PROCEEDINCS nB Vol. 18,No.2/3, t985
5l
SPEKTROFOTODENSITOMETRI UNTUK MENENTUKAN ANTIDEPRESANAMIN TRISIKLIK YANG BEREDAR DI INDONESIADALAM TABLET DAN DALAM URIN. Oleh: RaslimRasyid, Yeyet C. Sumirtapura,TisnoSuwdmo, INK llid jaia, Anwar*
SARI Penentuan kadar antidepresanamin trisiklik yang beredar di Indonesia (amitriptilin, nortriptilin, dan imipramin) dengancaraspektrofotodensitometridilakukan terhadaptablet dan urin. Isolasidari tablet dilakukan denganmetanol dan dari urin denganeter. Cara ini sudah dicoba untuk menentukan kadar senyawaamin trisiklik dalam tablet dan ini dalam dosistun88al. urin sukarelawansetelahpemberiansenyawa-senyawa ABSTRACT A spectrophotodensitometricmethod has been caffied out for the determination of tricylic amine antidepressantsavailable in lndonesia(amitdptyline, nortriptyline, and imipramine) in tablets and urine. Isolation was done by methanol from tablets and by elher from urine. The method has been applied for examinations of tricyclic amine compounds in tablets aswell asin urine of volunteersreceivinga singledose of the compounds.
+ JurusanFaJmasiITB, Indonesia.
5) I
ITB, ol. ) 8, No. 2/3. 1985 PROCEEDINGS
Pendahuluan
Pada saat ini di Indonesia cukup banyak beredar scdiaanobat yang mengandung zat aktif antidepresanturunan amin trisiklik, baik yang berisi zat tunggal nraupundalanr kombinasi dengansenyawapsikotropik lain seperti perfenazin, flufenlzin, diazcpamdan klordiazepoksida. Bcrbagaicara penentuankadar senylrvaantidepresananiin trisiklik, baik untuk p e n c n t u a n n y ad a l a r r s e d i a a nn l a L r p L rdna l a n l c a i r a nb i o l o g i su n t u k k c l t e r l L r a n p u r g c n d l l i a nn u t u o b a t t l a n p e r n e r i k s a aknl i n i s ,t e l a ht l i k c n r b a n g k aonl e h p a r a p c n e l i t i t e r d a l t u l u ( 1 , 2 ) . C a r a a n a l i s i sy a n g s u d a h d i k e n r b a n g k a nl e r s c b u t nrcncnkttp cara yang seclerhana.seperti spektrofotomctri. sirnl\rr cf,rr yrng n r e l i b r t k a np e r a l a t a na n a l i s i sy r n g n r o d e r ns c p e r t ik r o m a t o g r a fgi a s( 3 . 4 ) d a n k r o r n a t o g r i r fcia i r p e n a r r p i l a nt i n g g i( 5 , 6 , 7 , 8 , 9 ) . Cara analisis yang sr.rdahdikembangkandi suatu laboratoriunt tidak selalu dafat diterapkan cli laboratoriunr lain karcna nrasalahperalatandan pereaksi y r r r g t e r s e d J aO . l c h k a r e n a i t u p e r l u d i k e n r b a n g k a nn t e t o d e a n a l i s i sy a n g s c : u l i t l e n g a nk o n d i s i l a b o r a t o r i l r n yr a n g a d a u n t L r kt u j u a n a n a l i s i sy a n g d r h a d e p i .I ' r d a p c n c l i t i a nt c r d a l r u l Lt e r l a hd i k e r r r b a n g k amne t o d ea n a l i s i sb e t r e r a p a s e n ! ' r \ a l ! l n t i d e p r e s atnr i s i k l i k d e r r g a nc l r a k r o n t a t o g r a flia p i st i p i s ( K L T ) c h n s p e k t r o t o t o r n e t r iC . u r a i n i r n n s i l rn r e n r i l i k ib e b e r l p a k c l r , ' : t i a ) t a knh. L r s r r s n y a d r l l n r h u l y r e n y i a p a sna n r p e l e k s t r a k s i )d a n b a t a sk e p c k a a n r l e t o d c a n a l i s i s . L ) a l a n rp c n c l i t i a n : n i d i k e n r b a n g k i l ns u a t u c a r a p e n c l t t u i l Dk a d a r b e b e r a p a s ! . n y a w ra n t i d e p r c s a tnr r n l n a na m i n t r i s i k l i k 1 ' a n gp e n r i s a h a n n llrr c n g g u n a k a n k r o n r a t o g r a f il a p : s t i p i s , s e d a t l g k a lpl e n e n t u a nk L r a n t i t a t i fd i l a k L r k a nd e n g a n cara spcktrofotodensitometri. T u j u a n p e n e l i t i a ni n i t e r u t a n l au u t u k n t e n d a p a t k a n r c t o d ep e n e n t u a nk a d a r s e n )a w a t e r s c b u t b , a i k d a l a n rs e d i l l n n r a u p u nd a l a n ts a r . n p culr i n .
