Spesifisitas Substrat KanJ Dioksigenase dan KanK Dehidrogenase yang Berperan dalam Tahap Akhir Biosintesis Kanamysin

1

Spesifisitas Substrat KanJ Dioksigenase dan KanK Dehidrogenase yang Berperan dalam Tahap Akhir Biosintesis Kanamysin Diana Ayu Nindita dan Endang Saepudin Departemen Kimia, FMIPA, Universitas Indonesia, Depok 16424, Indonesia Abstrak Kanamysin adalah antibiotik aminoglikosida yang diproduksi oleh Streptomyces kanamyceticus dan dikenal sebagai agen antituberkulosis. Peran enzim KanJ dioksigenase dan KanK dehidrogenase dalam tahap akhir biosintesis kanamysin telah dikonfirmasi, yaitu mengkonversi kanamysin B menjadi kanamysin A dengan oksidasi dan reduksi pada posisi C2’, yaitu dari gugus amina menjadi gugus hidroksi. Penelitian ini menganalisis spesifisitas substrat KanJ dan KanK dengan membuat assay enzim secara in vitro yang menggunakan beberapa aminoglikosida sebagai substrat, yaitu neamin, tobramysin, paromamin, paromomysin, ribostamysin, genetisin, neomysin B, dan butirosin A. Hasilnya, analisis HPLC dan LC-MS menunjukkan KanJ dan KanK hanya bereaksi dengan neamin dan tobramysin. Maka, KanJ dan KanK mengenali gugus kanosamin dan secara khusus mengenali gugus amina pada posisi C-6’ dalam gugus neosamin C dari kanamysin B untuk mengkatalisis oksidasi. Selanjutnya, dari hasil isolasi produk reaksi enzimatik KanJ dan KanK dengan neamin, analisis HPLC dan 1H-NMR memperlihatkan bahwa isolat masih berupa campuran produk dan neamin, sehingga struktur kimia produk belum dapat ditentukan secara akurat, namun dapat diprediksi bahwa produk merupakan 2’-deamino-2’-hidroksineamin. Kata kunci : biosintesis; kanamysin; KanJ dioksigenase; KanK dehidrogenase; spesifisitas substrat Abstract Kanamycin is an aminoglycoside antibiotics produced by Streptomyces kanamyceticus and widely known as antituberculosis agent. Functional role of KanJ and KanK in the last step of kanamycin biosynthesis have been confirmed, where they play a vital role to convert kanamycin B to kanamycin A by oxidation and reduction at C-2’ position, to replace the amino group by a hydroxyl group. This study examined the substrate specificity of KanJ and KanK using in vitro enzyme assay with several aminoglycosides as substrates, such as neamine, tobramycin, paromamine, paromomycin, ribostamycin, geneticin, neomycin B, and butirosin A. It was found that KanJ and KanK were active only on neamine and tobramycin. It appears that, KanJ strictly recognizes neosamine C moiety, particularly amino group at C-6’ and kanosamine moiety of kanamysin B to catalyze the oxidation. Furthermore, after product isolation from enzymatic reaction of KanJ and KanK with neamine, HPLC and 1H-NMR analysis showed that the isolate was the mixture of product and substrate, so the precise chemical structure of the KanJ-KanK reaction product from neamine has not been determined yet, but could be predicted that it was 2’-deamino-2’-dehydroxyneamine. Keywords : biosynthesis, kanamycin, KanJ dioxygenase, KanK dehydrogenase, substrate spesificity

Spesifisitas substrat ..., Diana Ayu Nindita, FMIPA UI, 2013

2

I. PENDAHULUAN Kanamysin adalah antibiotik aminoglikosida yang mengandung 2-deoksistreptamin (DOS) yang dihasilkan oleh Streptomyces kanamyceticus dan digunakan secara luas sebagai agen

antibakteri

selama

beberapa

dekade.

Namun,

munculnya

bakteri

resisten,

autotoksisitasnya (menyebabkan kerusakan organ pendengaran), dan nefrotoksisitasnya (menyebabkan kerusakan ginjal), penggunaan kanamysin secara klinis terbatas sebagai antituberkulosis saja[1,2].

NH2 HO HO

NH2

O

O2,  - KG

H2N

H2N O HO

HO HO

KanJ

NH2 O HO

OH

O

OH

CO2, Suksinat

NH2

O O

HO HO

H2N O HO

KanK

NH2 O HO

OH

O

NH2

O HO

H2N O HO

NH2 O

NAD(P)H NAD(P)+

OH

HO

NH2

2'-okso-kanamysin B

kanamysin B

OH

O

OH NH2

kanamysin A

Gambar 1. Tahap Akhir Biosintesis Kanamysin

Pada tahun 2004, 24 open reading frame (orfs) diidentifikasi dalam kluster gen biosintesis kanamysin [3]. Seluruh kluster gen tersebut diekspresikan dalam Streptomyces venezuelae dan dilaporkan memproduksi kanamysin A[4]. Peran fungsional dari enzim KanJ dan KanK pada tahap akhir biosintesis kanamysin telah dikonfirmasi, di mana mereka berperan vital untuk mengkonversi kanamysin B menjadi kanamysin A masing-masing melalui reaksi oksidasi dan reduksi pada posisi C-2’ (Gambar 1). KanJ adalah dioksigenase yang bergantung pada kofaktor FeII/-ketoglutarat dan KanK adalah ketoreduktase yang bergantung pada kofaktor NADPH [5]. Untuk keperluan aplikasi enzimatik untuk memproduksi antibiotik baru, maka studi ini dilakukan untuk menganalisis spesifisitas substrat KanJ dan KanK dengan beberapa aminoglikosida yang ditunjukkan pada Gambar 2. Percobaan isolasi serta penentuan struktur produk yang dihasilkan dari reaksi enzimatik KanJ dan KanK dengan substrat yang dikenali juga dilakukan pada penelitian ini.


