PEMBUATAN ETANOL MENGGUNAKAN Zymomonas mobilis PADA KONDISI STERIL DAN NONSTERIL DENGAN MEMANFAATKAN LIMBAH PADAT PABRIK ROKOK KRETEK SEBAGAI SUBSTRAT

PEMBUATAN ETANOL MENGGUNAKAN Zymomonas mobilis PADA KONDISI STERIL DAN NONSTERIL DENGAN MEMANFAATKAN LIMBAH PADAT PABRIK ROKOK KRETEK SEBAGAI SUBSTRAT Tine Sarlota Tanate1* , Surya Rosa Putra2 1*

Mahasiswa S2 Jurusan Kimia, FMIPA Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya 2 2 Jurusan Kimia, FMIPA Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya e-mail : [email protected]

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan etanol dengan memanfaatkan residu glukosa pada limbah padat pabrik rokok kretek, yang mengandung residu glukosa 6,02% berat

kering.

Mikroorganisme

yang

digunakan

adalah

Zymomonas

mobilis.

Mikroorganisme ini merupakan bakteri yang dapat mengubah glukosa, fruktosa dan sukrosa menjadi etanol. Proses fermentasi dilakukan pada kondisi steril dan nonsteril. Proses fermentasi berlangsung selama 50 jam dan rendemen diukur setiap 10 jam. Kadar glukosa hasil ekstrak substrat ditentukan dengan menggunakan metode Somogyi-Nelson, sedangkan etanol hasil fermentasi ditentukan dengan kromatografi gas (GC). Dari hasil penelitian ini diketahui bahwa dalam setiap ekstrak 320 g/1000 mL air terkandung glukosa 9,8 g. Fermentasi substrat dengan Zymomonas mobilis ATCC 10988 pada kondisi steril menghasilkan kadar etanol sebesar 0,315 g etanol/g glukosa atau dengan yield 67,25% dan pada kondisi nonsteril sebesar 0,342 g etanol/g glukosa atau dengan yield 66,86%. Sedangkan fermentasi substrat dengan Zymomonas mobilis A3 pada kondisi steril menghasilkan etanol sebesar 0,346 g etanol/g glukosa atau dengan yield sebesar 67,84 % dan pada kondisi nonsteril 0,345 g etanol/g glukosa atau yield 67,64 %.

Kata kunci : Zymomonas mobilis, fermentasi etanol, limbah padat pabrik rokok kretek

1

1. Pendahuluan

Sejak lima tahun terakhir Indonesia mengalami penurunan produksi minyak nasional yang disebabkan menurunnya secara alamiah cadangan minyak pada sumur-sumur yang diproduksi, dilain pihak pertambahan jumlah penduduk telah meningkatkan transportasi dan aktivitas industri yang berakibat pada peningkatan kebutuhan konsumsi Bahan Bakar Minyak (BBM). Untuk memenuhi kebutuhan BBM tersebut pemerintah mengimpor sebagian BBM. Menurut Ditjen Migas, impor migas mengalami peningkatan yang cukup signifikan 106,9 barel pada tahun 2002 menjadi 116,2 juta barrel pada tahun 2003 dan 154,4 juta barrel pada tahun 2004. Dilihat dari jenis BBM yang diimpor , minyak solar (ADO) merupakan volume impor terbesar setiap tahunnya. Pada tahun 2002 impor BBM jenis ini mencapai 60,6 juta barrel atau 56,7% dari total, kemudian meningkat menjadi 61,1 juta barrel pada tahun 2003 dan 77,6 juta barrel pada tahun 2004 (Budi, 2007). Dengan kondisi yang demikian sangat dibutuhkan upaya penggunaan dan pengembangan bahan bakar alternatif pengganti bahan bakar minyak yang renewable dan ramah lingkungan (Ingram dan Doran, 1995). Salah satu alternatif pengganti bahan bakar minyak adalah bioetanol. Etanol dapat dihasilkan melalui proses fermentasi oleh Mikroorganisme diantaranya adalah ragi atau khamir (Saccharomyces cereviceae), namun tidak tahan terhadap etanol konsentrasi tinggi yang dihasilkan. Penelitian yang sekarang difokuskan pada bakteri gram negatif Zymomonas mobilis. Bakteri ini bersifat anaerob fakultatif dan merupakan organisme fermentatif yang memanfaatkan sukrosa, glukosa dan fruktosa dengan mengikuti jalur Entner Duondoroff Pathway untuk menghasilkan etanol. Zymomonas mobilis memilki kelebihan dibandingkan Saccharomyces cerevisiae, diantaranya konversi yang lebih cepat, toleran terhadap suhu, pH rendah serta tahan terhadap etanol konsentrasi tinggi (Triphetchul et al, 1992). Proses fermentasi dapat memanfaatkan hasil pertanian, perkebunan maupun limbah industri yang mengandung gula. Dinegaranegara berkembang bahan dasar yang biasa digunakan diantaranya, sisa perkebunan misalnya molase ampas tebu, hasil pertanian misalnya singkong dan limbah cair ataupun padat sisa industri. Industri rokok memanfaatkan daun tembakau dan bungah cengkeh sebagai bahan baku. Dalam proses pengolahan bahan baku ini dilakukan penyemprotan glukosa dan fruktosa dan menghasilkan produk samping berupa limbah dalam bentuk padat maupun cair. Hasil samping berupah limbah dalam bentuk padat masih mengandung residu glukosa 6,02 % berat kering, (Holil, 2002). Limbah yang mengandung glukosa ini dapat dimanfaatkan untuk produksi etanol dengan biaya yang 2

rendah. Didukung oleh beberapa teknik yang telah dikembangkan seperti menerapkan strain-strain dengan kemampuan produksi etenol yang efisien, mengamobilisasi sel – sel dan produksi etanol pada kondisi nonsteril. 2. Metodologi Penelitian 2.1 Ekstraksi Substrat

