Diplomové práce absolventů studijních oborů „Biotechnologie“ a „Biotechnologie léčiv“, obhájené na Fakultě potravinářské a biochemické technologie VŠCHT Praha v akademickém roce 2011/2012 studijní obor „Biotechnologie“ Bc. Veronika Letfusová: Kultivace kvasinky Pichia pastoris fenotypu Mut+ a exprese rekombinantního trypsinogenu na médiích obsahujících vedle methanolu i další zdroj uhlíku a energie (Dr. Ing. Leona Paulová, ÚKCHB VŠCHT Praha) Diplomová práce se zabývá studiem růstu kvasinky Pichia pastoris a exprese rekombinantního trypsinogenu naklonovaného pod kontrolu alkoholoxidasového promotoru při kultivaci na substrátech, které kromě methanolu obsahují ještě další zdroj uhlíku a energie (glycerol, glukózu nebo sorbitol) v poměru s methanolem 1:1. Cílem práce bylo vybrat nejvhodnější kombinaci substrátů za účelem maximální produkce rekombinantního proteinu (vepřového trypsinogenu). Methanol je důležitý pro indukci alkoholoxidasového promotoru, pod jehož kontrolu je naklonován gen pro expresi rekombinantního proteinu. Při růstu v nadbytku substrátu (vsádková kultivace) docházelo k postupnému využívání substrátů, a to v pořadí glycerol, glukosa > methanol > sorbitol, přičemž glycerol a glukosa působily na alkoholoxidasivý promotor represivně. Při růstu za podmínek limitace zdrojem uhlíku a energie (přítokované kultivace s řízenou dodávkou substrátu) byly oba substráty využívány současně a byl produkován rekombinantní protein. Nejvyšší produkce vepřového trypsinogenu (949 mg/l) bylo dosaženo při kultivaci na směsném substrátu obsahujícím glycerol a methanol. Cultivation of Pichia pastoris Mut+ trast and expression of recombinant trypsinogen using media containing other source of caarbon slony with methanol This diploma thesis deals with the studying of growth of yeast Pichia pastoris and expression of recombinant protein which is cloned under control of alkoholoxidase promoter. The cultivations were carried on with mixed substrates containing methanol and another source of carbon and energy (glycerol, glucose or sorbitol) in the ratio of 1:1. Methanol is important for induction of alkoholoxidase promoter which controls an expression of recombinant protein. When growing in excess of substrates (batch cultivation), there was a gradual use of substrates in the order glycerol, glucose> methanol> sorbitol. Glycerol and glucose acted as repressors of alkoholoxidase promoter. During growth under substrate limitation (fed-batch cultivation with controlled delivery of substrate) both substrates were utilized simultaneously and recombinant protein was produced. The highest production of porcine trypsinogen (949 mg/l) was achieved in fed-batch cultivation with mixed substrate containing glycerol and methanol.
Bc. Waldir Desiderio Estela Escalante: Production of volatile compounds in wine fermentation with immobilised Saccharomyces cerevisiae and Candida stellata yeasts (prof. Ing. Karel Melzoch, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Nowadays, oenologists are focused in finding new yeast strains and new fermentation techniques to produce wines of better sensory quality. Utilization of non-Saccharomyces yeasts is not common but every day the interest is increasing. These yeasts must contribute to the sensory quality of wine. In this study, the aim was to evaluate the production of some compounds of sensory importance by mixed cultures of two wine yeasts, Saccharomyces cerevisiae RIVE V 1-15-77 1
and Candida stellata RIVE 3-16-1 free or immobilized in alginate matrix. As fermentation media were used synthetic medium resembling the basic chemical composition of white grape juice and, red grape juice. Fermentations were carried out with mixed cultures of both free and immobilised yeast cells. The compounds produced during fermentation were analyzed by GC and HPLC. In general it was observed that, yeast immobilization increases the production of glycerol, acetic and succinic acid, ethyl acetate and some higher alcohols whereas acetoin and 1-propanol were almost not affected. Nevertheless, the cell proportion of each strain in the inoculum significantly influenced in the production of all compounds analyzed. Tvorba těkavých sloučenin imobilizovanými kvasinkami Saccharomyces cerevisiae a Candida stellata v průběhu vinné fermentace V současnosti enologové hledají nové druhy kvasinek, nové metody a techniky fermentace pro účely výroby vín s lepšími organoleptickými vlastnostmi. Použití kvasinek jiného rodu než Saccharomyces není běžné, ale zájem o ně se neustále zvyšuje. Tyto kvasinky musí přispět k senzorické kvalitě vína. Cílem této práce bylo vyhodnotit tvorbu senzoricky zajímavých sloučenin kulturami dvou vinných kvasinek, Saccharomyces cerevisiae RIVE V 1-15-77 a Candida stellata RIVE 3-161, jak volných buněk, tak buněk imobilizovaných v alginátu. Jako fermentační médium bylo použito syntetické médium a hroznový mošt. Produkty vytvořené během fermentace byly analyzovány GC a HPLC. Obecně bylo pozorováno, že imobilizace kvasinek vedla k vyšší produkci glycerolu, kyseliny octové a kyseliny jantarové, octanu ethylnatého a některých vyšších alkoholů, zatímco acetoin a 1-propanol nebyly imobilizací téměř ovlivněny. Poměr buněk jednotlivých druhů v inokulu nicméně významně ovlivnil produkci všech analyzovaných sloučenin. Bc. Štěpán Halama: Studium vlivu sladování na obsahy vybraných polyfenolových látek ječmene (Ing. Marcel Karabín, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Polyfenoly v důsledku svých antioxidačních a dalších fyzikálně-chemických vlastností mohou značně ovlivnit organoleptické vlastnosti piva zejména s ohledem na jeho senzorickou a koloidní stabilitu. Tato diplomová práce se zabývá aplikací modifikovaných a dříve používaných metod izolace a analýzy polyfenolů pro kvantitativní a kvalitativní stanovení volných, esterifikovaných a vázaných polyfenolů v ječmeni a sladu s využitím vysokoúčinné kapalinové chromatografie s detektorem diodového pole (HPLC-DAD). Pomocí této metody byly nalezeny