+
6
CYP1A1 (CYP3A)
H
HO
O
N N
O O
6-OH-Sudan I
OH
CYP
CYP
+ DNA
4'-OH-Sudan I CYP
1,2-Naphthoquinone O
H HO
HO
O
H
N HO
N
N
N
HN
O
N
H2N
N N
N
N
DNA OH
4',6-diOH-Sudan I
3',4'-diOH-Sudan I
+
unknown adducts
8-Phenylazoguanine in DNA
Obrázek 2. 1. Metabolismus Sudanu I
Poslední výsledky výzkumu této problematiky, získané pomocí hmotnostních analys a metod NMR, dosud nevedly k totální charakterisaci aduktů tvořených ze Sudanu I
12
a deoxyguanosinu (guanosinu) v nukleových kyselinách. Výsledky pouze napovídají potenciální strukturu jednoho z aduktů, jmenovitě majoritního guaninového aduktu. Analysy získané pomocí NMR sice jasně prokazují, že Sudan I se váže na guanin v poloze 4 naftaleného kruhu své molekuly, poloha vazby v molekule guaninu však dosud není jednoznačně určena. Radikál Sudanu I se váže buď na exocyklickou OH- či NH 2 skupinu B
B
guaninu, či atom dusíku v poloze mezi těmito skupinami (Stiborová 2003).
2. 2. Úloha oxidačních a redukčních reakcí katalyzovaných cytochromy P450, peroxidasami, NAD(P)H chinonoxidoreduktasou a xanthioxidasou v aktivaci a detoxikaci karcinogenních nitrosloučenin, rostlinných produktů aristolochových kyselin Studium metabolismu aromatických nitrosloučenin (aristolochových kyselin, AAI a AAII) vedla k důkazu, že jsou obě tyto přírodní sloučeniny molekulární příčinou ledvinného selhání a nádorových procesů v onemocnění „Chinese herbs nephropathy“ a Balkánské endemické nefropathie. Výsledky jsou příkladem, že poznání molekulárních interakcí karcinogenů s aktivačními enzymy a DNA může přispět k vysvětlení etiologie některých závažných chorob. V komplexní studii se podařilo identifikovat aristolochové kyseliny jako příčinu nově popsané ledvinné intersticiální fibrosy provázené nádorovým onemocněním močových cest. Tato choroba byla poprvé zjištěna u žen, které se podrobily „léčebné“ kůře kontrolované redukce tělesné hmotnosti na jedné z Bruselských klinik (Vanherweghem et al. 1993). Označeno bylo jako „Chinese herbs nephropathy“, podle čínských bylin (u nichž bylo později zjištěno, že obsahují aristolochové kyseliny), kterými byla dieta doplněna počátkem devadesátých let. Ledvinné selhání resultovalo u řady pacientek k transplantaci ledvin. Onemocnění však pokračuje dále, dochází k vývoji nádorů močových cest. V současnosti byl navíc výskyt uvedené choroby popsán i v jiných zemích, přičemž vždy byla dána do souvislosti s konzumací potravin (potravních doplňků) obsahujících aristolochové kyseliny. K vysvětlení příčiny tohoto onemocnění jednoznačně přispěla studie řešící metabolickou aktivaci AAI a AAII enzymovými systémy resultující v tvorbu reaktivních intermediátů generujících adukty s DNA in vitro a in vivo. Majoritní adukty tvořené s deoxyguanosinem a deoxyadenosinem v DNA, jejichž struktura byla určena jako 13
7-(deoxyadenosin-N 6 -yl)-aristolaktam (dA-AA) a 7-(deoxyguanosin-N 2 -yl)aristolaktam P
P
P
P
(dG-AA) byly nalezeny v DNA ledvin a močové trubice pacientek trpících uvedenou chorobou. Posloužily tak jako přímý důkaz, že původcem choroby jsou aristolochové kyseliny. Z komplexního výzkumu (Arlt et al. 2002b) bylo zjištěno, že v iniciaci nádorových procesů vyvolaných aristolochovými kyselinami hraje majoritní úlohu perzistentní adukt 7-(deoxyadenosin-N 6 -yl)-aristolaktam I, který v organismu potkana P
P
způsobuje mutace v H-ras onkogenu a u člověka mutace tumorového supresorového genu p53 (Obr. 2.2.). Získané výsledky navíc otevírají další možnost využití poznatků ze studia mechanismu karcinogenity aristolochových kyselin. Konkrétně poznání příčin i dalšího ledvinného a nádorového onemocnění, Balkánské endemické nefropathie. Průběh této choroby je nápadně podobný průběhu onemocnění „Chinese herbs nephropathy“ a ve vědecké literatuře je její etiologie presentována jako „bílé místo na mapě příčin lidských chorob“. I když chorobou trpí značná část balkánské populace žijící v určitých oblastech podél Dunaje, o její příčině bylo dosud pouze spekulováno. COOH
