Prosiding Skripsi Semester Genap 2010/2011 SK
SK-091304
Studi Awal Pengaruh Permeabilisasi Sel Zymomonas mobilis dan Konsentrasi Substrat untuk Pembentukan Etanol secara Enzimatik
Baity Luthfia *, Refdinal Nawfa Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember
Abstrak Pada penelitian ini telah dilakukan pengaruh komposisi etanol toluen pada permeabilisasi sel Zymomonas mobilis dan pengaruh konsentrasi substrat glukosa pada produksi etanol secara enzimatik. Sel Zymomonas mobilis diinokulasikan dalam medium cair selama 22 jam pada suhu ruang untuk memperoleh biomassa. Permeabilisasi dilakukan dengan menambahkan berbagai komposisi perbandingan etanol dan toluen ke dalam biomassa. Komposisi perbandingan etanol dan toluen yang digunakan adalah 1:4, 2:3, 3:2, 4:1. Pengukuran absorbansi larutan menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 270 nm dilakukan untuk mengetahui keberhasilan proses permeabilisasi.. Untuk mengetahui kandungan etanolnya dilakukan uji secara kualitatif dan dapat dilihat dari perubahan konsentrasi substrat glukosa. Konsentrasi etanol tertinggi yang diasumsikan dari perubahan konsentrasi substrat glukosa terbesar dihasilkan oleh sel Zymomonas mobilis yang dipermeabilisasi menggunakan komposisi etanol toluen 1: 4 dan konsentrasi glukosa 10 % b/v. Kata kunci : Etanol, Permeabilisasi, Enzimatik, Zymomonas mobilis.
Abstract In this research, the composition ethanol toluene effect and substrate concentration effect on permeabilized cell of Zymomonas mobilis have been investigated. Zymomonas mobilis cell were innoculated in liquid medium in 22 hours at room temperature to obtain biomass. Permeabilization was done by adding ethanol toluene into biomassa. The ratio of ethanol toluene compositions are 1:4, 2:3, 3:2, 4:1. Measurement filtrate absorbance using UV spektrophotometer at wavelength 270 nm was done to know the successfully of permeabilization process. To determine the ethanol, qualitatif methode has been done and also from the decreased of glucose concentration. The highest ethanol concentration assumed from the biggest dcreased glucose concentration received from Z. mobilis cell permeabilized with composition ethanol: toluen (1:4) and glucose concentration 10%. Keywords: Ethanol, Zymomonas mobilis., permeabilization, enzimatic
1.
Pendahuluan Kebutuhan energi sekarang ini masih banyak disuplai dari bahan bakar yang berasal dari fosil. Adanya isu lingkungan, fakta akan terbatasnya sumber bahan bakar fosil telah menstimulasi upaya penggunaan dan pengembangan bahan bakar alternatif yang renewable dan ramah lingkungan. Salah satu bahan bakar alternatif yang sangat potensial untuk dikembangkan adalah alkohol (etanol). Etanol berfungsi sebagai penambah volume Bahan Bakar Minyak (BBM), peningkatan oktan dan sebagai sumber oksigen untuk pembakaran yang lebih bersih pengganti Metil Tersier-Butil Eter (MTBE). Etanol dapat juga meningkatkan efisiensi pembakaran karena mengandung 35 % oksigen disamping ramah lingkungan karena emisi kadar karbon monoksidanya, nitrogen oksida dan gas-gas rumah kaca lainnya rendah. Manfaat etanol tidak hanya sebagai bahan bakar tetapi juga digunakan sebagai bahan pelarut dan terdapat sebagai bahan pada kosmetik, minuman, farmasi, industri kimia dan berbagai produk industri lainnya. Produksi etanol dilakukan secara in vitro dalam industri kimia maupun secara in vivo oleh mikroba dalam * Corresponding author Phone : +6285733617522, Prosiding FMIPA e-mail: baity Kimia @chem.its.ac.id 1 Alamat sekarang : Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya.
