MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Ústav biochemie
Stanovení kofeinu a jeho metabolitu jako markeru biotransformační aktivity CYP1A2
Bakalářská práce studijního oboru Aplikovaná biochemie - směru Klinická biochemie
Vedoucí bakalářské práce: PharmDr. Jan Juřica, Ph.D.
Miroslava Ťupová Brno 2011
Poděkování Tímto bych chtěla poděkovat PharmDr. Janu Juřicovi, Ph.D., vedoucímu mé bakalářské práce, za vstřícnost a ochotu v průběhu jejího vypracovávání, cenné rady, připomínky a věnovaný čas. Poděkování patří také mé rodině za podporu, kterou mi během studia poskytla.
-2-
Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci Stanovení kofeinu a jeho metabolitu jako markeru biotransformační aktivity CYP1A2 vypracovala samostatně a všechny použité literární a jiné odborné zdroje jsem uvedla v seznamu použité literatury.
V Brně dne:
……………………………………… podpis autora -3-
OBSAH OBSAH ....................................................................................................................... 4 1
ÚVOD .................................................................................................................. 6
2
TEORETICKÁ ČÁST............................................................................................ 7 2.1
Kofein a jeho vlastnosti ........................................................................................ 7
2.2
Metabolismus kofeinu .......................................................................................... 7
2.2.1
Paraxantin ....................................................................................................................... 9
2.2.2
Teofylin a teobromin ...................................................................................................... 9
2.3
Cytochrom P450 ................................................................................................... 9
2.3.1
Izoforma CYP1A2 .........................................................................................................10
2.3.2
Izoforma CYP2C9 .........................................................................................................12
2.3.3
Izoforma CYP2D6.........................................................................................................12
2.3.4
Izoforma CYP3A4 .........................................................................................................12
2.4
Metody stanovení kofeinu a jeho metabolitů ................................................... 13
3
CÍL BAKALÁŘSKÉ PRÁCE ............................................................................ 18
4
METODICKÁ ČÁST........................................................................................... 19
5
4.1
Chemikálie .......................................................................................................... 19
4.2
Pracovní roztoky a vzorky ................................................................................. 19
4.2.1
Reálné vzorky biologického materiálu ..........................................................................19
4.2.2
Vzorky kontroly kvality ................................................................................................19
4.3
Instrumentace ..................................................................................................... 20
4.4
Validace metody ................................................................................................. 20
VÝSLEDKY ....................................................................................................... 21 5.1
Extrakce .............................................................................................................. 21
5.2
HPLC ................................................................................................................... 21
5.3
Validace metody ................................................................................................. 22
5.3.1
Linearita a pracovní rozsah měření ...............................................................................22
5.3.2
Analytická výtěžnost extrakce .......................................................................................22
5.3.3
Limity detekce ...............................................................................................................23
5.3.4
Přesnost a opakovatelnost měření .................................................................................23
-4-
6
DISKUZE .......................................................................................................... 27
7
ZÁVĚR ............................................................................................................. 29
8
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ........................................................... 30
9
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY………………………………..……..……..31
-5-
1
ÚVOD V současnosti se stále více hovoří o působení xenobiotik na lidský organismus a
v souvislosti s tím také o tom, jakým způsobem se naše tělo s těmito látkami může vypořádat. Pojmem cytochrom P450 se označuje velká skupina enzymů vyskytujících se v živých organismech a mající v různých částech lidského těla různé funkce. Jednou z hlavních funkcí enzymů cytochromu P450 v lidském organismu je biotransformace xenobiotik, mimo jiné i léčiv a jejich metabolitů.. Kofein se v současné době ve farmakologii používá jako adjuvans k analgetikům a také pro své psychostimulační účinky. Vedle toho se používá také jako marker pro zjištění metabolické aktivity (tedy aktuální schopnosti enzymu biotransformovat substráty) jedné z biotransformace
izoforem cytochormu P450, izoformy CYP1A2. Rychlost
kofeinu
na
paraxantin
a
poměr
paraxantin/kofein je měřítkem aktivity enzymu CYP1A2.
-6-
molárních
koncentrací
TEORETICKÁ ČÁST
2 2.1
Kofein a jeho vlastnosti
Kofein (1,3,7-trimetylxantin) je purinový alkaloid, hojně se vyskytující spolu se svými metabolity v lidských tělních tekutinách v důsledku každodenní spotřeby kávy a čaje, které jsou jeho hlavním zdrojem. Velká spotřeba kofeinu je způsobena především jeho stimulačními vlastnostmi na centrální nervový systém a srdeční činnost [1,3]. Z rostlinných zdrojů kofeinu je třeba zmínit kávové a kakaové boby, listy čajovníku, bobule guarany, cesmínu (keř podobný brusince, jinak známý také jako Illex vomitoria) a yerba maté. Yerba maté (neboli Cesmína paraguayská) je stále zelený strom rostoucí v Jižní Americe, jehož listy a stonky využívají především Argentinci k přípravě národního nápoje zvaného maté, který je znám svými povzbuzujícími účinky. Kofein je pravděpodobně nejrozšířenější stimulant na světě. Přibližně 85 % populace USA denně užívá kofein. Kofein je součást mnoha populárních nápojů. Nejčastějším zdrojem je káva (100 mg na porci), instantní káva (65 mg), čaj (40 mg) a čokoláda (5 mg). Průměrný příjem kofeinu je přibližně 210 mg denně na celou populaci v USA, ale 6 % obyvatelstva si na této látce vypěstovalo těžkou závislost (jedná se o dávky větší než 500 mg denně). Mnoho léčivých přípravků k výdeji na předpis, i bez předpisu, jako například přípravky proti bolesti či k potlačení příznaků nachlazení také obsahují kofein, i když v relativně malém množství. Bylo zjištěno, že akutní a zejména chronický příjem kofeinu může mít nepříznivé účinky na zdraví, a je-li používán ve vysokých dávkách, může způsobit nevolnost, třes, podrážděnost, ale také halucinace, deprese a dezorientaci. Dalšími typickými příznaky především chronického nadužívání jsou srdeční arytmie, hypertenze, nespavost, nesoustředěnost, nervozita nebo křeče [3,15]. Při náhlém vysazení se pak mohou objevit abstinenční příznaky zahrnující předrážděnost, letargii a bolesti hlavy [3].
