Studi ekspresi B-cell lymphoma-2 (BCL-2) dan Interleukin-2 (IL-2) pada uterus tikus (Rattus norvegicus)

Studi ekspresi B-cell lymphoma-2 (BCL-2) dan Interleukin-2 (IL-2) pada uterus tikus (Rattus norvegicus) model kanker mammae hasil induksi 7,12-Dimethylbenz (α)antrasene (DMBA) Multiple lowdose (MLD)

Study expression of B-cell lymphoma-2 (BCL-2) and Interleukin-2 (IL-2) on uterine rat (Rattus norvegicus) mammary cancer models induced by multiple lowdose (MLD) 7,12-dimethylbenz (α) antrasene (DMBA)

Neny Novita Widiyanti, Sri Murwani dan Dyah Ayu Oktavianie A.P Program Studi Kedokteran Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya [email protected] ABSTRAK Kanker mammae adalah tumor ganas yang jaringan mammae dan dapat dipicu oleh agen karsinogenik 7,12–dimethylbenz(α)antrhacene (DMBA). Induksi DMBA dapat menyebabkan peningkatan ekspresi Beta cell Lyphoma-2 (BCL-2) dan inflamasi sistemik pada uterus yang ditandai dengan peningkatan ekspresi Interleukin-2 (IL-2). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh induksi DMBA MLD terhadap ekspresi BCL-2 dan IL-2 pada uterus tikus. Metode penelitian ini adalah true experimental laboratory dengan menggunakan tikus betina yang berumur 10-12 minggu dan berat badan 150-200 gram sebagai hewan coba yang dibagi menjadi dua kelompok yaitu kontrol dan perlakuan. Pembuatan keadaan kanker mammae dilakukan dengan induksi DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB secara subcutan pada mammae sebanyak 10 kali dan estrogen dengan dosis 20.000 IU/kg BB secara intramuscular. Parameter yang di amati adalah ekspresi BCL-2 dan IL-2 dengan metode imunohistokimia. Analisa data dilakukan dengan parametik uji T tidak berpasangan. Hasil Penelitian menunjukkan bahwa induksi DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB dan estrogen dengan dosis 20.000 IU/kg BB dapat meningkatkan ekspresi BCL-2 uterus sebanyak 341,55% (12,54 ± 2,55) dan meningkatkan ekpresi IL-2 uterus sebanyak 1352,94% (14,82 ± 2,01) pada kelompok perlakuan. Kesimpulannya induksi DMBA MLD dengan dosis 10 mg/kg secara subcutan pada mammae dan estrogen dengan dosis 20.000 IU/kg BB dapat meningkatkan ekspresi BCL-2 dan IL-2 pada uterus tikus (Rattus norvegicus). Kata Kunci : Kanker Mammae, DMBA, IL-2, BCL-2 ABSTRACT Mammary cancer is a malignant breast tumor that can be triggered by 7,12dimethylbenz(α)antrhacene (DMBA) as a carcinogenic agent. DMBA induction can lead to increasing of Beta cell Lyphoma-2 (BCL-2) expression and systemic inflamation on reproductive organs such as uterine which was characterized by increasing of Interleukin-2 (IL-2) expression. This research was aimed to find out the effect of DMBA induction on uterine BCL-2 and IL-2 expression of rat (Rattus norvegicus). The method of this study was true experimental laboratory that used 10-12 weeks female rats with 150-200 grams body weight as animal models and divided into two groups: control and treatment group. The mammary cancer models were conducted by induction of DMBA with doses of 10 mg/kg subcutaneusly on mammae for 10 times and estrogen with dose of 20.000 IU/kg BW intramuscularly. The parameters of this study were the expression of BCL-2 and IL-2 that determined by immunohistochemistry method. Data were analyzed using independent T-test. The results showed that induction of DMBA with the dose of 10 mg/kg BW and estrogen dose of 20.000 IU/kg BW could increase the expression of uterine BCL-2 and IL-2 as much as 341,55% (12,54 ± 2,55) and 1352,94% respectively (14,82 ± 2,01). The conclusion is the induction of MLD DMBA with the dose of 10 mg/kg BW on mammae subcutaneously and estrogen with dose of 20.000 IU/kg BW can increase the expression of BCL-2 and IL-2 on rat uterine. Keywords : Mammary cancer, DMBA, IL-2, BCL-2