industri bioteknologi. Bakteri yang banyak digunakan dalam produksi bioetanol adalah Z. mobilis. Keunggulan pembuatan etanol dengan cara penggunaan mikroba adalah rendahnya biaya produksi, prosentase rendemen yang tinggi, proses lebih cepat dan penanganannya lebih sederhana dengan hasil samping yang relatif lebih sedikit. Perkembangan industri dalam beberapa dasawarsa terakhir ini semakin cepat sehingga kebutuhan akan etanol semakin meningkat. Oleh karena itu banyak dilakukan penelitian untuk peningkatan produksi etanol dilakukan dengan eksplorasi terhadap substrat yang digunakan, pencarian galur yang baik, optimasi proses fermentasi dan metoda pembuatannya. Fermentasi etanol secara mikrobial memiliki banyak keuntungan namun menghasilkan limbah biomassa yang cukup banyak, di dalam biomassa tersebut masih mengandung enzim – enzim yang digunakan untuk fermentasi etanol. Hal tersebut memicu lahirnya ide metode amobilisasi enzim. Beberapa manfaat amobilisasi enzim antara lain adalah mencegah difusi enzim ke dalam campuran reaksi dan memperoleh kembali enzim tersebut dari aliran produk dengan teknik pemisahan padat/cair yang sederhana, meningkatkan proses maupun untuk
menghasilkan sesuatu yang baru (Peter, 1997). Amobilisasi enzim dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu penjebakkan enzim pada gel, pengikatan enzim secara kovalen pada zat padat pendukung, enkapsulasi enzim, adsorpsi enzim pada permukaan zat padat, pengikat-silangan dengan bahan bergugus ganda. Permeabilisasi membran sel merupakan salah satu metode amobilisasi enkapsulasi enzim. Kazuhiko dan Kozoo pada tahun 1995 telah melakukan penelitian yang merekontruksi fermentasi etanol menggunakan Saccharomyces cereviseae dengan cara melakukan peningkatan permeabilitas dinding membran selnya. Hasil penelitian ini menunjukan enzim-enzim yang masih ada dalam sel yang terlibat pada pembentukan etanol masih dapat merubah glukosa menjadi etanol meski sel yang digunakan telah mati akibat perlakuan penambahan permeabilitas sel. Proses ini disebut pembuatan etanol secara enzimatis dimana etanol yang dihasilkan bukan lagi merupakan hasil metabolit sekunder karena mikroorganismenya sudah mati. Adanya metode ini mendorong untuk mencoba bakteri lain yaitu Z. Mobilis dengan melihat pengaruh permeabilisasi selnya dan konsentrasi substrat glukosa untuk pembentukan etanol. Penggunaan proses ini nantinya akan dapat menghasilkan kandungan alkohol yang lebih banyak dan tidak menghasilkan limbah biomassa sel karena digunakan sebagai sumber enzim. Enzim ini dapat dipakai berkali-kali karena sudah dalam bentuk teramobil oleh selnya sendiri. 2.2 Prosedur Kerja 2.2.1 Regenerasi Bakteri Z.mobillis Biakan murni Z. mobillis diremajakan pada agar miring(media NA) yang telah disterilisasi pada suhu 121 OC dan tekanan 1 atm selama 15 menit, selanjutnya diinkubasi pada suhu 30 oC selama 24 jam. Z. mobilis pada media ini menjadi stok kultur yang diregenerasi pada media NA yang baru sebelum digunakan. 2.2.2 Penentuan Kurva Pertumbuhan Inokulum dari media agar miring dipindahkan kedalam 5 ml media komplek sebanyak satu jarum ose. Kemudian diinkubasi pada suhu 30 oC selama 20 jam dengan menggunakan pengocok pada kecepatan 100 rpm. Setelah 20 jam medium dipindahkan kedalam 50 ml media komplek yang baru. Setelah diinkubasi selama 20 jam dipindahkan lagi kedalam 450 ml media komplek. Selanjutnya difermentasikan lagi dengan melakukan penyamplingan setiap 2 jam dengan mengambil 10 ml hasil fermentasi dan ditentukan kurva pertumbuhannya dengan metode turbidimetri menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 585 nm. Hasil fermentasi dilakukan pemisahan antara biomassa dengan filtrat cair hasil fermentasi dengan menggunakan sentrifugasi pada kecepatan 2.000 rpm. Terhadap supernatan dilakukan penentuan sisa substrat (glukosa) dengan metoda DNS Sedangkan untuk biomassanya dilakukan pengeringan dengan menggunakan desikator dan ditimbang untuk penentuan berat keringnya. Setelah diperoleh waktu maksimum untuk menghasilkan etanol, selanjutnya dilakukan kembali fermentasi untuk mendapatkan biomassa yang lebih banyak dengan lama waktu fermentasi yang telah diperoleh sebelumnya. Biomassa yang diperoleh digunakan untuk sumber enzim dengan perlakuan peningkatan permeabilitas sel. Prosiding Kimia FMIPA