O
NO2
O
Obrázek 2.2. Mechanismus OCH3
karcinogenity
aristolochic acid I
aristolochový
xanthine oxidase DT-diaphorase NADPH:CYP reductase CYP1A1, CYP1A2 peroxidases prostaglandin H synthase
metabolic activation
ch kyselin v organismu potkana a
O
člověka
O H3CO
dA-AAI
N NH
N
AAI
H-ras
rat forestomach
N
NH N
HO H H
OH
O
H H
H
C O
human urothelial tissue
persistent incorporation of dA opposite dA-AAI (AT→TA transversion mutation)
DNA replication
mutation cancer 14
p53
AAI
Extensivní epidemiologické a genetické studie signalisují multifaktoriální původ této nefropathie. Nedávné výsledky podporují předpoklad, že aristolochové kyseliny a ochratoxin A mohou být příčinou Balkánské nefropathie. Prekarcinogenní léze (adukty v DNA) generované aristolochovými kyselinami byly (vedle lézí tvořených ochratoxinem A) nalezeny v DNA vzorků ledvin několika jedinců žijících v oblasti postižené balkánskou nefropatií a vykazujících příznaky této choroby (Arlt et al. 2002a). Získané poznatky jsou vysoce slibné pro další výzkum a pro vysvětlení etiologie tohoto onemocnění.
2.3. Studium oxidace protinádorového léčiva ellipticinu odhaluje nový mechanismus jeho působení a vede ke konstrukci nových léčiv Studium metabolismu cizorodých látek vedla i k odhalení nového mechanismu působení protinádorového léčiva ellipticinu, vysvětlující jeho selektivitu vůči určitým typům neoplasie. Ellipticin (5,11-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]karbazol) a některé jeho deriváty jsou alkaloidy vykazující významnou protinádorovou aktivitu. Ellipticin samotný a jeho polárnější deriváty 9-hydroxyellipticin a 2-methyl-9-hydroxyellipticin (ve formě acetátu) jsou užívány zejména k léčení pokročilého karcinomu prsu s kostními metastázami a akutní myeloblastické leukémie (Auclair 1987). Důvody zájmu o ellipticin pro klinické použití jsou dva: 1) vysoká účinnost proti nádorovým onemocněním (cytotoxický vůči určitým typům nádorových buněk je ellipticin již v koncentracích 0.1
M) a 2) jeho nízké
vedlejší účinky. Až na nefrotoxicitu podobnou svým mechanismem vzniku nefrotoxicitě cisplatiny, jsou vedlejší toxické účinky ellipticinu minimální. Ellipticin byl pro studium vybrán z důvodu, že se jedná o protinádorové léčivo, jehož mechanismus účinku není ještě přesně rozluštěn. Předpokládá se, že převládajícími mechanismy protinádorového účinku ellipticinu jsou (i) interkalace do dvojšroubovicové struktury DNA, která vyplývá z velikosti a tvaru jeho molekuly a (ii) jeho působení jako inhibitoru topoisomerasy II (Auclair 1987). Ellipticin a 9-hydroxyellipticin také způsobují selektivní inhibici fosforylace produktu tumorového supresorového genu, proteinu p53 (Ohashi et al. 1995). Inhibice fosforylace proteinu p53 je pravděpodobně způsobena inhibicí specifické cyklin-dependentní kinasy. Nahromadění defosforylovaného proteinu p53 pak může vyústit v indukci apoptózy. Vedle uvedených mechanismů může ellipticin
15
fungovat i mechanismem dalším. Inhibuje oxidační fosforylaci, která vede ke drastickému snížení obsahu ATP v buňkách, což resultuje v jejich zánik (Schwaler et al. 1995). Všechna uvedená vysvětlení mechanismu protinádorové aktivity ellipticinu jsou založena na nespecifickém působení. Interkaluje do DNA jak buněk nádorových tak i zdravých a inhibice topoisomerasy II rovněž probíhá ve všech buňkách bez ohledu na jejich zdravotní stav. Analogické nespecifické působení se projevuje i u ostatních dosud zjištěných principů účinku ellipticinu. Tato skutečnost je však v rozporu s poměrně úzkou specifitou jeho účinku vůči nádorovým onemocněním. Je specifický pouze k určitým typům neoplasie. Vykazuje rovněž nízké vedlejší (toxické) účinky. Navíc, dosud poznané principy účinku tohoto léčiva (např. interkalace, inhibice toposisomerasy II) jsou typické pro daleko slabší kancerostatická agens než jakým je ellipticin. Specifické působení ellipticinu s vysokou