3

OH O

NH2 HO HO

H2 N

HO HO

H2N O HO

OH

H2 N

NH 2

NH2 O

HO

H2 N

H2 N O HO

OH

NH 2

H2 N O HO

O HO

paromamine (2)

OH O

HO HO

NH2

H2 N HO

O H2N

H2 N O O O

OH

NH2

H2 N HO

NH2

OH O OH

OH

paromomycin (5)

O

OH

HO

O O O

OH

NH2

OH

H2N

O OH

neomycin B (6)

OH

NH2

H3 C

O

HO HO

H2 N HO

H2N

O O O OH H

OH

OH

OH

H N OH

HO HO

O

H OH O H2 N

NH2

O HO

H2 N O HO

OH

NH2 O H3 CHN

butirosin A (7)

geneticin (8)

Gambar 2. Substrat yang dicobakan untuk menguji spesifisitas substrat KanJ dan KanK

II. TINJAUAN TEORITIS 2.1

Kanamysin Kanamysin adalah antibiotik aminoglikosida yang dihasilkan oleh Streptomyces

kanamyceticus. Kanamysin merupakan representasi kelas aminoglikosida 4,6-disubstitusi. Pada kelas ini, posisi C-4 pada 2-deoksistreptamin disubstitusi dengan aminoglukosa fungsional (contoh : 6-amino-6-deoksi-D-glukosa pada kanamysin A, neosamin C pada kanamysin B, atau D-glukosamin pada kanamysin C). Sedangkan pada posisi C-6, 2deoksistreptamin disubstitusi oleh gugus kanosamin (3-amino-3-deoksi-D-glukosa). Pada tahun 2004, kluster gen biosintetis kanamysin yang terdiri dari 24 open reading frames (orf) telah teridentifikasi [3]. Seluruh gen kluster biosintesis kanamysin diekspresikan dalam Streptomyces venezuelae dan protein rekombinannya dilaporkan memproduksi kanamysin A [4] (Gambar 3). Hingga saat ini, telah dilaporkan bahwa lima enzim biosintetik di dalam kluster gen biosintesis 2-DOS yang dikode pada kluster gen kan bertanggung jawab dalam pembentukan paromamin dengan mengekspresikan gen tersebut dalam Streptomyces lividans [6]. Kelima enzim tersebut adalah KanC (2-deoksi-scyllo-inosose (2DOI) sintase), KanS1 (Gln:2DOI aminotransferase), KanE (2-deoksi-scyllo-inosamin dehidrogenase dengan kofaktor NADPH), KanM1

(UDP-GlcNAc:2DOS

glikosiltransferase),

NH 2

ribostamycin (4)

NH2 H2 N

H2N

O O O

OH

O

tobramycin (3)

NH2 O

HO HO

H2 N HO

NH2

neamine (1)

NH2 O

HO HO

dan

KanN

(2’-N-asetilparomamin

deasetilase). Fungsi enzim KanM2 telah diklarifikasi sebagai glikosiltransferase yang


CH3 OH

4

mengkatalisis glikosilasi paromamin dengan UDP-glukosa (UDP-Glc) menghasilkan 3”deamino-3”-hidroksikanamysin C [7]. Ditambah lagi, dua set dehidrogenase dan aminotransferase KanD2/KanS2 dan KanQ/KanB (atau disebut juga KanC/KanD dan KanI/KanL) masing-masing diperkirakan berfungsi untuk memasukkan gugus amino pada posisi C3” dan C6’ [8]. Pada tahun 2012, Sucipto, Kudo, dan Eguchi melaporkan bahwa KanJ/KanK mengkatalisis transformasi kanamysin B menjadi kanamysin A dalam tahap akhir biosintesis kanamysin A.