2.2.3 Permeabilisasi Sel Z.mobillis Sel Z.mobillis yang diperoleh dari hasil sebelumnya diambil sebanyak 0,1 gram dan dipermeabilisasi dengan cara menambahkan 2 mM EDTA lalu diinkubasi selama 5 menit pada suhu 30°C kemudian ditambahkan campuran 0,075% SDS dan etanol : toluen dengan variasi perbandingan konsentrasi seperti pada Tabel 2.1. Kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu 30°C. Sel Z.mobillis yang telah dipermeabilisasi dipisahkan dari supernatannya dengan disentrifuge pada kecepatan 3000 rpm, suhu 30°C selama 5 menit.Terhadap supernatan ditentukan serapan protein yang terkandung didalamnya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 270 nm. Tabel 2.1 Variasi perbandingan konsentrasi etanol : toluen Etan Tolue ol n (%)
(%)
4
1
3
2
2
3
1
4
2.2.4 Pengaruh Kosentrasi Substrat Glukosa Terhadap Aktivitas Enzim Pembentuk Etanol Sel Z.mobillis yang telah dipermeabilisasi, sebanyak 0,1 gram diinkubasi dengan 200 ml larutan campuran 15 mM MgCl2, 2 mM ATPNa2, 1 mM NAD+, dan variasi glukosa sebesar 5%, 10%, 15%, 20%, 25% (% b/v). Selanjutnya diinkubasi selama 10 menit, dan diuji etanol yang dihasilkan secara kualitatif serta gula reduksinya. 2.2.5 Analisis Kadar Etanol secara Kualitatif Sampel sebanyak 1 mL ditempatkan dalam tabung reaksi. Ditambahkan larutan kalium dikromat dalam asam 1mL, dipanaskan dan diamati perubahan warna pada larutan tesebut. Keberadaan alkohol diindikasikan dengan perubahan warna dari orange menjadi hijau (Jungreis, 1926). Larutan kalium dikromat dalam asam dapat dibuat dengan cara diambil 56 mL asam sulfat 6 N ditambahkan aquades sampai 100 mL, ditambahkan 0,2947 gr padatan kalium dikromat kedalam lautan asam sulfat kemudian ditambahkan aquades lagi hingga 200 mL (Mustanir, 1991) . 2.2.6 Analisis Glukosa Reduksi Analisis glukosa sebagai gula reduksi dilakukan dengan metode DNS. Dalam analisa ini terlebih dahulu dibuat kurva standart glukosa. Larutan glukosa dibuat dengan kadar 2 %, 4%, 6%, 8%, 10% (% b/v). sebanyak 3 ml larutan ini kemudian dimasukkan masing – masing tabung reaksi dan ditambahkan 3 ml larutan asam 3,5- dinitrosalisilat (DNS) diletakkan dalam tabung tertutup yang terlindung dari sinar untuk menghindari berkurangnya larutan yang disebabkan oleh evaporasi, campuran dipanaskan pada suhu 90° C selama 5 menit untuk membentuk warna merah kecoklatan. Larutan ditambahkan 1 ml 40% larutan kalim natrium
tartrat ( garam rochele) untuk menstabilkan warna. Larutan didinginkan sampai suhu kamar, kemudian diencerkan sampai 10 ml dengan aquades kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 530nm. Persamaan garis kurva standart dibuat dengan mengalurkan grafik antara kadar glukosa sebagai gula reduksi dengan absorbansi. Untuk menganalisis kadar glukosa reduksi sampel, sampel cairan di sentrifus pada 2000 rpm selama 15menit. Kemudian dilakukan cara yang sama seperti pembuatan kurva standart glukosa di atas. Hasil pengukuran absorbansi dari setiap larutan sampel dimasukkan pada persamaan garis kurva standart glukosa. 