1

2 ini terdapat pada permukaan sel (Baratawidjaja, 2004). Induksi DMBA pada mammae, tidak hanya mempengaruhi organ mammae saja tetapi juga adanya kemungkinan mempengaruhi organ lain seperti uterus. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh induksi DMBA MLD dengan dosis 10 mg/kg BB (Modifikasi Cordeiro dan Kaliwal, 2011) terhadap ekspresi BCL-2 dan IL-2 pada organ uterus, karena belum banyaknya penelitian tentang pengaruh induksi DMBA pada kanker mammae terhadap organ uterus, hal ini mendorong penulis untuk melakukan penelitian lebih lanjut tentang kemungkinan tersebut.

PENDAHULUAN Kanker adalah kondisi sel kehilangan mekanisme normal dan pengendaliannya sehingga terjadi pertumbuhan yang tidak normal, cepat dan tidak terkendali (Hartati, 2008). Kanker mammae adalah salah satu neoplasma yang paling umum pada anjing betina, yaitu sebesar 52% dari semua neoplasma ganas. Kanker mammae pada hewan dapat disebabkan karena berbagai faktor seperti hormon, faktor lingkungan, gaya hidup, konstitusi genetika dan sinar UV (Polton, 2009). Senyawa karsinogen untuk menginduksi kanker mammae pada tikus yang sering digunakan dalam penelitian sebelumnya adalah senyawa 7,12dimethylbenz(α)antrasene (DMBA) (Singletary et al., 1997 ; Anderson et al., 1999 ; Kubatka et al., 2002). Mekanisme aktivasi DMBA yang dapat mengubah DMBA menjadi intermediate reaktif melibatkan enzim sitokrom P-450 yaitu menghasilkan epoksid dihidrodiol yang dapat merusak DNA (Melendez-Colon et al., 1999). Sel kanker berpotensi untuk melakukan apoptosis dan proliferasi sel yang tinggi. Protein dalam kelompok proapoptosis adalah BAX, BAK, dan BOK sedangkan yang termasuk protein yang termasuk antiapoptosis adalah BCL-2 dan BCL-XL. Protein proapoptosis menginduksi pelepasan sitokrom C melalui aktivasi caspase bersama Apaf-1. Pengaturan apoptosis tergantung rasio relative dari BCL-2 dan dimerisasinya. Homodimer BCL-2 akan menghambat apoptosis dan homodimer BAX menginduksi apoptosis (Sekti dkk., 2010). Sistem imunitas tubuh mengenali sel kanker sebagai nonself yang bersifat antigenik, sehingga akan menginduksi respon imun humoral dan seluler. Respon imun yang lebih banyak berperan adalah respon imun selular daripada respon imun humoral, meskipun tubuh tetap membentuk antibodi tehadap antigen tumor. Antigen dapat merangsang proliferasi limfosit T yang diatur oleh IL-2 terhadap reseptornya. Reseptor IL-

MATERI DAN METODE Perlakuan Hewan Coba Hewan coba menggunakan tikus (Rattus norvegicus) strain Sprague dawley betina, yang dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok kontrol adalah tikus sehat yang hanya diberi makan dan minum sedangkan kelompok perlakuan adalah tikus yang di induksi DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB dan estrogen 20.000 IU/kg BB. Penggunaan hewan coba telah mendapat sertifikat laik etik oleh Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya Nomor189KEP-UB. Perhitungan Dosis DMBA dan estrogen Dosis DMBA yang diberikan pada kelompok perlakuan yaitu 10 mg/kg BB yang merupakan modifikasi dari Cordeiro dan Kaliwal (2011), DMBA dilarutkan dengan minyak biji bunga matahari dan NaCl fisiologis dengan perbandingan 3:1 (Pugalendhi et al., 2011). Dosis estrogen yang diberikan pada kelompok perlakuan yaitu 20.000 IU/kg BB merupakan modifikasi dari Naciff et al., (2002). Pembuatan Hewan Model Kanker Mammae Pembuatan hewan model kanker mammae dilakukan dengan cara tikus diinduksi DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB

2

secara subcutan pada mammae setiap dua hari sekali sebanyak sepuluh kali induksi dan Induksi estrogen dengan dosis 20.000 IU/kg BB secara intramuscular setiap empat hari sekali yang diberikan dengan waktu bergantian dengan induksi DMBA.

dengan antibodi primer dalam susu skim 1% dalam pbs-tween suhu 4oC (24 jam). Slide dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x menit). Inkubasi dengan antibodi sekunder goat anti-rabbit berlabel biotin dengan suhu ruang (1 jam). Dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Ditetesi dengan SA-HRP dalam suhu ruang (45 menit) dan dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Ditetesi dengan DAB (Diamano Benzidine) dalam suhu ruang (30 menit) dan dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Counterstaning dengan Mayer Hematoxylen (10 menit) lalu direndam dalam air kran (10 menit). Slide dicuci dengan akuades dan dikeringkan kurang lebih satu malam. Dibilas dengan aquades dan dikeringkan. Mounting slide dengan entelan lalu keringkan dalam suhu ruang dan ditutup dengan cover glass (Hayat, 2005).

Pengamatan tikus pasca induksi DMBA Tikus yang sudah diinduksi DMBA dilakukan penimbangan berat badan dan palpasi pada daerah mammae. Palpasi dilakukan setiap satu minggu sekali untuk mengetahui perkembangan kanker sampai terbentuknya nodul pada mammae tikus. (Hamid dan Meiyanto, 2009). Pengambilan Organ Uterus Tikus Pengambilan organ uterus tikus dilakukan pada hari ke 28. Langkah pertama tikus dimasukan dalam wadah yang berisi kloroform. Setelah itu tikus diletakkan posisi terlentang dan dilakukan insisi pada bagian abdomen, kemudian organ uterus diambil. Organ uterus dicuci dengan NaCl fisiologis 0,9% dan selanjutnya uterus dimasukkan dalam PFA 4%.

Pengamatan Ekspresi BCL-2 dan IL-2 Perhitungan persentase area ekspresi IL-2 dan BCL-2 diamati menggunakan mikroskop olympus dengan perbesaran 400x sebanyak lima lapang pandang dan di analisa menggunakan software Axio Vision.

Pembuatan preparat histopatologi

Analisis Data

Proses pembuatan preparat histopatologi terdiri dari fiksasi, dehidrasi dan infiltrasi penjernihan, infiltrasi paraffin, embedding, sectioning dan penempelan di gelas objek (Muntiha, 2001).

Data yang diperoleh dari penelitian ini adalah data kuantitatif yang kemudian dianalisa menggunakan independent T test dengan α=0,05.

Pewarnaan Preparat dengan Imunohistokimia BCL-2 dan IL-2

HASIL DAN PEMBAHASAN

Preparat uterus direndam ke dalam xylol I, xylol II, ethanol absolut 1, ethanol absolut 2, ethanol 90%, ethanol 80%, ethanol 70%, ethanol 30% dan aquades selama (5 menit). Preparat dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Unmusking dalam buffer sitrat pH 6 dan edta pH 8 (10-20 menit) suhu suhu 9oC dan cuci dengan akuades. Jaringan ditetesi 3% H2O2 (10 menit) lalu dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit) dan diblok dengan susu skim 1% dalam PBS 30 menit suhu ruang. Jaringan dicuci dengan PBS pH 7,4 selama (3x5 menit). Jaringan diinkubasi

Metode untuk mengetahui keberhasilan pembuatan hewan model kanker adalah dengan cara melakukan palpasi pada daerah mammae setiap satu minggu sekali (Hamid dan Meiyanto, 2009). Pada penelitian ini nodul kanker pertama muncul pada hari ke 14 setelah induksi pertama kali. Pada hari ke 28 nodul sudah mengeras dan tidak dapat digerakkan. Menurut Khasanah (2013) adanya benjolan pada daerah mammae yang sudah mengeras dan tidak beraturan menunjukkan terjadinya kanker mammae. Pernyataan tersebut membuktikan bahwa