KanC KanS1 KanE

OPO3 2O

HO HO

OH

HO HO

O HO

O

H2N

O2,  - KG

H2N H2 N O HO

NH2

KanJ

O

HO

OH CO 2, suksinat OH

O

O HO

NH2

O

NH2 OH

O

HO

OH

3"-deamino-3"-hidroksikanamysin C NH2 O

KanQ KanB

H2N

OH OH

UDP-Glc

NH2

OH

OH O

HO HO

NH2 O

O HO

H2 N

paromamin

KanD2 KanS2

HO

HO HO

H2N

2-deoksistreptamin (2-DOS)

H2N

KanM2

UDP-GlcNAc

OH O H2 N

OH O

HO HO

NH2 OH

OH

glukosa-6-fosf at (G6P)

HO HO

KanM1 KanN

H2 N

OH

NH2

kanamysin C

HO HO

NH2 O O

H2N O HO

HO HO

KanK

NH2 O HO

OH OH

O

NH2 O HO

NAD(P)H NAD(P)+

H2N O HO

NH2 O

HO

NH2

kanamysin B

2'-oksokanamysin B

OH OH

O NH2

kanamysin A

Gambar 3. Prediksi jalur biosintesis kanamysin

2.2

Spesifisitas Substrat Enzim Enzim

merupakan sebuah kelompok protein yang menjalankan dan mengatur

perubahan-perubahan kimia dalam sistem biologi. Kemampuan enzim untuk mengkatalisis suatu reaksi merupakan hal yang spesifik. Ini berarti bahwa suatu enzim hanya mampu menjadi katalisator untuk reaksi tertentu. Spesifisitas enzim tersebut disebabkan oleh bentuknya yang unik dan gugus polar atau non polar yang terdapat pada struktur kimia enzim tersebut. Sebagian besar enzim mempunyai spesifisitas absolut, yaitu hanya dapat bereaksi dengan satu substrat. Laktase misalnya, hanya dapat mengkatalisis hidrolisis laktosa menjadi


5

glukosa dan galaktosa, tetapi tidak dapat mengkatalisis substrat lain. Spesifisitas stereokimia juga dimiliki oleh beberapa enzim. Dalam hal ini, enzim hanya mampu mengkatalisis salah satu bentuk stereokimia substrat tertentu. Spesifisitas stereokimia dibedakan menjadi : a.

Spesifisitas Optik Enzim hanya dapat mengkatalisis salah satu pasangan isomer optik suatu substrat. Misalnya, arginase hanya mampu mengkatalisis hidrolisis L-arginin menjadi ornitin dan urea, tetapi tidak mampu mengkatalisis D-arginin.

b.

Spesifisitas Geometrik Enzim hanya mampu mengkatalisis salah satu pasangan isomer geometrik suatu substrat. Misalnya, fumarase hanya dapat mengkatalisis hidrasi asam fumarat (asam etena dikarboksilat bentuk trans), tetapi tidak dapat mengkatalisis hidrasi asam maleat (asam etena karboksilat bentuk cis). Beberapa enzim memiliki spesifisitas gugus fungsional. Enzim ini hanya mampu

bekerja sebagai katalis senyawa (substrat) dengan gugus fungsional tertentu, misalnya enzim alkohol dehidrogenase hanya dapat mengkatalisis proses dehidrogenase alkohol, tetapi tidak proses yang lain [9].

2.3

KanJ Dioksigenase Dioksigenase memasukkan kedua atom dari molekul oksigen ke substrat, dan sering

terlibat dalam pemutusan ikatan, termasuk pada cincin aromatik. Beberapa dioksigenase menggunakan dua substrat penerima dan menginkorporasi satu atom oksigen ke masingmasing substrat tersebut. Maka, dioksigenase yang bergantung pada 2-oksoglutarat akan menghidroksilasi satu substrat, kemudian mengubah 2-oksoglutarat menjadi suksinat dan membebaskan CO2. Dioksigenase yang bergantung pada 2-oksoglutarat juga membutuhkan ion Fe2+ sebagai kofaktor untuk menstimulasi terbentuknya kompleks besi-oksigen pada enzim pada lagkah awal mekanisme katalisasi, dan asam askorbat (vitamin C) untuk mengurangi kompleks tersebut jika proses katalisasi telah selesai [10]. Hasil identifikasi fungsi KanJ dalam biosintesis kanamysin menunjukkan bahwa KanJ mengkatalisis hidroksilasi langsung untuk menghasilkan intermediet hemiaminal seperti yang terjadi pada hidroksilase yang bergantung pada kofaktor -ketoglutarat. Inkorporasi atom oksigen dari O2 ke dalam kanamysin pada proses enzimatik oleh KanJ mengindikasikan bahwa KanJ adalah dioksigenase yang bergantung pada kofaktor -ketoglutarat, yang bekerja dengar mentransfer satu atom oksigen ke substrat dan satu atom oksigen lainnya ke -


6

ketoglutarat menghasilkan suksinat. Formasi hemiaminal yang dikatalisasi oleh KanJ merupakan strategi yang unik untuk menyingkirkan gugus amina (Gambar 4) [5]. Mekanisme ini berbeda dari transaminasi yang bergantung pada kofaktor piridoksal 5’-fosfat (PLP), yang membentuk intermediet aldimin di antara dua gugus amina dan menghidrolisis PLP menjadi keton dan piridoksamin 5’-fosfat (PMP), kemudian gugus amina dari PMP ditransfer ke molekul lainnya yang mengandung keton seperti 2-oksoglutarat untuk menyelesaikan siklus katalitik. O