rozdíly v zastoupení volných, vázaných a esterifikovaných polyfenolů ječmene s ohledem na odrůdu, ročník sklizně a pěstební oblast. Dále byly srovnány změny v obsazích polyfenolů během sladování v závislosti na použité technologii. Study of the effect malting on the content of selected barley polyphenols Polyphenols due to their antioxidant and other physico-chemical properties can greatly affect the organoleptic properties of beer, with regard to its sensory and colloidal stability. The main aim of the thesis is application of the existing methods of isolation and analysis of polyphenols used in quantitative and qualitative determination of free, esterified and insoluble-bound phenolic compounds in barley and malt. The core of methodological approach is in application of high-performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD). The results of analyses show the differences in abundance of free, esterified and insoluble-bound phenolic compounds in barley according to variety, year of crop and growing area. Moreover the method was used to study the changes of polyphenols abundance during malting process in relation to different malting technologies. 2
Bc. Richard Ježdík: Modulace podmínek vnějšího prostředí umožňující posílení produkce rhamnolipidů u vybraných bakteriálních kmenů (prof. Ing. Jan Masák, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Problémem při biodegradaci hydrofobních látek je jejich nízká rozpustnost ve vodě, což způsobuje špatnou dostupnost pro mikroorganismy. Tu je možné zvýšit aplikací povrchově aktivních látek (surfaktantů), avšak tyto látky mohou mít negativní vliv na daný ekosystém. Použití biosurfaktantů je vhodnější alternativou vzhledem k menší toxicitě a nižžší zátěže znečištěného prostředí. Tato práce je zaměřena na produkci rhamnolipidů třemi bakteriálními kmeny: Acinetobacter calcoaceticus B59-190, Enterobacter asburiae B59-189 a Pseudomonas aeruginosa B59-188 (ARS Culture Collection, USA.), které byly již dříve označeny jako potenciální producenti rhamnolipidů. U těchto kmenů byla zkoumána produkce rhamnolipidů v závislosti na složení kultivačního média, především zdrojů uhlíku, dusíku a fosforu. Složení a vlastnosti jednotlivých rhamnolipidových směsí je charakteristické pro každého producenta a je částečně ovlivnitelné kultivačními podmínkami. Důkazem toho jsou značné rozdíly ve stanovené kritické micelární koncentraci izolovaných rhamnolipidových směsí. Orientačně byl potvrzen pozitivní vliv izolovaného rhamnolipidu na biodegradaci modelové hydrofobní sloučeniny naftalenu. Modulation of environmental conditions for an enhancement of rhamnolipid production by selected bacterial strains Low solubility in water of hydrophobic pollutants makes a problem in a biodegradation, because microorganisms have poor access to these substances. Bioavailability of hydrophobic compounds can be enhanced by the application of surfactants, but these compounds may have a negative impact on the ecosystem. Use of biosurfactants based is preferable alternative; biosurfactants are less toxic and reduce the burden of polluted environment. This work is focused on rhamnolipid production by three bacterial strains Acinetobacter calcoaceticus B59-190, Enterobacter asburiae B59-189 and Pseudomonas aeruginosa B59188 (ARS Culture Collection, USA.). These strains were tested for production of rhamnolipids, depending on the composition of cultivation medium. Composition and properties of the rhamnolipid mixtures is specific for each producer, and is influenced by culture conditions. Considerable differences in the critical micellar concentration of isolated rhamnolipid mixtures were found. A partial proof of positive influence caused by isolated rhamnolipid to degradation of hydrophobic compound naphthalene has been confirmed. Bc. Jan Kačaba: Výroba bioethanolu z hydrolyzátů pšeničné slámy (Dr. Ing. Leona Paulová, ÚKCHB VŠCHT Praha) Odpadní lignocelulosová biomasa by mohla být využívána k výrobě kapalných biopaliv, za předpokladu vyřešení řady technologických problémů, které povedou ke snížení ceny finálního produktu. Před vlastní fermentací je nutné materiál narušit v procesu předúpravy, přičemž podmínky musí být voleny tak, aby došlo k maximálnímu narušení struktury materiálu a zároveň minimalizaci vzniku inhibičních látek. První část práce byla zaměřena na ověření možnosti stanovení obsahu inhibičních látek rychlou spektrofotometrickou metodou, která by umožnila odhadnout obsah furfuralu a hydroxymethylfurfuralu v hydrolyzátech pšeničné slámy a tak sloužit ke kvalitativnímu posouzení toxicity hydrolyzátu. V další části práce byl využit reálný hydrolyzát pšeničné slámy k výrobě etanolu, byla řešena problematika hydromodulu použitého substrátu, 3
dávkování celulolytických enzymů a byla provedena modifikace procesou současné sacharifikace a fermentace. Při ověrovacích pokusech v laboratorním bioreaktoru ve vsádkovém i přítokovaném uspořádání bylo dosaženo výtěžnosti etanolu na vnesenou celulózu 0,249 g/g a produktivity ethanolu 0,277 g/l.h. Bioethanol production from hydrolysates of wheat straw Waste lignocellulosic biomass could be used for production of liquid biofuels providing that many technological problems will be solved to decrease a price of final product. Lignocellulose biomass must be disintegrated in pretreatment process at condition leading to maximum decomposition of material and at the same time minimization of amount of inhibitors. First part of thesis deals with evaluation of the spectrophotometric method for determination of concentration of the two most abundant inhibitors (furfural and hydroxymethylfurfural) in wheat straw hydrolysates and thus enabling to asses toxicity of hydrolysates. Afterwards, real hydrolysate of wheat staw was used to produce bioethanol; optimum concentration of substrate together with appropriate dosing of cellulolytic enzymes was determined and condition of simultaneous saccharification and fermentation was modified. Finally, the process was