2.2 Metabolismus kofeinu Ze zažívacího traktu se kofein vstřebává velmi rychle a maximální koncentrace v krvi dosahuje už po 1 hodině. Hlavním místem biotransformace kofeinu jsou játra, kde probíhají nejdůležitější reakce. Metabolismus kofeinu je realizován několika po sobě jdoucími a navzájem si konkurujícími kroky. Metabolizace se účastní enzymy cytochromu P450, především formou N-demethylace nebo například aromatické
-7-
hydroxylace. Nejdůležitějším enzymem je 1A2 isoforma cytochromu P450 (CYP1A2), která zajišťuje N-demetylaci. Dále se pak na biotransformaci kofeinu podílí enzymy Nacetyltransferáza (NAT) a xantinoxidáza (XO). Z uvedených reakcí je 3N-demetylace považována za specificky katalyzovanou reakci [2, 11]. Tři nejvýznamnější metabolity jsou paraxantin (PX), teobromin (TB) a teofylin (TP). Je známo, že 80 - 85 % kofeinu je přeměněno 3N-demetylací na paraxantin, 12 % je přeměněno 1N-demetylací na teobromin a 4 % 7N-demetylací na teofylin [1]. Prvními produkty metabolismu jsou právě již zmiňované dimetylxantiny: paraxantin (1,7-dimetylxantin), teobromin (3,7-dimetylxantin) a teofylin (1,3-dimetylxantin). Biologický poločas kofeinu je u dospělého jedince zhruba 5 h. Následně je kofein i jeho metabolity vyloučen z těla močí [4]. Obr. 2.1: Jaterní metabolismus kofeinu [4]
-8-
2.2.1 Paraxantin Nebyl nalezen v potravinách, ale je hlavním metabolitem kofeinu [5]. Nedávnou studií bylo zjištěno, že paraxantin má ochranné účinky proti neurodegeneraci a ztrátě synaptické funkce neuronů a tím snižuje riziko onemocnění Parkinsonovou chorobou. Paraxantin způsobuje aktivaci ryanodinových receptorů, kterými ionty Ca2+ z endoplazmatického retikula přechází do cytosolu buňky, kde se zvyšuje jejich koncentrac a tím i šance na přežití buňky. Z tohoto pohledu je dokonce paraxantin účinější než kofein [6].
2.2.2 Teofylin a teobromin Teofylin je inhibitorem fosfodiesterázy (jako ostatní metylxantinové deriváty využívané ve farmakoterapii), čímž zvyšuje dostupnost cAMP v buňkách hladkého svalstva a tím uvolňuje hladkou svalovinu průdušek, a proto je používaný při léčbě průduškového astmatu. Dále jsou známy účinky na kardiovaskulární systém a také protizánětlivé účinky. V přírodě se vykytuje spolu s teobrominem v listech čajovníku (Camellia sinensis) a semenech kakaovníku (Theobroma cacao). Teobromin působí diureticky, dilatuje cévy a snižuje tak krevní tlak [4].
2.3 Cytochrom P450 Pojmem cytochrom P450 je označena velká rodina enzymů obsahujících ve své molekule hem. Jedná se tedy o tzv. hemoproteiny. Charakteristickou vlastností enzymů této rodiny je UV absorpční maximum redukované formy s navázaným oxidem uhelnatým při 450 nm. Písmeno P v názvu pak označuje pigment [7]. Cytochromy P450 jsou systémy účastnící se enzymatické přeměny cizorodých organických sloučenin - xenobiotik [12]. Biotransformace xenobiotik, včetně léčiv, probíhá většinou ve dvou fázích. V I. fázi biotransformace dochází k přeměně xenobiotik na více hydrofilní produkty. Z chemických reakcí se zde uplatňují hydrolýza, redukce a především oxidace, kterou zprostředkovává právě cytochrom P450. V II. fázi biotransformace reagují vytvořené funkční skupiny s endogenními molekulami (konjugace například s glutathionem, kyselinou glukuronovou, octovou, žlučovými kyselinami atd.). Následně jsou pak polárnější produkty vylučovány močí. -9-
Mezi nejdůležitější funkce, kterou cytochromy P450 plní patří : detoxikační funkce, odstranění exogenních látek. Toho je dosaženo oxidační reakcí molekuly substrátu a následnou konjugací s endogenní hydrofilní látkou (glukuronová kyselina, acetát, sulfát, žlučové kyseliny atd.). V některých organismech živočichů slouží cytochrom P450 jako obranný mechanismus proti toxickým alkaloidům v rostlinách, které jsou pro tyto živočichy potravou. Mezi substráty se skupiny xenobiotik patří léčiva, karcinogeny, pesticidy, atd. metabolismus endogenních látek. Příklady těchto látek jsou steroidní hormony, žlučové kyseliny a vitamíny rozpustné v tucích (A a D). podílí se na syntéze oxidu dusnatého. Vedle detoxikační funkce se cytochromy P450 podílí na biotransformačních reakcích, které mohou vést ke zvýšení biologické nebo farmakologické aktivity. Těmito reakcemi však mohou vznikat nejen účinné formy léčiv, ale i látky toxické, mutagenní a karcinogenní. V lidském genomu se doposud podařilo identifikovat 57 genů pro různé izoformy CYP, které lze zařadit do 18 rodin a 45 podrodin. První číslo za zkratkou CYP450 označuje rodinu, následuje velké písmeno označující podrodinu a číslice na konci označující jednotlivou izoformu. Až na výjimky jsou všechny exprimovány převážně v játrech, dále pak v tenkém střevě, plicích, mozku, ledvinách a v kůži [7, 8, 18].
2.3.1 Izoforma CYP1A2 Představuje asi 15 % z celkového obsahu cytochromu P450 v játrech. Metabolizuje především xenobiotika, podílí se na biotransformaci několika důležitých léčiv jako je olanzapin, klozapin, teofylin a kofein, a dále na metabolismu endogenních substrátů jako jsou melatonin a estradiol (viz tabulka č. 2.1). Kofein, který je převážně metabolizován CYP1A2, je považován za ,,zlatý standard" pro sledování aktivity CYP1A2. Bylo zjištěno, že zvířecí izoformy CYP jsou do jisté míry podobné lidským izoformám, a proto se v experimentální farmakologii při testování možného ovlivnění biotransformační aktivity izoformy CYP1A2 nově vyvíjenými léčivy využívá malých laboratorních hlodavců (potkan, myš). [13].
