Stanovení nízkomolekulárních látek Klasické
metody – „chemicky“
Levné, jednoduché
Enzymové
metody
Specifita, Specifita, selektivita Vysoká reakční rychlost (37 oC) oC) Mírné reakční podmínky T, pH
⇒ automatické automatické analyzá analyzátory
Využití enzymů jako analytických činidel E
S
P
P’
EndEnd-point (reakce musí být rychlá a citlivá)
Kineticky (většinou metoda konstantního času)
Rovnice MichaelisMichaelis-Mentenové: Mentenové: V
V . [S] v= Km + [S] [S]<
vo V/2
V . [S] = konst.[S] Km
[S]
Možnost sledov ání enzymové aktivity sledování
Substrát či produkt dokážeme specificky detegovat přímo
Pokud ne, následuje druhá.. (obvykle opět enzymová) detekční (indikátorová) reakce Nejčastější indikátorové reakce H2O2 – vzniká při reakcích oxidas (využívají k oxidaci O2) Substrát + O2
XO
H2O2 + chromogen
Produkt + H2O2 POD
barevný produkt
V klinické diagnostice nejčastěji 44-aminoantipyrin + subst. subst. fenol ⇒ CHINONIMIN (červený, 555 nm) nm)
1
Možnost sledov ání enzymové aktivity sledování
Nejčastější indikátorové reakce Warburgův optický test 340 nm NADH, NADPH
O C +
N
O
NH NH
O
2
CH
O
2
O
P O
OH
N
O
-
O
P O
-
OH
CH
2
N
O
2
N N
OH
OH
O
H
C -2
+
N
NH
+
[H
substrátred + NAD+
2
]
2 [H
oxidoreduktasa (dehydrogenasa)
]
O
H H
C
NH
+ H
2
+
N
produktox + NADH + H+
Stanovení glukosy
CH2OH O OH
Chemické metody redukční vlastnosti monosacharidů 1. 2.
OH
OH OH
o-toluidinová metoda CH3
CH3
H2O
H
O C H C OH
NH2
N CH H C OH
modrá (625-630 nm)
Stanovení glukosy
CH2OH O OH
Enzymové metody OH
3.
glc
hexokinasa ATP
4.
OH OH
hexokinasová glc-6-P
ADP
G6PD +
NAD(P)
6-P-glukonolakton
NAD(P)H
+
H
glukosadehydrogenasová GD
glc NAD
+
glukonolakton +
NADH H
2
Stanovení glukosy
CH2OH O OH OH
OH OH
glukosaoxidasová
5.
GOD
glc +
O2
glukonolakton
kys. glukonová
H2O2
amperometrie
amperometrie
POD
chinonimin červený (555 nm)
4-aminoantipyrin + subst. fenol
Stanovení kyseliny močové Chemická metoda Oxidace kys. 1. kys.fosfowolframovou Æ fosfowolframová fosfowolframová modř modř (720 nm) nm) Enzymová metoda Urá 2. Urátoxidasa (urikasa) urikasa) OH
N HO
N N
N H
O2
H2O
O NH2
UO HO
OH
N
NH N H
CO2
H2O2
OH
alantoin
kys. močová A 293
Stanovení močoviny (BUN) Chemické metody Reakce s diketony a jejich oximy 1. bisacetylmonoxim
O NOH H3C C C CH3
O H2N C NH2
H2O +
H
O O H3C C C CH3
O O H3C C C CH3
HNO3
+
H
H3C C C CH3 2 H2O N N C diazin (žlutý) O
Dobře automatizovatelná, automatizovatelná, ale fotosenzitibilní, fotosenzitibilní, nestálá barva
3
Stanovení močoviny (BUN) Enzymové metody ureasa 2. urea
ureasa
CO2
2 NH4
+
a) Berthelot NH4
+
-
-
2
ClO
OH
OH
-
N
O
nitroprusid
O
indofenol (modrý)
b) GD NH4
+
glutamátdehydrogenasa
+
α-ketoglutarát + NADH + H
Glu + NAD
+
c) ISE
Stanovení bilirubinu 1.
Obecná Obecná metoda: kopulace s diazotovanou kys. kys. sulfanilovou HOOC
COOR
N N O
N
CH
N
H
CH2
H
N
CH
H
N
O
SO3H
Cl
H
HOOC
O
N H
CH
COOR
N N
N
SO3H
HO3S
N N
H
H
azopigment A
⇒ acidobazický indikátor
N
CH
N
O
H
azopigment B
H+ neutrální OH-
- fialový (~ 560 nm) – Malloy-Evelyn - červený - modrý (~ 600 nm) – Jendrassik-Gröf
Stanovení bilirubinu 2.
přímá spektrofotometrie – „bilirubinometr“ bilirubinometr“ – 454 nm (+ 540 nm odeč odečet HbO2) – neonatá neonatální lní diagnostika
3.
enzymaticky – bilirubinoxidasa (oxidace na biliverdin 405405-460 nm) nm)
konjugovaný bilirubin – „přímý“ mý“, konjugovaný s kyselinou glukuronovou nekonjugovaný bilirubin – „nepř nepřímý“ mý“, adsorbovaný na Alb, nutno solubilizovat: solubilizovat: kofeinkofein-benzoá benzoát sodný (Jendrassik (Jendrassik-Grö Gröf), DMSO, moč močovina, MetOH ⇒ kvantitativní kvantitativní stanovení stanovení celkové celkového a konjugované konjugovaného bilirubinu ∆-bilirubin
– kovalentně kovalentně vázaný na Alb
4
Stanovení kreatininu 1.
Jaffé Jaffé - 1886 NO2 H3C
HN
NO2
N
O N H
O2N
-
O -
O
-
OH
O2N
NO2
H3C
NO2 -
O
N N H
HN
červený
nespecifická (interference – askorbát, pyruvát, aceton, glc, kys. močová, proteiny, teplota, doba stanovení) ⇒ separace kreatininu (Lloydovo činidlo, floridin, HPLC) ⇒ kinetické stanovení
2.
Enzymové Enzymové metody
kreatininamidohydrolasa ⇒ kreatin kreatininiminohydrolasa ⇒ N-methylhydantoin + NH3
Stanovení cholesterolu Chemické metody modifikace LiebermannLiebermann-Burchardovy metody několikaná kolikanásobná sobná oxidace cholesterolu v prostř prostředí edí HAc, HAc, H2SO4, AcAc-anhydridu ⇒ tvorba nenasycených vazeb ⇒ cholestahexaencholestahexaen-sulfonová sulfonová kyselina – zelenomodré zelenomodré zbarvení zbarvení Enzymové metody (celkový, volný, esterifikovaný, esterifikovaný, HDL) cholesterolesterasa: cholesteroloxidasa: + H2O2
ChE Æ Chol + FFA Cholesterol + O2 Æ Cholest-4-en-3-on
HDL-cholesterol: srážení LDL a VLDL
- heparin + Mg2+
- kys. fosfowolframová + Mg2+
5