Pemeriksaan Nodul Kanker

3

induksi DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB dua hari sekali sebanyak 10 kali secara subcutan pada mammae dan estrogen dengan dosis 20.000 IU/kg BB empat hari sekali secara intramuscular dapat menginisiasi kanker mammae. Dalam penelitian ini pemberian induksi DMBA MLD dengan interval waktu 48 jam dapat menjaga kondisi DMBA dalam darah tetap stabil (Kuhl, 2013). Selain itu induksi DMBA dilakukan langsung ke organ target yaitu mammae sehingga mempercepat DMBA untuk

mencapai sel targetnya. Hasil penelitian ini terbentuknya nodul lebih cepat dibandingkan dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Ranasasnita (2008) menggunakan tikus SD yang berusia 38 hari, dimana induksi DMBA dilakukan secara oral dengan dosis 20 mg/kg BB dan nodul kanker pertama muncul 24 hari setelah induksi terakhir. Nodul terbentuk akibat dari sel yang mengalami perkembangan yang berlebih (proliferasi) sehingga berbentuk massa padat (Wongso dan Iswahyudi, 2013).

A

B

Gambar 1. Pemeriksaan Nodul kanker Ket : A = tikus kontrol dan B = tikus perlakuan (pasca induksi DMBA10 mg/kg BB dan estrogen 20.000 IU/kg BB), ( ) = nodul.

Pengaruh induksi DMBA terhadap ekspresi Beta cell lymphoma 2 (BCL-2) pada Uterus tikus (Rattus norvegicus)

bahwa induksi DMBA dan estrogen dapat menyebabkan peningkatan ekspresi BCL-2 (Gambar 2). Ekspresi BCL-2 pada uterus ditunjukkan dengan adanya warna coklat pada sitoplasma.

Hasil penelitian ini menunjukkan A

B

Gambar 2 : Ekspresi BCL-2 pada uterus tikus (Perbesaran 400x) Ket : A= tikus kontrol dan B = tikus perlakuan (pasca induksi DMBA 10 mg/kg BB dan estrogen 20.000 IU/kg BB), ( ) = ekspresi BCL-2.

4

Rata-rata persentase area ekspresi BCL-2 pada jaringan uterus tikus kelompok perlakuan mengalami peningkatan yang

signifikan dibandingkan pada jaringan uterus tikus kelompok control (Tabel 1).

Tabel 1. Persentase area Ekspresi BCL-2 pada uterus tikus Rata-rata persentase area ekspresi BCL-2

Peningkatan (%)

(A) Kontrol

2,84 ± 0,79

0

(B) Perlakuan

12,54 ± 2,55

341,55

Kelompok Perlakuan

Hasil analisa menggunakan uji T tidak berpasangan menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan (P˂0,05) antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan. Pada kelompok kontrol terdapat ekspresi BCL-2 yang lebih sedikit dibandingkan kelompok perlakukan karena BCL-2 secara normal digunakan untuk menentukan respon suatu sel terhadap stimulus apoptosis melalui jalur instrinsik yang terdapat pada membran mitokondria bagian luar, retikulum endoplasma dan membran inti (Chou et al., 1999). Induksi DMBA secara subcutan pada mammae menyebabkan DMBA berikatan dengan Aryl hydrocarbon receptor (Ahr) di sitosol, lalu menuju nukleus berikatan dengan Aryl receptor nuclear translocator (ARNT) sehingga mengaktivasi enzim sitokrom P-450 (Lin et al., 2002). Aktivasi sitokrom p-450 ini juga dipengaruhi oleh hormon estrogen dalam tubuh. Hormon estrogen didalam tubuh yang paling banyak estradiol (Clemons and Goss, 2001). Estradiol digunakan sebagai ligan dari reseptor estrogen dan substrat dari sitokrom P450 (James et al., 2006). Senyawa DMBA dioksidasi sitokrom P450 (CYP1B1) menjadi 3,4-epoxides, lalu menjadi metabolit proximate carcinogenic yaitu DMBA-3,4diol melalui reaksi hidrolisis oleh microsomal epoxide hydrolase (MEH). Metabolit ini akan dioksidasi oleh CYP1A1 atau CYP1B1 menjadi metabolit ultimate carcinogenic yaitu DMBA-3,4-diol-1,2epoxide yang merupakan metabolit reaktif dari DMBA (Smith, 2000). Metabolit reaktif