-10-
Tab. 2.1: Substráty, inhibitory a induktory isoformy CYP1A2 [25] Substráty amitriptylin kofein klomipramin klozapin cyklobenzamin estradiol fluvoxamin haloperidol mexiletin naproxen olanzapin ondansetron fenacetin propanolol riluzol ropivakain takrin teofylin tizanidin verapamil R-warfarin zileuton zolmitriptan
Inhibitory amiodaron
Induktory beta-naftoflavon cigaretový kouř
cimetidin
inzulín ciprofloxacin flavoxamin fluorochinolony
metylcholantren modafilin nafcilin omeprazol
furafylin
PAH v grilovaném mase
methoxsalen
rifampicin obsahové látky zeleniny
mibefradil
čeledi Brassicaceae paroxetin
(brokolice, růžičková kapusta)
Mutacemi genu pro cytochrom P450 mohou vzniknout enzymy s pozměněnou metabolickou aktivitou. Pokud se tato pozměněná alela vyskytuje alespoň u 1 % populace hovoříme o tzv. farmakogenetickém polymorfismu. Z hlediska polymorfismu bylo doposud u této izoformy nalezeno 21 alel, přičemž změna enzymové aktivity in vivo byla pozorována jen u několika z nich. Nejvýznamějšími alelami jsou z hlediska snížené enzymové aktivity CYP1A2*1C, CYP1A2*1K, CYP1A2*3, CYP1A2*4, CYP1A2*6 a CYP1A2*7 a z hlediska zvýšené inducibility (především cigaretovým kouřem) alela CYP1A2*1F [24].
-11-
2.3.2 Izoforma CYP2C9 Enzymy z podrodiny CYP2C tvoří 18,2 % celkového jaterního CYP. U lidí jsou zastoupeny 4 izoformy CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18 a CYP2C19, ze kterých jsou pro metabolizmus léčiv důležité zejména CYP2C9 a CYP2C19. Kvantitativně nejvíce je exprimován CYP2C9 a jeho obsah v játrech asi 5x převyšuje expresi CYP2C19 [7].
2.3.3 Izoforma CYP2D6 V organismu se CYP2D6 nachází především v játrech, ale i v mozku, plicích a trávicím traktu. Kvantitativně je málo zastoupen, ale v metabolismu léčiv je po CYP3A4 druhým nejvýznamnějším enzymem [7]. CYP2D6 je zodpovědný za metabolismus velké části psychoaktivních léčiv [10].
2.3.4 Izoforma CYP3A4 Kvantitativně nejdůležitější izoforma CYP se vyskytuje dominantně v játrech (30 % jaterních CYP 450) a ve střevě (více než 70 % CYP 450 ve střevní stěně), v menším množství v ledvinách, placentě, plicích a mozku. Mezi jeho substráty patří mnoho látek endogenního i exogenního původu a pravděpodobně více než 50 % všech klinicky používaných léčiv. Značné odlišnosti ve struktuře substrátů jsou pravděpodobně umožněny existencí více vazebných míst uvnitř aktivního místa enzymu [7].
Obr. 2.2: Podíl jednotlivých izoforem CYP450 na celkovém CYP450 v játrech a na metabolismu léčiv [7]
-12-
2.4 Metody stanovení kofeinu a jeho metabolitů HPLC Nejpoužívanější metodou pro stanovení kofeinu a jeho metabolitů v biologických vzorcích je metoda vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC). Pro přečištění vzorku před vlastním stanovením užívá většina těchto metod extrakci do rozpouštědla nebo extrakci na pevné fázi. Analyty jsou nejčastěji detekovány spektrofotometricky pomocí jedné vlnové délky nebo diodovým polem (DAD), popř. hmotnostní detekcí (MS). Jedna z publikovaných metod stanovení kofeinu a paraxantinu v lidském séru pomocí reverzně fázové vysoce účinné chromatografie (RP-HPLC) využívá přečištění vzorku extrakcí s použitím kyseliny chloristé, čímž se vysráží sérové proteiny a zbylý supernatant je dávkován
na kolonu. Používá se polární mobilní fáze (15mM
fosforečnanový pufr o pH 4,9) : methanol o složení 85:15 (v/v) a stacionární fáze – modifikovaného silikagelu C18. Na UV detektoru byla nastavená vlnová délka 274 nm a limit detekce této metody s použitím vnějšího standardu je 50 ng/ml pro každou stanovovanou látku [1]. Jiná metoda RP-HPLC pro stanovení kofeinu ve vzorku kakaového prášku využívá jednoduché extrakce do vody. Mobilní fáze byla složená z roztoku 20% methanolu ve vodě, stacionární fázi tvořil modifikovaný silikagel - C18. Analyty byly detekovány pomocí UV detektoru při vlnové délce 274 nm. Doba analýzy činila 10 minut. Metoda dosáhla výtěžnosti více než 95 % pro každý analyt. Bylo dosaženo následujících limitů detekce: teobromin (TB) 0,10 μg/ml, teofylin (TP) 0,08 μg/ml a kofein (CAF) 0,10 μg/ml; limity kvantifikace TB 0,50 μg/ml, TP 0,25 μg/ml a CAF 0,50 μg/ml. [19]. Aresta a kol. použili jinou metodu ke stanovení kofeinu, teobrominu, teofylinu, paraxantinu a nikotinu ve vzorcích mateřského mléka. Přečištění vzorků bylo realizováno pomocí extrakce na pevné fázi (SPE), detekce provedena diodovým polem při 260 nm, mobilní fáze měla složení metanol: pufr (5mM oktansulfonát sodný, 10 mM kyselinou citronovou upraveno pH na 5,8) v poměru 20:80, po 30 minutách analýzy byly zjištěny koncentrace CAF v jednotlivých vzorcích v rozmezí 0,07-0,77 μg/ml, paraxantinu (PAX) 0,15 – 1,68 μg/ml, TB 0,08-0,50 μg/ml a TP 0,10 – 0,66 μg/ml. Metoda poskytla limit detekce v rozmezí 8 ng/ml (CAF) - 13 ng/ml nikotin (NI). [5]. Další HPLC metoda sledovala kofein a paraxantin ve vzorcích krevního séra, čímž byla zkoumána aktivita CYP1A2. Jako vnitřního standardu bylo použito ß-hydroxy-13-