2
Bahandan alat
2.1 Bohon St'nyawa amin trisiklik munri: arnitriptilin hidroklorida (Roche), ilnipranrin hidroklorida (Ciba Geigy), dan nortriptilin hidroklorida (Squibb); beberapa sediaantablet yang mengandungzat aktif tenebut; pelat lapis tipis silika gel 60, E. Merck 20 X l0 cm; metanol dan eter berkualitaspro analisa;pereaksi kimia lain. 2.2 Alat Bcjana kronratografi untuk ukuran pelat 20 X 20 cm;spektrofotodensitonteter S h i n r a d z ut y p e C S - 9 1 0 .
PR)CE\:DINGS ITB t'ol. lti. i\b.2/3. 1985
3
Percobaan
3.I
Ekstaksi
f,J
3.1.l Untuk tablet Satu tablet dimasukkanke dalam vial l0 ml, kemudian ditambahkanair 2 ml. Vial digetarkan dengtrn ultrasomc sampai tablet hancur, tambahkan 8 ml nretrnol tlan isi vial dikocok selanralt'bih kurang satu nrenit. Bahan pembawa t a b l e t y a n g t i d a k l a n r l d i b i a r k a nn r c n g e n d a pd a l t s u p c r n a t a nd i a r n b i l u n t u k krorlltografi. -1.1.2Untuk uritt L i m a p u l L r hm l u r i n d i r l a s u k k a nk e d l l : r m c o r o n g p i s a hb e r k a p a s i t a Is2 5 t n l . U r i n d i b r s a k l n d e n g l n p c n l n t b u h a nl n t o n i a k p r k l t ( l 5 i i ) s a n r p a ip H 9 - 1 0 . k e n r u d j u nc l i e k s t r r k sdi L r ak a l i m a s i n g - n r a s i n dg c n g a nl 0 n r l e t e r ( l , c n l r o c o k a n d i l a k u k : r nd e n g a nt a n g u rk i r e - k i r al 0 r n e n i t ) . I r a s ce t e r c l i k t r n t p u l k adna l a mg e l a sp i a l a 5 0 u r l h l L r d i u a p k a nd i a t a sp c n a n g a s a i r s a n r p a ik e r i n g . R c s i c l Ldri l a n r t k l n k c n t b r l i d a l a n rs a t L rn r i l i l i t e r I n c t a n o l . k e r r r t r J i : r r r , l i l l k r rkkrrortrl r Jl o g r Jl i . 3.2 Kr0matografi T c r h a d a p l a r u r t a nz r t r r l u r n i a t a u c k s t r a k , t l i l a k r r k a nk r o n t a t o - e r a lsi e b a g a i b c r i k u t : s : l t u n r i k r o l i t c r l a r u t a n d i t o t o l k a np a d a p c h r l a p i st i p i s i l c n g a nj l r a k s a t u s e n t i r e t e r c l a r i s i s i b a w a h . d i b i e r k r n s a n l p J i k c r i n g . k c n t L r d i a nd i e l u s j s e j i l u j l I r n l . P c l J t d i k e r i n g k a nP a d t s u l ) u k r : n r r . k e n t r r r l i a nd i u k r r r s e c r r a s p e k t r o l b t o d c n s i t o l t c t rFi .a s cg c r t k l a n gd i p a k a ia t J a l l hn l c t a l o l . 3.3 Spektrofo todcnsitometi N o d a p l d a p c l a t K L T d i u k L r rs e c a r as p ! ' k t r o f o t o d e n s i t o n r cdt rei n g a ns p c k t r o f o t o d c n s i t o r n c t eS r l t i n t l c l z LCr S - 9 1 0 . P c r r g u k u r u n d i l a k u k a nd c n g a l tI n e t o d c l i r i r . r s l r k e t r o l o t o n r e t rUi V s i n g k v a t c l c n g t l rp a d ap a n j a n gg e l o r n b a n 2 g4 0 n r n . Kccepatan pengukuran (scaning) diatur patla kecr-patan20 mnr,/rnenitdan sensitivitasalat (rckordc'r)diatur pada "X2". 3.4 Perhitungan kador Perhitutrgirnkadar senyarvaantidcpresln anrin trisiklik (scblgai seny3',va Lrtuh) d a l a n t s a n r p c lt a b l e t n ) a u p u nc l a l a n ts l n t p e l u r i n d i l a k u k a nd e n g a nr n e n r a k l i k u r v a k l l j b e r a s i .K u r v a k a l i b e r a s d i i b u a t d c n g a nc a r a m e n o t o l k a nI a r u t a nz a t murni rlalam rnetanol, dalant konsentrasi yang bcrvariasi,pada pcll.t yang kemudiln dilakukan krontatografidan spektrolbtodensjtornetri. Kurva kalibcrasi yang tlihasilkan untLrk rnasing-nrasing senyawayang tlicoba p i l d ap e r c o b a r ni n i d a p a td i l i h a tp a d ag a n r b a r1 , 2 .r l a n3 .