efektivitou proti nádorovým buňkám musí tedy vycházet (být odvozeno) ještě z principů jiných, dosud neodhalených. Výsledky získané v naší laboratoři zcela zásadně mění pohled na mechanismus účinku studovaného protinádorového léčiva. Zjistili jsme, že ellipticin může působit jako „pro-léčivo“ („pro-drug“), které je metabolicky aktivováno enzymy exprimovanými v cílových nádorových tkáních (nádory prsu a leukemické buňky) na biologicky účinnější deriváty. V buňkách lidských prsních nádorů jsou exprimovány cytochromy P450 1A1, 2B6, 2E1 a 3A4 (Murray 2000, El-Rayes et al. 2003), přítomny i peroxidasy, laktoperoxidasa a prostglandin H synthesy (Williams a Phillips 2000). V řadě leukemických buněk je pak exprimována jiná peroxidasa, myeloperoxidasa. Enzymově katalyzovanou oxidací je ellipticin aktivován na metabolity, které generují kovalentní adukty s DNA in vitro (Obr. 2.3.) a in vivo. A
B
aduktů ellipticinu tvořených in vitro s DNA
2 1
2 1
Obrázek 2.3. Autoradiografie majoritních po aktivaci cytochromy P450 člověka (A), králíka (B) a potkana (C) a bez enzymové aktivace (D), detekované metodou „32P-
C 2 1
D
postlabeling“
2
16
Tak silná modifikace DNA jako je tvorba kovalentních aduktů s DNA jasně vysvětluje vysokou efektivitu tohoto protinádorového agens. Kovalentní adukty aktivovaného ellipticinu s DNA byly jednoznačně prokázány, a to dvěma nezávislými metodami (pomocí vazby radioaktivního, tritiovaného, elipticinu a pomocí metody „ 32 PP
P
postlabelingu“, Obr. 2.3.). Tvorba jednoho – majoritního - aduktu v DNA (adukt 1 na obrázku 4.10.) je totálně závislá na aktivaci elipticinu cytochromy P450 či dalšími hemovými enzymy, peroxidasami. Minoritní adukt vzniká z ellipticinu vedle enzymově závislé katalysy rovněž autooxidací. Z experimentů in vitro a in vivo byly identifikovány isoformy cytochromu P450, které jsou za aktivaci ellipticinu zodpovědné. Z komplexního výzkumu, který kombinuje užití subcellulárních systémů a isolovaných enzymů, rovněž jako experimentů in vivo jsme zjistili, že za aktivaci ellipticinu jsou zodpovědné orthologní formy cytochromů P450 člověka a potkana. Jedná se především o CYP3A4 člověka a CYP3A1 potkana, dále pak CYP1A1/2 a popřípadě CYP1B1 obou biologických druhů. Tyto výsledky a další experimenty s aktivací ellipticinu peroxidasami přinášejí originální data, která zcela jednoznačně ukazují na nový mechanismus působení ellipticinu jako alkylačního (arylačního) činidla. Vzhledem k analogii enzymových systémů člověka a laboratorního potkana aktivujících ellipticin bylo jeho působení in vivo sledováno na modelu potkana. I v tomto případě bylo prokázáno, že ellipticin generuje adukty s DNA. Také in vivo bylo prokázáno, že je tvorba aduktů závislá na enzymové aktivaci studovaného léčiva. V těch tkáních, ve kterých jsou exprimovány nízké hladiny cytochromů P450 aktivujích ellipticin (CYP3A1, CYP1A1/2), je množství generovaných aduktů odpovídajícím způsobem nízké. Signifikantní korelace mezi expresí CYP3A1 a CYP1A1/2 a množstvím aduktů tvořených v DNA několika tkání laboratorního potkana plně potvrdila, že tyto enzymy zprostředkovávají aktivaci ellipticinu na metabolit kovalentně modifikující DNA i in vivo. Zcela nedávné výsledky navíc ilustrují, že adukty aktivovaného ellipticinu s DNA jsou tvořeny i v cílových nádorových tkáních. Adukty byly detekovány v DNA prsních nádorů vyvolaných u samic laboratorního potkana nitrosomethylmočovinou (Obr. 2.4.), přičemž množství aduktů bylo vyšší v nádorové tkáni (Tab. 2.1.). Adukty byly dále detekovány v DNA buněk lidských nádorových linií, jako jsou buňky lidského prsního adenokarcinomu - MCF-7 buňky a v DNA leukemických buněk HL-60 a CCRF-CEM. Výsledky experimentů využívajících lidské nádorové linie navíc signalizují, že aktivity cytochromů P450 a peroxidas, jež determinují aktivaci ellipticinu na reaktivní metabolity vázající se na DNA, korelují s cytotoxicitou tohoto protinádorového agens.