3.Hasil dan Diskusi 3.1 Regenerasi Z. mobilis Bakteri Zymomonas mobilis diregenerasi dalam media padat Nutrien Agar (NA), fungsi media padat NA adalah untuk menumbuhkan bakteri dan menyimpan biakan bakteri sehingga dapat digunakan untuk proses selanjutnya. Pada nutrient agar sudah mengandung zat-zat yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri seperti glukosa, yeast, mineral seperti Fe, agar. 3.2 Kurva Pertumbuhan Bakteri Sel bakteri Z. mobilis yang akan diamobilisasi adalah sel yang telah mencapai usia fase log, karena jumlah sel yang hidup pada fase itu merupakan jumlah yang optimal dan memiliki aktivitas yang aktif dalam mengkonversi substrat glukosa menjadi etanol. Untuk mengetahui waktu pemanenan biomassa pada fase log tersebut, maka dilakukan monitoring pertumbuhan Z. mobilis terhadap fungsi waktu sehingga didapat kurva pertumbuhan (gambar 4.1). Dari kurva pertumbuhan Z. mobilis pada gambar 4.1 terlihat bahwa Z. mobilis tidak mengalami fase lag. Tidak mengalami fase lag karena media starter untuk pertumbuhan bakteri awal sama dengan media fermentasi dan sebelumnya telah dilakukan 2 kali transfer dari starter media kecil ke media besar, dengan waktu inkubasi masing-masing ± 22 jam. Akibatnya usia sel relatif seragam atau homogen. Lama waktu fase lag bergantung pada komposisi media, suhu, PH, aerasi, sifat fisiologis mikroorganisme pada media sebelumnya
Gambar 4.1 Kurva pertumbuhan Z. mobilis Akhir waktu log untuk pertumbuhan Zymomonas mobilis in terjadi pada ± 22 jam. Oleh karena itu pemanenan bakteri dilakukan pada sekitar waktu tersebut. Diantara waktu jam ke 22 – 24 biomassa mengalami fase perlambatan pertumbuhan, dan diatas 24 jam biomassa mulai memasuki fase stasioner. Prosiding Kimia FMIPA
Keseimbangan jumlah keseluruhan bakteri ini karena terjadinya pengurangan derajat pembelahan sel. Hal ini disebabkan oleh kadar nutrisi yang berkurang dan terjadi akumulasi produk toksik yang mengganggu pembelahan sel. Jumlah biomassa diukur dengan menggunakan metode turbidimetri. Meningkatnya turbidimetri dalam kultur adalah indeks lain dari pertumbuhan bakteri dan jumlah biomassa bakteri. Dengan menggunakan spektrofotometer, sinar yang ditransmisikan menurun karena populasi bakteri meningkat. Dengan kata lain absorbansi yang terbaca dari sinar semakin meningkat seiring dengan meningkatnya jumlah bakteri . Oleh karena itu kurva pertumbuhan bakteri dengan menggunakan Optical Density (OD) dapat diterjemahkan ke dalam jumlah bakteri (biomassa) seperti gambar kurva pertumbuhan diatas. Sampel hasil sampling tiap 2 jam setelah ditentukan kurva pertumbuhannya maka ditentukan kadar etanol dan kadar glukosa reduksinya, dan hasilnya dapat dijelaskan dengan gambar 4.2
Gambar 4.2 Pola perubahan sisa glukosa (glukosa10%b/v) Gambar grafik glukosa reduksi di atas tampak bahwa pada 2 jam pertama glukosa yang terkonsumsi cukup banyak yaitu sekitar 32,5 % dan sisa glukosa paling sedikit atau glukosa terkonsumsi paling banyak diperoleh pada jam ke 22. Glukosa yang dikonsumsi digunakan untuk pembentukan biomassa dan pembentukan etanol. Dari grafik di atas dapat dilihat semakin banyak glukosa yang dikonsumsi diasumsikan semakin banyak pula etanol yang dihasilkan. Pada jam ke-22 enzim yang ada di dalam sel mempunyai aktivitas cukup tinggi dalam mengkonversi glukosa menjadi etanol. Fermentasi Zymomonas mobilis ini dilakukan dengan menggunakan media kompleks. Media kompleks merupakan media yang tidak diketahui secara pasti komposisi kimianya. Media ini biasanya mengandung ekstrak yeast, ekstrak beef bahkan pepton. Menurut Dadds (1971) Zymomonas mobilis yang telah berhasil memfermentasi dan mengubah glukosa menjadi etanol di dalam media fermentasi diindikasikan dengan produksi gas yang ada di dalam media tersebut. Bakteri ini menunjukkan turbidan yang besar dan bau yang tidak sedap. Produk samping yang kemungkinan bisa terbentuk dalam fermentasi adalah asetaldehid, asam asetat,asamlaktat, dan gliserol. Stoikhiometri produksi etanol dapat juga ditulis berdasar kesetimbangan ATP sebagai berikut, C6H12O6 + ADP + Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + ATP