dari DMBA akan menyebabkan kerusakan DNA (Meiyanto dkk., 2007). Kerusakan DNA dapat menyebabkan mutasi gen P53. Inaktivasi P53 dapat menyebabkan peningkatan ekspresi BCL-2. Dimana BCL-2 adalah protein yang berperan untuk mengatur atau menghambat apoptosis. Ekspresi berlebih dari BCL-2 akan mencegah pelepasan sitokrom C sehingga ikatan antara sitokrom C dengan Apoptotic protease activating factor 1 (Apaf-1) dan ATP untuk membentuk apoptosome tidak terjadi. Hal ini menyebabkan caspase-9 tidak dapat diaktifkan sehingga terjadi hambatan apoptosis. (Bors et al., 1990 ; Kirkin et al., 2004 ; Skommer et al., 2010 ). Peningkatan ekspresi BCL-2 akan mempengaruhi fungsi proapoptosis sehingga akan menyebabkan penurunan apoptosis yang dapat menimbulkan kanker (Lumongga, 2008). Hasil penelitan ini menunjukkan terdapat peningkatan yang signifikan ekspresi BCL-2 pada uterus. Terjadinya peningkatan ini disebabkan karena hormon estrogen yang tinggi dan reseptor estrogen yang meningkat memicu terjadinya proliferasi sel uterus. Proliferasi sel uterus akan ditandai dengan peningkatan ekspresi BCL-2 yang merupakan gen antiapoptosis. Ekspresi BCL2 pada uterus yang meningkat akan menghambat gen proapoptosis yaitu BAX dan menyebabkan penurunan kemampuan apoptosis sel (Cahyanti, 2008). Adanya peningkatan ekspresi BCL-2 pada uterus dimungkinkan dapat memicu proliferasi sel uterus dan memunculkan kanker pada uterus.

5

Pengaruh induksi DMBA terhadap ekspresi Beta cell lymphoma 2 (BCL-2) pada Uterus tikus (Rattus norvegicus)

menyebabkan peningkatan ekspresi IL-2 (Gambar 3). Ekspresi IL-2 pada uterus tikus ditunjukkan dengan adanya warna coklat pada sitoplasma.

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa induksi DMBA dan estrogen dapat A

B

Gambar 3 : Ekspresi IL-2 pada uterus tikus (Perbesaran 400x) Ket : A = Uterus tikus kontrol dan B = uterus tikus Perlakuan (pasca induksi DMBA 10 mg/kg BB dan estrogen 20.000 IU/kg BB),( ) = ekspresi IL-2

Rata-rata persentase area ekspresi IL-2 pada uterus tikus kelompok perlakuan mengalami peningkatan yang signifikan

dibandingkan pada jaringan uterus tikus kelompok kontrol negatif (Tabel 2).

Tabel 2. Persentase area Ekspresi IL-2 pada uterus tikus Kelompok (A)

Kontrol Negatif

(B)

Perlakuan

Rata-rata presentase area ekspresi IL-2 ± SD 1,02 ± 0,54 14,82 ± 2,01

Hasil analisa menggunakan uji T tidak perpasangan menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan (P<0,05) antara kelompok kontrol dan perlakuan. Pada kondisi normal sitokin terdapat di dalam tubuh sebagai sistem kekebalan. Sitokin IL-2 merupakan protein yang dihasilkan oleh sel Th1 untuk membantu sistem kekebalan tubuh memicu respon imun (Baratawidjaya, 2004). Hasil induksi DMBA pada tikus secara subcutan pada mammae menyebabkan DMBA menjadi bentuk yang reaktif yang diubah oleh sitokrom