etylteofylinu. Vzorky byly extrahovány směsí chloroform:isopropanol o složení 9:1 (v/v). Mobilní fázi tvořila 0,05% kyselina octová, acetonitril a metanol. Analyty byly detekovány pomocí UV detekce při 282 nm. Paraxantin, vnitřní standard a kofein dosáhly základního rozlišení a jejich retenční časy byly kratší než 13 minut. Limit detekce obou látek byl 0,1 μmol/l. Výtěžnost obou látek se pohybovala v rozmezí 96108 % [17]. Podobných metod založených na extrakci do směsi organických rozpouštědel, eluci pufrovanou kyselou mobilní fází s použitím reverzní pevné fáze a detekcí při jedné vlnové délce bylo publikováno více [28,29]. HPLC metody ve spojení s hmotnostní detekcí dosahují dokonce lepších limitů detekce, jak dokládá např. metoda sledující 6 markerů nejvýznamnějších izoforem cytochromu P450 a jejich metabolitů - limity detekce dosahují řádu ng/l [30]. Podobných výsledků dosahuje i jiná HPLC-MS-MS metoda, vyvinutá právě pro stanovení fenotypu CYP1A2, sledující dokonce 11 metabolitů kofeinu a dosahující limitu detekce okolo 2 g/l [31]. Výhodou HPLC metod je univerzální použití, celkově dobrá dostupnost instrumentace, velká účinnost separace, vysoká rozlišovací schopnost, přesnost a reprodukovatelnost [1]. Kapilární elektroforéza a kapilární chromatografie Další často používanou metodou ke stanovení kofeinu je kapilární elektroforéza (CE). Ačkoliv RP-HPLC se stala jistým standardem pro stanovení kofeinu, ukázalo se, že výhody kapilární elektroforézy jsou vysoce efektivní separace, krátká doba analýzy, nízká spotřeba vzorku a rozpouštědel. Detektory v CE jsou nejčastěji založeny na optických spektroskopických technikách jako například UV nebo fluorescence. UV detekce je nejčastější detekční technika používaná díky své jednoduchosti a širokému uplatnění, ale postrádá selektivitu a má omezenou citlivost. Také hmotnostně spektrometrický detektor (CE-MS) nachází také ve farmaceutické analýze své místo. Je používán k detekci nečistot neobsahující UV-chromofory, k hmotnostně selektivní detekci a umožňuje získat informace o struktuře díky vysoké přesnosti měření. Hlavní výhodu CE je skutečnost, že nejlepších výsledků obvykle dosahuje při analýze malých objemů vzorků (obvykle <50 nl) a to vede k relativně nízkým hodnotám limitů detekce pro CE a CE-MS ve srovnání s HPLC nebo HPLC-MS [26,27]. Metoda kapilární elektroforézy byla použita při stanovení kofeinu a jeho 11 metabolitů ve vzorcích moči pacientů a analyty detekovány pomocí UV detektoru při -14-
280 nm a hmotnostního spektrometru. Extrakce vzorků byla provedena na SPE kolonách. Separace všech 12 analytů byla provedena v křemenné kapiláře o vnitřním průměru 50 μm a délce 90 cm potažené polyamidovým povlakem. Jako základní elektrolyt pro oddělení analytů kapilární elektroforézou byl použit glycinový a uhličitanový pufr (pH 11). Spolehlivého oddělení a rozlišení všech analytů bylo dosaženo v uhličitanovém pufru za méně než 30 minut. S použitím glycinového pufru bylo dosaženo pouze základního rozlišení, nikoli však oddělení [15]. Pro použití CE na separaci neutrálních částic byla zavedena metoda micelární elektrokinetické kapilární chromatografie (MECC), Jako mobilní fáze je používán nejčastěji dodecylsulfát sodný (SDS), který zajišťuje, aby povrchově aktivní látky a micely měly elektroforetickou mobilitu, která působí proti silnému elektroosmotickému toku. Analyty jsou tedy oddělovány na základě rozdílné elektroforetické mobility a hydrofobicity. Metoda Zhao a kol. pro oddělení kofeinu a jeho metabolitů teobrominu, paraxantinu, teofylinu a kyseliny 1,3,7-trimetylmočové micelární kapilární elektroforézou dosáhla vynikajícího času separace - méně než 2 minuty s použitím SDS jako mobilní fáze. Doposud se v literatuře neobjevila žádná jiná metoda, která by byla schopná oddělit kofein, teobromin, paraxantin, 1,3,7-trimetylmočovou kyselinu a teofylin za méně než 2 minuty. Metoda byla použita ke stanovení kofeinu a jeho metabolitů v nápojích, léčivech a tělesných tekutinách. Pro separaci byl použit elektroforetický systém s 60 cm tavenou křemennou kapilárou. UV detektor byl nastaven na 274 nm a limit detekce byl 1 μg/ml. Jiná metoda dělení theofylinu a dalších metabolitů kofeinu v krevní plazmě pomocí, dodecylsulfátu sodného jako mobilní fáze a UV detekce vyžaduje extrakci vzorku ethylacetátem, separace trvala 12 minut [14]. Thormann a kol. provedli stanovení substituovaných purinů v séru pomocí micelární kapilární elektroforézy s přímým vstřikováním vzorku. Analýza trvala 14 minut a oddělení nebylo úspěšné, odděleny byly pouze kyselina močová a teofylin [14]. Výhodami této MECC jsou malá spotřeba vzorku, rychlost analýzy, malá spotřeba chemikálií a s tím související malé množství vzniklého organického odpadu [14]. Plynová chromatografie Méně často používanou metodou ke stanovení kofeinu a jeho metabolitů je plynová chromatografie
(GC).
Výhodné
je
spojení
plynové
chromatografie
s
plamenoionizačním detektorem pro jeho vysokou citlivost, naopak jeho velkou nevýhodou je destrukce vzorku. Nevýhodou také je, že stanovované analyty musí být -15-
těkavé, což bývá při stanovení léčiv problém a musejí být tedy před samotným stanovením derivatizovány [20]. Přestože v dostupné literauře se GC metody pro stanovení kofeinu objevují zřídka, kofein a jeho metabolity mohou být takto stanoveny, jak dokládá práce Kumazawy a kol. Kofein a jeho metabolity byly stanoveny ve vzorcích krve a moči za použití plamenoionizačního detektoru. Přečištění vzorků bylo realizováno mikroextrakcí na pevné fázi (SPME). Účinnost extrakce metylxantinů činila v krvi pouze 0,01-0,047 % a v moči 0,05 – 0,229 % a při extrakci bylo použito pentifilinu jako vnitřního standardu. Nízká účinnost extrakce není překvapením, protože je pouze výsledkem rozdělovacího koeficientu analytů mezi stacionární fázi SPME a roztoky vzorků. Nízká účinnost extrakce přesto není dle autorů na závadu, především díky nízkému koeficientu variace spolu s nízkým detekčním limitem. Limit detekce jednotlivých stanovovaných látek ve vzorku krve byl 0,2 – 0,9 μg/ml a ve vzorku moči 0,06 -0,70 μg/ml [21]. Pomocí plynové chromatografie byl také stanoven