verified in laboratory bioreactor using batch and fed-batch régime with etahnol yeild from cellulose of 0,249 g/g and ethanol productivty of 0,277 g/l.h. Bc. Petra Kociánová: Využití SPME pro stanovení senzoricky významných těkavých látek piva (Ing. Marcel Karabín, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Jednou z charakteristických vlastností piva je jeho aroma způsobené kombinací různých chutí a vůní. Příčinou tohoto komplexního vjemu je hlavně společné senzorické působení skupiny tzv. „těkavých látek piva“, které zahrnují například vyšší alkoholy, organické kyseliny a estery. Náplní této práce byl vývoj metody pro stanovení těchto látek využívající „head-space“ mikroextrakce na pevné fázi (HS-SPME-GC). Tato metoda je časově nenáročná a nevyžaduje velké objemy vzorků a rozpouštědel. Byly navrženy vhodné parametry extrakce (délka, teplota), GC analýzy (volba vhodné kolony, teplotní program, průtok) i přípravy vzorků (vliv přídavku NaCl) pro dosažení co nejvyšší opakovatelnosti. Tato metoda byla použita pro sledování obsahů těkavých látek v různých druzích tuzemských i zahraničních piv. Application of SPME for the determination of major sensorially active volatile compounds of beer Flavor, which is one of the characteristic properties of beer, is created by a combination of various tastes and odors. The source of this complex perception is mostly a mutual sensory action of the so called “volatile beer compounds“ group, including higher alcohols, organic acids and esters. The purpose of this study was the development of a method for qualification and quantification of these compounds using head-space solid-phase microextraction coupled with GC analysis (HS-SPME-GC). This method is rapid and does not require large volumes of the samples and solvents. Suitable parameters for the extraction (length and temperature), the GC analysis (column, temperature profile, flow rate) and the sample preparation (NaCl addition effect) were revised so that maximal repeatability was reached. The method was used to monitor the amount of volatile compounds in different domestic and imported beers. Bc. Petr Linhart: Vliv chmelových přípravků na strukturu a stabilitu pivní pěny (doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) 4
Chmelové přípravky se dnes běžně používají v pivovarnictví jako náhrada hlávkového chmele. Rozvoj používání těchto přípravků je podporován díky jejich chemické stabilitě, lepší skladovatelnosti a snadnějšímu dávkování během výroby piva oproti hlávkovému chmelu. Většina těchto přípravků ovlivňuje pěnivost piva. Cílem práce bylo posoudit vliv vybraných chmelových přípravků, jejich koncentrace a pH na strukturu a stabilitu pěny v matricích modelového roztoku, modelového piva i skutečného piva z komerční sítě. Ze všech vzorků byla vytvořena pěna definovaným způsobem a vlastnosti vzniklé pěny byly analyzovány pomocí obrazové analýzy a komerčního přístroje NIBEM-T firmy Haffmans. Výsledkem analýz jsou strukturální a stabilitní charakteristiky pěn (rozpadová křivka, rychlost rozpadu, poločas rozpadu, rozložení velikostí bublin v souboru, tvarové charakteristiky bublin, apod.). Výsledkem diplomové práce jsou zjištěné závislosti mezi koncentrací a typem chmelového přípravku a charakteristikami pěn. The influence of hop products on the structure and stability of beer foam Hop products have been lately used in brewing industry as replacement of leaf hops. The increasing use of these products in beer production is supported by their chemical stability, better storage and easier dosing as compared to leaf hops. Most of these products affect beer foam. The aim of this work was to assess the impact of selected hop products, their concentration and pH on the foam structure and stability in matrices of model solution, model beer and real commercial beer. Each sample was used to create foam in a defined way and the foam was analyzed by image analysis and by the NIBEM-T method (Haffmans). The analyses led to structural and stability characteristics (decay curve, the rate of decay half-life, distribution of bubble sizes, shape characteristics of bubbles, etc.) of foams. The result of this diploma thesis are the relationships between the concentration and type of hop products and characteristics of foams. Bc. Jana Macháčková: Mikrobní produkce vybraných kyselin citrátového cyklu – výběr mikroorganismů (prof. Ing. Mojmír Rychtera, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Cílem této diplomové práce bylo otestovat z literatury vybrané mikroorganismy jako producenty některých kyselin citrátového cyklu a následně vybrat ty, které tvoří ve větším množství jen jeden produkt. Z kvasinkových mikroorganismů se jeví nejlépe kmeny Candida vinaria a Candida catenulata kultivované na médiu obsahujícím ethanol jako zdroj uhlíku. Dalšími testovanými mikroorganismy byly anaerobní kapnofilní bakterie z Německé sbírky mikroorganismů (DSMZ). Konkrétně šlo o Actinobacillus succinogenes, Mannheimia ruminalis, Succinimonas amylolytica, Succinivibrio dextrinosolvents, Wolinella succinogenes, Flavobacterium succinicans, které k tvorbě organických kyselin využívají kromě glukosy i oxid uhličitý. Experimenty prokázaly, že nejvyšších hodnot vyprodukovaných kyselin jablečné, jantarové a fumarové dosahují bakterie Actinobacillus succinogenes a Mannheimia ruminalis. Celková výtěžnost uvedených kyselin se pohybuje kolem 80 % vztaženo na utilizovaný cukr, přičemž výtěžnost biomasy je 40 – 50 %. To dokazuje vysoké využití oxidu uhličitého jako zdroje uhlíku. Microbial production of selected acids of the citrate cycle – selection of microorganisms The aim of this work was to test some microorganisms described in literature as producers of important acid of the citric acid cycle and then to select those producing preferentially one product in large quantity. Among yeasts and yeast-like microorganisms Candida vinaria and Candida catenulate grown in a medium containing ethanol as a C-source manifested the highest activities. Another 5