4 buah erlenmeyer masing-masing diisi substrat 80 g dan 500 mL air. Dishaker dengan kecepatan 120 rpm selama 2 jam. Untuk mendapatkan filtratnya dilakukan proses penyaringan, kemudian disentrifugasi untuk mendaptkan filtrat yang lebih jernih. Filtratnya diambil untuk pengukuran kadar gula dengan menggunakan metode Somogyi-Nelson (Sudarmadji, 1984). 2.2 Regenerasi Z. mobilis

Zymomonas mobilis ditumbuhkan pada media nutrien agar miring. Media yang telah diinokulasi ini kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam. Untuk memperkaya jumlah sel dalam proses fermentasi dibuat media cair yang terdiri dari 100g/L glukosa, 10 g/L yeast extract, 0,5 g/L MgSO4.7H2O, 1 g/L (NH4)2SO4 dan 1 g/L KH2PO4. Satu ose sel Zymomonas mobilis dari agar miring kemudian dimasukan ke dalam 10 mL larutan media cair dan dinkubasi selama 18 jam dengan dishaker pada kecepatan 120 rpm dan suhu 30oC. 10 mL media cair yang telah diinkubasi selanjutnya diinokulasikan kembali ke dalam 90 mL media cair dan dishaker 120 rpm selama 18 jam. Selanjutnya diinkubasi seperti pada proses sebelumnya hingga volume 1000 mL (Kim dkk, 1991).

2.2. Proses Fermentasi 2.2.1.Uji Metoda Sebanyak 320 g substrat dimasukan secara bertahap masing-masing 80 g kedalam erlenmeyer yang berisi 500 mL air, dishaker selama 2 jam. Untuk memperoleh filtratnya dilakukan proses penyaringan, setelah itu dilakukan sentrifugasi untuk memperoleh filtrat yang lebih jernih. Filtrat yang diperoleh diukur kadar gulanya dengan menggunakan metode Somogyi-Nelson. Dilakukan proses pemekatan hingga volume 100 mL, selanjutnya 200 mL cairan stok kultur bakteri Zymomonas mobilis disentrifugasi pada kecepatan 1600 rpm selama 30 menit biomassa yang diperoleh digunakan dalam media fermentasi 100 mL. Sebelum fermentasi, media dipanaskan

3

dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 20 menit (Tanaka, et al., 1999). Fermentasi dilakukan selama 50 jam.

2.2.2. Fermentasi dengan Zymomonas mobilis ATCC 10988 Menggunakan Glukosa Substrat dan Glukosa Murni Pada Kondisi Steril dan Nonsteril Untuk Mengetahui Pola Fermentasi 200 ml cairan stok biomassa disentrifugasi pada 1600 rpm selama 30 menit supernatannya didekantasi

dan biomassa yang diperoleh digunakan dalam media

fermentasi yang terdiri dari glukosa hasil ekstrak substrat pada penentuan kadar gula subtrat 10 g/L, yeast ekstrak 1 g/L, MgSO4.7H2O 0,05 g/L, (NH4)2SO4 0,1 g/L, KH2PO4 0,1 g/L. Media fermentasi untuk glukosa murni dengan komposisi yang sama pada media fermentasi glukosa substrat. Masing-masing bahan dilarutkan kemudian dipanaskan dalam autoklaf pada suhu 120oC selama 20 menit untuk media steril (Tanaka, et al., 1999). Sedangkan untuk media nonsteril masing-masing bahan yang telah dilarutkan tidak dipanaskan dalam autoklaf. Fermentasi dilakukan selama 50 jam dan setiap interval waktu 10 jam dianalisa kadar gula reduksi, etanol dan konsentrasi biomasanya ( Tao, et al, 2005 ).

2.2.3 Fermentasi dengan Zymomonas mobilis A3 Menggunakan Glukosa Substrat dan Glukosa Murni pada Kondisi Steril dan Nonsteril 200 mL cairan stok biomassa disntrifugasi pada 1600 rpm selama 30 menit, supernatan didekantasi dan biomassa yang diperoleh digunakan dalam media fermentasi yang terdiri dari 10 g/L glukosa hasil ekstrak substrat, yeast ekstrak 1 g/L, MgSO4.7H2O 0,05 g/L, (NH4)2SO4 0,1 g/L, KH2PO4 0,1 g/L. Media fermentasi untuk glukosa murni dengan komposisi yang sama pada media fermentasi glukosa substrat. Masing-masing bahan dilarutkan dan dipanaskan dalam autoklav pada suhu 1210C selama 20 menit untuk media steril (Tanaka et al, 1999). Sedangkan untuk media nonsteril masingmasing bahan yang dilarutkan tidak panaskan dalam autoklav. (Tao, et al., 2005). Fermentasi dilakukan selama 50 jam dan setiap interval waktu 10 jam dianalisa kadar gula reduksi, etanol dan konsentrasi biomasanya.

