Stručný návod k použití softwaru

Stručný návod k použití softwaru K použití s typizační sadou IMMUCOR® MIA FORA NGS HLA

Určeno pro diagnostiku in vitro

Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 550 West Avenue Stamford, CT 06902, Spojené státy americké 855-IMMUCOR www.immucor.com

Strana 1 ze 17 Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Všechna práva vyhrazena. LC1628CECS.0 (02/16)

Tato příručka je určena k použití se softwarem MIA FORA NGS

SR-790-00017

S veškerými dotazy, komentáři a požadavky se prosím obracejte na našeho zástupce prostřednictvím níže uvedené adresy.

Autorizovaný zástupce: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH Adam-Opel-Strasse 26A Rodermark 63322 Německo Tel.: (+49) 6074-84 20 -0 Technický servis pro Evropu: +32/3 385 47 91 IMMUCOR® je obchodní značka Immucor, Inc. MIA FORA™ je obchodní značka Sirona Genomics, Inc. ® illumina je obchodní značka Illumina, Inc. ® MiSeq je obchodní značka Illumina, Inc.

Účel použití Sada pro typizaci HLA pomocí NGS MIA FORATM slouží k amplifikaci a sekvenování HLA genů HLA -A, -B, -C, -DRB-1/3/4/5, -DQA1, -DQB1, -DPA1 a -DPB1 na sekvenační platformě Illumina NGS. Software MIA FORA slouží jako návod ke stanovení typu HLA z dat získaných pomocí sady Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 550 West Avenue Stamford, CT 06902, Spojené státy americké 855-IMMUCOR www.immucor.com


MIA FORA NGS HLA. Test je určen k použití v laboratořích způsobilých k manipulaci DNA pro amplifikaci a sekvenování.

Popis návodu Tento návod poskytuje základní pokyny k použití softwaru MIA FORA NGS Software 790-00017 ve spojení s následujícími sadami:

Typizační sada MIA FORA™ NGS HLA IVD pouze v Evropské unii)

SR-

SR-800-10377 (označení CE pro

Podrobné informace naleznete v příručce pro uživatele softwaru MIA FORA NGS. Tento návod nemůže nahradit příručku pro uživatele.

Příslušná dokumentace Níže uvedené materiály obsahují doplňující informace vztahující se k tomuto návodu, nebo na něj odkazující. Příručka pro uživatele softwaru MIA FORA NGS (LC1619) Příbalový leták pro typizační sadu MIA FORA NGS HLA (LC1618CE)

Omezení Omezení naleznete v příslušné dokumentaci.



Vytvoření projektu a analýza vzorku: 1. Vytvořte soubor s čárovými kódy vzorku (soubor Windows s hodnotami oddělenými čárkou(soubor csv)), který bude obsahovat názvy vzorků a přidělené čárové kódy. Uveďte také název projektu a polohy jamek. Tyto údaje budou použity pro analýzu sekvence.

a. Otevřete software MIA FORA a přejděte na záložku Projects (Projekty). Klikněte na tlačítko New Project (Nový projekt) v pravém horním rohu hlavní stránky.

b. Zadejte požadovaný název projektu (Project), číslo sady MIA FORA NGS (Lot), datum přijetí (Received at) a jméno operátora (Operator). Klikněte na tlačítko Browse (Hledat) a soubor s čárovým kódem vzorku (csv) bude nahrán.

Poznámka: Název projektu nesmí být delší než 30 znaků. Znaky pomlčky a podtržítka jsou povoleny, zvláštní znaky však povoleny nejsou a budou odstraněny.



c. K navigaci v listu s čárovými kódy slouží tlačítko Next (Další), správnost názvů vzorků potvrdíte pomocí Yes (Ano).

d. Nový projekt potvrdíte kliknutím na Finish (Dokončit). 2. Postup nastavení běhu MiSeq a pojmenování souborů FASTQ pomocí Illumina Experiment Manager naleznete v Příloze A. 3. Nový projekt je připraven k nahrání souborů FASTQ, jakmile je první řada označena oranžovou barvou.

a. Klikněte na zelené tlačítko přehrávání pod záložkou Next Step (Následující krok), pomocí kterého spustíte nápovědu k souboru FASTQ.



b. Pomocí hledání (browse) nahrajte soubory FASTQ. Před zvolením obou souborů dlouze stiskněte klávesu CTRL. POZNÁMKA: Názvy souborů FASTQ musejí začínat názvem projektu, aby byl software schopen rozpoznat soubory.

c. Klikněte na Finish (Dokončit) a spustí se nahrávání souborů FASTQ.