microorganisms tested were anaerobic capnophilic bacteria from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ), namely Actinobacillus succinogenes, Mannheimia ruminalis, Succinimonas amylolytica, Succinivibrio dextrinosolvents, Wolinella succinogenes and Flavobacterium succinicans that are using for organic acid production besides glucose also carbon dioxide. Experiments have shown that the highest values of produced malic, succinic and fumaric acids achieved bacteria A. succinogenes and M. ruminalis. Total yield of given acids moved around 80 % based on utilized sugar whereas biomass yield was 40 – 50 %. This proves high exploitation of carbon dioxide as the carbon source. Bc. Tomáš Pokorný: Kontinuální produkce 1-butanolu (Dr. Ing. Petra Patáková, ÚKCHB VŠCHT Praha) 1-butanol je možné získat tzv. aceton-butanol-ethanolovou (ABE) fermentací sacharidického substrátu pomocí solventogenních druhů bakterií rodu Clostridium. Kontinuální fermentace s volnými a imobilizovanými buňkami, s glukosou jako substrátem, byly prováděny ve většině případů s kmenem Clostridium pasteurianum NRRL B-598. Nejlepších výsledků bylo dosaženo s buňkami, imobilizovanými na povrch kukuřičných oklasků, kdy bylo při ustáleném stavu dosaženo produktivity tvorby rozpouštědel 0,45 g.l-1.h-1 při zřeďovací rychlosti 0,12 h-1. Imobilizace metodou „entrapment“ do peletek alginátu se osvědčila jako vhodný způsob pro dlouhodobé uchování aktivních buněk, kdy v opakovaných vsádkových fermentacích v baňkách bylo stabilně dosahováno výtěžnosti 0,23 g/g. Při dvoustupňových fermentacích s volnými buňkami, kdy byly oba stupně vedeny za různé zřeďovací rychlosti (0,1 a 0,04 h-1) a za různého pH (6,5 a 5) bylo úspěšně dosaženo pouze fáze acidogeneze tj. tvorby kyseliny máselné a octové. Continuous production of 1-butanol 1-butanol can be obtained by acetone-butanol-ethanol (ABE) fermentation of saccharides using solvent producing species of the genus Clostridium. Continuous fermentation with free and immobilized cells and glucose as substrate were carried out with Clostridium pasteurianum NRRL B-598. The best results were achieved with cells immobilized on the surface of corncob, then steady state was achieved at a dilution rate of 0.12 h-1 and butanol productivity of 0.45 g.l-1.h-1 was reached. An immobilization using the entrapment of the cells in alginate pellets has proved to be a suitable way for long-term preservation of active cells, because in repeated batch fermentation in flasks, there was steadily achieved the yield of 0.23 g/g. In two-stage fermentation with free cells, where both stages were conducted at various dilution rates (0.1 and 0.04 h-1) and under different pH (6,5 and 5), acidogenic phase ie. formation of butyric and acetic acid was successfully achieved. Bc. Jan Pošta: Selekce vhodného producenta etanolu z lignocelulózových materiálů a jeho využití v SSF procesu (prof. Ing. Karel Melzoch, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Lignocelulózové materiály jsou perspektivní surovinou pro výrobu bioetanolu. Práce se orientuje na hledání vhodného producenta etanolu z kolekce mikroorganismů (Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Kluyveromyces marxianus, Pichia stipitis, Zymomonas mobilis, Mucor rouxii), který by nejlépe využíval sacharidy vyskytující se v hydrolyzátech lignocelulózových materiálů a dosahoval vysoké produktivity a výtěžnosti etanolu a produkoval etanol za teplot blížících se optimální teplotě enzymové hydrolýzy během SSF procesu (simultánní sacharifikace a fermentace). Jako vhodní producenti etanolu vybrány bakterie Z. mobilis i kvasinka K. marxianus, při teplotě 40°C dosáhly výtěžnosti etanolu 0,37 6
g.g-1. Potenciál kvasinky P. stipitis umožňuje dofermentování xylózy zbylé v hydrolyzátu poté, co glukóza byla přeměněna na etanol jiným mikroorganismem. P. stipitis tak byla otestována na médiu obsahujícím směs glukózy a xylózy (výtěžnost etanolu 0,27 g.g-1) a samotnou xylózu (výtěžnost etanolu 0,35 g.g-1). Další část práce byla zaměřena na výběr vhodného komerčně dostupného enzymového preparátu. Nejvyšší konverze celulózy na glukózu dosáhly „NS-22086“ (konverze 67%) od firmy Novozyme a „Celuláza 500β“ (konverze 35%) od firmy Bio-BN. Screening of suitable microbial strain for lignocellulose ethanol production in SSF proces Lignocellulosic materials are promising substrate for the production of bioethanol. Selection of the efficient producer of ethanol was based on the spectrum utilized carbohydrates occuring in the hydrolysates of lignocellulose materials, and on production rate and yield of the ethanol and the ability to produce ethanol at temperature approaching the optimum temperature during the SSF-process (Simultaneous Saccharification and Fermentation). As efficient ethanol producers Z. mobilis and K. marxianus were selected. Bacteria Z. mobilis and yeast K. marxianus achieved at 40°C ethanol yield of 0,37 g.g-1. P. stipitis can be used to utilize the remaining xylose and thus increasing the overall yield of ethanol. The ability of P. stipitis to convert xylose into ethanol was tested using mixed substrate containing glucose and xylose as carbon sources (yield of ethanol 0,27 g.g-1) as well as sole xylose (yield of ethanol 0,35 g.g-1). The next part was focused on selection of cellulolytic enzymes which convert cellulose into glucose. Finally, two commercial enzymatic preparations achieving the highest conversion “NS-22086” (conversion 67%) and “Celuláza 500β” (conversion 35%) were selected. Bc. Michaela Poštulková: Vliv surovin a technologie na prekurzory přepěňování piva (Ing. Jaromír Fiala, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Přepěňování piva je jev, který vzniká po otevření pivní lahve nebo plechovky. Jeho prekurzory jsou sekundární metabolity vznikající z plísňové kontaminace – hydrofobiny nebo jako reakce na ni - PRP. Prekurzory gushingu obsahuje v latentní formě slad vyrobený z kontaminovaného ječmene a přepěňování se pak může projevit jako reakce na obsah těchto