O OH2

H2O

His

FeII H2O

-

OOC

Asp

His

O

O

FeII

H2 O

 - ketoglutarat

His

OOC

O

O

IV

Fe

-

O O

- OOC

His

OOC

O

IV

Fe

His

- OOC

His Asp

H2 N

H2 N HO HO R

O FeIV His

His

CO2

-

OOC

O

HO

O NH2

FeIV

O

Asp

His

O FeIII His

His

- OOC

O2

Asp

R

O

II

Fe

His H2 N HO HO

OH OH

His Asp kanamysin B

suksinat His

H2O

OH2 FeII

H2O

Asp

His

His Asp

OH O H2 N

R H2 N HO HO

NH2 O

Asp

His

O

O H2 N

His

FeII

NH3

H2 N

O HO

O HO

H O

R:

O

O

O

Asp

O

O H2 N HO HO

O O

Asp

His

O -

OOC

O

O -

-

His

O O

H2O R

H2 N HO HO

OH O HO

R

2'-oksokanamysin B

Gambar 4. Prediksi mekanisme reaksi KanJ

2.5 KanK dehidrogenase Dehidrogenase bekerja dengan menyingkirkan dua atom hidrogen dari substrat dan memindahkannya ke akseptor koenzim yang sesuai. Sistem koenzim yang terlibat secara umum berhubungan dengan gugus fungsi yang dioksidasi dalam substrat. Jika proses oksidasi yang terjadi misalnya mengubah gugus hidroksi menjadi gugus keto, maka nukleotida piridin, seperti nikotinamida adenin nukloetida (NAD+) dan nikotinamida adenin dinukleotida fosfat (NADP+), cenderung digunakan sebagai akseptor hidrogen. Satu hidrogen dari substrat (yang berikatan dengan karbon) ditransfer ke koenzim sebagai hidrida, dan satu hidrogen lainnya, sebagai proton, dikeluarkan dari koenzim [10].


7

Jika yang terjadi adalah proses reduksi, maka NADH dan NADPH (bentuk tereduksi dari NAD+ dan NADP+) digunakan sebagai kofaktor yang mendonorkan hidrogen dan sebagai agen pereduksi. Proses inilah yang dilakukan oleh enzim KanK dehidrogenase pada tahap akhir biosintesis kanamysin, dengan mereduksi gugus keto dari 2’-okso-kanamysin B pada posisi C-2’ menjadi gugus hidroksi [5].

NH2

CONH2

N

N

O N

N

H2 C O

P O P OH

O

RO

O O

CH2

N

O

OH

OH OH

HO R = H, NADH R = P, NADPH

C H

O

H

H

H

C H

O

H CONH2

CONH2

KanK

N

N

R

R

NADPH

NADP+

Gambar 5. Prediksi mekanisme reaksi KanK Dehidrogenase

III. METODE PENELITIAN 3.1

Pembuatan Medium Luria-Bertani (LB) Bubuk tripton, bubuk ekstrak yeast, dan NaCl ditimbang sebanyak 12 gram, 6 gram, dan

12 gram secara berurutan kemudian dilarutkan dalam 1200 mL akuades hingga menjadi warna kuning jernih. Larutan LB dimasukkan ke dalam enam erlenmeyer sebanyak masingmasing 200 mL dan ditutup dengan aluminium foil kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121C, tekanan 2 atm, selama 20 menit. 3.2

Kloning KanJ dan KanK Streptomyces kanamyceticus JCM433 diambil dari Japan Collection of Microorganism

(JCM) sebagai sumber DNA kromosom ntuk mengklon gen biosintesis kanamysin. Gen kanJ dan kanK diamplifikasi dengan PCR dengan primer KanJ-N 5’CCATATGTGCCCCGTCCCGCCCACC-3’, KanJ-C 5’-


8

CGAATTCACTGCTCACGGCGCGCC-3’, KanK-N 5’GACGGCGCCATATGAGCAGTCAACTC-3’, KanK-C 5’GAAGCTTGGATCATGCGGAACGATC-3’ (Fasmac) dan DNA kromosomal dari Streptomyces kanamyceticus JCM433 sesuai protokol standar (oleh Sucipto, H., 2009). Gen kanJ disisipkan ke situs NdeI/EcoRI dari plasmid pColdI untuk menghasilkan pColdI-kanJ dan gen kanK disisipkan pada situs NdeI/HIndIII dari plasmid pColdI untuk menghasilkan pColdI-kanK. Untuk menghasilkan protein KanK terlarut, KanK dikoekspresikan dengan pGro7 menghasilkan plasmid kanK-pColdI/pGro7. Plasmid kanJ-pColdI dan kanKpColdI/pGro7 secara terpisah ditransformasikan ke dalam E.coli BL21 (DE3) dengan elektroporasi. 3.3

Ekspresi Protein Enzim KanJ Overekpresi (overexpression) KanJ/pColdI dilakukan dalam E.coli BL21 (DE3). Mula-