4. Klikněte na Project name (Název projektu) a vyberte projekt určený k analýze a kontrole dat. Poznámka: Nejaktuálnější projekty jsou uvedeny v horní části seznamu.



5. Klikněte na záložku Statistics (Statistiky) a spusťte kontrolu kvality běhu a. Zkontrolujte Piechart (Výsečový graf) i. Platné výsledky jsou >85 %. Neplatné výsledky <10 %. b. Zvolte Insert Distribution (Rozdělení insertu) i. Velikost insertu by měla být cca 150-400 c. Zkontrolujte Read Distribution Among Samples/Barcode (Interpretace rozdělení mezi vzorky/čárovými kódy) d. Zkontrolujte Nucleotide Distribution Along Each Position (Rozdělení nukleotidu pro jednotlivé pozice) i. Graf by měl od pozice 20 vykazovat stejné % pro každou bázi e. Zkontrolujte Quality Score Distribution Along Each Position (Rozdělení výsledků kvality pro jednotlivé pozice)



6. Klikněte na Review (Kontrola) a spusťte kontrolu dat

Obr. 1. Kontrolní okno: (A) Rozbalovací menu se vzorky a lokusy (B) Zvolené genotypy pro vzorek (C) SNP (jednonukleotidový polymorfismus) a tabulky s navrženými LD (D) Tabulka vypočtených alelových frekvencí kandidátních genů (E) Linie pokrytí a prohlížeč zarovnávání (alignment) (F) Prohlížeč zarovnávání (alignement) pro contig de novo



a. Prostřednictvím systému značení pomocí praporků (Smart Flagging System) zkontrolujte všechny případné abnormální stavy, nedostatečná data a nejasnosti.

b. Otevřete rozbalovací nabídku Sample (Vzorek) a Locus (Lokus) a zkontrolujte všechny údaje (Obr. 1 (A)) c. Zkontrolujte alely v tabulce Candidate (Kandidátní geny) (Obr. 1 (D)), i. Vezměte v potaz sloupec minimálního pokrytí cDNA (pátý sloupec) a sloupec minimálního centrálního pokrytí cDNA (šestý sloupec). d. V případě homozygotních stavů (pouze jedna alela na daný lokus) zkontrolujte informaci obsahující návrh LD, šedé stínování v linii pokrytí a tabulku s kandidátními geny, a zjistěte, zda nechybějí alely (Obr. 1 (C)). e. Linie pokrytí (Coverage Plots) zobrazíte zvýrazněním kandidátních alel v tabulce s kandidátními geny, poté zvolte možnost Coverage (Pokrytí) (Obr. 1 (E)).



f.

V levém okně jsou zobrazeny referenční sekvence pokrytí souběžné s cDNA, v pravém okně se nacházejí referenční sekvence pokrytí souběžné s genomem. Červené svislé čáry (křížky) nad křivkami znázorňujícími pokrytí označují polohy, které jsou odlišné mezi vybranými referenčními alelami. Šedě vystínované oblasti znázorňují rozdíl mezi celkovým pokrytím pro základní gen a celkovým pokrytím pro vybrané alely. g. Pro potvrzení / kontrolu automatického přidělení zvolte přidělenou alelu a alelu dle vlastního výběru. Klikněte na tlačítko Consensus Alignment (Odsouhlasené zarovnání) a proveďte srovnání s nejblíže odpovídající Contig. h. Projděte různé funkce zarovnání a porovnejte alely, a potvrďte nebo změňte automatické přidělení.



i.