Peningkatan (%) 0 1352,94

P450 yaitu ultimate carsinogen berupa senyawa epoksida dihidrodiol yang merupakan metabolit aktif dari DMBA (Rowlands et al., 2001). Metabolit aktif DMBA ini dapat membentuk DNA adduct dan menginduksi reactie oxygen spesies (ROS) (Weimer et al., 2000). Reactive oxygen species (ROS) yang terangkut aliran darah keseluruh tubuh akan menyebabkan inflamasi sistemik pada uterus. Reactive oxygen species yang mengalami peningkatan sangat berbahaya karena memiliki sifat reaktifitas tinggi. Keberadaan ROS yang berlebihan akan

6

menyebabkan terjadinya stres oksidatif. Stres oksidatif terjadi karena adanya ketidak seimbangan antara radikal bebas dan antioksidan dalam tubuh yang dapat menyebabkan kerusakan sel yang ditandai dengan penurunan kadar antioksidan tubuh (Fiqriyana, 2010). Sel yang mengalami kerusakan akan mengaktivasi pelepasan dari mediator inflamasi. Adanya mediator inflamasi akan mendorong aktivasi dari platelet sehingga menyebabkan peningkatan permeabilitas dan dilatasi dari pembuluh darah. Keadaan ini akan memicu monosit ke bagian jaringan yang mengalami luka dan berdiferensiasi menjadi makrofag (Boyer et al., 2000). Aktivasi makrofag menghasilkan radikal bebas dan sitokin proinflamasi IL-2. (Abbas et al., 1991). Interleukin-2 akan menstimulasi terjadinya inflamasi sistemik pada uterus. Interleukin-2 merupakan hasil sekresi dari sel Th1 yang teraktivasi oleh aktivitas makrofag akan merangsang sel tersebut untuk memperbanyak diri dan menghasilkan sitokin yang lebih aktif lagi (Campbell, 2004). Pernyataan tersebut menyebabkan ekspresi IL-2 pada jaringan uterus meningkat. Sitokin IL-2 berfungsi sebagai faktor pertumbuhan autokrin dan memicu pertumbuhan dan diferensiasi sel T CD8 menjadi sel T sitotoksik (Abbas et al., 1991).

SARAN 1. Perlu dilakukan penelitian lanjutan adanya metastase kanker mammae ke uterus akibat induksi DMBA. 2. Perlu dilakukan penelitian induksi DMBA dengan dosis yang berbeda untuk mengetahui dosis yang paling optimal dalam pembuatan hewan coba kanker mammae. UCAPAN TERIMAKASIH Peneliti mengucapkan terima kasih kepada analis dan staf Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran dan Laboratorium Biokimia Fakultas MIPA Universitas Brawijaya yang telah membantu dalam penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA Abbas, A.K., A.H. Lichtman and J.S. Pober. 1991. Cellular and molecular immunology. WB Saunders Company: Philadelphia. Anderson, L.E., G.A. Boorman., J.E. Morris., L.B. Sasser., P.C. Mann., S.L. Grumbein., J.R. Hailey., A. Mc Nally, R.C. Sills and J.K Haseman. 1999. Effect of 13 weeks Magnetic Fields Exposure on DMBA-Initiated Mammary Gland Caricinomas in Female Sprague-Dawley Rats. Carcinogenesis 20 (8) : 1615-1620.

KESIMPULAN 1. Induksi DMBA secara subcutan pada mammae dapat menyebabkan kanker mammae dengan terbentuknya nodul yang mengeras pada mammae. 2. Induksi DMBA secara subcutan pada mammae dapat meningkatkan ekspresi BCL-2 dan IL-2 pada uterus tikus sebanyak 341,55% dan 1352,94%, dengan adanya peningkatan tersebut memungkinkan kanker mammae sudah mengalami metastase ke uterus.