54
PRoCEEDINGS ttB tot. t8, No 213.lggs t,nggi puncak
v
I
0.5 Kadar zat {!g)
Gambar 1 Kurva kaliberasiuntuk amitriptilin,denganpersamaan garis regresi: y = 6.45 x + 1,43 dan koelisienkorelasi= 0,999, dengan x adalah kadar zat (dalam,gg) dan y adalahtinggi puncak (dalam cml. 12
v
tt
t,4 Kadar zat l/]g)
3,6
Gambar 2 Kurva kaliberasiuntuk imipramin,denganpersamaan garis r e g r e s iyr = 3 . 7 ' l x + O , 5 2 d a n k o e f i s i ekno r e l a s=i 0 , 9 9 6 .
o,4
0,8
12 1,6 Kadarzar (/rg)
2,O
Gambar 3 Kurva kaliberasi untuk nortriptilin, dengan persamaanga(s regresi:y = 4,48 x 1,90 dan koefisienkorelasi= 0.996.
zRo.EEDINGSITB vol. 18.No. 2/3. 1985
4
Jf,
Hasil percobaan dan Pembahasan
4.1 Ekstraksi dari urin Dengan menggunakan eter sebagaipengekstraksi,penguapan pelarut relatif lebih cepat dan ekstraksi ketiga senyawa amin trisiklik yang dicoba cukup kuantitatif. Jumlah penemuankembali (recovery) zat dari sanlpelurin dengan prosedur ekstraksi ini adalah 89% untuk imipramin, 109% untuk nortriptilin, dan 75% untuk amitriptilin, dilakukan secarailr l,irr.r. Untuk rnengcnrbalikan konsentrasizat dalam ekstrak akhir ke konsentrasidalam urin, maka angkaangka tersebut harus diperhitungkankarenakurva kaliberasidibuat dari larutan zat mumi yang tidak melalui ekstraksi. Dalam penelitian ini pernah dicoba pelarut kloroform sebagaipelarut untuk ekstraksi; pelarut ini biasa dipakai untuk ekstraksi senyawa-senyawa organik dalam fase air. Penggunaanpelarut klorofbrm dalam prosedur ekstraksi percobaanini ternyata serrngmenimbulkan masalah, yaitu sering terbentuknya emulsi yang sukar menrisah pada pengocokan. 4.2 Kromatografi Pada penelitian terdaltulu dipakai pelarut campur untuk fase gerak kromatografi, sedangkandalarn penelitian ini digunakanpelarut tunggal metanol yang ternyata memberikan pemisahanyang cukup baik dan sempufna dari noda senyawalain yang mungkin mengganggu.Karena penggunaanpelarut tunggal ini. fas!' gerak bisa dipakai lebih lama (cukup stabil), tidak perlu mencampur pelarut untuk fase gerak dan reprodusibilitaskronratografi menjadi lebih baik. Dengan kondisi kromatografi ini harga Rp untuk masing-masingsenyawa adalah 0,33 untuk amitriptilin dan imipramin, dan 0,14 untuk nortriptilin. 4.3 Analisis kuantitatif Penggunaancara spektrofotodensitometriuntuk analisiskuantitatif noda-noda yang dihasilkan dalarn kromatograti memberikan beberapa keuntungan dibandingkandenganmetode sebelumnya,antara lain: (a) tidak perlu mengerok noda dari pelat dan mengekstraksikembali senyawayang diperiksa, dan (b) dapat mengurangi kesalahanyang mungkin terjadi pada waktu pengerokan noda dan ekstrasikembali. Denplandenrikiancaraanalisisrnenjadilebih praktis dan lebih reprodusibel. 4.4 Kepekaan metode analish Uji batas kepekaan alat spektrofotodensitometeryang dilakukan terhadap larutan senyawa murni yang dikrornatografi menunjukkan bahwa jumlah terkecil yang masih dapat diukur secarakuantitatif pada kondisi pengukuran
56
ITB Vol. 18,No. 2/3,1985 PROCEEDINGS