4

2.3. Metoda Analisis 2.3.1. Pembuatan Kurva Standar Glukosa dengan Menggunakan Metode Somogyi-Nelson Sebelum analisa kadar gula reduksi terlebih dahulu dibuat kurva standar glukosa. sebanyak 10 mg glukosa anhidrat dilarutkan dalam air hingga 100 mL ini merupakan larutan standar dengan konsentrasi 10 mg/100mL. Dari larutan standar ini dibuat 5 pengenceran sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8 dan 10 mg/100 mL. Disiapkan 5 tabung reaksi yang bersih, masing-masing diisi dengan 1 mL larutan glukosa standar dan satu tabung diisi dengan 1 mL aquades sebagai blanko. Pipet kedalam masing-masing tabung 1 mL reagensia Nelson (Nelson A : B = 4 : 1) dan dipanaskan pada penangas air selama 10 menit. Ambil semua tabung dan didinginkan dalam beker gelas yang berisi air dingin. Setelah itu tambahkan 1 mL

regensia

arsenomolibdat serta 7 mL air. Absorbansi masing-masing larutan diukur pada panjang gelombang 540 nm. Kurva standar dibuat dengan membuat grafik hubungan antara kadar glukosa sebagai gula reduksi dengan absorbansi (Sudarmadji, 1984).

2.3.2. Analisa Kadar Gula Substrat Pengambilan filtrat hasil ekstarksi dilakukan dengan menggunakan mikro pipet 1000 µL. Siapkan beberapa tabung reaksi kemudian masukan 1 mL larutan hasil pemekatan, tambahkan 1 mL reagensia Nelson (campuran Nelson A dan B dengan perbandingan 4 : 1) dan panaskan semua tabung pada penangas air selama 10 menit, semua tabung diambil dan didinginkan dalam beker gelas yang berisi air dingin. Setelah dingin tambahkan 1 mL reagensia arsenomolibdat dan tambahkan 7 mL air. Data absorbansi sampel diektrapolasikan pada persamaan regresi linier yang diperoleh dari kurva standar glukosa, sehingga diperoleh kadar glukosa substrat (Sudarmadji, 1984).

2.3.3. Analisa Konsentrasi Biomassa dengan Metoda Hemacytometer Konsentrasi biomassa juga dapat dihitung dari hasil pengenceran yang dilihat pada hemocytometer dengan mikroskop. Hasil pengenceran dipipet 10 µL dan ditetesi ke hemocytometer kemudian diamati melalui mikroskop, perhitungan jumlah biomassa pada daerah yang dihitung.

5

2.3.4. Analisa Kadar Etanol Untuk analisis kadar etanol, sampel hasil fermentasi disentrifusi pada 6000 rpm. Untuk menganalisis kadar etanol, sampel cairan fermentasi disentrifugasi pada 6000 rpm selama 30 menit. Cairan hasil fermentasi diuji kadar etanolnya dengan kromatografi gas Shimadzu GC-14B (kolom CBP-10 mediumlly polar, detektor FID, integrator Shimadzu C-R6A Chromatopac). Temperatur oven dan kolom 180oC, temperatur injektor 250oC. Waktu retensi etanol 4,2 menit. 3. Hasil dan Pembahasan 3.1. Pretreatment Substrat Substrat limbah padat pabrik rokok kretek berbentuk serbuk padat halus berwarna coklat yang merupakan limbah hasil pencampuran tembakau dan cengkeh yang mengandung residu glukosa 0,006g/mL berat kering (Holil, 2002). Dengan demikian dapat digunakan sebagai bahan baku pembuatan etanol. Glukosa dapat langsung difermentasi oleh mikroorganisme menjadi etanol. Glukosa larut dalam air maka substrat diekstrak dengan aquades. Dari hasil ekstrak 320 g/ 2000 mL (g substrat/mL diperoleh filtrat 1000 mL dan diuji kadar glukosanya dengan mengandung glukosa 0,9 g/mL. Bila dibandingkan dengan data diatas kadar glukosa hasil ekstrak yang diperoleh berbedah dari data awal dimana 320 g limbah mengandung glukosa 1,6 g/mL. Hal ini disebabkan 1000mL aquades yang digunakan untuk melarutkan glukosa yang ada pada substrat ketika disaring filtrat yang diperoleh 1000mL sehingga sebagian glukosa ada pada air yang terserap oleh substrat. Larutan hasil ekstrak substrat kemudian diuapkan pada suhu 80oC hingga volume 100mL.