Baratawidjaja, K. 2004. Imunologi dasar. Balai Penerbit Fakultas Kedokteran. Universitas Indonesia : Ed 6 Jakarta. Bors W., W. Heller., C. Michel., M. Saran., 1990. Flavonoids as antioxidants: Determination of radical scavenging efficiencies. Methods Enzymol. 186: 343- 55. Boyer, B., A.M. Valles and N. Edme. 2000. Induction and regulation of epithelial-mesnchymal transitions. Biochem Pharmacol. 60:10911099.

7

Cahyanti, R.D. 2008. Bcl-2 dan indeks apoptosis pada hiperplasia endometrium non-atipik simpleks dan kompleks [tesis]. Program Pasca Sarjan Magister Ilmu Biomedik dan Program Pendidikan Dokter Spesialis I obstetri Ginekologi. Universitas Diponegoro. Ceccarelli, C. 2005. Concurent EGFr and Cox-2 Expression in Colorectal Cancer : Proliferation Impact And Tumor Spreading. Annonc. 15 : 74-9. Chou, J.J., H. Li., G.S Salvesen., J. Yuan and G. Wagner. 1999. Solution Structure of Bid, an Intracellular Amplifier of Apoptotic Signaling. Cell. 96 : 615- 624. Clemons, M. and P. Goss., 2001, Estrogen and the risk of breast cancer, N. Engl. J. Med. 344(4). 276-285. Cordeiro, M.C and B.B. Kaliwal., 2011. Antioxidant activity of bark extract of bridelia retusa spreng on DMBA induced mammary carsinogenesis in female sprague dawley rats. Journal of pharmacognosy. 2:14-20. Fiqriyana, M.A., 2010. Pengaruh pemberian ekstrak Euchema spinom terhadap kadar glukosa dalam darah dan aktivitas superoksida dismutase (SOD) pada tikusterpapar multiple low doses streptozotocin (MLDSTZ) [Skripsi]. Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam. Universitas Brawijaya. Hamid, I.S dan E. Meiyanto. 2009. Modulasi CYP1A1 dan GST serta ekspresi P53 dan Ras setelah induksi 7,12-Dimethyl Benz(ά)antrasen (DMBA) dan pemberian anti karsinogenesis Gynura Procumbens dan curcuma zedoaria pada tikus galur Sprague dawley. J Penelit Med Eksakta. 8(3) : 168-177. Hartati, A.C. 2008. Konsep Diri dan Kecemasan Wanita Penderita Kanker Payudara di Poli Bedah Onkologi Rumah Sakit Umum Pusat Haji Adam Malik Medan [skripsi].

Fakultas Kedokteran. Universitas Sumatra Utara. Hayat, M.A. 2005. Handbook of Immunohistochemistry and in situ Hybridization of Human Carcinomas, Volume 3 Molecular Genetics, Liver Carcinoma, and Pancreatic Carcinoma. Department of Biological Sciences. Kean University Union, New Jersey. James, D., Ph.D. Yoger., E. Nancy and M.D. Davidson. 2006. Estrogen carsinogenesis in breast cancer. The new england journal of medicine. 354:270-82. Khasanah, S.T. 2013. Karsinoma mammae stadium IV dengan tanda-tanda dyspnoe dan paraplegi ekstremitas inferior. Medula. 1(2). Kirkin., S. Joos., M. Zornig., 2004. The role of Bcl-2 family members in tumorigenesis. Biochim Biophys Acta. 1644: 229-49. Kubatka, P., E. Ahlersova., I. Ahlers., B. Bojkova., K. Kalicka., E. Adamekova., M. Markova., M. Chamilova., and M. Cermakova. 2002. Variability of Mammary Carsinogenesis Induction in Female Sprague-Dawley and Wistar: Han Rats : the Effect of Season and Age. Physiol. 51 : 633-640. Kuhl, R. 2013. Consideration for use of dimethylbenz(a)anthracene(DMBA). Madison : Environment health and safety departement of University of Wiscosin. Lin, P., W. Suh., H. Tzu., 2003. Correlation between Gene Expression of Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR), Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (Arnt), Cytochromes P4501A1 (CYP1A1) and 1B1. Lumongga, F. 2008. Apoptosis. Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran. Universitas Sumatra Utara : Medan. Melendez-Colon, V., Luch, A., Seidel, A., and Baird, W.M., 1999. Cancer