kofein v krevní plazmě po požití 400 ml kávy. Bylo použito kolony o délce 75 cm, vzorku o objemu 1 ml a plamenoionizačního detektoru citlivého na dusíkaté látky. Limit detekce činil 1 ng/ml. Analýze předcházela extrakce dichlormethanem s použitím vnitřního standardu 7-pentylteofylinu [20]. Ostatní metody Velmi málo se ke stanovení kofeinu používají speciální elektrochemické metody využívající chemicky modifikované elektrody. V literatuře byla zmíněna jedna voltametrická metoda. Je to metoda využívaná ke studiu a stanovení látek rozpuštěných ve vodných roztocích a v organických či směsných rozpouštědlech. K voltametrickému stanovení kofeinu v nápojích bylo použito chemicky modifikovaných elektrod. Jejich výhodou oproti uhlíkovým elektrodám je to, že jsou více citlivé a selektivní ke stanovované látce než k rušícím složkám. Vhodnou úpravou povrchu pak může elektroda docílit požadovaných chemických, elektrochemických, elektrických nebo optických vlastností. Zen a kol. publikovali voltametrickou metodu pro stanovení kofeinu v nápojích. Systém byl složen z chemicky modifikované pracovní elektrody a argentochloridové referenční elektrody. Indiferentním elektrolytem byla 0,05 M kyselina chloristá. Limit detekce činil 2 μM. Hodnoty koncentrací pro jednotlivé nápoje byly stanoveny následovně: cola 44,01±0,50 mg/l, čaj 473,53±1,3 mg/l, káva 44,84±0,42 mg/g a káva se sníženým obsahem kofeinu 2,17±0,01 mg/g , výtěžnost metody se vždy pohybovala kolem 98 % [22]. -16-
Netradičním a málo používaným způsobem stanovení kofeinu je potenciometrie, která
při
stanovení
koncentrace
stanovované
látky využívá
měření
napětí
elektrochemických článků, kterými neprochází proud. Časté je stanovení analytů pomocí iontově selektivních elektrod (ISE), které své uplatnění v analytické chemii mají zhruba od roku 1970. Výhodou těchto elektrod je jednoduchost, selektivita, vysoká citlivost a možnost aplikovat je na vzorky různého původu. [23]. V literatuře byla publikována jedna potenciometrická metoda pro stanovení kofeinu v tabletách pomocí iontově selektivních elektrod s kapalnou membránou. Elektrochemický článek byl
složen z
elektrody s kapalnou
membránou (iontoměničem
je kyselina
pikrylsulfonová a aktivní složkou n-oktanol) a referenční argentochloridové elektrody. ISE poskytla rychlou a stabilní odpověď po dobu 30 dní a vysokou selektivitu na kofein v přítomnosti mnoha organických rozpouštědel. Výtěžnost metody se pohybovala okolo kolem 99,5 % [23].
-17-
3
CÍL BAKALÁŘSKÉ PRÁCE Hlavním cílem této bakalářské práce je vyvinout nebo adaptovat rychlou,
reprodukovatelnou a citlivou metodu pro stanovení kofeinu a jeho metabolitu paraxantinu. Tato metoda by měla být následně využitelná ke stanovení metabolické aktivity izoformy 1A2 cytochromu P450 jak v klinické praxi tak v preklinickém experimentu. Dalším cílem této bakalářské práce je také tuto metodu validovat a tím ověřit, že je k tomuto stanovení vhodná, přesná, dostatečně citlivá, spolehlivá a opakovatelná.
-18-
4
METODICKÁ ČÁST
4.1 Chemikálie Kyselina octová 99% (Fluka Chemie, SRN) Kyselina chlorovodíková -1 M (Spofa, ČR) Methanol (Scharlau Chemie S.A., ESP) Kofein, paraxanthin (Sigma-Aldrich, USA) Vnitřní standard paracetamol - 50 mg/l (Sigma-Aldrich, USA) Chloroform (Scharlau Chemie S.A., ESP) Isopropanol (Biosolve B.V, NLD)
4.2 Pracovní roztoky a vzorky Roztoky směsných standardů byly připraveny ze zásobního roztoku standardů o koncentraci 5000 mg/l a mobilní fáze o složení metanol:kyselina octová 25:75 (v/v). Byly připraveny 3 koncentrace zásobních roztoků: X 1250 mg/l, Y 250 mg/l, Z 62,5 mg/l. Z těchto zásobních roztoků byly dle potřeby připravovány ředěním s mobilní fází kontrolní vzorky, opět na 3 koncentračních hladinách: A 50 mg/l, B 10 mg/l, C 2,5 mg/l.
4.2.1 Reálné vzorky biologického materiálu Zdravým dobrovolníkům byl po minimálně 12h wash out periodě podán kofein ve formě šálku instantní kávy (cca 150 mg kofeinu, množství kofeinu ověřeno HPLC). Následně byly odebrány vzorky slin v intervalech 2, 3 a 4 hodiny a současně byla sbírána moč do sběrné nádoby a v čase 4 a 8h po podání kofeinu byly odebrány vzorky o objemu 1 ml. Všechny vzorky byly zamraženy při -75 °C do analýzy.
4.2.2 Vzorky kontroly kvality Vzorky kontroly kvality byly připraveny z pracovních roztoků standardů a vzorků čistých (blank) slin a moči (chromatograficky ověřena nepřítomnost kofeinu a metabolitů). Následujícím způsobem byly připraveny 3 vzorky na 3 koncentračních hladinách pro každý materiál (moč + sliny) - 2,5 mg/l, 10 mg/l a 50 mg/l. Do 9 skleněných zkumavek bylo pipetováno 480 μl vzorku slin (blank) a do dalších 9 -19-
zkumavek pipetováno 480 μl vzorku moči (blank). Do každé zkumavky bylo pipetováno 20 μl zásobního roztoku standardu (X, Y nebo Z) tak, aby byly připraveny vždy 3 vzorky na každé koncentrační hladině pro každý biologický materiál (moč + sliny). Vzorky moči byly dle koncentrací označeny jako AM1-3, BM1-3, CM1-3, vzorky slin pak AS1-3, BS1-3, CS1-3.
4.3 Instrumentace Třepačka Multi reax (Heidolph, SRN), centrifuga Universal 32R (Hettich, SRN), HPLC systém Shimadzu složený z gradientové pumpy LC-10 ADvp, jednotky pro odvzdušnění mobilní fáze DGU-14A, autosampleru SIL 10 ADvp, dc jednotky SCL 10 Avp, termostatu kolon CTO 10 ACvp, DAD detektoru SPD-M10Avp (Shimadzu, JPN). K separaci analytů bylo použito chromatografické kolony Kinetex 2,6 μm PFP (150 x 4,6 mm; 5 μm) s použitím předklony SecurityGuard C18 (8 x 3 mm; 5μm) (Phenomenex,USA). Data byla zpracována pomocí softwaru Labsolution 1.03 SP3 (Shimadzu, JPN).