17
Zajímavým výsledkem je rovněž poznání, že ellipticin ovlivňuje hladiny enzymů, které jsou v organismu účinné v jeho metabolismu. Ellipticin působí jako induktor cytochromů P450 v organismu laboratorního potkana, jejichž exprese je ovlivněna Ah receptorem. Jedná se především o CYP1A1/2. Vlastní aplikace léčiva tedy může stimulovat jeho farmakologické působení. _____________________________ Tkáň
Adukt (RAL/10 -8 ) P
1
P
2
_____________________________ Nádorová
1.42
0.03
Normální
0.94
0.02
_____________________________
Tab. 2.1. Množství aduktů ellipticinu
Obr. 2.4. Autoradiografie DNA
v DNA nádorové a zdravé prsní
aduktů ellipticinu v prsních
tkáně samic laboratorního potkana
nádorech samic potkana po
léčených ellipticinem (RAL, „relative
léčení ellipticinem
adduct labeling“)
Ve světle faktu, že tvorba aduktů s DNA je prvým krokem karcinogenního procesu vyvolaného řadou sloučenin, za závažnou je třeba považovat otázku, zda adukty tvořené ze studovaného protinádorového agens s DNA jsou v léčbě pouze positivní skutečností či mohou-li iniciovat ve zdravých tkáních vedlejší genotoxické účinky. Z tohoto důvodu bylo sledováno, zda adukty tvořené z aktivovaného ellipticinu v DNA zdravých tkání jsou perzistentními lézemi, či jsou-li reparačními enzymovými systémy opravovány. Obrázek 2.5. ilustruje kinetiku oprav DNA poškozené adukty generovanými ellipticinem ve zdravých tkáních laboratorního potkana. Bifázová kinetika eliminace aduktu 1 (Obr. 2.5.), jakož i dalších, minoritních aduktů, jasně prokazuje, že adukty vyvolané ellipticinem v DNA zdravých tkání nejsou perzistentními adukty. Po léčení nádorové tkáně ellipticinem a zastavení jeho aplikace dochází tak k opravě poškozené DNA. Z analogie osudu ellipticinu v organismu potkana a člověka lze předpokládat, že tento positivní výsledek lze očekávat i u člověka. 18
Cílovým deoxynukleosidem modifikovaným aktivovaným ellipticinem v DNA je deoxyguanosin. Otázkou však zůstává struktura detekovaných deoxyguanosinových aduktů. Pionýrské experimenty sledující metabolismus ellipticinu cytochromy P450 a peroxidasami alespoň napovídají, které z jeho metabolitů tvoří uvedené adukty
Liver
Liver
10
7
10
log RAL x 10
log RAL x 10
7
log RAL x 10
7
v DNA.