látek. Diplomová práce se teoreticky a prakticky zabývá vlivem technologického zpracování surovin na přepěňování piva, které pak ve výsledku může gushing podpořit nebo potlačit. Hypotézu o projevech a potlačení překurzorů přepěňování lze potvrdit tím, že ačkoliv je přepěňovací aktivita sladu nízká nebo žádná, výsledné vyrobené pivo přepěňuje a naopak, testovaný slad může být na gushing pozitivní a vyrobené pivo nikoliv. Dále se práce věnovala hlavní surovině, jež si může nést prekurzory přepěňování – sladu – vlivu sladovacího ročníku a typu sladu na gushing. V další části práce byl zkoumán vliv ostatních surovin (chmel, voda) na přepěňovací aktivitu sladu, jejichž úprava spolu s úpravou technologie by mohla v konkrétním pivovaru potlačit efekt přepěňování piva. The influence of raw materials and technology to gushing precursors Gushing is a phenomenon occuring after a bottle or a can of beer is opened. Its precursors are secondary metabolites emerging from a mold contamination – hydrophobines, or as a reaction to it – PRP. Precursors of gushing in latent form are present in malt produced from contaminated barley and overfoaming can manifest as a reaction to their presence. The thesis deals both theoreticaly and practicaly with the influence of the technological processing of brewing materials on the gushing of beer, because the processing itself can reinforce or suppress the gushing. This hypothesis can be confirmed by the observation of the 7
fact that while the gushing activity of the malt is low or zero, the resulting beer exhibits gushing and vice versa, the malt can be positive for gushing but not the resulting beer. The thesis deals further with the main brewing material that can carry the precursors of gushing – malt – the influence of malting year and the type of malt on gushing. In the last part of the thesis, the influence of brewing materials (hops, water) on the gushing activity of malt was examined and recommendations were proposed to modify the materials along with the brewing technology in order to suppress the gushing effect of the beer in a specific brewery. Bc. Jan Strejc: Fyziologická a genetická modifikace pivovarských kvasinek ve výrobě nealkoholického piva (doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Nealkoholickéo pivo patří k produktům pivovarského průmyslu těšící se vzrůstající oblibě u spotřebitelů a jeho výrobou se zabývá stále více pivovarů. Nejrozšířenějším způsobem výroby nealkoholického piva v České republice jsou metody zastaveného nebo limitovaného kvašení, nicméně piva vyrobená těmito metodami vykazují v chuti a vůni často nepříjemnou mladinovou příchuť. Mladinovou příchuť lze potlačit například změnou receptury, technologie nebo použitím speciálních kvasinek produkujících zvýšené množství senzoricky aktivních metabolitů. Práce byla zaměřena na izolaci spontánně mutovaných kmenů pivovarské kvasinky Saccharomyces carlsbergensis vyznačujících se nadprodukcí esteru isoamylacetátu a jejich možné využití ve výrobě nealkoholického piva. Po nárůstu kolonií mutantních kvasinek byl pomocí série kultivací v syntetickém minerálním médiu vybrán mutantní kmen pro pokusy s kvašením nealkoholického piva. Bylo zjištěno, že mutantní kmen vykazoval mírně snížené růstové rychlosti, schopnost zvýšené tvorby isoamylacetátu se při opakovaném nasazení buněk neztrácela, zatímco zvýšená teplota ani zákvasná dávka neměla pozitivní vliv na tvorbu isoamylacetátu. Physiological and genetic modification of brewing yeast in the production of alcohol-free beer Non-alcoholic beer is one of the products of beer industry with increasing popularity among consumers and therefore it is produced by an increasing number of breweries. The most common strategy to produce non-alcoholic beer in the Czech Republic are the methods of arrested or limited fermentation. The beer made by these methods often have an unpleasant worty off-flavour. The worty off-flavour can be suppressed for example by changing the recipe, technology or by using of special yeast overproducing sensory active metabolites. This work is focused on isolation of spontaneous mutants of brewer's yeast Saccharomyces carlsbergensis characterized by overproduction of isoamyl acetate and their possible use in the production of non-alcoholic beer. After the growth of mutant colonies a series of cultivations in synthetic medium led to the selection of a mutant strain for fermentation experiments of non-alcoholic beer. It was found that the mutant strain showed lower growth rates, its ability to overproduce isoamyl acetate was not affected by repeated use, while the increased temperature or pitching rate had no positive effect on isoamyl acetate production. Bc. Věra Šalplachtová: Produkce biosurfaktantů termofilními bakteriemi (Ing. Lucie Siříšťová, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Biosurfaktanty a jejich mikrobiální producenti jsou při průmyslových aplikacích často vystaveni extrémním podmínkám tedy i vysokým teplotám. Pro takové procesy může být výhodné použití termofilních mikroorganismů produkujících biosurfaktanty. Literární část diplomové práce je věnována vlastnostem biosurfaktantů a jejich producentům. Důraz je kladen na rhamnolipidy, které tvoří významnou skupinu povrchově aktivních látek. 8
Experimentální část se nejprve věnuje metodám kvantifikace rhamnolipidů, které byly navrženy pro sledování koncentrace rhamnolipidů v kultivačním médiu. Jedná se o dvě metody stanovující obsah rhamnosy, o měření emulzifikační aktivity a o měření změny povrchového napětí média. Ke kvantifikaci rhamnolipidů během experimentálních kultivací byla zvolena fenol-sírová metoda. Další část práce se zabývala kultivačními podmínkami produkce rhamnolipidů s cílem zvýšit jejich koncentraci. Bylo potvrzeno, že vybrané kmeny rodů Thermus a Meiothermus jsou schopny syntetizovat rhamnolipidy a že vhodným substrátem pro jejich produkci je glycerol. Výrazné snížení produkce bylo zaznamenáno při nižší teplotě než, je optimální teplota sledovaného kmene.