4.4
Validace metody
K sestrojení šestibodové kalibrační přímky byly připraveny roztoky standardů v takovém rozmezí, aby se nejnižší koncentrace blížila limitu detekce, a nejvyšší koncentrace aby převyšovala očekávané koncentrace, které by mohly být detekovány v reálných vzorcích. Pro stanovení opakovatelnosti měření, výtěžnosti extrakce a stanovení limitu detekce byly připraveny kontrolní vzorky o známé koncentraci (viz. Vzorky kontroly kvality) smícháním směsných standardů analytů s močí nebo slinami 1:24. Tímto způsobem byly připraveny 3 vzorky ve třech koncentracích, které pokrývaly námi očekávané rozmezí koncentrací v reálných vzorcích. Tyto kontrolní vzorky byly uchovávány, extrahovány a analyzovány stejným způsobem jako vzorky reálné. Při stanovení výtěžnosti extrakce byla srovnávána plocha píku u kontrolních vzorků s plochou píků u připravených čistých roztoků standardů. Ke stanovení opakovatelnosti měření byly 3 kontrolní vzorky měřeny pro každou koncentraci opakovaně v jednom dni (intraday) 10krát a při stanovení opakovatelnosti měření mezi dny (interday) byly kontrolní vzorky na každé koncentrační hladině měřeny 10 dní po sobě. Zjištěné hodnoty byly dále statisticky hodnoceny.
-20-
5
VÝSLEDKY Po vyzkoušení několika různých extrakčních postupů (diethylether, chloroform,
hexan, butanol) chromatografických kolon {(Luna C18(2) (150 x 4,6 mm; 5 µm) (Phenomenex, USA), Pathfinder AP, (150 x 4,6 mm, 3 µm)(Shimadzu, JPN), Kinetex PFP (150x3.0mm, 2.6 μm) (Phenomenex, USA)} a mobilních fází (octanový pufr o různých molaritách v rozmezí pH 3,0-5,8, fosfátový pufr v molaritách 0,5, 0,01 v rozmezí pH 4,2- 8,0, kys. octová v různých koncntracích) byla pro validaci vybrána jako nejlepší následující metoda.
5.1 Extrakce Ke vzorkům kontroly kvality nebo reálným vzorkům bylo pipetováno 50 μl vnitřního standardu - paracetamolu (50 mg/l) a směs byla následně okyselena 50 μl 1M HCl. Dávkovačem bylo přidáno 4 ml extrakční směsi o složení chloroform:isopropanol 85:15 (v/v) a zkumavky ponechány 10 min třepat na rotační třepačce při 1400 kmit/min. Následně byly zkumavky centrifugovány při 2500 ot./min. Do čistých zkumavek bylo odpipetováno 3,5 ml spodní organické fáze, která byla odpařena proudem dusíku při 30 ˚C. Odparek byl pak použit k vlastní analýze.
5.2 HPLC Odparek z extrakce byl rozpuštěn ve 250 μl mobilní fáze o složení 0,05% kyselina octová : methanol, 75:25 (v/v). Do chromatografického systému bylo dávkováno 25 μl vzorku a separace analytů byla provedena s použitím izokratické eluce při teplotě 40°C na koloně Kinetex PFP (150x3.0mm, 2.6 μm) a detekována pomocí DAD detektoru. Jednotlivé analyty byly detekovány při těchto vlnových délkách – kofein při 268 nm, paraxantin při 272 nm a paracetamol při 245 nm. Analýza trvala 12,5 minuty a průtok mobilní fáze činil 0,55 ml/min (cca 17, 6 MPa). Retenční časy analytů byly: CAF 10,8 min, PAX 6,4 min a PAR 5,4 min.
-21-
5.3 Validace metody 5.3.1 Linearita a pracovní rozsah měření Byla sestrojena šestibodová kalibrační přímka. Z kalibrační křivky je patrné, že závislost koncentrace analytu na odezvě detektoru je lineární v celém testovaném rozsahu koncentrací. Tab. 5.1: Parametry kalibračních přímek Rozsah
Odezva detektoru
Korelační
Koeficient
linearity
(mAU.s)
koeficient
determinace
y = 10168x +805
> 0,9999
> 0,9999
Analyt
(mg/l) CAF
0,0752 – 235 mg/l
PAX
0,04-125 mg/l
y = 84088x – 5648
> 0, 9999
> 0,9999
PAR
0,02 – 75 mg/l
y = 11512x - 248
0, 9995
0,9989
5.3.2 Analytická výtěžnost extrakce Při stanovení výtěžnosti extrakce byla srovnávána plochu píku kontrolních vzorků s plochou píků připravených čistých roztoků standardů.
Tab. 5.2: Výtěžnost extrakce paraxantinu ze vzorku slin a moči Materiál Sliny
A 50 mg/l
Průměr
C 2.5 mg/l
48,28
7,96
2,55
4,28
1,24
0,17
Výtěžnost [%]
96,56
79,67
101,81
Průměr
38,79
9,86
2,54
0,98
0,15
0,06
77,58
98,58
92,93
SD Moč
B 10 mg/l
SD Výtěžnost [%]
-22-
Tab. 5.3: Výtěžnost extrakce kofeinu ze vzorku slin a moči Materiál
A 50 mg/l
Průměr
Sliny
C 2.5 mg/l
47,73
8,29
2,21
5,09
1,29
0,22
Výtěžnost [%]
95,46
82,93
88,42
Průměr
40,49
9,65
2,49
1,37
0,45
0,51
80,98
96,5
99,90
SD Moč
B 10 mg/l
SD Výtěžnost [%]
Výtěžnost extrakce paracetamolu (ISTD) ze vzorků moči (ke vzorku přídavek 50 l zásobního roztoku o koncentraci 50 mg/l) dosahovala 91,63 % a ve vzorcích slin činila výtěžnost 98,81 %.