seperti telah disebutkandi muka adalahsekitar 100 ng untuk amitriptilin dan nortriptilin dan 300 ng untuk imipramin. Kalau dikembalikanke caraekstraksi dan kromatografi, dari metode analisisini dapat dihitung bahwa konsentrasi senyawa amin trisiklik terkecil dalam urin yang msih dapat diukur dcngan rnetodeini adalahsckitar 2 ug/ml urin untuk amitriptilin dan nortriptilin, dan sekitar 6 ug/nrl urin untuk inlipramill. Untuk kcperLrananalisisyang lebih peka lagi, beberapahal tersebut di bawah ini dapat disesuaikanlagi, yaitu (a) mengurangi volume pelarut (metanol) untuk melarulkan kembali residu hasil ekstrasi, (b) memperbanyak jumlah ekstrak yang ditotolkan pada waktu kromatografi (rnisalnya sampai l0 pl), dan atau (c) mengatur kepekaanalat spektrofotodensitonleter. 45
Reprodusibilitas
Reprodusibilitasmctode analisisini telah dicoba dengan menentukan kadar senyawaamin trisiklik dalam beberapasampel urin dengan konsentrasiyang sama. Konsentrasiyang dicoba udalah 20 pg/ml urin untuk anritriptilin dan nortriptilin, dan 40 gg/ml urin untLrk imiprarnin. tlasil yang diperoleh dapat d i l i h a t p a d at a b e l l . S e p e r t it e r l i h a tp a d at a b e lt e r s e b Lrl te p r o d u s i b i l i t ams e t o d c a n a i i s i si n i c u k u p b a i k d c n g a nk o e l i s i u rv a r i a s si e b e s a1r . 2 7 u n t u k i m i p r a m i n dan 2,7'l untLrknortriptilin. Senrenlaraitu koefisienvariasiuntuk arrritnptilin relatif lebih besar,yaitu 5,27 . Tabel1 Penemuan penentuan kembalilrecoveryl amintrisiklikdanreprod usibjlitas k a d adr a l a mu r i n . Persenpenemuankembali No.
I 2 3 4 5 7 I
Rata-rata S .D . Koef.var.
lmipramin
Nortriptilin
Amitriptilin
88,64 88.64 88,64 90.91 88.64 88,64 88,64 90.9r
108,6 1 1 1, 3 1053 11 3 , 9 't08.6
70,o7 76,67
107,2
74 , 1 9 70,89 75,44 75,O2 82,44
82,2 1,05
109,4 2,88 2,7%
74,7 3,89 5,20A
1,20/o
107,2 I tz,0
f/
ITB Vol. 18.No.2/3,1985 PROCEEDINGS
4.6 Kespesifikan metode Denganmetode ini amitriptilin dapat ditentukan kadarnyameskipun tercampur dengansalahsatu metabolit utamanya(nortriptilin) karenaamitriptilin terpisah sempurna pada waktu krontatografi. Selain itu, perfenazin yang rrerupakar.r salahsatu zat psikotropik yang biasadikombinasidenganantidepresantrisiklik, tidak mengganggupenentuan kadar amitriptilin dengan mctode analisisini. Kemungkinanadanyainterferensidari senyawa-senyawa metabolit antideprcsan trisiklik yang lain belum dapat dilakukan. 4.7 Peneropdnmetode Metode analisisini telah diterapkan dalam penentuankadar beberapasenyawa antidepresanamin trisiklik dalam sediaantablet dan dalam sampelurin setelalt pemberiansenyawa-senyawa tersebut (clalambentuk tablet) pada sukarclawan schat. 4.7.1 Penentuankadar tlai sediaantablet Pcncntuan kadar dari scdiaan tablet menunjukkan hasil yang baik (tabel 2). Kadar scnyawa antidepresan amin trisiklik dari masing-masingtablet yang diperiksa ada dalam ratlge yang diperbolehkan.Khusus pada penentuan tablet yang selain mcngandurrgamitriptilin mengandungjuga perfenazin, terlilrat bahwa perfenazin tidak mengganggupcnentuan kadar amitriptilin dengan m e t o d ea n a l i s i si n i .
Tabel2 Hasilpenentuankadardari sediaan lablet Amitriprilin (25 ms)* No,
Kadal
1
24,87 24,97 25,26
25,OO
23BO 24,48 24,48
24,48
26,O3 26,03 26.03
26,O3
24,4'l 24,O8
Rata-rata
lmipramin(25 mg) No.