mula, KanJ/pColdI diinokulasikan dalam 3 mL medium LB (pre-kultur) yang mengandung 50 g/mL ampisilin. Setelah inkubasi dilakukan selama 14 jam pada suhu 37C, pre-kultur tersebut digunakan untuk menginokulasi 600 mL medium LB steril yang mengandung 50 g/mL ampisilin (1 mL pre-kultur untuk setiap 200 mL medium LB). Bakteri kemudian dikultur dengan sentrifugasi 200 rpm selama 3 jam pada suhu 37C hingga mencapai OD600 0,6 – 1,0 (dalam waktu 3 – 3,5 jam). Setelah itu, kultur didinginkan dalam ice bath selama 30 menit kemudian dilakukan induksi ekspresi protein dengan menambahkan IPTG hingga konsentrasi akhir 30 mM dan kultur dilanjutkan selama 20 jam pada suhu 15C. Sel-sel dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 6.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4C. Sel basah sebanyak 2 g Cell-Free Extracts (CFE) dalam 20 mL buffer Tris 40 mM pH 7,5 (mengandung 10% gliserol dan 200 mM KCl) disiapkan dengan cara melakukan sonikasi selama 1 menit sebanyak 10 kali (1 min x 10), interval 1 menit, output 2, duty cycle 50%. Supernatan dan pelet dipisahkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm selama 25 menit pada suhu 4C. Supernatan digunakan sebagai CFE yang mengandung protein target. protein yang dihasilkan dianalisis dengan SDS PAGE (12,5%, Comassie Brilliant Blue). 3.4

Ekspresi Protein Enzim KanK Overekspresi (Overexpression) KanK/pColdI-pGro7 dilakukan dalam E.coli BL21

(DE3). Mula-mula, KanK/pColdI-pGro7 diinokulasikan dalam 3 mL medium LB (pre-kultur) yang mengandung 50 g/mL ampisilin dan 20 g/mL kloramfenikol. Setelah inkubasi dilakukan selama 14 jam pada suhu 37C, pre-kultur tersebut digunakan untuk menginokulasi


9

600 mL medium LB steril yang mengandung 50 g/mL ampisilin, 40 g/mL kloramfenikol, dan 2 g/mL L-arabinose (1 mL pre-kultur untuk setiap 200 mL medium LB). Bakteri kemudian dikultur dengan sentrifugasi 200 rpm selama 3 jam pada suhu 37C hingga mencapai OD600 0,6 – 1,0 (dalam waktu 3 – 3,5 jam). Setelah itu, kultur didinginkan dalam ice bath selama 30 menit kemudian dilakukan induksi ekspresi protein dengan menambahkan IPTG hingga konsentrasi akhir 15 mM dan kultur dilanjutkan selama 20 jam pada suhu 15C. Sel-sel dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 6.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4C. Sel basah sebanyak 1,8 g Cell-Free Extracts (CFE) dalam 18 mL buffer Tris 40 mM pH 7,5 (mengandung 10% gliserol dan 200 mM KCl) disiapkan dengan cara melakukan sonikasi selama 1 menit sebanyak 15 kali (1 min x 15), interval 1 menit, output 2, duty cycle 50%. Supernatan dan pelet dipisahkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm selama 25 menit pada suhu 4C. Supernatan digunakan sebagai CFE yang mengandung protein target. protein yang dihasilkan dianalisis dengan SDS PAGE (12,5%, Comassie Brilliant Blue). 3.5

Pemurnian Protein dengan IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography) Setelah sonikasi dilakukan, protein kemudian dipurifikasi untuk memperoleh enzim

KanJ dan KanK yang lebih murni. Supernatan yang mengandung enzim KanJ dan KanK masing-masing dituang ke dalam resin His-Bind yang telah mengandung kation Ni2+. Sisa protein pengotor dielusi dengan buffer tris 40 mM pH 7,5 (mengandung 10% gliserol dan 200 mM KCl), kemudian dicuci lagi dengan 25 mM imidazole dalam buffer tris 40 mM pH 7,5 (mengandung 10% gliserol dan 200 mM KCl). Protein KanJ dan KanK dielusi dengan 200 mM imidazole dalam buffer tris 40 mM pH 7,5 (mengandung 10% gliserol dan 200 mM KCl). Keberadaan protein dideteksi dengan UV 280 nm. Pertukaran buffer (untuk menghilangkan imidazole) dilakukan dengan menuangkan hasil elusi ke dalam kolom PD-10 dan eluennya dikumpulkan. Konsentrasi protein kemudian diestimasi menggunakan Qubit 2.0 Fluorometer kit. 3.6

Assay Enzim KanJ (21,6 µM) dan KanK (20 µM) diinkubasi dengan substrat (2 mM), -ketoglutarat

(1 mM), (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O (1 mM), dan NADPH (4 mM) dalam buffer Tris (pH 7,5; 40 mM), 10% gliserol, 200 mM KCl hingga volume totalnya 100 µL pada suhu 28C selama 18 jam. Substrat yang digunakan untuk masing-masing assay adalah kanamysin B, neamin, paromamin, paromomysin, tobramysin, ribostamysin, neomysin B, butirosin A, dan geneticin. Assay kontrol negatif adalah assay tanpa -ketoglutarat.