Gambar 3.1 Hasil Ekstrak Substart

6

3.2. Pembuatan Kurva Standar Glukosa Kurva standar dibuat dengan mengalurkan absorbansi terhadap konsentrasi larutan glukosa monohidrat pada panjang gelombang 540 nm. Dimana nilai absorbansi mengalami kenaikan dengan semakin besarnya konsentrasi larutan glukosa monohidrat sehingga diperoleh persamaan garis antara konsentrasi dan absorbansi yaitu y = 0.6 0.5

y = 0.05425x R² = 0.999

Absorbansi

0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

2

4 6 8 [glukosa] mg/100 mL

10

12

0,05425x.

Gambar 4.2 Kurva standar glukosa 3.3. Pembuatan Kurva pertumbuhan Zymomonas mobilis ATCC 10988 Pada umumnya bakteri dapat memperbanyak diri dengan cara pembelahan biner, yaitu dari 1 sel menjadi 2 sel baru olehnya itu pertumbuhan dapat diukur dari bertambahnya jumlah sel. Pertumbuhan sel Z. mobilis dimonitor untuk mengetahui pada jam ke berapa sel bakteri tersebut waktu berakhirnya fase log, karena pemanenan biomassa untuk fermentasi diambil pada fase tersebut. Pengukuran jumlah bakteri dapat ditentukan secara tidak langsung dengan mengukur turbiditas cairan medium tumbuh menggunakan spektrofotometer (Optical Density atau absorbansi). Unit Optical density sebanding dengan massa sel dan jumlah bakteri. Meningkatnya turbidimetri dalam media adalah indeks lain dari pertumbuhan bakteri serta jumlah biomassa bakteri. Apabilah sinar yang dittrasmisikan atau diteruskan menurun artinya terjadi peningkatan populasi pada media tersebut, atau dengan kata lain absorbansi yang terbaca dari sinar yang dihamburkan oleh partikel-partikel bakteri akan memberikan nilai yang besar. Dari kurva pertumbuhan Z, mobilis dapat dilihat bahwa bakteri Z. mobilis melakukan adaptasi pada fase lag selama

± 4 jam pertama. Pada fase ini, bakteri tidak mengalami

pertumbuhan yang signifikan, jumlahnya cendrung tetap karena belum mengalami pembelahan. Bakteri memerlukan waktu untuk beradaptasi, selnya akan mengalami

7

perubahan komposisi kimiawi dan ukuran serta bertambahnya substansi intraseluler sehingga siap untuk membelah diri. Waktu adaptasi ini tergolong singkat, hal ini dikarenakan sebelumnya telah dilakukan transfer dari starter 20 mL ke starter 200 mL dengan waktu inkubasi yang sama. Fase log berakhir setelah 18 jam inkubasi. Jumlah sel yang hidup pada fase inimerupakan jumlah sel yang hidup optimal dan memiliki aktivitas yang sangat aktif dalam mengkonversi substrat menjadi etanol. Oleh karena itu pemanenan bakteri dilakukan sekitar waktu tersebut. Diatas 20 jam, bakteri sudah masuk fase stasioner.

Kurva Pertumbuhan Zymomonas mobilis dari Data Optical Density

Optical Density (OD)

2

1,5

1

0,5

0 0

5

10

15

20

25

Waktu (jam )

Gambar 4.3 Kurva pertumbuhan Z. mobilis

3.4. Fermentasi 3.4.1

Penyiapan Sel Zymomonas mobilis ATCC 10988

Mikroorganisme yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri Zymomonas mobilis ATCC 10988 dan Zymomonas mobilis A3 . Zymomonas mobilis ini memiliki karakteristik sebagai bakteri Gram negatif, anaerob tetapi toleran terhadap oksigen atau biasa disebut anaerob fakultatif, dapat memperfermentasi glukosa, fruktosa dan sukrosa menghasilkan sejumlah etanol dan CO2 (Hendrie dan Shewan, 1966), tetapi tidak dapat memfermentasikan manitol dan laktosa, mampu menghasilkan enzim katalase, tidak dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon serta tidak memiliki enzim triptofanase dan gelatinase (Hany, 2009). Media pertumbuhan bakteri Zymomonas mobilis terdiri dari glukosa, yeast ekstrak, ammonium sulfat (NH4)2SO4, Kalium

8

Dihidrogen Posfat (KH2PO4), Magnesium Sulfat (MgSO4.7H2O). Glukosa berfungsi sebagai sumber karbon, yeast ekstrak dan garam amonium berfungsi sebagai sumber nitrogen. Sedangkan garam-garam yang lain seperti kalium dan magnesium berfungsi sebagai aktivator dalam kerja enzim (Schlegel, 1994). Penyediaan biakan Zymomonas mobilis meliputi 2 tahap yaitu penanaman dalam media padat dan selanjutnya penanaman dalam media cair. Penanaman dalam media padat bertujuan untuk memperbanyak stok biakan murni. Biakan Zymomonas mobilis mampu tahan dalam media padat selama dua minggu, sehingga perlu diregenerasi/diremajakan setiap dua minggu sekali. Pemindahan biakan Zymomonas mobilis dari media padat ke media cair dengan tujuan untuk memperoleh inokulum yang sudah beradaptasi dengan lingkungan fermentasi. Dalam media cair dilakukan pengocokan agar kebutuhan oksigen terpenuhi dan tidak terjadi endapan koloni. Pada percobaan ini dilakukan pemindahan biakan secara berantai yakni pada media cair dalam volume kecil (10 mL) selanjutnya dalam media cair dalam volume besar (1000 mL), sehingga diperoleh biomassa dalam jumlah yang cukup banyak.