Použijte nástroje SNP a LD Suggestion (Návrh LD) a zvolte nejvhodnější řešení. i. V tabulce SNP je uveden seznam polymorfních de-novo spojených contig, fázovaných bloků a frekvencí nukleotidů na jednotlivých polymorfních místech. Pokud je poměr nukleotidových frekvencí v Contig1 vůči Contig2 odlišný od průměrného poměru, budou příslušné buňky vyznačeny oranžovou barvou.



ii. V panelu LD Suggestion (Návrh LD) jsou uvedeny záznamy z databáze Linkage Disequilibrium (Nerovnováhy vazeb) obsahující alely uvedené v tabulce genotypu vzorku. Jednotlivé řady představují alely, u kterých byla zaznamenána vzájemná propojení. Panel LD Suggestion (Návrh LD) má pouze informativní povahu. LD neslouží k výpočtu genotypů vzorku.

j.

V případě, že budou ve stavu provedeny změny, klikněte na tlačítko Refresh (Obnovit) nad tabulkou s genotypy. Pokud jsou všechny stavy správné, klikněte na tlačítko schválení a přejděte na následující vzorek. Vypočítaný stav mohou změnit pouze uživatelé ve funkci technika či ředitele laboratoře.

k. Po schválení vzorku může výsledek změnit pouze uživatel v řídící roli, a to kliknutím na ReAnalysis (Provést novou analýzu).



7. Před vygenerováním zprávy (Report) klikněte na Summary (Shrnutí) a zkontrolujte genotypy všech vzorků.



8. Klikněte na tlačítko Report (Zpráva) a zvolte výsledný formát (PDF, PDF bez komentáře, XML)



PŘÍLOHA A Příloha: Spuštění MiSeq® vyžaduje vytvoření listu se vzorky 1. Pomocí níže uvedeného odkazu stáhněte Illumina® Experiment Manager. https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloa ds.html 2. Otevřete software a klikněte na Create Sample Sheet (Vytvořit list se vzorky)

3. Zvolte MiSeq Instrument a klikněte na Next (Další). 4. Pod záložkou Select Category (Zvolit kategorii) zvolte Other (Jiná), pod Select Application (Zvolit aplikaci) zvolte FASTQ Only (Pouze FASTQ) a nakonec klikněte na Next (Další).



5. Zadejte Workflow Parameters (Parametry pracovního postupu) a zvolte Next (Další) a. Reagent Cartridge barcode field (Pole pro čárový kód kazety činidla): Zadejte číslo čárového kódu MiSeq. Číslo čárového kódu naleznete na štítku kazety. b. Sample Prep Kit (Sada pro přípravu vzorku): Zvolte TruSeq HT c. Index Reads (Počet interpretací indexu): Zvolte 0 d. Experiment name (Název pokusu): Musí začínat názvem projektu, který byl právě vytvořen pomocí softwaru MIA FORA (např: Školení_6led16_QUAIL) Pozn.: Zkopírujte název pokusu a vložte jej do pole Sample ID (ID vzorku) v kroku 6. e. Investigator Name (Jméno osoby provádějící pokus): Jméno příslušné osoby f. Description (Popis): Veškeré doplňující informace g. Date (Datum): Datum běhu h. Read Type (Typ interpretace): Zvolte párovaný konec i. Cycles Read 1/2 (Interpretace cyklu 1/2): Obě hodnoty by měly být 151 j. FASTQ Only Workflow-Specific Settings (Nastavení pracovního pokusu FASTQ): Žádné políčko není zaškrtnuté



6. Na obrazovce Sample Sheet (List se vzorky) je nutné uvést pouze 1 řadu. Zkopírujte název pokusu použitý v kroku 5 do pole „Sample ID“ (ID vzorku). Klikněte na Finish (Dokončit). Soubor FASTQ bude pojmenován podle údaje zadaného v poli „Sample ID“ (ID vzorku) (např.: Školení_6led16_QUAIL).

7. Uložte soubor CSV s názvem projektu (Project name) na příslušné místo v MiSeq.



Stručný návod k použití softwaru

Recommend Documents