Kidney Kidney
Lung Lung
1 1
1
0.1 0.1
0.1
0
50
100
150
200
250
0
50
days
100
150
200
250
0
50
100
150
200
250
days
7
log RAL x 10
7
log RAL x 10
log RAL x 10
7
days
Spleen Spleen
1
Heart Heart
Brain
Brain
0.1
0.1
0.1
0.01
0.01
0.01
0
50
100
150
200
250
days
0
50
100
150
200
250
0
50
100
days
150
200
250
days
Obrázek 4.12. Kovalentní adukty tvořené z ellipticinu v DNA zdravých tkání laboratorního potkana nejsou perzistentní adukty
Ellipticin je cytochromy P450 oxidován na pět metabolitů (Obr. 2.6.), jejichž struktura byla určena teprve nedávno (Stiborová et al. 2004); z nich je detoxikačním metabolitem 7-hydroxyellipticin, neboť nevykazuje žádnou cytotoxicitu. Za tvorbu jednotlivých metabolitů jsou zodpovědné různé formy cytochromu P450. 9hydroxyellipticin a 7-hydroxyellipticin jsou tvořeny především lidskými CYP1A1, 1A2 a 1B1, minoritní metabolit 12-hydroxyellipticin pak CYP3A4 a 2C9. 13-hydroxyellipticin a N(2)-oxid ellipticinu jsou generovány především prostřednictvím CYP3A4, metabolit M3 pak rovněž CYP2D6 (Obr. 2.6.). Za zcela zásadní výsledek považuji určení, které metabolty jsou zodpovědné za tvorbu obou aduktů ellipticinu s DNA. Zjistili jsme, že 13-hydroxyellipticin a N(2)-oxid ellipticinu tvoří přímo (bez aktivace) adukty s DNA (Stiborová et al. 2004). 13-hydroxyellipticin se váže na DNA za tvorby majoritního aduktu 1 a N(2)-oxid ellipticinu za tvorby minoritního aduktu 2 (Obr. 2.6.).
19
Detailně byla studována rovněž oxidace ellipticinu peroxidasami. I když je známo, že mechanismus reakcí katalyzovaných peroxidasami je odlišný od mechanismu oxidací substrátů cytochromy P450, ellipticin při oxidaci těmito enzymy tvoří majoritní adukty shodné s
Obr. 4.13. Oxidace ellipticinu cytochromy P450
adukty generovanými 13-hydroxyellipticinem a N(2)-oxidem ellipticinu (tedy produkty oxidace ellipticinu cytochromy P450) Zjistili jsme, že ellipticin je peroxidasami oxidován na primární radikál, který dále poskytuje dimer ellipticinu (Obr. 2.7.). Jako druhý oxidační metabolit byl detekován N(2)-oxid ellipticinu. Tedy tentýž metabolit jakým je produkt oxidace ellipticinu cytochromy P450, a který participuje na tvorbě aduktu dG2. Obrázek 2.15. Struktura dimeru ellipticinu tvořeného peroxidasami
Ze struktury dimerní molekuly ellipticinu byla určena struktura i primárního radikálu. Peroxidasa atakuje ellipticin na dusíku cyklického sekundárního aminu pyrolového kruhu ellipticinového skeletu. Vzniklý radikál se pak váže na další molekulu ellipticinu v poloze 9 jeho molekuly (Obr. 2.7.).
20
Výsledky získané při studiu mechanismu působení ellipticinu jsou důležité nejen proto, že přinášejí původní vědecké poznatky rozvíjející teoretické poznání. Jsou podstatné i z hlediska praktického. Poznání, že farmakologický účinek studovaného protinádorového léčiva je ovlivněn metabolickou aktivací v cílových nádorových tkáních, jinými slovy, že ellipticin působí jako „pro-léčivo“, u nějž je mechanismus cíleného zásahu založen na nezbytnosti metabolické aktivace, může být využita minimálně ve dvou směrech. V prvé řadě pro užití ellipticinu v genové therapii. Výzkum genové therapie závislé na aktivitách cytochromů P450 je v současnosti „hitem“ výzkumu řady laboratoří (Baldwin et al. 2003). Modulací aktivit cytochromů P450 (v případě ellipticinu i peroxidas), tedy enzymů aktivujících toto protinádorové léčivo v cílové nádorové tkáni (indukcí nebo genovou manipulací), lze zvýšit jeho farmagologický účinek enormně. Druhým směrem, který je slibným pro využití získaných výsledků, je konstrukce cíleně specifických protinádorových léčiv. V případě nádorově specifických léčiv tkví mechanismus jejich selektivity v cíleném transportu pouze do buněk maligních neoplasií („targeting“) (Říhová 1997). Předchozí vývoj nádorově specifických protinádorových agens na bázi ellipticinu, který realisujeme ve spolupráci s kolegy z Německého centra výzkumu rakoviny [synthesa a studium farmakologického účinku konjugátu ellipticinu s lidským sérovým albuminem (HSA), Frei et al. 2000], bude rozšířen. Vyřešení struktury reaktivních metabolitů ellipticinu, 13-hydroxyellipticinu a N(2)-oxidu ellipticinu, které přímo tvoří adukty s deoxyguanosinem v DNA a potencují tak efektivitu ellipticinu v protinádorové therapii, využijeme pro přípravu nových derivátů nádorově směrovaných léčiv na bázi ellipticinu. Konkrétně pro synthesu konjugátu z již dříve použitého makromolekulárního nosiče (HSA) (Frei et al. 2000) a jednoho z reaktivních metabolitů ellipticinu, 13-hydroxyellipticinu. Takový konjugát může v nádorové tkáni poskytovat karbeniový ion ellipticinu i bez metabolické aktivace a kovalentní modifikací DNA (adukt dG1) pak efektivně likvidovat nádorové buňky přímo. Uvedený konjugát tedy může být využit i pro nádorové tkáně, v nichž nejsou exprimovány aktivační enzymy.