10

Untuk menghentikan reaksi enzimatik, protein dipresipitasi menggunakan 100 µL etanol yang dimasukkan ke dalam masing-masing assay. presipitat protein disingkirkan dengan sentrifugasi (12.000 rpm x 5 menit). Derivatisasi DNP terhadap hasil reaksi dilakukan dengan menambahkan 2,4-dinitrofluorobenzena (DNFB) 5% dalam metanol (20 µL), DMSO (10 µL), dan 2 M NaOH (2 µL) ke dalam masing-masing alikuot supernatan hasil reaksi (20 µL), kemudian diinkubasi pada suhu 60C selama 1,5 jam. Campuran reaksi lalu diekstraksi dengan etil asetat (500 µL). Setelah pelarut dievaporasi dengan centrifugal evaporator (selama 20 menit, suhu 40 C), residu dilarutkan dalam 100 µL dan dianalisis menggunakan HPLC dan LC-ESI-MS. HPLC dilakukan dengan instrumen L-7100 Intelligent Pump (Hitachi) yang dilengkapi dengan detektor UV L-7405 (Hitachi), oven kolom L-7300 (Hitachi), dan peranti lunak Chromatopro (Run Time Corporation). Alikuot dari larutan sampel (5 µL) diinjeksikan ke sistem HPLC dengan kolom Pegasil ODS (4,6 x 25S0 mm, Senshu, Jepang). Elusi dilakukan dengan memasukkan gradien linear 50 – 90% metanol (campuran dengan air Milli-Q) selama 30 menit dengan laju alir 1,9 mL min-1 dan diikuti dengan isokratik 100% metanol selama 10 menit. Oven kolom diatur pada suhu 40C dan elusi dimonitor pada panjang gelombang 350 nm. LC-ESI-MS dilakukan dengan menginjeksikan 5 L sampel ke dalam sistem HPLC, dan elusi dilakukan dengan gradien linear 50 – 90% metanol selama 30 menit diikuti dengan isokratik 100% metanol selama 10 menit pada laju alir 100 L/menit, suhu 40C. Elusi dimonitor pada panjang gelombang 350 nm serta ESI-MS dioperasikan pada mode ion negatif. 3.7

Isolasi produk dari reaksi KanJ dan KanK dengan neamin KanJ (6,5 mL; 15,72 µM) dan KanK (10,5 mL; 22 µM) diinkubasi dengan neamin (15,5

mg; 3,6 mM), -ketoglutarat (26 mg; 9 mM), (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O (28 mg; 3,6 mM), dan NADPH (32 mg; 1,8 mM) dalam buffer Tris (pH 7,5; 40 mM), 10% gliserol, 200 mM KCl hingga volume totalnya 20 mL pada suhu 28C selama 60 jam dengan beberapa kali penambahan KanK dan NADPH hingga mencapai konsentrasi akhir seperti di atas kemudian diderivatisasi dengan DNFB untuk kemudian dianalisis dengan HPLC pada jam ke-7, ke-45, dan ke-60. Reaksi dihentikan dengan merendam larutan assay enzim dalam air mendidih selama 3 menit dan disentrifugasi pada 15.000 rpm selama 30 menit. Supernatan kemudian dilewatkan melalui resin DOWEX AG1X8 (1,5 x 10 cm; bentuk OH-) dan komponen yang tidak terikat


11

di dalam resin dikumpulkan. Larutan yang telah dikumpulkan tersebut lalu dilewatkan ke resin Amberlite CG50 (0,75 x 18 cm; bentuk NH4+) dan dicuci dengan 50 mL air dan diikuti dengan gradien elusi dari 0,05 mM hingga 0,5 mM aqueous NH4OH (400 mL) lalu dielusi lagi dengan 1 M aqueous NH4OH. Keberadaan produk pada setiap fraksi dikonfirmasi dengan kromatografi lapis tipis (Thin Layer Chromatography, TLC) dengan pelarut pengembang CHCl3 : metanol : NH4OH : etanol = 4 : 6 : 7 : 1 dan diberi pewarna ninhidrin. Pelarut dari produk yang terdapat dalam fraksi disingkirkan dengan rotary evaporator dan konsentratnya dilewatkan ke resin DOWEX AG1-X8 (2 x 10 cm, bentuk SO42-) untuk memperoleh produk dalam bentuk sulfatnya. Data 1H-NMR (500 MHz) kemudian diambil dengan menggunakan pelarut deuterium oksida (D2O).

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Sebelum menguji spesifisitas substrat KanJ dan KanK, konfirmasi aktivitas enzimatik KanJ dan KanK dikonfirmasi dengan membuat assay enzim dengan kanamysin B sebagai substratnya. Enzim KanJ dan KanK dinyatakan aktif jika dapat mengkonversi kanamysin B menjadi kanamysin A. Analisis HPLC dari assay enzim menunjukkan bahwa substrat alami, kanamysin B, seluruhnya dikonversi menjadi kanamysin A pada kondisi reaksi enzimatik yang diaplikasikan (Gambar 6). Puncak baru terdeteksi pada reaksi enzimatik dengan neamin dan tobramysin, sedangkan reaksi enzimatik KanJ-KanK (juga hanya dengan KanJ) dengan substrat lain yang diujikan tidak menghasilkan produk dalam jumlah yang dapat dideteksi (Gambar 6). Analisis LC-ESI-MS dari produk reaksi enzimatik dengan neamin menunjukkan bahwa senyawa pada waktu retensi (RT) 23,8 menit adalah m/z 479, yang mengacu pada deoksistreptamin (DOS) yang terdeteksi dalam bentuk derivat dinitrofenil (DNP) sebagai senyawa dekomposisi dari produk reaksi enzimatik dengan KanJ, dan senyawa pada RT 25,8 menit adalah m/z 820,4; yang merujuk pada derivat DNP dari produk yang diharapkan, yaitu tris-(2,4-dinitrofenil)-2’-deamino-2’-hidroksineamin. Analisis LC-ESI-MS dari produk reaksi enzimatik dengan tobramysin menunjukkan bahwa senyawa pada RT 25,8 menit dengan m/z 820,4 yang mengacu pada derivat DNP produk hasil reaksi KanJ yang terdekomposisi oleh basa, yaitu tris-(2,4-dinitrofenil)paromamin ([M-H]- 820,1). Sedangkan senyawa pada RT 26,8 menit adalah m/z 1131,4; yang merujuk pada derivat DNP produk reaksi enzimatik KanJ-KanK yang diharapkan, yaitu tetrakis-(2,4-dinitrofenil)-2’-deamino-2’-hidroksitobramysin. Lebih lanjut, konsumsi 100%