Jadi yield etanol secara teoritis adalah 0,51 gram etanol/gram glukosa (El-Mansi, 2007). Bakteri Zymomonas mobilis hanya menghasilkan 1 mol ATP dari 1 mol glukosa. 3.3 Produksi Biomassa Dari data kurva pertumbuhan diketahui bahwa waktu pemanenan biomassa adalah jam ke-22. Fermentasi untuk mendapatkan biomassa lebih banyak dilakukan selama 22 jam dalam media kompleks 500 ml. Biomassa yang didapatkan dikeringkan dengan freeze drying dan ditimbang berat keringnya yaitu sebesar 4,3 gr (gambar 4.3)
akan menghilangkan Ca dan Mg sehingga menjadikan membran sel lebih permeable dan menyebabkan mikromolekul di dalam sel seperti ATP,NADP, FAD, garam- garam keluar dari dalam sel, sehingga yang tersisa adalah makromolekul seperti enzim dan inti sel. Keluarnya mikromolekul tersebut menyebabkan perubahan warna pada sel dan larutan, sel yang telah dipermeabilisasi berwarna lebih pucat daripada sel yang belum dipermeabilisasi sedangkan larutan hasil permeabilisasi berwarna sedikit kekuningan dan bening. Selain itu menurut kazuhiko dan kozo, senyawa senyawa intermediet seperti L-Valin, asam α aminoadipat dan Lsistein juga akan keluar. Gambar 4.4 (a) sel yang diinkubasi dengan berbagai komposisi etanol dan toluen, (b) supernatan hasil permeabilisasi dalam berbagai komposisi etanol dan toluen
Gambar 3.3 Biomassa kering yang belum dipermeabilisasi Selanjutnya biomassa Z. mobilis kering tersebut digunakan dalam proses permeabilisasi sel. 3.4 Hasil Permeabilisasi Sel Sel Z. mobilis pada jam ke 22 yang menghasilkan jumlah sel dan alkohol optimum dan dipermeabilisasi dengan campuran pelarut etanol toluene, SDS. Permeabilisasi sel dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai pelarut organik seperti kloroform dan eter , namun pada penelitian ini digunakan campuran etanol toluene untuk proses permeabilisasi karena larutan organik tersebut dapat mengubah permeabilitas membran plasma. Menurut kazuhiko dan kozoo, penambahan toluene sebanyak 1% pada sacharomycess sereviceae (ragi) telah dapat menyebabkan perrmeabilisasi sehingga pada penelitian ini yang menggunakan Z. mobilis dilakukan variasi komposisi etanol toluene untuk mengetahui pengaruhnya pada permeabilitas membrane dengan variasi komposisi tersebut. Bakteri Z. mobilis merupakan bakteri eukariot gram negatif yang memiliki sistem membran ganda dimana membran plasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini memiliki dinding sel tebal berupa peptidoglikan yang terletak diantara membran dalam dan luarnya. Peptidoglikan adalah polisakarida yang terdiri dari 2 gula turunan yaitu asam N asetil glukosamin dan asam N asetil muramat dan sebuah rantai pendek yang terdiri dari dari asam amino L-alanin, D-alanin, D-asam glutamat, L-lisin. Penambahan etanol dan toluene akan merusak ikatan pembentuk dinding sel dan mengekstrak protein serta lipid pembentuk dinding sel yang berfungsi mengatur transfer nutrisi dari dalam dan keluar sel. Menurut Edebo (1969) penambahan detergen akan mengakibatkan disorganisasi membran sel. Deterjen akan melarutkan sebagian lipida membran sel. SDS yang merupakan detergen berfungsi untuk mengemulsikan lipid dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel dan EDTA sebagai pengkhelat Prosiding Kimia FMIPA
Komposisi etanol dan toluene yang digunakan dalam percobaan ini adalah 1:4, 2:3, 3:2, 4:1. masing –masing perbedaan komposisi atanol dan toluen menunjukkan tingkat permeabilitas yang berbeda. sel yang dipermeabilisasi dengan menggunakan komposisi etanol dan toluen (1:4) menunjukkan warna yang lebih pekat sedikit kekuningan bila dibandingkan dengan perbandingan komposisi etanol dan toluen lainnya (gambar 4.4). Gambar 4.5 Sel yang telah dipermeabilisasi Gambar 4.5 memperlihatkan bahwa sel yang telah dipermeabilisasi berwarna putih dan pada sel yang dipermeabilisasi pada komposisi etanol dan toluen (1:4) warnanya lebih pucat dibanding yang lainnya. Hasil
pengukuran serapan protein dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 270 nm terhadap larutan hasil permeabilisasi menunjukkan hasil absorbansi tertinggi pada komposisi etanol dan toluen (1:4) (Tabel 4.1).