3. Literatura Arlt V.M., Ferluga D., Stiborová M., Pfohl-Leskowicz A., Vukelic M., Ceovic S., Schmeiser H.H., Cosyns J.-P.: Int. J. Cancer 101, 500-502 (2002)a. Arlt V.M., Stiborová M., Schmeiser H.H., Phillips D.H.: Mutagenesis, 17, 265-277 (2002)b. Auclair C.: Arch. Biochem. Biophys., 259, 1 (1987). Baldwin A., Huang Z., Jounaidi Y., Waxman D.J.: Arch. Biochem. Biophys., 409, 197 (2003).
21
El-Rayes B.F., Ali S., Heilbrun L.K., Lababidi S., Bouwman D., Visscher D., Philip P.A.: Clin. Cancer Res., 9, 1705 (2003). Frei E., Bieler C. A., Stiborová M., Breuer A., Wiessler M., Sinn H.: Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 41, 765 (2000). Childs J. J., Clayson, D. S.: Biochem. Pharmacol., 15, 1247 (1966). IARC Sudan I. IARC Monographs, Vol. 8, str. 225-231. Lyon: IARC (1975). Klener P.: Protinádorová chemoterapie, Galén, Praha (1996). Murray G.I.: J. Pathol., 192, 419 (2000). Nelson D.R., Koymans L., Kamataki T., Stegeman J.J., Feyereisen R., Waxman D.J., Waterman M.R., Gotoh O., Coon M.J., Estabrook R.W., Gunsalus I.C., Nebert, D.W.: Pharmacogenetics, 6, 1 (1996). Ohashi M., Sugikawa E., Nakanishi N.: Jpn J. Cancer Res., 86, 819 (1995). Patterson L.H., McKeown S.R., Robson T., Gallagher R., Raleigh S.M., Orr, S.: Anti-Cancer Drug Design, 14, 473 (1999). Říhová B.: Crit. Rev. Biotechnol., 17, 149 (1997). Schwaler M.A., Allard B., Lescot E., Moreau F.: J. Biol. Chem., 270, 22709 (1995). Stiborová M.: Chem. Listy, 96, 784 (2002). Stiborová M.: Doktorská disertační práce, PřF UK Praha (2003). Stiborová M., Martínek V., Rýdlová H., Hodek P., Frei E.: Cancer Res. 62, 5678-5684 (2002). Stiborová M., Mikšanová M.: Živa, 4, 146 (1999). Stiborová M., Mikšanová M., Martínek V., Frei E.: Collect. Czech. Chem. Commun., 65, 297 (2000). Stiborová M., Sejbal J., Bořek-Dohalská L., Aimová D., Poljaková J., Forsterová K., Rupertová M., Wiesner J, Hudeček J., Wiessler M., Frei E.: Cancer Res., 64, 8374-8380 (2004). Stiborová M., Schmeiser H.H., Breuer A., Frei E.: Collect. Czech. Chem. Commun. 64, 1335 (1999). Vanverheagem J.-L. Depierreux M., Tielemans C., Abramowicz D., Dratwa M., Jadoul M.,Richard C., Vandervelde D., Verbeelen D., Vanhaelen-Fastre R., Vanhaelen M.: Lance,t 341, 387 (1993). Williams J.A., Phillips D.H.: Cancer Res., 60, 4667 (2000).
22