Biosurfactant production by thermophilic bacteria During industrial applications, biosurfactants and their microbial producers are often exposed to extreme conditions including high temperature. Thermophilic microorganisms that are able to synthesize biosurfactants are of great interest. The theoretical part of this thesis is mainly focused on the characterisation of rhamnolipids and the diversity of their microbial producers. In the first step, the experimental part deals with quantification methods, which have been designed to monitor rhamnolipids in culture media. Two of them quantify rhamnose and the other two are based on the measurement of emulsification activity and the changes in surface tension of the culture medium. The phenol-sulfuric acid method was later used for the analysis of samples from cultivations. In the next step, cultivation conditions were studied with the aim to increase the amount of produced rhamnolipids. We confirmed that the selected strains of genera Thermus and Meiothermus are able to synthesize rhamnolipids and we found glycerol as a suitable substrate for the production. Rhamnolipid production was significantly reduced during cultivation at lower temperature than is the optimum of the tested strain. Bc. Lenka Wiedenová: Stanovení volných aminokyselin ve vínech (Ing. Jaromír Fiala, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Diplomová práce shrnuje význam aminokyselin ve víně a moštu, především jejich vliv na výslednou senzorickou kvalitu vín, na kterou může působit primárně nebo jako prekurzor senzoricky aktivních těkavých látek. Jedním z cílů práce byla validace použité metody, druhým cílem byla charakterizace nových interspecifických odrůd révy vinné z hlediska profilu aminokyselin, jejich porovnání s tradiční odrůdou a nalezení význačných rozdílů mezi nimi. Pro posouzení vlivu technologického postupu výroby vína byla každá z odrůd zpracována pomocí čtyř různých způsobů macerací. Aminokyseliny byly stanoveny pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s předkolonovou derivatizací vzorků, po které následuje separace derivátů v koloně na reverzní fázi a detekce fluorescenčním detektorem. Metoda byla validována pomocí výpočtu opakovatelnosti pro víno a vinný mošt. Nejvýraznější rozdíl mezi interspecifickými odrůdami a tradiční byl zaznamenán u obsahu argininu, zatímco ostatní aminokyseliny se ve svých koncentracích příliš nelišily. U vín všech odrůd byla provedena senzorická analýza, z jejichž výsledků vyplývá, že by chuť vína mohla být ovlivněna obsahem aminokyselin. Determination of free amino acids in wines Diploma thesis describes free amino acids influence on sensory quality of wine, where they act primarily or as precursors contributing to wine aroma. First objective of this work was to validate the method for determination of amino acids in wine. The second objective was to characterize new interspecific varieties of red wine from the aspect of amino acids, compare 9
them with traditional grape variety and find there some characteristic differences in their amino acid profiles. Four different kinds of maceration were used for each grape variety to find out the affect of technological process to final amino acid content. Amino acids were determined by high performance liquid chromatography with utilization of pre-column derivatization of the samples which was followed by separation of sample derivates in reverse phase column and fluorescent detection. This method was validated by calculation of reproducibility of the results. The most considerable difference between interspecific and traditional varieties was noted in arginine content while the other amino acids did not differ significantly. Sensory analysis of all samples was performed and according to its result amino acids may influence wine taste. Bc. Vít Ženíšek: Aplikace polyamidových sorbentů pro zvýšení koloidní stability piva (doc. Ing. Pavel Dostálek, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Polyfenoly jsou schopny interagovat s polypeptidy za vzniku koloidního zákalu, který je spotřebiteli vnímán jako negativní aspekt senzorického profilu piva. Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) a polyamid 6 jsou polymerní sorbenty běžně využívané v pivovarství k odstranění fenolových látek, které jsou považovány za hlavní prekurzory koloidního zákalu. Cílem práce bylo objasnění schopnosti jednotlivých sorbentů vázat na svůj aktivní povrch tyto fenolové látky. Pivo je velice složitá matrice a tak je pomocí modelových roztoků analyzována povaha a síla interakce polyfenolů s přípravky bez interference ostatních látek. Byly vytvořeny soubory dat, na jejichž základě se dále zkoumala doporučená dávkování těchto přípravků v světlém nestabilizovaném ležáku. Během procesu stabilizace přichází pivo do kontaktu s řadou dalších pevných částic (křemelina, silikagely), které mohou mít značný vliv na hodnotu sorpce. Proto byly provedeny testy zkoumající sorpční účinky těchto přípravků na polyfenoly. Application of polyamide sorbents to increase colloidal stability of beer Polyphenols are able to interact with the polypeptides to form colloidal haze, which is perceived by consumers as a negative aspect of the sensory profile of beer. Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) and polyamide 6 are commonly employed in brewing for remove phenolic compounds, which are considered as main precursors of colloidal haze. The aim of this diploma thesis was to clarify the effectiveness of individual sorbents to bind phenolic compounds on their active surfaces. Beer is a very complex matrix thus the model solutions were used for analysing the nature and interaction strength of polyphenols sorbents without interference. Recommended dosage of the stabilization agents for pale lager was created on the base of measured sorption data. Beer interacts with many other solid particles (silica, silica gel), which may have a significant impact on the sorption process during stabilization process. Therefore, tests were implicated examining the interaction between these particles and polyphenols contained in beer. studijní obor „Biotechnologie léčiv“ Bc. Jitka Holfeldová: Studium vlivu antibiotik na tvorbu a stabilitu biofilmu (prof. Ing. Jan Masák, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Byl zkoumán vliv pěti antimikrobních látek, jmenovitě bacitracinu, cefalosporinu C, chlorhexidinu, polymyxinu B a erytromycinu, na tvorbu a stabilitu biofilmu bakterií Pseudomonas fluorescens CCM 2115 a Rhodococcus erythropolis CCM 2595. Pro použité antimikrobní látky byly experimentálně stanoveny subinhibiční koncentrace. Byl sledován vliv antimikrobních látek na počáteční adhezi, na chování buněk adherovaných v přítomnosti 10