3.4.2. Uji Metoda Uji metoda dilakukan untuk membuktikan bahwa Z. mobilis mampu mengubah residu glukosa yang ada pada limbah padat pabrik rokok kretek menjadi etanol. Untuk membuktikan bahwa didalam substrat hasil fermentasi terbentuk etanol maka substrat hasil fermentasi disentrifuse terlebih dahulu untuk dipisahkan dengan biomassanya. Kadar etanol dianalisa dengan GC, pada uji metoda didapatkan hasil seperti pada Gambar 4.4 FID1 A, (ETOH-TSI\UP.D) pA

1200 1000 800

0.548 0.696 0.767 0.939 - EtOH 1.092

600 400 200 0 0

2

4

6

8

min

Gambar 4.4 GC hasil fermentasi substrat limbah padat pabrik rokok kretek pada uji pendahuluan

9

Dari hasil spektra pada Gambar 4.4 dapat diketahui adanya puncak yang menunjukan etanol. Dimana puncak tersebut tidak terlalu menonjol hal ini disebabkan oleh karena kondisi media yang hanya terdiri dari glukosa tanpa ada nutrisi tambahan seperti yeast ekstrak, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, KH2PO4.

3.4.3. Penentuan Pola Fermentasi 3.4.3.1. Pola Fermentasi Etanol pada Kondisi Steril dan Nonsteril Menggunakan Zymomonas mobilis ATCC 10988 dengan pH Normal Z. mobilis mempunyai laju pertumbuhan yang tinggi dan tahan terhadap konsentrasi etanol 10% dan dapat memfermentasi gula menjadi etanol dan CO2 melalui jalur glikolitik Enhtner-Doudoroff. Fermentasi etanol dilakukan menggunakan proses anaerob, yaitu dengan shaker sangat pelan 50 rpm. Shaker pelan hanya difungsikan sebagai penghomogenan larutan supaya bakteri tidak mengendap dibawah untuk mengoptimalkan proses fermentasi. Hal ini karena Z. mobilis bersifat anaerob fakultatif (mampu tumbuh dalam lingkungan tanpa atau dengan oksigen). Dalam hal ini oksigen akan menekan fermentasi dan menguntungkan respirasi (Schlegel, 1994). Media fermentasi glukosa hasil ekstrak dari residu glukosa yang ada pada substrat sebagai sumber karbonnya dengan konsentrasi 10%, Sedangkan sumber nitrogen dan garamgaram lain sama dengan media cair . Sebagai kontrol menggunakan sumber karbon dari glukosa murni. Untuk fermentasi pada kondisi steril semua bahan disterilisasi atau diautoclave selama 20 menit pada suhu 121oC. Sedangkan untuk fermentasi pada kondisi nonsteril semua bahan tidak disterilisasi atau diautoclave. Kedua media fermentasi ini dilakukan pada pH normal. Pola fermentasi etanol menggunakan Z. mobilis diperoleh dengan melihat pola konsumsi glukosa, produksi etanol dan konsentrasi biomassa setiap 10 jam selama 50 jam. Dalam proses fermentasi akan terjadi peningkatan jumlah etanol dan penurunan jumlah residu glukosa. Dimana glukosa sebagai substrat akan dimanfaatkan oleh mikroorganisme untuk diubah menjadi etanol. Pola fermentasi pada kondisi steril dan nonsteril dengan pH normal dapat dilihat melalui gambar 4.5 dari gambar 4.5, dimana pada 10 jam pertama kadar etanol 0,116 g/g glukosa dengan yield etanol 22,74 % dibanding teori.

10

80 Media steril

70 yield etanol (%)

60 50 40 30 20 10 0 0

20

40

60

Waktu fermentasi (jam)

Gambar 4.5 Pola produksi etanol oleh Z. mobilis ATCC 10988 media steril dan nonsteril

Seiring dengann bertambahnya waktu terjadi peningkatan jumlah etanol dan penurunan jumlah glukosa residu dimana hingga jam ke 40 etanol yang dihasilkan 0,315 g/g glukosa dengan yield etanol 67,25 %. Fermentasi glukosa substrat pada kondisi nonsteril menghasilkan kadar etanol etanol sebesar 0,111 g/g glukosa dengan yield etanol sebesar 21,56 % dan diakhir fermentasi yaitu pada jam ke 50 kadar etanol yang dihasilkan sebesar 0,342 g/g glukosa dengan yield 66,86 %. Ini berarti Z. mobilis mampu mengkonsumsi glukosa dalam substrat dalam dalam kondisi media steril maupun nonsteril dengan pH normal, walau kadar etanol yang diperoleh lebih kecil dibanding dengan yield etanol hasil fermentasi glukosa hasil hidrolisis Carboxy Methyl Cellulose (CMC) yaitu sebesar 89,6% (Masfufah, 2009). Hal ini disebabkan karena hasil ekstrak substrat bukan hanya terdiri dari glukosa saja tetapi terdiri dari beberapa senyawa lain yaitu nikotin, eugenol, humulen dan vanilin (Holil, 2002).Hasil ini berbedah dengan fermentasi pada kondisi steril selama 40 jam dengan menggunakan substrat glukosa (kontrol) 9,8 g/100mL sebagai substrat (kontrol)) menghasilkan etanol adalah 0,375 g/g gula reduksi, dengan memberikan yield etanol sebesar 73,52 % dibanding teori. Sedangkan fermentasi ermentasi pada kondisi nonsteril menghasilkan kan etanol 0,216 g/g glukosa dengan yield etanol sebesar 71,37 %.