Kadar
1
26,28 26,46 26.46 26,11 26,46 26,46 26,9'1 27,23 26,91
4
24,25
* Mengandung 2 mg perfenazin.
25,94 25,95
Rata-rata
Nortriptilin (10 mg) No. 'I
26,37
Kadar
8,96 9,10 9,03
Rata-rata
9,03
9,25 2654
o 1?
9,1'6
o tn
9,40 9,40 9,40
2 7p 5 4
25,94
10,95 10,82
9,40
10,89
PRoCEEDINCSITB VoI. )8, No.2/3,1985
58
4.7.2 Penentuan kadar dai urin sukerelartan Dalam penelitian ini obat diberikan dalam dosistrrnggaldan urin dikunrpulkan selamaperiode 0-8 jam sesudahpembcrianobat. Hasil yang diperoleh dapat dilihat pada tabel 3 yang menunjukkan bahwa senyawa antidepresanamin trisiklik yang dicoba termetabolisis secara ekstensif dalam tubuh. Untuk amitriptilin dan imipramin, denganmetode analisisini senyawautuhnya tidak terdeteksi lagi dalam urin, sedangkanunluk nortriptihn ntasih bisa terdeteksi tetapi dalam jumlah yang relatif kecil, yaitu sekitar 10% dari dosisyang diberikan. Oleh karena itu untuk amitriptilin dan imipramin, penentuandalarnurin p t ' m a k a i o b a t s e b a i k n y a d i a r a h l < a np a d a p e n e n t u a nm e t a b o l i t n y a .K e d u a ekstensifdi dalam tLrbuh. senyawaini mengalamimetxbolist.ne Karena keterbatasansenyawr pcrnbandingyang tersediadalant penelitian ini. b e h l n ld i t e n t u k a nr n et a b o l i t n y a . Tabel3 Hasilpenenluan senyawa amintrisiklikutuhdalam yangmeminum urinsukarelawan obatdalamdosistunggal. Antidepresan Amitriptilin lmipramin Nortriptilin
Oosis
Oitemukankembali
25 mg 25 mg i0 mg
T .T . T, T. 1.05 mg
' T. T- = tidak rerderersi
fustaka l.
Amundson M. E. & J. A. Manthey,Excretionof Nortriptylinehydrochlo(3),277-280. ridein Man1,J.Plnrm..lci..1966.J,5
2.
Pushkar,N. K., QuantitativeDeternrinationof Amitriptyline in Bloo<1, J . P h a r m,.S c i .1, 9 7 8 , 6 7 . ( l ) 6 0 6 2 . Howard B. H. & C. S. Susan.G. L. C Method for QuantitativeDeterI Pharm.Sci.,1974,63. mination of Amitriptyline in Human Plasnra, (2\.296-297.
A
5.
GarlandW. A.. QuantitativsDeterminationof Amitriptyline and Its PrincipalMetabolite,Nortriptyline,by G. L. C-Chenrical lonizationMass (l),77-81. 1977,66, Spectrornetry, Phann. Sci., "/. H. lligh Performance Liquid ChroBurke, D. & Sokoloff,Sinrultaneous rnatographicDeterminationof Chlordiazepoxideand Amitriptylille hydrochloride in Two ComponentTablet Formulations, J. Pharm. Sci.. ( 2, ) , r 3 8 - 1 4 0 198O,69
PRoCEEDINGS nB vot. t8, No.2/3,1985
59
6.
Buttedield, A. C. & R. W. Sears,High Perforrnance Liquid ChromatographicDetermin.rtion of Perphenazine andAmitriptytineHydrochloride in Two ComponentTablet Fonnulations,J. Pharm. Sci., 1977,66,(8), lllT ll19.
7.
Raymond,F. S. & B. C. Thomas.,SimultaneousDeterminationof Imiprame,Desipramine and their 2-HydroxyMetabolitesin Plasmaby Ionpair ReversedPhaseHigh PerformanceLiquid Chromatography with Amperonretric Detection,./. Pharnt.Sci.,1981,70, (3),257-)61 .
8.
Frei, R. W. et al, Liguid Chromatography of DansylDerivatives of some Alkoloids and the Application to thc Analysisof Pharmaceuticals, J. (lhromatogr., 1976,I16,365 377.
9.
Reece.P. A. & Z. Rudi,Quantificationof Imipramineand Desipranrine in Plasmaby High Pcrforniance Liquid Chromatography and Fluorescence Detection, J. Chromatosr.. 1979.163.310-314.