5.3.3 Limity detekce Limity detekce byly stanoveny na základě analýzy vzorků kontroly kvality. Za základní úroveň šumu byly považovány záznamy analýzy blank vzorků. Metoda poskytuje při poměru signál:šum (S/N) = 3 limity detekce CAF 13,79 g/l, PAX 12,67 g/l. 5.3.4 Přesnost a opakovatelnost měření Naměřené parametry opakovatelnosti stanovení jsou uvedeny v tabulkách 5.4 a 5.5 Tab. 5.4: Opakovatelnost měření v sérii (intraday), stanovení CAF a PAX v perfuzním mediu (n-10) Analy t
CAF
PAX
Nominální
Naměřená koncentrace
Relativní
± SD
směrodatná
Bias*
(mg/l)
(mg/l)
odchylka (%)
(%)
50,0
49,99 ± 0,09
0,18
-0,02
10,0
10,03 ± 0,03
0,30
0,30
2,5
2,49 ± 0,02
0,80
-0,44
50,0
49,82 ± 0,14
0,28
-0,36
10,0
10,05 ± 0,01
0,10
0,50
2,5
2,52 ± 0,02
0,80
0,80
koncentrace
-23-
Bias = C průměrná – C nominální . 100 %
C nominální Tab. 5.5: Opakovatelnost měření mezi dny (interday), stanovení CAF a PAX v perfuzním mediu (n-10)
Analyt
CAF
PAX
Nominální
Naměřená koncentrace
Relativní
koncentrace
± SD
směrodatná
Bias*
(mg/l)
(mg/l)
odchylka (%)
(%)
50,0
49,10 ± 1,58
3,21
-1,81
10,0
9,90 ± 0,20
2,02
-0,98
2,5
2,51 ± 0,04
1,59
0,31
50,0
48,97 ± 1,53
3,12
-2,06
10,0
9,91 ± 0,21
2,12
-0,92
2,5
2,54 ± 0,05
1,97
1,58
*Bias = C průměrná – C nominální . 100 % C nominální
Obr. 5.1: Chromatogram kalibrátoru (CAF, PAX 10 mg/l) detekce při 268 nm
-24-
Obr. 5.2: Chromatogram analýzy extraktu vzorku instantní kávy
Obr. 5.3: Chromatogram analýzy vzorku čistých slin před podáním kofeinu
Koncentrace CAF ve vzorku byla 0,028 mg/l, PAX pak 0,101 mg/l. Jedná se pravděpodobně o zbytková množství analytů z běžné potravy a nápojů. -25-
Obr. 5.4: Chromatogram analýzy extraktu vzorku slin 9 h po podání 150 mg kofeinu.
Koncentrace CAF ve slinách byla 14,23 mg/l, koncentrace PAX potom 8,58 mg/l.
-26-
6
DISKUZE V literatuře je v současné době publikováno velké množství metod stanovení
kofeinu a jeho metabolitu ve vzorcích slin, moči nebo krevní plasmy. Nejčastější metodou, se kterou se setkáváme při stanovení kofeinu je HPLC [1,5,17,19]. Obrovskou výhodou této metody je jednoduchost, možnost automatizace, krátká doba analýzy, reprodukovatelnost nebo nenáročná extrakce (co se týče postupu i vybavení) dosahující vysoké výtěžnosti. Méně metod je pak v literatuře publikováno pro stanovení PAX, TP a TB a dalších metabolitů kofeinu. Jedná se především o metody jako CE a GC [14,15,20,21]. U těchto metod se autoři potýkali s různými problémy, jako například nedokonalým oddělením jednotlivých analytů [14], nebo dosažení pouze základního rozlišení, nikoli však oddělení, jako tomu bylo u metody kapilární elektroforézy za použití glycinového pufru [15]. V případě GC se pak setkáváme sice s vysoce
účinným
provedením
analýzy
v kombinaci
s
vysokou
citlivostí
plamenoionizačního detektoru, avšak nevýhodu je již zmiňovaná destrukce vzorku. U GC se potýkáme s problémem, že analyty musí být těkavé, což při stanovení léčiv vyžaduje jejich derivatizaci. Ale naopak při zvolení vhodného typu detektoru (např. MS) můžeme docílit lepších vlastností jako je vyšší citlivost a selektivita měření. Jakýmsi standardem při stanovení léčiv a jejich metabolitů se stala metoda RP-HPLC, platí to i pro kofein a paraxantin [5,17,19] dosahující velké účinnosti a vysoké rozlišovací schopnosti. Metoda HPLC nevyžaduje derivatizaci vzorku jako je tomu u plynové chromatografie. Výjimečně se při stanovení CAF setkáváme s metodami elektrochemickými [22,23]. Výhodou voltmetrického stanovní kofeinu pomocí chemicky modifikovaných elektrod je jejich přijatelná cena a analýza dosahující vynikajícího rozlišení a selektivity bez nutnosti přečištění vzorku. Nevýhodou elektrod je možnost oxidace jejich povrchu a tvorba filmů, které mohou negativně ovlivnit výsledek analýzy. Ve spojení s HPLC může voltametrie sloužit k analýze složitějších směsí. Zde popsaná a datovaná HPLC metoda dosahuje dokonalého oddělení analytů v relativně krátkém čase, je nenáročná a snadno reprodukovatelná. Nenáročné přečištění vzorků extrakční směsí poskytlo vždy dostatečnou výtěžnost alespoň 80 %, což při použití vnitřního standardu postačuje pro běžné užití metody pro sledování rychlosti metabolizace kofeinu. Limity detekce pro kofein a paraxantin leží hluboko pod reálnou
-27-
koncentrací analytů v biologických vzorcích a jsou porovnatelné s metodami prezentovanými v odborné literatuře [1,5]. Při adaptaci této metody byl také kladen důraz na akceptovatelné parametry opakovatelnosti, výtěžnosti extrakce, nízký limit detekce, robustnost a jednoduchost. Metodou je možné sledovat aktivitu CYP1A2 jak v rámci experimentální farmakologie a biochemie, tak i v klinické praxi pro posouzení metabolizační schopnosti CYP1A2 u pacientů. Z tohoto pohledu se tedy jedná o velmi vhodnou a v praxi využitelnou metodu sledování rychlosti metabolizace jedné z nejvýznamnějších izoforem cytochromu P450. Tato metoda bude následně uplatněna v rámci výzkumného projektu pro sledování fenotypu CYP1A2 v rámci spolupráce Farmakologického ústavu LF a Psychiatrické kliniky Fakultní nemocnice v Brně.
-28-
7
ZÁVĚR Byla vyvinuta jednoduchá a citlivá HPLC metoda pro stanovení kofeinu a jeho
metabolitu paraxantinu ve slinách a moči poskytující dostatečně reprodukovatelné výsledky. Jedná se o nenáročné a rychlé stanovení kofeinu a jeho metabolitu paraxantinu, doba analýzy činila 12,5 min. Před samotnou analýzou byla použita jednoduchá extrakce směsí chloroform:isopropanol o složení 85:15 (v/v). Vlastní stanovení bylo prováděno metodou HPLC ve spojení s DAD detektorem a použitím paracetamolu jako vnitřního standardu. Tato metoda je v praxi použitelná a vhodná pro sledování aktivity CYP1A2 in vivo jak v klinické praxi, tak i pro experimentální účely. Po ověření a případné modifikaci je metoda použitelná i pro detekci obou analytů v jiných matricích (perfuzní medium, kultivační medium, mikrosomální jaterní frakce).