8

Initiation by Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Results from Formation of Stable DNA Adducts rather than Apurinic Sites. Carcinogenesis. 20(10) 1885-1891.

and Whey Proteins Downregulate DMBA-Induced Liver and Mammary Gland CYP1 Expression in Female Rats. Journal of Nutrition. 131 : 3281-3287. Sekti, D.A., M.F. Mubarok., I. Armandani., S. Junedy., E. Meiyanto. 2010. Ekstrak Etanolik Daun Awar-Awar (Ficus Septica Burm, F) Memacu Apoptosis Sel Kanker Payudara MCF-7 Melalui Penekanan Ekspresi BCL-2. Majalah Obat Tradisional. 15(3) : 100-104. Singletary, K., C. Macdonald and M. Wallig. 1997. The Plasticizer Benzyl Butyl Phtalate (BBP) Inhibits 7,12dimethylbenz(a)anthracene (DMBA)-induced rat Mammary DNA Adduct Formation and Tumorigenesis. Carsinogenesis. 18 (8) 1669-1673. Skommer, J., T. Brittain., S. Rayhaudhuri. 2010. Bcl-2 inhibits apoptosis by increasing the time-to-death and intrinsic cell-to-cell variations in the mitochondrial pathway of cell death. Apoptosis 15:1223–1233. Smith, A.D. 2000. Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology. Revised Ed. London : Oxford University Pr. pp. 345. Weimer, T.L., A.P. Reddy., U. Harttig., D. Alexander., S.C. Stamm., M.R. Miller., W. Baird., J. Hendricks and G. Bailey. 2000. Influence of bNaphthoflavone on 7,12Dimethylbenz [a] anthracene Metabolism, DNA Adduction, and Tumorigenicity in Rainbow Trout. Toxicological Sciences.57:217-228. Wongso, H dan Iswahyudi. 2013. Induksi Kanker Pada Tikus Putih Sprague Dawley sebagai Hewan Model Dalam Penelitian Radiofarmaka. Prosiding Seminar Sains dan Teknologi Nuklir. Bandung.

Meiyanto, E., S. Susilowati., S. Tasminatun., R. Murwanti dan Sugiyanto. 2007. Efek Komprehensif Etanolik Gynura Procumbens (Lour), Merr pada Karsinogenesis Kanker Payuara Tikus. 2007. Majalah Farmasi Indonesia. 18(3):154-161. Muntiha, M. 2001. Teknik Pembuatan Preparat Histopatologi Dari Jaringan Hewan dengan Pewarnaan Hematoksilin Eosin (H&E). Temu Teknis Fungsional Non Peneliti. Bogor. Naciff, J.M.M., Lynn J., Suzanne M.T., Gregory J.C., Jay P.T., Gary, J.O., George P.D. 2002. Gene Expression Profile Induced by 17a-Ethinyl Estradiol, Bisphenol a and Genistein In the Developing Female Reproductive System of The Rat. Toxicological sciences. 68 : 184-199. Polton G. 2009. Mammary Tumours in Dogs. Irish Veterinary Journal. 62(1). Pugalendhi, P., S. Manoharan., K. Suresh., N. Baskaran. 2011. Genistein and daidzein, in combination, protect cellular integrity during7,12dimethylbenz(a)antracene (DMBA) induced mammary carcinoogenesis in sprague-dawley Rats. Afr J Tradit Complement Altern Med. 8(2):91-97. Ranasasnita, R. 2008. Aktivitas antikanker ekkstrak Etanol Daun Aglaia Elliptica Blume pada Tikus Betina yang Diinduksi 7,12dimethylbenz(a)antrasena [skripsi]. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor. Rowlands, J.C., L. He, R. Hakkak., M.J.J. Ronis., and T.M. Badger. 2001. Soy

9