Tabel 4.1 Absorbansi pada panjang gelombang 270 nm larutan hasil permeabilisasi sel Z. mobilis yang menggunakan komposisi etanol dan toluen berbeda. Etanol( %) : Toluen (%) 1:4 2:3 3:2 4:1
Absorba nsi 1,044 0,934 0,580 0,295
Tabel 4.1 menunjukkan semakin besar konsentrasi toluen yang digunakan (1:4) maka semakin besar absorbansinya. hal ini menunjukkan bahwa semakin banyak protein pembentuk dinding sel yang terekstrak. Toluen menyebabkan terbentuknya kanalkanal pada membran sel dan mengakibatkan peningkatan permeabilitas membran. Hal ini mengakibatkan banyak senyawa mikromolekul yang keluar dan mengindikasikan bahwa membran sel lebih permeabel dibandingkan dengan sel yang mengunakan komposisi etanol dan toluen lain. Pada penelitian yang sama dengan mempermeabilisasi sel S. sereviceae yang pernah dilakukan sebelumnya oleh kazuhiko dan kozoo (1995) juga menyatakan bahwa membran sel yang dipermeabilisasi dengan komposisi etanol toluen (1:4) lebih permeabel bila dibandingkan dengan permeabelisasi menggunakan komposisi etanol toluen lainnya. Sel yang telah dipermeabilisasi dengan berbagai komposisi etanol dan toluen kemudian diinkubasi dalam media cair yang mengandung glukosa 10%, NADH,ATP dan MgCl2 selama 15 menit kemudian diuji sisa substrat glukosanya dan diuji secara kualitatif alkohol yang dihasilkan dengan menggunakan kalium dikromat dalam asam sulfat berdasarkan prinsip oksidasi-reduksi. Reaksi yang terjadi adalah : → 3CH3CH2OH + 2K2Cr2O7 + 8H2SO4 3CH3CHO + 2Cr2(SO4)3 + 2 K2SO4+ 7H2O Etanol teroksidasi menjadi asetaldehid kemudian menjadi asam asetat dan Cr (VI) akan tereduksi menjadi Cr (III), bila reaksi ini terjadi ditandai dengan perubahan warna dari orange menjadi hijau yang merupakan warna dari Cr (III). Hasil perubahan warna pada larutan sampel ditunjukkan pada gambar 4.6
Gambar 4.6 Perubahan warna pada uji kualitatif etanol (a) Warna orange pada campuran larutan kalium dikromat (K2Cr2O7) dan H2SO4 tanpa sampel (b) Warna Hijau kebiruan pada larutan kalium dikromat dalam asam dengan sampel yang mengandung alkohol. Prosiding Kimia FMIPA
Terlihat pada gambar 4.6 bahwa larutan sampel akan berubah warna menjadi hijau kebiruan. Kemudian larutan kalium dikromat dalam asam dan larutan sampel diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 480 nm yang merupakan panjang gelombang dari Cr (VI). Absorbansi kalium dikromat dalam asam adalah 0,180 dan absorbansi larutan sampel adalah 0,07, hal ini menunjukkan bahwa masih ada sisa Cr (VI) yang tidak terreduksi menjadi Cr (III). Pengaruh konsentrasi etanol : toluen terhadap etanol yang dihasilkan dilihat dari perubahan substrat glukosa ditunjukkan pada tabel 4.2 Tabel 4.2 Sisa glukosa hasil fermentasi sel Z. mobilis permeabel yang menggunakan komposisi etanol dan toluen berbeda Etanol (%) : toluen (%) 1:4 2:3 3:2 4:1
Sisa
glukosa
(g/L) 8,243 10 12 13,243