11

3.4.3.2. Pola Fermentasi Etanol Pada Kondisi Steril dan Nonsteril Menggunakan Zymomonas mobilis A3 dengan pH Rendah Proses fermentasi dilakukan pada kondisi steril dan nonteril dimana semua sem bahan berupa glukosa, yeast ekstrak, MgSO4. 7H2O, KH2.PO4, (NH4)2. SO4 dengan komposisi yang sama dengan media steril dan nonsteril dengan menggunakan Z. mobilis ATCC 10988. Semua bahan dilarutkan dalam air dan disterilisasi atau autoclave untuk media fermentasi pada kondisi steril dan untuk Fermentasi pada media nonsteril semua bahan tidak disterilisasi atau autoclave (Tao, F dkk, 2005). pH media menggunakan pH optimum (Alfena, 2008) pengaturan pH media dengan menggunakan H2SO4 dan NaOH.

yield etanol (%)

80 70

Media steril

60

Media nonsteril

50 40 30 20 10 0 0

20

40

60

Waktu fermentasi (jam)

Gambar 4.6 Pola produksi etanol oleh Z. mobilis A3 media steril dan nonsteril substrat

Berdasarkan data perhitungan yield etanol tabel 4.8 dan 4.6 untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada Gambar 4.6. menunjukan bahwa fermentasi glukosa substrat selama selam 40 jam dengan Z. mobilis A33 10 jam pertama pada kondisi steril menghasilkan etanol 0,153 g/g glukosa atau yield etanol 30%. Seiring dengan bertambahnya waktu terjadi penurunan jumlah glukosa dan penambahan kadar etanol dimana pada jam ke 40 etanol yangg dihasilkan 0,346 g/g glukosa atau dengan yield 67,84 % dengan demikian yield etanol yang dihasilkan lebih besar dibandingkan dengan penelitian oleh Maisaroh (2008) yaitu sebesar 0,323 g etanol /g /g glukosa atau dengan yield 63, 41%. Sedangkan 12

fermentasi pada da kondisi nonsteril etanol yang dihasilkan pada 10 jam pertama 0,089 g/g glukosa dengan yield etanol 17,45 %, hingga akhir waktu fermentasi etanol yang diperoleh 0,345 g/g glukosa dengan yield 67,64%. Hasil yang diperoleh ini berbedah dengan penelitian terdahulu erdahulu dimana etanol yang diperoleh melalui fermentasi dengan pH rendah (4,5) pada kondisi steril sebesar 73,3 g/L dan kondisi nonsteril 73,2 g/L (Tao dkk 2005) karena media fermentasi substrat bukan hanya terdiri dari glukosa saja tetapi terdiri dari beberapa eberapa senyawa lain diantaranya nikotin, eugenol, humulen dan vanilin. Hasil ini juga berbedah dengan kadar etanol fermentasi substrat glukosa kontrol yaitu sebesar 0,474 g etanol / g glukosa atau yield 92,85 % untuk kondisi steril dan 0,471 g etanol / g glukosa atau yield 92,35 %.

3.4.3.3. Perbandingan Produksi Etanol Zymomonas mobilis ATCC 10988 dengan pH Normal dan Zymomonas mobilis A3 dengan pH Rendah Aktivitas Zymomonas mobilis untuk etanol sangat tergantung dari kondisi media, baik itu kandungan nutrisi, utrisi, pH dan faktor penentu lainnya seperti penerapan strain – strain baru lewat mutasi gen, amobilisasi sel dan fermentasi pada kondisi nonsteril (Tao dkk, 2005). Dalam penelitian ini menunjukan bahwa etanol hasil fermentasi pada kondisi nonsteril tidakk berbedah jauh dengan fermentasi pada kondisi steril. Penggambaran lebih jelas dapat dilihat memproduksi pada Gambar 4.7. 80

Media steril Z. mobilis ATCC Media steril Z. mobilis A3 Media nonsteril Z. mobilis ATCC Media nonsteril Z. mobilis A3

Yield etanol (%)

70 60 50 40 30 20 10 0 0

20

40

60

Waktu (jam)

Gambar 4.7 Perbandingan Produksi etanol hasil fermentasi Z. mobilis ATCC dan Z. mobilis A3