12

substrat dapat kita lihat pada reaksi enzimatik KanJ-KanK dengan tobramysin sementara hal tersebut tidak terjadi pada neamin yang mengindikasikan bahwa tobramysin (pseudotrisakarida mirip kanamysin B) lebih efektif sebagai substrat daripada neamin (pseudodisakarida).

Kanamycin B assays

Neamine assays Tobr amycin assays

Paromamine assays Paromomycin assays

A K

Neomycin B assays C C

D A

A

B

D

B

Gambar 6. Kromatogram HPLC dari hasil reaksi enzimatik KanJ-KanK. (A) Reaksi dengan KanJ-KanK, (B) Reaksi dengan KanJ. (C) kontrol negatif (tanpa -ketoglutarat). (D) Substrat otentik. Panah ( ) menunjukkan puncak dari substrat, Panah ( ) menunjukkan puncak dari produk reaksi KanJ. Panah ( ) menunjukkan puncak dari produk reaksi KanJ-KanK.

Hasil uji spesifisitas substrat dengan menggunakan assay Cenzim skala kecil D

menunjukkan bahwa KanJ lebih memilih substrat dengan struktur mirip kanamysin B A B

A

(substrat alami), yaitu tipe pseudo-trisakarida seperti tobramysin, sehingga spesifisitas B substrat KanJ bersifat kaku (strict). KanJ juga aktif pada pseudo-disakarida neamin yang

Spesifisitas substrat ..., Diana Ayu Nindita, FMIPA UI, 2013 C

D

C

D

13

memiliki gugus amina pada posisi C-6’ tetapi tidak aktif pada paromamin yang memiliki gugus hidroksi pada posisi C-6’ karena perbedaan ukuran atom nitrogen dengan atom oksigen mempengaruhi jarak interaksi ikatan hidrogen dengan residu asam amino pada situs ikatan enzim (binding site). Hal ini menunjukkan bahwa gugus amina pada posisi C-6’ dari bagian neosamin C sangat penting sebagai situs pengenalan substrat. Di sisi lain, KanJ tidak aktif pada aminoglikosida tipe 4,5-disubstitusi 2-DOS yang strukturnya berbeda dengan kanamysin B (tipe 4,6-disubstitusi 2-DOS) seperti ribostamysin, butirosin A, neomysin B, dan paromomysin. Hal ini dikarenakan strukturnya yang tidak mendukung gugus-gugus fungsinya untuk berinteraksi dengan residu asam amino pada KanJ melalui interaksi ikatan hidrogen, elektrostatik, dan sebagainya sehingga reaksi enzimatik tidak dapat terjadi. Untuk menentukan struktur kimia dari produk dengan analisis spektrofotometri, pertama-tama KanJ dan KanK direaksikan dalam assay enzim skala besar dengan salah satu substrat yang dikenali, yaitu neamin. Sebagai hasilnya, adanya produk baru dideteksi dengan analisis HPLC dan secara bertahap jumlahnya meningkat seiring waktu (Gambar 7). Namun, setelah 60 jam, setengah dari neamin (substrat) masih tersisa dalam larutan assay. Hasil ini selaras dengan reaksi enzimatik skala kecil dengan neamin yang telah dijabarkan di atas. Produk

neamin e

hasil isolasi inkubasi 60 jam inkubasi 45 jam inkubasi 7 jam

Gambar 7. Kromatogram HPLC dari assay enzim skala besar KanJ-KanK dengan neamin sebagai substrat.

Untuk mengisolasi produk reaksi enzimatik KanJ-KanK dengan neamin, larutan produk reaksi dilewatkan ke resin penukar ion DOWEX AG-1X8 (bentuk OH–) untuk menyingkirkan protein yang tersisa, kemudian dilewatkan ke kolom resin Amberlite CG50 (bentuk NH4+) dan dielusi dengan gradien konsentrasi dari aqueous NH4OH 0.05 M – 0.5 M. Setelah fraksi-fraksi larutan yang mengandung produk aminoglikosida dikonsentrasikan, konter anion dari senyawa tersebut ditukar dengan SO42- dengan melewatkannya ke kolom resin DOWEX AG1X8 (bentuk SO42-) untuk menghasilkan 9,6 mg minoglikosida dalam bentuk sulfatnya.