Dari data diatas menunjukkan bahwa semakin permeabel sel Z. mobilis menghasilkan sisa substrat glukosa paling sedikit, secara tidak langsung dapat diartikan bahwa etanol yang dihasilkan lebih besar daripada sel Z. mobilis yang dipermeabilisasi dengan komposisi etanol-toluen lain. Semakin sedikit sisa substrat glukosa menunjukkan semakin banyak substrat glukosa yang dirubah menjadi etanol. 3.5 Hasil Pengaruh Konsentrasi Substrat Berdasarkan data yang didapat pada penelitian sebelumnya, permeabilitas membran yang paling besar adalah pada komposisi etanol : toluen (1:4). Oleh karena itu pada penelitian dengan variasi konsentrasi substrat, menggunakan sel yang telah dipermeabilisasi dengan komposisi etanol : toluen (1:4). Sel yang telah dipermeabilisasi diinkubasi selama 15 menit dengan media cair yang mengandung NAD, ATP, MgCl2 dan glukosa. Konsentrasi substrat glukosa yang digunakan dibuat dengan variasi 5%, 10%, 15%, 20%, 25%. Kluyver dan Hoppenbrouwers (1931) menyatakan bahwa strain Z. mobilis mampu tumbuh dan memfermentasi media dengan konsentrasi glukosa 25%. oleh karena itu pada penelitian ini konsentrasi glukosa untuk media fermentasi dibatasi hanya sampai 25%. Z.mobilis masih bisa menghasilkan etanol walau berada dalam media dengan konsentrasi tinggi. Hal ini disebabkan oleh adanya sistem difusi pada Z. mobilis yang memungkinkan terjadinya kesetimbangan yang cepat antara konsentrasi glukosa internal dan eksternal (Nowak, 2001). Hasil fermentasi oleh sel yang telah dipermeabilisasi dengan komposisi etanol : toluen (1:4) dengan variasi konsentrasi glukosa ini dapat dilihat pada tabel 4.3
Tabel 4.3 Pengaruh variasi konsentrasi substrat glukosa terhadap pengurangan substrat glukosa [ substrat glukosa ] (% b/v) 5 10 15 20 25
[Sisa glukosa] (g/L) 71.85 1.07 22.9 25.6 27.21
Dari data tabel di atas dapat dilihat bahwa pada konsentrasi substrat glukosa 5% (b/v) sisa glukosanya masih cukup banyak, hal ini dapat diasumsikan bahwa etanol yang dihasilkan dari perubahan substrat sedikit, karena konsentrasi substrat yang ada masih terlalu sedikit bila dibandingkan dengan jumlah enzim yang ada. Sel Z. Mobilis permeabel dengan konsentrasi substrat glukosa 10% mampu merubah glukosa menjadi etanol paling banyak,namun seiring dengan penambahan konsentrasi glukosa menyebabkan turunnya konsentrasi alkohol yang dihasilkan yang dindikasikan dengan semakin sedikitnya glukosa yang dikonsumsi, hal ini karena glukosa akan bereaksi dengan Phospat dari ATP membentuk glukosa6-P. Apabila kadar senyawa tersebut terlampau tinggi melebihi yang diperlukan, maka senyawa tersebut akan menghambat aktivitas enzim Heksokinase dukarenakan enzim sudah jenuh dengan substrat. Sehingga konsentrasi etanol yang dihasilkan akan menurun pada konsentrasi tertentu karena menurunnya aktifitas enzim. Enzim Heksokinase merupakan salah satu enzim yang terdapat di dalam Z. mobilis dan berperan penting di dalam fermentasi etanol dalam jalur Entner – Doudoroff. Berikut ditunjukkan jalur metabolisme Entner-Doudoroff (ED) secara ringkas: 1. Oksidasi glukosa oleh ATP yang dikatalisa oleh enzim heksokinase 2. Oksidasi gugus aldehid dari glukosa 6-fosfat menjadi 6-fosfoglukonat dan NADPH2 3. Dehidrasi dari 6-fosfat glukonat menjadi 2keto-3-deoksi-6-fosfoglukonat (KDPG) yang dikatalisa oleh enzim fosfoglukonatdehidrase 4. Pemecahan KDPG oleh enzim KDPG aldolase menghasilkan piruvat dengan gliseraldehid 3fosfat 5. Triosa Fosfat selanjutnya masuk ke jalur glikolisis menjadi piruvat dan memberikan 2 ATP dan 2 NADPH2 permol triosa fosfat. Dari hasil pengujian, pada konsentrasi substrat glukosa 10 % didapat sisa substrat glukosa sebesar 1,07 g/L maka etanol yang dihasilkan dapat dihitung secara teoritis yaitu sebesar 50,6 g/L.