13

Dari gambar 4.7 pola fermentasi menggunakan substrat limbah padat pabrik rokok kretek menunjukan bahawa pada 10 pertama kadar etanol yang dihasilkan masih rendah yaitu fermentasi pada kondisi nonsteril dengan Z. mobilis ATCC 10988 0,1 g/g glukosa atau yield sebesar 17,45 % dan 0.089 g/g glukosa atau yield 17,65 % oleh Z. mobilis A3. Sedangkan pada kondisi steril 0,091 g/g glukosa dengan yield 17,84 % untuk fermentasi steril dengan Z. mobilis ATCC dan 0,153 g etanol / g glukosa atau yield 30 %. Hal ini dikarenakan Z. mobilis masih beradaptasi dengan media fermentasi yang berbedah dengan media cair. Media cair menggunakan glukosa murni sebagai sumber karbon sedangkan media fermentasi menggunakan sumber karbon dari hasil ekstrak residu glukosa substrat limbah padat pabrik rokok yang merupakan campuran dari nikotin, eugenol, humulen dan vanilin (Holil, 2002). Oleh karena itu dilakukan uji metoda. Setelah 10 jam secara bertahap Z. mobilis mulai mampu mengkonsumsi glukosa dalam hasil ekstrak limbah padat pabrik rokok kretek hingga jam ke 50 kadar etanol yang dihasilkan pada pada kondisi nonsteril 0,341 g etanol / g glukosa atau yield 66,84 % oleh Z. mobilis ATCC 10988 (Tabel 4.11), 0,345 g etanol / g glukosa atau yield 67,64 % oleh Z. mobilis A3 (Tabel 4.15). Sedangkan pada kondisi steril sebesar 0,343 g etanol / g glukosa atau yield 67,25 % oleh Z. mobilis ATCC 10988 (Tabel 4.10), 0,346 g etanol/g glukosa atau yield 67,84 oleh Z. mobilis A3 (Tabel 4.14). Fermentasi nonsteril dengan subtrat glukosa sebagai kontrol oleh Z. mobilis ATCC 10988 menghasilkan etanol 0,356 g/g glukosa dengan yield 71,77% dan pada kondisi steril 73.52% sedangkan fermentasi nonsteril oleh Z. mobilis A3 0,471 g etanol/g glukosa atau yield sebesar 92,35% dan pada kondisi steril 92,94% . Berdasarkan penelitian sebelumnya, fermentasi glukosa selama 40 jam pada pH 4,5 dengan menggunakan Z. mobilis ATCC 31821 pada kondisi nonsteril dengan dan sebagai kontrol dibuat fermentasi pada kondisi steril. Etanol yang dihasilkan pada kondisi nonsteril dengan menggunakan glukosa 150 g/L adalah sebesar 73,2 g/L atau 95% yield etanol dibanding teori dan pada kondisi steril dihasilkan etanol sebesar 73,3 g/L atau 96,7% yield dibanding teori (Tao dkk, 2005). Dari data itu kadar etanol dengan substrat hasil ekstrak residu glukosa lebih rendah dibanding dengan substrat glukosa sebagai kontrol maupun penelitian sebelumnya hal ini disebabkan karena media fermentasi residu glukosa limbah padat pabrik rokok kretek selain mengandung glukosa juga mengandung senyawa lain sehingga media ini merupakan media baru bagi Z. mobilis dengan demikian fermentasi ekstrak limbah padat pabrik rokok kretek dengan Z. mobilis tidak memberi pengaruh yang terlalu besar jika dibandingkan 14

dengan fermentasi glukosa sebagai kontrol maupun aupun penelitian sebelumnya. sebelumnya Olehnya itu disarankan untuk dilakukan proses pemisahan senyawa – senyawa tersebut. 3.4.3.4. Konsentrasi Kandungan Biomassa Zymomonas mobils ATCC 10988 dan Untuk mengetahui konsentrasi biomassa Z. mobilis dilakukan perhitungan dengan menggunakan metoda Hemacytometer. Analisa biomassa dilakukan pada setiap 10 jam fermentasi dengan perbandingan biomassa Z. mobilis ATCC 10988 dan Z. mobilis A3 selama fermentasi menunjukan bahwa, jumlah biomassa yang diinokulasikan dan tumbuh antara Z. mobilis ATCC 10988 dan Z. mobilis A3 tidak sama. Perhitungan jumlah biomassanya (Tabel 4.22 dan 4.23) dan kemampuan tiap – tiap bakteri menghasilkan etanol dalam fermentasi pada kondisi kondisi steril maupun nonsteril dapat dipahami melalui Gambar 4.8.

70 60 50 40 30 20 10 0

66.86

67.25

3.2 0.04 1

% etanol

3.15 0.04 2

67.86

67.64

5.75 0.04 3

jumlah biomassa

5.75 0.04 4

% etanol / bakteri

Gambar 4.8 Perbandingan kemampuan masing – masing bakteri Z. mobilis ATCC 10988 dan Z. mobilis A3 untuk menghasilkan etanol