antimikrobních látek a vliv antimikrobních látek na adherované buňky. Biofilm byl sledován v průtočných celách za pomoci světelné mikroskopie a data byla vyhodnocována analýzou obrazu. Změny ve struktuře biofilmu byly stanovovány pomocí velikosti osídlené plochy a počtem a velikostí jednotlivých kolonií bakterií Pseudomonas fluorescens CCM 2115 a Rhodococcus erythropolis CCM 2595. Bylo zjištěno, že jednotlivé antimikrobní látky působí v různých fázích vývoje biofilmu odlišně, některé podporují kolonizaci povrchu nosiče, zatímco jiné tvorbu biofilmu potlačují. Experimenty dále prokázaly, že buňky v počátečních fázích tvorby biofilmu jsou více náchylné vůči působení antimikrobních látek než buňky ve zralém biofilmu. Influence of antibiotics on development and stability of biofilm In this diploma thesis has been studied the influence of five antimicrobial substances (bacitracin, cephalosporin C, chlorhexidine, polymyxin B and erythromycin) on the formation and stability of the biofilm of bacteria Pseudomonas fluorescens CCM 2115 and Rhodococcus erythropolis CCM 2595. It has been observed the influence of antimicrobial substances on the initial adhesion, the behavior of adhered cells in the presence of antimicrobial agents and influence of antimicrobial substance on adhesive cells. Changes in the structure of the biofilm have been determined by size of colonized area and the number and size of colonies. It was found that individual antimicrobial substances act at different stages of biofilm development differently; some of them encourage growth of the colonized area, while others inhibit biofilm formation. Experiments showed that the cells in earlier stages of biofilm formation are more susceptible to the influence of antimicrobial substance than cells in the mature biofilm. Bc. Jana Křenková: Vliv resveratrolu a jeho analogů na adhezivní schopnosti bakteriálních buněk (Ing. Irena Kolouchová, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Stilbeny jsou přírodní fenolické sloučeniny rostlin, které působí jako ochranné látky pro buňky vystavené stresovým podmínkám (UV záření, teplota, napadení mikroorganismy). Stilbeny řadíme mezi fytoalexiny - sekundární metabolity, mezi jejichž zástupce patří např.: resveratrol, pinosylvin a další. Ve stresových podmínkách, v přítomnosti některých stilbenů, nedochází k nárůstu bakteriálních buněk. Toto zjištění se však týká jen některých stilbenů, především resveratrolu a pinosylvinu. Biofilm studujeme díky schopnosti buněk adorovat na povrch. Biofilm je vrstva organismů na povrchu (jakýkoliv materiál, na kterém je daný organismus schopen adheze, např.:nemocniční materiál, sliznice, povrchy ve vodním prostředí). Biofilm je schopen odolávat různým fyzikálním a chemickým vlivům. V této práci studujeme vliv stilbenů na tvorbu a stabilitu biofilmu u bakterií rodu: Rhodococcus erythropolis, bakterie gram- atypicky pozitivní; Pseudomonas aeruginosa, bakterie gram negativní a Micrococcus luteus, bakterie gram - negativní. Effect of resveratrol and its analogues on the adhesive ability of bacterial cells Stilbenes are natural plant phenolic compounds which are protective agents for cells exposed to stress conditions (UV radiation, temperature, microorganisms attack). Stilbenes sort to phytoalexins - secondary metabolites. Their representatives include: resveratrol, pinosylvin etc. In stressful conditions, in the presence of some stilbenes, shows no increase in bacterial cells. This knowledge, however, applies to only some stilbenes, particularly resveratrol and pinosylvin. Biofilm is studied by the ability of cells to colonize the surface. Biofilm is a layer of organisms on the surface (any material in which the organism is able to adhere such as: hospital materials, mucous membranes, surfaces in the aquatic environment). The biofilm is able to resist various physical and chemical conditions. In this work we study the effect of stilbenes on formation and stability of biofilm of bacteria: Rhodococcus erythropolis atypical 11
bacteria Gram-positive, Pseudomonas aeruginosa a bacteria gram - negative and Micrococcus luteus, bacteria gram - negative. Bc. Karolína Pádrová: Interakce nanočástic železa s prokaryotní a eukaryotní buňkou (prof. Ing. Alena Čejková, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Nanočástice železa nulové valence disponují značným redukčním potenciálem, kterého lze úspěšně využít v oblasti remediací. Velká reaktivita nanočástic železa je však příčinou vzniku oxidativního stresu, který je důsledkem vysoké toxicity tohoto materiálu, jehož přítomnost v prostředí by mohla negativně narušovat autochtonní mikroflóru. První část experimentální práce se zabývá ovlivněním růstu prokaryotních a eukaryotních buněk, které jsou vystaveny působení nanočástic nulamocného železa. Vzhledem k značné cytotoxicitě nanočástic a možnostem jejich uplatnění, je druhá část práce zaměřena na hledání látek, které by exponované mikroorganismy před letálními účinky nanočástic ochránily. Potenciální protektivní charakter byl sledován u huminových látek, které jsou známé svou schopností interakce s mikroorganismy a schopností ochrany buněk před stresovým prostředím. Podíl životaschopných buněk po expozici nanočástic elementárního železa v přítomnosti huminových látek byl porovnán s množstvím buněk se zachovanou reprodukční aktivitou populace vystavené pouze účinkům nanočástic. Interaction of iron nanopartieles with prokaryotic and eukaryotic cells Nanoscale zero-valent iron has a significant reduction potential which may be used successfully in the area of remediations. High reactivity of nanoscale iron particles, however, is the cause of oxidation stress resulting from the high toxicity of this material. Namely in the area of decontamination of sub-surface water and soil of contaminated The first part of the experimental work deals with impacts on the growth of model organisms representing prokaryotic and eukaryotic cells which were exposed to the activity of the zero-valent iron compound. Because of the high cytotoxicity of nanoparticles and the opportunities of their use, the second part is focused on the search of substances which would protect exposed microorganisms against the lethal effects of nanoparticles. The potential protective nature was monitored for humic substances which are known for their capability of interacting with microorganisms and for the ability to protect cells against a stressful environment. Bc. Radek Šach: Studium interakce matrixového proteinu Mason-Pfizerova opičího viru s komplexem vezikulárního transportního systému COP I (Ing. Jan Lipov, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Příhodným modelem pro studium životního cyklu retrovirů je Mason – Pfizerův opičí virus (M-PMV). Na rozdíl například od HIV jsou jednotlivé kroky jeho životního cyklu, tj. transport prekursorů virové částice do místa skládání a proces pučení časově a prostorově odděleny. Matrixový protein (MA), který je syntetizován jako N-terminální část polyproteinu Gag tvoří vnitřní obal zralého virionu. Je známo, že je MA nejen zodpovědný za cílení preintegračního komplexu do jádra napadené buňky, ale také molekul Gag do místa skládáni. Tyto funkce plní MA prostřednictvím interakcí s celou řadou buněčných proteinů. Pro hledání interakčních partnerů proteinu MA byla použita metoda dvojhybridního kvasinkového systému a jedním z identifikovaných interagujících proteinů byla β1 podjednotka coatomeru (COPB1). Coatomer je druhem váčků, transportující proteiny na základě specifického motivu z Golgiho aparátu do endoplasmatického retikula. Cílem práce bylo ověření nalezené interakce dalšími metodami a příprava konstruktu pro expresi proteinu COPB1 v bakteriálních