4. Kesimpulan Kesimpulan yang diperoleh berdasarkan penelitian yang telah dilakukan adalah: 1. Komposisi campuran etanol toluene Konsentrasi etanol : toluen untuk permeabilisasi sel Z. mobilis yang paling baik adalah komposisi 1:4 ditandai dengan perubahan konsentrasi substrat glukosa yang digunakan untuk membentuk etanol. 2. Konsentrasi substrat glukosa paling baik dalam pembentukan etanol pasa sel Z. mobilis Prosiding Kimia FMIPA
permeabel diperoleh pada konsentrasi substrat glukosa 10%). . Ucapan Terima Kasih 1. Drs. Refdinal Nawfa, M.S selaku dosen pembimbing atas dukungan, bimbingan dan motivasi yang diberikan 2. Dra. Yulfi Zetra, M.Si., selaku koordinator tugas akhir 3. Kedua Orang Tua atas dukungan dan doanya 4. Semua pihak yang mendukung yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu hingga terselesainya penelitian ini Daftar Pustaka
DAFTAR PUSTAKA Beck, James S, 1980, Biomembrans. Fundamentals in relation to human biology, Hemisphere Publishing Coorporation, Washington Becker, Wayne M, 1986, The World of The Cell,The Benjamin Cummings Publishing Company, Inc.Menlo Park, California Brock, Thomas D., 1994, Biology of Microorganisms, seventh edition, Prentice Hall, New Jersey Chibata, I., Tosa, T. dan Sato, T, 1985, Immobilized Biocatalysts to Produce Amino Acids and Other Organic Compounds, Enzymes and Immobilized Cells in Biotechnology, Chapter 3, The Benjamin/Cummings, California Chelico, Linda, dan George, Khachatourians, 2003, “Permeabilization of Beauveria bassiana Blastospores for in Situ Enzymatic Assay”, J. Mycology, Vol. 95, N0. 5, The Mycologycal Society of America, pp: 976-981 Dadds, M.J. 1971, “The detection of Zymomonas mobilis anaerobia” , The society for applied bavteriology, Technical series no.5, academic press.inc, New York El-Mansi, E. M. T., Bryce, C. F. A., Demain, A.L.,Allman, A.R, 2007, Fermentation Microbiology and Biotechnology, second edition, Taylor & Francis Group, LLC, New York. Gunasekaran, P dan Raj K. C, 1999, Fermentation Technology-Zymomonas mobilis. Departement of microbial technology, School of biological science , mandurai kamaraj university, India.
Fessenden, 2001. Kimia Organik. Jilid 2. Edisi keempat. Erlangga. Jakarta
Schlegel, H. G. 1994, Mikrobiologi umum, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta
Godfrey,
T dan Reichel, J, 1983, Industrial Enzymology : The Application of Enzymes in Indstry, Macmillan, London
Serrano, R., Gancedo, J.M., Gancedo,J., 1973, “ Assay of Yeast enzymes in Situ, J. Biochem, 34 : 479482
Jungreis. Ervin, 1926, Spot Test Analysis Clinical, Environment, Forensic & Geochemical Application, Second edition, John Willey & Sons, Inc, New York.
Smith, J. E., 1990 , Prinsip Bioteknologi, Penerbit PT Gramedia, Jakarta
Kazuhiko T and Kozo O, ( 1995), “ Recontruction of Ethanol Fermentation In Permiabilized Cells of The Yeast Sacaromices cereviseae “, Jurnal Of Fermentation and Bioengineering, Vol. 79, No.1 Lay, Bibiana W., Hastowo, S. 1992, Mikrobiologi, Edisi 1, Rajawali Press Jakarta Layne, E, Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins, Methods in Enzymology 3: 447-455. 1957,
, 26 Juni 2008 Mustanir, (1991), “ Koamobilisasi kultur campuran Aspergillus wamoru dan S. sereviceae untuk memproduksi etanol” ITS, Surabaya Okuma Y, (1991), “ Purification and Properties of Alcohol Dehydrogenase from the Acid and Ethanol-Toleran Yeast Candida solicola” Journal of fermentation and bioengineering, vol.71, Central labroratory , lotte.co. Ltd, Tokyo Noko University, Japan. Pancasning, (2008), “ Produksi Etanol Menggunakan Zymomonas mobilis yang diamobilisasi dengan agarosa” ITS, Surabaya Prakasham, R.S. dan Ramakrishna, S. V, 1998, Microbial Fermentations With Immobilized Cells, Lecture Handouts, Biochemical and Environmental Engineering, Indian Institute of Chemical Technology, India Pudjiana,
Anna, 1999, Dasar-dasar Universitas Indonesi,. Jakarta
biokimia,
Ratna, 1986, Mikrobiologi Umum, UI Press, Jakarta Salisbury, Frank B. dan Ross, Cleon W. 1995. Fisiologi Tumbuhan. Jilid I. Terjemahan. ITB. Bandung
Prosiding Kimia FMIPA
Sumarsih, Sri, 2003, Mikrobiologi Dasar, Jurusan Ilmu Tanah Fakultas Pertanian UPN “Veteran”, Yogyakarta Wang, N.S. (2007), Experiment No 4A Glucose Assay By Dinitrosalicylic Colorimetric Methode, Department Of Chemical & Biomolecular Engineering, University Of Maryland