-29-
8
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK
NAT
N-acetyltransferáza
XO
xantinoxidáza
CYP
cytochrom P450
CYP1A2
izoforma cytochromu P450 1A2
CAF
kofein
PAX
paraxantin
TB
teobromin
TP
teofylin
HPLC
vysoce účinná kapalinová chromatografie
RP-HPLC
reverzní fázová účinná chromatografie
MECC
micelární elektrokinetická kapilární chromatografie
PAH
polycyklické aromatické uhlovodíky
SPE
extrakce na pevné fázi
SDS
dodecylsulfát sodný
NI
nikotin
CE
kapilární elektroforéza
GC
plynová chromatografie
ISE
iontově selektivní elektroda
ISTD
vnitřní standard
PAR
paracetamol
DAD detektor
detektor diodového pole
UV detektor
detektor snímající ultrafialové záření
M1, M2, M3
vzorky moči
S1, S2, S3
vzorky slin
-30-
9
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
[1] Holland, D., K. Godfredsen, T. Page & J. Connor (1998) Simple high-performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of serum caffeine and paraxanthine following rapid sample preparation. J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 707, 105-10. [2] Dobrocky, P., P. Bennett & L. Notarianni (1994) Rapid method for the routine determination of caffeine and its metabolites by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr, 652, 104-8. [3] Micromedex, Martindale, citováno 17. 3.2011 http://www.thomsonhc.com/hcs/librarian [4] Ben Best, Is caffeine health hazard?, citováno 11.12. 2010, dostupné z: http://www.benbest.com/health/caffeine.html [5] Aresta, A., F. Palmisano & C. Zambonin (2005) Simultaneous determination of caffeine, theobromine, theophylline, paraxanthine and nicotine in human milk by liquid chromatography with diode array UV detection. Food Chemistry, 177181. [6] S. Guerreiro, et al., (2008) Paraxanthine, the Primary Metabolite of Caffeine, Provides Protection against Dopaminergic Cell Death via Stimulation of Ryanodine Receptor Channels. Molecular Pharmacology, 980–989 [7] Ústav farmakologie Univerzity Karlovy v Praze, citováno 12.1. 20011, dostupné z: http://www.lfhk.cuni.cz/farmakol/interakce/P450.htm [8] Cytochrome P-450 functions, citováno 12.1.2011, dostupné z: http://www.cytochromep450.net/cytochrome-p-450-functions [9] E.Begas et al. (2007) In vivo evaluation of CYP1A2, CYP2A6, NAT-2 and xanthine oxidase activities in a Greek population sample by the RP-HPLC monitoring of caffeine metabolic ratios, Biomedical Chromatography,190-200
-31-
[10] Ingelman-Sundberg, M. (2004) Pharmacogenetics of cytochrome P450 and its applications in drug therapy: the past, present and future. Trends in Pharmacological Sciences, 193-200.
[11] Kot, M. & W. Daniel (2008) Relative contribution of rat cytochrome P450 isoforms to the metabolism of caffenine: The pathway and concentration dependence. Biochemical Pharmacology, 1538-1549.
[12] Elizabeth MJ Gillam (1998) Human cytochrome P450 enzymes expressed in bacteria: Reagents to probe molecular interactions in toxicology, Clinical und Experimental Pharmacology and Physiology 25, 877-886
[13] R.Ghotbi et al. (2007) Comparisons of CYP1A2 genetic polymorphisms, enzyme activity and the genotype-phenotype relationship in Swedes and Koreans, Eur J Clin Pharmacol 63:537–546 [14] Zhao, Y. & C. Lunte (1997) Determination of caffeine and its metabolites by micellar electrokinetic capillary electrophoresis. Journal of Chromatography B, 265-274.
[15] Unita L.Peri-Okonny et al. (2005) Determination of caffeine and its metabolites in urine by capillary electrophoresis-mass spectrometry, Electrophoresis 26, 26522663
[16] E.D.Conte and E.F. Barry (1993) Gas chromatographic determination of caffeine in beverages by alkali aerosol flame ionization detection, Microchemical Journal 48, 372-376 [17] Ou-Yang et al. (1998) Use of caffeine as a probe for rapid determination of cytochrome P-450 CYP1A2 activity in humans, Acta Pharmacologica Sinica 19 (1), 44-46 [18] M. Stiborová et al. (1999) Význam cytochromu P450 pro lidské zdravý, Chem. Listy 93, 229-237
-32-
[19] Brunetto et al. (2007) Determination of theobromine, theophylline and caffeine in cocoa samples by a high-performance liquid chromatographic method with online sample cleanup in a switching-column systém, Food Chemistry 100, 459467
[20] Teeuwen et al. (1991) Rapid and sensitive gas-chromatographic determination of caffeine in blood plasma, saliva and xanthine beverages, Molecular Biology Reports 15;1-7 [21] Kumazawa et al. (1999) Extraction of methylxanthines from human body fluids by solid-phase microextraction, Analytica Chimica Acta 387, 53-60
[22] Zen et al. (1998) Voltammetric determination of caffeine in beverages using a chemically modified electrode, Analyst, Vol. 123 ( 1145-1147)
[23] Hassan et al. (1984) A new lequid membrane electrode for selective determination of caffeine, Qatar Univ. Sci. Bull. 4: 45-55
[24] Home page of the human Cytochrome P450 (CYP) allele nomenclature committee, citováno 22.1.2011, dostupné z: http://www.cypalleles.ki.se/cyp1a2.htm [25] Indiana University, School of medicine, citováno 22.1.2011, dostupné z: http://medicine.iupui.edu/clinpharm/ddis/table.asp
[26] Paul Hommerson (2009) New approaches for capillary electrophoresis-mass spektrometry in drug analysis:Evaluation of photo-, chemical and thermospray ionization, Farmaceutische Wetenschappen Proefschriften, ISBN: 978-90-3935101-7
[27] A.J.Tomlinson et al. (1995) Enhancement of concentration limits of detection in CE and CE-MS: a review of on-line sample extraction, cleanup, analyte preconcentration, and microreactor technology, Journal of Capillary Electrophoresis, 2(6):247-66
-33-
[28] Perera V, Gross AS, McLachlan AJ (2010 ) Caffeine and paraxanthine HPLC assay for CYP1A2 phenotype assessment using saliva and plasma, Biomed Chromatogr. Oct;24(10):1136-44..
[29] Lous J. A. E. Doude van Troostwijk, Richard P. Koopmans, Henk-Jan Guchelaar. (2003) Two novel methods for the determination of CYP1A2 activity using the paraxanthine/caffeine ratio, Fundamental & Clinical Pharmacology 17, 355– 362
[30] Stewart NA, Buch SC, Conrads TP, et al (2011) A UPLC-MS/MS assay of the "Pittsburgh cocktail": six CYP probe-drug/metabolites from human plasma and urine using stable isotope dilution, Analyst 136 (3) , 605-612
[31] Schneider H, Ma L, Glatt H. (2003) Extractionless method for the determination of urinary caffeine metabolites using high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, Journal of chromatography Banalytical technologies in the biomedical and life sciences 789, 227-237
-34-
-35-