12
buňkách. Podařilo se připravit plasmid pTriEx-4-COPB1, byla provedena a ověřena produkce proteinu COPB1 v buňkách Escherichia coli z tohoto vektoru. Study of interaction of Mason-Pfizer monkey virus matrix protein with the complex of vesicular transport systém COP I Study of interaction of Mason-Pfizer monkey virus matrix protein with the complex of vesicular transport system COP I Suitable model for studying the life cycle of retroviruses is the Mason - Pfizer monkey virus (M-PMV). Contrary to HIV, the individual steps of its life cycle, i.e. the transport of precursors of viral particles to the place of assembly and budding process are temporally and spatially separated. Matrix protein (MA), which is synthesized as an N-terminal part of Gag polyprotein form the inner coat of a mature virion. It is known that MA is not only responsible for targeting the preintegration complex to the nucleus of infected cell, but also the Gag molecules to the place of composing. MA carries out these functions through interactions with many cellular proteins. To search for MA protein interaction partners has been used method of yeast two hybrid system and one of the interacting proteins was identified β1 subunit of coatomer (COPB1). Coatomer is a type of vesicle which transports proteins based on a specific motif from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum. The aim of this work was to verify the found interaction by other methods and preparation of the construct for protein COPB1 expression in bacterial cells. We managed to prepare plasmid pTriEx-4-COPB1, it was carried out and verified the production of COPB1 protein in cells of Escherichia coli from this vector. Bc. Eliška Vohradská: Numerické modelování a simulace genetických sítí (doc. Ing. Vojtěch Spiwok, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Z nezávislých experimentálních dat a pomocí počítačového modelu regulace genové exprese se podařilo identifikovat expandovanou genetickou síť regulace cyklinů Saccharomyces cerevisae a vypočítat parametry modelu pro jednotlivé regulační interakce uvnitř sítě. Zjištěné interakce odpovídají jednak statickým vazebným měřením, jednak splňují podmínky dané kinetikou transkripce. Výsledná síť tak představuje další přiblížení k systémové analýze regulace buněčného cyklu. Kompletní matematický popis genetické sítě tak umožnil vytvořit podmínky pro virtuální experimenty na této síti. Provedená in silico mutagenze na minimalizované genetické síti regulace cyklinů ukázala limity použitelnosti mutageneze jako prostředku identifikace kauzálních vztahů mezi deletovaným genem a geny níže v regulační kaskádě. Kombinace experimentálních dat a matematického modelování buněčných regulačních procesů tak představuje příspěvek ke zlepšení porozumění funkce buňky jako dynamického samoorganizovaného systému. Numerical modelling and simulation of genetic networks An expanded genetic network controling cyclins in Saccharomyces cerevisae was identified, using independent experimental data and a computational model of gene expression control. The identified interaction conform to static binding measurements and satisfy conditions given by the kinetics of transcription. Resulting network represent additional approach to the systems analysis of cell cycle control. Complete mathematical description of the genetic network created conditions for virtual experiments on the identified network. In silico mutagenesis in the minimized genetic network controling cyclins revealed limits for use of mutagenesis for identification of causal relations among deleted gene and genes lower in the regulatory cascade. Combination of experimental data and mathematical modeling of cell
13
regulatory processes thus represent a contribution to improved understanding of the cell function as dynamic selforganized system. Bc. Pavla Vykydalová: Vývoj metod pro sledování fyziologického stavu a sporulace u bakterií rodu (Dr. Ing. Petra Patáková, ÚKCHB VŠCHT Praha) Bakterie rodu Clostridium za nepříznivých podmínek vytvářejí klidové stádium - sporu. V této práci byly vybrány jako modelové organismy pro sledování sporulace nepatogenní, solventogenní druhy klostridií – Clostridium beijerinckii CCM 6218, Clostridium pasteurianum NRRL B-598, Clostridium tetanomorphum DSM 4473. Cílem experimentů byl vývoj metody využívající elektronovou a/nebo světelnou mikroskopii společně s analýzou buněk na průtokovém cytometru ke sledování průběhu sporulace. Srovnání mikroskopických technik ukázalo, že pro rozlišení všech stádií sporulace je nejvhodnější světelná mikroskopie s fázovým kontrastem. Při elektronové mikroskopii ultratenkých řezů buněk bylo možné sledovat akumulaci granulosy a obalové vrstvy spor, ale tato technika vyžaduje náročnou přípravu vzorku. Fyziologický stav populace byl sledován pomocí fluorescenčních sond karboxyfluorescein diacetát (CFDA), propidium jodid (PI) a bis-(1,3-dibutylbarbiturová kyselina) trimethin oxonol (BOX), které byly vyhodnoceny jako vhodné pro monitorování všech stádií sporulace. Development of methods for monitoring physiological state and sporulation of Clostridium Bacteria of genus Clostridium produce under unfavorable conditions resting stage - the spore. In this work non-pathogenic, solventogenic Clostridium species - Clostridium beijerinckii CCM 6218, Clostridium pasteurianum NRRL B-598 and Clostridium tetanomorphum DSM 4473 were chosen as model organisms for monitoring sporulation. The aim of the experiments was development of a method combining electron and/or light microscopy with flow cytometry analysis to monitor the stages of sporulation. Comparison of microscopic techniques showed the best technique for distinguishing all stages of sporulation is the light microscopy with phase contrast. Electron microscopy of ultra-thin cells sections enabled to monitor the accumulation of granulose and also the spore coat, but this technique required sophisticated sample preparation. Physiological state of the population was studied using fluorescent probes - the carboxyfluorescein diacetate (CFDA), propidium iodide (PI) and bis(1,3-dibutylbarbiture acid) trimethin oxonol (BOX), which were assessed as suitable for monitoring of all stages of sporulation. Na závěr bych chtěl popřát všem “čerstvým inženýrkám a inženýrům” úspěšný start jejich profesní kariéry, hodně štěstí a spokojenosti v osobním životě a byl bych rád, kdyby na svoji Alma Mater nezapomněli a udržovali s ní kontakty i v budoucnosti.
14