Pada gambar 4.8 dapat dijelaskan bahwa fermentasi glukosa substrat pada kondisi nonsteril dengan Z. mobilis ATCC 10988 selama 50 jam dengan jumlah biomassa 3,15 x 10-5 sel/mL jumlah ini hampir sama dengan penelitian sebelumnya yaitu 3,20 x 10 10-5 sel / mL (Hany, 2009), adalah 0,125 g etanol/100 mL menghasilkan yield etanol sebesar 66,86 % sehingga kemampuan rata – rata Z. mobilis ATCC 10988 adalah 0,04 x 10-5 (Tabel 4.21) sedangkan oleh Z. mobilis A3 dengan jumlah biomassa 5,75 x 10-10 dimana jumlah ini hampir ampir sama dengan penelitian sebelumnya yaitu 5,9 x 1010 sel / mL (Alfena, 2008) hal ini disebabkan karena sumber enzim dan kondisi yang dilakukan sama, dengan 0,210 g etanol / 100 mL menghasilkan etanol sebesar 67,64 % dengan kemampuan rata – rata 0,04 x 1010

15

(Tabel 4.21) dengan demikian yield etanol yang diperoleh lebih besar dari yield etanol yang dihasil fermentasi oleh Z. mobilis ATCC 10988 hal ini disebabkan karena Z. mobilis A3 merupakan Z. mobilis yang sudah dimutasikan dengan hydroxylamin dengan pH optimum 4,5 (Alfena, 2008). Hasil fermentasi pada kondisi steril tidak berbedah jauh dengan hasil fermentasi pada kondisi nonsteril yaitu dengan jumlah biomassa 3,10 x 105, kadar etanol yang diperoleh pada fermentasi dengan kondisi steril oleh Z. mobilis ATCC 10988 adalah 0,224 g etanol / 100 mL dengan yield sebesar 67,25 % dengan kemampuan rata – rata 0,04 x 10-5 g etanol / 100 mL (Tabel 4.20) dan oleh Z. mobilis A3 0,351 g etanol / 100 mL dengan yield 67,84 % dengan kemampuan rata – rata 0,06 x 10-10 (Tabel 4.20) tiap bakteri. Selain perhitungan biomassa juga dilakukan pengamatan bentuk morfologi Z. mobilis dengan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 400x, dimana Z. mobilis berbentuk batang (2-6 mm x 1-1.4 mm) bercemeti polar dan merupakan bakteri gram negatif (Schlegel, 1994).

Gambar 4.9 Morfologi bakteri dengan perbesaran 400x a. Bakteri Z. Mobilis ATCC 10988 b. Bakteri Z. Mobilis A3 c. Dari Gambar 4.9 a, yang diperoleh dari hasil pengamatan dengan mikroskop terlihat bakteri berbentuk batang dan bercemeti (Z. mobilis ATCC 10988) ini sesuai dengan bentuk morfologi Z. mobilis sedangkan pada Gambar 4.9 b bentuk Z. mobilis A3 mengalami perubahan dari bentuk basil dan bercemeti dengan gerakan yang cepat sedikit berubah menjadi sedikit lebih besar dengan gerakan yang lebih sedikit karena bentuknya menjadi

lebih besar dan cemeti yang tidak berubah (Alfena, 2008). Maka dapat

disimpulkan bahwa tidak terdapat mikroorganisme lain dalam media fermentasi dengan demikian tidak terjadi kontaminasi selama fermentasi non-steril.

16

4. KESIMPULAN

4.1. Kesimpulan Dari penelitian yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa 1.

Proses ekstraksi 320 g limbah padat pabrik rokok kretek / 1000 mL aquades selama 1 jam menghasilkan 0,98 g glukosa/ mL.

2.

Residu glukosa limbah padat pabrik rokok kretek dapat digunakan untuk produksi etanol menggunakan : a. Zymomonas mobilis ATCC 10988 pada pH normal dengan yield etanol sebesar 67,25 % teoritis atau 0,343 g etanol / g glukosa pada kondisi steril dan 66,86 % atau 0,341 g etanol / g glukosa pada kondisi nonsteril b. Zymomonas mobilis A3 pada pH 4,5 dengan yield etanol sebesar 67,84 % teoritis atau 0,346 g etanol / g glukosa pada kondisi steril dengan yield etanol sebesar 67,64 % atau 0,345 g etanol / g glukosa pada kondisi nonsteril.

4.2. Saran 1. Untuk meningkatkan produktivitas etanol dari limbah padat pabrik rokok kretek perlu dilakukan proses pemisahan komponen senyawa seperti nikotin, eugenol yang ada pada limbah tersebut yang bisa menjadi inhibitor dalam proses fermentasi. 2. Menggunakan metode lain untuk mengontrol kontaminasi yang terjadi misalnya dengan mendeteksi asam volatil. Daftar Pustaka Alfena, (2008), “Produksi Etanol Menggunakan Zymomonas mobilis yang Dimutasi dengan Hidroksilamin”, Tugas Akhir Jurusan Kimia FMIPA, ITS, Surabaya. Budi, M dan Sasongko. (2007), “ Prospek Pengembangan Ubi Kayu Sebagai Bahan Baku Bioetanol Daerah Istimewa Yogyakarta, www.distan.pemda.diy.go id. Holil, M., (2002), “Standar Proses Blending SKM Reguler, R&D Departemen PT Gelora Djaja, Surabaya. Tao, F., Miao, J. Y., Shi, G. Y. and Zhang, K. C. (2005), “Ethanol Fermentation by Acid Tolerant Zymomonas mobilis Under Non-Sterilized Condition”, ProcessBiochem, Elsevier, 40, 183-187

17