14

Spektrum 1H-NMR dari senyawa hasil isolasi (Gambar 8) dalam D2O mengindikasikan adanya proton anomerik H-1’ dari produk yang diharapkan, 2’-deamino-2’-hidroksineamin pada 5,95 ppm dan H-1’ dari substrat (neamin) pada 5,6 ppm. Sinyal-sinyal khas dari dua atom hidrogen pada C-2 dari DOS (H-2ax at 1,9 ppm and H-2eq at 2,45 ppm) ditemukan saling tumpang-tindih. Sinyal-sinyal lain teramati pada 3,1-4,0 ppm. Hasil spektrum NMR yang menunjukkan adanya campuran produk (yang diprediksi merupakan 2’-deamino-2’hidroksineamin) dan substrat (neamin) menyebabkan struktur kimia dari reaksi enzimatik KanJ dan KanK terhadap neamin tidak dapat ditentukan secara akurat.

H-1' neamine H-1' product

H-2eq

H-2ax

Gambar 8. Spektrum 1H-NMR dari hasil isolasi produk reaksi enzimatik KanJ-KanK dengan neamin (500 MHz, D2O)

V.

KESIMPULAN DAN SARAN KanJ mengenali gugus kanosamin dan secara tegas mengenali gugus neosamine C pada

kanamysin B, terutama gugus amina pada posisi C-6’. Spesifisitas substrat KanJ bersifat kaku (strict) karena hanya dapat bereaksi dengan aminoglikosida yang sangat mirip dengan kanamysin B (substrat alami). Struktur kimia produk reaksi enzimatik KanJ dan KanK dengan neamin belum dapat ditentukan secara akurat karena hasil isolasi produk masih merupakan campuran produk dan substrat namun dapat diprediksi bahwa produk merupakan 2’-deamino2’-hidroksi-neamin atau lebih dikenal dengan 4,6-diamino-2,3-dihidroksisikloheksil-6-amino6-deoksi--D-glukopiranosida. Penelitian

mengenai

spesifisitas

substrat

KanJ

dan

KanK

melalui

analisis

bioinformatika untuk simulasi interaksi molekular KanJ dan KanK dengan berbagai substrat aminoglikosida serta penentuan struktur kimia hasil produk reaksi enzimatiknya dengan


15

menggunakan konsentrasi enzim yang lebih besar perlu dilakukan. Protein engineering berdasarkan studi biokimia termasuk analisis struktur kristal protein KanJ dan KanK perlu dilakukan untuk aplikasi enzim KanJ dan KanK yang mungkin dapat memodifikasi berbagai aminoglikosida untuk menghasilkan senyawa bioaktif baru.

UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Tadashi Eguchi dan Associate Prof. Fumitaka Kudo dari Department of Chemistry and Materials Science, Tokyo Institute of Technology, Jepang, atas bimbingan penelitian dan penulisan skripsi ini. REFERENSI [1] Mingeot-Leclercq, M.P. & Tulkens, P.M. (1999). Aminoglycoside: nephrotoxicity. Antimicrobial agents and chemotherapy, 43, pp. 1003-1012. [2] Magnet, S. & Blanchard, J.S. (2005). Molecular insights into aminoglycoside action and resistance. Chemical Reviews, 105, pp. 477-479. [3] Yanai, K. & Murakami, T. (2004). The kanamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces kanamyceticus. The Journal of antibiotics, 57, pp. 351-354. [4] Thapa, L.P., Oh, T.J., Lee, H., Liou, K., Park, J., Yoon, Y., Sohng, J.K. (2007). Heterologous expression of the kanamycin biosynthetic gene cluster (pSCK2) in Streptomyces venezuleae YJ003. Applied microbiology and biotechnology, 76, pp. 1357-1364. [5] Sucipto, H., Kudo, F., & Eguchi, T. (2012). The last step of kanamycin biosynthesis: unique deamination reaction catalyzed by the -ketoglutarate-dependent nonheme iron dioxygenase KanJ and the NADPHdependent reductase KanK” Angew. Chem. Int. Ed., 51, pp. 3428-3431. [6] Nepal, K.K., Oh, T.J., & Sohng, J.K. (2009). Heterologous production of paromamine in Streptomyces lividans TK24 using kanamycin biosynthetic genes from Streptomyces kanamyceticus ATCC12853. Mol. Cells., 27, pp. 601-608. [7] Kudo F., Sucipto H., & Eguchi T. (2009). Enzymatic activity of a glycosyltransferase KanM2 encoded in the kanamycin biosyntetic gene cluster. Journal of Antibiotics, 62, pp. 707-710. [8] Kudo, F. & Eguchi, T. (2009). Biosynthetic genes for aminoglycoside antibiotics. Journal of Antibiotics, 62, pp. 471-481. [9] Sumardjo, D. (2006). Pengantar Kimia. Jakarta : penerbit buku kedokteran EGC. [10] Dewick, M. (2001). Medicinal natural products, a biosynthetic approach. West Southampton : John Wiley and Sons, Ltd.


Spesifisitas Substrat KanJ Dioksigenase dan KanK Dehidrogenase yang Berperan dalam Tahap Akhir Biosintesis Kanamysin

Recommend Documents